ES2562627T3 - Anticuerpos anti-C5aR humanizados - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo humanizado que se une C5aR humano, que comprende i) una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, y ii) una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.

Description

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SEQ ID NO: 25 -Región que se une a la cadena pesada humana de Hv1Cj_human. SEQ ID NO: 26 -región que se une a la cadena pesada humana de Hv2Ij_human. SEQ ID NO: 27 -Región que se une a la cadena pesada humana de Hv3Hj_human. SEQ ID NO: 28 -Región que se une a la cadena pesada humana de Hv3Kj_human. SEQ ID NO: 29 -Región que se une a la cadena pesada humana de Hv3Tj_human. SEQ ID NO: 30 -Secuencia de consenso hVhjFW Cons de secuencias de la región (J) que se une a la cadena

pesada humana conforme a lo dispuesto en la Figura 2B. SEQ ID NO: 31 -Secuencia de aminoácidos h7Vk de la cadena ligera de la región V humanizada de 7F3. SEQ ID NO: 32 -Secuencia de aminoácidos h7aVk de la cadena ligera de la región V humanizada de 7F3. SEQ ID NO: 33 -Secuencia de aminoácidos h7bVk de la cadena ligera de la región V humanizada de 7F3. SEQ ID NO: 34 -Secuencia de aminoácidos h7Vh de la cadena pesada de la región V humanizada de 7F3. SEQ ID NO: 35 -Secuencia de aminoácidos h7aVh de la cadena pesada de la región V humanizada de 7F3. SEQ ID NO: 36 -Secuencia de aminoácidos h7bVh de la cadena pesada de la región V humanizada de 7F3. SEQ ID NO: 37 -C5aR humano. SEQ ID NO: 38 -Epítopo en el segundo bucle extracelular de C5aR humano. SEQ ID NO: 39 -Secuencia de consenso h7F3VhCons de las regiones variables de la cadena pesada humanizada

de 7F3 de la invención según lo dispuesto en la Figura 10. SEQ ID NO: 40 -Región constante de la cadena ligera humana hCκ-R. SEQ ID NO: 41 -Región constante de la cadena ligera humana hCκ. SEQ ID NO: 42 -Región constante de la cadena pesada humana hCγ4. SEQ ID NO: 43 -Región constante de la cadena pesada humana hCγ4PE. SEQ ID NO: 44 -Región constante de la cadena pesada humana hCγ1. SEQ ID NO: 45 -Región constante de la cadena pesada humana hCγ4P. SEQ ID NO: 46 -Secuencia RNOK203VL humanizada. SEQ ID NO: 47 -Secuencia VLCD18-Q obtenida a partir de KV2F-HUMAN. SEQ ID NO: 48 -Secuencia de consenso h7F3VkCons de las regiones variables de la cadena ligera humanizada de

7F3 de la invención según lo dispuesto en la Figura 6. SEQ ID NO: 49 -Secuencia marco VJ de la cadena pesada humana de consenso hVhFW Cons. SEQ ID NO: 50 -Secuencia humana SGI-VH. SEQ ID NO: 51-Secuencia HG3 de la línea germinal humana. SEQ ID NO: 52 -Secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos h7Vk de la cadena ligera

de la región V humanizada de 7F3.

SEQ ID NO: 53 -Secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos h7aVk de la cadena ligera de la región V humanizada de 7F3. SEQ ID NO: 54 -Secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos h7bVk de la cadena ligera

de la región V humanizada de 7F3.

SEQ ID NO: 55 -Secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos h7Vh de la cadena pesada de la región V humanizada de 7F3. SEQ ID NO: 56 -Secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos h7aVh de la cadena

pesada de la región V humanizada de 7F3.

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Tal como se utiliza en esta memoria, los términos "tratando", "tratar" o "tratamiento" y variaciones de los mismos incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención que es suficiente para reducir o eliminar al menos un síntoma del trastorno.

Tal como se utiliza en esta memoria, los términos "evitando", "prevenir" o "prevención" o variaciones de los mismos se refieren a proteger un sujeto del desarrollo de al menos un síntoma de una enfermedad, o reducir la gravedad de un síntoma de un trastorno.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "exponer la célula" se refiere a proporcionar el anticuerpo de modo que sea capaz de ponerse en contacto con/unirse a C5aR humano siempre que C5aR esté presente en la célula.

La expresión "concentración eficaz del 50 %" (abreviado como "CE50") representa la concentración de un anticuerpo de la invención que se requiere para un 50 % de un efecto dado de la molécula a la que se dirige el anticuerpo (por ejemplo, inhibición/desplazamiento de la unión de C5a humano a C5aR humano). Un experto en la técnica entenderá que un valor menor de CE50 se corresponde con un anticuerpo más potente.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "inhibición" se refiere a la reducción, y posiblemente la anulación por completo, de la actividad definida. Preferiblemente, la actividad definida se reduce en al menos un 50 %, más preferiblemente al menos un 75 % e incluso más preferiblemente al menos un 90 %.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "aproximadamente" se refiere a un intervalo de +1-5 % del valor especificado.

A lo largo de esta memoria descriptiva, la palabra "comprenden" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un elemento declarado, número entero o una etapa, o un grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas. En una realización, una molécula "consiste esencialmente en" la secuencia definida. En otra realización, una molécula "consiste en" la secuencia definida.

