ES2558603T3 - Proceso de purificación de teicoplanina - Google Patents

Abstract

Un proceso para la preparación de teicoplanina purificada, comprendiendo el proceso someter la teicoplanina a una técnica de intercambio catiónico y aniónico, en donde una resina de intercambio catiónico y aniónico que tiene teicoplanina enlazada a la misma, es respectivamente tratada con un eluyente que tiene un valor de pH en el rango de 5 hasta por debajo de 9.

Description

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DESCRIPCION

Proceso de purification de teicoplanina Campo de la invention

La presente invention se refiere al campo de la tecnologla qulmica, mas especlficamente a una manera novedosa y efectiva de purification del antibiotico teicoplanina.

Antecedentes de la invention

Teicoplanina es un termino usado comunmente para un grupo de antibioticos de glicopeptido a partir de la familia de vancomicina-ristocetina, producida por un microorganismo fungico tal como, por ejemplo, Actinoplanes teichomyceticus. Teicoplanina se divulga por primera vez en J. Antibiotics 31 (1978), p. 170-177 como una mezcla de tres factores denominados teicomicina A1, A2 y A3. El factor A2, llamado mas tarde teicoplanina A2, fue identificado como el componente principal, el cual se aislo mediante cromatografla de columna sobre Sephadex LH- 20™. Teicoplanina A2 fue luego reconocida como una mezcla de cinco moleculas (J. Antibiotics 37 (1984), p. 615620), las cuales pronto se dilucidaron como estructuras que difieren en la naturaleza de la cadena lateral acilo- alifatica (J. Am. Chem. Soc. 106 (1984), 4895-4902). Una representation de compuesto, ejemplificada y tlpica, de teicoplanina se ilustra en la Fig. 1 (R puede significar diversos residuos de alquilo de C10-C11). Estos cinco compuestos A2 constituyen la teicoplanina conjuntamente con otro compuesto principal (A3) y algunos otros compuestos secundarios (por ejemplo Rs-1 a Rs-4). La mezcla de estos componentes en una variation de proportion limitada esta disponible en el mercado como Targocid® para el tratamiento de infecciones por bacterias Gram-positivas. Ademas de la vancomicina y de los antibioticos similares a vancomicina, aun sigue siendo un compuesto activo clave contra microorganismos altamente resistentes.

Se ha hecho una cantidad de esfuerzos para separar teicoplanina de un caldo de cultivo de los microorganismos y para purificar teicoplanina para lograr un grado farmaceutico. De acuerdo con la primera publication en US 4239751, un caldo de cultivo se divide en una torta micelial y en un filtrado. Despues del tratamiento de la torta, se extrajeron ambas fracciones con butanol a un pH acido y el producto de fermentation crudo se precipito despues de retirar parcialmente el solvente. Los precipitados se recogieron, se purificaron en una columna de Sephadex LH20 y sobre una resina de intercambio ionico acida, tal como Amberlite IR-120 y Dowex 50, con aislamiento final del producto mediante precipitation a 4°C. No obstante, este proceso es un experimento de laboratorio para aislamiento, el cual tiene varias desventajas para el uso industrial en vista de su complejidad, calidad, costes y rendimientos.

A fin de mejorar los rendimientos de fermentation en tal production auto-inhibida de teicoplanina, se intento retirar continuamente el producto adicionando solventes organicos miscibles con agua, tales como acetona, n-propanol, y acetonitrilo (patente coreana no. 367890), o adicionando una resina de intercambio ionico muy acida, tal como Dow XFS-43278.00 y Diaion SK-1 02 (patente coreana no. 118034) a un caldo de cultivo. Pero tales procesos todavla necesitan grandes volumenes de solventes organicos para extraer teicoplanina provocando problemas de manejo y contamination ambiental.

La solicitud de patente estadounidense 4,845,194 reporta un proceso para purification de teicoplanina que involucra una tecnica de intercambio cationico antes del ajuste del pH. Teicoplanina es eluida a partir de la resina de intercambio cationico usando una solution que tiene un valor de pH desde aproximadamente 9 hasta aproximadamente 12.

Un progreso adicional en el aislamiento de teicoplanina fue hecho mediante el descubrimiento del enlace eficiente de teicoplanina con resinas hidrofobas, divulgadas por primera vez en la EP 0241758, usando una resina de poliamida especial y mejorando aun mas la purification mediante un proceso de extraction de teicoplanina a partir de micelio a un pH alcalino como una simplification de los procesos primarios divulgados (EP 0479086). Sin embargo, la pureza de teicoplanina no fue superior a 85 % y el descoloramiento fue insuficiente.

La introduction de resinas hidrofobas, preferiblemente aplicadas como una columna antes que en un tratamiento de suspension, represento otro progreso. La publication J. Biochem. 275 (2000), p. 6201-6206 describe el uso de una resina hidrofuga comercial Dianion HP2 MGL™ con elucion adicional usando solution de NaOH. Sin embargo, la estrategia requerla la neutralization continua de la solution de elucion a fin de impedir la epimerisacion del producto sensible en el medio alcalino. Incluso en companla de otras estrategias especiales a fin de obtener teicoplanina pura, en vista de una pureza de solo 50 a 60 % (p/p), este proceso de laboratorio es adecuado mas bien para propositos distintos del uso como ingrediente farmaceutico.

La patente coreana 321304 (KR100321304) divulga una resina de adsorcion neutra y un paso de cromatografla de afinidad con inmovilizacion en lectina, usando resinas seleccionadas del grupo que consiste en Amberlite XAD 16, Diaion HP 20, gel de sllice y carbon activado. Sin embargo, en caso que el caldo de cultivo filtrado, extraldo de una solution basica, se adsorba a una resina, tal como Diaion HP 20, se pierde una cantidad sustancial de teicoplanina en el paso de adsorcion y la pureza de teicoplanina eluida mediante un gradiente de concentration de metanol es

muy baja. Ademas, es necesario retirar metanol a fin de aplicar la solucion a una resina inmovilizada con lectina. Ademas, no es deseable aplicar la estrategia en produccion a larga escala debido al coste de las resinas inmovilizadas con lectina.

De acuerdo con la patente coreana 2003/017067 (KR20030017067), teicoplanina de un caldo de cultivo es 5 adsorbida a una resina porosa de adsorcion, la resina porosa de adsorcion se lava con acido clorhldrico diluido y la teicoplanina se desorbe de la resina de adsorcion usando una solucion mezclada de agua y acetona. La solucion de elucion que contiene teicoplanina se concentra mediante destilacion al vaclo, se trata con carbon activado y se somete a un proceso de precipitacion; de esta manera se purifica la teicoplanina. Una vez mas, el proceso es insuficiente para escalamiento debido a la adsorcion irreversible de teicoplanina a la resina, lo cual reduce el 10 rendimiento, y debido al uso de grandes cantidades de solvente. Por otra parte, es diflcil de purificar teicoplanina a 95 % en area o mas empleando solamente un proceso unico que utilice resinas porosas de adsorcion.

Como alternativa, algunos otros estudios han incluido resinas de fase inversa para separar y purificar teicoplanina del caldo de cultivo. Por ejemplo, un proceso publicado en Chromatographia 24 (1987) p. 295-301 propuso purificar teicoplanina usando una resina Lichrosorb™, pero el uso de grandes cantidades de acetonitrilo y el intercambio 15 frecuente de resina puede aumentar considerablemente los costes de produccion. Otras dos alternativas llevaron a cabo los metodos cromatograficos sobre resinas de fase inversa mediante maneras adicionales de purificacion. Por ejemplo, la solicitud de patente coreana 2003/092504 (KR20030092504) describe la extraction de productos de fermentation con acetona acuosa, seguida de cromatografla sobre gel de sllice recubierta con silano, adsorcion sobre carbon activado en el paso de aislamiento y ultrafiltracion. La US 7405267 describe un proceso para purificar 20 teicoplanina de un caldo de cultivo que incluye un paso primario de purificacion en el que se usa un absorbente sintetico, un paso secundario de purificacion en el que se usa una resina de intercambio ionico, una resina catalltica o una resina quelato, un paso terciario de purificacion en el que se usa una resina de fase inversa y un paso final de liofilizacion. Por consiguiente, el uso de la fase inversa mas costosa no puede impedir el uso de adsorbentes adicionales, de modo que no justifica los costes adicionales.

