KR102040344B1 - 테이코플라닌의 정제 방법 - Google Patents

테이코플라닌의 정제 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102040344B1
KR102040344B1 KR1020147015311A KR20147015311A KR102040344B1 KR 102040344 B1 KR102040344 B1 KR 102040344B1 KR 1020147015311 A KR1020147015311 A KR 1020147015311A KR 20147015311 A KR20147015311 A KR 20147015311A KR 102040344 B1 KR102040344 B1 KR 102040344B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
teicoplanin
solution
cation
resin
eluent
Prior art date
Application number
KR1020147015311A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140091738A (ko
Inventor
사모 안드렌세크
로크 그라헤크
토마즈 마르코
Original Assignee
레크 파마슈티칼스 디.디.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 레크 파마슈티칼스 디.디. filed Critical 레크 파마슈티칼스 디.디.
Publication of KR20140091738A publication Critical patent/KR20140091738A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102040344B1 publication Critical patent/KR102040344B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/006—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure
    • C07K9/008—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure directly attached to a hetero atom of the saccharide radical, e.g. actaplanin, avoparcin, ristomycin, vancomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/14—Peptides containing saccharide radicals; Derivatives thereof, e.g. bleomycin, phleomycin, muramylpeptides or vancomycin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은, 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스의 발효 배양물로부터 테이코플라닌을, 상당한 색 제거와 함께 제약학적 용도를 위한 등급으로 단리시키는 저비용의 방법을 제공한다. 양이온 및 음이온 교환 기술과 함께 추가의 개선된 정제의 최적 조합 적용은 독특한 탈색 테이코플라닌 물질을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 글리코펩티드 항생제를 5 내지 9 미만의 pH에서 이온 교환 칼럼으로부터 용리시킨다.

Description

테이코플라닌의 정제 방법 {PROCESS OF PURIFICATION OF TEICOPLANIN}
본 발명은 화학 기술 분야, 보다 구체적으로는 항생제 테이코플라닌의 신규하고 효과적인 정제 방식에 관한 것이다.
테이코플라닌은, 예를 들어 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스(Actinoplanes teichomyceticus)와 같은 진균 미생물에 의해 생성된, 반코마이신-리스토세틴 패밀리로부터의 글리코펩티드 항생제의 군에 대해 통상적으로 사용되는 용어이다. 테이코플라닌은, 테이코마이신 A1, A2 및 A3이라 불리는 3개의 인자의 혼합물로서 문헌 [J. Antibiotics 31 (1978), p. 170-177]에 최초로 개시되었다. 인자 A2 (이후에는 테이코플라닌 A2라 불림)가 주성분으로서 확인되었고, 이는 세파덱스(Sephadex) LH-20™ 상에서의 칼럼 크로마토그래피에 의해 단리되었다. 테이코플라닌 A2는 이후에 5종의 분자의 혼합물로서 인식되었고 (문헌 [J. Antibiotics 37 (1984), p. 615-620]), 이들은 곧 아실-지방족 측쇄의 성질이 상이한 구조로서 규명되었다 (문헌 [J. Am. Chem. Soc. 106 (1984), 4895-4902]). 테이코플라닌의 전형적 예시 화합물 표시를 도 1에 나타내었다 (R은 다양한 C10-C11-알킬 잔기를 나타낼 수 있음). 이들 5종의 A2 화합물은 또 다른 주성분 (A3) 및 일부 부성분 (예를 들어 RS-1 내지 RS-4)과 함께 테이코플라닌을 구성한다. 제한된 비율 변화의 이들 성분들의 혼합물은 그람-양성 박테리아에 의한 감염 치료를 위한 타르고시드(Targocid)®로서 시판된다. 반코마이신 및 반코마이신-유사 항생제 이외에도, 이는 또한 고도 내성 미생물에 대해 중요한 활성 화합물로 남아있다.
미생물의 배양 브로쓰(broth)로부터 테이코플라닌을 분리하고 테이코플라닌을 정제하여 제약학적 등급에 도달하기 위한 많은 노력이 이루어져 왔다. US 4239751에서의 최초 공개에 따르면, 배양 브로쓰를 균사체 케이크 및 여과물로 분할한다. 케이크 처리 후, 두 분획을 산성 pH에서 부탄올로 추출하고, 용매의 부분적 제거 후에 조 발효 생성물을 침전시켰다. 침전물을 수집하고, 세파덱스 LH20 칼럼 및 산성 이온 교환 수지, 예컨대 앰벌라이트(Amberlite) IR-120 및 도웩스(Dowex) 50 상에서 정제하고, 4℃에서의 침전에 의해 생성물의 최종 단리를 수행하였다. 그러나, 이 방법은 복잡성, 품질, 비용 및 수율의 관점에서 산업적 용도에 있어서는 여러 단점을 갖는 단리의 실험실 시험이다.
이러한 테이코플라닌의 자가-억제된 제조에서 발효의 수율을 향상시키기 위해서는, 배양 브로쓰에 수-혼화성 유기 용매, 예컨대 아세톤, n-프로판올, 및 아세토니트릴을 첨가함으로써 (한국 특허 번호 367890), 또는 강한 산성 양이온 교환 수지, 예컨대 다우(Dow) XFS-43278.00 및 디아이온(Diaion) SK-1 02를 첨가함으로써 (한국 특허 번호 118034) 생성물을 연속적으로 제거하도록 시도되었다. 그러나 이러한 방법들은, 여전히 테이코플라닌을 추출하기 위해 다량의 유기 용매를 필요로 하고, 이는 취급 문제 및 환경 오염을 일으킨다.
US 특허 출원 4,845,194에는, 이전의 pH 조정이 없는 양이온 교환 기술을 포함한 테이코플라닌의 정제 방법이 보고되어 있다. 약 9 내지 약 12의 pH 값을 갖는 용액을 사용하여 양이온 교환 수지로부터 테이코플라닌을 용리시킨다.
테이코플라닌의 단리에 있어서의 추가의 진전은, 특정 폴리아미드 수지를 사용하는, 최초로 EP 0241758에 개시된, 소수성 수지에 대한 테이코플라닌의 효율적인 결합의 발견, 및 1차 개시된 방법 (EP 0479086)의 간소화로서의 알칼리 pH에서의 균사체로부터 테이코플라닌의 추출 공정에 의한 정제의 추가의 등급상승에 의해 이루어졌다. 그러나, 테이코플라닌의 순도는 85% 이하였으며, 탈색이 불충분하였다.
바람직하게는 현탁액 처리에서보다는 칼럼으로서 적용되는, 시판용 소수성 수지의 도입은 추가의 진전을 나타내었다. 공개 문헌 [J. Biochem. 275 (2000), p. 6201-6206]에는, 시판용 소수성 수지 디아니온(Dianion) HP2 MGL™의 사용과 NaOH 용액을 사용한 추가의 용리가 기재되어 있다. 그러나, 이 접근은 알칼리-감응성 생성물의 에피머화를 막기 위해 용리액의 연속적 중화를 필요로 하였다. 순수한 테이코플라닌을 얻기 위한 다른 특정 접근이 수반되는 경우에도, 단지 50 내지 60% (w/w)의 순도의 관점에서, 이러한 실험실 방법은 제약 성분으로서의 사용 이외의 목적에 더 적합하다.
한국 특허 번호 321304에는, 중성 흡착 수지, 및 앰벌라이트 XAD 16, 디아이온 HP 20, 실리카 겔, 및 활성탄으로 이루어진 군으로부터 선택된 수지를 사용한 렉틴-고정화 친화성 크로마토그래피 단계가 개시되어 있다. 그러나, 염기성 용액으로부터 추출된 여과 배양 브로쓰가 디아이온 HP 20과 같은 수지에 흡착되는 경우, 상당량의 테이코플라닌이 흡착 단계에서 손실되고, 메탄올 농도 구배에 의해 용리된 테이코플라닌의 순도가 매우 낮다. 또한, 렉틴-고정화 수지에 용액을 적용하기 위해 메탄올을 제거하는 것이 필수적이다. 또한, 렉틴-고정화 수지의 비용으로 인해 상기 전략을 대규모 제조에 적용하는 것은 바람직하지 않다.
한국 특허 출원 2003/017067에 따르면, 배양 브로쓰의 테이코플라닌을 다공성 흡착 수지에 흡착시키고, 다공성 흡착 수지를 희석된 염산으로 세척하고, 테이코플라닌을 물과 아세톤의 혼합 용액을 사용하여 흡착 수지로부터 탈착시킨다. 테이코플라닌을 함유하는 용리액을 진공 증류에 의해 농축시키고, 활성탄으로 처리하고, 침전 공정에 적용하고, 이로써 테이코플라닌을 정제한다. 또한, 상기 방법은, 수지에 대한 테이코플라닌의 비가역적 흡착이 수율을 감소시키는 것으로 인해, 또한 다량의 용매가 사용되는 것으로 인해, 규모 상승에는 불충분하다. 또한, 다공성 흡착 수지를 사용하는 단일 방법만을 사용하여서는 테이코플라닌을 95 면적% 이상으로 정제하기가 어렵다.
다르게는, 일부 다른 연구들은, 배양 브로쓰로부터 테이코플라닌을 분리하고 정제하기 위해 역상 수지를 포함하였다. 예를 들어, 문헌 [Chromatographia 24 (1987) p. 295-301]에 공개된 방법은, 리크로소르브(Lichrosorb)™ 수지를 사용한 테이코플라닌의 정제를 제안하였지만, 다량의 아세토니트릴의 사용 및 빈번한 수지의 교환은 제조 비용을 상당히 상승시킬 수 있다. 두가지 다른 대안은, 추가의 정제 방식에 의한 역상 수지 상에서의 크로마토그래피 방법을 달성하였다. 예를 들어, 한국 특허 출원 2003/092504에는, 수성 아세톤을 사용한 발효 생성물의 추출 후, 실란 코팅된 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피, 활성탄 상에서의 흡착 (단리 및 한외여과 단계에서)이 이어지는 것이 기재되어 있다. US 7405267에는, 합성 흡착제를 사용한 1차 정제 단계, 양이온-교환 수지, 촉매 수지, 또는 킬레이트 수지를 사용한 2차 정제, 역상 수지를 사용한 3차 정제 단계, 및 최종 동결건조 단계를 포함하는, 배양 브로쓰로부터 테이코플라닌의 정제 방법이 언급되어 있다. 따라서, 보다 고가의 역상을 단독으로 사용하는 것은 추가의 흡착제의 사용을 피할 수 없고, 따라서 이는 추가의 비용을 정당화하지 못한다.
