ES2565331T3 - Análisis de dosificación génica - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para la detección cuantitativa diferencial de dos o más genes homólogos estrechamente vinculados en una muestra que comprende las etapas de: (i) someter la muestra a reacciones de amplificación separadas utilizando (a) una primera pareja de cebadores directo e inverso específicos de la región de cabeza de cada uno de dichos dos o más genes homólogos estrechamente vinculados y (b) una segunda pareja de cebadores directo e inverso específicos de la región de cola de cada uno de dichos dos o más genes homólogos estrechamente vinculados; y (ii) detectar y cuantificar los productos de la amplificación con respecto a un producto del control, en el que cada primera pareja de cebadores se hibrida en la dirección 5' y cada segunda pareja de cebadores se hibrida en la dirección 3' de un punto de rotura estimado debido al entrecruzamiento en cada uno de dichos dos o más genes homólogos estrechamente vinculados correspondientes, y en el que la región de cabeza de cada uno de los mencionados dos o más genes homólogos estrechamente vinculados representa una secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de dicho gen y la región de cola de cada uno de dichos dos o más genes homólogos estrechamente vinculados representa una secuencia de nucleótidos en el extremo 3' de dicho gen, con la condición de que la pareja de cebadores directo e inverso se seleccione de tal manera que una pareja de cebadores localizada en la región de cola no se solape con una pareja de cebadores localizada en la región de cabeza de dos genes adyacentes de dichos dos o más genes homólogos estrechamente vinculados.

Description

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con una secuencia diana, situada 3’ o 5’ de una secuencia de bases contigua que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia diana.
El término “condiciones rigurosas” como se usa en el presente documento se refiere a las condiciones de lavado utilizadas en el protocolo de hibridación y significa que la hibridación se produciría solo si existe al menos un 95 % y preferentemente al menos un 97 % de identidad entre las secuencias. En general, las condiciones de lavado deben ser una combinación de temperatura y concentración salina seleccionadas de tal manera que la temperatura de desnaturalización sea aproximadamente 5-20 ºC por debajo de la Tf calculada (la temperatura de fusión a la cual la mitad de las moléculas se disocian de sus moléculas de hibridación asociadas) del ácido nucleico híbrido en estudio. Las condiciones de temperatura y sal se determinan fácilmente de forma empírica en experimentos preliminares en los cuales las muestras de ADN de referencia inmovilizadas sobre filtros se hibridan con el ácido nucleico que codifica la sonda o la proteína de interés y a continuación se lavan en condiciones de diferente rigor. Se puede estimar la Tf de dicho oligonucleótido estableciendo 2 ºC para cada nucleótido A o T, y 4 ºC para cada G o C.
Las personas expertas en la técnica conocen bien las condiciones de hibridación rigurosas adecuadas (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª ed., Sambrook y col., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; DNA Cloning: A practical Approach, Glover & Hames eds., Oxford University Press, 1996; Nucleic Acid Hybridization: Essential techniques, Ross ed. Wiley, 1998). Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas puede ser 4 x SSC (solución salina de citrato normalizada) a 65 ºC. Las condiciones de lavado muy rigurosas incluyen, por ejemplo, 0,2 x SSC a 65 ºC. El término “deleción” como se usa en el presente documento abarca una mutación que elimina uno o más nucleótidos de un ácido nucleico. De forma inversa, el término “duplicación” se refiere a una mutación que inserta uno o más nucleótidos de secuencia idéntica (en la mayor parte) directamente cerca de esta secuencia en un ácido nucleico. En una realización preferida, una deleción o duplicación implica un segmento de cuatro o más nucleótidos. Con respecto a la α-talasemia, una deleción puede eliminar parte o todo el gen α1, el gen α2 o parte o todo de ambos (α1/α2).