25 En resumen, todos los metodos descritos antes ofrecen solamente soluciones parciales que no resuelven la complejidad del aislamiento y de la purificacion de teicoplanina. La patente EP 1735337B1 (WO 2005/116059) ha ofrecido la solucion mas completa para aislamiento y purificacion de teicoplanina hasta ahora. Se devolvio al metodo de adsorcion sobre resinas hidrofobas, describiendo los siguientes pasos claves de purificacion y aislamiento de teicoplanina:

30 - separation de micelio de teicoplanina disuelta en un filtrado,

- adsorcion de teicoplanina purificada aproximadamente en resinas porosas de adsorcion desde un medio acuoso al 10-40% de alcoholes de C1-C4 o de acetonas de C3-C4 de pH 6.5 a 7.5, seguida por elucion con alcoholes de C1-C4 acuosos al 40 a 90 % con control cuidadoso de la concentration de sal,

- adsorcion de impurezas en carbon activado usando solucion acuosa diluida de alcohol, calculada 35 aproximadamente a partir de metanol acuoso con maximo 30 %

- desalinizacion mediante adsorcion en resinas porosas, seguida de elucion con alcoholes de C1-C4 acuosos al 40 a 90 %

- ultrafiltracion sobre membranas con tamano de poro desde 3 - 100 kDa a 0 - 4 kPa de presion usando soluciones alcoholicas acuosas diluidas de teicoplanina purificada en concentracion menor a 20 %

40 - precipitacion de teicoplanina.

Aunque este proceso puede representar la mejor option bibliografica para aislar teicoplanina, su reproduction presenta de manera sorprendente desventajas considerables:

- la desorcion desde la resinas porosas no es completa (maximo 87.6 %);

- la disminucion en los tamanos de poro en la ultrafiltracion reduce sorprendentemente el paso de teicoplanina a 45 traves de las membranas, aunque los poros son considerablemente mayores que el radio de las moleculas de

teicoplanina, mientras que el uso de poros mas grandes reducen la selectividad, de modo que se requieren varios ciclos de ultrafiltracion, lo cual incrementa la cantidad media de solvente a volumenes enormes;

- la remocion de impurezas coloreadas sigue siendo el problema principal debido a que los colores no se retiran completamente ni en el paso de adsorcion sobre la resinas ni durante la descoloracion sobre carbon y ultrafiltracion.

50 Por lo tanto, todavla existe una necesidad de un procedimiento comprensivo eficiente de aislamiento de teicoplanina con grado farmaceutico.

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La WO 2006/045627 divulga un metodo para la purificacion de un antibiotico glicopeptido, incluyendo la vancomicina, avopracin, ristocetina y teicoplanina, usando una mayor concentracion de sal y material de intercambio ionico.

La EP1612216 divulga un metodo de purificacion de un vancomicina a partir de un caldo de fermentacion de un microorganismo que contiene vancomicina, incluyendo pasar el caldo de fermentacion de un microorganismo que contiene vancomicina a traves de una resina de intercambio cationico de acido fuerte, una resina de intercambio anionico de base debil, alumina y secuencialmente una resina absorbente hidrofuga.

Resumen de la invencion

La invencion esta definida por las reivindicaciones.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: Ilustra una representacion de compuesto ejemplificado y tlpico de teicoplanina;

Figura 2: Muestra esquematicamente una reaccion de desaminacion oxidativa de la teicoplanina

Figura 3: Muestra esquematicamente una vision general de todo un proceso para la produccion de teicoplanina

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se describe ahora con mayor detalle mediante realizaciones preferidas y ejemplos, los cuales se presentan, no obstante, solamente con un proposito ilustrativo y no deben entenderse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invencion.

la presente invencion provee un proceso economico para aislar teicoplanina a partir de un cultivo de fermentacion de un microorganismo fungico adecuado que produce teicoplanina tal como, por ejemplo, Actinoplanes teichomyceticus en un grado para aplicacion farmaceutica con remocion sustancial de colores. Aplicando combinacion optima de las tecnicas de intercambio cationico y anionico junto con purificacion adicional mejorada produce un material de teicoplanina decolorada unico.

El termino "teicoplanina", tal como se usa en el contexto de la invencion, se refiere a un antibiotico de glicopeptido que consiste en una mezcla de compuestos o se refiere a los componentes individuales de dicha mezcla. Los componentes individuales de la mezcla comprenden de manera tlpica cinco componentes principales (A2-1, A2-2, A2- 3, A2-4, A2-5), un nucleo de glicopeptido A3-1 y componentes secundarios tales como RS-1, RS-2, RS-3 y RS-4. Se hace referencia expllcita a la descripcion de los antecedentes de la invencion, tal como fueron citados en la presente. La proporcion de contenido de los componentes individuales puede no ser constante y puede variar de acuerdo con la cepa utilizada, las condiciones de cultivo o el proceso de purificacion aplicado.

El cultivo de fermentacion de por ejemplo Actinoplanes teichomyceticus usado para la produccion de teicoplanina tlpicamente es un caldo coloreado de marron intenso a casi negro, el cual puede descolorarse gradualmente mediante un procedimiento tecnologico seleccionado, por adsorcion y metodos cromatograficos conocidos por el experto en la materia, a fin de obtener un producto final que esta todavla considerablemente coloreado con un tono amarillo o cercano al marron, el cual puede oscurecerse adicionalmente durante el almacenamiento. Hemos encontrado de manera sorprendente que las impurezas coloreadas pertenecen a al menos tres grupos fisicoqulmicos que no pueden retirarse mediante solamente una operacion tecnica. Las impurezas crlticas pueden categorizarse en los siguientes grupos.

Un grupo representa impurezas coloreadas con alto peso molecular las cuales pueden retirarse mediante metodos de separation adecuados para grandes moleculas, tales como adsorcion sobre resinas o filtration con gel. Estas pueden comprender residuos macromoleculares de estructura celular.

Otro grupo representa impurezas de bajo peso molecular, probablemente menores a 1000 Da, de baja polaridad, lo cual tambien origina componentes de celula no especlficos que comprenden moleculas con partes de llpido unidas mediante enlace doble.

El tercer grupo representa productos de degradation Intimamente relacionados, caracterizados en la publication J. Antibiotics 49 (1996), p. 644-650, los cuales se producen supuestamente mediante aminolisis oxidativa. El reemplazo del grupo amino por un grupo ceto causa un doble efecto: la parte afectada de la molecula se vuelve una estructura similar a la quinona conjugativa que mueve el maximo de absorcion al espectro visual y la molecula pierde caracter basico (Figura 2).

Asl, la invencion provee un proceso para la preparation de teicoplanina purificada, en donde de acuerdo con una solution tecnica el proceso comprende someter teicoplanina a etapas de purificacion combinadas que involucran

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tanto, una tecnica de intercambio cationico como una tecnica de intercambio de aniones, en donde el cation y/o la resina de intercambio anionico, a la que se une la teicoplanina, se eluye con un eluyente que tiene un pH de 5 hasta por debajo de 9, que esta regulado preferiblemente mediante, por ejemplo, una solucion de regulador organico o al menos un compuesto ionico.

Se provee un proceso para una remocion eficiente de impurezas por medio de adsorcion de componentes particulares disueltos desde el material filtrado del caldo de fermentacion de cultivo de Actinoplanes teichomyceticus, que comprende opcionalmente etapas de purificacion adicionales tales como adsorcion de teicoplanina sobre resinas adsorbentes hidrofobas comerciales o ligeramente polares de medio predominantemente acuoso y remocion adicional del producto desde la resina por medio de un eluyente menos polar, principalmente un eluyente con contenido reducido de agua.

El material filtrado del caldo de fermentacion del cultivo de Actinoplanes teichomyceticus significa aqul un caldo de cultivo filtrado sin micelio, preparado mediante procedimientos conocidos por un biotecnologo versado en la materia.