Anticuerpos anti-C5aR humanizados

El término inmunoglobulina se refiere a una clase de glicoproteínas relacionadas estructuralmente que consisten en dos parejas de cadenas polipeptídicas, una pareja de cadenas ligeras de bajo peso molecular (L) y una pareja de cadenas pesadas (H), las cuatro interconectadas por enlaces disulfuro. La estructura de las inmunoglobulinas ha sido bien caracterizada, véase por ejemplo Fundamental Immunology cap. 7 (Paul, W., compilador, 2ª ed. Raven Press, NY (1989)). Brevemente, cada cadena pesada normalmente se compone de una región variable de la cadena pesada (abreviada en este documento como VH) y una región constante de la cadena pesada (abreviada en este documento como CH). La región constante de la cadena pesada normalmente se compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta normalmente por una región variable de la cadena ligera (abreviada en este documento como VL) y una región constante de la cadena ligera (abreviada en este documento como CL). La región constante de la cadena ligera normalmente se compone de un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad (o regiones hipervariables que pueden ser hipervariables en la secuencia y/o en la forma de bucles definidos estructuralmente), también denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDRs), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FRs). Cada VH y VL se compone normalmente de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde el extremo amino-terminal al extremo carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (véase también Chothia y Lesk, 1987). Normalmente, la numeración de los residuos de aminoácidos en esta región se realiza por el método descrito en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (expresiones tales como numeración de los residuos del dominio variable, como en Kabat o de acuerdo con Kabat, se refieren en este documento a este sistema de numeración para dominios variables de la cadena pesada o dominios variables de la cadena ligera). Empleando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real de un péptido puede contener menos o más aminoácidos correspondientes a un acortamiento o a una inserción en una FR o CDR del dominio variable.

La expresión "anticuerpo humanizado", tal y como se emplea en esta memoria, se refiere en la presente memoria a un anticuerpo obtenido a partir de un anticuerpo no humano, normalmente murino, que conserva o conserva sustancialmente las propiedades de unión al antígeno del anticuerpo parental, pero que es menos inmunogénico en los seres humanos. Debido a que los anticuerpos de la invención se han definido por características estructurales y funcionales, la expresión "anticuerpo humanizado" se usa de manera intercambiable con "anticuerpo".

La expresión región determinante de la complementariedad (CDR), tal y como se usa en esta memoria, se refiere a secuencias de aminoácidos que definen conjuntamente la afinidad de la unión y la especificidad de una región de fragmento variable (Fv) de un sitio que se une a inmunoglobulina.

La expresión región marco (FR), tal y como se usa en esta memoria, se refiere a secuencias de aminoácidos interpuestas entre las CDRs. Estas porciones del anticuerpo sirven para mantener las CDRs en una orientación apropiada (permite que las CDRs se unan al antígeno). Una región variable, ya sea ligera o pesada, comprende un marco y normalmente tres CDRs.

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La expresión región constante (CR), tal y como se usa en esta memoria, se refiere a la porción de la molécula de anticuerpo que confiere funciones efectoras. Las regiones constantes de los anticuerpos humanizados objeto se obtienen a partir de inmunoglobulinas humanas. La región constante de la cadena pesada se puede seleccionar a partir de cualquiera de los cinco isotipos: alfa, delta, épsilon, gamma o mu. Además, las cadenas pesadas de diferentes subclases (tales como las subclases de IgG de las cadenas pesadas) son responsables de diferentes funciones efectoras y por lo tanto, con la elección de la región constante de la cadena pesada deseada, se pueden producir anticuerpos con una función efectora deseada. Las regiones constantes de la cadena pesada preferidas son gamma 1 (IgG1), gamma 2 (IgG2), gamma 3 (IgG3) y gamma 4 (IgG4), más preferiblemente gamma 4 (IgG4). Más preferida es una región cristalizable de un fragmento (Fc) del isotipo gamma 4 (IgG4) con mutaciones Ser228Pro (referida como mutación "P") y/o Leu235Glu (referida como mutación "E"). Las secuencias de la región constante de la cadena pesada particularmente preferidas se proporcionan como SEQ ID NOs 42 a 45. La región constante de la cadena ligera puede ser de tipo kappa o lambda, preferiblemente de tipo kappa. Las secuencias de la región constante de la cadena ligera particularmente preferidas se proporcionan como SEQ ID NOs 40 y 41.

En una realización preferida, una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina descrita en este documento se une directamente a una región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina descrita en este documento. Del mismo modo, en una realización preferida adicional, una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina descrita en este documento se une directamente a una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina descrita en este documento. Por lo tanto, el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos proporcionada como SEQ ID NO: 31 se puede unir directamente al extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos proporcionada como SEQ ID NO: 41, y el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos proporcionada como SEQ ID NO: 36 se une directamente al extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos proporcionada como SEQ ID NO: 45.

Un experto en la materia entenderá que las regiones variables y constantes de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina se pueden unir como se describe, mediante el uso de tecnología de ADN recombinante convencional para crear un polinucleótido (que codifica los dominios variables y constantes unidos) que se puede expresar en un hospedador adecuado (para producir dicha(s) cadena(s) de inmunoglobulina) o mediante el uso de la química de péptidos para la síntesis de los dominios variables y constantes unidos.