El término “específico” como se usa en el presente documento en referencia a un cebador de oligonucleótido significa que la secuencia de hibridación del cebador tiene al menos 10 bases de identidad de la secuencia con una parte del ácido nucleico que se va a amplificar cuando el oligonucleótido y el ácido nucleico se alinean. Un cebador de oligonucleótido que es específico de un ácido nucleico es aquel que, en las condiciones de hibridación o lavado adecuadas, es capaz de hibridarse “específicamente con y amplificar” la diana de interés y no hibridarse sustancialmente con y amplificar ácidos nucleicos que no son de interés. Se prefieren mayores niveles de identidad de la secuencia e incluyen al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % y de forma más preferente al menos un 80 % de identidad de la secuencia.
El término “hibridar” o “hibridar específicamente” como se usa en el presente documento se refiere a un procedimiento donde dos hebras complementarias de ácido nucleico se hibridan entre sí en condiciones rigurosas de forma adecuada. Las hibridaciones se llevan a cabo normal y preferentemente con moléculas de ácidos nucleicos con la longitud de una sonda, preferentemente 10-100 nucleótidos de longitud, más preferentemente 10-50 nucleótidos de longitud, lo más preferente 10-30 nucleótidos de longitud: Son bien conocidas en la materia las técnicas de hibridación de ácidos nucleicos. Véase, por ejemplo, Sambrook, y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. Los expertos en la materia saben cómo estimar y ajustar el rigor de las condiciones de hibridación de tal manera que las secuencias que tienen al menos un nivel deseado de complementariedad se hibriden de forma estable, mientras que aquellas que tienen una complementariedad más baja no lo hagan. Para los ejemplos de las condiciones y parámetros de hibridación, véanse, por ejemplo, Sambrook, y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición; Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.; Ausubel, F.M. y col. 1994, Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Secaucus, N.J.
El término “homólogo” con referencia a las secuencias de ácidos nucleicos indica que dos o más secuencias comparten una mayoría de su secuencia. Generalmente, esto será al menos aproximadamente un 70 % de su secuencia y preferentemente al menos un 95 % de su secuencia. Otra indicación de que las secuencias son sustancialmente idénticas si se hibridan con la misma secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas (véanse, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning—A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias.
Los términos “cabeza” y “cola” como se usa en el presente documento (por ejemplo, en combinación con el término “región” se refieren a secuencias de nucleótidos en cualquier extremo, es decir, 5’ o 3’ de un gen concreto. Las regiones de la cabeza y la cola pueden estar flanqueadas tanto sin solapamiento con el gen respectivo o bien pueden solaparse con el extremo respectivo del gen. En el último caso los extremos de las regiones de cabeza y cola (es decir, el extremo 3’ de la región de cabeza y el extremo 5’ de la región de cola) están tanto separados por un hueco como (ii) colindantes entre sí o (iii) se solapan entre sí. Más específicamente, en una realización, las secuencias de ácidos nucleicos específicas de las regiones de cabeza y/o las regiones de cola pueden ser específicas de una región que (i) flanquea y se solapa con el respectivo extremo del gen, o (ii) flanquea solo el respectivo extremo del gen, o (iii) se solapa solo con el respectivo extremo del gen o (iv) sus combinaciones. La longitud de la región de cabeza y cola de un gen, por ejemplo, el gen α1, está confinada normalmente por el gen
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adyacente, por ejemplo, el gen α2. De acuerdo con la convención, las secuencias de las hebras monocatenarias de ADN y ARN se escriben en la dirección 5’ a 3’. De esta manera, con respecto a los genes de la α-globina, las regiones de cabeza y cola de α1 comprenden aproximadamente los nucleótidos 163708 a 167099 de la secuencia 5’ (es decir, la región de cabeza) y aproximadamente los nucleótidos 167099 a 170335 de la secuencia 3’ (es decir, la región de cola) de la agrupación de genes de la α-globina como se ha identificado en el N.º de registro del GenBank AE006462. De esta forma, las regiones de cabeza y cola de α2 comprenden aproximadamente los nucleótidos 158640 a 162875 de la secuencia 5’ (es decir, la región de cabeza) y aproximadamente los nucleótidos 162875 a 166679 de la secuencia 3’ (es decir, la región de cola) de la agrupación de genes de la α-globina como se ha identificado en el Número de registro del GenBank AE006462.
