JP6034826B2 - ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、ヒトＣ５ａ受容体に結合するヒト化抗体ならびに治療薬および診断薬として
のその使用を対象とする。本発明はさらに、前記ヒト化抗体をコードする核酸配列および
組換え宿主細胞におけるその発現を対象とする。特に、本発明は、ヒトＣ５ａ受容体に特
異的に結合するマウス抗体７Ｆ３に由来するヒト化抗体を対象とする。
補体タンパク質Ｃ３〜Ｃ５はそれぞれタンパク質分解されると、アナフィラトキシンと
呼ばれるシグナル伝達分子を有するアミノ末端カチオン性断片が生じる。これらの中で最
も強力であるＣ５ａは、最も広範な応答を誘発する。白血球の辺縁趨向および浸潤、顆粒
結合性タンパク質分解酵素の放出、活性化酸素および窒素由来ラジカルの生成、血流およ
び毛細管漏出の変化、ならびに平滑筋の収縮能力などの炎症反応の要素を考慮すると、Ｃ
５ａ分子は「完全な」前炎症性メディエータである。ナノモル以下からナノモルのレベル
では、Ｃ５ａ分子は、すべての骨髄細胞系列（好中球、好酸球および好塩基球、マクロフ
ァージおよび単球）の走化性を誘発し、プロスタグランジンによって著しく増強される血
管透過性および白血球循環を引き起こす。より高いナノモル濃度では、脱顆粒およびＮＡ
ＤＰＨオキシダーゼの活性化が誘発される。生物活性のこの幅は、他の炎症性メディエー
タとは対照的である。Ｃ５ａは、関節リウマチ、乾癬、敗血症、再潅流傷害および成人呼
吸窮迫症候群を含めた様々な発病に関与するとされている（ＧｅｒａｒｄおよびＧｅｒａ
ｒｄ、１９９４；ＭｕｒｄｏｃｈおよびＦｉｎｎ、２０００）。
Ｃ５ａの活性は、Ｃ５ａがその受容体（Ｃ５ａＲ）に結合することによって媒介される
。Ｃ５ａＲは、７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体のファミリーに属する。Ｃ５ａＲは
、約１ｎＭのＫｄを有する、Ｃ５ａの高アフィニティー受容体であり、白血球を含めたい
くつもの様々な細胞型に位置する。細胞当たりの受容体数は極めて多く、白血球当たり最
大２００，０００部位である。受容体の生物学的活性化は、結合が飽和する範囲を上回っ
た場合に起こる。
Ｃ５ａＲ構造は、７回膜貫通型の受容体ファミリーに従い、細胞外Ｎ末端を有し、その
後に細胞内ループおよび細胞外ループとして交互に並ぶヘリックス間ドメインでつながれ
た７回膜貫通ヘリックスが続き、細胞内Ｃ末端ドメインで終結する。Ｃ５ａＲは、伸長し
たＮ末端細胞外ドメインを含む。この大きなＮ末端ドメインは、ＩＬ−８およびｆＭｅｔ
−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ＦＭＬＰ）受容体ファミリーを含めた、ペプチドと結合するＧタンパ
ク質共役受容体に典型的である。
Ｃ５ａＲアンタゴニストによってＣ５ａ応答が阻害されると、他の補体成分に影響を及
ぼすことなくＣ５ａを介して媒介される急性炎症反応が低減する。この目的のために、Ｃ
５ａＲペプチドアンタゴニストおよび抗Ｃ５ａ受容体抗体が以前に報告されている（Ｗａ
ｔａｎａｂｅら、１９９５；Ｐｅｌｌａｓら、１９９８；Ｋｏｎｔｅａｔｉｓら、１９９
４；Ｋａｎｅｋｏら、１９９５；Ｍｏｒｇａｎら、１９９３）。例えば、ＷＯ９５／００
１６４には、Ｃ５ａＲのＮ末端ペプチド（残基９〜２９）に対する抗体が記載されている
。
また、ＷＯ０３／０６２２７８にはＣ５ａＲに対する抗体が記載されている。こうした
マウス抗体のうち３つは、７Ｆ３、６Ｃ１２および１２Ｄ４と呼んだ。こうした抗体は、
Ｃ５ａとその受容体の結合を遮断し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣ５ａによって誘導される好
中球の遊走を停止し、動物モデルにおける炎症を抑える点で極めて有効であることなど、
優れた特性を有することが示された。慢性疾患を制御するためには、この抗体を数カ月ま
たは数年にわたり継続的に投与することが必要である可能性がある。しかし、マウス抗体
を投与することの１つの欠点は、ヒト免疫系が、マウス抗体に対してそれ自体の抗体を生
成し得ること（ＨＡＭＡ応答）である。ＨＡＭＡ応答は、血液からマウス抗体を迅速に除
去することによってマウス抗体を中和する可能性があり、したがってマウス抗体のその標
的への結合が阻止される。
ＨＡＭＡ応答の発生を回避するために、採用されている１つの戦略は、非エピトープ結
合領域中の多くの「外来性」残基をヒト配列で置き換えることにより、マウス抗体を「ヒ
ト化」することである。しかし、このプロセスは抗原性の喪失をもたらすことが多い。さ
らに、抗体をヒト化する技術分野の研究者らは、ヒトの療法において使用するためのすべ
ての必要要件を有するヒト化抗体を確実に産生するための適切なガイドラインを特徴付け
ることに取り組んだ。
ヒト化手順の主要な問題は、抗原に対するアフィニティーの喪失であり（Ｊｏｎｅｓら
、１９８６）、ある例では、抗原がタンパク質である場合は特に１０分の１以下である（
Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８）。当然、いかなるアフィニティーの喪失も極めて望ま
しくない。少なくとも、それは、いっそう多くのヒト化抗体を患者に注射しなければなら
ず、費用がさらにかかり、有害作用のリスクが高まることを意味する。さらに重要なこと
には、アフィニティーが低減された抗体は、補体溶解、抗体依存性細胞傷害またはウイル
ス中和などの生物学的機能に劣る可能性がある。したがって、ヒト化に基づく治療用途ま
たは診断用途に有用である決定的な抗体の構造は現在予測できず、有用なヒト化抗体を得
るためには、何回かの反復といくつかの技法の使用が必要とされることが多い。
診断方法および／または治療方法に使用することができる、代替および／または改良の
Ｃ５ａＲアンタゴニストが必要とされている。特に、ヒトにおける前記診断方法および／
または治療方法に適したヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体の開発が必要とされている。
Ｃ５ａＲに結合するが、劣った結合特異性および／または他の望ましくない特徴を有す
る多数のヒト化抗体が作製されている。しかし、本発明者らは、ヒトにおける診断方法お
よび／または治療方法に使用するのに適した活性を有する関連のヒト化抗体をいくつか作
製した。
第１の態様において、本発明は、
ｉ）配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号４８の１つまたは複数
と少なくとも９３％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖、
および／または
ｉｉ）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３９の１つまたは複
数と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン重鎖
を含み、ヒトＣ５ａＲに結合する、実質的に精製された、かつ／または組換えのヒト化抗
体を提供する。
好ましい実施形態において、免疫グロブリン重鎖は、配列番号３４、配列番号３５およ
び配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変領域を含む。より好ま
しくは、免疫グロブリン重鎖は、配列番号３６として示されるアミノ酸配列を含む可変領
域を含む。
別の好ましい実施形態において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３１、配列番号３２
および配列番号３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変領域を含む。より
好ましくは、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３１として示されるアミノ酸配列を含む可
変領域を含む。
特に好ましい実施形態において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３１として示される
アミノ酸配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号３６として示され
るアミノ酸配列を含む可変領域を含む。好ましくは、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４
１として示されるアミノ酸配列を含む定常領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号
４２、配列番号４３、配列番号４４または配列番号４５として示されるアミノ酸配列を含
む定常領域を含む。より好ましくは、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４１として示され
るアミノ酸配列を含む定常領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号４３または配列
番号４５、より好ましくは配列番号４５として示されるアミノ酸配列を含む定常領域を含
む。
一実施形態において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３１として示されるアミノ酸配
列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号３４として示されるアミノ酸
配列を含む可変領域を含む。好ましくは、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４１として示
されるアミノ酸配列を含む定常領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号４２または
配列番号４３として示されるアミノ酸配列を含む定常領域を含む。
別の実施形態において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３２として示されるアミノ酸
配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号３４として示されるアミノ
酸配列を含む可変領域を含む。好ましくは、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４１として
示されるアミノ酸配列を含む定常領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号４２また
は配列番号４３として示されるアミノ酸配列を含む定常領域を含む。
さらなる実施形態において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３３として示されるアミ
ノ酸配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号３４として示されるア
ミノ酸配列を含む可変領域を含む。好ましくは、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４１と
して示されるアミノ酸配列を含む定常領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号４２
、配列番号４３または配列番号４４として示されるアミノ酸配列を含む定常領域を含む。
別の実施形態において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３３として示されるアミノ酸
配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号３４として示されるアミノ
酸配列を含む可変領域を含む。好ましくは、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４１として
示されるアミノ酸配列を含む定常領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号４２、配
列番号４３、配列番号４４または配列番号４５として示されるアミノ酸配列を含む定常領
域を含む。
別の実施形態において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３１として示されるアミノ酸
配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号３５として示されるアミノ
酸配列を含む可変領域を含む。好ましくは、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４１として
示されるアミノ酸配列を含む定常領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号４３とし
て示されるアミノ酸配列を含む定常領域を含む。
さらなる実施形態において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３３として示されるアミ
ノ酸配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号３５として示されるア
ミノ酸配列を含む可変領域を含む。好ましくは、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４１と
して示されるアミノ酸配列を含む定常領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号４３
として示されるアミノ酸配列を含む定常領域を含む。
別の実施形態において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３２として示されるアミノ酸
配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号３６として示されるアミノ
酸配列を含む可変領域を含む。好ましくは、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４１として
示されるアミノ酸配列を含む定常領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号４３とし
て示されるアミノ酸配列を含む定常領域を含む。
さらなる実施形態において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３３として示されるアミ
ノ酸配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号３６として示されるア
ミノ酸配列を含む可変領域を含む。好ましくは、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４１と
して示されるアミノ酸配列を含む定常領域を含み、免疫グロブリン重鎖は、配列番号４３
として示されるアミノ酸配列を含む定常領域を含む。
好ましい実施形態において、抗体は、ヒトＣ５ａＲの第２細胞外ループにあるエピトー
プＥＥＹＦＰＰ（配列番号３８）に結合する。さらなる実施形態において、抗体は、ヒト
Ｃ５ａＲのＮ末端にあるエピトープＰＤＹＧＨＹＤＤＫＤＴＬＤＬＮＴＰＶＤＫＴ（配列
番号５９）に検出可能に結合しない。
好ましい実施形態において、抗体は、ヒトＣ５ａＲに７Ｆ３の少なくとも８倍以内、よ
り好ましくは７Ｆ３の少なくとも４倍以内、さらに好ましくは７Ｆ３の少なくとも３倍以
内のアフィニティーで結合する。
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＣ５ａＲを発現するヒト好中球に対
して４．５ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。代替の実施形態において、本発明の抗体は、３
ｎＭ未満、２ｎＭ未満または１ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。Ｃ５ａＲを発現するヒト好
中球に対する抗体のＥＣ５０は、実施例３に記載のとおり決定することができる。
別の実施形態において、本発明の抗体は、ヒト好中球遊走を少なくとも４０％、より好
ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくと
も７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％低減することができる。さらなる実施形態
において、本発明の抗体は、Ｃ５ａＲによって誘発されるヒト好中球遊走を遮断する能力
が７Ｆ３よりも高い、好ましくは７Ｆ３の少なくとも２倍、さらに好ましくは７Ｆ３の５
倍である。ヒト好中球遊走の低減は、実施例５に記載のとおり決定することができる。
さらなる実施形態において、本発明の抗体は、ヒト好中球を検出可能に活性化しない。
好中球活性化は、実施例７に記載のとおり、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ１１ｂの発現および／
またはスーパーオキシド産生を分析するによって決定することができる。
さらに別の実施形態において、本発明の抗体は、ｅｘ ｖｉｖｏで血液から好中球また
は単球を検出可能に枯渇させない。ｅｘ ｖｉｖｏでの好中球または単球の枯渇は、実施
例８および９に記載のとおり決定することができる。
さらなる実施形態において、本発明の抗体は、抗体濃度３０μｇ／ｍｌ未満、より好ま
しくは１０μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは５μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは１μｇ／
ｍｌ未満で、Ｃ５ａによって誘発されるヒト好中球中へのＣａ２＋流入を遮断することが
できる。Ｃ５ａによって誘発されるヒト好中球中へのＣａ２＋流入の遮断は、実施例６に
記載のとおり決定することができる。
一例を挙げると、本発明の抗体は、非枯渇型（non-depleting）および非活性化型（non
-activating）である。本明細書に記載のこのような抗体の例は、ｈＡｂ−Ｑである。代
替の実施形態において、本発明の抗体は、枯渇型（depleting）および非活性化型である
。本明細書に記載のこのような抗体の例は、ｈＡｂ−Ｎである。
好ましい実施形態において、
ｉ）免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４０および配列番号４１の１つまたは複数と少な
くとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む定常領域を含み、
ｉｉ）免疫グロブリン重鎖が、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４および配列
番号４５の１つまたは複数と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む定常領域を
含む。より好ましくは、
ｉ）免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列
を含む定常領域を含み、
ｉｉ）免疫グロブリン重鎖は、配列番号４５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配
列を含む定常領域を含む。
ヒト化抗体は、当技術分野で知られている任意の適当な構造を有することができる。例
としては、それだけに限らないが、２本の重鎖および２本の軽鎖からなる４ポリペプチド
鎖構造、単鎖抗体、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ(triabody)またはテトラボ
ディ(tetrabody)、ならびに抗体フラグメント、例えば、それだけに限らないが、Ｆａｂ
フラグメントまたは単一ドメイン抗体が挙げられる。
別の態様において、本発明は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列
番号４８の１つまたは複数と少なくとも９３％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を
含む、実質的に精製された、かつ／または組換えの免疫グロブリン軽鎖を提供する。
好ましい実施形態において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３１と少なくとも９３％
同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む。
さらなる態様において、本発明は、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および
配列番号３９の１つまたは複数と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む可変領
域を含む、実質的に精製された、かつ／または組換えの免疫グロブリン重鎖を提供する。
好ましい実施形態において、免疫グロブリン重鎖は、配列番号３６と少なくとも９０％
同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む。
別の態様において、本発明は、本発明の免疫グロブリン軽鎖および／または本発明の免
疫グロブリン重鎖を含み、ヒトＣ５ａＲに結合する、実質的に精製された、かつ／または
組換えの抗体を提供する。
さらに、本発明の抗体およびこの抗体に直接的または間接的に結合している治療薬を含
むコンジュゲートも提供される。治療薬の例としては、それだけに限らないが、細胞毒、
放射性同位体（例えば、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０もしくはインジウム−１１
１）、免疫調節薬、抗血管新生薬、抗新血管形成薬および／または他の血管形成薬、毒素
、抗増殖薬、アポトーシス促進剤、化学療法剤および治療用核酸が挙げられる。
一実施形態において、毒素は緑膿菌外毒素またはその誘導体である。
さらなる実施形態において、治療薬は、リンカーを介して抗体に間接的に結合している
。例としては、それだけに限らないが、４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（Ａｃ
Ｂｕｔ）、３−アセチルフェニル酸性酸（ＡｃＰａｃ）、４−メルカプト−４−メチル−
ペンタン酸（アミド）およびその誘導体が挙げられる。
別の態様において、本発明は、本発明の抗体およびこの抗体に直接的または間接的に結
合している検出可能な標識を含むコンジュゲートを提供する。適当な標識の例としては、
それだけに限らないが、放射標識、蛍光標識、酵素標識および造影剤が挙げられる。
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体もしくはその鎖、本発明の免疫グロブ
リン軽鎖、本発明の免疫グロブリン重鎖、ならびに／または本発明のコンジュゲートをコ
ードする単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチドを提供する。
好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号５２から５７のいずれか１つとして示され
る配列を含む。
別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
好ましくは、ベクターは発現ベクターである。より好ましくは、ポリヌクレオチドは、プ
ロモーターと作動可能に連結している。
別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび／または本発明のベク
ターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞または動物
細胞などの任意の細胞型とすることができる。
さらに、本発明の細胞を含む非ヒトトランスジェニック生物も提供される。
さらに、本発明の抗体、本発明の免疫グロブリン軽鎖、本発明の免疫グロブリン重鎖、
本発明のコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターならびに／また
は本発明の宿主細胞および担体を含む組成物も提供される。
別の態様において、本発明は、抗体を産生するプロセスであって、ポリヌクレオチドが
発現され、抗体が産生されるように、本発明の宿主細胞を培養することを含み、宿主細胞
が、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプロセスを提供する。
一実施形態において、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖は、一続きのポリ
ヌクレオチド上の２つの別個のオープンリーディングフレームによってコードされる。
好ましくは、このプロセスは、宿主細胞培養物から抗体を回収することをさらに含む。
さらなる態様において、本発明は、ヒトＣ５ａＲとそのリガンドとの相互作用を阻害す
るための方法であって、細胞を、本発明の抗体または本発明のコンジュゲートに曝露する
ことを含む方法を提供する。
好ましくは、リガンドはヒトＣ５ａである。
好ましくは、抗体またはコンジュゲートは、細胞に対する少なくとも一部のリガンド結
合を阻止する。
別の態様において、本発明は、細胞におけるヒトＣ５ａＲ活性を阻害するための方法で
あって、細胞を、本発明の抗体または本発明のコンジュゲートに曝露することを含む方法
を提供する。
２つの前述の態様に関して、これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏで
も実施することができる。
別の態様において、本発明は、対象において障害を治療または予防する方法であって、
本発明の抗体、本発明のコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター
、本発明の宿主細胞および／または本発明の組成物を対象に投与することを含む方法を提
供する。
一実施形態において、障害は、自己免疫疾患などの免疫病理学的障害である。
別の実施形態において、障害は、急性炎症または慢性炎症などの炎症性疾患である。
別の実施形態において、免疫病理学的障害または炎症性疾患に白血球遊走および／また
は白血球活性化が関与する。
さらなる実施形態において、免疫病理学的障害または炎症性疾患に補体活性化が関与す
る。
治療または予防することができる障害の例としては、それだけに限らないが、アレルギ
ー性鼻炎、過敏性肺疾患、過敏性肺炎、間質性肺炎、アナフィラキシー応答、過敏性応答
、薬物アレルギー、虫刺されアレルギー、炎症性腸疾患、脊椎関節症、強皮症、乾癬、皮
膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹、血管炎、関節炎、多
発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、若年発症糖尿病、腎炎（nephriti
des）、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病、移植片拒絶、アテローム性動脈硬化症、
皮膚または器官の白血球浸潤を伴う癌、再灌流傷害、卒中発作、成人呼吸窮迫症候群、血
液学的悪性疾患、サイトカイン誘導毒性、多発性筋炎、皮膚筋炎、類天疱瘡、アルツハイ
マー病、肉芽腫性疾患、血友病性滑膜炎、痛風、感染に伴う有害な炎症反応、ＳＡＲ、敗
血症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、関節リウマチ、抗リン脂質抗体症候群、加齢黄斑
変性、膜性増殖性糸球体腎炎およびデンスデポジット病が挙げられる。
本発明の方法は、他の既知の療法と組み合わせて実施することができる。したがって、
一実施形態において、この方法は、障害を治療または予防するための少なくとも１つの他
の化合物を投与することをさらに含む。このような他の療法は、同時または順次に提供す
ることができる。
当業者に理解されるように、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターおよび／ま
たは宿主細胞は、対象に投与される場合、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体またはコンジュゲートが
発現されるような適当な条件下に置かれる。
好ましくは、抗体、コンジュゲート、ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または宿主
細胞は、本発明の組成物として投与される。
別の態様において、本発明は、対象において治療薬を炎症部位に送達するための方法で
あって、本発明のコンジュゲートまたはそれをコードするポリヌクレオチドを対象に投与
することを含む方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、遺伝物質を、Ｃ５ａＲを提示する細胞に導入するた
めの方法であって、この細胞を、本発明の抗体または本発明のコンジュゲートと接触させ
ることを含み、抗体またはコンジュゲートが遺伝物質に結合している、またはそれと会合
している方法を提供する。
遺伝物質の例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその組合せが挙げられる。好ましい実施
形態において、遺伝物質は、少なくとも部分的に二本鎖のＤＮＡまたは少なくとも部分的
に二本鎖のＲＮＡである。
好ましい実施形態において、Ｃ５ａＲを提示する細胞は、白血球、例えば、顆粒球（例
えば、好中球、好塩基球、好酸球）、単球、肥満細胞および形質細胞様樹状細胞、ならび
に組織中の免疫細胞、例えば、マクロファージ（例えば、小膠細胞、肝クッパー細胞、腎
糸球体メサンギウム細胞）、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、血管内皮細胞、心筋細胞、星状細
胞、神経幹細胞、希突起膠細胞、滑膜細胞、関節軟骨細胞、刺激肝細胞、気管支上皮細胞
、角化細胞および胸腺細胞からなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、
Ｃ５ａＲを提示する細胞は、白血球、例えば、顆粒球（例えば、好中球、好塩基球、好酸
球）、単球、肥満細胞および形質細胞様樹状細胞、ならびに組織中の免疫細胞、例えば、
マクロファージ（例えば、小膠細胞、肝クッパー細胞、腎糸球体メサンギウム細胞）から
なる群から選択される。
さらに別の態様において、本発明は、試料中のヒトＣ５ａＲの存在または非存在を検出
する方法であって、試料を、本発明の抗体および／または本発明のコンジュゲートと接触
させること、ならびに試料をヒトＣ５ａＲと抗体またはコンジュゲートとの結合について
分析することを含む方法を提供する。
試験することができる適当な試料の例としては、必ずしもそれだけに限らないが、血液
、血清、血漿ならびに細胞または組織生検が挙げられる。
別の態様において、本発明は、対象において障害を診断するための方法であって、対象
またはそれから得られた試料を、本発明の抗体または本発明のコンジュゲートと接触させ
ること、および対象または試料をヒトＣ５ａＲと抗体またはコンジュゲートとの結合につ
いて分析することを含む方法を提供する。
したがって、この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも実施することがで
きる。
一実施形態において、この方法は、対象から得られた組織標本または組織もしくは体液
の亜分画を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
別の実施形態において、この方法は、対象において抗体とＣ５ａＲを提示する細胞との
複合体が形成されるような条件下で、造影剤で標識した本発明の抗体を対象に投与するこ
と、およびこの複合体をイメージングすることを含む。
好ましくは、障害は免疫病理学的障害である。
さらに、対象において障害を治療または予防するための医薬品を製造するための、本発
明の抗体、本発明のコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本
発明の宿主細胞および／または本発明の組成物の使用も提供される。
さらに、対象において治療薬を炎症部位に送達するための医薬品を製造するための、本
発明のコンジュゲートまたはそれをコードするポリヌクレオチドの使用も提供される。
さらに、対象において障害を治療または予防するための医薬品としての、本発明の抗体
、本発明のコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿
主細胞および／または本発明の組成物の使用も提供される。
さらに、対象において治療薬を炎症部位に送達するための医薬品としての、本発明のコ
ンジュゲートまたはそれをコードするポリヌクレオチドの使用も提供される。
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体、本発明のコンジュゲート、本発明の
ポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞および／または本発明の組成物
を含むキットを提供する。
明らかであるように、本発明の一態様の好ましい特色および特徴は、本発明の多くの他
の態様に適用可能である。
当業者に理解されるように、本発明の多くの態様において、定義済みの分子（抗体また
は免疫グロブリンなど）は、指定の配列番号の配列を含むこととは対照的に、前記配列か
ら本質的になる、またはより好ましくはそれからなることが好ましい。
本発明は、以下の非限定的な実施例によって、また添付の図面を参照して以下に説明す
る。
図１は、マウス７Ｆ３軽鎖Ｖｋ領域に対する最大の相同性を有するヒトＩｇ軽鎖配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示す図である。７Ｆ３について規定されたＣＤＲを四角で囲んだ。コンセンサスフレームワーク配列が示される（ｈＶｋＦＷ Ｃｏｎｓ）。 図２は、マウス７Ｆ３重鎖Ｖｈ配列に対する最大の相同性を有するヒトＩｇの重鎖Ｖ領域配列（Ａ）およびＪ領域配列（Ｂ）のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示す図である。７Ｆ３について規定されたＣＤＲを四角で囲んだ。７Ｆ３ ＣＤＲを移植するために、示されたＶ領域（ｈＶｈｖＦＷ Ｃｏｎｓ）およびＪ領域（ｈＶｈｊＦＷ Ｃｏｎｓ）に関するコンセンサスフレームワーク配列を連結して、コンセンサス配列（ｈＶｈＦＷ Ｃｏｎｓ）を作製した（注意：Ｄ領域はＣＤＲ−Ｈ３内に含まれる）。 図２Ａの続き 図３は、図１のコンセンサスヒトＶｋフレームワーク配列と、マウス７Ｆ３ Ｖｋ配列とのアラインメントを使用して、ヒト化７Ｆ３ Ｖｋ軽鎖配列、ｈ７Ｖｋを作製したことを示す図である。マウス７Ｆ３ ＣＤＲ（囲み）を、ｈＶｋＦＷコンセンサスフレームワーク配列中に移植した。アスタリスク付の３つのアミノ酸を、マウス７Ｆ３フレームワーク配列に逆変異させた。 図４は、ヒト化ＲＮＯＫ２０３ＶＬ配列とマウス７Ｆ３ Ｖｋ配列とのアラインメントを使用して、ヒト化７Ｆ３ Ｖｋ軽鎖配列、ｈ７ａＶｋを作製したことを示す図である。マウス７Ｆ３ ＣＤＲ（囲み）を、ＲＮＯＫ２０３ＶＬフレームワーク配列中に移植した。 図５は、ＫＶ２Ｆ−ＨＵＭＡＮ由来ＶＬＣＤ１８−Ｑ配列とマウス７Ｆ３ Ｖｋ配列とのアラインメントを使用して、ヒト化７Ｆ３ Ｖｋ軽鎖配列、ｈ７ｂＶｋを作製したことを示す図である。マウス７Ｆ３ ＣＤＲ（囲み）を、ＶＬＣＤ１８−Ｑフレームワーク配列中に移植した。 図６は、ヒト化７Ｆ３ Ｖｋ配列とマウス７Ｆ３ Ｖｋ配列とのアラインメントを示す図である。コンセンサス配列ｈ７Ｆ３ ＶｋＣｏｎｓは、３つのヒト化配列のコンセンサスである。ＣＤＲを四角で囲んだ。ヒト化７Ｆ３ Ｖｋ配列間の差異を、黒の背景に白字で示した。 図７は、図２Ａおよび２ＢのコンセンサスヒトＶｈフレームワーク配列と、マウス７Ｆ３ Ｖｈ配列とのアラインメントを使用して、ヒト化７Ｆ３ Ｖｈ重鎖配列、ｈ７Ｖｈを作製したことを示す図である。マウス７Ｆ３ ＣＤＲ（囲み）を、ｈＶｈＦＷコンセンサスフレームワーク配列中に移植した。アスタリスク（＊）付のアミノ酸を、マウス７Ｆ３フレームワーク配列に逆変異させた。＃付のアミノ酸を、本文中で議論したような代替の残基に変異させた。 図８は、ヒトＳＧＩ−ＶＨ配列とマウス７Ｆ３ Ｖｈ配列とのアラインメントを使用して、ヒト化７Ｆ３ Ｖｈ重鎖配列、ｈ７ａＶｈを作製したことを示す図である。マウス７Ｆ３ ＣＤＲ（囲み）を、ＳＧＩ−ＶＨフレームワーク配列中に移植した。アスタリスク（＊）付のアミノ酸を、マウス７Ｆ３フレームワーク配列に逆変異させた。 図９は、ヒトＨＧ３配列とマウス７Ｆ３ Ｖｈ配列とのアラインメントを使用して、ヒト化７Ｆ３ Ｖｈ重鎖配列、ｈ７ｂＶｈを作製したことを示す図である。マウス７Ｆ３ ＣＤＲ（囲み）を、ＨＧ３フレームワーク配列中に移植した。アスタリスク（＊）付のアミノ酸を、マウス７Ｆ３フレームワーク配列に逆変異させた。 図１０は、ヒト化７Ｆ３ Ｖｈ配列とマウス７Ｆ３ Ｖｈ配列とのアラインメントを示す図である。コンセンサス配列ｈ７Ｆ３ＶｈＣｏｎｓは、３つのヒト化配列のコンセンサスである。ＣＤＲを四角で囲んだ。ヒト化７Ｆ３ Ｖｈ配列間の差異を、黒の背景に白字で示した。 図１１は、ヒト好中球上のｈＣ５ａＲからの、ヒト化７Ｆ３抗体およびマウス７Ｆ３による１２５Ｉ−Ｃ５ａの置換を比較する、競合的リガンド結合アッセイを示す図である。 図１２は、Ｌ１．２／ｈＣ５ａＲトランスフェクタント上のｈＣ５ａＲからの、ヒト化７Ｆ３抗体およびマウス７Ｆ３による１２５Ｉ−Ｃ５ａの置換を比較する競合的リガンド結合アッセイを示す図である。 図１２は、Ｌ１．２／ｈＣ５ａＲトランスフェクタント上のｈＣ５ａＲからの、ヒト化７Ｆ３抗体およびマウス７Ｆ３による１２５Ｉ−Ｃ５ａの置換を比較する競合的リガンド結合アッセイを示す図である。 図１２は、Ｌ１．２／ｈＣ５ａＲトランスフェクタント上のｈＣ５ａＲからの、ヒト化７Ｆ３抗体およびマウス７Ｆ３による１２５Ｉ−Ｃ５ａの置換を比較する競合的リガンド結合アッセイを示す図である。 図１３は、ｘ軸上にｌｏｇ１０（上のパネル）および線形（下のパネル）スケールでプロットした、４℃でのヒト好中球に対する抗Ｃ５ａＲ抗体の飽和結合を示す図である。 図１４は、ペプチドＥＬＩＳＡを示す図である：ヒトＣ５ａＲの第２細胞外ループ由来の１２マー配列（各々１つずつずれた）を含む一連の重複するペプチド（１〜２２番）および配列番号３７由来の残基１７３〜２０５を含む３３マー（２３番）に対する、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｊ（パネルＡ）およびｈＡｂ−Ｑ（パネルＢ）の結合。ヒトＣ５ａＲの第２細胞外ループ由来の１２マー配列（Ａ１番）、単一のＡｌａ変異を有する１２マーを含む一連の変異ペプチド（Ａ２〜Ａ１３番）、およびスクランブル化ペプチド（Ａ１４番）に対する、ｈＡｂ−Ｊ（パネルＣ）およびｈＡｂ−Ｑ（パネルＤ）の結合。 図１５は、種々の希釈でＥＬＩＳＡプレート上を被覆したペプチドＰＥＰ１（配列番号３７の残基９〜２９）に対する、ヒト化抗Ｃ５ａＲ ｍＡｂのｈＡｂ−ＪおよびＱまたは抗Ｃ５ａＲ ｍＡｂ Ｓ５／１（５μｇ／ｍ１）の結合を示す図である。 図１６は、走化性アッセイを示す図である：５μｇ／ｍｌの７Ｆ３および種々のヒト化７Ｆ３抗体の存在下での、１ｎＭのＣ５ａに対するヒト好中球の遊走。 図１７は、抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑ（閉じたひし形）および７Ｆ３（白い四角）による、Ｃ５ａによって誘発されるヒト好中球の走化性の阻害を示す図である。４つの別個の実験からの平均（±標準誤差）結果を、抗体なしの対照試料の最大遊走の百分率（上パネル）として、または、遊走細胞の平均数（下パネル）として示す。ｘ軸上の単位は、μｇ／ｍ１でのｌｏｇ１０Ａｂ濃度である。 図１８は、親マウス抗体７Ｆ３ならびにヒト化抗体ＪおよびＱによる、Ｃ５ａによって駆動されるｈＣ５ａＲ／Ｌ１．２トランスフェクタント細胞遊走の阻害を示す図である。 図１９は、Ｃ５ａによって誘発されるヒト好中球の走化性が、高濃度のヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑとのプレインキュベーション後に抑制されたことを示す図である。 