En una realizacion preferida de la invencion, se combinan las etapas de remover sustancialmente material coloreado de teicoplanina cruda, el enlazamiento a una resina de intercambio cationico y la adsorcion a una resina de intercambio anionico. En esta realizacion preferida, la teicoplanina se prepara mediante:

a) proveer teicoplanina cruda en solucion;

b) enlazar la teicoplanina a partir de la solucion a una resina de intercambio cationico y eluyendo el producto con un regulador o una solucion salina de acido debil;

c) tratar la solucion obtenida por metodos de rutina de concentracion y desalinizacion opcional, y el enlazamiento de teicoplanina a partir de la solucion a una resina de intercambio anionico y eluyendo el producto con una solucion reguladora o una solucion salina de acido debil;

d) someter la solucion obtenida a un tratamiento con metodos de rutina de aislamiento para remover las impurezas, sales y pirogenos;

e) aislar el producto final con cantidades reducidas de material coloreado.

En otra opcion de esta parte de la invencion la teicoplanina se prepara, de acuerdo con una realizacion preferida, mediante:

a') proveer teicoplanina cruda en solucion;

b') enlazar la teicoplanina a partir de la solucion a una resina de intercambio anionico y eluyendo el producto con un regulador o una solucion salina de acido debil;

c') tratar la solucion obtenida por metodos de rutina de concentracion y desalinizacion opcional, y el enlazamiento de teicoplanina a partir de la solucion a un resina de intercambio cationico y eluyendo el producto con una solucion reguladora o una solucion salina de acido debil;

d') someter la solucion obtenida a un tratamiento con metodos de rutina de aislamiento para remover las impurezas, sales y pirogenos;

e') aislar el producto final con cantidades reducidas de material coloreado.

Proveer solucion de teicoplanina cruda de Items a) y a') puede incluir al menos una de las siguientes operaciones:

a1) incubar un cultivo de fermentacion de una cepa de Actinoplanes teichomyceticus para obtener una concentracion optima de compuestos de teicoplanina de seguido por la eliminacion de todo el material no disuelto por filtracion, ultrafiltracion o centrifugacion;

a2) adsorber teicoplanina a una resina de adsorcion hidrofuga seguido de lavado de la resina y elucion del producto de la resina con una mezcla de agua y un solvente miscible con agua, preferiblemente metanol;

a3) tratar la solucion de teicoplanina con carbon;

a4) concentrar y desalinizar la solucion por ultrafiltracion en membranas con un corte de al menos 1000 Da;

a5) aislar un producto crudo solido de la solucion de cualquiera de los Items a1) a a4) por evaporacion y/o precipitacion con un antisolvente, seguido por redisolucion del producto crudo en un medio apropiado con el fin de continuar con las etapas de Items b ) o b');

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a6) tomar teicoplanina de color de cualquier fuente, incluyendo una fuente comercial, y disolviendola en un solvente apropiado con el fin de continuar con los pasos de Items b) o b').

Enlazar teicoplanina a partir de la solucion de acuerdo con los Items b) y c') puede incluir el uso de la solucion de la etapa anterior a) o b'), ajustando la solucion a condiciones adecuadas para la adsorcion por evaporacion parcial opcional, la adicion de un solvente de correccion o ajustar pH y tratar la solucion obtenida mezclandola con una resina de intercambio cationico mediante agitacion, eliminando el medio de la resina por filtracion seguido de lavado y desorcion con un medio de elucion o mediante la adicion de la solucion a una columna de una resina de intercambio cationico seguido de lavado y elucion del producto por un medio de elucion, en donde la resina de intercambio cationico se selecciona preferiblemente de resinas de intercambio cationico de acido debil macrorreticulares, seleccionadas de, pero no limitadas a, grupos de marcas comerciales de Amberlite © IRC, Amberlite® FPC, Diaion® WK, Purolite® C, mas preferiblemente de Amberlite IRC50™, Amberlite FPC 3500T™, Diaion WK 100™ (lo mas preferiblemente de Amberlite IRC50™) en una forma protonica, y en donde el eluyente comprende preferiblemente una solucion al 10-40% en agua de solvente miscible con agua, mas preferiblemente solucion metanolica, lo mas preferiblemente 20% de metanol y un regulador agregado de pH en el rango desde 5 hasta por debajo de 9, o una solucion de una sal de un acido debil, preferiblemente sal alcalina de acido alifatico inferior, mas preferiblemente de acetato de sodio en un rango de concentracion desde 0.01 hasta 0.5 mol/L, por ejemplo acetato de sodio 0.1 M.

Enlazar teicoplanina a partir de la solucion de acuerdo con los Items c) y b') puede incluir el uso de la solucion de la etapa anterior b) o a'), ajustando la solucion para adaptarse a las condiciones optimas adecuadas para la adsorcion por evaporacion parcial opcional, la adicion de una solvente de correccion o la correccion de pH y el tratamiento de la solucion obtenida mezclandola con una resina de intercambio anionico por agitacion, eliminando el medio de la resina por filtracion seguido de lavado y desorcion con un medio de elucion o mediante el vertido de la adicion de la solucion a una columna de una resina de intercambio anionico seguido de lavado y eluyendo el producto mediante un medio de elucion en donde una resina de intercambio anionico se selecciona preferiblemente de, pero no limitada a, marcas comerciales Amberlite® FPA, Dowex® Marathon, Dowex® Upcore, Diaion® WA, Purolite® A, preferiblemente Amberlite FPA51™, Amberlite FPA55™, Dowex Marathon WBA™, Purolite A830™, lo mas preferiblemente de Purolite A830™, y en donde el eluyente comprende preferiblemente solucion al 10-50% en agua de un solvente miscible con agua, mas preferiblemente solucion metanolica, lo mas preferiblemente 40% de metanol y agregado un regulador de pH en el rango de 5 hasta por debajo de 9, o una solucion de una sal de un acido debil, preferiblemente sal alcalina de acido alifatico inferior, mas preferiblemente de acetato de sodio en un rango de concentracion de 0.01-0.5 mol/L, mas preferiblemente acetato de sodio 0.1M.

Los eluyentes de las etapas b/b' y c/c' pueden ser identicos o diferentes, preferiblemente son identicos y contienen al menos un compuesto ionico, seleccionado preferiblemente de sales de acidos debiles. Durante la elucion utilizando dicho eluyente, la teicoplanina, que esta enlazada a la resina de intercambio cationico, se sustituye por una parte cationica del eluyente, seleccionado a partir de cationes de metales alcalinos, cationes de metales alcalinoterreos, amonio, amonio mono-, di-, tri- o tetra sustituido, en el que los sustituyentes son iguales o diferentes y se seleccionan de C1-C16- alquilo, C1-C4-alquilo sustituido por arilo, preferiblemente la parte de cation del compuesto se selecciona entre cationes de metales alcalinos, mas preferiblemente Na+, y teicoplanina, enlazado a la resina de intercambio anionico, se sustituye por la parte anionica del eluyente, seleccionado entre aniones de acidos debiles, en particular seleccionados de fosfato, hidrogeno fosfato, dihidrogeno fosfato, carbonato, hidrogeno carbonato, borato, alquil carboxilatos, dicarboxilatos, tricarboxilatos o tetracarboxilatos lineales o ramificados que contienen C1- C16 organico, en donde el alquilo esta opcionalmente sustituido con 1-3 grupos hidroxilo, 1-2 grupos amino, un grupo mercapto o metilmercapto o un grupo fenilo, mas preferiblemente la parte anionica del eluyente es acvetato y la solucion de una o mas sustancias ionicas, que contienen dichos cationes y aniones, presentan un pH en el rango de 5 hasta por debajo de 9 ("por debajo de 9" significa por ejemplo, un pH de 8.8), mas preferiblemente en el rango de 5.5 hasta 8.5, incluso mas preferiblemente de 6 hasta 8.5. Tal eluyente mantiene la teicoplanina en el rango de pH, en el que sea mas estable.

Se ha encontrado inesperadamente que la combinacion de ambas, una tecnica de intercambio cationico y anionico, lleva a una pureza incrementada de la teicoplanina obtenida, especialmente con respecto a las impurezas coloreadas.