A la vista de lo anterior resulta evidente que los cebadores pueden tener diversas longitudes diferentes, y que la localización exacta del tramo de nucleótidos contiguos al cual se hibrida el cebador, puede variar. Por tanto, es importante que las secuencias a las cuales se hibridan los cebadores directo e inverso de cada pareja de cebadores (para cada uno de los genes homólogos estrechamente vinculados) estén localizadas en ambos lados de la posición concreta del acontecimiento de entrecruzamiento (que ocasiona los diversos genotipos). Por ejemplo, cuando se diseñan las parejas de cebadores para la amplificación de genes múltiples muy adyacentes (al menos dos), cada ensayo consiste en dos parejas de cebadores para cada uno de los genes homólogos estrechamente vinculados; una primera pareja de cebadores localizada en la dirección 5’ del punto de ruptura estimado debido al entrecruzamiento en el primer gen dirigido (región de cabeza) y una segunda pareja de cebadores localizada en la dirección 3’ del punto de rotura en el primer gen dirigido (región de cola), con la condición de que las localizaciones del cebador se seleccionen de tal manera que la pareja de cebadores localizada en la región de cola del primer gen no esté solapándose con la pareja de cebadores localizada en la región de cabeza del segundo gen de dichos genes homólogos múltiples estrechamente vinculados. Por ejemplo, donde los genes homólogos múltiples estrechamente vinculados representan el gen α1 y el gen α2 de la α-talasemia, el amplicón de cabeza de α2 es el amplicón en la dirección 5’ del primer gen de estos dos genes fuertemente homólogos, el amplicón de cola de α2 es el amplicón en la dirección 3’ del primer gen de estos dos genes fuertemente homólogos, el amplicón de cabeza de α1 es el amplicón en la dirección 5’ y el amplicón de cola de α1 es el amplicón de cola del segundo gen de estos dos genes fuertemente homólogos.
Como se usa en el presente documento, el término “amplicón” se refiere a una secuencia de polinucleótidos amplificada en una secuencia diana, y definida por los extremos distales de los dos sitios de unión al cebador. Para uso en la presente invención los amplicones generados por las diversas parejas de cebadores pueden ser iguales o diferentes.
Como se usa en el presente documento, “vinculado” o “enlace” (que se distingue del término “enlazado operativamente”) debe referirse al enlace genético o físico de los loci o genes. Los loci o genes se consideran genéticamente vinculados si la frecuencia de recombinación entre ellos es menor de aproximadamente un 50 % determinado en una cartografía de meiosis simple. Están progresivamente más vinculados si la frecuencia de recombinación es aproximadamente 40 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 10 % o menos, como se ha determinado en una cartografía de meiosis simple. El término “estrechamente vinculado” significa que dos loci genéticos están normalmente comprendidos en 10 centimorgans (cM) entre sí. Esto es, los dos elementos genéticos asociados experimentan la recombinación durante la meiosis entre sí a una frecuencia de menos de o igual a aproximadamente 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 0,75%, 0,5%, 0,25% o menos. Se espera que los loci estrechamente vinculados segreguen simultáneamente al menos aproximadamente el 90 % del tiempo.
La presente invención proporciona en un primer aspecto un procedimiento para la detección cuantitativa precisa de deleción(ones) o duplicación(ones) de un polimorfismo genético que se produce en dos o más genes homólogos estrechamente vinculados en una muestra.