요약하면, 상기에 기재된 모든 방법은 단지 부분적 해결책만을 제공하고, 이들은 테이코플라닌의 단리 및 정제의 복잡성을 해결하지 못한다. 특허 EP 1735337B1 (WO 2005/116059)은 지금까지 테이코플라닌의 단리 및 정제에 대한 가장 포괄적인 해결책을 제공하였다. 이는 하기와 같은 테이코플라닌의 정제 및 단리의 핵심적 단계를 나타내는 소수성 수지 상에서의 흡착 방법에 대한 것이었다:
- 여과물 중에 용해된 테이코플라닌으로부터의 균사체의 분리,
- pH 6.5 내지 7.5의 중성 10 내지 40% 수성 C1-C4-알콜 또는 C3-C4-케톤 매질로부터의 다공성 흡착 수지에 대한 대충 정제된 테이코플라닌의 흡착, 그 후 주의깊은 염 농도 조절 하에서의 40 내지 90% 수성 C1-C4-알콜로의 용리,
- 최대 30%로 수성 메탄올로부터 대략 계산된, 희석된 수성 알콜 용액을 사용한 활성탄에 대한 불순물의 흡착,
- 다공성 수지에 대한 흡착, 그 후 40 내지 90% 수성 C1-C4-알콜로의 용리에 의한 탈염,
- 20% 미만 농도의 정제된 테이코플라닌의 희석된 수성 알콜 용액을 사용한 0 내지 4 kPa의 압력에서의 3 내지 100 kDa의 세공 크기를 갖는 멤브레인 상에서의 한외여과,
- 테이코플라닌의 침전.
상기 방법은 테이코플라닌 단리에 대한 최선의 문헌 선택사항을 나타낼 수 있지만, 놀랍게도 그의 재현은 상당한 결점을 나타낸다:
- 다공성 수지로부터의 탈착이 완전하지 않음 (최대 87.6%);
- 세공이 테이코플라닌 분자 반경보다 상당히 더 큼에도 불구하고, 한외여과에서 세공 크기 감소는 놀랍게도 멤브레인을 통한 테이코플라닌의 통과를 감소시키며, 보다 큰 세공의 사용은 선택성을 감소시키고, 따라서, 용매 매질 양을 거대 부피로 향상시키는 수회의 한외여과 사이클이 필요함;
- 수지 상에서의 흡착 단계에서나 목탄 상에서의 탈색 및 한외여과 동안 색이 완전히 제거되지 않기 때문에, 착색 불순물의 제거가 주요 문제로 남아있음.
따라서, 제약학적 등급의 테이코플라닌의 효율적인 포괄적 단리 절차에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 하기 측면, 청구 사항 및 바람직한 실시양태를 제공하며, 이들은 각각 단독으로 또는 조합되어 본 발명의 목적을 해결하는 데 추가로 기여한다.
1. 테이코플라닌을 양이온 교환 기술 및 음이온 교환 기술 둘 다를 포함하는 조합된 정제 단계에 적용하는 것을 포함하는, 정제된 테이코플라닌의 제조 방법.
2. a) 용액 중의 테이코플라닌을 제공하는 단계;
b) 용액으로부터 테이코플라닌을 양이온 교환 수지에 결합시킨 후, 용리액으로 용리시키는 단계;
c) 테이코플라닌을 음이온 교환 수지에 결합시킨 후, 용리액으로 용리시키는 단계; 및
d) 정제된 테이코플라닌을 얻는 단계;
또는
a') 용액 중의 조 테이코플라닌을 제공하는 단계;
b') 용액으로부터 테이코플라닌을 음이온 교환 수지에 결합시킨 후, 용리액으로 용리시키는 단계;
c') 테이코플라닌을 양이온 교환 수지에 결합시킨 후, 용리액으로 용리시키는 단계; 및
d') 정제된 테이코플라닌을 얻는 단계
를 상기에 기재된 순서로 포함하는, 항목 1에 따른 방법.
3. 테이코플라닌을 양이온 및 음이온 교환 기술에 적용하는 것을 포함하며, 테이코플라닌이 결합되어 있는 양이온 및 음이온 교환 수지를 5 내지 9 미만 범위의 pH 값을 갖는 용리액으로 처리하는 것인, 정제된 테이코플라닌의 제조 방법.
4. 용리액이 5.5 내지 8.5, 바람직하게는 6 내지 8.5 범위의 pH 값을 갖는 것인, 항목 3에 따른 방법.
5. a1) 테이코플라닌 화합물을 생성하는 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스의 균주의 발효 배양물을 인큐베이션시킨 후, 미용해 물질을 여과, 한외여과 또는 원심분리에 의해 제거하는 단계;
a2) 테이코플라닌을 소수성 흡착 수지에 흡착시키고, 임의로 그 후 수지를 세척하고, 물과, 바람직하게는 메탄올인 수-혼화성 용매의 혼합물에 의해 수지로부터 용리시키는 단계;
a3) 테이코플라닌 샘플을 목탄으로 처리하는 단계;
a4) 1000 Da 이상의 컷-오프(cut-off)를 갖는 멤브레인 상에서의 한외여과에 의해 테이코플라닌의 용액을 농축시키고 탈염시키는 단계
중 적어도 하나, 바람직하게는 상기 기재된 단계들의 조합을 포함하는 방법에 의해 테이코플라닌을 미리 제공하는 것인, 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 방법.
6. 항목 a1) 내지 a4) 중 어느 하나의 각각의 단계 후에 테이코플라닌을 증발 및/또는 역용매를 사용한 침전에 의해 단리한 후, 고체 형태의 얻어진 조 테이코플라닌을 용매 중에 재용해시킴으로써 용액 중의 테이코플라닌을 제공하는 것인, 항목 5에 따른 방법.
7. 시판원을 포함한 임의의 공급원의 착색된 테이코플라닌을 출발 물질로서 사용하는 것인, 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 방법.
8. 앰벌라이트® IRC, 앰벌라이트® FPC, 디아이온® WK 및 푸롤라이트(Purolite)® C 상표명 군으로 이루어진 군으로부터 선택된 거대망상형 약산 양이온 교환 수지인 양이온 이온 교환 수지를 사용하는 것인, 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 따른 방법.
9. 양이온 이온 교환 수지가 앰벌라이트 IRC50™, 앰벌라이트 FPC 3500™ 및 디아이온 WK 100™으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항목 8에 따른 방법.
10. 양이온 이온 교환 수지가 양성자성 형태의 앰벌라이트 IRC50™인, 항목 8 또는 9에 따른 방법.
11. 앰벌라이트® FPA, 도웩스® 마라톤(Marathon), 도웩스® 업코어(Upcore), 디아이온® WA 및 푸롤라이트® A 상표명 군으로 이루어진 군으로부터 선택된 음이온 교환 수지를 사용하는 것인, 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 방법.
12. 음이온 교환 수지가 앰벌라이트 FPA51™, 앰벌라이트 FPA55™, 도웩스 마라톤 WBA™, 푸롤라이트 A830™으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항목 11에 따른 방법.
13. 음이온 교환 수지가 푸롤라이트 A830™인, 항목 11 또는 12에 따른 방법.
14. 양이온 교환 또는 음이온 교환 수행 후에, 테이코플라닌-함유 샘플을 적어도 하나의 추가의 정제 방법에 의해 처리한 다음, 각각 다른 이온 교환 기술을 계속하는 것인, 항목 1 내지 13 중 어느 하나에 따른 방법.
15. 적어도 하나의 추가의 정제 방법이, 목탄을 사용한 용액의 처리; 5000 Da 이상의 컷-오프 멤브레인을 사용한 한외여과에 의한 생체거대분자의 제거; 1000 Da 이상의 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과에 의한 용액의 농축 및 탈염; 소수성 흡착 수지 상에서의 흡착/탈착 방법에 의한 염 및 생체거대분자의 제거; 수-불혼화성 유기 용매에 의한 불순물의 추출; 임의로는 용매의 부분적 교환 하에서의, 용액의 농축으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 항목 14에 따른 방법.
16. 소수성 흡착 수지가 20 내지 500 Å의 세공 크기를 갖는 폴리스티렌 또는 폴리아크릴레이트 가교 비-이온성 거대망상형 수지인, 항목 5 내지 15 중 어느 하나에 따른 방법.
17. 소수성 흡착 수지가 100 내지 500 Å의 세공 크기를 갖는 것인, 항목 5 내지 16 중 어느 하나에 따른 방법.
18. 소수성 흡착 수지가 하이퍼졸-마크로넷(Hypersol-Macronet)®, 도웩스® 옵티포어(Optipore), 앰벌라이트® XAD16, 앰벌라이트® XAD 1600, 앰벌라이트® XAD 1180, 디아이온® HP20, 디아이온® 세파비즈(Sepabeads) SP207, 디아니온® HP2MG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항목 5 내지 17 중 어느 하나에 따른 방법.
19. 소수성 흡착 수지가 앰벌라이트® XAD16, 앰벌라이트® XAD 1600 및 앰벌라이트® XAD 1180으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항목 5 내지 18 중 어느 하나에 따른 방법.
20. 정제된 테이코플라닌을 분무 건조; 동결건조; 바람직하게는 감압 하에서의, 용매의 증발; 또는 역용매를 사용한 및/또는 pH 조정 하에서의 침전으로부터 선택된 임의의 방법에 의해 단리시키는 것인, 항목 1 내지 19 중 어느 하나에 따른 방법.