Se ha encontrado ademas, sorprendentemente por los inventores que las condiciones de elucion especificas de la resina de intercambio cationico y anionico de acuerdo con la invencion es particularmente efectiva en proveer teicoplanina que se caracteriza por una cantidad reducida de impurezas coloreadas.

La aplicacion de metodos adicionales de aislamiento con el fin de eliminar las impurezas, sales y pirogenos de acuerdo con el item d) o d') puede incluir al menos uno de los siguientes metodos

d1) tratar la solucion de teicoplanina con carbon;

d2) eliminar las ultimas trazas de biomacromoleculas incluyendo pirogenos por ultrafiltracion en membranas con un punto de corte de al menos 5000 Da;

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d3) concentrar y desalinizar la solucion por ultrafiltracion en membranas con un corte de al menos 1000 Da;

d4) eliminar las sales y ultimas trazas de biomacromoleculas por un proceso de adsorcion/desorcion en resinas hidrofobas

d5) extraccion de impurezas por un solvente organico inmiscible en agua

d6) concentracion de la solucion, opcionalmente con intercambio parcial de los solventes.

El aislamiento del producto final de acuerdo con los Items e) o e') puede incluir uno de los siguientes metodos: e1) secar por aspersion la solucion; e2) liofilizacion de la solucion;

e3) la evaporacion del solvente, preferiblemente a presion reducida e4) precipitacion con un antisolvente y/o con ajuste de pH,

en donde el metodo mas preferido incluye la opcion e4), precipitacion con un antisolvente, seleccionado a partir de solventes miscibles en agua tales como C3-C4-alcoholes, C3-C4-cetonas o C2-C4 nitrilos, preferiblemente acetona en 5-15 veces mayor volumen, preferiblemente en 10 veces mayor volumen que el volumen de la solucion de teicoplanina. El producto precipitado se alsla por filtracion o centrifugacion y se seca in vacuo para producir un polvo blanco.

Despues de cualquier etapa, seleccionada de a) a d), a') a d'), a1) a a4) y d1) a d6), el pH de la solucion es opcionalmente ajustarse al valor en el que la teicoplanina es mas estable, preferiblemente de 6.5 a 7.5, mas preferiblemente de 6.7 a 7.1, preferiblemente mediante NaOH o HCl.

La aplicacion de la tecnica de intercambio de cationes o la tecnica de intercambio de aniones, en combinacion con los metodos seleccionados de a1) a a4), d1) a d6) y e4) reduce el nivel de impurezas en un polvo final al nivel farmaceuticamente aceptable y colores a un nivel, definido por transmitancia de una solucion acuosa de 40 g/l en longitud de onda de 405 nm de al menos 40%, mientras que la combinacion de tecnicas tanto de intercambio de iones reduce los colores a un nivel definido por una transmitancia de mas de 80% en las mismas condiciones de medicion. De acuerdo con la presente invencion, por la combinacion de ambos, cromatografla de intercambio cationico y anionico la pureza del producto de teicoplanina es por lo tanto ventajosamente e inesperadamente mejorado. El uso combinado de tecnicas de intercambio anionico y cationico, incluso sin un tratamiento de purificacion refinado adicional, tal como tratamiento con carbon (vease, por ejemplo, el Ejemplo 5) sorprendentemente permite obtener teicoplanina que tiene una transmitancia notablemente mayor que, por ejemplo, teicoplanina obtenida mediante el empleo de solamente ya sea tecnica de intercambio cationico o anionico en combinacion con tal tratamiento de purificacion adicional (por ejemplo, tratamiento con carbon; vease, por ejemplo, los Ejemplos 3 y 4).

Usando el proceso de la invencion, se puede proveer as! la teicoplanina que tiene una transmitancia de mas de 80% a una longitud de onda de 405 nm tras la disolucion en agua a una concentracion de 40 g/l.

Con el fin de alcanzar beneficios optimos del proceso de la invencion algunas operaciones de pre-preparacion se pueden aplicar dependiendo de la pureza de la fuente de teicoplanina. En la operacion de acuerdo con el Item a) resinas adsorbentes hidrofobas o ligeramente polares adecuadas y disponibles comercialmente, pueden seleccionarse de resinas de poliestireno o poliacrilato reticuladas, no ionicas, macroreticulares que tienen un radio de poro de 20 to 500 A, seleccionadas del grupo de las marcas comerciales, pero no limitadas a, Hypersol- Macronet®, Amberlite® XAD, Diaion® HP y Sepabeads SP, o Dowex® Optipore, preferiblemente seleccionadas de la resinas que tienen un radio de poro de 100 a 500 A seleccionadas de las marcas comeciales Amberlite® XAD16, Amberlite® XAD 1600, Amberlite® XAD 1180, Diaion® HP20, Diaion® Sepabeads SP207, Dianion® HP2MG, mas preferiblemente de Amberlite® XAD16, Amberlite® XAD 1600, Amberlite® XAD 1180. Las resinas de este tipo adsorben selectivamente moleculas con residuos lipofllicos, incluidas moleculas de peso molecular ligeramente mayor, tal como teicoplanina, desde soluciones acuosas y dejan componentes polares de bajo peso molecular, incluidos solutos ionicos y una variedad de macromoleculas. Las moleculas menos polares se adsorben desde una solucion acuosa que contiene no mas de 30 % (v/v) de solventes miscibles con agua, preferiblemente no mas de 20 % de C1-C4 alcoholes, acetonas o acetonitrilos, preferiblemente de metanol.

Desde la solucion, el adsorbente se enlaza y por lo tanto retira al menos 80 % de la teicoplanina total, preferiblemente al menos 90 %, y de la manera mas preferida al menos 95 % de la teicoplanina total. El proceso de adsorcion se realiza agitando la resina suspendida en dicha solucion de teicoplanina durante al menos 2 horas, preferiblemente durante al menos 12 horas y de la manera mas preferida al menos 24 horas a una temperatura de 040 °C, preferiblemente a temperatura ambiente. Finalmente, la resina que contiene teicoplanina se retira por

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filtracion y opcionalmente se lava con agua mediante re-suspension o enjuague. Como alternativa, el caldo filtrado que contiene teicoplanina se eluye a traves de una columna de dicho adsorbente, hasta la saturacion del adsorbente con productos de fermentacion.

Las especies adsorbidas se liberan de las resinas mediante elucion con soluciones acuosas ricas en solvente organico, que contiene preferiblemente al menos 40% (v/v) de un solvente organico miscible con agua, seleccionado de Ci-C4-alcoholes, acetona o acetonitrilo, preferiblemente de metanol. La separacion de las impurezas de la teicoplanina se puede mejorar mediante elucion continua a partir de una columna empacada con una resina cargada de teicoplanina, cuando el proceso se lleva de manera similar a un proceso cromatografico, en el que la teicoplanina se eluye preferiblemente en diferentes fracciones. La separacion de teicoplanina se puede mejorar mediante columnas mas largas pero debe haber un compromiso entre la eficiencia de la separacion y el volumen de solvente de elucion, lo que puede mejorar los costes y aplicabilidad tecnica. Sin embargo, una elimination completa de las sustancias relacionadas y de una variedad de impurezas coloreadas no se puede lograr solamente mediante esta etapa.

En una realization de la invention, la solution eludida de la teicoplanina el pH esta opcionalmente ajustado a 6-7 y luego concentrado a 2 - 20% (p/v), preferiblemente a 5 - 15% (p/v), lo mas preferiblemente a 10% (p/v) de contenido de teicoplanina, seguido por la adicion de un antisolvente, seleccionado de solventes miscibles con agua tales como C3-C4-alcoholes, C3-C4-cetonas o C2-C4-nitrilos, preferiblemente a partir de acetona en 5- 15 veces el volumen mas grande, preferiblemente en 10 veces el volumen mayor que el volumen de una solucion de teicoplanina. El precipitado se separa por filtracion o centrifugacion para dar el producto crudo amarillo o marron.