図２０は、種々の濃度のヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑと共にプレインキュベートした細胞の、Ｃ５ａによって誘発される走化性の前および後に、ヒト好中球上の未結合のＣ５ａＲのレベルと結合した抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑのレベルとの間で観察された、半比例の関係を示す図である。 図２１は、種々の濃度のヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑと共にプレインキュベートした、ヒト好中球上の結合した抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑのレベル（Ｃ５ａによって誘発される走化性の前および後）と細胞遊走の阻害との間で観察された関係を示す図である。 図２２は、種々の濃度のヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑと共にプレインキュベートしたヒト好中球上の、Ｃ５ａによって誘発されるＣＤ１１ｂ発現の阻害を示す図である。 図２３は、種々の濃度のヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑと共にプレインキュベートしたヒト好中球上の、Ｃ５ａによって誘発されるＣＤ６２Ｌの下方制御の阻害を示す図である。 図２４は、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−ＱおよびｈＡｂ−Ｊ、ＰＢＳまたは顆粒球活性化因子ｆＭＬＰとヒト全血との１時間のインキュベーション後の、好中球上のＣＤ１１ｂ（パネルＡ）およびＣＤ６２Ｌ（パネルＢ）の発現を示す図である。 図２５は、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−ＧもしくはｈＡｂ−Ｊ、またはＣ５ａとヒト全血との２０分間のインキュベーション後の、ＰＢＳ対照に対する好中球上のＣＤ１１ｂ（パネルＡ）およびＣＤ６２Ｌ（パネルＢ）発現を示す図である。 図２６は、ｈＡｂ−Ｑ、ｈＩｇＧアイソタイプ対照抗体単独またはｈＩｇＧ抗体＋１００ｎＭ ヒトＣ５ａと共にインキュベートしたヒト全血における、相対的なＣＤ１１ｂ発現（パネルＡ）およびＣＤ６２Ｌ発現（パネルＢ）の変化によって示される、好中球の活性化を示す図である。 図２７は、ｈＡｂ−Ｑ（抗Ｃ５ａＲ ａｂともいう）それ自体は、固相に結合したヒト好中球がスーパーオキシドを産生するように刺激することはないが、Ｃ５ａによる産生の惹起と反対の作用をすることを示す図である。 図２８は、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑまたは対照（リツキシマブ、無関係のヒトＩｇＧ４、ＰＢＳ）との４時間のｅｘ ｖｉｖｏインキュベーション後の、ヒト血液１ｍｌ当たりのＢ細胞、単球および好中球の平均数（±標準偏差）を示す図である。 図２９は、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑまたは対照抗体（リツキシマブ、無関係のヒトＩｇＧ４）との４時間のｅｘ ｖｉｖｏインキュベーション後の、ヒト血液１ｍｌ当たりのＢ細胞、単球および好中球の、ＰＢＳ対照に対する平均％枯渇（±標準偏差）を示す図である。 図３０は、１％ウサギ補体の存在下での、１００μｇ／ｍｌのｈＡｂ−Ｑ、リツキシマブおよびｈＩｇＧ４、または２０μｇ／ｍｌのポリクローナル抗Ｃ５ａＲ抗体とのインキュベーション後の、特異的ＣＤＣ（％ＴｏＰｒｏ３＋ｖｅ（溶解済み）Ｒａｍｏｓ Ｅ２細胞）を示す図である。 図３１は、１０％ヒト血清の存在下での、１〜１００μｇ／ｍｌのｈＡｂ−Ｑ、リツキシマブおよびｈＩｇＧ４とのインキュベーション後の、特異的ＣＤＣ（％非生存Ｒａｍｏｓ Ｅ２細胞）を示す図である。１０％熱不動化ウシ血清と共にインキュベートした各試料について、非特異的溶解が既に差し引かれている。 図３２は、特異的ＡＤＣＣ（「培地のみ」および「標的のみ」のバックグラウンドを差し引いた後の、「標的＋エフェクター」試料における％標的細胞溶解）：１０％熱不動化胎児ウシ血清を含む培地中で、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞＋１００μｇ／ｍｌ抗体と共にインキュベートした後の、％非生存（ＴＰ３＋ｖｅ）Ｒａｍｏｓ Ｅ２標的細胞を示す図である。 図３３は、特異的ＡＤＣＣ（「培地のみ」および「標的のみ」のバックグラウンドを差し引いた後の、「標的＋エフェクター」試料における％標的細胞溶解）：１０％ヒトドナー血清を含む培地中で、ヒトドナーＰＢＭＣエフェクター細胞＋１〜１００μｇ／ｍｌの抗体と共にインキュベートした後の、％非生存（ＴＰ３＋ｖｅ）Ｒａｍｏｓ Ｅ２標的細胞を示す図である。 図３４は、炎症性関節炎のモデルにおける疾患の進行を示す図である。１０ｍｇ／ｋｇ 抗ｈＣ５ａＲ抗体Ｇ、ＭおよびＮの５日目の腹腔内投与後の、ｈＣ５ａＲノックインマウス（１群当たりｎ＝６）におけるＫ／ＢｘＮ血清によって誘発される炎症の復帰が、群平均臨床スコアの変化によって示される。 図３５は、炎症性関節炎のモデルにおける疾患の進行を示す図である。１〜１０ｍｇ／ｋｇの抗ｈＣ５ａＲ抗体ＣおよびＪの５日目の腹腔内投与後の、ｈＣ５ａＲノックインマウス（１群当たりｎ＝４〜５）におけるＫ／ＢｘＮ血清によって誘発される炎症の復帰が、群平均臨床スコアの変化によって示される。 図３６は、炎症性関節炎のモデルにおける疾患の進行を示す図である。１〜１０ｍｇ／ｋｇのｈＡｂ−Ｑの５日目の腹腔内投与後の、ｈＣ５ａＲノックインマウス（１群当たりｎ＝１０＋）におけるＫ／ＢｘＮ血清によって誘発される炎症の復帰が、群平均の足サイズ（Ａ）および臨床スコア（Ｂ）の変化によって示される。 図３７は、種々の用量のヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体、対照抗体またはＰＢＳのｉｎ ｖｉｖｏ投与後の、占有されたＣ５ａＲの経時的なレベルを示す図である。 図３８は、種々の用量のヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体、対照抗体またはＰＢＳのｉｎ ｖｉｖｏ投与後の、未結合のＣ５ａＲの経時的なレベルを示す図である。 図３９は、関節の炎症を有するマウスに５日目に治療的に投与されたｈＡｂ−Ｑの、経時的な血清濃度を示す図である。 図４０は、０日目および２日目にＫ／ＢｘＮ血清を注射し、５日目に１０ｍｇ／ｋｇのヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体を注射したマウスにおける、臨床スコア（足および関節における炎症のレベル）と、占有されたＣ５ａ受容体のレベルと、ｈＡｂ−Ｑの血清濃度との間の関係を示す図である。 図４１は、０日目および２日目にＫ／ＢｘＮ血清を注射し、５日目に３ｍｇ／ｋｇのヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体を注射したマウスにおける、臨床スコア（足および関節における炎症のレベル）と、占有されたＣ５ａ受容体のレベルと、ｈＡｂ−Ｑの血清濃度との間の関係を示す図である。 図４２は、０日目および２日目にＫ／ＢｘＮ血清を注射し、５日目に１ｍｇ／ｋｇ ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体を注射したマウスにおける、臨床スコア（足および関節における炎症のレベル）と、占有されたＣ５ａ受容体のレベルと、ｈＡｂ−Ｑの血清濃度との間の関係を示す図である。 図４３は、トランスジェニックマウスでの毒物学研究および薬理学研究における、ｈＡｂ−Ｑに関する統合されたＰＫ／ＰＤモデルの模式図を示す図である。 図４４は、毒物学研究（注釈中Ｔｏｘで示す）および薬理学研究（注釈中ＫＲＮで示す）における、ｈＡｂ−Ｑ（抗Ｃ５ａＲ ａｂともいう）の種々の静脈内、皮下および腹腔内投薬に関する、モデルが予測しそして観察された濃度（左）および占有率（右）対時間を示す図である。毒物学研究のために、ＰＫ試料を、投薬後１日目および投薬後４３日目に採取した。４３日目のデータを定常状態と仮定し、６回目の投薬を追跡するために考慮した。平均群値：ひし形、個々のマウス：白丸、標的コンパートメントを介してフィットさせたモデル：太線。 図４５は、薬理学研究において実験的に誘発した関節炎の阻害に対するｈＡｂ−Ｑの影響に関する、ＰＫ／ＰＤモデルの模式図を示す図である。このモデルは、図４３中に示したＰＫ／ＰＤモデルで計算した占有率を組み込んでいる。 図４６は、トランスジェニックマウスにおける、５日目に投与されたｈＡｂ−Ｑの種々の腹腔内投薬での、０日目の炎症チャレンジ後の占有率（左）および足サイズの変化（右）対時間を示す図である。平均郡測定値：色で塗りつぶしたひし形。個々のマウス値：色つきの中白の丸。各群におけるフィットしたモデル：色つき線。 図４７は、ヒトでの予測のために適用したＰＫ／ＰＤモデルの模式図を示す図である。このモデルは、標的媒介性の体内動態で増強された、典型的なＩｇＧパラメーターを使用する２コンパートメントモデルからなる。Ｖ１＝中央体積。Ｖ２＝末梢体積。ＣＬ＝クリアランス。Ｑ＝分布クリアランス。ｋｏｆｆ／ｋｏｎ＝会合／解離に関する速度定数。ターンオーバー＝標的を刷新し、結合した抗体を除去するのにかかる時間。２標的コンパートメントを使用して、標的が血液の内側および外側の両方に分布すると考えられることを反映した。 図４８は、抗Ｃ５ａＲ（ｈＡｂ−Ｑ）の静脈内投薬後の、薬物動態（左）および占有率（右）に関するモデル予測を示す図である。定量化の下限を水平線によって示す。 図４９は、抗Ｃ５ａＲ（ｈＡｂ−Ｑ）の皮下投薬後の、薬物動態（左）および占有率（右）に関するモデル予測を示す図である。定量化の下限を水平線によって示す。
全般的な技術
別段に具体的な定義がなされない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および
科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、抗体技術、免疫学、免疫組織化学
、タンパク質化学、および生化学）により一般的に理解される意味と同じ意味を有すると
理解されるものとする。
別段に示されない限り、本発明で用いられる組換えタンパク質法、細胞培養法、および
免疫学的技法は、当業者によく知られた標準的な手順である。このような技法は、Ｊ．Ｐ
ｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）；Ｊ．Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ（１９８９）；Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編）、「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、第１巻および第２
巻、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ｄ．Ｍ．ＧｌｏｖｅｒおよびＢ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ
（編）、「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、第
１〜４巻、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５および１９９６）；ならびにＦ．Ｍ．Ａｕｓｕ
ｂｅｌら（編）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ
−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのすべての改定を含めた）；Ｈａｒｌ
ｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ（１９８８）；ならびにＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ
（現在までのすべての改定を含めた）などの出典中の文献全体において記載および説明さ
れている。
精選された定義
本明細書で用いられる「Ｃ５ａ受容体」、「Ｃ５ａＲ」、「Ｃ５ａＲ１」、または「ヒ
トＣ５ａＲ」、およびその突然変異体は、当技術分野でＣ５ａアナフィラトキシン受容体
およびＣＤ８８抗原としても知られているヒト補体成分５受容体１を指す。Ｃ５ａＲは、
７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体ファミリーに属し、Ｃ５ａに結合する（Ｇｅｒａｒ
ｄおよびＧｅｒａｒｄ、１９９１）。ヒトＣ５ａＲのアミノ酸配列の例は配列番号３７に
示されているが、この分子の天然の対立遺伝子突然変異体もまた「Ｃ５ａＲ」という用語
によって包含されることを当業者は認識しているであろう。ヒトＣ５ａＲの各ドメインは
、以下：
アミノ酸１〜３７ 細胞外ドメイン：Ｎ末端
アミノ酸３８〜６１ 膜貫通ドメイン
アミノ酸６２〜７１ 細胞内ドメイン
アミノ酸７２〜９４ 膜貫通ドメイン
アミノ酸９５〜１１０ 細胞外ドメイン：細胞外ループ１
アミノ酸１１１〜１３２ 膜貫通ドメイン
アミノ酸１３３〜１４９ 細胞内ドメイン
アミノ酸１５０〜１７４ 膜貫通ドメイン
アミノ酸１７５〜２０６ 細胞外ドメイン：細胞外ループ２
アミノ酸２０７〜２２７ 膜貫通ドメイン
アミノ酸２２８〜２４２ 細胞内ドメイン
アミノ酸２４３〜２６４ 膜貫通ドメイン
アミノ酸２６５〜２８３ 細胞外ドメイン：細胞外ループ３
アミノ酸２８４〜３０７ 膜貫通ドメイン
アミノ酸３０８〜３５０ 細胞内ドメイン：Ｃ末端
のとおりに規定されている。
本明細書で用いられる「対象」という用語は、任意の動物、特に、ヒト、ウマ、ウシ、
ネコ、およびイヌなどの哺乳動物を意味し、適切な場合は、「患者」という用語と互換的
に用いることができる。対象はヒトであることが好ましい。
本明細書で用いられる「治療すること」、「治療する」、または「治療」、およびその
変化形は、障害の少なくとも１つの症状を軽減または除去するのに十分な治療有効量の本
発明の抗体を投与することを包含する。
本明細書で用いられる「予防すること」、「予防する」、もしくは「予防」、またはそ
の変化形は、疾患の少なくとも１つの症状を発症することから対象を保護すること、また
は障害の症状の重症度を軽減することを指す。
本明細書で用いられる「細胞の曝露」という用語は、Ｃ５ａＲが細胞に存在する場合に
、抗体がヒトＣ５ａＲに接触／結合することが可能であるように、抗体が供給されること
を指す。
「５０％の有効濃度」（「ＥＣ５０」と略記する）という用語は、本発明の抗体が標的
とする分子に対する所与の効果（例えば、ヒトＣ５ａＲに対するヒトＣ５ａの結合を阻害
／置換すること）の５０％に必要とされる該抗体の濃度を表す。より低値のＥＣ５０はよ
り強力な抗体に対応することが、当業者により理解される。
本明細書で用いられる「阻害すること」という用語は、規定の活性を低減すること、ま
たおそらくは、完全に除去することを指す。規定の活性は、少なくとも５０％低減される
ことが好ましく、より好ましくは少なくとも７５％、またさらにより好ましくは少なくと
も９０％低減される。
本明細書で用いられる「約」という用語は、具体的な値の＋／−５％の範囲を指す。
本明細書全体において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏ
ｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、言及さ
れる要素、十進数、もしくはステップ、または複数の要素、複数の十進数、もしくは複数
のステップの群の包含を含意するが、他の任意の要素、十進数、もしくはステップ、また
は複数の要素、複数の十進数、もしくは複数のステップの群の除外を含意するものではな
いと理解される。ある実施形態では、ある分子が規定の配列「から本質的になる」。別の
実施形態では、ある分子が規定の配列「からなる」。
ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体
免疫グロブリンという用語は、４本の鎖すべてがジスルフィド結合により相互に結合さ
れる、１対の低分子量の軽（Ｌ）鎖および１対の重（Ｈ）鎖である２対のポリペプチド鎖
からなる、構造的に関連する糖タンパク質のクラスを指す。免疫グロブリンの構造は十分
に特徴付けられており、例えば、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、
第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））
を参照されたい。略述すると、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記する）
および重鎖定常領域（本明細書ではＣＨと略記する）を含むことが典型的である。重鎖定
常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含むことが典型的である。各
軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記する）および軽鎖定常領域（本明細書で
はＣＬと略記する）を含むことが典型的である。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを
含むことが典型的である。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称
し、フレームワーク領域（ＦＲ）と称するより保存的な領域が間に散在する、超可変的な
領域（または構造的に規定されるループの配列および／もしくは形態において超可変的で
あり得る超可変領域）へとさらに細分することができる。好ましい実施形態において、本
発明の抗体は、少なくともＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む。
各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、Ｃ
ＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端へと並ぶ３つのＣＤＲおよび４つのＦＲ
からなることが典型的である（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７も参照されたい
）。この領域内にあるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、
第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１）（本明細書で
は、Ｋａｂａｔにおける、またはＫａｂａｔによる可変ドメイン残基の番号付け、などの
表現は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについてのこの番号付けシステムを指
す）に記載の方法により実施される。この番号付けシステムを用いると、あるペプチドの
実際の直鎖アミノ酸配列は、該可変ドメインのＦＲもしくはＣＤＲの短縮または同ＦＲも
しくはＣＤＲへの挿入に対応する、より少数であるかまたは追加のアミノ酸を含有する場
合がある。
本明細書で用いられる「ヒト化抗体」という用語は、本明細書において、該親抗体の抗
原結合特性を保持するかまたは実質的に保持するが、ヒトにおける免疫原性はより低度な
非ヒト抗体、典型的にはマウス抗体に由来する抗体を指す。構造的および機能的な特色に
より定義される本発明の抗体により、「ヒト化抗体」という用語は、「抗体」と互換的に
用いられる。
本明細書で用いられる相補性決定領域（ＣＤＲ）という用語は、免疫グロブリン結合部
位の可変フラグメント（Ｆｖ）領域の結合アフィニティーおよび結合特異性を共に規定す
るアミノ酸配列を指す。
本明細書で用いられるフレームワーク領域（ＦＲ）という用語は、ＣＤＲの間に挟み込
まれるアミノ酸配列を指す。抗体のこれらの部分は、ＣＤＲを適切な指向性に保持する（
ＣＤＲが抗原に結合することを可能とする）のに用いられる。軽鎖または重鎖の可変領域
は、フレームワーク、また典型的に３つのＣＤＲを含む。
本明細書で用いられる定常領域（ＣＲ）という用語は、エフェクター機能を付与する抗
体分子の部分を指す。対象のヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。
重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ：アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、または
ミューのいずれかから選択することができる。さらに、各サブクラスの重鎖（重鎖のＩｇ
Ｇサブクラスなど）が異なるエフェクター機能の一因となり、したがって、所望の重鎖定
常領域を選択することにより、所望のエフェクター機能を有する抗体を産生することがで
きる。好ましい重鎖定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ２（ＩｇＧ２）、ガンマ
３（ＩｇＧ３）、およびガンマ４（ＩｇＧ４）であり、より好ましくはガンマ４（ＩｇＧ
４）である。突然変異Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ（「Ｐ」突然変異と称する）および／またはＬ
ｅｕ２３５Ｇｌｕ（「Ｅ」突然変異と称する）を伴うガンマ４（ＩｇＧ４）アイソタイプ
の結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）領域がより好ましい。特に好ましい重鎖定常領域配列
は、配列番号４２〜４５として示される。軽鎖定常領域は、カッパ型またはラムダ型であ
り得、カッパ型であることが好ましい。特に好ましい軽鎖定常領域配列は、配列番号４０
および４１として示される。
好ましい実施形態において、本明細書に記載の免疫グロブリン軽鎖可変領域は、本明細
書に記載の免疫グロブリン軽鎖定常領域に直接的に接合される。同様に、さらに好ましい
実施形態において、本明細書に記載の免疫グロブリン重鎖可変領域は、本明細書に記載の
免疫グロブリン重鎖定常領域に直接的に接合される。したがって、好ましい実施形態にお
いて、配列番号３１として示されるアミノ酸配列のＣ末端は配列番号４１として示される
アミノ酸配列のＮ末端に直接的に接合され、配列番号３６として示されるアミノ酸配列の
Ｃ末端は配列番号４５として示されるアミノ酸配列のＮ末端に直接的に接合される。
標準的な組換えＤＮＡ法を用いることにより、免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変領
域および定常領域を記載のとおりに接合させて、（（１つまたは複数の）前記免疫グロブ
リン鎖を産生するのに）適する宿主において発現し得る（接合された可変ドメインおよび
定常ドメインをコードする）ポリヌクレオチドを作製することもでき、ペプチド化学反応
を用いることにより、接合された可変ドメインおよび定常ドメインを合成することもでき
ることを、当業者は理解するであろう。
本発明のヒト化抗体は、親抗体、すなわち、受託番号第００１１０６０９号の下に、２
０００年１１月６日にＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生された、７Ｆ３
と称するモノクローナル抗体の結合特性の大部分を保持している。特に、本発明のヒト化
抗体は、このようなヒト化抗体を産生するのに用いられた親抗体により認識される抗原に
特異的に結合する能力を保持する。該ヒト化抗体は、該親抗体と同じであるかまたは実質
的に同じ抗原結合アフィニティーおよび抗原結合アビディティを示すことが好ましい。理
想的には、該抗体のアフィニティー（ＫＤ）は、該親抗体のアフィニティーの１０倍を超
えず、より好ましくは約５倍を超えず、該アフィニティーは、該親抗体のアフィニティー
の３倍を超えないことが最も好ましい。抗原結合アフィニティーをアッセイするための方
法は当技術分野においてよく知られており、これには、最大半量結合アッセイ、競合アッ
セイ、およびスカチャード分析が含まれる。適切な抗原結合アッセイは、本出願において
記載されている（例えば、実施例３を参照されたい）。
当業者が理解するとおり、「アビディティ」は、抗体および抗原など２つの分子間にお
ける相互作用の全体的な強さに関する。アビディティは、相互作用のアフィニティーおよ
び価数の両方に依存する。さらに、「アフィニティー」は、分子（例えば、抗体）および
リガンド（例えば、抗原）の単独の結合部位間における結合の強さに関する。リガンドＹ
に対する分子Ｘのアフィニティーは、溶液中に存在する分子Ｘの半分の結合部位を占める
のに必要とされるＹの濃度である解離定数（Ｋｄ）により表される。Ｋｄが小さければ、
相互作用のアフィニティーがより強いかまたはより高度であり、該部位を占めるのに必要
とされるリガンド濃度がより低度であることを示す。
本発明で用いられる「ヒト化抗体」または「抗体」という用語は、完全分子のほか、Ｆ
ａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、およびＦｖなど、エピトープ決定基に結合可能なそのフラグメン
トを包含する。これらの抗体フラグメントは、ヒトＣ５ａＲに選択的に結合する一部の能
力を保持し、その例としては、それだけに限らないが、以下：
（１）Ｆａｂ：抗体分子の１価の抗原結合フラグメントを含有するこのフラグメントは
、酵素パパインにより全抗体を消化して、完全な軽鎖および１本の重鎖の一部をもたらす
ことにより産生することができる；
（２）Ｆａｂ’：抗体分子のこのフラグメントは、ペプシンにより全抗体を処理した後
で還元反応を行い、完全な軽鎖および重鎖の一部をもたらすことにより得ることができる
；抗体分子当たり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる；
（３）（Ｆａｂ’）２：後続の還元反応なしに酵素ペプシンで全抗体を処理することに
より得ることができる抗体フラグメント；Ｆ（ａｂ）２は、２つのジスルフィド結合によ
り一体に保持される２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である；
（４）Ｆｖ：２本の鎖として発現される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含有する、
遺伝子改変されたフラグメントとして定義される；
（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）：適切なポリペプチドリンカーにより、遺伝子融合され
た単鎖分子として連結された軽鎖可変領域、重鎖可変領域を含有する遺伝子改変分子とし
て定義される；このような単鎖抗体は、多価特異的の場合もそうでない場合もあるダイア
ボディ、トリアボディ、およびテトラボディなどの多量体の形態（例えば、ＷＯ９４／０
７９２１およびＷＯ９８／４４００１を参照されたい）であり得る；ならびに
（６）単一ドメイン抗体：軽鎖を欠く重鎖可変ドメインであることが典型的である；
が挙げられる。
ヒト化抗体フラグメントには、個別の重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２
、Ｆｃ、重鎖を欠く軽鎖可変ドメイン、軽鎖を欠く重鎖可変ドメイン、およびＦｖが含ま
れる。フラグメントは、組換えＤＮＡ法により産生され、または完全免疫グロブリンの酵
素的分離または化学的分離により産生される。
本発明の「ヒト化抗体」または抗体はまた、ヘテロコンジュゲート抗体でもあり得る。
ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合により接合された２つの抗体からなる。このよう
な抗体は、例えば、望ましくない細胞を免疫系細胞の標的とするため（ＵＳ４，６７６，
９８０）、およびＨＩＶ感染の治療用（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３
；ＥＰ５８６５０５）に提起されている。該抗体は、架橋形成剤を伴う反応を含めた、タ
ンパク質合成化学反応において知られている方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製し得
ることが意図されている。
例えば、関節炎など、本明細書に記載の障害の治療における抗体の有効性を増強するた
めに、エフェクター機能の点で本発明の抗体を改変することが望ましい場合がある。例え
ば、（１つまたは複数の）システイン残基をＦｃ領域内に導入して、これにより、この領
域内における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能とすることができる。こうして生成され
たホモ二量体のヒト化抗体は、内部化能力を改善し、かつ／または補体媒介性細胞死滅作
用および抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を増大させることができる（Ｃａｒｏｎら
、１９９２；Ｓｈｏｐｅｓ、１９９２）。活性を増強したホモ二量体の抗体はまた、Ｗｏ
ｌｆｆら（１９９３）に記載のヘテロ二機能性架橋剤を用いても調製することができる。
代替的に、二重Ｆｃ領域を有するように抗体を改変し、これにより、補体による溶解およ
びＡＤＣＣ能を増強させることもできる（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、１９８９）。
本明細書で用いられる「非枯渇型抗体」とは、その標的に結合するが、標的細胞の溶解
を実行する免疫系のエフェクター機能は動員しない抗体を指す。免疫系のエフェクター機
能は、補体カスケードの第１成分であるＣ１ｑおよび／または受容体（ＦｃＲ）とのＦｃ
ドメインの相互作用に依存する。Ｃ１ｑとの複数のＦｃドメインの相互作用により補体依
存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）が誘発され、最終的にはこの結果として、膜攻撃複合体（Ｍ
ＡＣ）の形成を介して標的細胞の溶解がもたらされ得る。加えて、顆粒球、マクロファー
ジ、およびＮＫ細胞などの免疫系細胞は、ＦｃＲを介して、標的細胞に結合したｍＡｂと
相互作用し得る。標的細胞の溶解は、抗体依存性細胞媒介性傷害作用（ＡＤＣＣ）または
食作用を介して誘発される。非枯渇型抗体には、例えば、１価フォーマット（例えば、Ｆ
ａｂ、ｓｃＦｖ、ナノボディ、およびｄＡｂ）、２価フォーマット（例えば、Ｆ（ａｂ’
）２およびダイアボディ）、および多価フォーマット（例えば、トリアボディおよびペン
タボディ）を含めた、Ｆｃドメインなしの抗体フラグメントが含まれる。加えて、非枯渇
型抗体には、薬物動態に影響を与えることなくエフェクター機能を除去するように改変さ
れた抗体が含まれ、例えば、Ｃ１ｑおよびＦｃＲとの相互作用において主要な役割を果た
すＦｃドメイン内のアミノ酸残基ならば改変することもできようし、ＣＨ２ドメイン内の
Ｎが連結されたグリコシル化部位ならば除去することもできよう。当業者が理解するとお
り、非枯渇型抗体を改変する可能性は、該抗体を産生するのに用いられる定常領域と関連
する。ＩｇＧ３定常領域がＩｇＧ１定常領域よりも枯渇型抗体を産生する可能性が高く、
ＩｇＧ１定常領域がＩｇＧ２定常領域よりも枯渇型抗体を産生する可能性が高いのに対し
、ＩｇＧ４定常領域は一般に、その抗体が非枯渇型であることを意味する。当業者はまた
、定常領域に対して改変を行えば、枯渇型抗体を非枯渇型抗体へと転換することもでき、
この逆も可能であることを理解するであろう。
本明細書で用いられる「非活性化型抗体」とは、細胞表面受容体に結合し、内因性リガ
ンドの作用を無化または遮断する抗体を指す。
本発明のヒト化抗体は、人的な介入により産生される。したがって、これらは、自然発
生することが期待されない。にもかかわらず、好ましい実施形態において、本発明の抗体
鎖または免疫グロブリン鎖は、「実質的に精製」されているかまたは「精製」されている
。本発明者らによれば、「実質的に精製」されているかまたは「精製」されているとは、
１つまたは複数の脂質、核酸、他のポリペプチド、またはその天然状態ではそれが関連す
る他の夾雑分子から抗体が分離されていることを意味する。実質的に精製されているポリ
ペプチドとは、天然ではそれが関連する他の成分を少なくとも６０％含まず、より好まし
くは少なくとも７５％含まず、またより好ましくは少なくとも９０％含まないことが好ま
しい。別の実施形態において、「実質的に精製」されているかまたは「精製」されている
とは、該分子が、該組成物中において、それが属する分子クラスに関して見出される主要
な分子種であることを意味する（すなわち、それが、該組成物中における分子の種類の少
なくとも約５０％を占め、該組成物中における分子種、例えば、ペプチドの少なくとも約
７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約
９５％以上を占めることが典型的である）。
抗体鎖または免疫グロブリン鎖の関連における「組換え」という用語は、細胞または無
細胞発現系により、その天然状態と比較して変化した量または変化した速度で産生される
場合の抗体鎖または免疫グロブリン鎖を指す。一実施形態において、細胞は、天然では抗
体鎖または免疫グロブリン鎖を産生しない細胞である。しかし、細胞は、産生されるポリ
ペプチド量の変化、好ましくは増大を引き起こす非内因性遺伝子を含む細胞であり得る。
本発明の組換えによる抗体鎖または免疫グロブリン鎖には、その中でそれが産生されるト
ランスジェニック（組換え）細胞または無細胞発現系の他の成分と分離されていないポリ
ペプチドが含まれ、このような細胞または無細胞系内において産生される抗体鎖または免
疫グロブリン鎖は、その後、少なくとも一部の他の成分から精製される。
ポリペプチド（免疫グロブリン鎖）の％同一性は、ギャップ創出ペナルティ＝５、およ
びギャップ伸長ペナルティ＝０．３とするＧＡＰ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃ
ｈ、１９７０）解析（ＧＣＧプログラム）により決定される。クエリー配列は少なくとも
５０アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ解析では、少なくとも５０アミノ酸の領域にわたり２
つの配列が整列される。クエリー配列が少なくとも１００アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ
解析では、少なくとも１００アミノ酸の領域にわたり２つの配列が整列されることがさら
により好ましい。２つの配列がそれらの全長にわたり整列されることが最も好ましい。
規定された免疫グロブリン鎖に関しては、上記に示された数値よりも高値の％同一性の
数値が好ましい実施形態に包含されると理解される。したがって、適切な場合、％同一性
の最小値に照らすと、免疫グロブリン鎖は、命名された関連の配列番号と少なくとも９４
％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましく
は少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９
％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より
好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましく
は少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なく
とも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、さらにより好ましくは少なくと
も９９．９％同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。
別の実施形態では、命名された配列番号に１つの残基を付加するか、命名された配列番
号から１つの残基を欠失させるか、命名された配列番号と比較して１つの残基を付加して
１つの残基を欠失させるか、命名された配列番号に２つの残基を付加するか、命名された
配列番号から２つの残基を欠失させるか、命名された配列番号から１つの残基を変化させ
るか、命名された配列番号から２つの残基を変化させるか、命名された配列番号から１つ
の残基を変化させて１つの残基を欠失させるか、もしくは命名された配列番号から１つの
残基を変化させてこれに１つの残基を付加するか、またはこれらの任意の組合せを実施す
る。
好ましい実施形態において、アライメント内にはギャップが存在しない。より具体的に
述べると、アルゴリズムは、アミノ酸の連続するつながりの中にギャップを創出して、最
適な（％同一性が最大の）アライメントを得る必要がない。
本発明の抗体鎖および／または免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列突然変異体は、本発明
の核酸内に適切なヌクレオチド変化を導入することによっても調製することができ、ｉｎ
ｖｉｔｒｏにおける所望のポリペプチドの合成によっても調製することができる。この
ような突然変異体は、例えば、該アミノ酸配列内において、残基の欠失、挿入、または置
換を包含する。最終的なポリペプチド産物が所望の特徴を有する場合は、欠失、挿入、お
よび置換の組合せを行って最終構築物に到達することができる。
突然変異（改変）ポリペプチドは、当技術分野で知られている任意の技法を用いて調製
することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変異
誘発にかけることができる。このようなｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変異誘発法には、適切な
ベクター内へのポリヌクレオチドのサブクローニング、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−１
レッド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などの「突然変異誘発」株内へのベクターの形質転
換、および形質転換された細菌の増殖による適切な数の生成が含まれる。突然変異／改変
ＤＮＡは、本明細書に記載の技法を用いて容易にスクリーニングし、これらが受容体結合
活性および／または受容体阻害活性を有するかどうかを判定することができる。
アミノ酸配列の突然変異体を設計する場合、突然変異部位の位置および突然変異の性質
は、改変される（１つまたは複数の）特徴に依存する。突然変異される部位は、例えば、
（１）まず保存的アミノ酸の選択により、次いで、達成された結果に応じてより根本的な
選択により置換すること、（２）標的残基を欠失させること、または（３）位置を特定し
た部位に隣接する形で他の残基を挿入することにより、個別にまたは連鎖的に改変するこ
とができる。
アミノ酸配列の欠失は一般に、約１〜１５残基、より好ましくは約１〜１０残基、また
典型的には約１〜５の連続残基の範囲にわたる。
置換突然変異体では、抗体鎖および／または免疫グロブリン鎖分子中における少なくと
も１つのアミノ酸残基が除去され、その代わりに異なる残基が挿入される。置換的突然変
異誘発にとって最大の対象部位には、抗原結合に重要であると同定される部位が含まれる
。これらの部位、とりわけ、ヒト抗体鎖および／または免疫グロブリン鎖の少なくとも３
カ所の他の同一保存部位の配列内に収まる部位は、比較的に保存的な形で置換することが
好ましい。このような保存的置換は、「例示的な置換」の表題の下に、表１に示される。
置換の具体例は、図６および１０に示され、この場合、所与の部位におけるアミノ酸は、
他のヒト化鎖内の同じ部位に存在する別のアミノ酸により置換することができる。
さらに、所望の場合、非天然アミノ酸または化学的なアミノ酸類似体を、本発明の抗体
鎖および／または免疫グロブリン鎖内への置換または付加として導入することができる。
このようなアミノ酸としては、それだけに限らないが、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、
２，４−ジアミノブチル酸、α−アミノイソブチル酸、４−アミノブチル酸、２−アミノ
ブチル酸、６−アミノヘキサン酸、２−アミノイソブチル酸、３−アミノプロピオン酸、
オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン
、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニル
グリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸；β−メチルア
ミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸；およ
びアミノ酸類似体全般が挙げられる。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチドの産生および回収、ならびに該ポリペプ
チドの化学合成を含めた各種の方法により産生することができる。一実施形態において、
本発明の単離ポリペプチドは、該ポリペプチドを産生するのに有効な条件下で該ポリペプ
チドを発現可能な細胞を培養し、該ポリペプチドを回収することにより産生される。培養
に好ましい細胞は、本発明の組換え細胞である。有効な培養条件としては、それだけに限
らないが、有効な培地、バイオリアクター、ポリペプチド産生を可能とする温度条件、ｐ
Ｈ条件、および酸素条件が挙げられる。有効な培地とは、そこにおいて細胞を培養して本
発明のポリペプチドを産生する任意の培地を指す。このような培地は、同化可能な炭素供
給源、窒素供給源、およびリン酸供給源、ならびに適切な塩、鉱物、金属、およびビタミ
ンなど他の栄養素を有する水性培地を含むことが典型的である。本発明の細胞は、従来の
発酵型バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロ滴定ディッシュ、およびペ
トリプレートにおいて培養することができる。培養は、組換え細胞に適切な温度、ｐＨ、
および酸素含量で実行することができる。このような培養条件は、当業者の専門技術内に
ある。
ポリヌクレオチドおよびその発現
本発明者らによれば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはセンス方向もしくはアンチセンス方向
またはこれら両方の組合せにおける、１本鎖または２本鎖によるこれらの組合せ、ｄｓＲ
ＮＡ、あるいはその他の形を含めた「単離ポリヌクレオチド」とは、その天然状態におい
てそれが会合するかまたは連結されるポリヌクレオチド配列とは少なくとも部分的に分離
されるポリヌクレオチドを意味する。単離ポリヌクレオチドは、これらが天然において会
合する他の成分を少なくとも６０％含まないことが好ましく、少なくとも７５％含まない
ことが好ましく、少なくとも９０％含まないことが最も好ましい。さらに、本明細書にお
いて、「ポリヌクレオチド」という用語は、「核酸」および「遺伝物質」という用語と互
換的に用いられる。
ポリヌクレオチドの関連における「外因的な」という用語は、細胞または無細胞発現系
内において、その天然状態と比較して変化した量で存在する場合のポリヌクレオチドを指
す。一実施形態において、細胞は、天然では該ポリヌクレオチドを含まない細胞である。
しかし、細胞は、結果としてコードされるポリペプチドの産生量が変化する、好ましくは
増加する非外因性ポリヌクレオチドを含む細胞であり得る。本発明の外因性ポリヌクレオ
チドには、その中にそれが存在するトランスジェニック（組換え）細胞、または無細胞発
現系の他の成分と分離されていないポリヌクレオチドが含まれ、このような細胞または無
細胞発現系内において産生されるポリヌクレオチドは、その後、少なくとも一部の他の成
分から精製される。外因性ポリヌクレオチド（核酸）は、天然で存在するヌクレオチドの
連続的なつながりの場合もあり、接合されて単一のポリヌクレオチドを形成する、異なる
供給源（天然および／または合成）に由来する２つ以上のヌクレオチドの連続的なつなが
りを含む場合もある。このようなキメラポリヌクレオチドは、対象細胞内におけるオープ
ンリーディングフレームの転写を駆動するのに適するプロモーターに作動可能に連結され
る、本発明のポリペプチドをコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレーム
を含む。
本発明は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号４８、配列番号３４
、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３９の１つもしくは複数をコードするポ
リヌクレオチド、および／または配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号
４８、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３９の１つもしくは
複数をコードするポリヌクレオチドと少なくとも６７％同一のポリヌクレオチドに関する
。このようなポリヌクレオチドの例としては、それだけに限らないが、配列番号５２〜５
７のいずれか１つにおいて示される配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
ポリヌクレオチドの％同一性は、ギャップ創出ペナルティ＝５、およびギャップ伸長ペ
ナルティ＝０．３とするＧＡＰ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０）解
析（ＧＣＧプログラム）により決定される。別段の言及がない限り、クエリー配列は少な
くとも４５ヌクレオチドの長さであり、ＧＡＰ解析では、少なくとも４５ヌクレオチドの
領域にわたり２つの配列が整列される。クエリー配列が少なくとも１００ヌクレオチドの
長さであり、ＧＡＰ解析では、少なくとも１００ヌクレオチドの領域にわたり２つの配列
が整列されることが好ましい。２つの配列がそれらの全長にわたり整列されることが最も
好ましい。
規定されたポリヌクレオチドに関しては、上記に示された数値よりも高値の％同一性の
数値が、好ましい実施形態に包含されることが理解される。したがって、適切な場合、％
同一性の最小値に照らすと、本発明のポリヌクレオチドは、命名された関連の配列番号と
少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％
、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは
少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％
、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好まし
くは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少な
くとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９
９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％
、さらにより好ましくは少なくとも９９．９％同一の配列を含むことが好ましい。
本発明はまた、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号４８、配列番号
３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３９の１つまたは複数をコードする
ポリヌクレオチドに対して、厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにも関
する。本明細書で用いられる「厳密なハイブリダイゼーション条件」または「厳密な条件
」などの用語は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの長さによるハイブリダイ
ゼーション温度の変化を含めた、当技術分野が精通するパラメーターを指す。核酸ハイブ
リダイゼーションのパラメーターは、このような方法を一括する参考文献であるＳａｍｂ
ｒｏｏｋら（前出）；およびＡｕｓｕｂｅｌら（前出）において見出すことができる。例
えば、本明細書で用いられる厳密なハイブリダイゼーション条件とは、ハイブリダイゼー
ション緩衝液（３．５倍濃度ＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロ
リドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．
５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中における６５℃でのハイブリダイゼーション、および
各洗浄ステップを約３０分間とする、６５℃の０．２倍濃度ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中に
おける２回の洗浄を指すことができる。
本発明の抗体鎖および免疫グロブリン鎖は、組換え発現により産生されることが典型的
である。場合によって定常領域に連結される軽鎖可変量異域および重鎖可変領域をコード
する核酸は、発現ベクター内に挿入される。軽鎖および重鎖は、同じ発現ベクター内でク
ローニングすることもでき、異なる発現ベクター内でクローニングすることもできる。免
疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を
確保する（１つまたは複数の）発現ベクター内における制御配列に作動可能に連結される
。発現制御配列としては、それだけに限らないが、プロモーター（例えば、天然会合プロ
モーターまたは異種プロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント、および転
写終結配列が挙げられる。発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換するかまたはトラン
スフェクションすることが可能なベクター内における真核生物のプロモーター系であるこ
とが好ましい。ベクターが適切な宿主内に組み込まれると、該宿主は、ヌクレオチド配列
の高レベルの発現、ならびに抗体鎖および／または免疫グロブリン鎖の回収および精製に
適する条件下で維持される。
これらの発現ベクターは、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分
として宿主細胞内で複製可能であることが典型的である。一般に、発現ベクターは、所望
のＤＮＡ配列により形質転換された細胞の検出を可能とする選択マーカー（例えば、アン
ピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４
１８耐性、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ＡＤＡ（アデノシンデアミナーゼ）
、ＧＳ（グルタミンシンセターゼ））（例えば、Ｕ．Ｓ．４，７０４，３６２を参照され
たい）を含有する。
大腸菌は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列）をクローニングするのに
特に有用な１つの原核宿主である。使用に適する他の微生物宿主には、枯草菌（Bacillus
subtilus）などの桿菌、およびサルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）
などの腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、および各シュードモナス属（Pseudomonas）
菌種が含まれる。これらの原核宿主ではまた、該宿主細胞に適合する発現制御配列（例え
ば、複製起点）を含有することが典型的な発現ベクターも作製することができる。加えて
、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラク
タマーゼプロモーター系、Ｔ７プロモーター、またはファージラムダに由来するプロモー
ター系など、任意の数の各種のよく知られたプロモーターも存在する。プロモーターは、
場合によってオペレーター配列により発現を制御し、リボソーム結合部位配列などを有し
、転写および翻訳を開始および終結することが典型的である。
酵母など他の微生物もまた、発現に有用である。サッカロミセス属（Saccharomyces）
は、好ましい酵母宿主であり、所望に応じて発現制御配列（例えば、プロモーター）、複
製起点、終結配列などを有する適切なベクターを伴う。典型的なプロモーターには、３−
ホスホグリセレートキナーゼおよび他の糖分解酵素が含まれる。誘導可能な酵母プロモー
ターには、特に、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣ、ならびにマルトース
およびガラクトースの使用の一因となる酵素が含まれる。発現に有用な酵母の別の例は、
メタノール資化酵母（Pichia pastoris）である。
微生物に加えて、哺乳動物の組織細胞培養物もまた、本発明の抗体鎖および／または免
疫グロブリン鎖を発現および産生するのに用いることができる（例えば、免疫グロブリン
またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、「Ｆｒ
ｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ」、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．、
Ｎ．Ｙ．（１９８７）を参照されたい）。異種タンパク質（例えば、完全免疫グロブリン
）を分泌することが可能な多数の適切な宿主細胞株が当技術分野では開発されており、こ
れには、ＣＨＯ細胞株、各種のＣｏｓ細胞株、ＮＳＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰｅｒＣ
６細胞、ＨｅＬａ細胞、好ましくは骨髄腫細胞株、または形質転換されたＢ細胞もしくは
ハイブリドーマが含まれるので、真核細胞が実際には好ましい。細胞は非ヒト細胞である
ことが好ましい。これらの細胞の発現ベクターには、複製起点、プロモーター、およびエ
ンハンサー（Ｑｕｅｅｎら、１９８６）などの発現制御配列、ならびにリボソーム結合部
位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列など、必要なプロ
セシング情報部位が含まれ得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ
４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来する
プロモーターである（Ｃｏら、１９９２を参照されたい）。
代替的に、抗体をコードする配列は、トランスジェニック動物のゲノム内への導入およ
びトランスジェニック動物のミルク中におけるその後の発現のためのトランス遺伝子内に
組み込むことができる（例えば、Ｕ．Ｓ．５，７４１，９５７；Ｕ．Ｓ．５，３０４，４
８９；およびＵ．Ｓ．５，８４９，９９２を参照されたい）。適切なトランス遺伝子には
、カゼインまたはベータラクトグロブリンなど、哺乳動物の腺特異的遺伝子に由来するプ
ロモーターおよびエンハンサーと作動可能に連結される軽鎖および／または重鎖のコード
配列が含まれる。
対象のポリヌクレオチド配列（例えば、重鎖および軽鎖のコード配列ならびに発現制御
配列）を含有するベクターは、細胞宿主の種類に応じて変化する、よく知られた方法によ
り宿主細胞内に導入することができる。例えば、原核細胞には塩化カルシウムによるトラ
ンスフェクションが一般に用いられる一方、他の細胞宿主には、リン酸カルシウム処理、
電気穿孔、リポフェクション、微粒子銃、またはウイルスベースのトランスフェクション
を用いることができる（全般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照されたい）。哺乳動
物細胞を形質転換するのに用いられる他の方法には、ポリブレン、プロトプラスト融合、
リポソーム、電気穿孔、およびマイクロインジェクションの使用が含まれる。トランスジ
ェニック動物を産生する場合、トランス遺伝子は、受精した卵細胞内にマイクロインジェ
クトすることもでき、胚性幹細胞のゲノム内に組み込んで、このような細胞の核を除核さ
れた卵細胞内に導入することもできる。
重鎖および軽鎖を個別の発現ベクターでクローニングする場合、該ベクターは、完全免
疫グロブリンを発現および構築するように共トランスフェクトされる。発現したら、硫酸
アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、
ゲル電気泳動などを含めた、当技術分野の標準的な手順に従い、本発明の全抗体、それら
の二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態を精製することができ
る（全般的に、Ｓｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２））を参照されたい）。
コンジュゲート
本発明の抗体に直接的または間接的に結合する治療薬にコンジュゲートする該抗体を含
むコンジュゲート（免疫コンジュゲート）もまた提供される。治療薬の例としては、それ
だけに限らないが、細胞毒素、放射性同位体（例えば、ヨウ素１３１、イットリウム９０
、またはインジウム１１１）、免疫調節薬、抗血管新生薬、抗新血管形成薬、および／ま
たは他の血管形成薬、毒素、抗増殖薬、アポトーシス促進薬、化学療法薬、および治療用
核酸が挙げられる。
細胞毒素には、細胞に対して有害な（例えば、これらを死滅させる）任意の薬剤が含ま
れる。当技術分野でよく知られたこれらのクラスの薬剤、およびこれらの作用機序の説明
については、Ｇｏｏｄｍａｎら、「Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ'ｓ Ｔｈｅ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、
第８版、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、１９９０を参照されたい
。抗体免疫毒素の調製に関連するさらなる技法は、例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ （１９９３
）；およびＵＳ５，１９４，５９４において示されている。
本発明の免疫コンジュゲートを形成するのに適する治療薬には、タキソール、サイトカ
ラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、
テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノル
ビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチ
ノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラ
カイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン；代謝拮抗剤（メトト
レキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５
−フルオロウラシル、デカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビ
ン、クラドリビンなど）；アルキル化剤（メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、
メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミ
ド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩ
Ｃ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチンおよびカルボプラチンなど他の
白金誘導体など）；抗生剤（ダクチノマイシン（旧称アクチノマイシン）、ブレオマイシ
ン、ダウノルビシン（旧称ダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマ
イシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭ
Ｃ）など）；ジフテリア毒素および関連分子（ジフテリアＡ鎖およびその活性フラグメン
トならびにハイブリッド分子など）；リシン毒素（リシンＡ鎖毒素または脱グリコシル化
したリシンＡ鎖毒素など）、コレラ毒素、志賀様毒素（ＳＬＴ−Ｉ、ＳＬＴ−ＩＩ、ＳＬ
Ｔ−ＩＩＶ）、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆ボーマン
−バークプロテアーゼ阻害薬、緑膿菌外毒素、アロリン、サポリン、モデクシン、ゲラニ
ン、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリ（Aleurites fo
rdii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolacca americana
）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（Momordica ch
arantia）による阻害薬、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィキナリス（Sapaona
ria officinalis）による阻害薬、ゲロニン毒素、マイトゲリン毒素、レストリクトシン
毒素、フェノマイシン毒素、およびエノマイシン毒素が含まれる。
適切な血管新生阻害薬（抗血管新生薬）の例としては、それだけに限らないが、ウロキ
ナーゼ阻害薬；マトリックスメタロプロテアーゼ阻害薬（マリマスタット、ネオバスタッ
ト、ＢＡＹ １２−９５６６、ＡＧ ３３４０、ＢＭＳ−２７５２９１、および類似の薬
剤など）；内皮細胞の遊走および増殖に対する阻害薬（ＴＮＰ−４７０、スクアラミン、
２−メトキシエストラジオール、コンブレタスタチン、エンドスタチン、アンジオスタチ
ン、ペニシラミン、ＳＣＨ６６３３６（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｃｏｒｐ、Ｍ
ａｄｉｓｏｎ、ＮＪ）、Ｒ１１５７７７（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
，Ｉｎｃ、Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ、ＮＪ）、および類似の薬剤など）；血管新生成長因子
に対するアンタゴニスト（ＺＤ６４７４、ＳＵ６６６８、血管新生物質および／またはこ
れらの受容体（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびアンジオポエチン−１など）に対する抗体、
サリドマイド、サリドマイド類似体（ＣＣ−５０１３など）、Ｓｕｇｅｎ ５４１６、Ｓ
Ｕ５４０２、抗血管新生リボザイム（アンジオザイムなど）、インターフェロンα（イン
ターフェロンα２ａなど）、スラミン、および類似の薬剤など）；ＶＥＧＦ−Ｒキナーゼ
の阻害薬および他の抗血管新生チロシンキナーゼ阻害薬（ＳＵ０１１２４８など）；内皮
特異的インテグリン／生存シグナル伝達に対する阻害薬（ビタキシンおよび類似の薬剤な
ど）；銅アンタゴニスト／キレート化剤（テトラチオモリブデート、カプトプリル、およ
び類似の薬剤など）；カルボキシアミド−トリアゾール（ＣＡＩ）、ＡＢＴ−６２７、Ｃ
Ｍ１０１、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、ＩＭ８６２、ＰＮＵ１４５１５６Ｅの
ほか；血管新生を阻害するヌクレオチド分子（アンチセンスＶＥＧＦ−ｃＤＮＡ、アンジ
オスタチンをコードするｃＤＮＡ、ｐ５３をコードするｃＤＮＡ、および欠損のあるＶＥ
ＧＦ受容体−２をコードするｃＤＮＡなど）；ならびに類似の薬剤が挙げられる。血管新
生、新血管形成、および／または他の血管形成に対する阻害薬の他の例は、抗血管新生ヘ
パリン誘導体および関連分子（例えば、ヘパリナーゼＩＩＩ）、テモゾロミド、ＮＫ４、
マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、シクロオキシゲナーゼ−２阻害薬、低酸素症誘
導因子１に対する阻害薬、抗血管新生大豆イソフラボン、オリチプラズ、フマギリンおよ
びその類似体、ソマトスタチン類似体、ペントサンポリスルフェート、テコガランナトリ
ウム、ダルテパリン、ツムスタチン、トロンボスポンジン、ＮＭ−３、コンブレスタチン
、カンスタチン、アバスタチン、他の関連標的に対する抗体（抗アルファ−ｖ／ベータ−
３インテグリンおよび抗キニノスタチンｍＡｂなど）、ならびに類似の薬剤である。
各種の放射性核種が放射性コンジュゲート抗体の産生に使用可能であり、その例として
は、それだけに限らないが、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げら
れる。
それだけに限らないが、４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）、３
−アセチルフェニル酢酸（ＡｃＰａｃ）、４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸（Ａ
ｍｉｄｅ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（
ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（ジメチルアジ
ピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデ
ヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）
ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾ
イル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネー
トなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベン
ゼンなど）、ならびにこれらの誘導体など、各種の二機能性タンパク質結合剤を用いて、
抗体および治療薬のコンジュゲートが作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅ
ｔｔａら（１９８７）により記載されるとおりに調製することができる。炭素１４で標識
された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（Ｍ
Ｘ−ＤＴＰＡ）は、抗体に対する放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示
的なキレート化剤である（ＷＯ９４／１１０２６）。
別の実施形態において、抗体は、Ｃ５ａ発現細胞の予めの標的化において用いられる「
受容体」（ストレプトアビジンなど）にコンジュゲートすることができ、この場合、抗体
−受容体コンジュゲートを患者に投与した後で、除去剤を用いて未結合のコンジュゲート
を循環から除去し、次いで、治療薬（例えば、放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートす
る「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。
一実施形態では、本発明の抗体を用いて、遺伝物質を送達することができる。遺伝物質
を当技術分野で知られている任意の技術で抗体にコンジュゲートすることができる。例と
しては、それだけに限らないが、ビオチン−アビジン間の相互作用、ジスルフィド架橋の
形成、アミン結合（例えば、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎら、１９９５を参照されたい）、チ
オール結合（例えば、Ｎｉｅｍｅｙｅｒら、２００３を参照されたい）、またはアルデヒ
ド−ヒドラジン間の相互作用（例えば、Ｋｏｚｌｏｖら、２００４を参照されたい）の使
用が挙げられる。当技術分野で知られている他の結合剤には、ｍ−マレイミドベンゾイル
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたは関連化合物、１−エチル−３−（３−ジエ
チルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミド、スクシンイミジ
ル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、
およびグルタルアルデヒド架橋剤が含まれる。
シグナル伝達アッセイ
Ｃ５ａＲに対する、アゴニストまたはＣ５ａなどのリガンドの結合は、このＧタンパク
質共役受容体によるシグナル伝達、およびＧタンパク質の活性のほか、他の細胞内シグナ
ル伝達分子の刺激を結果としてもたらす可能性がある。本発明の抗体の阻害活性は、適切
なアッセイにおいてリガンドを用い、リガンドにより誘導される該活性を阻害する抗体の
能力を評価して決定することができる。
ＧＴＰからＧＤＰへの加水分解、または細胞内（細胞質）遊離カルシウム濃度の急速か
つ一過性の上昇の誘導など、受容体の結合により誘発されるその後のシグナル伝達イベン
トなどのＧタンパク質活性は、当技術分野で知られている方法または他の適切な方法（例
えば、Ｎｅｏｔｅら、１９９３；Ｖａｎ Ｒｉｐｅｒら、１９９３；およびＤａｈｉｎｄ
ｅｎら、１９９４を参照されたい）によりアッセイすることができる。
ハイブリッドのＧタンパク質共役受容体を用いる、ＵＳ５，２８４，７４６に記載の機
能アッセイを用いて、受容体に結合し、Ｇタンパク質を活性化するリガンドの能力をモニ
タリングすることができる。
このようなアッセイは、評価される抗体の存在下において実施することができ、知られ
ている方法および／または本明細書に記載の方法を用いて、該リガンドにより誘導される
活性を阻害する抗体の能力が決定される。
走化性および細胞刺激アッセイ
本発明の抗体がＣ５ａＲに対するリガンドの結合を遮断し、かつ／または該受容体に対
するリガンドの結合と関連する機能を阻害する能力を評価するには、走化性アッセイもま
た用いることができる。これらのアッセイは、化合物（化学誘引物質）により誘導される
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞の機能的遊走に基づく。走化性は、
例えば、９６ウェルの走化性プレートを用いるか、または走化性を評価するのに当技術分
野で認知される他の方法を用いるアッセイにおいて、任意の適切な手段により評価するこ
とができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける経内皮走化性アッセイの使用は、Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒら（ＷＯ９４／２０１４２）；およびＢｅｒｍａｎら（１９８８）により説明
されている。内皮を隔てたコラーゲンゲル内への遊走もまた説明されている（Ｋａｖａｎ
ａｕｇｈら、１９９１）。走化性アッセイでは、マウスＬ１．２プレＢ細胞または走化性
が可能な他の適切な宿主細胞の安定的な形質転換体を用いることができる。
一般に、走化性アッセイでは、障壁（例えば、内皮、フィルター）内へまたは障壁を介
して、障壁の第１の表面から向い側の第２の表面へと、化合物レベルの上昇に向かって方
向づけられた適切な細胞（白血球（例えば、リンパ球、好酸球、好塩基球、好中球）など
）の移動または遊走がモニタリングされる。フィルター内へまたはフィルターを介して、
フィルターの第１の表面から向い側のフィルターの第２の表面へと、化合物レベルの上昇
に向かって方向づけられた適切な細胞の移動または遊走がモニタリングされるように、膜
またはフィルターが好都合な障壁を提供する。一部のアッセイにおいて、膜は、ＩＣＡＭ
−１、フィブロネクチン、またはコラーゲンなど、付着を促進する物質により被覆される
。このようなアッセイにより、白血球の「帰巣」についてのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける近
似が示される。
例えば、第１のチャンバーから、微小孔性の膜内へまたはこれを介して、化学誘引物質
および試験対象の抗体を含有し、該膜により該第１のチャンバーから分断される、第２の
チャンバー内への、適切な容器（手段を含有する）内における細胞の遊走に対する阻害を
検出または測定することができる。例えば、ニトロセルロース、ポリカルボネートを含め
た、化合物に応答する特異的な遊走をモニタリングするのに適する小孔サイズを有する適
切な膜が選択される。例えば、約３〜８ミクロン、また好ましくは約５〜８ミクロンの小
孔サイズを用いることができる。小孔サイズは、フィルター上において、または適切な小
孔サイズの範囲内において一様であり得る。
遊走および遊走の阻害を評価するため、フィルター内への遊走の距離、フィルターを横
切り、フィルターの第２の表面に対する付着を保つ細胞の数、および／または第２のチャ
ンバー内に蓄積する細胞の数を、標準的な技法（例えば、顕微鏡およびフローサイトメト
リー）を用いて決定することができる。一実施形態では、細胞を、検出可能な標識（例え
ば、放射性同位体、蛍光標識、抗原標識、またはエピトープ標識）により標識し、適切な
方法を用いて（例えば、放射能、蛍光、イムノアッセイを検出することにより）膜に付着
する標識および／または第２のチャンバー内に存在する標識の存在を決定することにより
、抗体の存在下または不在下における遊走を評価することができる。適切な対照と比べて
（例えば、抗体の不在下において決定されるバックグラウンドの遊走と比較して、第２の
化合物（すなわち、基準化合物）により誘導される遊走の程度と比較して、抗体により誘
導されるトランスフェクトされない細胞の遊走と比較して）、抗体アンタゴニストにより
誘導される遊走の程度を決定することができる。一実施形態において、特にＴ細胞、単球
、またはＣ５ａＲを発現する細胞の場合、経内皮遊走をモニタリングすることができる。
この実施形態では、内皮細胞層を介する経内皮遊走が評価される。細胞層を調製するには
、場合によって、内皮細胞の付着を促進するように、コラーゲン、フィブロネクチン、ま
たは他の細胞外マトリックスタンパク質などの物質により被覆した微小孔性のフィルター
または膜上において内皮細胞を培養することができる。内皮細胞は、コンフルエントの単
層が形成されるまで培養することが好ましい。単層の形成には、ヒト臍帯静脈内皮細胞（
Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）など、例えば、静
脈内皮細胞、動脈内皮細胞、または毛細血管内皮細胞を含めた各種の哺乳動物内皮細胞が
入手可能である。特定の哺乳動物受容体に応答する走化性をアッセイするためには、同じ
哺乳動物の内皮細胞が好ましいが、種または属の異なる哺乳動物に由来する内皮細胞もま
た用いることができる。
Ｃ５ａシグナル伝達に対する抗体による阻害薬についての試験に用いられる一実施形態
では、遊走およびＣ５ａＲの発現が可能な細胞を含む組成物を第１のチャンバー内に入れ
ることができる。第１のチャンバー内における細胞の走化性を誘導することが可能な（化
学誘引物質機能を有する）１つまたは複数のリガンドまたはプロモーターを含む組成物を
第２のチャンバー内に入れる。第１のチャンバー内に細胞を入れる少し前、または細胞と
同時に、試験対象の抗体を含む組成物を、好ましくは第１のチャンバーに入れることが好
ましい。抗体は、受容体に結合し、リガンドまたはプロモーターによる、Ｃ５ａＲを発現
する細胞の走化性の誘導を阻害することが可能である。このアッセイにおいて、抗体は、
受容体機能の阻害薬（例えば、刺激機能の阻害薬）である。抗体の存在下においてリガン
ドまたはプロモーターにより誘導される遊走の程度の低減は、阻害活性を示す。別個の結
合試験を実施すれば、阻害が受容体に対する抗体の結合の結果であるのか、または異なる
機構を介して発生するのかを判定することができるであろう。
組織内における化合物（例えば、ケモカインまたは抗体）の注射に応答する、組織に対
する白血球の浸潤をモニタリングするｉｎ ｖｉｖｏアッセイが、以下（「炎症モデル」
を参照されたい）に記載される。これらのｉｎ ｖｉｖｏにおける帰巣モデルでは、炎症
部位への移出および走化性により、リガンドまたはプロモーターに応答する細胞の能力が
測定され、この移出を遮断する抗体またはそのフラグメントの能力が評価される。
記載の方法に加えて、受容体を含有する適切な宿主細胞を用いて、活性受容体により誘
導される細胞応答をモニタリングすることにより、Ｃ５ａＲの刺激機能に対する抗体の効
果を評価することができる。
本明細書では走化性アッセイについての他の例も記載されており、例えば、実施例４を
参照されたい。
炎症モデル
治療薬としてのｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体の効果を評価するのに用い得る、炎症のｉ
ｎ ｖｉｖｏモデルが使用可能である。例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、
またはアカゲザルなどの適切な動物内へのケモカインおよびＣ５ａＲ反応性抗体の皮内注
射時における白血球の浸潤をモニタリングすることができる（例えば、Ｖａｎ Ｄａｍｍ
ｅら、１９９２；Ｚａｃｈａｒｉａｅら、１９９０；Ｊｏｓｅら、１９９４を参照された
い）。
一実施形態では、白血球（例えば、好酸球、顆粒球）の浸潤について、皮膚生検を組織
学的に評価する。別の実施形態では、走化性および溢出が可能な標識された細胞（例えば
、Ｃ５ａＲを発現する、安定的にトランスフェクトされた細胞）を動物に投与する。標識
された細胞を試験動物に投与する前、これと同時、またはこの後において、評価される抗
体を投与することができる。阻害薬の不在下における浸潤の程度と比較した、抗体の存在
下における浸潤の程度の低下は、阻害を示す。
使用
本発明の抗体は、研究への適用、診断的適用、および治療的適用を含めた各種の適用に
おいて有用である。
Ｃ５ａＲは、白血球の輸送において重要な役割を果たす。Ｃ５ａＲは、好中球、好酸球
、マスト細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、およびミクログリアを含めた自然免疫
系細胞の化学誘引物質受容体であり、このため、抗Ｃ５ａＲ抗体を用いて、白血球遊走、
特に、灌流傷害および脳卒中など、好中球による組織傷害、またはアテローム性動脈硬化
など、単球を介する障害と関連する白血球遊走を阻害（低減または阻止）することができ
る。
本明細書に記載の抗体は、（ａ）受容体に対する結合（例えば、リガンド、阻害剤の）
、（ｂ）受容体のシグナル伝達機能、および／または（ｃ）刺激機能を阻害（低減または
阻止であり得る）する阻害薬として作用し得る。受容体機能の阻害薬として作用する抗体
は、直接的または間接的に（例えば、立体構造変化を引き起こすことにより）リガンド結
合を遮断し得る。例えば、抗体は、リガンドの結合を阻害することにより受容体機能を阻
害する場合もあり、脱感作（リガンドの結合に対する阻害を伴う場合であれそうでない場
合であれ）により受容体機能を阻害する場合もある。
一態様において、本発明は、対象における障害を治療または予防する方法を提供する。
本明細書で用いられる「障害」とは、正常な機能の破壊またはこれに対する干渉である。
ある実施形態において、障害とは、免疫病理学的障害である。
免疫病理学とは、免疫学的原因を有する疾患の研究であり、免疫学的疾患とは、抗原に
対する抗体の反応により引き起こされる任意の状態である。したがって、「免疫学的障害
」とは、抗原に対する抗体の反応から生じる障害と定義することができ、これには、自己
免疫疾患および感覚過敏反応（例えば、Ｉ型：アナフィラキシー、蕁麻疹、食物アレルギ
ー、喘息；ＩＩ型：自己免疫性溶血性貧血、血液透析反応；ＩＩＩ型：血清病、壊死性血
管炎、糸球体腎炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス；ＩＶ型：接触皮膚炎、移植
拒絶）が含まれる。
免疫系が自己反応性リンパ球を発生時において除去できず、その後の調節の破綻により
、自己反応性Ｔ細胞クローンまたは自己反応性Ｂ細胞クローンが活性化して、自己抗原に
対する体液性反応または細胞媒介性反応が生じ、これにより、細胞および臓器に対する重