21. 역용매가 C3-C4-알콜, C3-C4-케톤 또는 C2-C4 니트릴로 이루어진 군으로부터 선택된 수-혼화성 용매인, 항목 20에 따른 방법.
22. 역용매가 아세톤인 항목 20 또는 21에 따른 방법.
23. 역용매의 부피가 테이코플라닌 용액의 부피보다 5 내지 15배 더 큰 것인, 항목 20 내지 22 중 어느 하나에 따른 방법.
24. 역용매의 부피가 테이코플라닌 용액의 부피보다 10배 더 큰 것인, 항목 20 내지 23 중 어느 하나에 따른 방법.
25. 용액의 pH를 임의로 임의의 공정 단계에서 또는 다수의 공정 단계에서 NaOH 또는 HCl에 의해 6.5 내지 7.5로 조정하는 것인, 항목 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 방법.
26. 최종 생성물로서 얻어진 테이코플라닌이 조 테이코플라닌에 비해 현저히 감소된 착색 물질 함량을 특징으로 하는 것인, 항목 1 내지 25 중 어느 하나에 따른 방법.
27. 양이온 교환 기술에서 용리액이 물 중 10 내지 40%의 수-혼화성 용매를 포함하는 것인, 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 따른 방법.
28. 음이온 교환 기술에서 용리액이 물 중 10 내지 50%의 수-혼화성 용매를 포함하는 것인, 항목 1 내지 27 중 어느 하나에 따른 방법.
29. 용리액이 메탄올 용액인, 항목 27 또는 28에 따른 방법.
30. 양이온 및/또는 음이온 교환 기술에서, 용리액이 유기 완충제를 포함하는 것인, 항목 1 내지 29 중 어느 하나에 따른 방법.
31. 유기 완충제가 트리스(Tris)/HCl, 비신(Bicine), 트리신(Tricine) 또는 헤페스(HEPES)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항목 30에 따른 방법.
32. 양이온 및/또는 음이온 교환 기술에서, 용리액이 약산의 염의 용액을 포함하는 것인, 항목 1 내지 29 중 어느 하나에 따른 방법.
33. 양이온 및/또는 음이온 교환 기술에서, 용리액이 하나 이상의 이온성 화합물을 포함하는 것인, 항목 1 내지 32 중 어느 하나에 따른 방법.
34. 이온성 화합물이, 알칼리 금속 양이온; 알칼리 토금속 양이온; 암모늄; 치환기가 동일하거나 상이하며 C1-C16-알킬, 아릴, 치환된 C1-C4-알킬로부터 선택된 것인 일-, 이-, 삼- 또는 사치환된 암모늄으로부터 선택된 양이온인, 항목 33에 따른 방법.
35. 용리액 중에 포함된 이온성 화합물이 알칼리 금속 양이온인, 항목 33 또는 34에 따른 방법.
36. 이온성 화합물이, 포스페이트; 히드로겐 포스페이트; 디히드로겐 포스페이트; 카르보네이트; 히드로겐 카르보네이트; 보레이트; 유기 C1-C16-함유 선형 또는 분지형 알킬 카르복실레이트, 디카르복실레이트, 트리카르복실레이트 또는 테트라카르복실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 약산의 음이온이고, 여기서 알킬은 1 내지 3개의 히드록시 기, 1 내지 2개의 아미노 기, 메르캅토 또는 메틸메르캅토 기 또는 페닐 기로 임의로 치환된 것인, 항목 33에 따른 방법.
37. 음이온이 아세테이트인, 항목 36에 따른 방법.
38. 양이온 및/또는 음이온 교환 기술에서, 용리액이 저급 지방족 산의 알칼리 염의 용액을 포함하는 것인, 항목 32 또는 33에 따른 방법.
39. 양이온 및/또는 음이온 교환 기술에서, 용리액이 0.01 내지 0.5 mol/L의 농도 범위로 아세트산나트륨의 용액을 포함하는 것인, 항목 32 또는 33에 따른 방법.
40. 양이온 및/또는 음이온 교환 기술에서, 용리액이 아세트산나트륨의 0.1 M 용액을 포함하는 것인, 항목 32 또는 33에 따른 방법.
41. 40 g/l의 농도로 물 중에 용해시 파장 405 nm에서 80% 초과의 투과도를 갖는 것을 특징으로 하는 테이코플라닌.
42. 항목 1 내지 40 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 얻어진, 항목 41에 따른 테이코플라닌.
43. 항목 41 또는 42의 테이코플라닌을 포함하는 제약 조성물.
44. 항목 41 또는 42에 정의된 바와 같은 테이코플라닌을 제공하고, 제공된 테이코플라닌을 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 담체와 혼합하는 것을 포함하는, 제약 조성물의 제조 방법.
45. 항목 1 내지 40 중 어느 하나에 따른 방법, 및 단리된 정제된 테이코플라닌을 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 담체와 혼합하는 것을 포함하는, 제약 조성물의 제조 방법.
도 1: 테이코플라닌의 전형적 예시 화합물 표시를 나타냄.
도 2: 테이코플라닌의 산화적 탈아미노화 반응을 개략적으로 나타냄.
도 3: 테이코플라닌의 전체적 제조 방법의 개요를 개략적으로 나타냄.
발명의 상세한 설명
이제, 본 발명을 바람직한 실시양태 및 실시예에 의해 보다 상세히 설명하지만, 이는 단지 예시적 목적으로 제공된 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되지 않는다.
본 발명은, 예를 들어 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스와 같은 테이코플라닌을 생성하는 적합한 진균 미생물의 발효 배양물로부터 테이코플라닌을, 상당한 색 제거와 함께 제약학적 용도를 위한 등급으로 단리시키는 저비용의 방법을 제공한다. 양이온 및 음이온 교환 기술과 함께 추가의 개선된 정제의 최적 조합 적용은 독특한 탈색 테이코플라닌 물질을 제공한다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 바와 같은 용어 "테이코플라닌"은, 화합물의 혼합물로 이루어진 글리코펩티드 항생제 또는 상기 혼합물의 단일 성분들에 관한 것이다. 혼합물의 단일 성분들은 전형적으로 5종의 주성분 (A2-1, A2-2, A2-3, A2-4, A2-5), 코어 글리코펩티드 A3-1 및 부성분, 예컨대 RS-1, RS-2, RS-3 및 RS-4를 포함한다. 본원에서 언급되는 본 발명의 배경기술의 기재를 명시적으로 참조한다. 단일 성분들의 함량비는 일정하지 않을 수 있으며, 사용되는 균주, 배양 조건 또는 적용되는 정제 방법에 따라 달라질 수 있다.
예를 들어 테이코플라닌의 생성에 사용되는 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스의 발효 배양물은 전형적으로 강력하게 갈색 내지 거의 흑색으로 착색된 브로쓰이고, 이는 당업자에게 공지된 흡착 및 크로마토그래피 방법에 의한 소정의 기술적 절차를 통해 점차 탈색되어, 여전히 황색 또는 갈색을 띠는 상당히 착색된 최종 생성물을 형성하고, 이는 저장에 의해 추가로 어두워질 수 있다. 본 발명자들은 놀랍게도, 착색 불순물은 적어도 3개의 물리화학적 그룹에 속하는 것이고, 이는 단지 하나의 기술적 작업에 의해서는 제거될 수 없다는 것을 발견하였다. 중요 불순물은 하기 그룹으로 분류될 수 있다.
하나의 그룹은 고분자량 착색 불순물을 나타내고, 이는 수지에 대한 흡착 또는 겔 여과와 같은 큰 분자에 적합한 분리 방법에 의해 제거될 수 있다. 이들은 주로 셀 구조의 거대분자 잔류물을 포함한다.
또 다른 그룹은, 또한 이중 결합된 지질 부분을 갖는 분자를 포함하는 비특이적 셀 성분에서 유래된, 보다 낮은 극성의, 아마도 1000 Da 미만의 저분자량 불순물을 나타낸다.
제3 그룹은, 아마도 산화적 아미노분해에 의해 생성된, 공개 문헌 [J. Antibiotics 49 (1996), p. 644-650]에서 특성화된, 밀접하게 관련된 분해 생성물을 나타낸다. 아미노 기가 케토 기로 대체됨으로써 이중 효과가 제공된다: 분자의 영향 부분은 공액 퀴논 유사 구조가 되어, 흡수 최대를 가시 스펙트럼으로 이동시키고, 분자는 염기 특성을 잃는다 (도 2).
따라서, 본 발명은, 하나의 기술적 해결에 따르면, 테이코플라닌을 양이온 교환 기술 및 음이온 교환 기술 둘 다를 포함하는 조합된 정제 단계에 적용하는 것을 포함하는, 정제된 테이코플라닌의 제조 방법을 제공한다. 추가의 기술적 해결에 따르면, 테이코플라닌이 결합되어 있는 양이온 및/또는 음이온 교환 수지를, 바람직하게는 예를 들어 유기 완충제 용액 또는 하나 이상의 이온성 화합물에 의해 완충화된 5 내지 9, 바람직하게는 5 내지 9 미만의 pH를 갖는 용리액으로 용리시킨다.
악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 배양물의 발효 브로쓰의 여과물로부터의 특정 용해 성분의 흡착에 의한 효율적인 불순물 제거 방법이 제공되며, 이는 임의로, 대체로 수성인 매질로부터의 시판용 소수성 또는 약간 극성의 흡착 수지 상에서의 테이코플라닌의 흡착과 같은 추가의 정제 단계 및 덜 극성인 용리액, 주로 감소된 물 함량을 갖는 용리액에 의한 수지로부터의 생성물의 추가 제거를 포함한다.