Los anticuerpos humanizados de la invención conservan una proporción significativa de las propiedades de unión del anticuerpo parental, es decir, el anticuerpo monoclonal denominado 7F3, producido por el hibridoma depositado el 6 de noviembre 2000 en la ECACC con el número de orden 00110609. En particular, los anticuerpos humanizados de la invención conservan la capacidad de unirse específicamente al antígeno reconocido por el anticuerpo parental utilizado para producir tal anticuerpo humanizado. Preferiblemente, el anticuerpo humanizado muestra la misma o sustancialmente la misma afinidad de unión al antígeno y la misma avidez que el anticuerpo parental. Idealmente, la afinidad (KD) del anticuerpo no será más de 10 veces superior a la afinidad del anticuerpo parental, más preferiblemente no más de aproximadamente 5 veces y más preferiblemente la afinidad no será más de tres veces superior a la del anticuerpo parental. Los métodos para someter a ensayo la afinidad de la unión al antígeno son bien conocidos en la técnica e incluyen ensayos de unión media-máxima, ensayos de competición y análisis de Scatchard. Ensayos de unión a antígeno adecuados se describen en esta solicitud (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3).

Como una persona experta apreciará, "avidez" se refiere a la fuerza total de la interacción entre dos moléculas, tales como un anticuerpo y antígeno. La avidez depende tanto de la afinidad como de la valencia de las interacciones. Además, "afinidad" se refiere a la fuerza de la unión entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y un ligando (por ejemplo, un antígeno). La afinidad de una molécula X hacia un ligando Y está representada por la constante de disociación (Kd), que es la concentración de Y que se requiere para ocupar los sitios de combinación de la mitad de las moléculas de X presentes en una solución. Una Kd más baja indica que se requiere una interacción de la afinidad más fuerte o más alta, y una menor concentración de ligando para ocupar los sitios.

La expresión "anticuerpo humanizado" o "anticuerpo" tal y como se usa en esta invención incluye moléculas intactas, así como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')2 y Fv, que son capaces de unirse al determinante epitópico. Estos fragmentos de anticuerpo conservan cierta capacidad para unirse selectivamente a C5aR humano, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, los siguientes:

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Fab, el fragmento que contiene un fragmento monovalente que se une a antígeno de una molécula de anticuerpo puede ser producido por digestión de un anticuerpo completo con la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una porción de cadena pesada;

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Fab', el fragmento de una molécula de anticuerpo se puede obtener tratando un anticuerpo completo con pepsina, seguido por reducción, para producir una cadena ligera intacta y una porción de cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo;

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(Fab')2, el fragmento del anticuerpo que se puede obtener tratando un anticuerpo completo con la enzima pepsina sin una reducción posterior; F(ab)2 es un dímero de dos fragmentos Fab' mantenidos juntos con dos

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nitrógeno y fosfato asimilables, y sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados, tales como vitaminas. Las células se pueden cultivar en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas de Petri. El cultivo se puede llevar a cabo a una temperatura, pH y contenido en oxígeno apropiados para una célula recombinante. Tales condiciones de cultivo están dentro de la pericia de un experto normal en la técnica.

Polinucleótidos y expresión de los mismos

Por "polinucleótido aislado", que incluye ADN, ARN o una combinación de estos, monocatenarios o bicatenarios, con una orientación sentido o antisentido o una combinación de ambas, ARNds o de otro modo, nos referimos a un polinucleótido que está al menos parcialmente separado de las secuencias de polinucleótidos con las que está asociado o ligado en su estado natural. Preferiblemente, el polinucleótido aislado está exento al menos en un 60 %, preferiblemente al menos en un 75 % y lo más preferiblemente en al menos un 90 % de otros componentes con los que está asociado de forma natural. Además, el término "polinucleótido" se emplea indistintamente en este documento con las expresiones "ácido nucleico" y "material genético".

El término "exógeno" en el contexto de un polinucleótido se refiere al polinucleótido cuando está presente en una célula, o en un sistema de expresión exento de células, en una cantidad alterada en comparación con su estado natural. La célula puede ser una célula que no comprende el polinucleótido de forma natural. Sin embargo, la célula puede ser una célula que comprende un polinucleótido no endógeno que da como resultado una cantidad alterada, aumentada preferiblemente, de la producción del polipéptido codificado. Un polinucleótido exógeno incluye polinucleótidos que no han sido separados de otros componentes de la célula transgénica (recombinante), o del sistema de expresión exento de células, en el que está presente, y los polinucleótidos producidos en tales células o sistemas exentos de células se purifican posteriormente apartados de al menos algunos otros componentes. El polinucleótido exógeno (ácido nucleico) puede ser un tramo contiguo de nucleótidos existentes en la naturaleza, o comprender dos o más tramos contiguos de nucleótidos de diferentes fuentes (que se producen en la naturaleza y/o sintéticos) unidos para formar un solo polinucleótido. Normalmente, tales polinucleótidos quiméricos comprenden al menos un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido ligado funcionalmente a un promotor adecuado para conducir la transcripción del marco de lectura abierto en una célula de interés.