篤な損傷が引き起こされる場合に、自己免疫疾患は生じる。
別の実施形態において、障害は、炎症性疾患である。
炎症は、刺激または傷害に対する身体組織の防護反応であり、急性の場合もあり、慢性
の場合もある。したがって、炎症性障害には、サイトカイン放出、ヒスタミン放出、酸化
的バースト、食作用、他の顆粒酵素の放出、および走化性が生じる好中球、単球、マスト
細胞、好塩基球、好酸球、マクロファージを伴う疾患が含まれる。感覚過敏反応（免疫病
理学的障害の下に上記で定義された）は、補体の活性化、および好中球、マスト細胞、好
塩基球など、各種の白血球の動員／浸潤を伴うことが多いため、これらもまた炎症性疾患
（急性または慢性）と考えることができる。
したがって、本発明を用いて治療または予防し得るヒトまたは他の動物種の障害として
は、それだけに限らないが、
ｉ）虚血／再灌流傷害、再灌流傷害、脳卒中、成人呼吸逼迫症候群（ＡＲＤＳ）、喘息
、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アテローム性動脈硬化、関節リウマチ、乾癬、移植拒
絶、皮膚または臓器に対する白血球の浸潤を伴う癌、水泡性類天疱瘡、抗リン脂質抗体症
候群（ＡＰＳ）など、白血球の遊走および／または白血球の活性化を伴う障害；
ｉｉ）全身炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症性ショック、内毒素性ショック、アナ
フィラキシー性ショック、アナフィラキシー、薬剤アレルギー、感覚過敏反応、急性肺傷
害などの急性炎症；
ｉｉｉ）乾癬、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰ
Ｄ）、喘息などの慢性炎症；
ｉｖ）全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（Ｍ
Ｓ）、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、強皮症、糸球体腎炎、自己免疫性甲状腺炎（
橋本甲状腺炎）、グッドパスチャー症候群、乾癬性関節炎、水泡性類天疱瘡、重症筋無力
症、グレーブス病、Ｉ型／若年発症型／インスリン依存型糖尿病、自己免疫性貧血（例え
ば、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血）（これにはｉ）と重複する例が含まれる）などの
自己免疫疾患；
ｖ）ｉ）またはｉｉ）で対象とされない障害のほか、間質性炎症性疾患、脊椎関節症、
脊椎炎、血管炎（例えば、壊死性血管炎、皮膚性血管炎、感覚過敏性血管炎、アレルギー
性血管炎）、皮膚筋炎、皮膚炎（例えば、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、
湿疹）、アレルギー性鼻炎を含めた炎症性疾患；
ｖｉ）移植拒絶（移植、例えば、同種移植、異種移植の後における）、移植対宿主病（
ＧＶＨＤ）など、ｉ）〜ｉｉｉ）で対象とされない障害を含めた免疫病理学的障害；
ｖｉｉ）加齢黄斑変性、敗血症、膜性増殖性糸球体腎炎、デンスデポジット病、および
アルツハイマー病を含めた、上記で言及されない他の種類の障害
が挙げられる。
治療有効量の抗体を投与することが典型的である。「治療有効量」という表現は、対象
における治療または他の治療的効果を促進、誘導、および／または増強するのに十分な量
を指す。実施例節に記載の「治療有効量」の例は、１０ｍｇ／ｋｇである。
別の実施形態では、本発明の各種の抗体を用いて、例えば、好中球、単球、および／ま
たは受容体遺伝子をトランスフェクトした細胞上におけるＣ５ａＲを検出するか、または
受容体の発現を測定することができる。したがって、これらはまた、診断または研究を目
的とする細胞分類（例えば、フローサイトメトリー、蛍光活性化による細胞分類）などの
適用においても有用である。
本発明の抗Ｃ５ａＲ抗体は、特に、診断的適用のために、Ｃ５ａＲの存在または不在の
検出において価値を有する。典型的には、診断的アッセイは、Ｃ５ａＲに対する抗体また
はそのフラグメントの結合から生じる複合体の形成の検出を伴う。診断的目的の場合、抗
体または抗原結合フラグメントは、標識される場合もあり、未標識の場合もある。抗体ま
たはフラグメントは、直接的に標識することができる。それだけに限らないが、放射性核
種、蛍光物質、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、およびリガンド（例えば、ビ
オチン、ヘプテン）が含まれる各種の標識を用いることができる。当業者には、多数の適
切なイムノアッセイが知られている（例えば、ＵＳ３，８１７，８２７；同３，８５０，
７５２；同３，９０１，６５４；および同４，０９８，８７６を参照されたい）。本発明
の診断法では、組織試料の免疫組織化学もまた用いることができる。未標識の場合、抗体
またはフラグメントは、例えば、凝集アッセイにおけるとおり、適切な手段を用いて検出
することができる。未標識の抗体またはフラグメントはまた、第１の抗体（例えば、未標
識の免疫グロブリンに特異的な抗イディオタイプ抗体または他の抗体）または他の適切な
試薬（例えば、標識されたプロテインＡ）と反応性の標識された抗体（例えば、第２の抗
体）など、抗体を検出するのに用い得る別の（すなわち、１つまたは複数の）適切な試薬
との組合せでも用いることができる。
造影剤については、用い得る任意の適切な薬剤としては、それだけに限らないが、ＭＲ
Ｉ剤、ＣＴ造影剤、光学造影剤、超音波造影剤、ｐａｒａＣＥＳＴ造影剤、およびこれら
の組合せが挙げられる。ある実施形態において、該薬剤は、プロトンベースのＭＲＩ、ま
たはスカンジウム、チタニウム、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケ
ル、銅、モリブデン、ルテニウム、セリウム、インジウム、プラセオジミウム、ネオジミ
ウム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロ
シウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、およびイッテルビウムからなる群から選択
される常磁性金属キレートを含むｐａｒａＣＥＳＴ剤である。さらなる実施形態において
、該薬剤は、ヨウ素化油ナノ粒子または封入型固体金属粒子を含むＣＴ造影剤であり得る
。本発明に有用な造影剤のさらなる例は、ＰＦＯＢまたは他のフッ素ベースのＭＲＩ剤な
ど、ハロカーボンベースのナノ粒子である。
生物学的試料中におけるＣ５ａＲタンパク質の存在を検出するのに用いられるキットも
また調製することができる。このようなキットは、Ｃ５ａＲに結合する本発明の抗体のほ
か、該抗体またはフラグメントとＣ５ａＲとの間における複合体の存在を検出するのに適
する１つまたは複数の補助試薬も包含し得る。本発明の抗体組成物は、単独の、または他
のエピトープに特異的なさらなる抗体と組み合わせた凍結乾燥形態で提供することができ
る。標識される場合もあり未標識の場合もある抗体は、付属成分（例えば、トリス緩衝液
、リン酸緩衝液、および炭酸緩衝液などの緩衝液、安定化剤、賦形剤、殺生物剤、および
／または不活性タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン）を伴うキット内に包含され得
る。例えば、付属成分との凍結乾燥混合物として抗体を提供することもでき、付属成分を
別個に提供して使用者が混合することもできる。一般に、これらの付属物質は、活性抗体
量に基づく約５％未満の重量で存在し、通常、抗体濃度に基づく重量による少なくとも約
０．００１％の総量で存在する。該抗体に結合可能な第２の抗体を用いる場合、このよう
な抗体はキット内、例えば、別個のバイアルまたは容器内において提供することができる
。存在する場合、第２の抗体は、標識されることが典型的であり、本明細書に記載の抗体
製剤と類似の形で処方することができる。
組成物および投与方式
投与される本発明の抗体の製剤は、選択される投与経路および組成物の性質（例えば、
溶液、エマルジョン、カプセル）によって異なる。投与される本発明の抗体を含む適切な
医薬組成物は、生理学的に許容される担体中において調製することができる。抗体の混合
物もまた用いることができる。溶液またはエマルジョンの場合、適切な担体には、例えば
、水溶液、アルコール／水溶液、生理食塩液および緩衝媒体を含めたエマルジョンまたは
懸濁液が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デ
キストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または固定油が含まれ得る。水
、緩衝水、緩衝生理食塩液、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール
、液体ポリエチレングリコール）、デキストロース溶液、およびグリシンを含めた各種の
適切な水性担体が当業者に知られている。静脈内媒体には、各種の添加剤、防腐剤、また
は流体、栄養素もしくは電解質補給剤が含まれ得る（全般的に、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'
ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第１６版、Ｍａｃｋ編、１９８
０を参照されたい）。組成物は、場合によって、ｐＨ調整剤およびｐＨ緩衝剤、ならびに
毒性調整剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム
、および乳酸ナトリウムなど、生理学的状態を近似するのに必要とされる薬学的に許容さ
れる補助物質を含有し得る。
本発明の抗体は、当技術分野で知られている凍結乾燥法および再構成法により、凍結乾
燥させて保管し、使用前に適切な担体中で再構成することができる。選択された媒体中に
おける（１つまたは複数の）有効成分の最適濃度は、当業者によく知られた手順により経
験的に決定することができ、これは、所望される最終的な医薬製剤に依存する。吸入の場
合、抗体またはフラグメントは、溶解させ、投与に適する分注器（例えば、噴霧器（atom
izer、nebulizer）、または高圧エアゾール分注器）内に充填することができる。
治療される疾患または状態に応じて、必ずしもそれだけに限らないが、経口投与、食餌
投与、局所投与、非経口投与（例えば、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下注射
）、吸入投与（例えば、気管支内投与、眼内投与、鼻腔内投与、または経口吸入、鼻腔内
滴下）を含めた各種の投与経路が可能である。他の適切な投与法にはまた、充電式デバイ
スまたは生体分解性デバイスおよび徐放ポリマーデバイスも含まれる。
本発明の医薬組成物はまた、他の薬剤との組合せ療法の一部としても投与することがで
きる。このような他の療法／薬剤は、当業者によく知られている。一実施形態において、
障害は、関節リウマチであり、他の治療薬は、それだけに限らないが、アザチオプリン、
クロロキン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリン、Ｄ−ペニシラミン、金塩（金チオ
リンゴ酸ナトリウム、アウラノフィン）、レフルノミド、メトトレキサート、ミノサイク
リン、スルファサラジンおよびシクロホスファミドおよびグルココルチコステロイドを含
めたＡＴＣコードＭ０１Ｃクラスの抗リウマチ薬、およびＡＴＣコードＬ０４クラスの免
疫抑制薬から選択される。別の実施形態において、障害は、全身性エリテマトーデスであ
り、他の治療薬は、それだけに限らないが、アザチオプリン、クロロキン、ヒドロキシク
ロロキン、シクロスポリン、Ｄ−ペニシラミン、金塩（金チオリンゴ酸ナトリウム、アウ
ラノフィン）、レフルノミド、メトトレキサート、ミノサイクリン、スルファサラジンお
よびシクロホスファミド、グルココルチコステロイド、マイコフェノール酸またはマイコ
フェノレート、およびタクロリムスを含めたＡＴＣコードＭ０１Ｃクラスの抗リウマチ薬
、およびＡＴＣコードＬ０４クラスの免疫抑制薬から選択される。別の例において、本発
明の抗体はまた、他の抗体と組み合わせて（例えば、それだけに限らないが、ＣＣＲ２お
よびＣＣＲ３を含めたケモカイン受容体に結合する抗体と組み合わせて）、または抗ＴＮ
Ｆ薬、または他の抗炎症薬、または予防的もしくは治療的処置において用いられる、市販
のガンマグロブリン製品および免疫グロブリン製品など、既存の血漿製品と組み合わせて
も用いることができる。本発明の抗体は、抗生剤および／または抗微生物薬と共に施され
る、個別投与の組成物として用いることができる。
本発明の抗体を投与するための用量範囲は、免疫病理学的疾患の症状を改善するか、ま
たは感染症の可能性もしくは免疫系の過剰刺激を軽減する所望の効果をもたらすのに十分
な高用量である。用量は、過粘稠度症候群、肺浮腫、うっ血性心不全などの有害な副作用
を引き起こすほどの高用量ではないものとする。一般に、用量は、患者における年齢、状
態、性別、および疾患の程度により異なり、当業者により決定され得る。用量は、合併症
がある場合、個々の医師により調整され得る。用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍ
ｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、またより好ましくは約
０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇで変化し得る。用量の投与は、毎日、毎週、もしく
は隔週、または必要と判定される他の任意の頻度のほか、毎日複数回でもあり得、慢性疾
患の場合、投与は、何カ月間（またはさらに何年間）にもわたり継続され得る。
本発明の抗体は、該抗体をコードする配列を含む核酸分子を投与することにより、対象
内に導入し得ることを当業者は理解するであろう。核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形
態の場合もあり、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むキメラ分子の場合もある。抗体をコー
ドする（１つまたは複数の）ヌクレオチド配列は、該薬剤をコードする配列が発現制御エ
レメントと作動可能に連結される発現ベクター内にクローニングすることができる。発現
制御エレメントは当技術分野においてよく知られており、これには例えば、プロモーター
、エンハンサー、ならびに適切な開始コドンおよび終始コドンが含まれる。
ｉｎ ｖｉｖｏの標的細胞内に抗体をコードする核酸を導入するには、各種の方法を用
いることができる。例えば、裸の核酸を標的部位に注射することもでき、これをリポソー
ム内に封入することもでき、ウイルスベクターを介してこれを導入することもできる。
ＴＳＰ−１をコードする核酸をｉｎ ｖｉｖｏの非分裂細胞または分裂細胞内へと安定
的に遺伝子導入するには、単独の、または例えば、カチオンリポソーム内に封入した核酸
分子の直接的な注射を用いることができる（Ｕｌｍｅｒら、１９９３）。加えて、粒子照
射法を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏの各種の組織内に核酸を導入することもできる（Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓら、１９９１）。
抗体をコードする核酸分子をｉｎ ｖｉｖｏにおける特定の細胞型内へと遺伝子導入す
るには、ウイルスベクターが有用である。ウイルスは、特定の細胞型内において感染およ
び増殖し得る特殊な感染性作用物質である。特定の細胞型に感染するこの特異性は、選択
されたｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞を抗体の標的とするのにとりわけ適する。ウイルスベ
クターの選択は、標的とされる細胞型に部分的に依存する。
当技術分野では、特定の細胞型を標的とし得る特殊なウイルスベクターがよく知られて
いる。このようなベクターには、例えば、一般的プロモーターまたは組織特異的プロモー
ターを有する組換えアデノ関連ウイルスベクターが含まれる（ＵＳ５，３５４，６７８）
。組換えアデノ関連ウイルスベクターは、該組換えウイルスを、増殖しない休眠細胞のク
ロマチン内にも安定的に組み込み得るというさらなる利点を有する（Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ
ら、１９８８）。
組織特異的なプロモーターまたはエンハンサーをベクター内に組み込むことにより、コ
ードされる抗体を発現する細胞型をさらに制御するようにウイルスベクターを構築するこ
とができる（Ｄａｉら、１９９２）。
レトロウイルスベクターもまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗体をコードする核酸分子を
送達する方法に適する。このようなベクターは、感染性粒子として機能する可能性もあり
、初回１回だけの感染ラウンドを経過する非感染性粒子として機能する可能性もある。
架橋形成分子を介して核酸分子と非共有結合的に複合体化する組織特異的なリガンドま
たは抗体を用いて、抗体をコードする核酸分子を組織特異的な形で細胞内に送達するには
、受容体を介するＤＮＡ送達法もまた用いることができる（Ｃｕｒｉｅｌら、１９９２；
ＷｕおよびＷｕ、１９８７）。
対象内において抗体を発現させる遺伝子導入はまた、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏにおける
自己細胞のトランスフェクションによっても実施することができる。血液細胞は、当技術
分野でよく知られた方法による操作および対象内への再導入に容易に使用可能であるため
、このようなｅｘ ｖｉｖｏにおけるトランスフェクションに適する細胞にはこれらの細
胞が含まれる。
ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞のトランスフェクションを介する遺伝子導入は、例えば、
リン酸カルシウム沈殿、ジエチルアミノエチルデキストラン、電気穿孔、リポフェクショ
ン、またウイルス感染を含めた各種の方法により実施することができる。このような方法
は、当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照
されたい）。細胞は、トランスフェクトされると、治療される対象内に再移植（ｔｒａｎ
ｓｐｌａｎｔまたはｇｒａｆｔ）される。体内に導入された細胞は、抗体を産生すること
が可能であり、これが循環内に入り、疾患または状態の部位において血小板の凝集を阻害
し得る。
ヒト化プロセス
ＣＤＲおよびフレームワークの残基を規定する
抗体のＣＤＲおよびフレームワーク領域は、通常、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａまたは
ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登
録商標）ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）などの種々の番号付けスキームに
従って定義される。Ｋａｂａｔの定義は、配列可変性に基づき、最も一般に使用されるも
のである。しかし、Ｋａｂａｔにより規定されるような所与の抗体に関するＣＤＲは、他
の番号付けシステムによって規定されるＣＤＲと必ずしも同一ではない。２つの番号付け
システムによって規定されたＣＤＲは重複してもよく、一方が他方のいずれかの側に数残
基伸びてもよい。
本発明者らは、ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの番号付けシステムの組合せを使用して、可
変（Ｖ）ドメイン中のＣＤＲおよびフレームワーク領域を規定した。本発明者らは、抗原
結合ポケットの構造を保存するために、ヒトフレームワーク中に移植されたマウスＣＤＲ
配列の範囲を最大化することを望んだ。そこで、Ｃ５ａＲ抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔお
よびＩＭＧＴの両方の番号付けシステムによってＣＤＲとして分類されたすべての残基を
含んだ。残りの配列は、Ｖドメインフレームワークを含んだ。
適切なヒト抗体フレームワーク配列を選択する
マウスＣＤＲを移植する適切なヒト抗体フレームワーク配列を選択するために、本発明
者らは、多数のストラテジーを使用した：
ｉ）配列データベースのＢｌａｓｔ検索により、マウスＣ５ａＲ抗体に対して最高の相
同性を有するヒトＩｇ Ｖ領域の軽鎖および重鎖の配列を同定した。最も相同性が高い配
列をアラインさせ、軽鎖および重鎖についてコンセンサスフレームワーク配列を作製した
。
ｉｉ）マウスＣ５ａＲ抗体の重鎖または軽鎖に対して高い相同性を有する既知のヒト抗
体を同定し、Ｖ領域フレームワーク（または改変バージョン）を使用して、マウスＣ５ａ
Ｒ抗体のＣＤＲを移植した。
ｉｉｉ）マウスＣ５ａＲ抗体に類似するフレームワーク配列を利用する他の成功したヒ
ト化抗体を同定し、マウスＣＤＲをこれらのフレームワークに移植した。
配列データベースから相同な抗体を選択する
マウスＣ５ａＲ抗体、７Ｆ３可変領域アミノ酸配列（重鎖および軽鎖の両方、配列番号
１および２を参照のこと）を、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴおよびＧｅｎｂａｎｋデータベース中
のヒト免疫グロブリンのＢｌａｓｔｐ検索においてクエリー配列として個々に使用した。
マウス７Ｆ３可変領域ＤＮＡ配列（重鎖および軽鎖の両方をコードする、配列番号３お
よび４を参照のこと）を、ヒト免疫グロブリン遺伝子のＩＭＧＴデータベースのＢｌａｓ
ｔ検索においてクエリー配列として個々に使用した。
クエリー配列に対して最高の相同性を有する配列のリストを、各検索から作製した（表
２および３）。
コンセンサスフレームワーク配列−軽鎖７Ｆ３
７Ｆ３軽鎖ＣＤＲを移植するための軽鎖ヒトフレームワークコンセンサス配列を、表２
中の以下の配列をアラインさせることによってＣｌｕｓｔａｌＷを用いて生成した：ＫＶ
２Ｆ＿ＨＵＭＡＮ、ＫＶ２Ｄ＿ＨＵＭＡＮ、ＫＶ２Ｅ＿ＨＵＭＡＮ、ＫＶ２Ｂ＿ＨＵＭＡ
Ｎ、ＫＶ２Ａ＿ＨＵＭＡＮおよびＤＮＡ配列Ｘ１２６９１、Ｕ４１６４５、Ｕ４１６４４
、Ｍ３１９５２のアミノ酸翻訳。このアラインメントおよびコンセンサス配列を図１中に
示す。このヒトコンセンサスフレームワークは、マウスＣ５ａＲ抗体７Ｆ３軽鎖フレーム
ワーク配列に対して８６％同一であった。
コンセンサスフレームワーク配列−重鎖７Ｆ３
７Ｆ３重鎖ＣＤＲを移植するためのコンセンサスヒトフレームワーク配列を、以下のよ
うに作製した：
ａ）Ｖ領域アミノ酸配列ＨＶ１Ｃ＿ＨＵＭＡＮ、ＨＶ１Ｂ＿ＨＵＭＡＮ、ＨＶ１Ｇ＿Ｈ
ＵＭＡＮおよびＨＶ１Ａ＿ＨＵＭＡＮならびにＶ遺伝子配列Ｘ９２３４３、Ｘ６２１０９
、Ｍ９９６４１、Ｍ９９６４２およびＺ１２３０５のアミノ酸翻訳を、ＣＬＵＳＴＡＬＷ
を使用してアラインさせ、コンセンサスＶ領域フレームワーク配列を生成した。
ｂ）Ｊ領域アミノ酸配列ＨＶ３Ｋ＿ＨＵＭＡＮ、ＨＶ２Ｉ＿ＨＵＭＡＮ、ＨＶ１Ｃ＿Ｈ
ＵＭＡＮ、ＨＶ３Ｈ＿ＨＵＭＡＮおよびＨＶ３Ｔ＿ＨＵＭＡＮを、ＣＬＵＳＴＡＬＷを使
用してアラインさせ、コンセンサスＪ領域フレームワーク配列を生成した。
これらのアラインメントおよびコンセンサス配列を図２に示す。
相同なヒト化抗体を選択する
他の適切なフレームワーク配列を、マウス抗体配列と最も近く一致する成功したヒト化
抗体に関する文献を検索することによって選択した。
２つの軽鎖フレームワーク配列を、７Ｆ３軽鎖ＣＤＲを移植するために同定した：
・Ｃａｌｄａｓら（２００３）に記載されたＫＶ２Ｆベースの配列
・Ｎｉｓｉｈａｒａら（２００１）に記載されたＨｕＶＬ−１９ベースの配列
７Ｆ３重鎖ＣＤＲを移植するために同定された重鎖フレームワーク配列は以下のとおり
であった：
・ Ｃａｌｄａｓら（２０００）に記載されたＨＧ３ベースの配列
・ Ｎｉｓｉｈａｒａら（２００１）に記載されたＳＧＩ−ＶＨベースの配列
フレームワーク配列へのＣＤＲの移植ならびにヒト化軽鎖配列および重鎖配列の作製
ヒト化７Ｆ３軽鎖
３つのバージョンのヒト化７Ｆ３軽鎖可変領域を作製した。
第１のヒト化７Ｆ３軽鎖可変領域は、図１からコンセンサスヒトフレームワーク配列を
取得し、この配列をマウス７Ｆ３フレームワーク配列と比較し、ヒトフレームワーク中の
選択されたアミノ酸をマウス残基に逆変化させ、次いでマウス７Ｆ３軽鎖ＣＤＲに移植す
ることによって設計した（図３）。マウス配列に逆変化させるために選択したヒトフレー
ムワーク中の残基は以下のとおりであった：＃２でＩｌｅからＶａｌ、＃１５でＰｒｏか
らＬｅｕおよび＃９２でＴｙｒからＰｈｅ。最初の２つの変化は、マウスにおいて見出さ
れた残基が、マウス７Ｆ３に対して最も相同性が高いヒト配列（すなわち、ＫＶ２Ｆ＿Ｈ
ＵＭＡＮ）中のアミノ酸と一致したために行った。３番目の変化は、ＣＤＲ３に近いこと
、および抗体結合領域の構造への変化を最小化する必要性に起因して、行った。マウス７
Ｆ３軽鎖ＣＤＲを、改変されたコンセンサスフレームワーク配列中に移植して、配列ｈ７
Ｖｋ（図３）（配列番号３１）を作製した。
第２のヒト化７Ｆ３軽鎖可変領域は、マウス７Ｆ３軽鎖ＣＤＲをヒト化ＨｕＶＬ−１９
フレームワーク配列、ＲＮＯＫ２０３ＶＬ、上記（図４）に移植することによって作製し
た。これにより、配列ｈ７ａＶｋ（図４）（配列番号３２）が得られた。
第３のヒト化７Ｆ３軽鎖可変領域は、マウス７Ｆ３軽鎖ＣＤＲをＫＶ２Ｆ由来のフレー
ムワーク配列ＶＬＣＤ１８−Ｑ、上記（図５）に移植することによって作製した。ＫＶ２
Ｆ＿ＨＵＭＡＮフレームワーク配列（図１および配列番号５を参照のこと）と比較して、
２つのアミノ酸を、マウス７Ｆ３配列に逆変化させた：＃５１ではＡｒｇからＬｅｕに変
化して、２番目の荷電残基が除去された。このとき、マウスにおいてはただ１つの変異が
存在し、＃１０９でＶａｌからＬｅｕであった。さらなる１つの差異は、嵩高い側鎖を除
去する、残基＃１０５でのＧｌｎからＧｌｙへの変化である。これにより、配列ｈ７ｂＶ
ｋ（図５）（配列番号３３）が得られた。
作製された３つのヒト化７Ｆ３ Ｖｋ配列の比較を図６に示す。これらの配列は、フレ
ームワーク領域中の２〜５の位置でコンセンサス配列ｈ７Ｆ３ ＶｋＣｏｎｓから変化し
ており、これは、これらすべてが互いに９３％同一であることを意味する。以下に示すデ
ータは、特定の軽鎖を含むヒト化７Ｆ３抗体が、他のものよりも好ましいことを示してい
る。特に、ＣＤＲループＬ１とＬ２との間の残基が重要であり、この領域中での特定の変
化は有害な影響を有し得る（例えば、残基＃４１でのＣｙｓ残基の導入）。さらなる荷電
残基の導入などの他の変化は、相対的な影響をほとんど有さなかった。これらの変化を含
む抗体の特性に対して有害でない他の変化が、ヒト化７Ｆ３ Ｖｋ配列に対してなされ得
る。
ヒト化７Ｆ３重鎖
３つのバージョンのヒト化７Ｆ３重鎖可変領域を作製した。
第１のヒト化７Ｆ３重鎖可変領域は、図２からコンセンサスヒトフレームワーク配列を
取得し、この配列をマウス７Ｆ３フレームワーク配列と比較し、ヒトフレームワーク中の
選択されたアミノ酸を変化させ、次いでマウス７Ｆ３重鎖ＣＤＲに移植することによって
設計した（図７）。ヒトコンセンサスフレームワーク中の変更させた残基は以下のとおり
であった：＃２０でＩｌｅに、＃４３でＬｙｓに（荷電残基を保持するため）、＃７２で
Ａｌａに（荷電残基を除去するため）、＃９１でＳｅｒに、および＃９５でＰｈｅに。こ
れらの残基はマウスフレームワークと同じであったが、少なくとも１つのヒトＩｇ配列中
にも見出された。さらに、Ｆ３中の比較的あいまいな領域を、この時点でＨＶ１Ａｖ配列
を選択することによって解消し、こうして残基＃７０でＩｌｅを、＃７４でＧｌｕを組み
込んだ。マウス７Ｆ３重鎖ＣＤＲを改変されたコンセンサスフレームワーク配列中に移植
することにより、配列ｈ７Ｖｈ（図７）（配列番号３４）を作製した。
第２のヒト化７Ｆ３重鎖可変領域は、マウス７Ｆ３重鎖ＣＤＲをＳＧＩ−ＶＨ由来のフ
レームワーク配列、上記（図８）に移植することによって作製した。ＳＧＩ−ＶＨフレー
ムワーク中の６つの位置で、ヒト残基をマウス７Ｆ３残基に変化させた。これらの変化は
、残基＃３８（ＡｒｇからＬｙｓ）、＃４８（ＶａｌからＩｌｅ）、＃６７（Ａｒｇから
Ｌｙｓ）、＃６８（ＶａｌからＡｌａ）、＃７２（ＬｅｕからＡｌａ）および＃７７（Ａ
ｓｎからＳｅｒ）で行った。これらの残基がＣＤＲのＨ１またはＨ２に密に近接しており
、結合ポケットの形成に重要であると考えられたために、これらの変化を行った。例えば
、配列ＲＮＯＫ２０３ＶＨを作製するためのＳＧＩ−ＶＨ中のこれらの位置での逆変異は
、ヒト化抗ＦａｓＬ抗体の中和活性を改善することが示されている（Ｎｉｓｉｈａｒａら
、２００１）。これにより、配列ｈ７ａＶｈ（図８）（配列番号３５）が得られた。
第３のヒト化７Ｆ３重鎖可変領域は、マウス７Ｆ３軽鎖ＣＤＲをＨＧ３由来のフレーム
ワーク配列、上記（図９）に移植することによって作製した。ＨＧ３フレームワーク中の
１つの位置、残基＃７１（Ａｒｇ）を、マウス７Ｆ３残基（Ａｌａ）に逆変異させて、正
に荷電した残基を除去した。これにより、配列ｈ７ｂＶｈ（図９）（配列番号３６）が得
られた。
作製された３つのヒト化７Ｆ３ Ｖｈ配列の比較を図１０に示す。これらの配列は、フ
レームワーク領域中の１〜８の位置でコンセンサス配列ｈ７Ｆ３ＶｈＣｏｎｓから変化し
ており、これは、これらすべてが互いに９０％同一であることを意味する。配列間のいく
つかの重要な差異には、残基＃４３でのＬｙｓ対Ｇｌｎおよび＃７４でのＧｌｕ対Ｔｈｒ
が含まれる。しかし、以下に示すデータは、３つの重鎖のいずれかを含むヒト化７Ｆ３抗
体が、ヒトＣ５ａＲへのＣ５ａの結合を遮断するのに有効であることを示している。従っ
て、Ｖｈ配列間の差異は重要でないと思われ、このような改変配列を含む抗体の特性に有
害でない他の変化が、ヒト化７Ｆ３ Ｖｈ配列になされ得る。それにもかかわらず、ヒト
化７Ｆ３ Ｖｈ配列になされた特定の置換は抗体の特性を改善し得る可能性があり、他の
置換は有害である可能性がある。
分子モデリング
背景
抗体結合部位のモデリングは、タンパク質相同性モデリング（多数の抗体構造が既知の
データベースとして機能し得る）とａｂ ｉｎｉｔｉｏモデリング（相同性法を適用する
にはあまりに可変すぎる抗体の部分のために使用すべきもの）との組合せである。可変フ
ラグメント（Ｆｖ）フレームワーク領域（ＦＷ）の大多数は、種々の抗体間で構造が十分
保存されている。特にβ鎖で生じるバリエーションを考慮した後、このフレームワークは
、モデリングするＦｖに配列が最も近い既知の構造の選択によって、モデリングできる。
抗体中のほとんどの配列および構造の可変性は、抗原に結合する超可変領域（ＣＤＲ）
に制限される。これら６つのループ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）は抗体
表面に位置し、これらのＣＤＲのモデリングは最大の困難となっている。Ｈ３以外のすべ
てのＣＤＲは、通常、２〜６の構造的（カノニカル）クラスのうち１つに入る（Ｃｈｏｔ
ｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９）。カノニカルクラスの
メンバーは、すべてほぼ同じ骨格コンフォメーションを有する。つまり、未知のＣＤＲを
モデリングするためには、配列を試験し、適切なカノニカルクラスを割り当て、最も配列
が相同な既知のＣＤＲを使用する。Ｈ３ループは、構造間でコンフォメーションがかなり
異なるため、モデリングがより困難である。
現在の抗体モデリング方法は通常、相同性アプローチをとっている（例えば、Ｐｕｌｉ
ｔｏら、１９９６；Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔら、１９９３；Ｂａｒｒｙら、１９９４を参照の
こと）。ＷＡＭ（Ｗｅｂ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ、ｈｔｔｐ：／／ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋを参照のこと）が使用するアルゴリズムは、既知の
抗体構造のデータベースから選択された、モデリングする配列に対して最も配列が相同な
フレームワークおよびカノニカルＣＤＲループを使用する。
ノンカノニカルループには、異なる方法が使用される。これはＭａｒｔｉｎら（１９８
９）のＣＡＭＡＬ（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ Ａｌｇ
ｏｒｉｔｈｍ）であり、データベース／コンフォメーション検索の組合せからなる。
モデル作製
ＷＡＭを使用して、マウス７Ｆ３ Ｆｖ領域（重鎖および軽鎖の両方を有する）のモデ
ルならびにヒト化７Ｆ３ Ｆｖ領域のモデルを作製した。
本発明者らは、ヒト化７Ｆ３の重鎖および軽鎖のそれぞれについていくつかの配列変異
体を作製していたので、ヒト化Ｆｖ領域の多数のモデルを作成した（それぞれ、１つのＶ
領域軽鎖およびＶ領域重鎖を含む）。各ヒト化Ｆｖモデルをマウス７Ｆ３ Ｆｖ構造と比
較し、ＣＤＲの構造をＤｅｅｐＶｉｅｗ／ＳＷＩＳＳ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒを使用して詳
細に比較した。２つの構造間の差異を強調した。例えば、ｈ７Ｖｋ−ｈ７Ｖｈ構造を７Ｆ
３ Ｆｖ構造と比較したとき、７Ｆ３ Ｖｋへのｈ７Ｖｋ軽鎖の一致は非常に良好であり
、ほぼ同一であったが、重鎖ＣＤＲ Ｈ２およびＨ３は密にアラインしなかった。対照的
に、ｈ７ａＶｋ−ｈ７ａＶｈ配列を含む別のモデルにおいて、７Ｆ３ Ｖｈとの重鎖アラ
インメントはｈ７Ｖｈとよりも良好であったが、軽鎖アラインメントはＣＤＲがかなり異
なっていた。この分析から、ｈ７Ｖｋとｈ７ａＶｈとの組合せは、７Ｆ３に最も類似した
抗体を生じ得ると推測された。ｈ７ｂＶｋ−ｈ７ｂＶｈ配列を含む抗体の分析により、Ｃ
ＤＲ Ｌｌ、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３が、他のｈ７Ｆ３重鎖および軽鎖と比較して、等価な
７Ｆ３のＣＤＲとは、構造的により異なっていることが明らかとなった。これは、ｈ７ｂ
Ｖｋまたはｈ７ｂＶｈ配列を含む抗体が、これらの配列を含まない７Ｆ３またはヒト化７
Ｆ３抗体ほど有効ではない可能性があることを示唆している。これを考慮すると、ｈ７ｂ
Ｖｈ配列を含む１つの抗体が７Ｆ３に対する優れた活性を有していることが示されたこと
は、驚くべき予測できないことであった（例えば、実施例５、図１７を参照のこと）。
次のステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで試験するために、上記ヒト
化７Ｆ３重鎖および軽鎖の配列を抗体へと変換することであった。
ヒト化抗体の発現および産生
抗体可変領域遺伝子を、定常領域遺伝子を含むベクター中にクローニングする
重鎖および軽鎖の可変アミノ酸配列を、上記のように設計した。これらのドメインを含
む抗体を産生するために、各可変領域をコードするＤＮＡ配列を合成した（Ｇｅｎｅｓｃ
ｒｉｐｔ Ｃｏｒｐ．）。ベクターｐＵＣ１８中へのクローニングを容易にするために、
ＥｃｏＲ１部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を５’末端または３’末端に付加した。さらに
、軽鎖可変遺伝子は、各末端に独自のＢｓｍＢ１制限部位を有していた。重鎖遺伝子は５
’末端にＢｓｍＢ１部位を有し、３’末端にＮｈｅ１部位を有していた。
全長抗体遺伝子を構築するために、分泌シグナルおよび定常領域をコードするベクター
中に可変領域遺伝子をサブクローニングした。軽鎖については、このベクターは、２つの
独自のＢｓｍＢ１部位によって分離された、分泌シグナル配列およびヒト定常κ（Ｃκ）
領域遺伝子を含んでいた。重鎖ベクターは、ＢｓｍＢ１部位およびＮｈｅ１部位によって
分離された、分泌シグナルおよびヒト定常γ（Ｃγ）領域遺伝子を含んでいた。重鎖ベク
ターは、γ１（Ｃγ１）、γ２（Ｃγ２）、γ３（Ｃγ３）、γ４（Ｃγ４）、γ４ＰＥ
変異体（Ｃγ４ＰＥ）またはγ４Ｐ変異体（Ｃγ４Ｐ）遺伝子のいずれかを含んでいた。
クローニングプロセスは、標準的方法によるプラスミドＤＮＡの調製、製造業者（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓおよびＰｒｏｍｅｇａ）が推奨するＢｓｍＢ１（軽
鎖ベクターおよびＶｋ領域遺伝子）またはＢｓｍＢ１およびＮｈｅｌ（重鎖ベクターおよ
びＶｈ領域遺伝子）によるプラスミドＤＮＡの消化、アガロースゲル電気泳動によるＤＮ
Ａフラグメントの分離、ゲル抽出キット（ＪｅｔＱｕｉｃｋ、Ｇｅｎｏｍｅｄ）を使用し
たゲルからのＤＮＡフラグメントの回収、ベクターフラグメントへの可変遺伝子フラグメ
ントのライゲーション（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、コンピテントＥ．ｃ
ｏｌｉ細胞（ＴＯＰ１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へのＤＮＡの形質転換を含んでいた
。形質転換細胞由来のプラスミドＤＮＡを、制限消化によって分析し、プラスミド中の抗
体配列を配列決定して、正しいリーディングフレームでサブクローニングされた可変領域
を確認した。
抗体遺伝子を発現ベクター中にサブクローニングする
全長抗体遺伝子が正確な配列を有していることを確認した後で、それを発現ベクター中
にサブクローニングした。使用できる発現ベクターの例には、ｐｃＤＮＡ、ｐＬＥＮＴＩ
、ｐＴ−ＲＥＸ、ｐＡｄ、ｐＲＥＰまたはｐＣＥＰ哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）、ｐＴｒｉＥｘｌまたはｐＢａｃベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ＺＡＰおよび
ｐＣＭＶ発現ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＧＳ発現系ベクター（例えば、ｐＥＥ
１２．４およびｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ））、ｐＣＭＶ５ ｃｕｍａｔｅ発現系ベクタ
ー（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）、ＵＣＯＥ発現系プラスミド（ＭＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
）またはＭＡＲｔｅｃｈ発現プラスミド（Ｓｅｌｅｘｉｓ）のいずれかが挙げられる。こ
の場合、重鎖遺伝子（５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を有し、３’末端にＥｃｏＲ１部位
を有する）を、マウスＤＨＦＲ遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３由来ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）中のＣＭＶプロモーターの下流のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲ１部位および／また
はＧＳ発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）中にサブクローニングした。軽鎖遺伝子（５’末端に
Ｓｐｅ１部位を有し、３’末端にＥｃｏＲ１部位を有する）を、ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ
／ＢＳＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｈｅ１−ＥｃｏＲ１部位中にサブクローニングし
た。５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を有し、３’末端にＥｃｏＲＩ部位を有する軽鎖遺伝
子も、ＧＳ発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位中にサブクロ
ーニングした。ある場合には、重鎖発現カセット（プロモーター、軽鎖コード配列および
ポリアデニル化シグナル）を軽鎖ベクター中にサブクローニングして、重鎖および軽鎖の
両方を発現する単一のベクターを作製した。
哺乳動物細胞においてヒト化抗体を発現させる