En una realizacion preferida adicional, la solucion eludida de teicoplanina el pH esta ajustado a 6-7, opcionalmente diluido con agua o un solvente miscible con agua y se trato adicionalmente por carbon activo. La cantidad de carbon se agrega en 5 - 300% (p/p), 'referiblemente en 50 - 100% (p/p) de una cantidad esperada de teicoplanina en la solucion, y la mezcla se trata durante 5 minutos a 12 horas, preferiblemente a 0.5 - 2 horas a 0-60°C, preferiblemente a temperatura ambiente. El carbon activo se separa entonces por filtracion y la solucion de teicoplanina se concentra a 2 - 20% (p/v), preferiblemente a 5 - 15% (p/v), lo mas preferiblemente al 10% (p/v) de contenido de teicoplanina , seguido por la adicion de un antisolvente, seleccionado de solventes miscibles con agua tales como C3-C4-alcoholes, C3-C4-cetonas o C2-C4-nitrilos, preferiblemente a partir de acetona en 5-15 veces mayor volumen, preferiblemente en 10 veces mayor volumen que el volumen de la solucion de teicoplanina. El precipitado se separa por filtracion o centrifugation para dar el producto crudo de color amarillo.

Tal proceso de adsorcion/desorcion en resinas hidrofobas elimina la mayor parte de los residuos de fermentacion, una variedad de impurezas macromoleculares y los residuos de bajo peso molecular polares, pero no las impurezas mas relacionadas y residuos no polares, en especial un poco de material de color. Aun mas, sorprendentemente el tratamiento con carbon no es tan eficiente como se esperaba en la eliminacion de colores, creando as! una necesidad de un mayor volumen de adsorbente.

En una realizacion de esta invencion, la teicoplanina cruda que es preparada por purificacion sobre resinas hidrofobas y/o sobre carbon activo o cualquier otro metodo conocido para el aislamiento de productos de fermentacion, pero que todavla contiene cantidades considerables de material de color, se purifica mediante el enlazamiento a una resina de intercambio cationico con elucion adicional con una solucion de elucion. En otra realizacion, la teicoplanina se enlaza a la resina mediante la adicion de la resina a la solucion agitada o sacudida, seguida por filtracion de la resina, lavandola y liberando el producto mediante el tratamiento con una solucion de elucion. Preferiblemente, el tratamiento de resina de intercambio cationico se lleva a cabo en una columna tal como se aplica en una cromatografla. La resina de intercambio cationico se selecciona preferiblemente de una resina de intercambio cationico de acido, preferiblemente resinas de intercambio cationico de acido debil, mas preferiblemente de resinas de intercambio cationico de acido debil macroreticular seleccionadas de, pero no limitadas a, grupos de marcas comerciales de Amberlite ® IRC, Amberlite ® FPC, Diaion® WK, Purolite® C, mas preferiblemente de Amberlite IRC50, Amberlite FPC 3500™, Diaion WK 100™, mas preferiblemente de Amberlite IRC50 ™ en una forma protonica.

En otra realizacion de esta invencion, la teicoplanina cruda que es preparada por purificacion sobre resinas hidrofobas y/o sobre carbon activo o cualquier otro metodo conocido para el aislamiento de productos de fermentacion, pero que todavla contiene cantidades considerables de material de color, se purifica mediante el enlazamiento a una resina de intercambio cationico con elucion adicional con una solucion de elucion. En una realizacion de la invencion, la teicoplanina se enlaza a la resina mediante la adicion de la resina a la solucion agitada o sacudida, seguida por filtracion de la resina, lavandola y liberando el producto mediante el tratamiento con una solucion de elucion. Preferiblemente, el tratamiento de resina de intercambio cationico se lleva a cabo en una columna tal como se aplica en cromatografla. La resina de intercambio cationico se selecciona preferiblemente de una resina de intercambio anionico basico, preferiblemente resinas de intercambio anionico de base debil, mas preferiblemente de resinas de intercambio anionico de base debil macrorreticular seleccionadas de, pero no limitadas a, marcas comerciales de Amberlite® FPA, Dowex® Marathon, Dowex® Upcore, Diaion® WA, Purolite® A, preferinlemente Amberlite FPA51™, Amberlite FPA55™, Dowex Marathon WBA™, Purolite A830™, lo mas preferiblemente de Purolite A830™.

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10

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30

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50

55

El eluyente comprende preferiblemente 10-50%, en el caso de la tecnica de intercambio cationico 10-40%, de un solvente en agua miscible con agua, preferiblemente solucion metanolica, lo mas preferiblemente 20% de metanol.

En una realizacion preferida, el eluyente comprende un regulador de pH, lo que provee un valor de pH en el rango desde 5 hasta por debajo de 9, mas preferiblemente en el rango de 5.5 a 8.5, incluso mas preferiblemente de 6 a 8.5. En particular, el eluyente puede comprender ademas un regulador organico tal como, por ejemplo, Tris/HCl, Bicina, Tricina o HEPES, o similares, asegurando as! un valor de pH adecuado del eluyente. En una realizacion preferida, el eluyente comprende un compuesto ionico, en donde el compuesto ionico es un cation seleccionado de cationes de metales alcalinos; cationes de metales alcalinoterreos; amonio; amonio mono-, di-, tri- o tetra-sustituido, en el que los sustituyentes son identicos o diferentes y se seleccionan de C1-C16- alquilo, arilo, C1-C4 alquilo sustituido. En una realizacion particular, el cation es un cation de metal alcalino.

El compuesto ionico puede ser, ademas, un anion de un acido debil seleccionado del grupo que consiste de fosfato; hidrogeno fosfato; dihidrogeno fosfato; carbonato; hidrogeno carbonato; borato; alquil carboxilatos, dicarboxilatos, tricarboxilatos o tetracarboxilatos lineales o ramificados que contienen C1-C16 organico, en donde alquilo esta opcionalmente sustituido con 1-3 grupos hidroxi, 1-2 grupos amino, un grupo mercapto o metilmercapto o un grupo fenilo. En una realizacion preferida, el anion es acetato.

Asl, en una realizacion particular de la invencion, una solucion de una sal de un acido debil se utiliza con el fin de estabilizar el valor de pH como se ha mencionado anteriormente, preferiblemente una sal alcalina de un acido alifatico inferior, mas preferiblemente de acetato de sodio en un rango de concentracion desde 0.01 hasta 0.5 mol / L, por ejemplo de acetato de sodio 0.1M.

El regulador o solucion adicionado es relevante para facilitar la elucion y la proteccion continua de moleculas sensibles de teicoplanina de los valores potenciales de pH extremos causados por elucion de protones de sitios activos desocupados de intercambio ionico en una tecnica de intercambio cationico. Por otro lado, en el caso de una tecnica de intercambio anionico, se provee asl que la teicoplanina sensible al pH este protegido de sobrealcalinizacion de la solucion eludida, lo que causarla considerable epimerizacion de la molecula. Por lo tanto, el regulador o solucion adicionados contribuye significativamente a la obtencion de una combinacion unica de los rendimientos mejorados de teicoplanina y las impurezas sustancialmente reducidas, en particular, impurezas coloreadas.

Las fracciones incoloras o ligeramente amarillentas, que contienen teicoplanina, se combinan, tratadas opcionalmente para eliminar las ultimas trazas de macromoleculas y pirogenos y, finalmente, desalinizadas por metodos conocidos para una persona experta, tales como proceso de adsorcion/desorcion en resinas de adsorcion (por ejemplo como se ha descrito anteriormente con respecto a la operacion de pre-preparacion a2)), la filtracion a traves de membranas, o ultrafiltracion. La solucion obtenida se puede concentrar a 2 - 20% (p/v), preferiblemente de 5 - 15% (p/v), lo mas preferiblemente al 10% (p/v) de contenido de teicoplanina, opcionalmente ajustando la relacion de solvente para tener 0-20% (v/v) de un solvente acuoso organico miscible en agua, preferiblemente metanol, seguido de adicion de un antisolvente, seleccionados de solventes miscibles con agua tales como C3-C4-alcoholes, C3-C4-cetonas o C2 nitrilos-C4, preferiblemente de acetona en 5-15 veces volumen mayor, preferiblemente en 10 veces volumen mayor que el volumen de la solucion de teicoplanina. Un precipitado formado puede separarse, por ejemplo, por filtracion o centrifugacion, para producir polvo casi blanco o ligeramente amarillento.