El % de identidad de un polinucleótido se determina mediante el análisis GAP (Needleman y Wunsch, 1970) (programa GCG) con una penalización por creación de hueco = 5, y una penalización por extensión de hueco = 0,3. A menos que se indique lo contrario, la secuencia de consulta tiene al menos 45 nucleótidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 45 nucleótidos. Preferiblemente, la secuencia de consulta tiene al menos 100 nucleótidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 100 nucleótidos. Más preferiblemente, las dos secuencias se alinean a lo largo de toda su longitud.

En cuanto a los polinucleótidos definidos, se apreciará que cifras del % de identidad superiores a las previstas anteriormente, abarcarán realizaciones preferidas. Por lo tanto, en su caso, a la luz de las cifras del % de identidad mínimo, se prefiere que un polinucleótido comprenda una secuencia que tiene al menos 91 %, más preferiblemente al menos 92 %, más preferiblemente al menos 93 %, más preferiblemente al menos 94 %, más preferiblemente al menos 95 %, más preferiblemente al menos 96 %, más preferiblemente al menos 97 %, más preferiblemente al menos 98 %, más preferiblemente al menos 99 %, más preferiblemente al menos 99,1 %, más preferiblemente al menos 99,2 %, más preferiblemente al menos 99,3 %, más preferiblemente al menos 99,4 %, más preferiblemente al menos 99,5 %, más preferiblemente al menos 99,6 %, más preferiblemente al menos 99,7 %, más preferiblemente al menos 99,8 %, e incluso más preferiblemente al menos 99,9 % de identidad con la SEQ ID NO nombrada relevante.

La expresión "condiciones de hibridación rigurosas" o "condiciones rigurosas" y similares, tal y como se emplea en esta memoria, se refiere a parámetros con los que está familiarizada la técnica, que incluyen la variación de la temperatura de hibridación con la longitud de un polinucleótido u oligonucleótido. Los parámetros de la hibridación de ácidos nucleicos se pueden encontrar en referencias que recopilan tales métodos, Sambrook, et al., (supra) y Ausubel, et al., (supra). Por ejemplo, unas condiciones de hibridación rigurosas, tal y como se emplean en esta memoria, se pueden referir a la hibridación a 65°C en tampón de hibridación (3,5xSSC, 0,02 % de Ficoll, 0,02 % de polivinilpirrolidona, 0,02 % de albúmina de suero bovino, NaH2PO4 2,5 mM (pH 7), 0,5 % de SDS, EDTA 2 mM) y el lavado dos veces en 0,2 x SSC, 0,1 % de SDS a 65°C, siendo la duración de cada etapa de lavado de aproximadamente 30 min.

Los anticuerpos y las cadenas de inmunoglobulina se producen normalmente mediante expresión recombinante. Los ácidos nucleicos que codifican regiones variables de la cadena ligera y pesada, opcionalmente ligadas a regiones constantes, se insertan en vectores de expresión. Las cadenas ligera y pesada se pueden clonar en el mismo o en diferentes vectores de expresión. Los segmentos de ADN que codifican las cadenas de inmunoglobulina están ligados funcionalmente a secuencias de control en el(los) vector(es) de expresión lo que asegura la expresión de los polipéptidos de inmunoglobulina. Las secuencias de control de la expresión incluyen, pero no se limitan a, promotores (por ejemplo, promotores asociados naturalmente o heterólogos), secuencias señal, elementos potenciadores y secuencias de terminación de la transcripción. Preferiblemente, las secuencias de control de la expresión son sistemas de promotores eucariotas en vectores, capaces de transformar o transfectar células hospedadoras eucariotas. Una vez que el vector se ha incorporado en el hospedador apropiado, el hospedador se

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mantiene en condiciones adecuadas para una expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótidos, y la recogida y la purificación de los anticuerpos y/o las cadenas de inmunoglobulina.

Estos vectores de expresión se pueden replicar normalmente en las células hospedadoras ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico del hospedador. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección (por ejemplo, resistencia a la ampicilina, resistencia a la higromicina, resistencia a la tetraciclina, resistencia a la neomicina, resistencia a G418, DHFR (dihidrofolato reductasa), ADA (adenosina desaminasa), GS (glutamina sintetasa)) para permitir la detección de las células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (véase, por ejemplo, el documento EE.UU. 4.704.362).

E. coli es un hospedador procariota particularmente útil para clonar los polinucleótidos (por ejemplo, secuencias de ADN). Otros hospedadores microbianos adecuados para uso incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacterias, tales como Salmonella, Serratia, y varias especies de Pseudomonas. En estos hospedadores procariotas, también se pueden preparar vectores de expresión, que normalmente contendrán secuencias de control de la expresión compatibles con la célula hospedadora (por ejemplo, un origen de replicación). Además, estará presente cualquier cantidad entre una variedad de promotores bien conocidos, como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de beta-lactamasa, un promotor T7 o un sistema promotor del fago lambda. Los promotores controlarán normalmente la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tienen secuencias con sitio de unión al ribosoma y similares, para iniciar y completar la transcripción y la traducción.

Otros microbios, tales como la levadura, también son útiles para la expresión. Saccharomyces es un hospedador de levadura preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de la expresión (por ejemplo, promotores), un origen de replicación, secuencias de terminación y similares como se desee. Los promotores típicos incluyen 3-fosfoglicerato cinasa y otras enzimas glucolíticas. Los promotores inducibles de levadura incluyen, entre otros, promotores de la alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Otro ejemplo de levadura útil para la expresión es Pichia pastoris.