Más específicamente, este procedimiento comprende
(i) someter la muestra a reacciones de amplificación separadas usando (a) una primera pareja de cebadores directo e inverso específicos de la región de cabeza de dichos dos o más genes homólogos estrechamente vinculados y (b) una segunda pareja de cebadores directo e inverso específicos de la región de cola de cada uno de los mencionados dos o más genes homólogos estrechamente vinculados, y (ii) detectar y cuantificar productos de la amplificación con respecto a un producto del control, en el que cada primera pareja de cebadores se hibrida en la dirección 5’, y cada segunda pareja de cebadores se hibrida en la dirección 3’ de un punto de rotura estimado debido a un entrecruzamiento en cada uno de los dos o más genes homólogos estrechamente vinculados correspondientes y en el que la región de cabeza de cada uno de dichos dos o más genes homólogos estrechamente vinculados representa una secuencia de nucleótidos en el extremo 5’ de dicho gen y la región de cola de dichos dos o más genes homólogos estrechamente vinculados representa una secuencia de nucleótidos en el extremo 3’ de dicho gen, con la condición de que la pareja de cebadores directo e inverso se seleccionen de tal manera que la pareja de cebadores localizada en la región de cola no se solape con la pareja de cebadores localizada en la región de cabeza de dos genes adyacentes de dichos dos o más genes homólogos estrechamente vinculados.
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directo e inverso específicos de la β-globina, es decir, que son capaces de hibridarse específicamente a y amplificar una secuencia del gen de la β-globina como se ha identificado por el N.º de registro del GenBank U01317. En una realización, la pareja de cebadores directo e inverso específicos de la β-globina se incluyen en cada reacción de amplificación (i) a (iv), en otra realización se lleva a cabo una reacción de la RT-PCR separada utilizando los cebadores directo e inverso específicos de la β-globina.
En otra realización, las regiones de cabeza y cola de α1, que se definen como las regiones de los extremos 5’ y 3’ de α1, corresponden, respectivamente a los nucleótidos 163708 a los nucleótidos 167099 de la secuencia 5’ (es decir, la región de cabeza) y de los nucleótidos 167099 a los nucleótidos 170335 de la secuencia 3’ (es decir, la región de cola) de la agrupación de genes de la α-globina, por ejemplo, como se ha identificado en el N.º de registro del GenBank AE006462. En otra realización, las regiones de cabeza y cola de α2, corresponden respectivamente a los nucleótidos 158640 a los nucleótidos 162875 de la secuencia 5’ (es decir, la región de cabeza) y a los nucleótidos 162875 a 166679 de la secuencia 3’ (es decir, la región de cola) de la agrupación de genes de la α-globina, por ejemplo, como se ha identificado en el N.º de registro del GenBank AE006462.
En una realización adicional se lleva a cabo la etapa de detección utilizando al menos una sonda de hibridación marcada. En una realización preferida, se usa una pareja de sondas, en el que una primera sonda tiene una marca en su extremo 3’ y una segunda sonda tiene una marca en su extremo 5’. En otra realización, se utiliza una sonda que tiene una marca en cada uno de sus extremos 3’ y 5’.
Las parejas de sondas preferidas son la SEQ ID NO: 9 y 10 para la región de cabeza de α1, 11 y 12 para la región de cola de α1, 13 y 14 para la región de cabeza de α2, y 15 y 16 para la región de cola de α2.
En una realización adicional, las posiciones de los cebadores se seleccionan de tal manera que obtienen un amplicón que tiene una longitud de 150 a 250 pb.
Junto con el procedimiento, la presente divulgación proporciona también oligonucleótidos específicos que se van a usar como cebadores en los procedimientos de acuerdo con la invención.