본원에서 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 배양물의 발효 브로쓰의 여과물은, 숙련된 생물공학자에게 공지된 절차에 의해 제조된 균사체를 갖지 않는 여과된 배양 브로쓰를 의미한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 조 테이코플라닌으로부터 착색 물질을 실질적으로 제거하는 단계, 양이온 교환 수지로의 결합 단계 및 음이온 교환 수지로의 흡착 단계가 조합된다. 이러한 바람직한 실시양태에서, 테이코플라닌은,
a) 용액 중의 조 테이코플라닌을 제공하고;
b) 용액으로부터 테이코플라닌을 양이온 교환 수지에 결합시키고, 생성물을 완충제 또는 약산 염 용액으로 용리하고;
c) 얻어진 용액을 통상적인 농축 및 임의의 탈염 방법에 의해 처리하고, 용액으로부터 테이코플라닌을 음이온 교환 수지에 결합시키고, 생성물을 완충제 용액 또는 약산 염 용액으로 용리하고;
d) 얻어진 용액을 통상적인 단리 방법을 이용한 처리에 적용하여 불순물, 염 및 발열원을 제거하고;
e) 감소된 양의 착색 물질을 갖는 최종 생성물을 단리함으로써, 제조된다.
본 발명의 이러한 부분의 또 다른 선택사항에서, 테이코플라닌은, 바람직한 실시양태에 따라,
a') 용액 중의 조 테이코플라닌을 제공하고;
b') 용액으로부터 테이코플라닌을 음이온 교환 수지에 결합시키고, 생성물을 완충제 또는 약산 염 용액으로 용리하고;
c') 얻어진 용액을 통상적인 농축 및 임의의 탈염 방법에 의해 처리하고, 용액으로부터 테이코플라닌을 양이온 교환 수지에 결합시키고, 생성물을 완충제 용액 또는 약산 염 용액으로 용리하고;
d') 얻어진 용액을 통상적인 단리 방법을 이용한 처리에 적용하여 불순물 ,염 및 발열원을 제거하고;
e') 감소된 양의 착색 물질을 갖는 최종 생성물을 단리함으로써, 제조된다.
항목 a) 및 a')의 조 테이코플라닌 용액의 제공은,
a1) 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스의 균주의 발효 배양물을 인큐베이션시켜 테이코플라닌 화합물의 최적 농도를 얻은 후, 여과, 한외여과 또는 원심분리에 의해 미용해 물질 모두를 제거하는 작업;
a2) 테이코플라닌을 소수성 흡착 수지에 흡착시킨 후, 수지를 세척하고, 생성물을 물과 수-혼화성 용매, 바람직하게는 메탄올의 혼합물에 의해 수지로부터 용리시키는 작업;
a3) 테이코플라닌의 용액을 목탄으로 처리하는 작업;
a4) 1000 Da 이상의 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과에 의해 용액을 농축시키고 탈염시키는 작업;
a5) 증발 및/또는 역용매를 사용한 침전에 의해 항목 a1) 내지 a4) 중 어느 하나의 용액으로부터 고체 조 생성물을 단리한 후, 조 생성물을 항목 b) 또는 b')의 단계와 연속되기 위해 적절한 매질 중에 재용해시키는 작업;
a6) 시판원을 포함한 임의의 공급원의 착색된 테이코플라닌을 취하여, 이를 항목 b) 또는 b')의 단계와 연속되기 위해 적절한 용매 중에 용해시키는 작업
중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
항목 b) 및 c')에 따른 용액으로부터 테이코플라닌의 결합은, 이전 단계 단계 a) 또는 b')로부터의 용액을 사용하고, 용액을 임의의 부분적 증발, 보정 용매의 첨가 또는 pH 조정에 의해 흡착에 적합한 상태로 조정하고, 얻어진 용액을, 이를 교반에 의해 양이온 교환 수지와 혼합하고, 여과에 의해 수지로부터 매질을 제거한 후 세척 및 용리 매질을 사용한 탈착에 의해, 또는 양이온 교환 수지의 칼럼에 용액을 첨가한 후 생성물을 용리 매질에 의해 세척 및 용리함으로써 처리하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 양이온 교환 수지는, 바람직하게는 양성자성 형태의 앰벌라이트® IRC, 앰벌라이트® FPC, 디아이온® WK, 푸롤라이트® C 상표명 군으로부터 (이에 제한되지는 않음), 보다 바람직하게는 앰벌라이트 IRC50™, 앰벌라이트 FPC 3500™, 디아이온 WK 100™으로부터 (가장 바람직하게는 앰벌라이트 IRC50™으로부터) 선택된 거대망상형 약산 양이온 교환 수지로부터 선택되고, 용리액은 바람직하게는 물 중 수-혼화성 용매의 10 내지 40% 용액, 보다 바람직하게는 메탄올 용액, 가장 바람직하게는 20% 메탄올, 및 5 내지 9, 보다 바람직하게는 5 내지 9 미만 범위의 pH를 갖는 첨가 완충제, 또는 약산의 염, 바람직하게는 저급 지방족 산의 알칼리 염, 가장 바람직하게는 0.01 내지 0.5 mol/L 농도 범위의 아세트산나트륨, 예를 들어 0.1 M 아세트산나트륨의 용액을 포함한다.
항목 c) 및 b')에 따른 용액으로부터 테이코플라닌의 결합은, 이전 단계 b) 또는 a')로부터의 용액을 사용하고, 용액을 임의의 부분적 증발, 보정 용매의 첨가 또는 pH 보정에 의해 흡착에 적합한 최적 상태에 맞도록 조정하고, 얻어진 용액을, 이를 교반에 의해 음이온 교환 수지와 혼합하고, 여과에 의해 수지로부터 매질을 제거한 후 세척 및 용리 매질을 사용한 탈착에 의해, 또는 음이온 교환 수지의 칼럼에 용액을 투입 첨가한 후 생성물을 용리 매질에 의해 세척 및 용리함으로써 처리하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 음이온 교환 수지는, 바람직하게는 상표명 앰벌라이트® FPA, 도웩스® 마라톤, 도웩스® 업코어, 디아이온® WA, 푸롤라이트® A, 바람직하게는 앰벌라이트 FPA51™, 앰벌라이트 FPA55™, 도웩스 마라톤 WBA™, 푸롤라이트 A830™으로부터 (이에 제한되지는 않음), 가장 바람직하게는 푸롤라이트 A830™으로부터 선택되고, 용리액은 바람직하게는 물 중 수-혼화성 용매의 10 내지 50% 용액, 보다 바람직하게는 메탄올 용액, 가장 바람직하게는 40% 메탄올, 및 5 내지 9, 보다 바람직하게는 5 내지 9 미만 범위의 pH를 갖는 첨가 완충제, 또는 약산의 염, 바람직하게는 저급 지방족 산의 알칼리 염, 가장 바람직하게는 0.01 내지 0.5 mol/L 농도 범위의 아세트산나트륨, 예를 들어 0.1 M 아세트산나트륨의 용액을 포함한다.
단계 b/b' 및 c/c'의 용리액은 동일하거나 상이할 수 있고, 바람직하게는 이들은, 바람직하게는 약산의 염으로부터 선택된 하나 이상의 이온성 화합물을 함유한다. 상기 용리액을 사용한 용리 동안, 양이온 교환 수지에 결합된 테이코플라닌은, 알칼리 금속 양이온, 알칼리 토금속 양이온, 치환기가 동일하거나 상이하며 C1-C16-알킬, 아릴, 치환된 C1-C4-알킬로부터 선택된 것인 일-, 이-, 삼- 또는 사치환된 암모늄으로부터 선택된, 용리액의 양이온 부분으로 대체되고 (바람직하게는 화합물의 양이온 부분은 알칼리 금속 양이온, 가장 바람직하게는 Na+로부터 선택됨), 음이온 교환 수지에 결합된 테이코플라닌은, 약산의 음이온으로부터 선택된, 특히 포스페이트, 히드로겐 포스페이트, 디히드로겐 포스페이트, 카르보네이트, 히드로겐 카르보네이트, 보레이트, 유기 C1-C16-함유 선형 또는 분지형 알킬 카르복실레이트, 디카르복실레이트, 트리카르복실레이트 또는 테트라카르복실레이트로부터 선택된 (여기서 알킬은 임의로 1 내지 3개의 히드록실 기, 1 내지 2개의 아미노 기, 메르캅토 또는 메틸메르캅토 기 또는 페닐 기로 치환됨), 용리액의 음이온 부분으로 대체된다 (가장 바람직하게는 용리액의 음이온 부분은 아세테이트이고, 상기 양이온 및 음이온을 함유하는 하나 이상의 이온성 성분의 용액은 5 내지 9, 바람직하게는 5 내지 9 미만 ("9 미만"은 예를 들어 8.8의 pH를 의미함) 범위의, 보다 바람직하게는 5.5 내지 8.5, 훨씬 더 바람직하게는 6 내지 8.5 범위의 pH를 나타낸다. 이러한 용리액은 테이코플라닌을, 이것이 가장 안정한 pH 범위에서 유지한다.
양이온 및 음이온 교환 기술 둘 다의 조합은, 예상외로, 특히 착색 불순물에 대하여, 얻어진 테이코플라닌의 증가된 순도를 제공하는 것으로 나타났다.
또한 놀랍게도, 본 발명자들은, 양이온 또는 음이온 교환 기술을, 본 발명에 따른 양이온 또는 음이온 교환 수지로부터의 특정 용리 조건과 조합하여 이용하는 것이, 감소된 양의 착색 불순물을 특징으로 하는 테이코플라닌을 제공하는 데 있어 특히 효과적이라는 것을 발견하였다.