En una realizacion preferida, la solucion de teicoplanina cruda se preparo previamente mediante la disolucion de cualquier teicoplanina cruda solida, incluyendo el material insuficientemente puro a partir de una fuente comercial, en una mezcla de un solvente en agua miscible con agua, preferiblemente en una solucion metanolica, mas preferiblemente en 20% (v/v) de metanol, seguido de dicho tratamiento por adsorcion sobre una resina de intercambio cationico. En otra realizacion una solucion de teicoplanina se puede transferir directamente a partir de una etapa de proceso anterior, obtenida despues de separar por filtracion micelio y otro material insoluble a partir de un caldo de fermentacion y/o despues del tratamiento por adsorcion sobre resina hidrofoba como se describe anteriormente y/o despues del tratamiento por adsorcion sobre carbon activo. La solucion a partir de dichas etapas pueden ser opcionalmente concentrado y ajustado para obtener 10-40% (v/v) de solucion en agua de un solvente miscible con agua, preferiblemente para obtener 10-40% (v/v) de solucion metanolica, lo mas preferiblemente 20% (v/v) de metanol, seguido de dicho tratamiento por adsorcion sobre una resina de intercambio cationico.

Dicho tratamiento elimina sustancialmente impurezas coloreadas con una debil o ninguna afinidad a una resina de intercambio cationico y/o tiene al menos esencialmente diferente afinidad en comparacion con teicoplanina. Tal tratamiento elimina preferiblemente impurezas no basicas, preferiblemente impurezas coloreadas oxidadas, que estan estrechamente relacionados con la teicoplanina, pero que no contiene el grupo amino basico, importante para un fuerte enlazamiento a la resina de intercambio cationico.

Impurezas coloreadas que tienen debil o ninguna afinidad a una resina de intercambio anionico se pueden separar de la teicoplanina de una manera analoga a la anterior mediante el uso (adicional) de una tecnica de intercambio anionico.

Una realizacion particularmente preferida de un proceso global de la invencion se muestra esquematicamente en la Figura 3. Las llneas sombreadas en la misma representan operaciones opcionales.

La preparacion de una composicion farmaceutica que contiene teicoplanina de alta pureza y excipientes farmaceuticamente aceptables es un aspecto adicional de la presente invencion. Una composicion farmaceutica de 5 acuerdo con la invencion es adecuada para administracion parenteral y la dosis terapeutica de teicoplanina de acuerdo con la invencion en cualquier caso dado dependera de la naturaleza y severidad de la enfermedad que va a tratarse. La dosis y la frecuencia de dosis tambien pueden variar de acuerdo con la edad, el peso corporal y la respuesta del paciente individual. En general, una dosis adecuada del ingrediente activo se encuentra dentro del rango de 50 mg a 800 mg diario, preferiblemente 100 mg a 400 mg, preferiblemente entre 100 y 800 mg de 10 dosificacion diaria total. Las formas de dosificacion incluyen dispersiones, soluciones, suspensiones, emulsiones, polvos, implantes, en cuyo caso las formas de dosificacion mas preferidas de teicoplanina son inyecciones de polvo seco e infusiones. En la modalidad mas preferida, la teicoplanina novedosa descrita en la presente se disuelve en agua esteril y no pirogenica conjuntamente con estabilizantes, reguladores de pH y aditivos y la mezcla se liofiliza para producir un polvo amorfo que se reconstituye en llquido preparado precisamente antes de usar. La inyeccion 15 reconstituida puede administrarse por via intravenosa o intramuscular. La inyeccion intravenosa puede administrarse, por ejemplo, como un bolo o como una infusion de 30 minutos. La dosificacion es habitualmente una vez al dla pero, en casos de infeccion severa, debe administrarse una segunda inyeccion el primer dla a fin de lograr las concentraciones requeridas en suero de manera mas rapida.

Ejemplos

20 Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invencion. Estos se proveen para propositos ilustrativos solamente y no tienen la intencion de limitar la invencion de ninguna manera.

Las cantidades de componentes de teicoplanina en diversas soluciones intermedias o en intermediarios solidos aislados y productos finales de los ejemplos experimentales representativos se miden mediante metodos de HPLC en un instrumento Agilent 1100™. La fase movil A contiene un regulador de pH de fosfato de 5 mM de pH 4.9 y la 25 fase movil B contiene acetonitrilo. Se detectaron picos cromatograficos a 280 nm, la temperatura de la columna fue de 45°C y se inyectaron 5 pl de muestra. La separation se llevo a cabo sobre la columna Ascentis Express C18™, 10 cm x 4.6 mm, 2.7 pm equipada con una precolumna C18, 2 cm x 4.0 mm, 3 pm. Caudal de 2.2 ml/min y el gradiente durante la cromatografla fue tal como sigue:

Tiempo (min)

Fase movil B

0.0

15 %

0.8

20 %

0.9

24 %

3.3

25 %

4.8

29 %

8.4

41 %

8.7

60 %

9.2

60 %

9.5

15 %

11.0

15 %

30 Los valores se expresan como porcentaje en area de la suma de todos los componentes de teicoplanina o de los componentes particulares mismos y tienen principalmente un significado relativo o comparativo.

La transmitancia se mide sobre un espectrometro Perkin Elmer Lamda 25 UV-VIS a 405 nm y a una concentration de muestras de teicoplanina de 40 g/l en agua.

EJEMPLO 1

35 Aislamiento de caldo de fermentation crudo

El caldo entero recien hecho, recogido inmediatamente despues del final de la fermentacion de Actinoplanes teichomyceticus fue usado para los experimentos. Un sobrenadante de caldo (caldo clarificado) fue producido centrifugando el caldo en una centrlfuga de laboratorio (Megafuge 1.0R™, Heraeus) a 4000-6000 rpm durante 10-30

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

minutos. El sobrenadante se filtro adicionalmente a traves de un embudo de filtro de vidrio sinterizado (porosidad 4 y 5, Schott Duran GmbH) y se analizo mas tarde mediante el metodo de HPLC. El filtrado claro (permeado) se produjo por medio de una filtracion de flujo cruzado. Se uso un modulo de filtracion de ceramica (Membralox 1P19-60™) con tamano de poro de 0.1 pm. Se recogio la solucion permeada y se analizo mediante el metodo de HPLC.

EJEMPLO 2

Preparacion de teicoplanina cruda

70 L de caldo de cultivo de Actinoplanes teichomyceticus se diluyeron con 70 L de agua desmineralizada y se filtraron usando el filtro de vaclo para eliminar el micelio obteniendo 140 L de filtrado. El caldo se analizo mediante una columna de HPLC RP-C18 (4.6x250 mm). Con respecto a esto, el contenido y la cantidad total de teicoplanina en el caldo fueron de 2-3 g/L. Se agregaron 35 L de metanol a 140 L de filtrado, y la mezcla resultante se aplico sobre una columna empacada con 11 L de Amberlite XAD 16 a una rata de flujo de 0.3 BV (volumen de lecho)/hora. Subsecuentemente, 8 BV (90 L) de agua desmineralizada se cargaron a una rata de flujo de 2 BV/hora en la columna para lavar la resina empacada en la columna.

Posteriormente 9 BV (100 L) de 30% (v/v) de metanol se cargaron a una rata de flujo de 0.5 BV/hora en la columna para lavar la resina empacada en la columna. Ademas 4.5 BV (50 L) de 85% (v/v) de metanol se cargo en la columna a una rata de flujo maximo de 0.5 BV/hora para eluir teicoplanina. Con respecto a esto, el contenido de la cantidad total de teicoplanina en la solucion de elucion fue 2.2 g/L.