De esta manera, en una realización específica adicional, las parejas de cebadores directo e inverso específicos de la región de cabeza o cola da cada uno de α1 y α2 son cada uno una secuencia de ácido nucleico de entre 10 y aproximadamente 100 nucleótidos, preferentemente 10 y aproximadamente 50 nucleótidos, más preferentemente aproximadamente 10 y 30 nucleótidos, lo más preferente, entre 14 y 22 nucleótidos de longitud. Dichos oligonucleótidos o parejas de cebadores de la PCR pueden derivarse de la secuencia conocida de la agrupación de genes de la α-globina que se muestra en el N.º de registro del GenBank AE006462 utilizando los programas informáticos previstos para este fin tales como LightCycler Probe Design Software 2.0 (Roche Applied Science, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) o Primer (Versión 0.5, © 1991, Witehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA) o cualquier otro programa y son de composición y longitud específicas de tal manera que son capaces de hibridarse en condiciones muy rigurosas y/o muy estrictas a su sitio diana. De la misma forma, los oligonucleótidos o parejas de cebadores de la PCR de la secuencia génica de control de elección (por ejemplo, la secuencia del gen de la β-globina), pueden derivarse de la secuencia conocida del gen de la β-globina que se muestra en el No de registro del GenBank: U01317.
De esta manera, en una realización, la pareja de cebadores directo e inverso específicos de la región de cabeza y cola de α1 comprende una secuencia de ácido nucleico específica de los nucleótidos 163708 a los nucleótidos 167099 de la secuencia 5’ (es decir, la región de cabeza) y de los nucleótidos 167099 a los nucleótidos 170335 de la secuencia 3’ (es decir, la región de cola) de la agrupación de genes de la α-globina (como se ha identificado por el N.º de Registro del GenBank AE006462). En otra realización, la pareja de cebadores directo e inverso específicos de la región de cabeza y cola de α2 comprende una secuencia de ácido nucleico específica de los nucleótidos 158640 a los nucleótidos 162875 de la secuencia 5’ (es decir, la región de cabeza) y a los nucleótidos 162875 a los nucleótidos 166679 de la secuencia 3’ (es decir, la región de cola) de la agrupación de genes de la α-globina (como se ha identificado por el N.º de Registro del GenBank AE006462).
La pareja de cebadores directo e inverso específicos de las regiones de cabeza y cola de α1 puede comprender una secuencia de ácido nucleico al menos un 95 % idéntica a las secuencias de nucleótidos que se muestran como SEQ ID NO: 1(α1-cabeza-directo) y 4 (α1-cabeza-inverso) correspondientes a las posiciones 165586-165607 y 165737165752, y la SEQ ID NO: 3 (α1-cola-directo) y 2 (α1-cola-inverso), correspondientes a las posiciones 168-168354 y 168476-168494, respectivamente. La pareja de cebadores directo e inverso específicos de las regiones de cabeza y cola de α2 puede comprender una secuencia de ácido nucleico al menos un 95 % idéntica a la secuencia de nucleótidos que se muestra como SEQ ID NO: 5 (α2-cabeza-inverso) correspondiente a las posiciones 161708161723 y 161899-161914, y la SEQ ID NO: 7 (α2-cola-directo) y 8 (α2-cola-inverso) correspondiente a las posiciones 163584-163602 y 1637439-163755, respectivamente.
Se entiende que los oligonucleótidos que consisten en la SEQ ID NO: 1 a 8 pueden contener deleciones, adiciones y/o sustituciones menores de bases de ácidos nucleicos, en la medida en que dichas alteraciones no afecten negativamente el rendimiento o el producto obtenido en un grado significativo.
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En una realización más específica, el (los) cebador(es) comprende una marca, por ejemplo, una marca fluorescente, biotina, enzimática, química o radiomarca, preferentemente una marca fluorescente, o una derivatización adicional como se define anteriormente en el presente documento necesaria para el uso en la RT-PCR, es decir, para estabilizar los productos de la amplificación o para potenciar la separación de fragmentos que hace la discriminación, identificación y cuantificación de amplicones más precisa.
Los procedimientos para preparar y utilizar cebadores se describen en, por ejemplo, Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Ausubel y col. (1987) Current Protocols en Molecular Biology, Green Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences.