항목 d) 또는 d')에 따른 불순물, 염 및 발열원을 제거하기 위한 추가의 단리 방법의 적용은,
d1) 테이코플라닌의 용액을 목탄으로 처리하는 방법;
d2) 5000 Da 이상의 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과에 의해 발열원을 포함하는 최후 미량의 생체거대분자를 제거하는 방법;
d3) 1000 Da 이상의 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과에 의해 용액을 농축 및 탈염시키는 방법;
d4) 소수성 수지 상에서의 흡착/탈착 방법에 의해 염 및 최후 미량의 생체거대분자를 제거하는 방법;
d5) 수-불혼화성 유기 용매에 의해 불순물을 추출하는 방법;
d6) 임의로는 용매의 부분적 교환 하에, 용액을 농축시키는 방법
중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
항목 e) 또는 e')에 따른 최종 생성물의 단리는,
e1) 용액의 분무 건조 방법;
e2) 용액의 동결건조 방법;
e3) 바람직하게는 감압 하에서의, 용매의 증발 방법;
e4) 역용매의 사용에 의한 및/또는 pH 조정 하에서의 침전 방법
중 하나를 포함할 수 있고, 여기서 가장 바람직한 방법은, C3-C4-알콜, C3-C4-케톤 또는 C2-C4 니트릴 등의 수-혼화성 용매로부터 선택된 역용매, 바람직하게는 아세톤을, 테이코플라닌 용액의 부피보다 5 내지 15배 더 큰 부피, 바람직하게는 10배 더 큰 부피로 사용하는 선택사항 e4)의 침전을 포함한다. 침전된 생성물을 여과 또는 원심분리에 의해 단리시키고, 진공에서 건조시켜, 백색 분말을 얻는다.
a) 내지 d), a') 내지 d'), a1) 내지 a4) 및 d1) 내지 d6)으로부터 선택된 임의의 단계 후, 임의로 용액의 pH를, 바람직하게는 NaOH 또는 HCl에 의해, 테이코플라닌이 가장 안정한 값, 바람직하게는 6.5 내지 7.5, 가장 바람직하게는 6.7 내지 7.1로 조정한다.
a1) 내지 a4), d1) 내지 d6) 및 e4)로부터 선택된 방법과 조합된, 양이온 교환 기술 또는 음이온 교환 기술의 적용은, 최종 분말 중 불순물의 수준을 제약상 허용되는 수준으로, 또한 색을, 파장 405 nm에서 40 g/l의 수용액의 40% 이상의 투과도로 정의되는 수준으로 감소시키며, 두 이온 교환 기술의 조합은 색을 동일한 측정 조건에서 80% 초과의 투과도로 정의되는 수준으로 감소시킨다. 본 발명에 따라, 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피 둘 다의 조합에 의해, 테이코플라닌 생성물의 순도가 유리하게, 또한 예상외로 향상된다. 음이온 및 양이온 교환 기술의 조합 이용은, 목탄 처리와 같은 추가의 정련된 정제 처리 없이도 (예를 들어, 실시예 5 참조), 예를 들어, 양이온 또는 음이온 교환 기술 중 단지 한쪽을 이러한 추가의 정제 처리 (예를 들어 목탄 처리; 예를 들어 실시예 3 및 4 참조)와 조합하여 이용함으로써 얻어진 테이코플라닌에 비해, 놀랍게도 현저히 더 높은 투과도를 갖는 테이코플라닌을 얻을 수 있게 한다.
본 발명의 방법을 이용함에 따라, 40 g/l의 농도로 물 중에 용해시 파장 405 nm에서 80% 초과의 투과도를 갖는 테이코플라닌이 제공될 수 있다.
본 발명의 방법의 최적 이점에 도달하기 위해, 테이코플라닌의 공급원의 순도에 따라 일부 예비-제조 작업이 적용될 수 있다. 항목 a)에 따른 작업에서, 상업적으로 입수가능한 적합한 소수성 또는 약간 극성의 흡착 수지는, 하이퍼졸-마크로넷®, 앰벌라이트® XAD, 디아이온® HP 및 세파비즈 SP, 또는 도웩스® 옵티포어 (이에 제한되지는 않음)의 상표명 군으로부터 선택된, 20 내지 500 Å의 세공 반경을 갖는 폴리스티렌 또는 폴리아크릴레이트 가교 비-이온성 거대망상형 수지로부터 선택되고, 바람직하게는 상표명 앰벌라이트® XAD16, 앰벌라이트® XAD 1600, 앰벌라이트® XAD 1180, 디아이온® HP20, 디아이온® 세파비즈 SP207, 디아니온® HP2MG로부터 선택된, 가장 바람직하게는 앰벌라이트® XAD16, 앰벌라이트® XAD 1600, 앰벌라이트® XAD 1180으로부터 선택된 100 내지 500 Å의 세공 반경을 갖는 수지로부터 선택된다. 이러한 유형의 수지는, 수용액으로부터, 테이코플라닌과 같은 약간 큰 분자량의 분자를 포함한 친지질성 잔기를 갖는 분자를 선택적으로 흡착하고, 이온성 용질을 포함한 저분자량 극성 성분 및 각종 거대분자를 남긴다. 보다 덜 극성인 분자가 수용액으로부터 흡착되고, 이는 30% (v/v) 이하의 수-혼화성 용매, 바람직하게는 20% 이하의 C1-C4 알콜, 아세톤 또는 아세토니트릴, 바람직하게는 메탄올을 함유한다.
흡착제는, 용액으로부터, 전체 테이코플라닌의 80% 이상, 바람직하게는 전체 테이코플라닌의 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상에 결합되고, 이를 제거한다. 흡착 방법은, 상기 테이코플라닌 용액 중에 현탁된 수지를 0 내지 40℃의 온도, 바람직하게는 실온에서 2시간 이상 동안, 바람직하게는 12시간 이상 동안, 가장 바람직하게는 24시간 이상 동안 진탕시킴으로써 수행된다. 마지막으로, 테이코플라닌 함유 수지를 여과하고, 임의로 재현탁 또는 헹굼에 의해 물로 세척한다. 다르게는 테이코플라닌 함유 여과 브로쓰를 상기 흡착제의 칼럼을 통해 발효 생성물로의 흡착제의 포화시까지 용리시킨다.
흡착 종은, 바람직하게는 40% (v/v) 이상의, C1-C4-알콜, 아세톤 또는 아세토니트릴로부터 선택된 수-혼화성 유기 용매, 바람직하게는 메탄올을 함유하는 유기 용매 풍부 수용액을 사용한 용리에 의해 수지로부터 방출된다. 불순물로부터의 테이코플라닌의 분리는, 방법이 테이코플라닌이 바람직하게는 상이한 분획으로 용리되는 크로마토그래피 방법과 유사하게 진행되는 경우, 테이코플라닌 로딩 수지로 패킹된 칼럼으로부터의 연속적 용리에 의해 개선될 수 있다. 테이코플라닌의 분리는 보다 긴 칼럼에 의해 개선될 수 있지만, 분리 효율과, 비용 및 기술적 적용성을 상승시킬 수 있는 용리 용매 부피 사이에서 절충되어야 한다. 그럼에도 불구하고, 관련 물질 및 각종 착색 불순물의 완전한 제거는 단지 이러한 단계에 의해서만은 달성될 수 없다.
본 발명의 한 실시양태에서는, 테이코플라닌의 용리된 용액을 임의로 6 내지 7로 pH-조정하고, 이어서 2 내지 20% (w/v), 바람직하게는 5 내지 15% (w/v), 가장 바람직하게는 10% (w/v)의 테이코플라닌 함량으로 농축시킨 후, C3-C4-알콜, C3-C4-케톤 또는 C2-C4-니트릴 등의 수-혼화성 용매로부터, 바람직하게는 아세톤으로부터 선택된 역용매를, 테이코플라닌 용액의 부피보다 5 내지 15배 더 큰 부피, 바람직하게는 10배 더 큰 부피로 첨가한다. 침전물을 여과 또는 원심분리에 의해 분리하여, 황색 또는 갈색 조 생성물을 얻는다.
추가의 바람직한 실시양태에서는, 테이코플라닌의 용리된 용액을 6 내지 7로 pH-조정하고, 임의로 물 또는 수-혼화성 용매로 희석하고, 활성탄으로 추가로 처리한다. 목탄의 양을 용액 중 테이코플라닌의 예상량의 5 내지 300% (w/w), 바람직하게는 50 내지 100% (w/w)로 첨가하고, 혼합물을 0 내지 60℃에서, 바람직하게는 실온에서 5분 내지 12시간, 바람직하게는 0.5 내지 2시간 동안 처리한다. 이어서, 활성탄을 여과하고, 테이코플라닌의 용액을 2 내지 20% (w/v), 바람직하게는 5 내지 15% (w/v), 가장 바람직하게는 10% (w/v)의 테이코플라닌 함량으로 농축시킨 후, C3-C4-알콜, C3-C4-케톤 또는 C2-C4-니트릴 등의 수-혼화성 용매로부터, 바람직하게는 아세톤으로부터 선택된 역용매를, 테이코플라닌 용액의 부피보다 5 내지 15배 더 큰 부피, 바람직하게는 10배 더 큰 부피로 첨가한다. 침전물을 여과 또는 원심분리에 의해 분리하여, 황색 조 생성물을 얻는다.
이러한 소수성 수지 상에서의 흡착/탈착 방법은 대부분의 발효 잔류물, 각종 거대분자 불순물 및 극성 저분자량 잔류물을 제거하지만, 추가의 관련 불순물 및 비-극성 잔류물, 특히 일부 착색 물질은 제거하지 못한다. 한층 더, 놀랍게도, 목탄 처리는 색 제거에 있어 기대만큼 효율적이지 않고, 따라서 보다 큰 부피의 흡착제에 대한 필요성을 초래한다.