Además de los microorganismos, el cultivo de células de tejidos de mamíferos también se puede utilizar para expresar y producir los anticuerpos y/o las cadenas de inmunoglobulina (por ejemplo, polinucleótidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas) (véase, Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY, NY (1987)). Las células eucariotas se prefieren realmente, porque se ha desarrollado en la técnica una serie de líneas de células hospedadoras adecuadas, capaces de secretar proteínas heterólogas (por ejemplo, inmunoglobulinas intactas), e incluyen líneas de células CHO, diversas líneas celulares COS, células NSO, células HEK293, células PerC6, células HeLa, preferiblemente, líneas celulares de mieloma o linfocitos B transformados o hibridomas. Preferiblemente, las células no son humanas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor y un potenciador (Queen et al., 1986), y sitios de información necesarios para el procesamiento, tales como sitios de unión al ribosoma, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Las secuencias de control de la expresión preferidas son promotores obtenidos a partir de genes de inmunoglobulina, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino, citomegalovirus y similares (véase, Co et al., 1992).

Alternativamente, las secuencias que codifican anticuerpos se pueden incorporar en transgenes para la introducción en el genoma de un animal transgénico y la expresión posterior en la leche del animal transgénico (véanse, por ejemplo, los documentos EE.UU. 5.741.957, EE.UU. 5.304.489 y EE.UU. 5.849.992). Los transgenes adecuados incluyen secuencias codificadoras de las cadenas ligeras y/o pesadas ligadas funcionalmente con un promotor y un potenciador procedentes de un gen específico de la glándula mamaria, tal como caseína o beta lactoglobulina.

Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés (por ejemplo, las secuencias que codifican la cadena pesada y ligera y las secuencias de control de la expresión) se pueden transferir a la célula hospedadora mediante métodos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de hospedador celular. Por ejemplo, la transfección de cloruro de calcio se utiliza comúnmente para células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio, electroporación, lipofección, biolística o la transfección basada en virus se puede utilizar para otros hospedadores celulares (véase en general Sambrook et al., supra). Otros métodos utilizados para transformar células de mamífero incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplastos, liposomas, electroporación y microinyección. Para la producción de animales transgénicos, los transgenes se pueden microinyectar en oocitos fertilizados, o se pueden incorporar en el genoma de células madre embrionarias, y los núcleos de tales células se transfieren a oocitos desnucleados.

Cuando las cadenas pesada y ligera se clonan en vectores de expresión distintos, los vectores se cotransfectan para obtener una expresión y un ensamblaje de inmunoglobulinas intactas. Una vez expresados, los anticuerpos completos, sus dímeros, las cadenas ligeras y pesadas individuales, u otras formas de inmunoglobulinas, se pueden purificar de acuerdo con procedimientos convencionales de la técnica, que incluyen la precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, purificación por HPLC, electroforesis en gel y similares (véase, en general Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, (1982)).

Modelos de Inflamación

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Los modelos de inflamación in vivo están disponibles, los cuales se pueden utilizar para evaluar los efectos de los anticuerpos in vivo como agentes terapéuticos. Por ejemplo, se puede supervisar la infiltración de leucocitos después de una inyección intradérmica de una quimiocina y un anticuerpo reactivo con C5aR en un animal adecuado, tal como conejo, ratón, rata, cobaya o macaco Rhesus (véase, por ejemplo, Van Damme et al., 1992; Zachariae et al., 1990; Jose et al., 1994).

Las biopsias de piel se evalúan histológicamente para estudiar la infiltración de leucocitos (por ejemplo, eosinófilos, granulocitos). Las células marcadas (por ejemplo, células transfectadas de forma estable que expresan C5aR) capaces de una quimiotaxis y extravasación, se pueden administrar al animal. Un anticuerpo que se va a evaluar, se puede administrar, ya sea antes, simultáneamente o después de que las células marcadas se administren al animal del ensayo. Una disminución del grado de infiltración en presencia de anticuerpo, en comparación con el grado de infiltración en ausencia de inhibidor, es indicativa de inhibición.

Usos

Los anticuerpos son útiles en una variedad de aplicaciones, que incluyen la investigación, el diagnóstico y las aplicaciones terapéuticas.

C5aR tiene un papel importante en el tráfico de leucocitos. C5aR es un receptor quimioatrayente para las células del sistema inmune innato, que incluyen neutrófilos, eosinófilos, mastocitos, macrófagos, células dendríticas, monocitos y microglía, y también se pueden utilizar anticuerpos anti-C5aR para inhibir (reducir o evitar) la migración de leucocitos, en particular la asociada con una lesión de los tejidos con neutrófilos, tal como una lesión por reperfusión y accidente cerebrovascular, o con trastornos mediados con monocitos tales como la aterosclerosis.