De esta manera, en una realización más específica, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar un polimorfismo genético en los genes α1 y α2 de la talasemia, que comprende las etapas de:
(i)
obtener una muestra genómica
(ii)
someter dicha muestra a cuatro reacciones de amplificación separadas mediante la RT-PCR utilizando
(a)
en una primera reacción una pareja de cebadores que se hibrida específicamente en la dirección 5’ de un punto de rotura estimado debido al entrecruzamiento, en condiciones adecuadas de una PCR con una secuencia entre los nucleótidos 163708 a los nucleótidos 167099 de la agrupación de genes de la α-globina como se ha identificado en el N.º de Registro del GenBank AE006462 (secuencia de cabeza de α1), preferentemente una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO: 1 y 2 (cebador de cabeza de α1),
(b)
en una segunda reacción, una pareja de cebadores que tiene una secuencia que se hibrida específicamente en la dirección 3’ de un punto de rotura estimado debido al entrecruzamiento en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia entre los nucleótidos 158640 a los nucleótidos 162875 de la agrupación de genes de la α-globina como se ha identificado en el N.º de registro del GenBank AE006462 (secuencia de cabeza de α2), preferentemente una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO: 5 y 6 (cebador de cabeza α2),
(c)
En una tercera reacción, una pareja de cebadores que se hibrida específicamente en la dirección 3’ de un punto de rotura estimado debido al entrecruzamiento en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia entre los nucleótidos 167099 a los nucleótidos 170335 de la agrupación de genes de la α-globina como se ha identificado en el N.º de Registro del GenBank AE006462 (secuencia de cola de α1), preferentemente una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO: 3 y 4 (cebador de cola de α1),
(d)
En una cuarta reacción, una pareja de cebadores que tiene una secuencia que se hibrida específicamente en la dirección 3’ de un punto de rotura estimado debido al entrecruzamiento en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia entre los nucleótidos 162875 a los nucleótidos 166679 de la agrupación de genes de la α-globina como se ha identificado en el N.º de registro del GenBank AE006462 (secuencia de cola de α2), preferentemente, una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO 7 y 8 (cebador de cola de α2), y
(iii) detectar y cuantificar los productos de la amplificación con respecto a un producto del control,
(iv) en el que las localizaciones de los cebadores se seleccionan de tal manera que la pareja de cebadores de cola de α2 no se solapan con la pareja de cebadores de cabeza de α1.
El producto de control puede ser un producto de control endógeno, preferentemente el producto de amplificación del gen β. De esta manera, el procedimiento puede incluir añadir una pareja de cebadores de una secuencia control endógena, por ejemplo, una pareja de cebadores que se hibrida específicamente en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia del gen de la β-globina como se ha identificado en el N.º de registro del GenBank U01317, preferentemente una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO: 17 y 18 (cebador del gen de la βglobina), a cada una de las reacciones de amplificación.
Alternativamente, el procedimiento puede incluir una etapa adicional que comprende someter dicha muestra a una quinta reacción de amplificación separada mediante la RT PCR utilizando una pareja de cebadores que se hibrida específicamente en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia del gen de la β-globina como se ha identificado en el N.º de registro del GenBank U01317, preferentemente una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO: 17 y 18 (cebador del gen de la β-globina).