본 발명의 한 실시양태에서는, 소수성 수지 및/또는 활성탄 상에서의 정제 또는 임의의 다른 공지된 발효 생성물 단리 방법에 의해 제조되며, 여전히 상당량의 착색 물질을 함유하는 조 테이코플라닌을, 양이온 교환 수지에 대한 결합과 용리액을 사용한 추가의 용리에 의해 정제한다. 또 다른 실시양태에서는, 교반 또는 진탕 용액에 수지를 첨가하여 테이코플라닌을 수지에 결합시킨 후, 수지를 여과하고, 용리액을 사용한 처리에 의해 이를 세척하여 방출시킨다. 바람직하게는 양이온 교환 수지 처리는 크로마토그래피에서 적용된 것과 같은 칼럼에서 수행된다. 양이온 교환 수지는 바람직하게는 산 양이온 교환 수지, 바람직하게는 약산 양이온 교환 수지로부터, 보다 바람직하게는 양성자성 형태의 앰벌라이트® IRC, 앰벌라이트® FPC, 디아이온® WK, 푸롤라이트® C 상표명 군으로부터 (이에 제한되지는 않음), 보다 바람직하게는 앰벌라이트 IRC50™, 앰벌라이트 FPC 3500™, 디아이온 WK 100™으로부터, 가장 바람직하게는 앰벌라이트 IRC50™으로부터 선택된 거대망상형 약산 양이온 교환 수지로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 소수성 수지 및/또는 활성탄 상에서의 정제 또는 임의의 다른 공지된 발효 생성물 단리 방법에 의해 제조되며, 여전히 상당량의 착색 물질을 함유하는 조 테이코플라닌을, 음이온 교환 수지에 대한 결합과 용리액을 사용한 추가의 용리에 의해 정제한다. 본 발명의 한 실시양태에서는, 교반 또는 진탕 용액에 수지를 첨가하여 테이코플라닌을 수지에 결합시킨 후, 수지를 여과하고, 용리액을 사용한 처리에 의해 이를 세척하여 방출시킨다. 바람직하게는 음이온 교환 수지 처리는 크로마토그래피에서 적용된 것과 같은 칼럼 상에서 수행된다. 음이온 교환 수지는 바람직하게는 염기성 음이온 교환 수지, 바람직하게는 약염기성 음이온 교환 수지로부터, 보다 바람직하게는 상표명 앰벌라이트® FPA, 도웩스® 마라톤, 도웩스® 업코어, 디아이온® WA, 푸롤라이트® A (이에 제한되지는 않음), 바람직하게는 앰벌라이트 FPA51™, 앰벌라이트 FPA55™, 도웩스 마라톤 WBA™, 푸롤라이트 A830™으로부터, 가장 바람직하게는 푸롤라이트 A830™로부터 선택된 거대망상형 약염기성 음이온 교환 수지로부터 선택된다.
용리액은 바람직하게는 10 내지 50%, 양이온 교환 기술의 경우에는 10 내지 40%의 물 중 수-혼화성 용매, 바람직하게는 메탄올 용액, 가장 바람직하게는 20% 메탄올을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 용리액은 5 내지 9 범위의 pH 값, 바람직하게는 5 내지 9 미만, 보다 바람직하게는 5.5 내지 8.5, 훨씬 더 바람직하게는 6 내지 8.5 범위의 pH 값을 제공하는 pH 완충제를 포함한다. 특히, 용리액은, 예를 들어 트리스/HCl, 비신, 트리신 또는 헤페스 등과 같은 유기 완충제를 추가로 포함하여, 용리액의 적합한 pH 값을 보장할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 용리액은 이온성 화합물을 포함하며, 여기서 이온성 화합물은 알칼리 금속 양이온; 알칼리 토금속 양이온; 암모늄; 치환기가 동일하거나 상이하며 C1-C16-알킬, 아릴, 치환된 C1-C4-알킬로부터 선택된 것인 일-, 이-, 삼- 또는 사치환된 암모늄으로부터 선택된 양이온이다. 특정 실시양태에서, 양이온은 알칼리 금속 양이온이다.
이온성 화합물은 또한, 포스페이트; 히드로겐 포스페이트; 디히드로겐 포스페이트; 카르보네이트; 히드로겐 카르보네이트; 보레이트; 유기 C1-C16-함유 선형 또는 분지형 알킬 카르복실레이트, 디카르복실레이트, 트리카르복실레이트 또는 테트라카르복실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 약산의 음이온일 수 있고, 여기서 알킬은 1 내지 3개의 히드록시 기, 1 내지 2개의 아미노 기, 메르캅토 또는 메틸메르캅토 기 또는 페닐 기로 임의로 치환된다. 바람직한 실시양태에서, 음이온은 아세테이트이다.
따라서, 본 발명의 특정 실시양태에서는, 상기에 언급된 바와 같은 pH 값을 안정화시키기 위해 약산의 염, 바람직하게는 저급 지방족 산의 알칼리 염, 가장 바람직하게는 0.01 내지 0.5 mol/L 농도 범위의 아세트산나트륨, 예를 들어 0.1 M 아세트산나트륨의 용액이 사용된다.
첨가된 완충제 또는 용액은, 양이온 교환 기술에서 이온 교환의 비점유 활성 자리로부터의 양성자의 용리에 기인하는 가능한 극도의 pH 값으로부터의 테이코플라닌의 감응성 분자의 계속적 보호 및 용이한 용리를 위해 적절하다. 한편, 음이온 교환 기술의 경우에는, 분자의 상당한 에피머화를 초래하는 용리된 용액의 과도알칼리화로부터 pH-감응성 테이코플라닌이 보호되는 것을 조건으로 한다. 따라서, 첨가된 완충제 또는 용액은, 향상된 테이코플라닌의 수율 및 상당히 감소된 불순물, 특히 착색 불순물의 독특한 조합을 얻는 데 현저히 기여한다.
테이코플라닌을 함유하는 약간 황색 또는 무색 분획을 합하고, 임의로 처리하여 최후 미량의 거대분자 및 발열원을 제거하고, 마지막으로 흡착 수지 상에서의 흡착/탈착 방법 (예를 들어 예비-제조 작업 a2)에 대해 상기에 기재된 바와 같음), 멤브레인을 통한 여과, 또는 한외여과와 같은 당업자에게 공지된 방법에 의해 탈염시킨다. 얻어진 용액을 2 내지 20% (w/v), 바람직하게는 5 내지 15% (w/v), 가장 바람직하게는 10% (w/v)의 테이코플라닌 함량으로 농축시키고 (임의로 용매 비율을 0 내지 20% (v/v)의 수성, 수-혼화성 유기 용매, 바람직하게는 메탄올을 갖도록 조정함), 그 후 C3-C4-알콜, C3-C4-케톤 또는 C2-C4 니트릴 등의 수-혼화성 용매로부터, 바람직하게는 아세톤으로부터 선택된 역용매를, 테이코플라닌 용액의 부피보다 5 내지 15배 더 큰 부피, 바람직하게는 10배 더 큰 부피로 첨가한다. 형성된 침전물을, 예를 들어 여과 또는 원심분리에 의해 분리하여 거의 백색인 또는 약간 황색인 분말을 얻을 수 있다.
바람직한 실시양태에서는, 미리, 시판원으로부터의 불충분하게 순수한 물질을 포함한 임의의 고체 조 테이코플라닌을 물 중 수-혼화성 용매의 혼합물, 바람직하게는 메탄올 용액, 가장 바람직하게는 20% (v/v) 메탄올 중에 용해시켜 조 테이코플라닌의 용액을 제조한 후, 양이온 교환 수지 상에서의 흡착에 의한 상기 처리를 수행한다. 또 다른 실시양태에서는, 발효 브로쓰로부터의 균사체 및 기타 불용성 물질의 여과 후에 및/또는 상기에 기재된 바와 같은 소수성 수지 상에서의 흡착에 의한 처리 후에 및/또는 활성탄 상에서의 흡착에 의한 처리 후에 얻어진, 테이코플라닌의 용액이 이전 공정 단계로부터 직접 전달될 수 있다. 상기 단계로부터의 용액을 임의로 농축시켜 물 중 수-혼화성 용매의 10 내지 40% (v/v) 용액을 얻도록, 바람직하게는 10 내지 40% (v/v) 메탄올 용액, 가장 바람직하게는 20% (v/v) 메탄올을 얻도록 조정한 후, 양이온 교환 수지 상에서의 흡착에 의한 상기 처리를 수행할 수 있다.
이러한 처리는, 양이온 교환 수지에 대해 약한 친화성을 갖는 또는 친화성을 갖지 않는 및/또는 테이코플라닌과 비교하여 적어도 본질적으로 상이한 친화성을 갖는 착색 불순물을 실질적으로 제거한다. 이러한 처리는 바람직하게는 테이코플라닌에 밀접하게 관련된 비-염기성 불순물, 바람직하게는 산화된 착색 불순물을 제거하지만, 이들은 양이온 교환 수지에 대한 보다 강한 결합을 위해 중요한 염기성 아미노 기를 함유하지 않는다.
음이온 교환 수지에 대해 약한 친화성을 갖는 또는 친화성을 갖지 않는 착색 불순물은 음이온 교환 기술의 (추가적) 이용에 의해 상기의 것과 유사한 방식으로 테이코플라닌으로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 전체 방법의 특히 바람직한 실시양태를 도 3에 개략적으로 나타내었다. 여기서 파선은 임의의 작업을 나타낸다.
고순도의 테이코플라닌 및 제약상 허용되는 부형제를 함유하는 제약 조성물의 제조가 본 발명의 추가의 측면이다. 본 발명에 따른 제약 조성물은 비경구 투여에 적합하고, 임의의 주어진 경우에 본 발명에 따른 테이코플라닌의 치료학적 용량은 치료할 질병의 성질 및 중증도에 따라 달라진다. 용량 및 투여 빈도수는 또한, 개개의 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 활성 성분의 적합한 용량은 1일 당 50 mg 내지 800 mg, 바람직하게는 100 mg 내지 400 mg의 범위 내이고, 바람직하게는 100 내지 800 mg의 총 1일 투여량이다. 투여 형태는 분산액, 용액, 현탁액, 에멀젼, 분말, 이식물을 포함하고, 여기서 테이코플라닌의 가장 바람직한 투여 형태는 건조 분말 주사 및 주입액이다. 가장 바람직한 실시양태에서는, 본원에 기재된 신규한 테이코플라닌을, 안정화제, 완충제 및 첨가제와 함께 멸균 및 무발열원성 물 중에 용해시키고, 혼합물을 동결건조시켜 무정형 분말을 얻고, 이를 사용 직전에 준비된 액체 중에서 재구성한다. 재구성된 주사액을 정맥내 또는 근육내 투여할 수 있다. 정맥내 주사는, 예를 들어 볼루스로서 또는 30분 주입으로서 투여할 수 있다. 투여는 통상적으로 1일 1회이지만, 중증 감염의 경우, 필요한 혈청 농도에 보다 빨리 도달하기 위해 제1일에 제2 주사액을 투여하여야 한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하는 것이다. 이들은 단지 예시적 목적으로 제공된 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는다.