Los anticuerpos descritos en este documento pueden actuar como inhibidores para inhibir (que puede ser reduciendo o previniendo) (a) la unión (por ejemplo, de un ligando, un inhibidor) al receptor, (b) la función de señalización de un receptor, y/o (c) una función estimuladora. Los anticuerpos que actúan como inhibidores de la función del receptor pueden bloquear la unión de un ligando de forma directa o indirecta (por ejemplo, provocando un cambio conformacional). Por ejemplo, los anticuerpos pueden inhibir la función del receptor inhibiendo la unión de un ligando, o mediante desensibilización (con o sin inhibición de la unión de un ligando).

En la presente memoria, un "trastorno" es una interrupción o una interferencia de la función normal.

En una realización, el trastorno es un trastorno inmunopatológico.

La inmunopatología es el estudio de una enfermedad que tiene una causa inmunológica y una enfermedad inmunológica es cualquier alteración causada por las reacciones de anticuerpos con antígenos. Por lo tanto, un "trastorno inmunopatológico" se puede definir como un trastorno que surge de la reacción de anticuerpos con antígenos -este incluye enfermedades autoinmunes y respuestas de hipersensibilidad (por ejemplo, de Tipo I: anafilaxis, urticaria, alergias alimentarias, asma; de Tipo II: anemia hemolítica autoinmune, reacciones a transfusiones sanguíneas; de Tipo III: enfermedad del suero, vasculitis necrotizante, glomerulonefritis, artritis reumatoide, lupus; de Tipo IV: dermatitis de contacto, rechazo de injerto).

Una enfermedad autoinmune surge cuando el sistema inmune falla en la eliminación de los linfocitos autoreaccionantes durante el desarrollo y un fallo posterior de la regulación conduce a la activación de clones de linfocitos T o B autoreaccionantes, generando respuestas humorales o mediadas por células contra antígenos propios, lo que causa graves daños a las células y órganos.

En otra realización, el trastorno es una enfermedad inflamatoria.

La inflamación es una respuesta protectora de los tejidos corporales frente a una irritación o lesión -y puede ser aguda o crónica. Por tanto, los trastornos inflamatorios incluyen enfermedades que implican neutrófilos, monocitos, mastocitos, basófilos, eosinófilos, macrófagos en donde se produce una liberación de citocinas, liberación de histaminas, estallido oxidativo, fagocitosis, liberación de otras enzimas granulares y quimiotaxis. Las respuestas de hipersensibilidad (definidas anteriormente en trastornos inmunopatológicos) también se pueden considerar como enfermedades inflamatorias (agudas o crónicas), ya que implican frecuentemente la activación del complemento y el reclutamiento/infiltración de diversos leucocitos tales como neutrófilos, mastocitos, basófilos, etc.

Por ello, los trastornos de seres humanos o de otras especies que se pueden tratar o prevenir empleando la invención incluyen, pero no se limitan a:

i) trastornos relacionados con la migración de leucocitos y/o la activación de leucocitos, tales como isquemia/lesión por reperfusión, lesión por reperfusión, accidente cerebrovascular, síndrome de dificultad respiratoria del adulto (ARDS), asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), aterosclerosis, artritis reumatoide, psoriasis, rechazo de injerto, cánceres con infiltración de leucocitos de la piel u órganos, penfigoide bulloso, síndrome antifosfolipídico (SAF);

ii) inflamación aguda, tal como el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), choque séptico,

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vivo incluyen células sanguíneas, ya que estas células son fácilmente accesibles para la manipulación e introducción de nuevo en el sujeto por métodos bien conocidos en la técnica.

La transferencia de genes a través de la transfección de células ex vivo se puede realizar por una variedad de métodos, que incluyen, por ejemplo, precipitación con fosfato de calcio, dietilaminoetil dextrano, electroporación, lipofección o infección vírica. Tales métodos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbour Laboratory Press (1989)). Una vez que las células se han transfectado, a continuación se trasplantan o se injertan en un sujeto que se va a tratar. Las células, una vez introducidas en el cuerpo, pueden producir el anticuerpo que puede entrar en la circulación e inhibir la agregación plaquetaria en el sitio de la enfermedad o la afección.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 -Proceso de humanización

Definición de CDR y residuos estructurales

Las regiones CDRs y marco de un anticuerpo, por lo general se han definido de acuerdo con diversos esquemas de numeración tales como Kabat, Chothia o IMGT (ImMunoGeneTics information system® http://imgt.cines.fr). La definición de Kabat se basa en la variabilidad de las secuencias y es la empleada más comúnmente. Sin embargo, las CDRs de un anticuerpo dado tal como se definen por Kabat no son necesariamente idénticas a las CDRs definidas por los otros sistemas de numeración. Las CDRs definidas por dos sistemas de numeración se pueden superponer, o una se puede extender unos pocos residuos a ambos lados de la otra.

Los inventores han utilizado una combinación de los sistemas de numeración de Kabat e IMGT para definir las CDRs y las regiones marco en el dominio (V) variable. Los inventores querían maximizar la extensión de las secuencias de CDRs de ratón que se injertaron en el marco humano con el fin de preservar la estructura del sitio de unión al antígeno. Por lo tanto, las CDRs del anticuerpo de C5aR incluyen todos los residuos clasificados como CDR por los sistemas de numeración de Kabat e IMGT. Las secuencias restantes comprendían el marco del dominio V.