Ademas se agregaron 70 g de Norit CA1 como un carbon activado a 35 L de la solucion de teicoplanina anterior y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego se filtro para eliminar el carbon activado de la mezcla resultante. El pH del filtrado resultante, con el contenido de teicoplanina 1.59 g/L, se ajusto a 7.0 usando NaOH. El filtrado se concentro usando una evaporation al vaclo hasta que se alcanzo 0.7 L de concentrado. Tambien, se agregaron lentamente 7 L de acetona al concentrado mientras que el concentrado se agito para precipitar teicoplanina durante 3 horas. Una portion (6.7 L) de la suspension resultante se filtro por filtro Nuch B4 para recuperar un precipitado. El precipitado se seco en un secador de vaclo a 40 °C durante 21 horas para recuperar 46.3 g de polvo de teicoplanina cruda (83% de pureza). El polvo de teicoplanina se disolvio en agua destilada para proveer una concentration de teicoplanina de 40 mg/ml. Transmitancia a 405 nm de una solucion de teicoplanina fue evaluada para la elimination de componentes coloreados. En consecuencia, el polvo de teicoplanina de la presente invention tenia una transmitancia por debajo del 17%.

EJEMPLO 3

Decoloration utilizando resina de intercambio cationico

Se agregaron 7,3 g de Norit CA1 como un carbon activado a 3,3 L de solucion de elucion de teicoplanina con 2,2 g/L de teicoplanina, preparada de acuerdo con el primer parrafo de la description en el Ejemplo 2. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego se filtro para eliminar el carbon activado de la mezcla resultante. El pH del filtrado resultante, con el contenido de 1,7 g/L de teicoplanina, se ajusto a pH 6,7 utilizando NaOH. Despues el filtrado se disolvio con 10,6 L de agua desmineralizada y la solucion asi preparada se aplico a una columna empacada con 0,54 L de Amberlite IRC50 (resina de intercambio cationico) a una rata de flujo de 0,65 BV/hora. Subsecuentemente, 3 BV (1,5 L) de 20% (v/v) de metanol se cargaron a una rata de flujo de 2 BV/hora en la columna para lavar la resina empacada en la columna. Ademas 7,6 BV (4,1 L) de 20% (v/v) de solucion de metanol que contenia 1 mol de Na-acetato se cargaron en la columna a una rata de flujo maxima de 2 BV/hora para eluir teicoplanina. El pH de la teicoplanina eludida se ajusto a 6,9 usando NaOH y la cantidad total (4,1 L) de la solucion de teicoplanina eludida solucion se desalinizo adicionalmente mediante la adsorcion del producto a 0,1 L de Amberlite XAD16 y eluyendolo con 85% (v/v) de metanol. Despues de 0,475 L de desalinizado se obtuvieron 85% (v/v) de solucion de metanol de teicoplanina (mas de 98% de area de pureza por HPLC). Con respecto a esto, el contenido y la cantidad total de teicoplanina en el eluato eran 2.6 g/L y 1,05 g, respectivamente. Ademas se agregaron 2 g de Norit CA1 como un carbon activado a 0.4 L de la solucion de teicoplanina anterior y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego se filtro para eliminar el carbon activado de la mezcla resultante. El pH del filtrado resultante, con el contenido de teicoplanina se ajusto a 7.3 usando NaOH. El filtrado se concentro usando una evaporacion al vacio hasta que se alcanzaron 10 ml de concentrado. El pH del concentrado resultante se ajusto a 6,9 usando NaOH. Despues de 120 mL de acetona se agregaron lentamente a la mezcla agitada para precipitar teicoplanina. La suspension se agito durante 3 horas adicionales y la suspension resultante se filtro a traves de un filtro de B4 Nuch para recuperar un precipitado. El precipitado se seco en un secador de vacio a 40°C durante 20 horas para recuperar 0.8 g de polvo de teicoplanina (mas del 98% de area de pureza por HPLC).

El polvo de teicoplanina se disolvio en agua destilada para proveer una concentracion de teicoplanina de 40 mg/ml. La transmitancia a 405 nm de una solucion de teicoplanina fue evaluada para la eliminacion de componentes coloreados. En consecuencia, el polvo de teicoplanina de la presente invencion tenia una transmitancia del 44%.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

EJEMPLO 4

Decoloracion utilizando resina de intercambio anionico

Se agregaron 1,3 g de Norit CA1 como un carbon activado a 0,6 L de teicoplanina eluyendo la solucion con 2,17 g / L de teicoplanina, preparada de acuerdo con el primer parrafo de la descripcion en el Ejemplo 2. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego se filtro para eliminar el carbon activado de la mezcla resultante. El pH del filtrado resultante, con el contenido de 1,7 g/L de teicoplanina, se ajusto a pH 6,7 utilizando NaOH. Despues el filtrado se disolvio con 0,7 L de agua desmineralizada y la solucion as! preparada se aplico a una columna rellena con 0,1 L de Purolite A830 (resina de intercambio anionico) a una rata de flujo de 0,25 BV/hora. Subsecuentemente, 3 BV (0,3 L) de 40% (v/v) de metanol se cargaron a una rata de flujo de 2,5 BV/hora en la columna para lavar la resina empacada en la columna. Ademas 3 BV (0,3 L) de 40% (v/v) de solucion de metanol que contenla 1 mol de Na-acetato se cargaron en la columna a una rata de flujo maxima de 2 BV/hora para eluir teicoplanina. El pH de la teicoplanina eludida se ajusto a 6,9 usando NaOH y la cantidad total (0,3 L) de solucion de teicoplanina eludida se diluyo ademas con 0,3 L de agua desmineralizada y desalinizada mediante la adsorcion del producto a 0,02 L de Amberlite XAD16 y eluyendo con 85% (v/v) de metanol. Despues de 0,116 L desalinizados se obtuvieron 85% (v/v) de solucion de metanol de teicoplanina (con mas de 90% de area de pureza por HPLC). Con respecto a esto, el contenido y la cantidad total de teicoplanina en el eluato fueron 4,31 g/L y 0,5 g, respectivamente. Adicionalmente se agrego 1 g de Norit CA1 como un carbon activado a 0,116 L de la solucion de teicoplanina anterior y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego se filtro para eliminar el carbon activado de la mezcla resultante. El pH del filtrado resultante, con el contenido de teicoplanina se ajusto a pH 7,0 utilizando NaOH. El filtrado se concentro usando una evaporacion al vaclo hasta que se alcanzaron 4 ml de concentrado. El pH del concentrado resultante se ajusto a 6,9 usando NaOH. Despues se agregaron lentamente 50 ml de acetona a la mezcla agitada para precipitar teicoplanina. La suspension se agito durante 3 horas adicionales y la suspension resultante se filtro a traves de un filtro de B4 Nuch para recuperar un precipitado. El precipitado se seco en un secador de vaclo a 40°C durante 20 horas para recuperar 0,38 g de polvo de teicoplanina (mas del 90% de area de pureza por HPLC).

El polvo de teicoplanina se disolvio en agua destilada para proveer una concentracion de teicoplanina de 40 mg/ml. La transmitancia a 405 nm de una solucion de teicoplanina fue evaluada para la eliminacion de componentes coloreados. En consecuencia, el polvo de teicoplanina de la presente invencion tenia una transmitancia del 42%.

EJEMPLO 5

Preparacion de teicoplanina pura

Se disolvieron 45 g de teicoplanina cruda en polvo de acuerdo con el Ejemplo 2 en 30 L de 20% (v/v) de metanol y la solucion as! preparada se aplico en una columna empacada con 3 L de Amberlite IRC50 (resina de intercambio cationico) a una rata de flujo de 0,65 BV/hora. Subsecuentemente, 4 BV (12 L) de 20% (v/v) de metanol se cargaron a una rata de flujo de 2 BV/hora en la columna para lavar la resina empaacada en la columna. Ademas 10 BV (30 L) de 20% (v/v) de solucion de metanol que contenla 1 mol de acetato de sodio se cargo en la columna a una rata de flujo maximo de 2 BV/hora para eluir teicoplanina. El pH de la teicoplanina eluida se ajusto a 6,7 usando NaOH y la cantidad total (30L) de la solucion de teicoplanina eluida se desalinizo adicionalmente mediante la adsorcion del producto a 0,7 L de Amberlite XAD16 y eluyendolo con 85% (v/v) de metanol. Despues de 5,4 L desalinizados se obtuvieron 85% (v/v) de solucion de metanol de teicoplanina (mas de 98% de area de pureza por HPLC) y el pH de la teicoplanina eluida se ajusto a 7,1 usando NaOH. Con respecto a esto, el contenido y la cantidad total de teicoplanina en el eluato eran 4,3 g/L y 23.22 g, respectivamente.