대표적 실험 실시예의 다양한 중간체 용액 또는 단리된 고체 중간체 및 최종 생성물 중 테이코플라닌 성분의 양을 애질런트(Agilent) 1100™ 기기 상에서의 HPLC 방법에 의해 측정하였다. 이동 상 A는 pH 4.9의 5 mM 인산염 완충제를 함유하고, 이동 상 B는 아세토니트릴을 함유하였다. 크로마토그래피 피크를 280 nm에서 검출하였고, 칼럼 온도는 45℃였고, 5 ㎕의 샘플을 주입하였다. 프리칼럼 C18, 2 cm x 4.0 mm, 3 ㎛이 장착된 칼럼 아센티스 익스프레스(Ascentis Express) C18™, 10 cm x 4.6 mm, 2.7 ㎛ 상에서 분리를 수행하였다. 유량은 2.2 ml/min이었고, 크로마토그래피 동안 구배는 하기와 같았다.
표 1
Figure 112014053077955-pct00001
값을 모든 테이코플라닌 성분의 합계 또는 특정 성분 자체의 면적 백분율로서 나타내었고, 이들은 주로 상대적 또는 비교적 의미를 갖는다.
퍼킨 엘머 람다(Perkin Elmer Lamda) 25 UV-VIS 분광계 상에서 405 nm에서, 또한 물 중의 40 g/l의 테이코플라닌 샘플 농도에서 투과도를 측정하였다.
실시예 1
조 발효 브로쓰의 단리
악티노플라네스 테이코마이세티쿠스의 발효 종료 직후 수집된 신선한 전체 브로쓰를 실험에 사용하였다. 실험실 원심분리기 (메가퓨즈(Megafuge) 1.0R™, 헤라에우스(Heraeus))에서 10 내지 30분 동안 4000 내지 6000 rpm으로 브로쓰를 원심분리함으로써 브로쓰 상청액 (정화된 브로쓰)을 생성시켰다. 상청액을 추가로 소결 유리 필터 깔때기 (다공도 4 및 5, 스코트 두란 게엠베하(Schott Duran GmbH))로 여과하고, 이후에 HPLC 방법에 의해 분석하였다.
교차-유동 여과에 의해 투명한 여과물 (투과물)을 생성시켰다. 0.1 ㎛ 세공 크기를 갖는 세라믹 여과 모듈 (멤브랄록스(Membralox) 1P19-60™)을 사용하였다. 투과물을 수집하고, HPLC 방법에 의해 분석하였다.
실시예 2
조 테이코플라닌의 제조
70 L의 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스의 배양 브로쓰를 70 L의 탈염수로 희석하고, 진공 필터를 사용하여 여과하여, 균사체를 제거하고 140 L의 여과물을 얻었다. 브로쓰를 RP-C18 (4.6x250 mm) HPLC 칼럼으로 분석하였다. 이에 대하여, 브로쓰 중 테이코플라닌의 함량 및 총량은 2 내지 3 g/L였다. 35 L의 메탄올을 140 L의 여과물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 0.3 BV (층 부피)/hr의 유량으로 11 L의 앰벌라이트 XAD 16으로 패킹된 칼럼 상에 적용하였다. 이어서, 8 BV (90 L)의 탈염수를 칼럼 상에 2 BV/hr의 유량으로 로딩하여 칼럼 내 패킹된 수지를 세척하였다. 그 후, 9 BV (100 L)의 30% (v/v) 메탄올을 칼럼 상에 0.5 BV/hr의 유량으로 로딩하여 칼럼 상에 패킹된 수지를 세척하였다. 추가의 4.5 BV (50 L)의 85% (v/v) 메탄올을 0.5 BV/hr의 최대 유량으로 칼럼 상에 로딩하여 테이코플라닌을 용리시켰다. 이에 대하여, 용리액 중 테이코플라닌의 총량의 함량은 2.2 g/L였다.
추가의 활성탄으로서의 70 g의 노리트(Norit) CA1을 35 L의 상기 테이코플라닌 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 여과하여 생성된 혼합물로부터 활성탄을 제거하였다. 1.59 g/L의 테이코플라닌 함량을 갖는 생성된 여과물의 pH를 NaOH를 사용하여 7.0으로 조정하였다. 0.7 L의 농축물에 도달할 때까지 진공 증발을 이용하여 여과물을 농축시켰다. 또한, 농축물을 교반하면서 7 L의 아세톤을 농축물에 서서히 첨가하여 3시간 동안 테이코플라닌을 침전시켰다. 생성된 현탁액의 일부 (6.7 L)를 필터 nuch B4로 여과하여 침전물을 회수하였다. 침전물을 40℃에서 21시간 동안 진공 건조기에서 건조시켜 46.3 g의 조 테이코플라닌 분말 (83% 순도)을 회수하였다. 테이코플라닌 분말을 증류수 중에 용해시켜 40 mg/ml의 테이코플라닌 농도를 얻었다. 테이코플라닌 용액의 405 nm에서의 투과도를 착색 성분의 제거에 대해 평가하였다. 그 결과, 본 발명의 테이코플라닌 분말은 17% 미만의 투과도를 가졌다.
실시예 3
양이온 교환 수지를 사용한 탈색
실시예 2에서의 기재의 제1 단락에 따라 제조된, 2.2 g/L의 테이코플라닌을 함유하는 3.3 L의 테이코플라닌 용리액에 활성탄으로서의 7.3 g의 노리트 CA1을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 여과하여 생성된 혼합물로부터 활성탄을 제거하였다. 1.7 g/L의 테이코플라닌 함량을 갖는 생성된 여과물의 pH를 NaOH를 사용하여 pH 6.7로 조정하였다. 그 후, 여과물을 10.6 L의 탈염수로 용해시키고, 이렇게 제조된 용액을 0.65 BV/hr의 유량으로 0.54 L의 앰벌라이트 IRC50 (양이온 교환 수지)으로 패킹된 칼럼 상에 적용하였다. 이어서, 3 BV (1.5 L)의 20% (v/v) 메탄올을 2 BV/hr의 유량으로 칼럼 상에 로딩하여 칼럼 상에 패킹된 수지를 세척하였다. 1 mol의 Na-아세테이트를 함유하는 추가의 7.6 BV (4.1 L)의 20% (v/v) 메탄올 용액을 2 BV/hr의 최대 유량으로 칼럼 상에 로딩하여 테이코플라닌을 용리시켰다. 용리된 테이코플라닌의 pH를 NaOH를 사용하여 6.9로 조정하고, 생성물을 0.1 L의 앰벌라이트 XAD16에 흡착시키고 이를 85% (v/v) 메탄올로 용리함으로써 용리된 테이코플라닌 용액의 전량 (4.1 L)을 추가로 탈염시켰다. 그 후, 0.475 L의 테이코플라닌의 탈염된 85% (v/v) 메탄올 용액을 수득하였다 (98 면적% 초과의 HPLC 순도). 이에 대하여, 용리액 중 테이코플라닌의 함량 및 총량은 각각 2.6 g/L 및 1.05 g이었다. 추가의 활성탄으로서의 2 g의 노리트 CA1을 0.4 L의 상기 테이코플라닌 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 여과하여 생성된 혼합물로부터 활성탄을 제거하였다. 테이코플라닌 함량을 갖는 생성된 여과물의 pH를 NaOH를 사용하여 7.3으로 조정하였다. 10 ml의 농축물에 도달할 때까지 진공 증발을 이용하여 여과물을 농축시켰다. 생성된 농축물의 pH를 NaOH를 사용하여 6.9로 조정하였다. 그 후, 120 mL의 아세톤을 교반 혼합물에 서서히 첨가하여 테이코플라닌을 침전시켰다. 현탁액을 추가의 3시간 동안 교반하고, 생성된 현탁액을 필터 nuch B4로 여과하여 침전물을 회수하였다. 침전물을 40℃에서 20시간 동안 진공 건조기에서 건조시켜 0.8 g의 테이코플라닌 분말 (98 면적% 초과의 HPLC 순도)을 회수하였다.
테이코플라닌 분말을 증류수 중에 용해시켜 40 mg/ml의 테이코플라닌 농도를 얻었다. 테이코플라닌 용액의 405 nm에서의 투과도를 착색 성분의 제거에 대해 평가하였다. 그 결과, 본 발명의 테이코플라닌 분말은 44%의 투과도를 가졌다.
실시예 4
음이온 교환 수지를 사용한 탈색
실시예 2에서의 기재의 제1 단락에 따라 제조된, 2.17 g/L의 테이코플라닌을 함유하는 0.6 L의 테이코플라닌 용리액에 활성탄으로서의 1.3 g의 노리트 CA1을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 여과하여 생성된 혼합물로부터 활성탄을 제거하였다. 1.7 g/L의 테이코플라닌 함량을 갖는 생성된 여과물의 pH를 NaOH를 사용하여 pH 6.7로 조정하였다. 그 후, 여과물을 0.7 L의 탈염수로 용해시키고, 이렇게 제조된 용액을 0.25 BV/hr의 유량으로 0.1 L의 푸롤라이트 A830 (음이온 교환 수지)으로 패킹된 칼럼 상에 적용하였다. 이어서, 3 BV (0.3 L)의 40% (v/v) 메탄올을 2.5 BV/hr의 유량으로 칼럼 상에 로딩하여 칼럼 상에 패킹된 수지를 세척하였다. 1 mol의 Na-아세테이트를 함유하는 추가의 3 BV (0.3 L)의 40% (v/v) 메탄올 용액을 2 BV/hr의 최대 유량으로 칼럼 상에 로딩하여 테이코플라닌을 용리시켰다. 용리된 테이코플라닌의 pH를 NaOH를 사용하여 6.9로 조정하고, 용리된 테이코플라닌 용액의 전량 (0.3 L)을 0.3 L의 탈염수로 추가로 희석하고, 생성물을 0.02 L의 앰벌라이트 XAD16에 흡착시키고 이를 85% (v/v) 메탄올로 용리함으로써 탈염시켰다. 그 후, 0.116 L의 테이코플라닌의 탈염된 85% (v/v) 메탄올 용액을 수득하였다 (90 면적% 초과의 HPLC 순도를 가짐). 이에 대하여, 용리액 중 테이코플라닌의 함량 및 총량은 각각 4.31 g/L 및 0.5 g이었다. 추가의 활성탄으로서의 1 g의 노리트 CA1을 0.116 L의 상기 테이코플라닌 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 여과하여 생성된 혼합물로부터 활성탄을 제거하였다. 테이코플라닌 함량을 갖는 생성된 여과물의 pH를 NaOH를 사용하여 7.0으로 조정하였다. 4 ml의 농축물에 도달할 때까지 진공 증발을 이용하여 여과물을 농축시켰다. 생성된 농축물의 pH를 NaOH를 사용하여 6.9로 조정하였다. 그 후, 50 mL의 아세톤을 교반 혼합물에 서서히 첨가하여 테이코플라닌을 침전시켰다. 현탁액을 추가의 3시간 동안 교반하고, 생성된 현탁액을 필터 nuch B4로 여과하여 침전물을 회수하였다. 침전물을 40℃에서 20시간 동안 진공 건조기에서 건조시켜 0.38 g의 테이코플라닌 분말 (90 면적% 초과의 HPLC 순도)을 회수하였다.