Selección de secuencias marco de anticuerpos humanos adecuados

Para seleccionar secuencias marco de anticuerpos humanos adecuados en las que se injertaban las CDRs de ratón, los inventores utilizaron una serie de estrategias:

i) Búsquedas Blast en bases de datos de secuencias identificaron secuencias de la cadena ligera y pesada de la región V de Ig humana con la mayor homología con anticuerpos de C5aR de ratón. Las secuencias con mayor homología se alinearon y se generaron secuencias marco de consenso para las cadenas ligeras y pesadas.

ii) Anticuerpos humanos conocidos con alta homología con una cadena ligera o pesada del anticuerpo de C5aR de ratón, se identificaron y se empleó el marco de la región V (o una versión modificada) para injertar las CDRs de anticuerpos de C5aR de ratón.

iii) Otros anticuerpos humanizados con éxito que empleaban secuencias marco similares a los anticuerpos de C5aR de ratón, se identificaron y las CDRs de ratón se injertaron en estos marcos.

Selección de anticuerpos homólogos a partir de las bases de datos de secuencias

El anticuerpo de C5aR de ratón, secuencias de aminoácidos de la región variable de 7F3 (ambas cadenas pesadas y ligeras, véanse SEQ ID NOs 1 y 2) se utilizaron individualmente como secuencia de consulta en las búsquedas Blastp de las secuencias de inmunoglobulina humana en las bases de datos SWISSPROT y GenBank.

Las secuencias de ADN de la región variable de 7F3 de ratón (que codificaban tanto las cadenas pesadas como las ligeras, véanse las SEQ ID NOs 3 y 4) se utilizaron individualmente como secuencia de consulta en búsquedas Blast de la base de datos IMGT, de genes de inmunoglobulina humana.

Una lista de las secuencias con la mayor homología con la secuencia de consulta se generó a partir de cada búsqueda (Tablas 2 y 3).

Tabla 2: Secuencias humanas homólogas a mAb de C5aR de ratón de la cadena ligera variable

Consulta

Base de datos ID de la secuencia Descripción imagen13 Puntuación

aminoácido de Vk de 7F3 de ratón

SIWSS_PROT KV2F HUMAN Cadena kappa de Ig RPMI6410 V-II: 181,0

KV2D HUMAN

Cadena kappa de Ig V-II: 181,0

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Consulta Base de datos

ID de la secuencia Descripción Puntuación

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TEW imagen15

KV2E HUMAN

Cadena kappa de Ig V-II: GM607 176,0

KV2B HUMAN

Cadena kappa de Ig V-II: FR 173,0

KV2A HUMAN

Cadena kappa de Ig V-II: CUM 169,0

KV2C HUMAN

Cadena kappa de Ig V-II: MIL 166,0

KV4C HUMAN

Cadena kappa de Ig V-IV: B17 150,0

KV4A HUMAN

Cadena kappa de Ig V-IV: LEN 150,0

KV4B HUMAN

Cadena kappa de Ig V-IV: JI 148,0

KV3D HUMAN

Cadena kappa de Ig V-III: TI 138,0

ADN de Vk de 7F3 de ratón

genes V de Ig humana de IMGT U416644 IGKV2D-29*02 993

M31952

IGKV2D-29*01 984

X63396

IGKV2-29*01 984

U41645

IGKV2-29*02 975

X12691

IGKV2D-28*02 975

Secuencia marco de consenso -Cadena ligera de 7F3

Una secuencia de consenso marco humana de la cadena ligera para injertar las CDRs de la cadena ligera de 7F3, se generó usando ClustalW alineando las siguientes secuencias de la Tabla 2: KV2F_HUMAN, KV2D_HUMAN, KV2E_HUMAN, KV2B_HUMAN, KV2A_HUMAN y la traducción en aminoácidos de las secuencias de ADN X12691, U41645, U41644, M31952. Esta alineación y la secuencia de consenso se muestran en la Figura 1. El marco de consenso humano era 86 % idéntico a la secuencia marco de la cadena ligera de 7F3 del anticuerpo de C5aR murino.

Tabla 3: Secuencias humanas homólogas a la cadena pesada variable del mAb de C5aR de ratón

Consulta

Base de datos ID de la secuencia Descripción Puntuación

Aminoácido de Vh de 7F3 de ratón (región del gen V)

SWISS_PROT HV1C HUMAN Cadena pesada de Ig V-I: ND 142,0

HV1B HUMAN

Cadena pesada de Ig VI: HG3 138,0

HV1G HUMAN

Cadena pesada de Ig VI: V35 134,0

HV3J HUMAN

Cadena pesada de Ig V-III: HIL 130,0

HV1A HUMAN

Cadena pesada de Ig VI: EU 127,0

HV3G HUMAN

Cadena pesada de Ig V-III: CAM 123,0

HV3K HUMAN

Cadena pesada de Ig V-III: KOL 122,0

21

Consulta

Base de datos ID de la secuencia Descripción Puntuación

HV3H HUMAN

Cadena pesada de Ig V-III: GA 122,0

HV1H HUMAN

Cadena pesada de Ig VI: DOT 120,0

HV1F HUMAN

Cadena pesada de Ig VI: MOT 120,0

Aminoácido de Vh de 7F3 de ratón (región del gen J)