1 L de 85% (v/v) de solucion de metanol de teicoplanina desalinizada, preparada como se ha descrito anteriormente se diluyo con 1 L de agua desmineralizada y la solucion asi preparada se aplico en una columna empacada con 0,5 L de Purolite A830 (resina de intercambio anionico) a una rata de flujo de 0,25 BV/hoa. Subsecuentemente, 4 BV (2 L) de 40% (v/v) de metanol se cargaron en la rata de flujo de 2,5 BV/hora en la columna para lavar la resina empacada en la columna. Ademas, 4 BV (2 L) de 40% (v/v) de solucion de metanol que contenia 1 mol de acetato de sodio se cargaron en la columna a una rata de flujo maximo de 2 BV/hora para eluir teicoplanina. El pH de la teicoplanina eluida se ajusto a 6,8 usando NaOH y la cantidad total (2 L) de solucion de teicoplanina eluida se diluyo adicionalmente con 2L de agua desmineralizada y desalinizada mediante la adsorcion del producto a 0,1 L de Amberlite XAD16 y eluyendo con 85% (v/v) de metanol. Despues de 0,45 L desalinizados se obtuvieron 85% (v/v) de solucion de metanol de teicoplanina (con mas de 98% de area de pureza por HPLC). Con respecto a esto, el contenido y la cantidad total de teicoplanina en el eluato era de 4,58 g/L y 2,0 g, respectivamente. 0,15 L de solucion de teicoplanina desalinizada fue entonces concentrada utilizando una evaporacion al vacio hasta que se alcanzaron 10 ml de concentrado. El pH del concentrado se ajusto a 7,0 y se agregaron lentamente 120 mL de acetona a la mezcla agitada para precipitar teicoplanina. La suspension se agito durante 3 horas adicionales y la suspension resultante se filtro por filtro B4 Nuch para recuperar un precipitado. El precipitado se seco en un secador de vacio a 40°C durante 20 horas para recuperar 0.52 g de polvo de teicoplanina (con mas de 98% de area de pureza por HPLC).

El polvo de teicoplanina se disolvio en agua destilada para proveer una concentracion de la teicoplanina de 40 mg/ml. La transmitancia a 405 nm de una solucion de teicoplanina fue evaluada para la eliminacion de componentes coloreados. En consecuencia, el polvo de teicoplanina de la presente invencion tenia, segun se midio en la solucion de referencia indicada, una transmitancia del 81%.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un proceso para la preparacion de teicoplanina purificada, comprendiendo el proceso someter la teicoplanina a una tecnica de intercambio cationico y anionico, en donde una resina de intercambio cationico y anionico que tiene teicoplanina enlazada a la misma, es respectivamente tratada con un eluyente que tiene un valor de pH en el rango de 5 hasta por debajo de 9.
2. 2. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el eluyente tiene un valor de pH en el rango de 5.5 hasta 8.5, mas preferiblemente de 6 hasta 8.5.
3. 3. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2 que comprende las etapas, en el siguiente orden indicado, de bien sea

   a) proveer teicoplanina en solucion;

   b) enlazar teicoplanina de la solucion a una resina de intercambio cationico, seguido por elucion con dicho eluyente;

   c) enlazar teicoplanina a una resina de intercambio anionico, seguido por elucion con dicho eluyente, y

   d) obtener teicoplanina purificada; o

   a') proveer teicoplanina cruda en solucion;

   b') enlazar teicoplanina de la solucion a una resina de intercambio anionico, seguido por elucion con dicho eluyente; c') enlazar teicoplanina a una resina de intercambio cationico, seguido por elucion con dicho eluyente, y d') obtener teicoplanina purificada.
4. 4. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la teicoplanina se provee previamente por un proceso, que incluye al menos uno de las siguientes etapas, preferiblemente una combinacion de las etapas indicadas, de

   a1) incubar un cultivo de fermentacion de una cepa de Actinoplanes teichomyceticus que produce compuestos de teicoplanina, seguido por eliminacion del material no disuelto por filtracion, ultrafiltracion o centrifugacion;

   a2) adsorber teicoplanina a una resina de adsorcion hidrofoba, opcionalmente seguido por lavado de la resina, y elucion de la resina mediante una mezcla de agua y solvente miscible en agua, en donde preferiblemente el solvente miscible con agua es metanol;

   a3) tratar una muestra de teicoplanina con carbon vegetal;

   a4) concentrar y desalinizar una solucion de teicoplanina por ultrafiltracion en una membrana con un corte de al menos 1000 Da.
5. 5. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la muestra que contiene teicoplanina es tratada por al menos un metodo adicional de purificacion antes de proceder con la, respectivamente, otra tecnica de intercambio ionico, en donde preferiblemente el al menos un metodo adicional de purificacion comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste de un tratamiento de la solucion con carbon vegetal; la eliminacion de biomacromoleculas mediante ultrafiltracion utilizando una membrana con un corte de al menos 5000 Da; concentrar y desalinizar la solucion por ultrafiltracion en una membrana con un corte de al menos 1000 Da; la eliminacion de sales y biomacromoleculas por un proceso de absorcion/desorcion en un resinas de adsorcion hidrofobas; extraction de impurezas por un solvente organico inmiscible en agua; concentrar la solucion, opcionalmente con intercambio parcial de solventes.
6. 6. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la teicoplanina purificada se alsla por cualquier metodo seleccionado de secado por aspersion; liofilizacion; evaporation del solvente, preferiblemente a presion reducida; o precipitation usando un antisolvente y/o con ajuste de pH.
7. 7. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde,

   en la tecnica de intercambio cationico, dicho eluyente comprende 10-40% de un solvente en agua miscible con agua, y

   en la tecnica de intercambio anionico dicho eluyente comprende 10-50% de un solvente en agua miscible con agua.
8. 8. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde, la tecnica de intercambio cationico y/o anionico, dicho eluyente comprende un regulador organico o una solucion de una sal de un acido debil.
9. 9. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde, en la tecnica de 5 intercambio cationico y/o anionico, dicho eluyente comprende al menos un compuesto ionico, preferiblemente el

   compuesto ionico es un cation seleccionado de cationes de metales alcalinos; cationes de metales alcalinoterreos; amonio; amonio mono-, di-, tri- o tetra-sustituidos, en el que los sustituyentes son identicos o diferentes y se seleccionan de C1-C16- alquilo, arilo, Ci-C4-alquilo sustituido, y/o el compuesto ionico es un anion de un acido debil seleccionado del grupo que consiste de fosfato; hidrogeno fosfato; dihidrogeno fosfato; carbonato; hidrogeno 10 carbonato; borato; alquil carboxilatos, dicarboxilatos, tricarboxilatos o tetracarboxilatos lineales o ramificados que contienen C1-C@ organico, en donde alquilo es opcionalmente sustituido con 1-3 grupos hidroxi, 1-2 grupos amino, un grupo mercapto o metilmercapto o un grupo fenilo.
10. 10. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en donde, en la tecnica de intercambio cationico y/o anionico, el eluyente comprende una solucion de una sal alcalina de un acido alifatico inferior.

    15 11. Teicoplanina caracteriza por tener una transmitancia de mas de 80%, en longitud de onda de 405 nm tras la

    disolucion en agua a una concentracion de 40 g/l, obtenida por un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
11. 12. Una composicion farmaceutica que comprende la teicoplanina de la reivindicacion 11.
12. 13. Un proceso para la fabricacion de una composicion farmaceutica que comprende proveer teicoplanina como se 20 define en la reivindicacion 11 y mezclar la teicoplanina provista con al menos un excipiente o vehlculo

    farmaceuticamente aceptable.