ヒト化抗体を発現させるために、重鎖および軽鎖のベクターを、リポフェクタミン（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＣＨＯ細胞中に共トランスフェクトした。あるいは、ベ
クターＤＮＡは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接インジェクショ
ン、遺伝子銃または当業者に公知の別の方法によってトランスフェクトできる。あるいは
、ベクターＤＮＡは、任意の多数の細胞株（例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＨＥＫ２９３、Ｐ
ｅｒＣ６またはＮＳ０）中にトランスフェクトできる。ある場合には、重鎖および軽鎖の
両方をコードする単一のベクターを、エレクトロポレーションにより、またはリポフェク
タミンを使用して、細胞中にトランスフェクトした。
形質転換の一日前に、４×１０５のＣＨＯ ｄｈｆｒ−細胞（ＡＴＣＣ）を、１５ｍｌ
の非選択的培地（ヌクレオシドを含むα−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭのＬ
−グルタミン、１０％ＦＢＳ）中でＴ１７５フラスコ中に播種し、５％ＣＯ２中３７℃で
インキュベートした。トランスフェクションの直前に、８００μｌの増殖培地中のプラス
ミドＤＮＡ（１５μｇ）を、８００μｌの増殖培地中の１００μｌのリポフェクタミン（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加し、室温で２０分間インキュベートした。細胞単層をＰＢ
Ｓでリンスし、ＤＮＡ／リポフェクタミン混合物を、５ｍｌの増殖培地を含むフラスコに
添加した。５％ＣＯ２中３７℃で１６時間インキュベートした後、もう１０ｍｌの培地を
添加した。一日後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１５ｍｌの選択培地（ヌクレオシドを含まな
いα−ＭＥＭおよび５％透析ＦＢＳ）を添加した。２日後、１ウェル当たり約２〜５細胞
の平均密度で、接着細胞を９６ウェルの組織培養プレート中に再プレートした。さらに２
〜３週間の増殖の後、ヒトＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡを使用して抗体産生を測定した。抗体
を発現する細胞を、産生のためにＴ−フラスコ中に増殖させた。培養培地を回収し、以下
に記載するように抗体を精製した。ＧＳ系発現ベクターをＣＨＯＫ１ＳＶ細胞中にトラン
スフェクトし、抗体分泌細胞株を単離して、製造業者（Ｌｏｎｚａ）の推奨するとおりに
産生のために増殖させた。
ヒト化抗体の精製
トランスフェクトされた細胞は、増殖培地中に抗体を分泌する。抗体を、プロテインＡ
またはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥまたはヒトＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡによって同定した、抗体を含む画分をプールした
。ヒトＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡを使用して、回収された抗体の量およびその濃度を決定し
た。抗体純度を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって概算した。
産生しアッセイしたヒト化抗体のリスト
表４は、産生された種々の抗体を列挙し、抗体中に存在する重鎖および軽鎖の配列を示
す。
ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体を用いた結合研究
ヒトＣ５ａ受容体（ｈＣ５ａＲ）に対するヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体の結合動態を特徴付け
るために、２つのタイプの結合研究を本実施例に記載する。第１の結合研究は、競合的リ
ガンド結合アッセイにおいてヒトＣ５ａＲに対する抗体およびＣ５ａの結合を比較した。
第２の結合研究は、ヒトＣ５ａＲを発現する細胞における飽和結合を含んだ。
Ａ．ヒト化抗Ｃ５ａＲは、Ｃ５ａＲへのＣ５ａ結合を置換する−競合的リガンド結合ア
ッセイ
ｈＣ５ａＲ遺伝子をトランスフェクトしたＬ１．２細胞またはヒト好中球への１２５Ｉ
標識Ｃ５ａの結合を阻害するヒト化Ａｂの能力を、以下に記載するとおり試験した。組換
えヒトＣ５ａは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）か
ら取得した。２２００Ｃｉ／ｍＭの比活性を有する１２５Ｉ−Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅ
ｒ標識した補体Ｃ５ａは、ＮＥＮ−Ｄｕｐｏｎｔ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。
簡潔に述べると、Ｌ１．２／ｈＣ５ａＲ安定トランスフェクタントを数日間増殖させ、そ
の後実験を５ｍＭ酪酸で一晩処理して、結合アッセイ前にｈＣ５ａＲ発現を刺激した。ヒ
ト好中球を、健康なボランティアから採取した静脈血から精製した。好中球は、パーコー
ル密度遠心分離によって他の白血球から分離し、その後赤血球溶解ステップを行った。両
方の細胞型をＰＢＳで１回洗浄し、結合緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１
ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５％ ＢＳＡ）中に１×１０７／ｍｌの濃
度で再懸濁した。４０μｌ（４×１０５細胞）のアリコートを、９６ウェルのマイクロタ
イタープレート中に分配し、その後非放射性競合物（抗体またはヒトＣ５ａ）を添加した
。細胞および非放射性競合物を室温で１５分間インキュベートし、その後、放射能標識し
たＣ５ａを０．４ｎＭの最終濃度になるよう添加した。最終反応体積は１２０μｌであっ
た。室温で６０分間のインキュベーション後、０．１５ＭのＮａＣｌを含む結合緩衝液１
５０μｌで、細胞を３回洗浄した。次いで、細胞ペレットを、ＴｏｐＣｏｕｎｔ Ｓｃｉ
ｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）で計数した。試料を、各々６
〜８の濃度で、３連でアッセイした。各抗体は、少なくとも３回の別々のアッセイで試験
した。各試料中の計数を、バックグラウンドの差し引き後、非放射性競合物を添加してい
ないウェルで観察された最大１２５Ｉ−Ｃ５ａ結合の百分率として表した。
ヒト好中球およびＬ１．２／ｈＣ５ａＲトランスフェクタントにおける、マウス抗体７
Ｆ３と比較した各ヒト化抗体についてのこの分析の結果（置換曲線）を、それぞれ図１１
および１２に示す。表５は、各抗体についてのＥＣ５０値を示す。これらの値は、Ｇｒａ
ｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、データを１部位での競合に関する非線
形方程式にフィッティングさせて得た。データは、すべてのヒト化抗体が受容体から放射
能標識Ｃ５ａを置換するのに等しく有効であるわけではないことを示している。ヒト化抗
体ＯおよびＮは、ヒト好中球ではマウス７Ｆ３と同様に有効であったが、抗体Ｃ、Ｊ、Ｍ
、Ｎ、ＯおよびＱは、Ｌ１．２／ｈＣ５ａＲトランスフェクタントでは７Ｆ３と有意に異
ならなかった。
Ｂ．精製されたヒト好中球に対する抗Ｃ５ａＲ抗体の飽和結合
上記のように単離したヒト好中球を、ｄＰＢＳ中に再懸濁し、１×１０５細胞（２５μ
ｌ中）を、９６ウェルプレートのウェル中に分配した。等体積（２５μｌ）の２×抗体（
ＰＢＳ中に希釈）を、各ウェルに添加した。２倍連続希釈を使用した最終抗体濃度は、４
０〜０ｕｇ／ｍｌ（未標識のｈＡｂ−Ｑ、ｈＡｂ−Ｊおよび７Ｆ３を使用）の範囲であっ
た。細胞と抗体とを、４℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、１０
０μｌ ＰＢＳ＋１％ ＢＣＳを各ウェルに添加し、プレートを２，０００ｒｐｍで３分
間遠心分離した。細胞を、ＰＢＳ＋１％ ＢＣＳ中で３回洗浄し、ＰＢＳ中に１／３００
希釈した抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ Ｆ１６４１）または抗マウスＩｇＧ−Ｆ
ＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ １９５−１１５−００３）中に再懸濁し、氷上で２０分間イン
キュベートした。細胞を上記のように１回洗浄し、フローサイトメトリーによる分析のた
めにＰＢＳ＋１％ ＦＣＳ中に再懸濁した。ＦＳＣ対ＳＳＣ散乱を使用して好中球を同定
し、各試料について中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓ
ｍ（ｖ４．０）ソフトウェアを用いてデータ（ＭＦＩ−バックグラウンド対ｌｏｇ１０［
抗体濃度］）をシグモイド用量反応（傾き変動）（すなわち、４パラメーターのロジステ
ィック方程式）にフィッティングさせることによって、ＥＣ５０値を決定した。Ｂｍａｘ
およびＫＤを、１部位結合双曲線方程式にデータをフィッティングさせることによって決
定した。
図１３は、２つの飽和結合グラフを示し、ｘ軸はｌｏｇ１０（ＥＣ５０を計算するため
）および線形（ＢｍａｘおよびＫＤを計算するため）スケールである。データは、４℃で
のヒト好中球へのヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ＮおよびＱの結合のＫＤおよびＥＣ５０値が、７
Ｆ３よりも約２〜３倍高かったことを示している。ヒト化抗体についてのＫＤおよびＥＣ
５０は類似しており、それぞれ約２０〜２５ｎＭ（約３ｕｇ／ｍｌ）であるが、７Ｆ３に
ついてのＫＤおよびＥＣ５０は、このアッセイの条件下で約８〜１０ｎＭの範囲であった
。
ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体は、ヒトＣ５ａＲの第２細胞外ループ中のエピトープＥＥＹＦＰ
Ｐ（配列番号３８）に結合する。
方法
キメラ受容体に対する抗体結合
マウスおよびヒトのＣ５ａＲのセグメントを含む一連のキメラ受容体を構築して、抗体
が結合するＣ５ａ受容体の領域を同定した。これらの受容体は、標準的な分子技術を使用
して作製した（Ｌｅｅら、２００６）。種々のキメラ受容体をコードする各組換えベクタ
ー（ＤＭＥＭ中希釈で５μｇ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）を使用して、５×１０５のマウスＬ１．２細胞中にトランスフェクトした。
細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させた。２４時間または４８時間の後、細胞を１，５００ｒｐ
ｍで５分間遠心分離することによって回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ウシ血清アルブミン
を含むリン酸緩衝生理食塩水）中に再懸濁した。ｈＡｂ−Ｑでの染色のために、０．５×
１０５のトランスフェクト細胞を、１ウェル当たり５０μｌの体積中５μｇ／ｍｌまたは
１０μｇ／ｍｌの抗体と共に、４℃で２０分間インキュベートした。細胞を上記のとおり
ペレット化し、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、その後、１：２００または１
：３００希釈したＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ１６４１）５
０μｌを添加した。この混合物を４℃で２０分間インキュベートし、その後細胞をペレッ
ト化し、ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、最後に１５０〜２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に
再懸濁した。試料はＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析
した。
第２細胞外ループ由来のペプチドへの抗体結合
ヒトＣ５ａＲの第２細胞外ループ（第３細胞外ドメイン）にわたる、各々次のペプチド
から１残基ずつずれた２２個の重複するペプチド（１２マー）のセットを合成した（Ｍｉ
ｍｏｔｏｐｅｓ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）。各ペプチドは、そのＮ末端にビオチン基および
４アミノ酸リンカー（ＳＧＳＧ）を付けて作製した。合成した１つのペプチド２３番は、
ｈＣ５ａＲの第２細胞外ループの全長（配列番号３７由来の残基１７３〜２０５）に相当
する３３マーであり、これもＮ末端にビオチン−ＳＧＳＧを有していた。この実験で使用
したペプチドは、Ｌｅｅら（２００６）に記載されている。
この実験は、３８４ウェルのストレプトアビジン被覆プレートにペプチドを結合させ、
次いでこのペプチドと共に抗体をインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）にコンジュゲート化した抗マウスＩｇＧを用いて、結合した抗体を検出することによ
って以下のように実施した。各ペプチドを２００μｌの６０％ ＤＭＳＯ中に溶解させて
、１０ｍｇ／ｍｌの濃度にした。ペプチドを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０／アジド溶液（Ｐ
ＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０中０．１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウム）でさらに１：
１０００希釈して、１０μｇ／ｍｌの作業濃度にした。
３８４ウェルのストレプトアビジン被覆プレート（Ｎｕｎｃ）を、１ウェル当たり２０
μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％ｗ／ｖのＢＳＡ）でブロッキングした。プレー
トをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液（ＰＢＳ中０．１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０）で４回
洗浄した。２０μｌの希釈ペプチド溶液をウェルに移し、プレートを室温で１時間インキ
ュベートした。プレートを（上記のように）４回洗浄した後、２０μｌの抗体（０．５、
１、１．２５、２．５または５μｇ／ｍｌ）をウェルに添加し、プレートを２０℃で１時
間インキュベートした。このプレートを上記のように４回洗浄し、次いで２０μｌのＨＲ
Ｐコンジュゲート化抗マウスＩｇＧ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０中に１：５０００希釈）を
各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、このプレートを（上記のよう
に）３回洗浄し、次いでＰＢＳで２回洗浄して微量のＴｗｅｅｎを除去した。ペルオキシ
ダーゼの存在を、新たに調製したＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ試薬（ＢＤ Ｏｐｔ ＥＩ
Ａ）を各ウェルに２０μｌ添加し、室温で２０分間インキュベートすることによって検出
した。最後に、プレートを６５０ｎｍ／４５０ｎｍで読み取った。
第２細胞外ループ内の必須アミノ酸の同定：アラニンスキャニング変異ペプチド。
エピトープＥＥＹＦＰＰ（配列番号３７由来の残基１７９〜１８４）（配列番号３８）
中の必須結合残基をさらに規定するために、ヒトＣ５ａＲの第２細胞外ループ配列ＶＲＥ
ＥＹＦＰＰＫＶＬＣ（配列番号３７由来の残基１７７〜１８８）（配列番号５８）を含み
、結合モチーフ中の種々の位置がアラニン置換された、一連の短いペプチド（１２マー）
を、そのＮ末端にビオチン基および４アミノ酸リンカー（ＳＧＳＧ）を付けて、上記のよ
うに合成した（Ｌｅｅら、２００６）。ペプチドＡ１はＡｌａ置換を有さず、ペプチドＡ
１４はペプチドＡ１のスクランブル化バージョンであった。ペプチドＡ２〜１３は、１２
から１までの各アミノ酸位置に、それぞれ１つのアラニン置換を含んだ。ＥＬＩＳＡプレ
ート上を被覆したペプチドへの抗体の結合を、上記のように実施した。
Ｎ末端ペプチド（ＰＥＰ１）ＥＬＩＳＡ
３８４ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を、ＰＢＳ／０．０１％ Ｔｗ
ｅｅｎ−２０中１〜１５μｇ／ｍｌの濃度の、ヒトＣ５ａＲの残基９〜２９に対応するペ
プチド（ＰＥＰ１）で３７℃で１．５時間被覆し、次いで３回洗浄した。このプレートを
、１ウェル当たり２０μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％ｗ／ｖのＢＳＡ）で４℃
で一晩ブロッキングした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％ｖ
／ｖのＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。２０μｌの抗体（最終濃度５μｇ／ｍｌ）を
各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートを上記のよ
うに３回洗浄し、次いで２０μｌのＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧκ（ＰＢＳ／Ｔ
ｗｅｅｎ２０中１：８０００希釈）またはＨＲＰコンジュゲート化抗マウスＩｇＧ（１：
７５００希釈）を各ウェルに添加した。室温で２時間インキュベートした後、プレートを
（上記のように）４回洗浄した。ペルオキシダーゼの存在を、新たに調製したＴＭＢ Ｓ
ｕｂｓｔｒａｔｅ試薬（ＢＤ Ｏｐｔ ＥＩＡ）を各ウェルに２０μｌ添加し、室温で２
０分間インキュベートすることによって検出した。最後に、１ウェル当たり２０μｌの１
Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた後、プレートリーダーでプレートを４５０ｎｍ（参照
６２０ｎｍ）で読み取った。
結果
ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体が、親抗体７Ｆ３と同じヒトＣ５ａＲ中の結合部位を認識したこ
とを確認するために、４つの実験を実施した。第一に、ｈＡｂ−Ｑを使用して、種々のキ
メラヒト／マウスＣ５ａＲを発現する細胞を染色した。第二に、ｈＡｂ−ＪおよびＱを、
ｈＣ５ａＲの第２細胞外ループを含む重複する一連のペプチド（１２マー）と共にインキ
ュベートした。第三に、ｈＡｂ−ＪおよびＱを、各位置にＡｌａ置換を有するヒトＣ５ａ
Ｒの第２細胞外ループ由来の１２アミノ酸モチーフを含む一連の変異体ペプチドと共にイ
ンキュベートした。第四に、ｈＡｂ−ＪおよびＱを、ヒトＣ５ａＲのＮ末端細胞外ドメイ
ン由来の残基９〜２９を含むペプチドと共にインキュベートした。
ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体は、ヒトＣ５ａＲの第２細胞外ループを含むキメラ受容体に結合
する。
各細胞外ドメイン中にヒトまたはマウスのいずれかのＣ５ａＲ配列を含む一連のキメラ
受容体：Ｎ末端ドメイン、ならびに第１、第２および第３の細胞外ループ（ＥＣＬ）を、
上記のように構築した。各細胞外ドメインならびに膜貫通セグメントおよび細胞内セグメ
ントの由来を表６中に詳述した。各構築物中の細胞外ドメインの由来は、４文字コードで
規定した：例えば、ｍＨＨＨは、マウスＣ５ａＲのＮ末端およびヒトＣ５ａＲの第１、第
２および第３のＥＣＬを有するキメラ受容体を規定する。
親抗Ｃ５ａＲ ｍＡｂ ７Ｆ３は、キメラＣ５ａＲを発現する細胞を染色するパターン
を示し、これは、この抗体がヒトＣ５ａＲの第２細胞外ループ（第３の細胞外ドメイン）
中のエピトープを認識することを示唆する。ＣＤＲ移植によってマウスｍＡｂ ７Ｆ３か
ら誘発され、したがって同じ抗原結合部位を含むはずのヒト化抗体ｈＡｂ−Ｑが、７Ｆ３
と同じ染色パターンを有することを確認するために、異なるキメラヒト／マウスＣ５ａＲ
を発現する一過性トランスフェクトされた細胞をｈＡｂ−Ｑで染色し、フローサイトメト
リーによって分析した。ポジティブに染色されたキメラ受容体を表６中に示す。ｈＡｂ−
Ｑによる染色のパターンは、７Ｆ３で観察されたパターンと同一であった。二次抗体（抗
ｈＩｇＧ−ＦＩＴＣ）単独では染色は見られなかった。キメラ受容体１、２、３、６、８
および１１をｈＡｂ−Ｑで染色したところ、この抗体がヒトＣ５ａＲの第２細胞外ループ
中のエピトープを認識することが示された。
第２細胞外ループ由来のペプチドへの抗体結合
第２細胞外ループ中のヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体が結合するエピトープをさらに規定するた
めに、それぞれ次のペプチドから１残基ずつずれた、ヒトＣ５ａＲの第２細胞外ループに
わたる２２の重複するペプチド（１２マー）のセットを合成した。これらのペプチドに対
する抗体の結合を、ペプチドＥＬＩＳＡによって分析した。
７Ｆ３によるペプチド結合パターンは、ヒト化７Ｆ３抗体ｈＡｂ−ＱおよびｈＡｂ−Ｊ
によるパターンと類似していた。これらのヒト化抗体は、ペプチド４および５ならびにペ
プチド２３に、最も強く結合した（図１４Ａおよび１４Ｂ）。ペプチド２３は、ヒトＣ５
ａＲの完全な第２細胞外ループである（配列番号３７の残基１７３〜２０５）。ペプチド
１〜３および６〜７に対してはより弱い結合が見られた。対照的に、７Ｆ３はペプチド１
〜７に強く結合した。ペプチド１〜７は、共通の要素：６アミノ酸モチーフ：ＥＥＹＦＰ
Ｐを含んでいる。これらの抗体は、このモチーフを欠くペプチド１３〜２２にも結合せず
、このモチーフの短縮バージョンを含むペプチド８〜１２にも結合しなかった。これらの
抗Ｃ５ａＲ抗体は、ヒトＣ５ａ受容体の第２細胞外ループ上の線状エピトープ（ＥＥＹＦ
ＰＰ；配列番号３７由来の残基１７９〜１８４）を認識して結合する。これらのヒト化抗
体は、一方の末端または他方の末端の近くにＥＥＹＦＰＰモチーフを含むペプチドには結
合しないが、このモチーフが中央に位置するペプチドには結合する。
第２細胞外ループのＥＥＹＦＰＰモチーフ内の必須結合残基
ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体が結合するエピトープＥＥＹＦＰＰ中の必須結合残基をさらに規
定するために、ヒトＣ５ａＲの第２細胞外ループ配列ＶＲＥＥＹＦＰＰＫＶＬＣ（配列番
号３７由来の残基１７７〜１８８）を含み、結合モチーフ中の種々の位置がアラニン置換
された、一連の短いペプチド（１２マー）を合成した。これらのペプチドに対する抗体の
結合を、ペプチドＥＬＩＳＡによって分析した。
この実験では、マウス抗Ｃ５ａＲ ｍＡｂ ７Ｆ３の結合に必須なアミノ酸は、エピト
ープＥ１Ｅ２Ｙ３Ｆ４Ｐ５Ｐ６中のＹ３およびＦ４であることが見出された（Ｌｅｅら、
２００６）。７Ｆ３と同様に、ヒト化抗体ｈＡｂ−ＪおよびＱ（それぞれ、図１４Ｃおよ
びＤ）は、位置Ｙ３またはＦ４にＡｌａ置換を有するペプチドには結合しなかった。さら
に、Ｅ１、Ｅ２およびＰ５での置換は、ｈＡｂ−ＪおよびＱによる結合を低下させた。
リード抗体ｈＡｂ−Ｑは、Ｎ末端の９〜２９ペプチド（ＰＥＰ１）に結合しない。
本実施例は、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体が、Ｃ５ａＲの第２細胞外ループ中のエピトープに
結合することを示す。さらに、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体は、ヒトのＮ末端ドメインおよびマ
ウスの第２細胞外ループを含むキメラマウス／ヒトＣ５ａＲ構築物＃７および＃９に結合
しなかった（表６を参照のこと）。
抗Ｃ５ａＲ抗体がヒトＣ５ａＲのＮ末端ドメイン由来の線状ペプチドに結合しなかった
ことを確認するために、配列ＰＤＹＧＨＹＤＤＫＤＴＬＤＬＮＴＰＶＤＫＴ（配列番号３
７由来の残基９〜２９）（配列番号５９）を有するペプチドＰＥＰ１を合成し、このペプ
チドに対する抗体の結合をペプチドＥＬＩＳＡによって分析した。
初期の研究により、抗Ｃ５ａＲｍＡｂの７Ｆ３、１２Ｄ４および６Ｃ１２が、トランス
フェクタント上のヒトＣ５ａＲに結合するＰＥＰ１と競合せず、これらのｍＡｂがＥＬＩ
ＳＡプレート上を被覆したＰＥＰ１に結合しなかったことも実証している（ＷＯ ０３／
０６２２７８）。図１５は、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−ＪおよびＱ（５μｇ／ｍｌ）
が、３つの異なる濃度（それぞれ、１／１００、１／５００および１／１０００、すなわ
ち、１０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌ）でＥＬＩＳＡプレートに結合し
たＰＥＰ１に結合しなかったことを示す。しかし、ヒトＣ５ａＲのＮ末端ペプチド１〜３
１に対して惹起された抗Ｃ５ａＲ（ＣＤ８８）ｍＡｂ Ｓ５／１（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅ
ｃ、カタログ番号ＭＣＡ１２８３）は、予測どおり、５μｇ／ｍｌでＰＥＰ１に結合した
。
ヒトＣ５ａＲを発現する細胞の遊走を遮断する
Ａ．ヒト化抗体は、ヒト好中球の遊走を遮断する
ヒト好中球を、室温で４０分間のデキストラン沈降ステップを介して、白血球画分を最
初に得ることによって、末梢血から単離した。次いで、室温で２５００ｒｐｍで１５分間
の密度勾配遠心のために、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上
に細胞を重ねた。残留赤血球の低浸透圧溶解後、好中球を、走化性緩衝液（４９％ ＲＰ
ＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４９％ Ｍｅｄｉｕｍ １９９（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）、２％透析ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中に再懸濁した。抗Ｃ５ａＲ
抗体を、５μｇ／ｍｌの濃度で好中球（１×１０７／ｍｌ）に添加した。陰性対照（Ａｂ
添加なしだが、１×ＰＢＳを添加した）を含めた。
次いで、細胞を、３．０μｍの空隙率のポリカーボネート膜を有する２４ウェルの組織
培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）中のインサートの上部チャンバ中にロードし
、室温で１０分間インキュベートした。次いで、このインサートを、０．１〜１００ｎＭ
の濃度でヒト好中球化学誘引物質の組換えヒトＣ５ａ（Ｓｉｇｍａ）を含む下部チャンバ
上に配置した。最大の好中球遊走は、１〜１０ｎＭのＣ５ａが下部チャンバ中に存在する
ときに生じた。次いで、好中球を３７℃で３０分間インキュベートした。膜を通って下部
チャンバ中に遊走する好中球の数を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；
ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって定量した。相対細胞計数は、３０秒間の一定期
間にわたって事象を獲得することによって得た。この方法は、再現性が高いことが見出さ
れており、生きた細胞をゲートし、残骸を排除することが可能であった。
図１６中に示される結果は、ヒト化抗体が、陰性（抗体なし）対照と比較して、Ｃ５ａ
に対するヒト好中球の遊走を阻害したことを示している。５μｇ／ｍｌの濃度のマウス抗
体７Ｆ３で、９７％のヒト好中球遊走が遮断された。ヒト化抗体ＧおよびＪがそれぞれ、
５μｇ／ｍｌで８４％および８２％の遊走を遮断した一方で、抗体ＣおよびＫはあまり有
効ではなく、それぞれ、７５％および５５％の好中球遊走を遮断しただけであった。
Ｂ．ヒトＣ５ａＲを発現する細胞の、Ｃ５ａによって誘発される遊走は、用量依存的な
様式でヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体によってｉｎ ｖｉｔｒｏで阻止される。
方法
ヒト好中球遊走
ヒト静脈血を、抗凝固剤としてＥＤＴＡを含むチューブ（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ
＃３６６４５７）中に、健康なボランティアから収集した。好中球は、パーコール密度
遠心分離によって他の血液から精製し、その後赤血球溶解ステップを行った（Ｌｅｅら、
２００６）。精製した好中球は、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、走化性緩衝液（
４９％ ＲＰＭＩ １６４０、４９％ Ｍｅｄｉｕｍ １９９、２％透析ＦＢＳ；ＧＩＢ
ＣＯ）中に、走化性緩衝液１ｍｌ当たり２×１０７細胞で再懸濁した。２００μｌの総体
積中の抗体（走化性緩衝液中に希釈、最終濃度０．００３〜１０μｇ／ｍｌ）および細胞
（２×１０６細胞／ウェル）を、５％ＣＯ２中で３７℃で約２０分間インキュベートした
。次いで、これを２×１００μｌ試料に分割し、２４ウェルのトランスウェルプレート（
ＨＴＳ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、３．０ミクロンの孔径、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の上部チャンバ
中の２つのウェルに添加した。Ｃ５ａ（最終濃度０〜１００ｎＭ）を含む走化性緩衝液（
合計６００μｌ）を、下部チャンバ中に配置した。プレートを５％ＣＯ２中で３７℃で約
１時間インキュベートして、細胞を遊走させた。対照ウェルは、抗体なしの細胞またはＣ
５ａなしの緩衝液を含んだ。このアッセイの標準曲線を、以下に記載するように、ＣｙＱ
ＵＡＮＴ色素を含む９６ウェルプレートで設定した。
Ｌ１．２／ｈＣ５ａＲトランスフェクタント細胞遊走
ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳ、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）中で増殖する、５ｍＭ酪酸で一晩刺激したＬ１．２／ｈＣ５ａＲ細胞を、１，２
００ｒｐｍで５分間遠心分離し、走化性緩衝液（４９％ ＲＰＭＩ １６４０、４９％
Ｍｅｄｉｕｍ １９９、２％透析ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）中で洗浄し、次いで再度遠心分離
し、最後に、走化性緩衝液１ｍｌ当たり２×１０６細胞で再懸濁した。２００μｌの総体
積中の、細胞（１×１０５細胞／ウェル）と混合した抗体（走化性緩衝液中に希釈、最終
濃度０．００５〜５μｇ／ｍｌ）を、９６ウェルプレートに添加し、５％ＣＯ２中で３７
℃で約２０分間インキュベートした。これを２×１００μｌ試料に分割し、９６ウェルの
トランスウェルプレート（ＨＴＳ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−９６ Ｓｙｓｔｅｍ、５．０ミ
クロンの孔径；Ｃｏｒｎｉｎｇ）の上部チャンバ中の２つのウェルに添加した。最終濃度
０．１〜１００ｎＭの組換えヒトＣ５ａ（Ｓｉｇｍａ）を含む走化性緩衝液（合計１５０
μｌ）を、下部チャンバ中に配置した。プレートを５％ＣＯ２中で３７℃で約１時間イン
キュベートして、細胞を遊走させた。対照ウェルは、抗体なしの細胞またはＣ５ａなしの
緩衝液を含んだ。走化性緩衝液中のｈＣ５ａＲ／Ｌ１．２細胞の連続希釈を調製して、Ｃ
ｙＱＵＡＮＴ（登録商標）検出アッセイのための標準曲線を作成した。固定数の細胞（１
ウェル当たり０、１５０、４５０、１３５０、４０５０、１２１５０）を含む緩衝液（１
５０μｌ）を、下部チャンバ中の２つのウェルの各々に直接添加し、その後１時間のイン
キュベーションステップを行った。
ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）色素を用いる定量
インキュベーション後、トランスウェルの下部チャンバ中の緩衝液＋遊走細胞を、９６
ウェルの平底プレート（Ｎｕｎｃ）に移し、２００×ｇ（約１，５００ｒｐｍ）で５分間
遠心分離した。細胞ペレットを１５０μｌのＰＢＳで洗浄し、ＣｙＱＵＡＮＴ蛍光を遮断
する微量のフェノールレッドを除去した。第２の遠心分離ステップ後、上清を注意深く除
去し、プレートを−８０℃で一晩凍結して、細胞を溶解させた。このプレートを室温で解
凍し、溶解緩衝液中に希釈したＣｙＱＵＡＮＴ ＧＲ色素（ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）
Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２００μｌ中に希釈し、各ウェルに添加した。
Ｌ１．２／ｈＣ５ａＲ細胞を使用するアッセイについて、最初に標準曲線を上記のよう
にトランスウェルプレートで確立し、細胞を９６ウェルプレートに移して、ＣｙＱＵＡＮ
Ｔ色素で標識した。好中球を使用するアッセイについて、標準曲線を、ＣｙＱＵＡＮＴ色
素を含む９６ウェルプレートで、以下のように直接設定した：１×１０６の好中球を含む
ペレットを、−８０℃で一晩凍結させ、次いで解凍し、１ｍｌのＣｙＱＵＡＮＴ色素中に
再懸濁し、次いで２００μｌ中２×１０５の細胞を、２００μｌのＣｙＱＵＡＮＴ色素を
含む９６ウェルプレート中の２つのウェルの各々に添加し、２つのうち１つを連続希釈し
て、１００，０００から約４８．８細胞／ウェルの範囲で標準曲線（２連）を確立した。
このプレートを、アルミホイル（光から保護するため）に包んで室温で２〜５分間イン
キュベートし、次いでＦｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙ、ＢＭ
Ｇ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に配置し、最大励起（Ａ１）を４８５ｎｍに設
定し、最大放射（Ｂ１）を５２０ｎｍに設定して読み取った。蛍光強度を記録し、ＦＬＵ
Ｏｓｔａｒ Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェアを用いてデータを処理した。標準曲線を使用し
て蛍光強度を細胞数に変換し、線形回帰または非線形４パラメーターｌｏｇ方程式（Ｇｒ
ａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ４．０）のいずれかを使用して、データを分析した。
結果
一定の濃度範囲にわたり、Ｃ５ａによって誘発されるヒト好中球およびｈＣ５ａＲ／Ｌ
１．２細胞トランスフェクタントの遊走を遮断するヒト化７Ｆ３抗体の能力を調査した。
４人の異なる健康なボランティアドナー由来の好中球を、種々の濃度の抗Ｃ５ａＲ抗体
ｈＡｂ−Ｑまたは７Ｆ３もしくはアイソタイプ対照抗体と共にプレインキュベートし、
その後トランスウェルアッセイにおいて１０ｎＭ Ｃ５ａに曝露させた。試料は２連で実
行した。回帰分析を使用して標準曲線からバックグラウンド蛍光を差し引いた後に、遊走
細胞の数を計算した。各実験について、標準曲線フィットした方程式ｒ２の値は、＞０．
９９であった。
抗Ｃ５ａＲ抗体は、用量依存的な関係を示した。１０μｇ／ｍｌの濃度のｈＡｂ−Ｑお
よび７Ｆ３の両方は、１０ｎＭ Ｃ５ａによって誘発されるヒト好中球の遊走を完全に遮
断した。抗体濃度が低下するにつれて、遊走細胞の数は増加した。０．１μｇ／ｍｌ未満
の濃度でのｈＡｂ−Ｑまたは７Ｆ３と好中球とのプレインキュベーションは、遊走の防止
に有効ではなかった。アイソタイプ対照抗体は、Ｃ５ａによって誘発されるヒト好中球の
走化性を遮断しなかった。図１７は、ｈＡｂ−Ｑおよび７Ｆ３について示された最良のフ
ィットの非線形回帰直線を用いてプロットした、４回の実験からの平均データを示す。ヒ
ト化抗Ｃ５ａＲ抗体は、７Ｆ３よりも、約６分の１から８分の１の低いＩＣ５０で、Ｃ５
ａによって誘発されるヒト好中球の遊走の遮断においてより有効であった。
ヒトＣ５ａＲを発現するトランスフェクト細胞も、種々の濃度の抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ
−Ｑ、ｈＡｂ−Ｊまたは７Ｆ３もしくはアイソタイプ対照抗体とのプレインキュベーショ
ン後、遊走アッセイに供した。図１８は、ｈＣ５ａＲ／Ｌ１．２トランスフェクタント遊
走が、５μｇ／ｍｌで、ヒト化抗Ｃ５Ｒ抗体ＪおよびＱ、ならびに７Ｆ３によって完全に
阻害されたことを示している。シグモイダル用量反応方程式（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｓ
ｉｍソフトウェア）を用い非線形回帰を使用するデータの分析により、７Ｆ３、Ｊおよび
Ｑについてそれぞれ０．５、０．６および０．７μｇ／ｍｌのＩＣ５０値が得られ、これ
は、これらの抗体が、Ｃ５ａによって誘発されるｈＣ５ａＲＪＬ１．２細胞の遊走を中和
することに、各々非常に有効であったことを示唆している。
Ｃ．ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体は、低レベルの受容体占有率で、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト好
中球遊走を有効に遮断する。
上記より、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体が、Ｃ５ａによって誘発される、ヒトＣ５ａＲを発現
する細胞の遊走（走化性）を阻害したことが示された。この阻害をさらに特徴付けるため
に、ヒト好中球遊走をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害するのに必要な、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体に
よるＣ５ａ受容体占有率のレベルを、以下のように決定した。
方法
ｈＡｂ−ＱのＦＩＴＣ標識
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を、共有結合によってｈＡｂ−Ｑにコ
ンジュゲート化した。簡潔に述べると、約２．２ｍｇのｈＡｂ−Ｑを、「反応緩衝液」（
１６０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３４０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５）中に交換し、回収
された１．８ｍｇを、ＤＭＳＯ中に溶解させた１４４μｇのＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｆ１９０６）に添加した。反応を、暗中で室温（約２１
℃）で１時間実施した。非コンジュゲート化ＦＩＴＣを、「保存緩衝液」（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．２）で予め平衡化したＰＤ−１０カラムを使用
して除去し、これで溶出した。コンジュゲート化ｈＡｂ−Ｑ−ＦＩＴＣを、Ｃｅｎｔｒｉ
ｃｏｎ ＹＭ−３０スピンフィルター（Ａｍｉｃｏｎ、カタログ番号４２０８）を使用し
て５．７ｍｇ／ｍｌの最終濃度を達成するまで濃縮し、暗中で４℃で保存した。
ヒト好中球上のＣ５ａＲに対するｈＡｂ−Ｑの結合
赤血球溶解ステップがない以外は上記と同様に調製したヒト好中球を、１，２００ｒｐ
ｍで５分間遠心分離し、走化性緩衝液（４９％ ＲＰＭＩ １６４０、４９％ Ｍｅｄｉ
ｕｍ １９９、２％透析ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）１ｍｌ中２×１０７細胞で再懸濁した。抗
体ｈＡｂ−Ｑを、必要な最終濃度×２になるまで、走化性緩衝液中に希釈した。０．００
２、０．００６、０．０２、０．０６、０．２、０．６、２、６、２０、６０、２００お
よび６００ｕｇ／ｍｌの濃度を準備した。等体積の細胞（１２５μ１）および抗体（１２
５μｌ）を混合し、３７℃で１０分間インキュベートして、ｈＡｂ−ＱをＣ５ａＲに結合
させた。
ヒト好中球走化性アッセイ
簡潔に述べると、好中球およびｈＡｂ−Ｑのインキュベーション後、２×１０６細胞お
よび０〜１００μｇ／ｍｌのｈＡｂ−Ｑを含む各混合物の１００μｌアリコートを、２４