De esta manera, se describe también en el presente documento un procedimiento para detectar un polimorfismo genético en los genes α1 y α2 de la talasemia, que comprende las etapas de:
(i)
obtener una muestra genómica,
(ii)
someter dicha muestra a cuatro reacciones de amplificación separadas mediante la RT-PCR utilizando
(a) en una primera reacción una pareja de cebadores que se hibrida específicamente en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia de entre aproximadamente los nucleótidos 163708 a los
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45
50
55
nucleótidos 167099 de la agrupación de genes de la α-globina como se ha identificado en el N.º de registro del GenBank AE00642 (secuencia de cabeza de α1), preferentemente una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO: 1 y 2 (cebador de cabeza de α1) y una pareja de cebadores que se hibrida específicamente en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia del gen de la β-globina, como se ha identificado en el N.º de registro del GenBank U01317, preferentemente una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO: 17 y 18 (cebador del gen de la globina-β),
(b)
En una segunda reacción, una pareja de cebadores que tiene una secuencia que se hibrida específicamente en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia de entre aproximadamente los nucleótidos 158640 a los nucleótidos 162791 de la agrupación de genes de la α-globina como se ha identificado en el N.º de registro del GenBank AE006462 (secuencia de cabeza de α2), preferentemente una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO: 5 y 6 (cebador de cabeza de α2), y una pareja de cebadores que se hibrida específicamente en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia del gen de la β-globina como se ha identificado en el N.º de registro del GenBank U01317, preferentemente, una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO: 17 y 18 (cebador del gen de la globina β),
(c)
En una tercera reacción, una pareja de cebadores que se hibrida específicamente en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia de entre aproximadamente los nucleótidos 167099 a los nucleótidos 170335 de la agrupación de genes de la α-globina como se ha identificado en el N.º de registro del GenBank AE006462 (secuencia de cola de α1), preferentemente una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO: 3 y 4 (cebador de cola de α1), y una pareja de cebadores que se hibrida específicamente en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia del gen de la β-globina como se ha identificado en el N.º de Registro del GenBank U01317, preferentemente una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO. 17 y 18 (cebador del gen de la β-globina),
(d)
En una cuarta reacción, una pareja de cebadores que tiene una secuencia que se hibrida específicamente en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia de entre aproximadamente los nucleótidos 162791 a los nucleótidos 166679 de la agrupación de genes de la α-globina como se ha identificado en el N.º de registro del GenBank AE006462 (secuencia de cola de α2), preferentemente una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO: 7 y 8 (cebador de cola de α2), y una pareja de cebadores que se hibrida específicamente en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia del gen de la β-globina como se ha identificado en el N.º de registro del GenBank U01317, preferentemente una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO: 17 y 18 (cebador del gen de la β-globina), y
(iii) detectar y cuantificar los productos de la amplificación con respecto a un producto del control.
Se describe además en el presente documento un procedimiento para detectar un polimorfismo genético en los genes α1 y α2 de la talasemia, que comprende las etapas de:
(i)
obtener una muestra genómica,
(ii)
Someter dicha muestra a cinco reacciones de amplificación separadas mediante la RT-PCR utilizando
(a)
En una primera reacción, una pareja de cebadores que se hibrida específicamente en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia de entre aproximadamente los nucleótidos 163708 a los nucleótidos 167099 de la agrupación de genes de la α-globina como se ha identificado en el n.º de registro del GenBank AE006462 (secuencia de cabeza de α2), preferentemente, una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO: 5 y 6 (cebador de cabeza de α2),
(b)
En una segunda reacción, una pareja de cebadores que tiene una secuencia que se hibrida específicamente en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia de entre aproximadamente los nucleótidos 158640 a los nucleótidos 162791 de la agrupación de genes de la α-globina como se ha identificado en el N.º de Registro del GenBank AE006462 (secuencia de cabeza de α2), preferentemente una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO: 5 y 6 (cebador de cabeza de α2),
(c)
En una tercera reacción, una pareja de cebadores que se hibrida específicamente en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia de entre aproximadamente los nucleótidos 167099 a los nucleótidos 170335 de la agrupación de genes de la α-globina como se ha identificado en el N.º de registro del GenBank AE006462 (secuencia de cola de α1), preferentemente una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO: 3 y 4 (cebador de cola de α1),
(d)
En una cuarta reacción, una pareja de cebadores que tiene una secuencia que se hibrida específicamente en condiciones adecuadas para una PCR con una secuencia de entre aproximadamente los nucleótidos 162791 a los nucleótidos 166679 de la agrupación de genes de la α-globina como se ha identificado en el N.º de registro del GenBank AE006462 (secuencia de cola de α2) preferentemente, una pareja de cebadores tal como la SEQ ID NO: 7 y 8 (cebador de cola de α2),
imagen9
Diseño de cebadores. Se diseñaron cebadores y sondas utilizando el LightCycler Probe Design Software 2.0 (Roche Applied Science, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). Todos los cebadores cumplieron los siguientes criterios: los productos de la amplificación tienen 200-300 pb, las temperaturas de fusión son 45-65 ºC, ausencia de formación de dímeros estables y formación de estructuras en horquillas estables. La modificación de las 5 sondas de hibridación incluyó fosfato (PH) y el marcado con 3’-fluoresceína (FL) y 5’-LightCycler Red 640 (LC), respectivamente.