SWISS-PROT HV3K HUMAN Cadena pesada de Ig V-III: KOL 29,0

HV2I HUMAN

Cadena pesada de Ig V-II: ARH-77 28,2

HV1C HUMAN

Cadena pesada de Ig VI: ND 28,2

HV3T HUMAN

Cadena pesada de Ig V-III: GAL 27,8

HV3H HUMAN

Cadena pesada de Ig V-III: GA 27,8

ADN de Vk de 7F3 de ratón (región del gen V)

genes V de Ig humana de IMGT Z12305 IGHV1-f*01 777

M99642

IGHV1-24*01 768

L06612

IGHV1-46*03 750

J00240

IGHV1-46*02 750

X92343

IGHV1-46*01 750

Secuencia marco de consenso -cadena pesada de 7F3

Una secuencia marco humana de consenso para injertar las CDRs de la cadena pesada de 7F3, se generó del modo siguiente:

5 a) secuencias de aminoácidos de la región V, HV1C_HUMAN, HV1B_HUMAN, HV1G_HUMAN y HV1A_HUMAN y las traducciones en aminoácidos de las secuencias de los genes V, X92343, X62109, M99641, M99642 y Z12305 se alinearon utilizando CLUSTALW para generar una secuencia marco de la región V de consenso.

b) secuencias de aminoácidos de la región J, HV3K_HUMAN, HV2I_HUMAN, HV1C_HUMAN, 10 HV3H_HUMAN y HV3T_HUMAN se alinearon utilizando CLUSTALW para generar la secuencia marco de la región J de consenso.

Estas alineaciones y las secuencias de consenso se muestran en la Figura 2.

Selección de anticuerpos humanizados homólogos

Otras secuencias marco adecuadas se seleccionaron mediante una búsqueda en publicaciones de anticuerpos 15 humanizados con éxito con la mayor coincidencia con las secuencias de anticuerpos murinos.

Se identificaron dos secuencias marco de la cadena ligera para injertar las CDRs de la cadena ligera de 7F3:

 Secuencia basada en KV2F descrita en Caldas et al. (2003).

 Secuencia basada en HuVL-19 descrita en Nisihara et al. (2001).

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(nucleósidos alfa-MEM menos y 5 % de FBS dializado). Después de 2 días, las células adherentes se volvieron a sembrar en placas de cultivo tisular de 96 pocillos con una densidad promedio de ~2-5 células por pocillo. Después de 2 -3 semanas de crecimiento, se midió la producción de anticuerpos usando un ELISA específico de IgG humana. Las células que expresaban anticuerpos se expandieron en frascos T para la producción. El medio de

5 cultivo se recogió y el anticuerpo se purificó tal y como se describe a continuación. Los vectores de expresión del sistema GS se transfectaron en células CHOK1SV y líneas celulares secretoras de anticuerpos aisladas y expandidas para la producción, según lo recomendado por el fabricante (Lonza).

Purificación del anticuerpo humanizado

Las células transfectadas secretan anticuerpo en el medio de crecimiento. El anticuerpo se purificó mediante

10 cromatografía de afinidad hacia la proteína A o la proteína G. Las fracciones que contenían el anticuerpo, identificadas por SDS-PAGE o por ELISA específico de IgG humana, se agruparon. Un ELISA específico de IgG humana se utilizó para determinar la cantidad de anticuerpo recuperado y su concentración. La pureza del anticuerpo se estimó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.

Lista de anticuerpos humanizados producidos y sometidos a ensayo.

15 La Tabla 4 presenta los diferentes anticuerpos producidos, mostrando las secuencias de la cadena pesada y ligera presentes en el anticuerpo.

Tabla 4: Anticuerpos humanizados producidos

Anticuerpo

Cadena ligera Cadena pesada

hAb

Variable (V) Constante Variable (V) Constante

A

7Vk hCκ-R 7VH hCγ4

B

7aVk hCκ-R 7VH hCγ4

C

7bVk hCκ-R 7VH hCγ4

D

7Vk hCκ-R 7VH hCγ4PE

E

7aVk hCκ-R 7VH hCγ4PE

F

7bVk hCκ-R 7VH hCγ4PE

G

7Vk hCκ-R 7aVh hCγ4PE

H

7aVk hCκ-R 7aVh hCγ4PE

I

7bVk hCκ-R 7aVh hCγ4PE

J

7Vk hCκ-R 7bVh hCγ4PE

K

7aVk hCκ-R 7bVh hCγ4PE

L

7bVk hCκ-R 7bVh hCγ4PE

M

7Vk hCκ-R 7aVh hCγ4

N

7Vk hCκ-R 7aVh hCγ1

O

7bVk hCκ-R 7VH hCγ1

P

7Vk hCκ 7bVh hCγ1

Q

7Vk hCκ 7bVh hCγ4P

R

7Vk hCκ 7aVh hCγ4P

S

7Vk hCκ 7bVh hCγ4PE

T

7Vk hCκ 7aVh hCγ4PE

U

7Vk hCκ 7aVh hCγ1

V

7Vk hCκ 7aVh hCγ4P

Ejemplo 3 -Estudios de unión con anticuerpos anti-C5aR humanizados.

20 Para caracterizar la cinética de la unión de los anticuerpos anti-C5aR humanizados con el receptor de C5a humano (hC5aR), en este ejemplo se describen dos tipos de estudios de unión. El primero comparaba la unión de los

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Claims (1)

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