ウェルのトランスウェルプレート（６．５ｍｍインサート、３．０ミクロンのポリカーボ
ネート膜；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３４１５）の上部チャンバ中に
（２連で）配置した。組換えヒトＣ５ａ（最終濃度０、０．１、１、１０または１００ｎ
Ｍ）を含む走化性緩衝液（合計６００μｌ）を、下部チャンバ中に配置した。プレートを
５％ＣＯ２中で３７℃で３０分間インキュベートして、細胞を遊走させた。対照ウェルは
、抗体なしの細胞またはＣ５ａなしの緩衝液を含んだ。インキュベーション後、下部チャ
ンバ中の細胞数を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのフロ
ーサイトメトリーによって計数した。
結合したｈＡｂ−Ｑの測定
ヒト好中球上の結合したｈＡｂ−Ｑの量を、以下の２つの試料で計算した：走化性前の
細胞＋抗体混合物の試料（試料Ａ）および走化性後のトランスウェルプレートの下部チャ
ンバ由来の細胞の試料（試料ＢＬ）。これは、遊走した細胞の受容体占有率に差異がある
かどうか、または受容体占有率が走化性の開始と終了との間で変化したかどうかを決定す
るためであった。結合したｈＡｂ−Ｑは、抗ｈＩｇＧ−ＦＩＴＣと共に細胞をインキュベ
ートすることによって検出した。あるアッセイでは、結合した抗体の量は、第３の試料（
走化性後のトランスウェルプレートの上部チャンバ由来の細胞＋抗体混合物の試料（試料
ＢＵ））において測定した。
試料Ａ（遊走前の細胞＋抗体１０μｌ）を、９６ウェルのＵ字底プレートのウェルに（
２連で）添加し、卓上遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ
−１５Ｒ）において、室温で１，２００ｒｐｍで２分間遠心分離した。細胞ペレットを２
００μｌ ＰＢＳで２回洗浄し、その後、５０μｌの抗ｈＩｇＧ−ＦＩＴＣ（ｄＰＢＳ中
に１／３００希釈）中に再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。試料を２，００
０ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを１５０μｌ ＦＡＣＳ緩衝
液（ＰＢＳ、１％ ＢＣＳ）中に再懸濁して、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉ
ｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析した。
試料ＢＬ（遊走後のトランスウェルプレートの下部チャンバ由来の細胞２００μｌ）お
よび試料ＢＵ（遊走後のトランスウェルプレートの上部チャンバ由来の細胞＋抗体混合物
５０μｌ）を、９６ウェルのＵ字底プレートのウェルに（２連で）添加し、試料Ａについ
て記載したのと同様に処理した。
未結合のＣ５ａ受容体の測定
ヒト好中球上の未結合の受容体の量を、以下の２つの試料で計算した：走化性前の細胞
＋抗体混合物の試料（試料Ｃ）および走化性後のトランスウェルプレートの下部チャンバ
由来の細胞の試料（試料Ｄ）。未結合の受容体は、ＦＩＴＣ標識したｈＡｂ−Ｑ（ｈＡｂ
−Ｑ−ＦＩＴＣ）と共に細胞をインキュベートすることによって検出した。
試料Ｃ（遊走前の細胞＋抗体１０μｌ）を、９６ウェルのＵ字底プレートのウェルに（
２連で）添加し、室温で２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。細胞ペレットを２００
μｌ ＰＢＳで２回洗浄し、その後、５０μｌのｈＡｂ−Ｑ−ＦＩＴＣ（１００μｇ／ｍ
ｌ、ｄＰＢＳ中に希釈）中に再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。試料を２，
０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢ
Ｓ、１％ＢＣＳ）中に再懸濁して、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂ
Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析した。
試料Ｄ（遊走後のトランスウェルプレートの下部チャンバ由来の細胞の試料２００μ１
）を、９６ウェルのＵ字底プレートのウェル中に（２連で）配置し、試料Ｃについて記載
したのと同様に処理した。
好中球Ｃ５ａ受容体占有率のフローサイトメトリー分析
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを、チャネルＦＬ−１について確立した
補償パラメーターを用いて設定した。試料を獲得し、死細胞および残骸を排除した。好中
球は、ＦＳＣおよびＳＳＣに基づいて同定した。結合したｈＡｂ−Ｑ（抗ｈＩｇＧ−ＦＩ
ＴＣ）または未結合のＣ５ａＲ（ｈＡｂ−Ｑ−ＦＩＴＣ）の量を、試料中の好中球のＦＩ
ＴＣ（ＦＬ−１）平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定することによって決定した。
結合したｈＡｂ−Ｑの割合は、以下の等式に従って、（ｈＡｂ−Ｑなしの試料のＭＦＩ
である非特異的バックグラウンド（ＮＳＢ）の差し引き後に）３００μｇ／ｍｌのｈＡｂ
−Ｑと共にインキュベートした試料のＭＦＩの百分率として、試料ＡおよびＢの各々のＭ
ＦＩを決定することによって定量した：
％占有された受容体＝［ＭＦＩ（試料）−ＭＦＩ（ＮＳＢ）］／［最大ＭＦＩ（３００
μｇ／ｍｌのｈＡｂ−Ｑ試料）−ＭＦＩ（ＮＳＢ）］×１００
未結合のＣ５ａ受容体の割合は、以下の等式に従って、（３００μｇ／ｍｌの未標識ｈ
Ａｂ−Ｑと共にインキュベートした試料のＭＦＩである非特異的バックグラウンド（ＮＳ
Ｂ）の差し引き後に）ｈＡｂ−Ｑなしでインキュベートした試料の最大ＭＦＩの百分率と
して、試料ＣおよびＤの各々のＭＦＩを決定することによって定量した：
％未結合の受容体＝［ＭＦＩ（試料）−ＭＦＩ（ＮＳＢ）］／［最大ＭＦＩ（未標識ｈ
Ａｂ−Ｑなしの試料）−ＭＦＩ（ＮＳＢ）］×１００
結果
４つの実験を実施した。簡潔に述べると、健康なボランティアの静脈血から単離した精
製好中球を、０．００１〜１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度のｈＡｂ−Ｑと共に１０分間プ
レインキュベートした。小アリコートのこの混合物を採取して、抗体結合受容体の量（％
受容体占有率）を決定し、残りをトランスウェルプレートの上部チャンバ中に配置した。
Ｃ５ａ（１０ｎＭ）を下部チャンバ中に配置した。３０分間のインキュベーション後、下
部チャンバ中に遊走した細胞の数を、ＦＡＣＳを使用して決定した。ＦＩＴＣ標識した抗
ｈＩｇＧおよびフローサイトメトリーを使用して、遊走終了時の下部チャンバおよび上部
チャンバの両方における好中球上の結合抗体の量もまた決定した。１つの実験では、未結
合の受容体（結合した抗体なし）のレベルを、遊走の前および後に、ＦＩＴＣ標識したｈ
Ａｂ−Ｑと共に好中球をインキュベートすることによって決定した。
好中球の遊走は、ｈＡｂ−Ｑによって遮断された
図１９は、４つの実験の組み合わせたデータから作成した、ｈＡｂ−Ｑ濃度対遊走細胞
の総数のプロットを示す。ｈＡｂ−Ｑ濃度と遊走との間には、用量反応関係が存在した。
０．１μｇ／ｍｌ以上の濃度で、ｈＡｂ−Ｑは、１０ｎＭのＣ５ａによって誘発されるヒ
ト好中球の遊走を完全に遮断した。抗体濃度が低下するにつれて、遊走細胞の数は増加し
た。この結果は、上記の結果（図１７）と類似していた。
受容体占有率は、抗体濃度の増加と共に増加した
４つの実験からの受容体占有率データを組み合わせた。走化性前および走化性後の下部
トランスウェルチャンバ試料中の、各ｈＡｂ−Ｑ濃度での、好中球上の結合した抗体（占
有された受容体）の平均量を、図２０にグラフで示す。走化性前の試料と下部トランスウ
ェルチャンバからの走化性後の試料との間の、占有された受容体のレベルにおける差異（
それぞれ、ＥＣ５０値０．３および１．１μｇ／ｍｌ）。所与のいずれのｈＡｂ−Ｑ濃度
でも、走化性前よりも走化性後において、細胞に結合した抗体が少なかった。この差異は
、優先的に遊走した細胞が、遊走しなかった細胞よりも、平均して、受容体を遮断するｈ
Ａｂ−Ｑが少なかったことにおそらく起因した。この差異の別の説明は、予め混合された
細胞＋抗体溶液（１００μｌ）が、下部チャンバ中の６００μｌの緩衝液を含むトランス
ウェルプレート中に配置したとき、本質的に約７分の１に希釈されていたことであろう。
抗体がトランスウェルの３μｍの膜を自由に横切ることができる場合、希釈されて、結合
反応の平衡は変化するであろう。
未標識ｈＡｂ−Ｑ結合後の未結合の受容体の量を、１つの実験において測定した。この
データも、図２０中にグラフで示す。走化性前の試料および走化性後の試料の両方におい
て、結合した受容体と未結合の受容体との間には、半比例の関係が観察された。
受容体占有率と走化性阻害との間の関係
図１９に示す好中球の遊走データを、抗体なしの試料における１０ｎＭのＣ５ａに対し
て遊走する細胞の平均数の百分率として遊走細胞の数を表現することによって、変換した
。次いでこの百分率を１００％から差し引いて、遊走の百分率阻害を得た。このように、
抗体なし試料における遊走細胞の数は０％阻害となり、遊走細胞０は１００％阻害となっ
た。次いでこのデータを、非線形回帰（シグモイダル用量応答（傾き変動）方程式）を使
用するＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて分析した。次いで、この分析後に得られた
曲線を、図２０由来の受容体占有率データと共にプロットして、図２１を作成した。
図２１は、受容体占有率の増加が、好中球遊走阻害の増加と相関することを示している
。遊走の阻害に関するＥＣ５０値は０．０３μｇ／ｍｌであり、受容体占有率に関するＥ
Ｃ５０値は、走化性前の試料については０．３μｇ／ｍｌであり、下部トランスウェルチ
ャンバからの走化性後の試料については１．１μｇ／ｍｌであった。このデータは、非常
に低い受容体占有率が、遊走の有意な遮断と関連していたことを示唆している。１０％の
受容体だけが０．０３μｇ／ｍｌのｈＡｂ−Ｑで結合した抗体を有していたが、この用量
は遊走の５０％の低下を引き起こした。受容体占有率が約１５〜４５％の場合、０．３μ
ｇ／ｍｌの濃度で、遊走は完全に遮断された。結論として、ｈＡｂ−Ｑは、低レベルの受
容体占有率では、Ｃ５ａが媒介するヒト好中球の遊走をｉｎ ｖｉｔｒｏで遮断するのに
非常に有効であった。
ヒト化抗体は、Ｃ５ａによって誘発されるヒト好中球からのカルシウムイオン放出を遮
断する。
カルシウム動員は、Ｃ５ａが好中球の表面上のその受容体Ｃ５ａＲに結合した後に生じ
る最初の事象の１つである。Ｃ５ａ結合は、内部貯蔵から放出されるサイトゾル遊離Ｃａ
２＋における即座の上昇（数秒以内）を引き起こし、その後、細胞外媒体からの流入に起
因するより持続性の効果（数分にわたる）が生じる。遊離Ｃａ２＋の一過的な増加は、Ｃ
５ａＲへのＣ５ａ結合後に好中球で観察される種々の生物学的応答のこのセカンドメッセ
ンジャーとして機能する。
Ｃ５ａによって誘発されるＣａ２＋放出の遮断においてヒト化７Ｆ３抗体が有効である
かどうかを決定するために、「カルシウム流入」アッセイを以下のように実施した。簡潔
に述べると、ヒト好中球を健康なボランティアから単離し、上記のように精製した。各試
料について、１×１０６の好中球が必要であった。この好中球を遠心分離し、ＰＢＳで洗
浄し、次いで、Ｃｅｌｌ Ｄｙｅ（２５０μＭのスルフィンピラゾンおよび１．７μＭの
Ｆｌｕｏ３−ＡＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号３４３２４２）またはＦｌｕｏ
４−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＭＧＢ［５ｍＭ ＫＣｌ
、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、３００μＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＭｇＣ１２、２２０μＭ
ＫＨ２ＰＯ４、１．１ｍＭ ＮａＨＰＯ４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５．５ｍＭグルコー
ス］）中に１×１０７細胞／ｍｌで再懸濁し、暗中で室温で４０分間インキュベートした
。細胞を遠心分離し、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＭＧＢ＋２５０μＭスルフィンピラゾンで洗浄
して、過剰の色素を除去し、再度遠心分離し、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＭＧＢ＋２５０μＭス
ルフィンピラゾン中に２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞（０．５ｍｌ）を、各試
料につき１つのチューブで非滅菌ガラスＦＡＣＳチューブ中にアリコート化し、１時間以
内に使用した。種々の試薬（Ｃ５ａ、イオノマイシン、抗体）を、Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ
ＭＧＢ（ＨＥＰＥＳおよびグルコースを含まないＣｏｍｐｌｅｔｅ ＭＧＢ）中に、最
終濃度×１０で調製した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を設定し、好中球を、ｘ軸方向への散乱、ｙ軸側への散乱を使用
してゲートした。ｙ軸のＦＬ−１（ＦＩＴＣ）チャネルを使用して、好中球応答をチェッ
クした。試料の蛍光を継続的に測定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔファイルでデータを保存した
。種々の対照試験を他の試料の前に実施した（処理なしの細胞を使用して、ベースライン
蛍光を確立した）。Ｃ５ａを細胞に添加して（１０ｎＭの組換えヒトＣ５ａ（Ｓｉｇｍａ
）５０μｌ：最終濃度１ｎＭ）、応答を試験した。抗体プレ処理なしのとき、細胞は、機
能的であればｈＣ５ａに対して直ぐに応答したが、応答が得られなかった場合には、細胞
は不適切であった。イオノマイシン（チューブ中、０．１〜１μｇ／ｍｌの最終濃度）を
使用して、細胞が色素を保持していたかどうかを決定した。
Ｃ５ａによって誘発されるＣａ２＋放出の遮断においてヒト化７Ｆ３抗体が有効である
かどうかを決定するために、色素を保持させた好中球を、抗Ｃ５ａＲ抗体（チューブ中０
．１〜５０μｇ／ｍｌの最終濃度）と共に１０〜２５分間プレインキュベートした。次い
で、細胞＋抗体をフローサイトメーターにかけて、１ｎＭのｈＣ５ａ（最終濃度）の添加
前のベースライン読み取りを得た。ｈＣ５ａが蛍光においてスパイクを生じなかった場合
、イオノマイシン（Ｓｉｇｍａ、０．１〜１μｇ／ｍｌの最終濃度）を添加して、細胞が
応答できること（生存）をチェックした。
Ｃ５ａによって誘発されるＣａ２＋放出を遮断する元のマウス抗ヒトＣ５ａＲ ｍＡｂ
７Ｆ３の能力を調査した。１０μｇ／ｍｌの濃度の７Ｆ３は、Ｃ５ａによって誘発され
るＣａ２＋流動を完全に遮断し、１μｇ／ｍｌでは部分的に有効であったが、より低い濃
度（０．０１μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌ）は、Ｃａ２＋放出を遮断しなかった。
１０μｇ／ｍｌの７Ｆ３と共にインキュベートした細胞は、１μｇ／ｍｌのイオノマイシ
ンをＣ５ａの約３０秒後に添加したとき、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増加によって明らか
なように、Ｃａ２＋をなお放出できた（データ示さず）。
ヒト化７Ｆ３抗体（Ｆ、Ｇ、Ｊ、Ｍ、ＮおよびＯ）を、１０μｇ／ｍｌの濃度で、１ｎ
ＭのＣ５ａを添加する約１０分前に好中球と共にインキュベートした場合、ヒト好中球に
おけるＣ５ａによって誘発されるカルシウム放出を中和するそれらの能力について試験し
た。抗体ＮおよびＯはＣａ２＋流動を完全に遮断したが、抗体Ｆ、Ｇ、ＪおよびＭは、抗
体と共にプレインキュベートしていない対照細胞と比較して、より低い観察された蛍光値
によって示唆されるように、Ｃａ２＋放出を部分的に遮断した。抗体ＮまたはＯとプレイ
ンキュベートした細胞にイオノマイシンを添加した場合、ＭＦＩは即座に増加し、これは
、遮断抗体の存在下で好中球がなおもＣａ２＋放出可能なままであったことを実証してい
る（データ示さず）。
抗体Ｇ、Ｊ、Ｍ、ＮおよびＱについての用量応答関係を、Ｃ５ａの添加前に種々の濃度
の抗体と共にヒト好中球をプレインキュベートし、Ｃａ２＋放出を測定することによって
試験した。３０μｇ／ｍｌの濃度の抗体Ｇは、Ｃ５ａによって誘発されるＣａ２＋放出を
完全に遮断したが、より低い濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）は有効ではなかった。
これらの結果は、抗体Ｍと同じであった。どちらの場合も、３０μｇ／ｍｌの抗体で処理
した細胞は、１μｇ／ｍｌのイオノマイシンをＣ５ａの約９０秒後に添加したときに示さ
れるように、なおもＣａ２＋放出可能であった。抗体Ｊは、３０μｇ／ｍｌおよび１０μ
ｇ／ｍｌの濃度で完全な遮断を示したが、以前の実験では、１０μｇ／ｍｌの抗体Ｊは、
Ｃａ２＋流動の遮断において部分的に有効なだけであった。抗体Ｎは最も有効な抗体であ
り、２つの別個の実験において１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌで、Ｃ５ａによって誘
発されるＣａ２＋放出を完全に遮断した。すべての場合において、Ｃ５ａがＣａ２＋流動
を引き起こすことができなかった場合、１μｇ／ｍｌのイオノマイシンを添加し、ＭＦＩ
における大きい増加を生じさせた。これは、これらの細胞がなおも応答可能であったこと
を示している。抗体Ｑを用いると、Ｃ５ａによって誘発されるヒト好中球からのＣａ２＋
放出は、１ｎＭのＣ５ａの添加の際の蛍光におけるピークの欠如によって示されるように
、５μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌの抗体Ｑと共に細胞をプレインキュベートしたとき
に防止された。これらの試料へのイオノマイシンの添加の短時間後に、蛍光における通常
の増加が発生し、このことは、好中球がなおも応答可能であったことを示唆している。０
．５μｇ／ｍｌの抗体Ｑとのプレインキュベーションは有効ではなく、蛍光における大き
な増加が、１ｎＭのＣ５ａを試料に添加した後に観察され、これは、１ｎＭのＣ５ａのみ
（抗体の添加なし）で細胞を処理したときに観察された効果と類似していた。これらの結
果を表７にまとめる。
表７は、最も有効な遮断ヒト化７Ｆ３抗体が、抗体ＮおよびＱであったことを示してい
る。興味深いことに、抗体ＮはアイソタイプＩｇＧ１であり、好中球上のＦｃγ受容体（
ＦｃγＲ）への結合に起因して、アイソタイプＩｇＧ４を有する抗体よりも、有効であり
得る。ヒトＩｇＧ１は、ｈＩｇＧ４よりも、ＦｃγＲに対するアフィニティーが高い。抗
体ＮまたはＯによるＦｃγＲの結合が、Ｃ５ａによって媒介されるＣａ２＋放出の中和に
寄与するかどうかを決定するために、Ｆｌｕｏ３−ＡＭを予め保持させたヒト好中球を、
抗体ＮもしくはＯ単独、または抗体Ｎ＋５０μｌのＦｃブロック［好中球が単離されたの
と同じ血液試料から調製したヒト血清］、または抗体Ｏ＋Ｆｃブロック、またはＦｃブロ
ック単独と共に、１０分間プレインキュベートした。Ｃ５ａ（および必要に応じてイオノ
マイシン）に応答した細胞内Ｃａ２＋レベルへの変化を、フローサイトメーターで測定し
た。Ｆｃブロックの存在下でも非存在下でも、Ｃ５ａによって誘発されるＣａ２＋流動を
中和する抗体Ｎの能力にも抗体Ｏの能力にも差異は存在しなかった。これらの細胞は、イ
オノマイシン添加の効果によって示されるように、Ｃａ２＋放出がなおも可能であった。
好中球をＦｃブロック単独と共にプレインキュベートすることでは、Ｃ５ａによって誘発
されるＣａ２＋放出は阻止されなかった。これらのデータは、抗体ＮおよびＯが、Ｆｃγ
Ｒとの相互作用を介してではなく、Ｃ５ａＲへの結合およびＣ５ａシグナル伝達の遮断を
介して、保護効果を発揮していることを示唆する。
好中球活性化に対するヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体の影響
Ａ．ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト好中球のＣ５ａによって誘発され
る活性化を阻止する
Ｃ５ａは、表面抗原ＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ−１インテグリンのα鎖、走化性および内皮と
の相互作用を媒介する）の上方制御、および接着性分子ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）の
消失を誘導する、ヒト好中球の強力な活性剤である。Ｃ５ａ媒介性好中球活性化を阻止す
るヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体の能力は、全血活性化アッセイ中で調べた。
方法
健常なヒトボランティア（２ドナー）由来の血液を、抗凝血剤クエン酸デキストロース
（ＡＣＤ）を含有する試験管に回収し、Ｈ２ＤＣＦＤＡ（最終５０μＭ）を含有するウェ
ルに加えて室温（２３℃）で１０分間置き、次に０．３〜３００μｇ／ｍｌのｈＡｂ−Ｑ
、０．３〜３００μｇ／ｍｌのＩｇＧ４アイソタイプ対照、またはｄＰＢＳのみを加えた
。試料は室温（２３℃）で２０分間インキュベートした。Ｃ５ａ（１００ｎＭ最終）、Ｐ
ＭＡ（０．２〜４００ｎｇ／ｍｌ）、またはｄＰＢＳをそれぞれの試料に加え、室温（２
３℃）で２０分間再度インキュベートした。抗ＣＤ１１ｂおよび抗ＣＤ６２Ｌ抗体（１／
４００最終）をすべての試料に加え１５分間置いた。赤血球はＲＢＣ溶解バッファーを使
用して除去し、白血球はｄＰＢＳ＋１％ＦＣＳ中に懸濁させた。
好中球におけるＣＤ１１ｂおよびＣＤ６２Ｌの発現レベルは以下のように測定した。Ｆ
ＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、チャ
ネルＦＬ−２およびＦＬ−４に関して確立された補償パラメーターでセットアップした。
試料を入手して死細胞および残骸は除外した。好中球は高いＦＳＣおよびＳＳＣを有する
として同定し、これらの細胞のＰＥ（ＦＬ−２）およびＡＰＣ（ＦＬ−４）平均蛍光強度
（ＭＦＩ）を測定した。
ＣＤ１１ｂおよびＣＤ６２Ｌの発現レベル（ＭＦＩ）は以下の式を使用して最大発現率
として報告した：
最大発現率＝［（試料−最小発現）／（最大発現−最小発現）］×１００
注釈。最大発現はＣＤ１１ｂに関して無抗体（ｄＰＢＳのみ）＋１００ｎＭのＣ５ａ試
料、および（ＣＤ６２Ｌは活性化好中球において低減するので）ＣＤ６２Ｌに関して無抗
体（ｄＰＢＳ）＋０ｎＭのＣ５ａ（ｄＰＢＳ）試料であった。
ＣＤ１１ｂおよびＣＤ６２Ｌ発現のＣ５ａ媒介性変化のｈＡｂ−Ｑ中和に関するＩＣ５
０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ４．０）ソフトウェアを使用して計算した。
データは非線形回帰を使用してそれぞれの実験のＳ字状用量応答（変数勾配）式および２
つの実験の平均に適合させた。
結果
Ｃ５ａによって誘発される好中球活性化に対するｈＡｂ−Ｑの阻害効果を、２ドナーを
使用して全血アッセイにおいて評価した。Ｃ５ａで活性化した試料中では、ＣＤ１１ｂの
発現はｈＡｂ−Ｑの不在下で増大した。しかしながら、このＣＤ１１ｂ発現の増大は、ｈ
Ａｂ−Ｑが存在した場合、ＩＣ５０値約１０．７μｇ／ｍｌで用量応答式に妨げられた（
図２２）。アイソタイプ対照抗体は、１００μｇ／ｍｌ超でさえＣＤ１１ｂ発現のＣ５ａ
によって誘発される上方制御を妨げなかった（データ示さず）。
ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑは、約５．４μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で用量依存式に
ＣＤ６２ＬのＣ５ａによって誘発された消失も妨げた（図２３）。アイソタイプ対照抗体
は、１００μｇ／ｍｌ超でさえＣＤ６２ＬのＣ５ａによって誘発された消失を妨げなかっ
た（データ示さず）。
Ｂ．ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで溶液中のヒト好中球を活性化しなか
った
好中球のＣ５ａによって誘発される活性を中和するヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体の能力は前に
記載した。以下の実験では、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体をＣ５ａの不在下で精製ヒト好中球と
共にインキュベートし、これは細胞表面マーカー、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ６２Ｌの発現を
変えなかった。これらの実験は、抗Ｃ５ａＲ抗体は、溶液中の細胞自体は活性化しないこ
とを実証した。
方法
ヒト好中球活性化アッセイおよびＣＤ１１ｂおよびＣＤ６２Ｌの発現の測定
ヒト末梢静脈全血を、一連の実験中でヒト化抗ｈＣ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑ、ｈＡｂ−Ｊ
またはｈＡｂ−Ｇと共にｅｘ ｖｉｖｏでインキュベートした。好中球活性化は、以下に
記載するようにＣＤ１１ｂおよびＣＤ６２Ｌの発現レベルを決定することにより測定した
。ＣＤ６２Ｌレベルの低下またはＣＤ１１ｂレベルの増大は、好中球活性化の指標である
。
実験１
簡単に述べると、健常ドナー由来のヘパリン化ヒト全血を、１、１０、または１００μ
ｇ／ｍｌのｈＡｂ−ＪまたはｈＡｂ−Ｑ、１０μＭのｆＭＬＰ（ホルミルＭｅｔ−Ｌｅｕ
−Ｐｈｅペプチド）、またはｄＰＢＳのみのいずれかに加えた。試料は、１／１００の最
終希釈で抗ＣＤ１１ｂ−ＰＥおよび抗ＣＤ６２Ｌ−ＡＰＣ抗体を加える前に、５％ＣＯ２
中で３７℃において１時間インキュベートした。赤血球はＲＢＣ溶解バッファーを使用し
て除去し、白血球はｄＰＢＳ＋１％ＦＣＳ中に再懸濁させた。
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ）を、チャネルＦＬ−２およびＦ
Ｌ−４に関して確定した補償パラメーターでセットアップした。試料を入手して死細胞お
よび残骸は除外した。好中球は高いＦＳＣおよびＳＳＣを有するとして同定した。ＦＬ−
２（ＣＤ１１ｂ−ＰＥ）およびＦＬ−４（ＣＤ６２Ｌ−ＡＰＣ）チャネル中のこれらの細
胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。ＣＤ１１ｂ（ＰＥ）およびＣＤ６２Ｌ（ＡＰＣ
）のレベルをそれぞれの試料に関して決定し、ｄＰＢＳ対照に対する発現倍数として報告
した。
実験２
４健常ボランティア由来のヘパリン化血液を、０．１、１、１０または１００μｇ／ｍ
ｌのｈＡｂ−Ｇ、ｈＡｂ−Ｊ、１０ｎＭまたは１００ｎＭのヒトＣ５ａまたはｄＰＢＳの
みのいずれかを含有する試験管に加えた。３７℃で２０分置いた後、６％デキストラン（
最終濃度１％）をそれぞれの試験管に加え、３０分間放置して赤血球を沈殿させた。上部
の白血球が豊富な血漿層を９６ウェルプレートに移し、そこで細胞を冷却ｄＰＢＳ中で洗
浄した。遠心分離後、上清を除去し、細胞は抗ＣＤ１１ｂ−ＰＥ（１／５０）および抗Ｃ
Ｄ６２Ｌ−ＡＰＣ（１／５０）を含有するｄＰＢＳ中に再懸濁し、次いで氷上で３０分間
インキュベートした。細胞は再度洗浄し、ｄＰＢＳ＋１％ＦＣＳ中に再懸濁した。好中球
におけるＣＤ１１ｂおよびＣＤ６２Ｌの発現レベルは前に記載したように測定した。
実験３
健常なヒトボランティア（２ドナー）由来の血液を、抗凝血剤クエン酸デキストロース
（ＡＣＤ）を含有する試験管に回収し、Ｃ５ａを試料に加えなかったこと以外、実施例７
Ａ中で前に記載したように処理した。好中球におけるＣＤ１１ｂおよびＣＤ６２Ｌのレベ
ルは、実施例７Ａ中で前に記載したようにＦＡＣＳによって測定した。
結果
ヒト好中球におけるＣＤ１１ｂおよびＣＤ６２Ｌの発現は、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体を用
いた全血アッセイ中で変わらなかった。
第一の実験では、ヒト全血を１、１０、または１００μｇ／ｍｌのｈＡｂ−Ｑまたはｈ
Ａｂ−Ｊ、１０μＭのｆＭＬＰ、またはｄＰＢＳと共に３７℃で１時間インキュベートし
、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ６２Ｌの発現はフローサイトメトリーによって測定した。１〜１
００μｇ／ｍｌの任意の濃度においてｈＡｂ−ＱまたはｈＡｂ−Ｊを含有する試料中では
、ＣＤ１１ｂ発現の増大またはＣＤ６２Ｌ発現の低下はなかった（図２４Ａおよび２４Ｂ
）。対照的に、顆粒球を活性化することが知られているペプチドｆＭＬＰは、ＣＤ１１ｂ
発現の多大な増大およびＣＤ６２Ｌの消失をもたらした。
第二の実験では、４ドナー由来のヒト全血を、０．１〜１００μｇ／ｍｌのヒト化抗Ｃ
５ａＲ抗体ｈＡｂ−ＧまたはｈＡｂ−Ｊ、１０〜１００ｎＭのヒトＣ５ａ、またはｄＰＢ
Ｓと共に３７℃で２０分間インキュベートした。処理後のｄＰＢＳ対照における発現と比
較した好中球におけるＣＤ１１ｂおよびＣＤ６２Ｌの発現は、それぞれ図２５Ａおよび２
５Ｂ中に示す。試験した試料のいずれにおいても、好中球ＣＤ１１ｂのｈＡｂ−Ｇもしく
はｈＡｂ−Ｊ誘発性上方制御またはＣＤ６２Ｌの発現の消失はなかった。対照的に、１０
ｎＭおよび１００ｎＭのＣ５ａは、それぞれｄＰＢＳと比較してＣＤ１１ｂ発現の２．５
および３．０倍の増大をもたらし、一方ＣＤ６２Ｌの発現はそれぞれｄＰＢＳ対照中で０
．３３および０．１４のレベルに低下した。ｆＭＬＰと同様に、Ｃ５ａは顆粒球を活性化
することが知られている。
第三の実験では、２健常ボランティア由来の全血を０．３〜３００μｇ／ｍｌのｈＡｂ
−Ｑまたはアイソタイプ対照抗体に加え、次いで１００ｎＭのＣ５ａまたはｄＰＢＳをそ
れぞれの試料に加えた。好中球ＣＤ１１ｂおよびＣＤ６２Ｌの発現はフローサイトメトリ
ーによって測定し、結果は図２６ａおよび２６ｂ中に示す。ＣＤ１１ｂの発現レベルは、
ＰＢＳ中にｈＡｂ−Ｑまたはアイソタイプ対照抗体を含有する試料中で変化せず（増大せ
ず）、３００μｇ／ｍｌまでの任意の抗体濃度で活性化がなかったことを示す（図２６ａ
）。しかしながら、アイソタイプ対照抗体を含有する試料に１００ｎＭのＣ５ａを加えた
とき、１００ｎＭのＣ５ａを含有し抗体を含有しない試料中で測定してＣＤ１１ｂの発現
は最大レベルに増大した。ＣＤ６２Ｌの発現はＣ５ａを含まない試料中でその最大レベル
（活性化なし）であった。３００μｇ／ｍｌまでの濃度でのｈＡｂ−Ｑまたはアイソタイ
プ対照抗体の添加はＣＤ６２Ｌ発現のレベルを下げなかった、すなわち、好中球を活性化
しなかった（図２６ｂ）。対照的に、アイソタイプ対照抗体および１００ｎＭのＣ５ａを
含有する試料はＣＤ６２Ｌ発現を消失し、最大に活性化された。
要約すると、これらの結果は、ｅｘ ｖｉｖｏでのヒト全血のインキュベーション後の
ＣＤ６２ＬおよびＣＤ１１ｂの発現レベルによって示されるように、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗
体はヒト好中球を活性化しないことを実証する。
Ｃ．ｈＡｂ−Ｑは、固形支持体と結合するとｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒト好中球を活
性化しない
スーパーオキシドは、生成された好中球を活性化して病原体と闘う活性酸素種の１つで
ある。しかしながら、スーパーオキシドは正常組織に対して悪影響を有する可能性もある
。抗Ｃ５ａＲ抗体がそれ自体で好中球によるスーパーオキシドの生成を刺激することがで
きる可能性を調べた。以下に記載する実験は、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑがヒト好
中球を刺激してスーパーオキシドを生成することはないが、ヒト好中球がＣ５ａによって
刺激されるとき、その生成に対抗することができることを示す。
方法
単離ヒト好中球によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのスーパーオキシド生成の測定
スーパーオキシド（Ｏ２ ―）は、好中球が炎症性メディエータ、例えばＣ５ａによって
活性化されるときＮＡＤＰＨオキシダーゼによって生成される第一の酸素含有物質である
。いくつかのＯ２ ―は細胞外に分泌される。膜不透過性であるシトクロムＣ（Ｆｅ３＋）
は、スーパーオキシドによって、５５０ｎｍで分光光度法によって検出することができる
シトクロムＣ（Ｆｅ２＋）に還元される。本試験では、９６ウェルプレートを使用して、
Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２（Ｍａｙｏ ａｎｄ Ｃｕｒｎｕｔｔｅ、１９９０）を使
用して分光光度法によりシトクロムＣの減少を決定した。
ヒト好中球の調製
ヒト好中球を前の実施例５Ｂ中で前に記載したように精製した。９６ウェルマイクロタ
イタープレートは、ヒトフィブリノゲン（１ｍｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。それ
ぞれのウェルに、５０μｌのＲＭ（ＨＢＳＳ（カタログ番号１４１７５Ｇｉｂｃｏ）およ
び０．４ｍＭのＭｇＳＯ４、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＣａＣｌ２および２
０ｍＭのＨＥＰＥＳからなる反応混合物、および７．４でのｐＨセット）中の１００μｌ
のシトクロムＣ（１５０μＭ）および２００，０００の好中球を加えた。プレートは３７
℃でＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）中に挿入し、非刺激性
Ｏ２ ―生成は４分間毎分測定した。次に抗体を１５μｌのＲＭ中に加え、ウェルは１０分
間２分毎に測定した。最後にＣ５ａを加え、プレートは３０分間２分毎に測定し、次に６
０分間１０分毎に測定した。１．５時間後に測定した値を結果として使用した。４つのウ
ェルをそれぞれの群に使用した。
結果
２〜６の健常ドナー由来の好中球をこの試験中で使用した。図２７は、３７℃で１．５
時間のインキュベーション後のスーパーオキシドの生成を示す。反応混合物（ＲＭ）は対
照として使用した（６ドナー）。炎症性メディエータＣ５ａは確かなＯ２ ―生成を誘導し
（６ドナー）、これは抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑによって対抗された（５ドナー）。この
試験では、高濃度の抗体を使用してどんな刺激効果も見落とさないことを確実にした。１
０００μｇ／ｍｌ（４ドナー）、２５０μｇ／ｍｌ（３ドナー）および１００μｇ／ｍｌ
（２ドナー）でのｈＡｂ−Ｑ、ならびに、ネズミ抗体Ａ−ＴＮＰのヒト化型である、対照
、無関係なＩｇＧ４抗体ＨｚＡＴＮＰ（２ドナー）は、刺激効果がなかったことは明らか
である。
要約すると、前に記載した結果は、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑはヒト好中球を刺
激せず、フリーラジカルＯ２ ―を生成しなかったことを実証する。対照的に、それはＣ５
ａによって誘発された生成に対抗することができた。
ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体は、ｅｘ ｖｉｖｏヒト全血アッセイ中で白血球細胞を枯渇させ
ない
ｈＡｂ−ＱがＣ５ａＲを発現する他のヒト細胞、特に血中の好中球および単球を死滅ま
たは枯渇することができたかどうか決定するために、いくつかのｅｘ ｖｉｖｏ全血枯渇
アッセイを実施した。全血枯渇試験は、補体または抗体媒介性死滅機構（ＣＤＣ、ＡＤＣ
Ｃ）を不活性化しない、抗凝血剤、レピルジン（Ｒｅｆｌｕｄａｎ（登録商標））を使用
した。レピルジンは非常に特異的な直接的トロンビン阻害剤である。それはヒルから抽出
した抗凝血剤ヒルジンの組換え類似体である。
方法
血液採取
末梢静脈血を、５０または５００μｇ／ｍｌのレピルジン（Ｒｅｆｌｕｄａｎ（登録商
標）、Ｐｈａｒｍｉｏｎ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、オーストラリア）の最
終濃度を含有する滅菌１５ｍｌのポリプロピレンチューブ中に健常なボランティアから採
取した。
抗体のインキュベーション
抗凝固処理血液のアリコート（５０μｌ）を９６ウェルプレートに分配し、１００μｇ
／ｍｌの最終濃度でｄＰＢＳに希釈した２５μｌの抗体と共に５％ＣＯ２中で３７℃にお
いて３．５時間２連でインキュベートした。対照試料は５０μｌの血液および２５μｌの
ｄＰＢＳを含んでいた。抗ｈＣＤ６６ｂ−ＦＩＴＣ（１／１００最終）、抗ｈＣＤ１９−
ＡＰＣ（１／３００最終）および抗ｈＣＤ１４−ＰＥ（１／３００最終）を含む染色カク
テル（２５μｌ）をそれぞれの試料に加え、５％ＣＯ２中で３７℃において３０分間イン
キュベーションを続けた。次いで、キャリブレーションビーズ（５０μｌ、９８０ビーズ
／μｌ；Ｆｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕ
ｌｔｅｒ、ＵＳＡ；カタログ番号７５４７０５３）をそれぞれの試料に加えた。１００μ
ｌの１×ＦＡＣＳ溶解溶液（１０×ＦＡＣＳ溶解溶液；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；
カタログ番号３４９２０２）を加えることにより赤血球を溶かした。全試料を１．５ｍｌ
の試験管に移し、さらなる５００μｌの１×ＦＡＣＳ溶解溶液を加えた。試験管は３分間
４，０００ｒｐｍで遠心分離にかけ、上清は除去した。細胞およびビーズは１５０μｌの
ＦＡＣＳバッファー（ｄＰＢＳ＋１％ＢＣＳ）中に再懸濁した。
ＦＡＣＳ分析
細胞はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメ
ーターで分析した。前方散乱光および側方散乱光を使用してすべての細胞を含めたが、残
骸は除外した。ゲートを設定して、ＣＤ６６ｂ−ＦＩＴＣ（ＦＬ−１）陽性細胞（好中球
）、ＣＤ１９−ＡＰＣ（ＦＬ−４）陽性細胞（Ｂリンパ球）またはＣＤ１４−ＰＥ（ＦＬ
−２）陽性細胞（単球）を計数した。５０００ビーズ当たりの細胞数を決定した。
血液１ミリリットル当たりのそれぞれの細胞型の合計数は以下のように計算した：
細胞数／ｍｌ＝５０００ビーズ中の細胞数×（５０×９８０）／５０００×１０００／
５０
枯渇率は以下のように計算した：
枯渇率＝１００×（１−（細胞数／抗体処理試料１ｍｌ／（細胞数／ＰＢＳ処理試料１
ｍｌ））
結果
レピルジンを含有する滅菌試験管中に回収した３人の異なる健常ボランティア由来の全
末梢静脈血を使用して、３つの別個の実験を実施した。血液は、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈ
Ａｂ−Ｑ、リツキシマブ（陽性対照抗ＣＤ２０抗体）、ｈＩｇＧ４（陰性アイソタイプ対
照抗体）またはＰＢＳ（バッファー対照、細胞枯渇の程度を測定するためのベースライン
）と共にインキュベートした。インキュベーションの最後に、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１４およ
びＣＤ１９に対する標識抗体のカクテルを使用して細胞を染色し、顆粒球（好中球：ＣＤ
６６ｂ＋ｖｅ）、単球（ＣＤ６６ｂ−ｖｅ、ＣＤ１４＋ｖｅ）およびＢ細胞（ＣＤ１９＋
ｖｅ）を同定した。それぞれの細胞型の絶対数を決定するために、既知の濃度を有する一
定体積のキャリブレーションビーズをそれぞれの試料に加えた。したがって、それぞれの
試料中の好中球（顆粒球）、単球およびＢ細胞の絶対数（１ｍｌ当たりの細胞数として）
、および、ＰＢＳとインキュベートした試料中の細胞の合計数の割合として、発現した抗
体を用いた治療後のそれぞれの細胞型の相対的枯渇を決定することができた。
３つの実験からのデータは平均し、結果は図２８および２９中に表す。図２８は、３セ
ットのデータから計算した細胞の平均数（±標準偏差）を示す。図２９は、ＰＢＳ処理試
料中の細胞数と比較した、それぞれの細胞型の平均枯渇率（±ｓｄ）を示す。データは、
ｈＡｂ−Ｑとの４時間のインキュベーション後に顆粒球または単球の枯渇がなかったこと