La tabla 1 siguiente resume una selección de cebadores y sondas que se utilizaron para la amplificación de cuatro loci diferentes en el gen de la α-globina y un locus en el gen de la β-globina, que fue seleccionado como gen de referencia en este caso específico:
10 Tabla 1:
Cebador/ Sonda
Nombre Secuencia (con/sin marcas) SEQ ID NO Posición de bases
α1-cabezadirecto
α1h-F 5’-CCTCCTCCACCTAATACATATC-3’ 1 165586-165607
α1-cabezainverso
α1h-R 5’-AggTAggCAgTCCTCT-3’ 2 165737-165752
α1-cola-directo
α1t-F 5’-CTggCCCTCAACTgAT-3’ 3 168339-168354
α1-cola-inverso
α1t-R 5’-AAATAACgAAgACACCgTC-3’ 4 168476-168494
α2-cabezadirecto
α2h-F 5’-gACggggTTTCTCCAT-3’ 5 162708-161723
α2-cabezainverso
α2h-R 5’-ggTgAggAAggAAggg-3’ 6 161899-161914
α2-cola-directo
α2t-F 5’-CTCCAAATACCgTTAAgCTg-3’ 7 163584-163603
α2-cola-inverso
α2t-R 5’-ATTgTTggCACATTCCg-3’ 8 163739-163755
α1-cabeza-P1
α1h-P1 5’-ACTAACCCTggTCACCTTgAA-FL 9 165640-165660
α1-cabeza-P2
α1h-P2 Red640-CCTCgTCCACACCTCCag-Ag.PH 10 165663-165680
α1-cola-P1
α1t-P1 5’-TCACCCTTggTAAACACCTATggC-FL 11 168386-168409
α1-cola-P2
α1t-P2 LC Red640-gCCCTCTgCCTgCgTT-PH 12 168412-168427
α2-cabeza-P1
α2h-P1 5’-ggTCTCgAACTCCCgACC-FL 13 161736-161753
α2-cabeza-P2
α2h-P2 5’-LC Red640-AgCTgATCCACCCgCC-PH 14 161756-161771
α2-cola-P1
α2t-P1 5’-CCTTCCTggTCTTTgAATAAAgTTgAg-FL 15 163673-163700
α2-cola-P2
α2t-P2 5’-LC Red640-ggCAgCAgCCTgTgTgTgT-PH 16 163703-163719
β-directo
β-F 5’-ACACAACTgTgTTCACTAgC-3’ 17 40355294035510
β-inverso
β-R 5’-CAACTTCATCCACgTTCACC-3’ 18 40354204035439
β-P1
β-P1
5’-AAACAgACACCATggTgCACCTgA-CTCCTgAggA-FL 19 40355034035470
β-P2
β-P2
5’-LC Red640-AAgTCT-gCCTTACTgCCCTgTggggCAA-PH 20 40354684035440
Ejemplo 1: Optimización de la RT PCR cuantitativa
Se llevó a cabo la optimización de la RT PCR para la cuantificación utilizando el colorante SYBR green fluorescente intercalante de ADN (que representa las señales de fluorescencia potencial que surgen debido a productos 15 bicatenarios no específicos con colorantes intercalantes). La mezcla de reacción contenía 1x LightCycler FastStart DNA Master SYBR GREEN I (Roche Diagnostic AG, Rotkreuz, Suiza) MgCl2 1 mM, 0,5 µM de cebadores directo e
imagen10

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    imagen2
    imagen3
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