を示す。対照的に、リツキシマブは（ＣＤ２０、リツキシマブの標的を発現する）Ｂ細胞
の約７０％の枯渇を引き起こしたが、ＣＤ２０を発現しない単球または好中球、細胞型の
数は減らさなかった。
ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑは、補体媒介性溶解によってＣ５ａＲ発現細胞を死滅
しない
Ｃ５ａＲ発現細胞（好中球、単球など）を死滅しないヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体を開発する
ことは望まれていた。いくつかの機構によって、抗体は標的抗原を発現する細胞の死滅を
開始することができる。ｈＡｂ−Ｑは、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）および抗体依存性
細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）を回避／低減するためのＩｇＧ４アイソタイプとして生
成した。補体媒介性死滅は、抗原−抗体複合体が補体タンパク質、Ｃ１ｑと結合すると、
抗体のＦｃドメインを介して誘導されて、一連のタンパク質分解事象の活性化を開始させ
、Ｃ５ａの放出および標的細胞を溶かす膜攻撃複合体の形成をもたらす。
ｈＡｂ−ＱがＣＤＣ活性を誘導しなかったことを実証するために、以下の実験を実施し
た。
方法
高レベルのＣ５ａＲを発現するＲａｍｏｓ Ｅ２クローンの作製
ＣＤ２０発現ヒトＢリンパ球細胞系（Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫由来）、Ｒａｍｏｓを
、製造者のプロトコルに従いリポフェクタミンＴＭＬＴＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
を使用して、ヒトＣ５ａＲ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−Ｃ５ａＲ；４μｇのＤＮ
Ａ／３×１０６個の細胞）で安定的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４
０時間後に、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８硫酸塩、Ｇｉｂｃｏ）を２ｍｇ／ｍｌで増殖
培地に加えた。細胞（非クローン）を選択培地中で約３週間増殖させ、このときトランス
フェクトしたＣ５ａＲの発現および割合を、抗Ｃ５ａＲ抗体を使用してフローサイトメト
リーによって確認した。約３０〜４０の陽性クローン／プレートをもたらす密度で、細胞
を３８４ウェルプレートに移した。単クローンコロニーを選択し、増殖用に９６ウェルプ
レートに移した。十分な増殖後、それぞれのクローンにおけるＣ５ａＲの発現は、抗Ｃ５
ａＲ抗体を使用してフローサイトメトリーによって決定した。最高発現クローン、Ｅ２を
選択し増殖させた。Ｒａｍｏｓ Ｅ２細胞はＲＰＭＩ、１０％のＦＣＳ、２ｍｇ／ｍｌの
Ｇ４１８中に維持した。
ウサギ補体を用いたＣＤＣのアッセイ
標的細胞（Ｒａｍｏｓ Ｅ２細胞）は、抗体または培地単独（ＲＰＭＩ＋１０％熱不活
性化ＢＣＳ）と共に５％ＣＯ２中で３７℃において３０分間インキュベートした。インキ
ュベーション後、ＲＰＭＩに希釈したウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を１％ｖ／ｖの
最終濃度で試料に加えた。５％ＣＯ２中で３７℃においてさらに２時間、試料をインキュ
ベートした。
Ｔｏ−Ｐｒｏ−３陽性として定義した非生存標的細胞をフローサイトメトリーにより測
定し、全標的細胞の割合として表す前に、蛍光性生死判別色素、Ｔｏ−Ｐｒｏ−３（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）をそれぞれの試料に加えた。
それぞれの試料の特異的ＣＤＣは、対応する試料の「標的および補体」（Ｂ）から非生
存「標的のみ」の平均率（Ａ）を引くことによって計算した。次いで「標的および補体」
の「培地のみ」試料（Ｃ）をそれぞれの試料から引いて、特異的ＣＤＣの最終値を得た：
特異的ＣＤＣ（溶解率）＝（Ｂ−Ａ）−Ｃ
前の式は以下のように表すこともできる：
特異的ＣＤＣ（溶解率）＝（Ｔ＋ＣＳ−Ｔ＋ＣＭＯ）−（ＴＯＳ−ＴＯＭＯ）。
上式で：Ｔ＋ＣＳは抗体を含む標的＋補体試料中の非生存細胞の平均率であり、
Ｔ＋ＣＭＯは標的＋補体培地のみ（抗体含まず）中の非生存細胞の平均率であり、
ＴＯＳは抗体を含む標的のみ試料中の非生存細胞の平均率であり、
ＴＯＭＯは標的のみ培地のみ（抗体含まず）中の非生存細胞の平均率である。
ヒト血清を用いたＣＤＣアッセイ
ヒト血清を使用するＡＤＣＣアッセイを、実施例１０中で以下に記載したように実施し
た。抗体のＣＤＣ活性は、ヒト血清を含有する「標的のみ＋抗体」試料（Ｂ）から非生存
「標的のみ／培地のみ」試料の平均率（Ａ）を引くことによって決定した。次いで、熱不
活性化ウシ血清反応中の非生存「標的のみ＋抗体」試料（Ｃ）−「標的のみ／培地のみ」
試料（Ｄ）の割合を引いて、特異的ＣＤＣの最終値を得た：
特異的ＣＤＣ（溶解率）＝（Ｂ−Ａ）−（Ｃ−Ｄ）
結果
Ｒａｍｏｓ Ｅ２標的細胞を使用したｈＡｂ−ＱのＣＤＣアッセイ
補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を誘導するｈＡｂ−Ｑの可能性を、ウサギ補体の存在下
で抗体とヒト好中球をインキュベートすることによって最初に調べた。このアッセイ中好
中球の特異的死滅（０．５％未満の細胞死）はほとんどなかった（データ示さず）。
高レベルのヒトＣ５ａＲおよびＣＤ２０を発現するＲａｍｏｓ Ｅ２細胞系の開発後、
ｈＡｂ−ＱがＣＤＣを誘導することができたかどうかという問題を再検討した。標的とし
てＲａｍｏｓ Ｅ２細胞を使用した２連の実験を実施した。第一連は１％ウサギ補体を使
用し、リツキシマブは陽性対照として働いた。第二連は、１０％ヒト血清とインキュベー
トした試料中の細胞死と、熱不活性化ウシ血清とインキュベートした試料中の細胞死を比
較した。
抗体ｈＡｂ−Ｑは、１％ウサギ血清の存在下でＲａｍｏｓ Ｅ２細胞のＣＤＣを誘導し
なかった
３つのアッセイを実施した。第一のアッセイは、１０μｇ／ｍｌの最終濃度の抗体ｈＡ
ｂ−Ｑ、リツキシマブ（Ｒｏｃｈｅ）およびｈＩｇＧ４アイソタイプ対照（Ｓｉｇｍａ）
と、Ｒａｍｏｓ Ｅ２細胞および１％ウサギ補体をインキュベートすることを含んでいた
。第二および第三のアッセイは１００μｇ／ｍｌで抗体を用いて実施し、過剰な陽性対照
、ウサギポリクローナル抗Ｃ５ａＲ（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を含んでいた。
第一の実験では、１０μｇ／ｍｌのｈＡｂ−Ｑ、リツキシマブおよびｈＩｇＧ４とイン
キュベートした試料中の特異的ＣＤＣのレベルは、それぞれ０％、９６％および０％であ
った。第二および第三の実験では、１００μｇ／ｍｌのｈＡｂ−Ｑ、リツキシマブおよび
ｈＩｇＧ４とのインキュベーション後の平均特異的ＣＤＣは、それぞれ１．５％、９８％
および１％であった。Ｒａｍｏｓ Ｅ２と２０μｇ／ｍｌのポリクローナルおよび１％ウ
サギ補体のインキュベーションは、８２％の特異的ＣＤＣをもたらした（図３０）。リツ
キシマブはＣＤＣによりＣＤ２０を発現する細胞を死滅することが報告されている。ポリ
クローナル抗体も、補体活性化およびＣＤＣの有効な誘導剤である。これらの陽性対照は
ＣＤＣアッセイが働いていたことを示し、ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−ＱはＣＤＣによ
り細胞を死滅しなかったことを実証する。
抗体ｈＡｂ−Ｑは、１０％ヒト血清の存在下でＲａｍｏｓ Ｅ２細胞のＣＤＣを誘導し
なかった
ヒト血液から単離したエフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を使用して、一連のＡＤＣＣアッ
セイを実施して（以下の実施例１０参照）、ヒト化抗Ｃ５ａＲまたは対照抗体とインキュ
ベートしたＲａｍｏｓ Ｅ２細胞を標的化した。一組の対照反応を並行して実施し、熱不
活性化ウシ血清またはＰＢＭＣをもたらした同じドナー由来の１０％ヒト血清の存在下で
、Ｒａｍｏｓ Ｅ２細胞（「標的のみ」）および抗体のインキュベーションを含んでいた
。
ヒト血清を含有した対照反応は、それらはウサギ補体ではなくヒト血清以外、前に記載
したＣＤＣアッセイに類似するので、ＣＤＣアッセイを表すと考えた。しかしながら、１
つの違いは、ヒト血清なしでインキュベートした標的＋抗体試料が存在しないことであっ
た。したがって、ヒト血清を使用したアッセイ中では、特異的ＣＤＣは、ヒト血清とイン
キュベートした標的＋抗体試料中の「非生存標的細胞の割合」から、熱不活性化ウシ血清
とインキュベートした標的＋抗体試料中の「非生存標的細胞の割合」を引くことによって
計算した。
ヒト血清を使用した７つのアッセイを実施した。Ｒａｍｏｓ Ｅ２細胞を、３時間１０
％熱不活性化ウシ血清または１０％ヒト血清の存在下において１、１０または１００μｇ
／ｍｌでｈＡｂ−Ｑ、リツキシマブまたはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体とインキュベ
ートした。Ｒａｍｏｓ Ｅ２細胞に、インキュベーション前に色素ＰＫＨ−２６およびイ
ンキュベーション後に生死判別色素ＴｏＰｒｏ３を充填して、非生存細胞と生存細胞を区
別することができた。特異的ＣＤＣは前に記載したように計算し、培地のみのバックグラ
ウンドをアッセイ中でそれぞれの試料から引いた。ヒト血清を用いたそれぞれの処理に関
する非生存標的（Ｒａｍｏｓ Ｅ２）細胞の平均率、熱不活性化ウシ血清試料中で観察し
た非特異性が低い死は特異的ＣＤＣと一致し、結果は図３１中に示す。
図３１は、ｈＡｂ−Ｑを含有する試料中では、非常に低レベルの特異的ＣＤＣが存在し
（約１〜２％）、用量間で差はなかったことを示す。Ｒａｍｏｓ Ｅ２溶解のレベルは、
ｈＡｂ−Ｑを含有する熱不活性化ウシ血清とヒト血清試料の両方と類似していた。特異的
ＣＤＣの類似していたレベル（約０〜４％）は、アイソタイプ対照抗体とインキュベート
した試料中で観察した。重要なことに、ｈＡｂ−ＱおよびｈＩｇＧ４アイソタイプ抗体と
インキュベートした試料中で観察した溶解の平均量の間で、統計上有意な差はなかった（
ｐ＞０．０５）。このデータは、ｈＡｂ−ＱはＣＤＣを特異的に媒介しないことを示唆す
る。対照的に、リツキシマブを含有する試料中の特異的ＣＤＣは用量依存性であり、１μ
ｇ／ｍｌのリツキシマブでの７２％から１００μｇ／ｍｌのリツキシマブでの９１％の範
囲であった。ヒト血清の存在下においてリツキシマブで観察した高レベルの死滅は、アッ
セイが働いていたことを示し、したがって、ｈＡｂ−ＱはＣＤＣを媒介しないと結論付け
る。ｈＡｂ−ＱがＣＤＣを媒介した場合、Ｒａｍｏｓ Ｅ２クローンが類似した高レベル
のＣＤ２０およびｈＣ５ａＲを発現することを考慮して、リツキシマブに対する類似した
レベルの死滅を予想することができた。
ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体によって誘導される抗体依存性細胞障害は、重鎖アイソタイプに
依存する
Ｃ５ａＲ発現細胞（好中球、単球など）を死滅しないヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体を開発する
ことは望まれていた。いくつかの機構によって、抗体は標的抗原を発現する細胞の死滅を
開始することができる。いくつかのヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体（例えば、ｈＡｂ−Ｑ、ｈＡｂ
−Ｊ、ｈＡｂ−Ｇ）はＩｇＧ４アイソタイプで生成し、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）お
よび抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）を回避／低減した。他のヒト化抗Ｃ５ａ
Ｒ抗体（例えば、ｈＡｂ−Ｎ、ｈＡｂ−Ｏ）は、Ｃ１ｑおよびＦｃｙＲと結合し、したが
ってＣＤＣおよびＡＤＣＣを誘導する可能性が高いことが知られているＩｇＧ１アイソタ
イプで生成した。抗体のＦｃドメインが抗原、例えば「標的細胞」上の受容体と結合し、
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好中球および好酸球を含めた、
細胞障害能を有する細胞（「エフェクター細胞」）上のＦｃ受容体と架橋すると、ＡＤＣ
Ｃが媒介される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体によって誘導されたＡＤＣＣ活性のレベルの
決定するために、以下の実験を実施した。
方法
ＡＤＣＣアッセイプロトコル
簡単に述べると、エフェクター細胞成分は、ＦｉｃｏｌｌまたはＰｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかの密度勾配分離を使用して健常ドナーから末梢血単
核細胞（ＰＢＭＣ）を単離することによって調製した。５％ＣＯ２中に３７℃で１００ｎ
ｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有する培地中で一晩インキュ
ベートした、残存する、非接着細胞（ＮＫ細胞を含有する）を含むフラスコに接着させる
ことによって（１時間、３７℃、５％ＣＯ２）、ＰＢＭＣ集団から次いで単球を枯渇させ
た。翌日、標的細胞（ｈＣ５ａＲを発現するＲａｍｏｓ Ｅ２細胞−前を参照）を蛍光細
胞膜色素、ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）で染色し、５×１０４個細胞／試料を、５％ＣＯ２
中で３７℃において３０分間抗体または培地のみとインキュベートした。インキュベーシ
ョン後、５０：１の比でエフェクター細胞、または培地のみのいずれかを標的細胞に加え
、試料を５％ＣＯ２中で３７℃においてさらに３時間インキュベートした。Ｔｏ−Ｐｒｏ
−３陽性として定義した非生存標的細胞をフローサイトメトリーにより測定し、全標的細
胞（ＰＨＫ−２６陽性細胞）の割合として表す前に、蛍光性生死判別色素、Ｔｏ−Ｐｒｏ
−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）をそれぞれの試料に加えた。培地は、ＰＢＭ
Ｃ「エフェクター」細胞を単離した同じドナー由来の１０％ヒト血清、または１０％熱不
活性化ウシ血清のいずれかを含有していた。
それぞれの試料の特異的ＡＤＣＣは、対応する試料の「標的およびエフェクター」（Ｂ
）から非生存「標的のみ」の平均率（Ａ）を引くことによって計算した。次いで「標的お
よびエフェクター」の「培地のみ」試料（Ｃ）をそれぞれの試料から引いて、特異的ＡＤ
ＣＣの最終値を得た：
特異的ＡＤＣＣ（溶解率）＝（Ｂ−Ａ）−Ｃ
前の式は以下のように表すこともできる：
特異的ＡＤＣＣ（溶解率）＝（Ｔ＋ＥＳ−Ｔ＋ＥＭＯ）−（ＴＯＳ−ＴＯＭＯ）。
上式で：Ｔ＋ＥＳは抗体を含む標的＋エフェクター試料中の非生存細胞の平均率であり
、
Ｔ＋ＥＭＯは標的＋エフェクター培地のみ（抗体含まず）中の非生存細胞の平均率であ
り、
ＴＯＳは抗体を含む標的のみ試料中の非生存細胞の平均率であり、
ＴＯＭＯは標的のみ培地のみ（抗体含まず）中の非生存細胞の平均率である。
結果
ＡＤＣＣ機構によって細胞死滅を誘導するヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑの能力を、
標的としてＲａｍｏｓ Ｅ２細胞を使用して一連のアッセイ中で調べた。Ｒａｍｏｓ Ｅ
２細胞はＣＤ２０とＣ５ａＲの両方を発現し、ＣＤ２０を標的化しＡＤＣＣによって死滅
するリツキシマブは陽性対照として使用することができる。Ｒａｍｏｓ Ｅ２におけるＣ
５ａＲの発現はヒト好中球における発現より約７倍高かった。細胞表面上で発現される標
的受容体のレベルは、抗体によって誘導されるＡＤＣＣおよびＣＤＣの程度に影響を与え
る可能性があることが報告されている（Ｐｒｅｉｔｈｅｎｅｒら、２００６；ｖａｎ Ｍ
ｅｅｒｔｅｎら、２００６；Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎら、２００６）。
エフェクター細胞は健常ボランティアの静脈血から精製したヒトＰＢＭＣであり、次い
で単核を枯渇させ、ＩＬ−２と共に一晩インキュベートしてＮＫ細胞を刺激（「初回抗原
刺激」）した。このステップは、エフェクターの細胞障害性を最大にするのに必要である
ことが分かった。
標的細胞は色素ＰＫＨ−２６で標識し、したがってそれらは、フローサイトメトリー中
にエフェクター細胞と区別することができた。それぞれの標的＋抗体試料用に、２本の試
験管をセットアップした（それぞれ２連）。１つは標的細胞および培地を含有しており、
もう１つは５０：１の比でエフェクターおよび標的を含有していた。５０：１の最適なエ
フェクター：標的比は、アッセイ開発中に、最大の死滅をもたらすことが示されている。
すべてのインキュベーションステップ後に試料に色素Ｔｏ−Ｐｒｏ−３（ＴＰ３）を加え
、フローサイトメトリーにより分析することによって生存能力を測定した。標的細胞の枯
渇は、バックグラウンド（無抗体試料）の控除後の全標的細胞（ＰＫＨ＋ｖｅ）の割合と
しての、非生存標的細胞（ＴＰ３＋ｖｅ／ＰＫＨ＋ｖｅ）の数であった。
標的細胞としてＲａｍｏｓ Ｅ２を使用してｈＡｂ−ＱおよびｈＡｂ−Ｎによって誘導
されたＡＤＣＣ活性の比較
第一系列の実験では、Ｒａｍｏｓ Ｅ２細胞のＡＤＣＣを誘導するヒト化抗Ｃ５ａＲ抗
体ｈＡｂ−Ｑ（重鎖アイソタイプｈＩｇＧ４）およびｈＡｂ−Ｎ（ｈＩｇＧ１）の能力を
、リツキシマブ（ｈＩｇＧ１）およびアイソタイプ対照抗体（ｈＩｇＧ４）によって誘導
されたＡＤＣＣと比較した。ヒトＩｇＧ１はｈＩｇＧ４よりＦｃγＲに対する高いアフィ
ニティーを有し、より効率良くＡＤＣＣを誘導すると予想される。
標的細胞は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）の存在下で、１００μｇ／ｍｌ
のｈＡｂ−Ｑ、ｈＡｂ−Ｎ、リツキシマブ（Ｒｏｃｈｅ）、ｈＩｇＧ４抗体（Ｓｉｇｍａ
）または培地（ＲＰＭＩ）のみと共にインキュベートした。３０分後、ＩＬ−２刺激ＰＢ
ＭＣ（５０：１（Ｅ：Ｔ）の比で）または培地のみのいずれかを標的細胞に加え、インキ
ュベーションは３時間続けた。フローサイトメトリーによって測定した非生存細胞の数は
ＡＤＣＣ活性の指標であった。培地のみのバックグラウンドおよび標的のみのバックグラ
ウンドをそれぞれの試料から引いて、特異的ＡＤＣＣ活性を決定した。３つの同一の実験
を実施した。結果（３つの実験からの結合データ±ｓｄ）は図３２中に示す。
ＩｇＧ１抗体、リツキシマブと抗Ｃ５ａＲｈＡｂ−Ｎの両方が、Ｒａｍｏｓ Ｅ２細胞
の（６５％を超える）高レベルの死滅を媒介する際に有効であった。対照的に、ｈＡｂ−
Ｑ（ＩｇＧ４）およびアイソタイプ対照ｈＩｇＧ４によって媒介された特異的ＡＤＣＣの
レベルは著しく低く、ＰＢＭＣおよびｈＡｂ−Ｑとのインキュベーション後わずか２３％
のＲａｍｏｓ Ｅ２細胞が非生存状態であった。アイソタイプ対照抗体とインキュベート
したＲａｍｏｓ Ｅ２細胞の死はなかった。これらの結果は、抗体のアイソタイプはＡＤ
ＣＣ活性の重要な決定因子であること、および抗体依存性の細胞死滅が望ましくない場合
、ｈＩｇＧ４アイソタイプのヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体がｉｎ ｖｉｖｏ治療に好ましい可能
性があることを示唆する。
標的としてＲａｍｏｓ Ｅ２Ｃ細胞を用いてｈＡｂ−Ｑにより媒介されたＡＤＣＣ活性
に対する血清の影響の比較
別の系のＡＤＣＣアッセイを前述のように実施し、一組の試料はＰＢＭＣエフェクター
細胞のドナーから単離した１０％ヒト血清を含有する培地中でインキュベートし、および
同組の試料は１０％熱不活性化ウシ血清を含有していた。血清の熱不活性化は補体活性を
損ねるように設計する。したがって、ヒト血清とインキュベートした試料中でＣＤＣ活性
を観察することができると予想した。ＣＤＣのレベルは「標的のみ」試料から決定した。
実際、リツキシマブを含有する「標的のみ」試料中では、非生存（ＴＰ３＋ｖｅ）細胞の
数は通常９０％を超えた。したがって、ヒト血清を含有する試料中でリツキシマブによっ
て誘導された特異的ＡＤＣＣ活性は決定することができなかった。しかしながら、１０％
熱不活性化ウシ血清および１００μｇ／ｍｌのリツキシマブを含有する並行試料中では、
平均６０％の標的（Ｒａｍｏｓ Ｅ２）細胞がエフェクター細胞によって特異的に死滅さ
れた。これは図３２中に表す結果と類似しており、エフェクター細胞およびＡＤＣＣアッ
セイが働いていたことを示した。
さらに、図３１中で前に示したように、ヒト化抗Ｃ５ａＲ（ｈＡｂ−Ｑ）およびｈＩｇ
Ｇ４アイソタイプ対照抗体は、このアッセイ中でＣＤＣ活性を誘導しなかった。したがっ
て、ｈＡｂ−Ｑおよびアイソタイプ対照抗体による特異的ＡＤＣＣは、ヒト血清を含有す
る試料に関して前に記載したように計算することができた。結果は図３３中に示す。１〜
１００μｇ／ｍｌの任意の濃度で、ｈＡｂ−Ｑ、アイソタイプ対照も、ＡＤＣＣによる有
意な細胞死は引き起こさなかった。ｈＡｂ−Ｑに関して、この結果は、熱不活性化ウシ血
清を含有する試料において観察したＡＤＣＣ活性と対照をなす（図３２）。
マウスの試験
ＫＲＮトランスジェニックマウス系は、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドで自己抗原グ
ルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）を認識するＴ細胞受容体を含有する。これ
らのマウスをＮＯＤマウスと交配すると、トランス遺伝子陽性Ｆ１子孫（Ｋ／ＢｘＮ）は
、ＧＰＩに対する循環抗体によって媒介される自己免疫様疾患を自然に発症する（Ｋｏｕ
ｓｋｏｆｆら、１９９６）。関節炎Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清は他の系統に移すことが
でき、そこで自己抗原免疫複合体は、別の補体経路、次にＣ５ａＲ−およびＦｃガンマＲ
ＩＩＩ媒介性細胞活性化および前炎症性サイトカインの生成を活性化する（Ｊｉら、２０
０２）。好中球、マスト細胞およびマクロファージは、このモデル中の病状の発症におい
て重要な役割を果たす（Ｗｉｐｋｅ ａｎｄ Ａｌｌｅｎ、２００１；Ｌｅｅら、２００
２；Ｓｏｌｏｍｏｎら、２００５）。観察した炎症性の表現型は、関節破壊を伴う慢性進
行性疾患の状態を含めたヒト関節リウマチの指標の多くの特徴をなす（Ｋｙｂｕｒｚ ａ
ｎｄ Ｃｏｒｒ、２００３）。
Ａ．炎症性関節炎のマウスモデル中のＣ５ａＲ逆炎症に対するヒト化抗体
方法
動物
約６〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドのヒトＣ５ａＲノックイントランス
ジェニックマウス（Ｌｅｅら、２００６）は、Ｇａｒｖａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、シド
ニーでの繁殖コロニーから入手した。雄のマウスが実験に好ましかったが、雌のマウスも
使用した。
Ｋ／ＢｘＮ血清の調製
実験用の血清を生成するために、ＫＲＮの雄をＮＯＤの雌と交配させた。炎症関節を発
症したＫＲＮトランス遺伝子を有するＦ１子孫は屠殺し、血液は心穿刺によって回収した
。血清は３７℃で２時間のインキュベーション後に単離し、４０００ｒｐｍで１０分間遠
心分離にかけた。多数のマウスからの血清をプールし、再度アリコートにし−８０℃で保
存した。
実験関節炎の誘導および測定
第０日および第２日に１００〜１５０μｌの血清を腹腔内注射することによって、レシ
ピエントマウスにおいて実験関節炎を誘導した。疾患の進行は、カリパスを使用して足首
の太さの変化を測定し、臨床値を決定することによって毎日モニタリングした。毎日の足
首の太さは、それぞれの後足からの２つの読み取り値を平均することによって決定した。
臨床値は、４足に関する値：０、正常関節、１、足首の軽度／適度な腫れおよび／または
１本の腫れた指、２、腫れた足首または２本以上の指の腫れ、３、足の全側面に沿った重
度の腫れまたは全５本の指の腫れを合計することによりそれぞれのマウスに関して計算し
た。マウスをモニタリングした調査員は、それぞれのマウスに与えた治療に対して盲検と
した。
治療
精製抗Ｃ５ａＲまたはアイソタイプ対照抗体（１〜１０ｍｇ／ｋｇ、ＰＢＳ中）を、第
５日に腹腔内注射した（療法治療レジメ）。いくつかの実験では、対照群にはアイソタイ
プ対照抗体ではなくＰＢＳを与えた。
統計分析
Ｋ／ＢｘＮモデル中の独立した対照群と治療群の間の差の統計的有意性を、マンホイッ
トニー検定を使用して、またはクラスカルワリス検定およびダンの多重比較検定と共に実
施した事後解析を使用して決定した。
結果
Ｋ／ＢｘＮモデルにおいて確定した炎症を逆行させるヒト化７Ｆ３抗体の能力を調べ、
それらの結果は以下に報告する。表８は、このモデルにおいて試験した抗体、および投与
した用量を列挙する。関節炎をＫ／ＢｘＮ血清注射によって誘導した後、すべての抗体を
第５日に腹腔内注射によって「治療的に」投与した。
図３４および３５中に表す結果は、炎症性関節炎の誘導後第５日に１０ｍｇ／ｋｇで腹
腔内投与したとき、ヒト化抗体が炎症の臨床兆候の逆行において有効であったことを示す
。低用量の抗体ＪおよびＣは１０ｍｇ／ｋｇの用量ほど有効ではなかったが、対照群（Ｐ
ＢＳまたはヒトＩｇＧ４−無関係なヒト抗原に対するアイソタイプ対照抗体を与えたマウ
ス）中で見られたように、大抵の場合、炎症の任意のさらなる増大を阻止することができ
た。
Ｂ．ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体は、関節リウマチのマウスモデル中の関節炎症の兆候および
症状を低減する：抗体用量、抗体血清濃度、受容体専有と有効性の間の関係
ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体の治療的投与の前に、マウスにおいて実験関節炎を誘導した。抗
体用量、血清中抗体濃度、抗体によるＣ５ａＲ専有のレベルとマウス中の関節炎症に対す
る影響の間の関係を調べた。
方法
動物
８〜１６週齢（平均約１２）のＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドの雄および雌のヒトＣ
５ａＲノックイントランスジェニックマウス（Ｌｅｅら、２００６）を、Ｇａｒｖａｎ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、シドニーまたはＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ
、パースでの繁殖コロニーから入手した。
Ｋ／ＢｘＮ血清の調製
この試験中のすべてのマウスに、前に記載したように調製したＫ／ＢｘＮ血清の同じバ
ッチを注射した。
ｈＡｂ−ＱのＦＩＴＣ標識
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を、以下のようにｈＡｂ−Ｑ抗体と共
有結合させた。簡単に述べると、約１．５ｍｇのｈＡｂ−Ｑを「反応バッファー」（１６
０ｍＭのＮａ２ＣＯ３、３４０ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５）中に交換し、抗体１ｍ
ｇ当たりＤＭＳＯに溶かした１２０μｇのＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ
）に加えた。反応は室温（２３℃）において１時間、暗所で実施した。非結合ＦＩＴＣは
、予め平衡状態にし「保存バッファー」（１０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐ
Ｈ８．２）で溶出したＰＤ−１０カラムを使用して除去した。結合ｈＡｂ−Ｑ−ＦＩＴＣ
は濃縮して、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（ＹＭ−３０）スピンフィルターを使用して１．０３６
ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得て、暗所で４℃において保存した。
実験関節炎の誘導および測定
前に記載したように第０日および第２日に１５０μｌのＫ／ＢｘＮ血清を腹腔内注射す
ることによって、レシピエントマウスにおいて実験関節炎を誘導した。第５日に、第０日
からの足サイズの変化（ｍｍ単位）と臨床値を掛けることによって、「ＲＡ値」をそれぞ
れのマウスに関して計算した。０．５を超えるＲＡ値を有していたマウスのみを試験の治
療段階に進めた。炎症性関節炎は、雄の約９０％および雌マウスの５０％において発症し
た。
試験設計−概観および群の大きさ
この試験は、抗Ｃ５ａＲ抗体を用いた治療の開始前後の、様々な時間でのＫ／ＢｘＮ疾
患モデルにおける炎症、ｉｎ ｖｉｖｏでの受容体専有、および血清抗体濃度を測定する
ために設計した。このモデルにおける疾患の過程は約３週間以内で一般に消散する。炎症
の兆候および症状は、Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清を用いた免疫処置の１日または２日以
内に明らかである。炎症は第１０〜１４日辺りがピークであり、その後ゆっくりと低下す
る。
これらの状況を考慮して、以下のスケジュールを分析に採用した：
●炎症：足サイズおよび臨床値は、第０日（最初の血清注射前）、第２日（第二回目の
血清注射前）、第５日（治療開始前）、次いで第６日、第７日、第８日、第９日、第１０
日、第１１日、第１２日、第１４日および第１６日に測定した。炎症は群当たり少なくと
も１０匹のマウスで決定した。
●血清抗体濃度：血液は第５日（治療後３０分および１２時間）、第６日（治療後２４
時間）、第７日（４８時間）、第８日（７２時間）、第９日（９６時間）、第１０日（１
２０時間）、第１１日（１４４時間）、第１２日（１６８時間）、第１４日（１９２時間
）および第１６日（２６４時間）に試料採取した。血清は第５．５日（治療後１２時間）
、第６日、第８日、第１０日、第１２日および第１６日に心穿刺によって回収した血液か
ら、および第５日（治療後３０分）および第７日、第９日、第１１日および第１４日に出
血させた尾静脈から調製した。２〜４匹のマウスの群はそれぞれの治療に関して毎回血液
を得たが、それぞれのマウスは３回を超えて出血させなかった。約１００μｌの血液を１
．５ｍｌの試験管（抗凝血剤含まず）中に回収し、３７℃で３０分間インキュベートして
凝固を促進し、次に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。血清は新たな試験
管（マウス試料当たり２本）中に分配し、ＥＬＩＳＡを使用して抗体濃度を決定する前に
−８０℃で保存した。
●受容体飽和：マウス（群当たりｎ＝４）を第５．５日（治療後１２時間）、第６日、
第８日、第１０日、第１２日および第１６日に屠殺し、心穿刺によって血液を回収した。
白血球をＦＩＴＣ標識ｈＡｂ−Ｑで染色して遊離Ｃ５ａ受容体の量を決定し、またはＦＩ
ＴＣ標識抗ヒトＩｇＧで染色してＰＢＳ対照と比較した結合ｈＡｂ−Ｑの量を決定した。
細胞はＣＤ１１ｂおよびＬｙ６Ｇで同時染色して好中球と単核を区別した。さらなる詳細
に関しては以下を参照。
治療
この試験に入れるために選択したマウスはランダムに５群に分けて、第５日に５つの治
療の１つを施した：
１．ＰＢＳ、腹腔内
２．ｈｕＩｇＧ対照抗体、腹腔内、＠８ｍｇ／ｋｇ
３．ｈＡｂ−Ｑ、腹腔内、＠１ｍｇ／ｋｇ
４．ｈＡｂ−Ｑ、腹腔内、＠３ｍｇ／ｋｇ
５．ｈＡｂ−Ｑ、腹腔内、＠１０ｍｇ／ｋｇ
注射する合計体積がマウス当たり約１００μｌであるように、抗体をＰＢＳ中に溶かし
た。マウスをモニタリングした調査員は、それぞれのマウスに施した治療に対して盲検と
した。受容体専有試験用にＰＢＳを施した動物を確認したこと以外、データ回収および分
析後まで治療群は明らかではなかった。
群１（ＰＢＳ対照）は抗体で治療せず、これを使用して受容体飽和、活性化およびＰＫ
分析のベースラインを設定した。群２は、無関係なヒトＩｇＧ抗体で治療した陰性対照群
であった。群３〜５には抗Ｃ５ａＲ治療を与えた。
統計分析
独立した対照群と治療群の間の差の統計的有意性を、前に記載したように決定した。
結合ｈＡｂ−Ｑの測定
それぞれの試験試料用にｈＡｂ−Ｑ（２００μｇ／ｍｌ、［最終］）またはｄＰＢＳの
いずれかを含有するようにプレートをセットアップした。それぞれのマウス由来の２５μ
ｌのヘパリン化血液をｈＡｂ−ＱとｄＰＢＳの両方を含有するウェルに加え、３７℃で１
．５時間インキュベートした。細胞はｄＰＢＳで３回洗浄して非結合ｈＡｂ−Ｑを除去し
、室温で４５分、抗ｈＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１／５０）、抗Ｌｙ−６Ｇ−ＰＥおよび抗ＣＤ
１１ｂ−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗体（１／４００）を含有するｄＰＢＳ中に再懸濁した
。赤血球はＢＤ ＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤ、３４９２０２）を加えることによって除去し
た。試料プレートは２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離にかけ、上清は除去し、フローサ
イトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ）による分析用にＢＤ ＦＡＣＳ溶解溶液中に
細胞を再び再懸濁した。
「遊離」Ｃ５ａ受容体の測定
ｈＡｂ−Ｑ（２００μｇ／ｍｌ、［最終］）、最大遊離Ｃ５ａＲ用）またはｄＰＢＳ（
最大遊離Ｃ５ａＲおよびすべての試験試料用）のいずれかを含有するようにプレートをセ
ットアップした。それぞれのマウス由来の２５μｌのヘパリン化血液を対応するウェルに
加えた（すなわち、ｄＰＢＳのみを注射したマウス由来の血液を＋ｈＡｂ−ＱとｄＰＢＳ
の両方を含有するウェルに加えた（最小および最大遊離Ｃ５ａＲ用））。すべての他の試
験用血液試料はｄＰＢＳのみを含有するウェルに加え、３７℃で１．５時間インキュベー
トした。細胞はｄＰＢＳで３回洗浄して過剰なｈＡｂ−Ｑを除去し、３７℃で４５分、２
５μｇ／ｍｌでｈＡｂ−Ｑ−ＦＩＴＣ、抗Ｌｙ−６Ｇ−ＰＥおよび抗ＣＤ１１ｂ−Ｐｅｒ
ＣＰ／Ｃｙ５．５抗体（１／４００）を含有するｄＰＢＳ中に再懸濁した。赤血球はＢＤ
ＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤ、３４９２０２）を加えることによって除去した。試料プレー
トは２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離にかけ、上清は除去し、フローサイトメトリー（
ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ）による分析用にＢＤ ＦＡＣＳ溶解溶液中に細胞を再び再懸
濁した。
好中球Ｃ５ａ受容体飽和のフローサイトメトリー分析
ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターを、チャネルＦＬ−１、ＦＬ−２およ
びＦＬ−３に関して確定した補償パラメーターでセットアップした。試料を入手して死細
胞および残骸は除外した。好中球はＬｙ−６Ｇ−ＰＥ高、ＣＤ１１ｂ−ＰｅｒＣＰ／Ｃ５
．５低−高として同定した。単球はＬｙ−６Ｇ−ＰＥ陰性、ＣＤ１１ｂ−ＰｅｒＣＰ／Ｃ
５．５高として同定した。結合ｈＡｂ−Ｑ（α−ＩｇＧ−ＦＩＴＣ）および遊離Ｃ５ａＲ
（ｈＡｂ−Ｑ−ＦＩＴＣ）のレベルは、それぞれの試料に関するＦＩＴＣ（ＦＬ−１）平
均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することによって決定した。
結合ｈＡｂ−Ｑの割合を、以下の等式に従い、（ＰＢＳ次いでＦＩＴＣ抗ｈＩｇＧとイ
ンキュベートしたＰＢＳ治療マウス試料から計算したバックグラウンドの控除後）２００
μｇ／ｍｌのｈＡｂ−Ｑとインキュベートした同じ試料に関するＭＦＩの割合として、ｄ
ＰＢＳ中でインキュベートしたそれぞれの試料のＭＦＩを決定することによって定量化し
た：
［［ＭＦＩ（試料＋ｄＰＢＳ）−ＭＦＩ（バックグラウンド、すなわちＰＢＳ対照マウ
ス＋ｄＰＢＳ）］／［Ｍａｘ＿ＭＦＩ（試料＋冷却ｈＡｂ−Ｑ）−ＭＦＩ（バックグラウ
ンド）］］×１００
遊離Ｃ５ａ受容体の割合を、最大遊離受容体試料、すなわちｄＰＢＳのみを投与したマ
ウスの割合として、ｄＰＢＳ中でインキュベートしたそれぞれの試料のＭＦＩを決定する
ことによって定量化した。最小遊離Ｃ５ａＲ、すなわち過剰なｈＡｂ−Ｑとｅｘ ｖｉｖ
ｏでインキュベートした試料はこの計算中では使用しなかったが、比較目的で使用した。
抗体血清濃度の測定
ｈＡｂ−Ｑの血清濃度は、マウス血清中のｈＡｂ−Ｑを検出することが実証されたＥＬ
ＩＳＡ法を使用してＧＬＰに従いアッセイした。定量化の下限（ＬＬＯＱ）は４ｎｇ／ｍ
ｌであった。ｉｎ ｖｉｔｒｏ消失試験用に、マウスアッセイをヒトＥＤＴＡ血漿中での
ｈＡｂ−Ｑの検出用に定性化した。アッセイを血漿に施したとき、ＬＬＯＱは１０ｎｇ／
ｍｌであった。
結果
数匹の２００ｈＣ５ａＲＫＯ／ＫＩマウスを、２日間隔で（第０日と第２日）Ｋ／Ｂｘ
Ｎマウス由来の血清を用いて２回免疫処置して、レシピエントマウスの足における膨張し
た関節および指として現れる炎症性関節炎を誘導した。第５日までに、約７０％のマウス
（約８５％の雄および約６０％の雌）が、足および関節のある程度の膨張および発赤を発
症した。０．５を超える「ＲＡ値」を有するマウスを、群当たり１１〜１２マウスの５つ
の治療群にランダムに選別した。それぞれの群には、５つの治療−１、３および１０ｍｇ
／ｋｇの用量でのＰＢＳに溶かしたｈＡｂ−Ｑ、８ｍｇ／ｋｇの用量でのＰＢＳに溶かし
た対照抗体（無関係な抗原に対するヒトＩｇＧ）およびＰＢＳのみの１つを施した。次の
１１日間、マウスを定期的にモニタリングし、臨床値を割り当て、足サイズ（足首の太さ
）を測定した。受容体占有率および抗体血清濃度を決定するために、第５．５日、第６日
、第７日、第８日、第９日、第１０日、第１２日、第１４日および第１６日に、血液試料
は尾静脈から、または心穿刺によって回収した。
ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体は、用量依存式に炎症性関節炎のＫ／ＢｘＮモデルにおいて炎症
を逆行させる
それぞれの治療群に関する第０日からの平均臨床値および足サイズの変化を図３６中に
示す。このデータは、ｈＡｂ−Ｑはｉｎ ｖｉｖｏで炎症の兆候および症状を低減する際
に有効であったことを示す。用量応答の関係を観察し、１０ｍｇ／ｋｇの用量は３および
１ｍｇ／ｋｇの用量より明らかに有効であった。２つの対照群を比較すると、１０ｍｇ／
ｋｇのｈＡｂ−Ｑは投与後１週間炎症および臨床値を低減および制御し、３ｍｇ／ｋｇの
ｈＡｂ−Ｑは約５日間炎症の任意のさらなる増大を阻止したが、既存の炎症を低減するこ
とはできず、かつ１ｍｇ／ｋｇのｈＡｂ−Ｑは有効ではなかった。最後の３〜５日の行程
中、１０ｍｇ／ｋｇと３ｍｇ／ｋｇの群の両方において炎症値の上昇の傾向があった。ｈ
Ａｂ−Ｑの１つの用量のみを第５日に与えた。以下に示すように、炎症の低減または安定
（さらなる増大なし）は、高い受容体飽和度および血清抗体濃度と関係があった。これら
が低下すると、炎症は回復した。
ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体によるＣ５ａ受容体占有率のレベルおよび程度は用量依存性であ
る
受容体占有率を２つの異なる方法で測定した。白血球はｈＡｂ−Ｑ−ＦＩＴＣで染色し
て「遊離」受容体の量を決定し、または抗ｈＩｇＧ−ＦＩＴＣで染色してｉｎ ｖｉｖｏ
で結合したｈＡｂ−Ｑ（「占有」受容体）の量を決定し、ＣＤ１１ｂとＬｙ６Ｇで同時染
色して好中球と単球を区別した。好中球上でＣ５ａＲと結合した抗体の量と遊離（空）受
容体の量の間には、反比例関係があるはずである。結合抗体を計算したとき、マウス毎の
受容体数の変動を補正した。遊離受容体を決定したとき、これは実施しなかった。結果は
図３７および３８中に示す。
図３７は、投与した抗体用量と好中球中の結合抗Ｃ５ａＲ抗体の間の関係を示す。最高
用量、１０ｍｇ／ｋｇで、結合抗体は投与（第１０日）後約１２０時間まで飽和レベルの
状態であり、次いで２６４時間（第１６日）までに約２０％の占有率に低下した。３ｍｇ
／ｋｇでは、結合抗体は約２４時間飽和レベルであり、次いで７２時間までに５０％、１
２０時間までに１５％に低下した。１ｍｇ／ｋｇの用量は抗体の飽和結合をもたらすのに
十分ではなく、受容体占有率は投与後２４時間でわずか７５％であった。７２時間までに
、好中球と結合したｈＡｂ−Ｑはほとんど存在しなかった。同様の結果を単球において観
察した（示さず）。
図３８は、「遊離」受容体のレベルが「占有」受容体（図３７中に示した結合抗体）の
割合と逆相関していたことを示す。投与後１週間まで、１０ｍｇ／ｋｇのｈＡｂ−Ｑで治
療したマウス中の好中球上には非常に少ない遊離受容体が存在した。３ｍｇ／ｋｇの群中
では、７２時間後まで遊離受容体はほとんど存在せず、かつ１ｍｇ／ｋｇの群中では、遊
離受容体は投与後２４時間後劇的に増大した。同様の結果を単球において観察した（示さ
ず）。
血清中のヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体濃度のレベルおよび程度は用量依存性である
動物の血清中のヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体の濃度を、投与後３０分と１１日の間の間隔で決
定した。結果は図３９中に示す。投与後、血清中のｈＡｂ−Ｑの濃度は急激に増大した。
測定した最大濃度には投与後３０分と１２時間の間で到達し、用量依存性であった。１ｍ
ｇ／ｋｇの抗体の投与後、血清中の濃度は３０分後１．９μｇ／ｍｌでピークに達し、１
２時間１．５μｇ／ｍｌを超えた状態であり、次いで第７日（投与後４８時間）に０．１
μｇ／ｍｌ未満に低下した。３ｍｇ／ｋｇの群中のピークの血清抗体濃度は、投与後１２
時間で１３．３μｇ／ｍｌであった。抗体のレベルは２日間高い状態であり（５μｇ／ｍ
ｌを超えた）、次いで第９日まで（投与後９６時間）に０．１μｇ／ｍｌ未満に急激に低
下した。１０ｍｇ／ｋｇの群中の血清抗体濃度は、投与後１２時間において６９．５μｇ
／ｍｌでピークに達し、次の７日間で５．５μｇ／ｍｌに、次いで第１４日までに０．１
μｇ／ｍｌ未満に徐々に低下した。
炎症の低減、または安定化は、高い受容体占有率および高い血清抗体濃度と相関関係が
ある
前述の図３６ａ（臨床値）、３７（ｈＡｂ−Ｑにより占有されたｈＣ５ａＲの割合）お
よび３９（血清中のｈＡｂ−Ｑ濃度）からのデータを図４０、４１および４２中で組み合
わせて、抗体用量、受容体占有率および血清抗体濃度の間の関係を実証した。
Ｋ／ＢｘＮ血清の注射によりマウスにおいて実験的関節炎を誘導すると、関節および足
の膨張および発赤の増大があり、前に記載した「関節炎の指標」を使用して、これを定量
化する（臨床値として表す）。ヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体ｈＡｂ−Ｑを「治療的」、すなわち
第０日および第２日にＫ／ＢｘＮ血清を与えたマウス中で炎症が発症した後第５日に投与
したとき、高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）を与えたマウス群中で炎症の重度の持続的な低減が
あった。図４０は、この群中の炎症のレベル（臨床値）は、受容体占有率が高くなった（
４０％超）のと同時に第５日および第１２日の間に低下したこと、および（５μｇ／ｍｌ
を超えた）高レベルのｈＡｂ−Ｑを血清中で測定したことを示す。３ｍｇ／ｋｇのｈＡｂ
−Ｑを投与したマウスは、次の４日間で再度増大する傾向が始まる前に、次の３日間で炎
症のわずかな低下を記録した。図４１は、３ｍｇ／ｋｇのｈＡｂ−Ｑを与えたマウス中で
、同時に血清抗体濃度が５μｇ／ｍｌを超え、受容体占有率は５０％以上であったことを
示す。第８日後、血清抗体濃度と受容体占有率の両方が急激に低下し、これは再度増大す
る傾向が始まった周期的炎症に対応した。マウスに１ｍｇ／ｋｇのｈＡｂ−Ｑ、低用量を
投与すると、臨床値によって証明されたように（図４２）、絶えず増大するレベルの炎症
の約１日の一時停止があった。同時に、血清中の抗体レベルは、注射直後の１．８μｇ／
ｍｌのピークから、および１２時間後の１．５μｇ／ｍｌに急激に低下した。Ｃ５ａＲの
占有率は、急激に低下する前の１日のみ５０％を超える状態であった。
総合すると、これらのデータは、高い受容体占有率は血清中の高い抗体濃度に依存し、
かつ組織切片中で観察し足サイズおよび臨床値の低減によって測定した関節内の白血球の
減少は、高レベルの受容体占有率（少ない「遊離」受容体）に依存するという提言を支持
する。遊離受容体なしでは、Ｃ５ａはＣ５ａＲと結合して、白血球の活性化および血液か
ら炎症部位への白血球の遊走、ならびに組織中での補体活性化を引き起こすことはできな
い。
Ｃ．Ｋ／ＢｘＮマウスモデルにおけるｈＡｂ−ＱのＰＫ／ＰＤ関係
この実施例では、本発明者らは、抗Ｃ５ａＲｍＡｂの薬物動態、標的受容体占有率、お
よび炎症性関節炎のＫ／ＢｘＮマウスモデルにおける影響の間の定量的関係を記載する、
考えられる薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）モデルを与える。モデリングに関するデータ
は、２つの試験、薬理学的試験（前で実施例１１Ｂ中に記載した）および毒性試験から作
成した。このモデルはデータを解釈するための方法を構成して濃度応答の関係を調べ、か
つこれを使用してヒト中で安全な開始用量の選択を支援することができる。
方法
薬理学的試験
薬理学的試験法の完全な詳細は実施例１１Ｂ中で前に与える。簡単に述べると、この試
験の目的は、第一にヒト化抗Ｃ５ａＲ抗体、ｈＡｂ−Ｑを用いた療法治療が、Ｋ／ＢｘＮ
モデルにおいて炎症性関節炎の兆候および症状を逆行させる際に有効であったかどうか決
定すること、および第二に、用量と抗炎症効果、受容体占有率のレベル（遊離ｈＣ５ａＲ
および結合ｈＡｂ−Ｑとして測定）、好中球活性化状態および循環血清中抗体濃度を関連
付けることであった。炎症は群当たり少なくとも１０匹のマウスにおいて決定した。受容
体飽和試験は、ＰＢＳを与えた対照群が２匹のマウスを含んでいたこと以外、群当たり４
匹のマウスで行った。投与群（１、３、１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、および対照動物）。
毒性試験
ｈＣ５ａＲトランスジェニックマウスへのｈＡｂ−Ｑの皮下および静脈内（ボーラス）
投与による毒性試験、用量は隔日で投与した。トキシコキネティックデータは、４つのｈ
Ａｂ−Ｑ用量群（５、５０、５００ｍｇ／ｋｇ、静脈内、および１００ｍｇ／ｋｇ皮下（
ｓ．ｃ．））のそれぞれにおいて、１８〜２１匹の雄および１８〜２１匹の雌から得た。
薬物動態
ｈＡｂ−Ｑの血清濃度は前に記載したようにアッセイした。
受容体占有率
ｈＡｂ−Ｑモノクローナル抗体の投与による好中球および単球におけるｈＣ５ａＲとの
結合を、前に記載したように決定した。薬理学的試験用に、占有率は、
として計算した。
結合前の値を引いた。これらはバックグラウンドＭＦＩを与えると考えたからである。
モデルの開発
一次条件付き評価（ＦＯＣＥ）を用いたＮＯＮＭＥＭ ＶＩ（非線形混合効果モデリン
グソフトウェア）をモデリングに使用し、Ｓ−ＰＬＵＳ（登録商標）８．０（Ｉｎｓｉｇ
ｔｈｆｕｌ）はグラフィックスおよびデータ処理に使用した。中間モデル間の区別の評価
は、目的関数値および標準的なグラフィック評価法に基づいた。目的関数値の点で、この
値の変化は（枝分かれモデルに関して）カイ二乗分布であると考え、モデルを拡大するた
めの基準を定義し適宜に使用した。
結果
占有率に関するＰＫ／ＰＤの関係
トランスジェニックマウスにおける毒性試験からのトキシコキネティックスと薬理学的
試験からのＰＫ／ＰＤデータを統合して、薬物動態と占有率の間の関係を評価した。これ
らのデータは、図４３中に例示したように、標的媒介性であるワンコンパートメントＰＫ
モデルによって十分記載することができた。それぞれの投与群に関するＰＫおよび占有率
モデルの適合性は図４４中に示し、一方パラメーター値は表９中に与える。毒性試験中で
は低い用量レベルではなく、５００ｍｇ／ｋｇの群に関して高いクリアランスを推定した
ことにも留意されたい。これは他の試験と一致し、ＦｃＲＮ受容体の飽和のため高い用量
に関して高いクリアランスを観察する（Ｈａｎｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｈａｓａｒ、２
００２）。
炎症に対する影響に関するＰＫ／ＰＤの関係
ＰＫ／ＰＤモデルを開発して、トランスジェニックマウスを使用した薬理学的試験（Ｋ
／ＢｘＮモデル）における炎症攻撃後の、薬物動態と足サイズの変化の間の関係を記載し
た。Ｋ／ＢｘＮモデルの自然経過は、実験的関節炎の誘導による足サイズの漸増、および
炎症減弱時の正常な足サイズへの約１２日後のそれに続く段階的な回復である。図４５中
に例示したＰＫ／ＰＤモデルは、誘導される炎症の阻害によるｈＡｂ−Ｑの影響を記載す
る。最大阻害の割合は、占有率ＰＫ／ＰＤモデルから得た占有率のレベルに設定した。図
４６中に見られるように、測定した足サイズとモデル化した足サイズの間の妥当な一致は
この手法によって得ることができ、これは好中球Ｃ５ａ受容体の占有率と炎症に対する影
響の間の非常に密接な関係を示す。
ＫＯ／ＫＩ ｈＣ５ａＲマウス（ｎ≧１０／時間地点／群）に第０日に実験的関節炎の
誘導を施し、第５日に１、３、１０または０ｍｇ／ｋｇの抗Ｃ５ａＲ（ｈＡｂ−Ｑ）を注
射した。約１２日後、足サイズは減少し始め、このとき炎症により誘導された増大は減弱
した。同様に、１００％に近い占有率で、炎症により誘導された増大は阻害され、１０ｍ
ｇ／ｋｇの群に関しては、足サイズのわずかな減少が見られた。このモデルでは、これら
のプロセスは関連があり、いずれも正常な足サイズへの自然な回復によって記載される。
このモデルは、ｈＡｂ−Ｑの影響の大部分は、循環好中球における受容体の完全な占有
をもたらす濃度で得られることを予測した。１ｍｇ／ｋｇでは、占有は投与後１〜２日の
み高く、その後足サイズは再度増大し始めた、図４６を参照。同様に、足サイズは再度増
大し始めた後に、３ｍｇ／ｋｇは約７２時間の高い占有をもたらした。１０ｍｇ／ｋｇで
は、ほぼ同じ期間の足部炎症の阻害をもたらす約１０日間の占有を得る。
示した考えられるモデルを使用して、本発明者らは、占有が５０％を超えたとき、足サ
イズの増大は阻害され、および占有が５０％未満に低下したとき、例えば３ｍｇ／ｋｇの
群において第８日後に、足サイズの炎症により誘導された増大が再び始まったことを観察
する。このモデルは５０％阻害および５０％占有と関係があるので、この十分な適合によ
って、１）占有と炎症に対する影響は密接に関係があること、および２）５０％における
ピークの占有は炎症に対して最小の影響を与えると予想されることを定量的に確認した。
結論
このモデルは、モノクローナル抗体濃度、占有、および炎症に対する影響の間の密接な
関係を実証し、観察値と予測値の間の十分な一致を発見した。このデータ中の最も重要な
特色、１）さらなる臨床開発を動機付けるマウスの足に対する明らかに有益な影響、２）
長期の治療効果のための高用量レベルの要件をもたらし得る、標的媒介性によって記載さ
れた高飽和性除去成分、および３）低用量で高ピークの占有をもたらし得る、おそらく二
価結合と関係がある、ｉｎ ｖｉｖｏでの受容体との比較的強い結合は、このモデルによ
って記載された。
初回ヒト試験における安全な開始用量を選択するためのすべての関連前臨床データに基
づいて、ヒトシミュレーションモデルを構築するために使用するパッケージの一部として
、このモデルを使用した。
ヒトデータを用いたＰＫ／ＰＤモデルのアップデート
ｈＡｂ−Ｑを用いた進行中の臨床試験からのデータを使用して、薬物動態およびＣ５ａ
Ｒ占有率データを使用して、実施例１１中に記載した前臨床ＰＫ／ＰＤモデルを実証およ
びアップデートした。このモデルのシミュレーションを使用して、高用量レベルでのＰＫ
／ＰＤに関する本発明の予想を記載する。このモデルは、将来の試験における用量レベル
およびレジメン選択に関する早期意志決定のための、データを解釈するための方法を構成
する。
方法
臨床データ
ＮＮ８２０９−１９４０は、それぞれ８および７用量レベルでの、平行した単回静脈内
および皮下投与のランダム化、二重盲検、プラセボ対照、用量増大試験である。対象は抗
Ｃ５ａＲ（ｈＡｂ−Ｑ）の単回静脈内または皮下投与にランダム化する。対象は３：１の
比にランダム化し、３対象にはそれぞれの用量レベルおよび投与経路で活性治療を割り当
て、１対象にはプラセボ治療を割り当てた。抗Ｃ５ａＲ（ｈＡｂ−Ｑ）は、予定用量レベ
ルで、前の用量レベルから３または３．３倍の実際の用量の増大で投与する。本発明の用
量レベルは、ＰＫ／ＰＤモデル最新版において、静脈内用量レベル：０．００３、０．０
１、０．０３、０．１、０．２、０．６ｍｇ／ｋｇ；皮下用量レベル：０．０１、０．０
３、０．１、０．３ｍｇ／ｋｇを含んでいた。
モデリング、懸案試験履行中に含まれなかったデータは、予定用量レベル：２および７
ｍｇ／ｋｇ静脈内、ならびに１および３ｍｇ／ｋｇ皮下を含む。
サンプリングスケジュール
抗Ｃ５ａＲ（ｈＡｂ−Ｑ）の測定用のＰＫサンプリングは、０時間での投与前（投与前
最大６０分）、および薬剤投与後５分（静脈内投与後のみ）、１５分（静脈内投与後のみ
）、および３０分、および１、２、４、６、８、１２、２４および４８時間および３、７
、１４、２１、２８、４２、５６、および７０日に予定する。時間地点は、０分での注射
または注入の開始を指す。静脈内投与にランダム化した対象に関しては、注入時間は１５
分であり、したがって１５分の時間地点は注入の最後を指す。
好中球および単球におけるＣ５ａＲ専有に関するサンプリングは、０時間での投与前（
投与前最大６０分）、および薬剤投与後４、２４、および４８時間および３、７、１４、
２１、４２、および７０日に予定する。
占有率の計算
ｈＡｂＱモノクローナル抗体の投与による好中球および単球におけるｈＣ５ａＲとの結
合は、３つの異なる方法を使用して決定した。ＦＡＣＳによる分析後、これらの測定のそ
れぞれは補正平均蛍光強度（ＭＥＦ）をもたらす。３つの方法は、１）ｉｎ ｖｉｖｏで
結合したｈＡｂＱを有する専有受容体を評価するためにＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ４二次
抗体を使用する直接法（ＭＥＦ結合）、２）ｉｎ ｖｉｖｏでのｈＡｂ−Ｑ投与、次にｅ
ｘ ｖｉｖｏでのｈＡｂ−Ｑ−ＦＩＴＣの添加の結果として遊離ｈＣ５ａ受容体を測定す
る間接法（ＭＥＦ遊離）、および３）全受容体数の測定、全受容体を充填するためのｅｘ
ｖｉｖｏでの過剰なｈＡｂ−Ｑとのインキュベーション、および次いで抗ヒト二次抗体
の添加である（ＭＥＦ最大結合）。占有率はその後以下のように導いた：
モデルの開発
一次条件付き評価（ＦＯＣＥ）を用いたＮＯＮＭＥＭ ＶＩをモデリングに使用し、か
つＳ−ＰＬＵＳ（登録商標）８．０をグラフィックスおよびデータ処理に使用した。中間
モデル間の区別の評価は、目的関数値および標準的なグラフィック評価法に基づいた。目
的関数値の点で、この値の変化は（枝分かれモデルに関して）カイ二乗分布であると考え
、モデルを拡大するための基準を定義し適宜に使用した。
最新モデルはデータから推定した。しかしながら、本発明のデータはすべてのパラメー
ターの確実な推定に不十分である可能性がある。この場合、いくつかのパラメーターは典
型的なＩｇＧパラメーターのパラメーター値に固定した。
結果
ヒトＰＫおよび占有率に関する本発明の最新モデルは図４７中に記載する。モデル予測
は一般に、実験中でこれまで観察した薬物動態および占有率と非常によく一致したことが
分かった。抗Ｃ５ａＲ（ｈＡｂ−Ｑ）投与後のＰＫ／ＰＤのこれらのモデル予測は、静脈
内投与に関しては図４８中、および皮下投与に関しては図４９中に与える。これらの予測
は、データの蓄積に応じて変わる可能性があることに留意されたい。
このモデルは非常に非線形であり、線形薬物動態より予測は困難となる。本発明のデー
タに基づくと、ごくわずかな情報が高用量レベルでの排出半減期に貢献し、特に高用量レ
ベルの予測に関しては、ある程度の不確かさを考慮に入れなければならないことが示唆さ
れた。皮下投与に関しては、利用可能な薬物動態データは依然として定量化の下限に近く
、これは主に占有率のデータが生物学的利用能の推定に貢献することを意味する。
結論
全体として、観察および予想ＰＫと占有率の間の十分な一致を見出した。前臨床データ
から予想した主な特色は臨床データにおいても観察した。これらの特色は、標的、および
低濃度での比較的高い占有率による可能性が高い、除去される高飽和成分を含む。
多数の変形および／または変更形態を、広義に記載するように本発明の精神または範囲
から逸脱せずに、具体的な実施形態中に示したように本発明に施すことができることは、
当業者によって理解されよう。したがって、本発明の実施形態は、すべての点で制限的で
はなく例示的であるとして考えられる。
本出願は、その全容が参照によって本明細書に組み込まれる、２００８年２月２０日に
出願されたＵＳ６１／０６６，５３９からの優先権を主張するものである。
前に論じたすべての刊行物は、それらの全容が本明細書に組み込まれる。
本明細書中に含まれている文献、作用、物質、デバイス、物品などのいずれの論述も、単に本発明の状況を示す目的である。これらの物体のいずれかまたはすべてが従来技術のベースの一部を形成し、または本発明が関係する分野の共通の一般知識であったことを、当然のこととして解釈すべきではない。それは本出願のそれぞれの特許請求の優先日前に存在したからである。
（参考文献）

本発明は、以下を提供する。
［１］
ｉ）配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号４８の１つまたは複数と少なくとも９３％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖、ならびに／または
ｉｉ）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３９の１つまたは複数と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン重鎖
を含み、ヒトＣ５ａＲに結合する、実質的に精製された、かつ／または組換えのヒト化抗体。
［２］
免疫グロブリン重鎖が、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
［３］
免疫グロブリン軽鎖が、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、請求項１または請求項２に記載のヒト化抗体。
［４］
免疫グロブリン軽鎖が、配列番号３１として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖が、配列番号３６として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
［５］
免疫グロブリン軽鎖が、配列番号３１として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖が、配列番号３４として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
［６］
免疫グロブリン軽鎖が、配列番号３２として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖が、配列番号３４として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
［７］
免疫グロブリン軽鎖が、配列番号３３として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖が、配列番号３４として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
［８］
免疫グロブリン軽鎖が、配列番号３１として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖が、配列番号３５として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
［９］
免疫グロブリン軽鎖が、配列番号３２として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖が、配列番号３５として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
［１０］
免疫グロブリン軽鎖が、配列番号３３として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖が、配列番号３５として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
［１１］
免疫グロブリン軽鎖が、配列番号３２として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖が、配列番号３６として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
［１２］
免疫グロブリン軽鎖が、配列番号３３として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含み、免疫グロブリン重鎖が、配列番号３６として示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
［１３］
ｉ）免疫グロブリン軽鎖が、配列番号４０および配列番号４１の１つまたは複数と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む定常領域を含み、
ｉｉ）免疫グロブリン重鎖が、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５の１つまたは複数と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む定常領域を含む、
請求項１から１２のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
［１４］
２本の重鎖および２本の軽鎖からなる４ポリペプチド鎖構造、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディまたはテトラボディである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
［１５］
ヒトＣ５ａＲに結合する抗体フラグメントである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
［１６］
前記フラグメントが、Ｆａｂフラグメントまたは単一ドメイン抗体である、請求項１５に記載のヒト化抗体。
［１７］
配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号４８の１つまたは複数と少なくとも９３％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、実質的に精製された、かつ／または組換えの免疫グロブリン軽鎖。
［１８］
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３９の１つまたは複数と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、実質的に精製された、かつ／または組換えの免疫グロブリン重鎖。
［１９］
請求項１７に記載の免疫グロブリン軽鎖および／または請求項１８に記載の免疫グロブリン重鎖を含み、ヒトＣ５ａＲに結合する、実質的に精製された、かつ／または組換えの抗体。
［２０］
請求項１から１６または１９のいずれか一項に記載の抗体および前記抗体に直接的または間接的に結合している治療薬を含むコンジュゲート。
［２１］
治療薬が、細胞毒、放射性同位体、免疫調節薬、抗血管新生薬、毒素、抗増殖薬、アポトーシス促進剤、化学療法剤および治療用核酸からなる群から選択される、請求項２０に記載のコンジュゲート。
［２２］
毒素が緑膿菌外毒素またはその誘導体である、請求項２１に記載のコンジュゲート。
［２３］
治療薬が、リンカーを介して抗体に間接的に結合している、請求項２０から２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［２４］
リンカーが、４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）、３−アセチルフェニル酸性酸（ＡｃＰａｃ）、４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸（アミド）およびその誘導体からなる群から選択される、請求項２３に記載のコンジュゲート。
［２５］
請求項１から１６または１９のいずれか一項に記載の抗体および前記抗体に直接的または間接的に結合している検出可能な標識を含むコンジュゲート。
［２６］
前記標識が、放射標識、蛍光標識、酵素標識および造影剤からなる群から選択される、請求項２５に記載のコンジュゲート。
［２７］
請求項１から１６もしくは１９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその鎖、請求項１７に記載の免疫グロブリン軽鎖、請求項１８に記載の免疫グロブリン重鎖、ならびに／または請求項２０から２３、２５もしくは２６のいずれか一項に記載のコンジュゲートをコードする単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド。
［２８］
請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［２９］
請求項２７に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項２８に記載のベクターを含む宿主細胞。
［３０］
請求項２９に記載の細胞を含む非ヒトトランスジェニック生物。
［３１］
請求項１から１６もしくは１９のいずれか一項に記載の抗体、請求項１７に記載の免疫グロブリン軽鎖、請求項１８に記載の免疫グロブリン重鎖、請求項２０から２６のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項２７に記載のポリヌクレオチド、請求項２８に記載のベクターおよび／または請求項２９に記載の宿主細胞ならびに担体を含む組成物。
［３２］
抗体を産生するプロセスであって、ポリヌクレオチドが発現され、抗体が産生されるように、請求項２９に記載の宿主細胞を培養することを含み、宿主細胞が、請求項２７に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプロセス。
［３３］
免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖が、一続きのポリヌクレオチドにある２つの別個のオープンリーディングフレームによってコードされる、請求項３２に記載のプロセス。
［３４］
宿主細胞培養物から抗体を回収することをさらに含む、請求項３２または請求項３３に記載のプロセス。
［３５］
ヒトＣ５ａＲとそのリガンドとの相互作用を阻害するための方法であって、細胞を、請求項１から１６もしくは１９のいずれか一項に記載の抗体または請求項２０から２６のいずれか一項に記載のコンジュゲートに曝露することを含む方法。
［３６］
細胞におけるヒトＣ５ａＲ活性を阻害するための方法であって、細胞を、請求項１から１６もしくは１９のいずれか一項に記載の抗体または請求項２０から２６のいずれか一項に記載のコンジュゲートに曝露することを含む方法。
［３７］
対象において障害を治療または予防する方法であって、請求項１から１６もしくは１９のいずれか一項に記載の抗体、請求項２０から２６のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項２７に記載のポリヌクレオチド、請求項２８に記載のベクター、請求項２９に記載の宿主細胞および／または請求項３１に記載の組成物を対象に投与することを含む方法。
［３８］
障害が免疫病理学的障害である、請求項３７に記載の方法。
［３９］
免疫病理学的障害が自己免疫疾患である、請求項３８に記載の方法。
［４０］
障害が炎症性疾患である、請求項３７に記載の方法。
［４１］
炎症性疾患が急性炎症または慢性炎症である、請求項３９に記載の方法。
［４２］
免疫病理学的障害または炎症性疾患に白血球遊走および／または白血球活性化が関与する、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の方法。
［４３］
免疫病理学的障害または炎症性疾患に補体活性化が関与する、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の方法。
［４４］
対象において治療薬を炎症部位に送達するための方法であって、請求項２０から２４のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたはそれをコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含む方法。
［４５］
遺伝物質を、Ｃ５ａＲを提示する細胞に導入するための方法であって、前記細胞を、請求項１から１６もしくは１９のいずれか一項に記載の抗体または請求項２０から２６のいずれか一項に記載のコンジュゲートと接触させることを含み、抗体またはコンジュゲートが遺伝物質に結合している、またはそれと会合している方法。
［４６］
試料中のヒトＣ５ａＲの存在または非存在を検出する方法であって、試料を、請求項１から１６または１９のいずれか一項に記載の抗体および／または請求項２０から２６のいずれか一項に記載のコンジュゲートと接触させること、ならびに試料をヒトＣ５ａＲと抗体またはコンジュゲートとの結合について分析することを含む方法。
［４７］
対象において障害を診断するための方法であって、対象またはそれから得られた試料を、請求項１から１６もしくは１９のいずれか一項に記載の抗体または請求項２０から２６のいずれか一項に記載のコンジュゲートと接触させること、および対象または試料をヒトＣ５ａＲと抗体またはコンジュゲートとの結合について分析することを含む方法。
［４８］
対象から得られた組織標本または組織もしくは体液の亜分画を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される、請求項４７に記載の方法。
［４９］
障害が免疫病理学的障害である、請求項４７または請求項４８に記載の方法。
［５０］
対象において障害を治療または予防するための医薬品としての、請求項１から１６もしくは１９のいずれか一項に記載の抗体、請求項２０から２６のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項２７に記載のポリヌクレオチド、請求項２８に記載のベクター、請求項２９に記載の宿主細胞および／または請求項３１に記載の組成物の使用。
［５１］
対象において治療薬を炎症部位に送達するための医薬品を製造するための、請求項２０から２４のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたはそれをコードするポリヌクレオチドの使用。
［５２］
対象において障害を治療または予防するための医薬品としての、請求項１から１６もしくは１９のいずれか一項に記載の抗体、請求項２０から２６のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項２７に記載のポリヌクレオチド、請求項２８に記載のベクター、請求項２９に記載の宿主細胞および／または請求項３１に記載の組成物の使用。
［５３］
対象において治療薬を炎症部位に送達するための医薬品としての、請求項２０から２４のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたはそれをコードするポリヌクレオチドの使用。
［５４］
請求項１から１６もしくは１９のいずれか一項に記載の抗体、請求項２０から２６のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項２７に記載のポリヌクレオチド、請求項２８に記載のベクター、請求項２９に記載の宿主細胞および／または請求項３１に記載の組成物を含むキット。
配列番号１：７Ｆ３可変軽鎖タンパク質配列。
配列番号２：７Ｆ３可変重鎖タンパク質配列。
配列番号３：７Ｆ３可変軽鎖コード配列。
配列番号４：７Ｆ３可変重鎖コード配列。
配列番号５：ＫＶ２Ｆ＿ヒトのヒト軽鎖可変領域。
配列番号６：ＫＶ２Ｅ＿ヒトのヒト軽鎖可変領域。
配列番号７：ＫＶ２Ｄ＿ヒトのヒト軽鎖可変領域。
配列番号８：ＫＶ２Ｂ＿ヒトのヒト軽鎖可変領域。
配列番号９：ＫＶ２Ａ＿ヒトのヒト軽鎖可変領域。
配列番号１０：Ｘ１２６９１のヒト軽鎖可変領域。
配列番号１１：Ｕ４１６４５のヒト軽鎖可変領域。
配列番号１２：Ｕ４１６４４のヒト軽鎖可変領域。
配列番号１３：Ｍ３１９５２のヒト軽鎖可変領域。
配列番号１４：図１に示されるヒト軽鎖可変配列のｈＶｋＦＷ Ｃｏｎｓコンセンサス配
列。
配列番号１５：Ｈｖ１Ａｖ＿ヒトのヒト重鎖可変領域。
配列番号１６：Ｈｖ１Ｂｖ＿ヒトのヒト重鎖可変領域。
配列番号１７：Ｈｖ１Ｃｖ＿ヒトのヒト重鎖可変領域。
配列番号１８：Ｈｖ１Ｇｖ＿ヒトのヒト重鎖可変領域。
配列番号１９：Ｍ９９６４１．ａａのヒト重鎖可変領域。
配列番号２０：Ｍ９９６４２．ａａのヒト重鎖可変領域。
配列番号２１：Ｘ６２１０９．ａａのヒト重鎖可変領域。
配列番号２２：Ｘ９２３４３．ａａのヒト重鎖可変領域。
配列番号２３：Ｚ１２３０５．ａａのヒト重鎖可変領域。
配列番号２４：図２Ａに示されるヒト重鎖可変（Ｖ）領域配列のｈＶｈｖＦＷ Ｃｏｎｓ
コンセンサス配列。
配列番号２５：Ｈｖ１Ｃｊ＿ヒトのヒト重鎖連結領域。
配列番号２６：Ｈｖ２Ｉｊ＿ヒトのヒト重鎖連結領域。
配列番号２７：Ｈｖ３Ｈｊ＿ヒトのヒト重鎖連結領域。
配列番号２８：Ｈｖ３Ｋｊ＿ヒトのヒト重鎖連結領域。
配列番号２９：Ｈｖ３Ｔｊ＿ヒトのヒト重鎖連結領域。
配列番号３０：図２Ｂに示されるヒト重鎖連結（Ｊ）領域配列のｈＶｈｊＦＷ Ｃｏｎｓ
コンセンサス配列。
配列番号３１：ヒト化７Ｆ３ Ｖ領域軽鎖ｈ７Ｖｋアミノ酸配列。
配列番号３２：ヒト化７Ｆ３ Ｖ領域軽鎖ｈ７ａＶｋアミノ酸配列。
配列番号３３：ヒト化７Ｆ３ Ｖ領域軽鎖ｈ７ｂＶｋアミノ酸配列。
配列番号３４：ヒト化７Ｆ３ Ｖ領域重鎖ｈ７Ｖｈアミノ酸配列。
配列番号３５：ヒト化７Ｆ３ Ｖ領域重鎖ｈ７ａＶｈアミノ酸配列。
配列番号３６：ヒト化７Ｆ３ Ｖ領域重鎖ｈ７ｂＶｈアミノ酸配列。
配列番号３７：ヒトＣ５ａＲ。
配列番号３８：ヒトＣ５ａＲの第２細胞外ループにあるエピトープ。
配列番号３９：図１０に示される本発明のヒト化７Ｆ３重鎖可変領域ｈ７Ｆ３ＶｈＣｏｎ
ｓコンセンサス配列。
配列番号４０：ヒト軽鎖定常領域ｈＣκ−Ｒ。
配列番号４１：ヒト軽鎖定常領域ｈＣκ。
配列番号４２：ヒト重鎖定常領域ｈＣγ４。
配列番号４３：ヒト重鎖定常領域ｈＣγ４ＰＥ。
配列番号４４：ヒト重鎖定常領域ｈＣγ１。
配列番号４５：ヒト重鎖定常領域ｈＣγ４Ｐ。
配列番号４６：ヒト化ＲＮＯＫ２０３ＶＬ配列。
配列番号４７：ＫＶ２Ｆ−ＨＵＭＡＮ由来ＶＬＣＤ１８−Ｑ配列。
配列番号４８：図６に示される本発明のヒト化７Ｆ３軽鎖可変領域のｈ７Ｆ３ ＶｋＣｏ
ｎｓコンセンサス配列。
配列番号４９：ｈＶｈＦＷ Ｃｏｎｓコンセンサスヒト重鎖ＶＪフレームワーク配列
配列番号５０：ヒトＳＧＩ−ＶＨ配列。
配列番号５１：ヒト生殖系列ＨＧ３配列。
配列番号５２：ヒト化７Ｆ３ Ｖ領域軽鎖ｈ７Ｖｋアミノ酸配列をコードするポリヌクレ
オチド配列。
配列番号５３：ヒト化７Ｆ３ Ｖ領域軽鎖ｈ７ａＶｋアミノ酸配列をコードするポリヌク
レオチド配列。
配列番号５４：ヒト化７Ｆ３ Ｖ領域軽鎖ｈ７ｂＶｋアミノ酸配列をコードするポリヌク
レオチド配列。
配列番号５５：ヒト化７Ｆ３ Ｖ領域重鎖ｈ７Ｖｈアミノ酸配列をコードするポリヌクレ
オチド配列。
配列番号５６：ヒト化７Ｆ３ Ｖ領域重鎖ｈ７ａＶｈアミノ酸配列をコードするポリヌク
レオチド配列。
配列番号５７：ヒト化７Ｆ３ Ｖ領域重鎖ｈ７ｂＶｈアミノ酸配列をコードするポリヌク
レオチド配列。
配列番号５８：ヒトＣ５ａＲの第２細胞外ループの断片。
配列番号５９：ヒトＣ５ａＲのＮ末端細胞外ドメインの断片。

Claims (11)

  1. ｉ）配列番号３１に示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖、ならびに
    ｉｉ）配列番号３６に示すアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン重鎖、
    を含み、ヒトＣ５ａＲに結合する、実質的に精製された、かつ／または組換えのヒト化抗体。
  2. ｉ）免疫グロブリン軽鎖が、配列番号４０および配列番号４１の１つまたは複数と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む定常領域を含み、かつ
    ｉｉ）免疫グロブリン重鎖が、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５の１つまたは複数と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む定常領域を含む、
    請求項１に記載のヒト化抗体。
  3. ｉ）免疫グロブリン軽鎖が、配列番号４１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む定常領域を含み、かつ
    ｉｉ）免疫グロブリン重鎖が、配列番号４５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む定常領域を含む、
    請求項１に記載のヒト化抗体。
  4. ｉ）ヒト好中球の遊走を低減させることが可能である、
    ｉｉ）Ｃ５ａによって誘発されるヒト好中球中へのカルシウム流入を遮断することが可能である、かつ/または
    ｉｉｉ）ヒト好中球を検出可能に活性化しない、
    請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
  5. ２本の重鎖および２本の軽鎖からなる４ポリペプチド鎖構造、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディもしくはテトラボディであるか、または
    ヒトＣ５ａＲに結合する抗体フラグメントである、
    請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
  6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体もしくはその鎖をコードする単離された、および／もしくは外因性のポリヌクレオチド。
  7. 請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  8. 請求項６に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。
  9. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体、請求項６に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載のベクターおよび／または請求項８に記載の宿主細胞ならびに担体を含む組成物。
  10. 医薬の製造における、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体、請求項６に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載のベクター、請求項８に記載の宿主細胞および／または請求項９に記載の組成物、の使用。
  11. 免疫病理学的障害もしくは炎症性疾患を治療または予防するための医薬の製造における、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体、請求項６に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載のベクター、請求項８に記載の宿主細胞および／もしくは請求項９に記載の組成物、の使用。
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