테이코플라닌 분말을 증류수 중에 용해시켜 40 mg/ml의 테이코플라닌 농도를 얻었다. 테이코플라닌 용액의 405 nm에서의 투과도를 착색 성분의 제거에 대해 평가하였다. 그 결과, 본 발명의 테이코플라닌 분말은 42%의 투과도를 가졌다.
실시예 5
순수한 테이코플라닌의 제조
실시예 2에 따른 45 g의 조 테이코플라닌 분말을 30 L의 20% (v/v) 메탄올 중에 용해시키고, 이렇게 제조된 용액을 0.65 BV/hr의 유량으로 3 L의 앰벌라이트 IRC50 (양이온 교환 수지)으로 패킹된 칼럼 상에 적용하였다. 이어서, 4 BV (12 L)의 20% (v/v) 메탄올을 2 BV/hr의 유량으로 칼럼 상에 로딩하여 칼럼 상에 패킹된 수지를 세척하였다. 1 mol의 아세트산나트륨을 함유하는 추가의 10 BV (30 L)의 20% (v/v) 메탄올 용액을 2 BV/hr의 최대 유량으로 칼럼 상에 로딩하여 테이코플라닌을 용리시켰다. 용리된 테이코플라닌의 pH를 NaOH를 사용하여 6.7로 조정하고, 생성물을 0.7 L의 앰벌라이트 XAD16에 흡착시키고 이를 85% (v/v) 메탄올로 용리함으로써 용리된 테이코플라닌 용액의 전량 (30 L)을 추가로 탈염시켰다. 그 후, 5.4 L의 테이코플라닌의 탈염된 85% (v/v) 메탄올 용액을 수득하였고 (98 면적% 초과의 HPLC 순도), 용리된 테이코플라닌의 pH를 NaOH를 사용하여 7.1로 조정하였다. 이에 대하여, 용리액 중 테이코플라닌의 함량 및 총량은 각각 4.3 g/L 및 23.22 g이었다.
상기에 기재된 바와 같이 제조된, 1 L의 테이코플라닌의 탈염된 85% (v/v) 메탄올 용액을 1 L의 탈염수로 희석하고, 이렇게 제조된 용액을 0.25 BV/hr의 유량으로 0.5 L의 푸롤라이트 A830 (음이온 교환 수지)로 패킹된 칼럼 상에 적용하였다. 이어서, 4 BV (2 L)의 40% (v/v) 메탄올을 2.5 BV/hr의 유량으로 칼럼 상에 로딩하여 칼럼 상에 패킹된 수지를 세척하였다. 또한, 1 mol의 아세트산나트륨을 함유하는 4 BV (2 L)의 40% (v/v) 메탄올 용액을 2 BV/hr의 최대 유량으로 칼럼 상에 로딩하여 테이코플라닌을 용리시켰다. 용리된 테이코플라닌의 pH를 NaOH를 사용하여 6.8로 조정하고, 용리된 테이코플라닌 용액의 전량 (2 L)을 2 L의 탈염수로 추가로 희석하고, 생성물을 0.1 L의 앰벌라이트 XAD16에 흡착시키고 이를 85% (v/v) 메탄올로 용리함으로써 탈염시켰다. 그 후, 0.45 L의 테이코플라닌의 탈염된 85% (v/v) 메탄올 용액을 수득하였다 (98 면적% 초과의 HPLC 순도를 가짐). 이에 대하여, 용리액 중 테이코플라닌의 함량 및 총량은 각각 4.58 g/L 및 2.0 g이었다. 이어서, 10 ml의 농축물에 도달할 때까지 진공 증발을 이용하여 0.15 L의 탈염된 테이코플라닌 용액을 농축시켰다. 농축물의 pH를 7.0으로 조정하고, 120 mL의 아세톤을 교반 혼합물에 서서히 첨가하여 테이코플라닌을 침전시켰다. 현탁액을 추가의 3시간 동안 교반하고, 생성된 현탁액을 필터 nuch B4로 여과하여 침전물을 회수하였다. 침전물을 40℃에서 20시간 동안 진공 건조기에서 건조시켜 0.52 g의 테이코플라닌 분말 (98 면적% 초과의 HPLC 순도를 가짐)을 회수하였다.
테이코플라닌 분말을 증류수 중에 용해시켜 40 mg/ml의 테이코플라닌 농도를 얻었다. 테이코플라닌 용액의 405 nm에서의 투과도를 착색 성분의 제거에 대해 평가하였다. 그 결과, 본 발명의 테이코플라닌 분말은, 기재된 기준 용액에서 측정시, 81%의 투과도를 가졌다.

Claims (15)

  1. 테이코플라닌을 양이온 및 음이온 교환 기술에 적용하는 것을 포함하며, 테이코플라닌이 결합되어 있는 양이온 및 음이온 교환 수지를 각각 5 내지 9 미만 범위의 pH 값을 갖는 용리액으로 처리하는 것인, 정제된 테이코플라닌의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 용리액이 5.5 내지 8.5, 또는 6 내지 8.5 범위의 pH 값을 갖는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a) 용액 중의 테이코플라닌을 제공하는 단계;
    b) 용액으로부터 테이코플라닌을 양이온 교환 수지에 결합시킨 후, 상기 용리액으로 용리시키는 단계;
    c) 테이코플라닌을 음이온 교환 수지에 결합시킨 후, 상기 용리액으로 용리시키는 단계; 및
    d) 정제된 테이코플라닌을 얻는 단계;
    또는
    a') 용액 중의 조 테이코플라닌을 제공하는 단계;
    b') 용액으로부터 테이코플라닌을 음이온 교환 수지에 결합시킨 후, 상기 용리액으로 용리시키는 단계;
    c') 테이코플라닌을 양이온 교환 수지에 결합시킨 후, 상기 용리액으로 용리시키는 단계; 및
    d') 정제된 테이코플라닌을 얻는 단계
    를 상기에 기재된 순서로 포함하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a1) 테이코플라닌 화합물을 생성하는 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스(Actinoplanes teichomyceticus)의 균주의 발효 배양물을 인큐베이션시킨 후, 미용해 물질을 여과, 한외여과 또는 원심분리에 의해 제거하는 단계;
    a2) 테이코플라닌을 소수성 흡착 수지에 흡착시키고, 임의로 그 후 수지를 세척하고, 물과 수-혼화성 용매의 혼합물에 의해, 또는 물과 메탄올의 혼합물에 의해 수지로부터 용리시키는 단계;
    a3) 테이코플라닌 샘플을 목탄으로 처리하는 단계;
    a4) 1000 Da 이상의 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과에 의해 테이코플라닌의 용액을 농축시키고 탈염시키는 단계
    중 적어도 하나, 또는 상기 기재된 단계들의 조합을 포함하는 방법에 의해 테이코플라닌을 미리 제공하는 것인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 앰벌라이트® IRC, 앰벌라이트® FPC, 디아이온® WK 및 푸롤라이트® C 상표명 군으로 이루어진 군으로부터 선택된 거대망상형 약산 양이온 교환 수지인 양이온 교환 수지를 사용하고/거나, 앰벌라이트® FPA, 도웩스® 마라톤, 도웩스® 업코어, 디아이온® WA 및 푸롤라이트® A 상표명 군으로 이루어진 군으로부터 선택된 음이온 교환 수지를 사용하는 것인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 테이코플라닌-함유 샘플을 적어도 하나의 추가의 정제 방법에 의해 처리한 다음, 각각 다른 이온 교환 기술을 계속하고, 여기서 적어도 하나의 추가의 정제 방법이, 목탄을 사용한 용액의 처리; 5000 Da 이상의 컷-오프 멤브레인을 사용한 한외여과에 의한 생체거대분자의 제거; 1000 Da 이상의 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과에 의한 용액의 농축 및 탈염; 소수성 흡착 수지 상에서의 흡착/탈착 방법에 의한 염 및 생체거대분자의 제거; 수-불혼화성 유기 용매에 의한 불순물의 추출; 임의로는 용매의 부분적 교환 하에서의, 용액의 농축으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 정제된 테이코플라닌을 분무 건조; 동결건조; 감압 하에서의 용매의 증발; 또는 역용매를 사용한 및/또는 pH 조정 하에서의 침전으로부터 선택된 임의의 방법에 의해 단리시키는 것인 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    양이온 교환 기술에서, 상기 용리액이 물 중 10 내지 40%의 수-혼화성 용매를 포함하고,
    음이온 교환 기술에서, 상기 용리액이 물 중 10 내지 50%의 수-혼화성 용매를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 양이온 및/또는 음이온 교환 기술에서, 상기 용리액이 유기 완충제 또는 약산의 염의 용액을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 양이온 및/또는 음이온 교환 기술에서, 상기 용리액이 하나 이상의 이온성 화합물을 포함하고, 이온성 화합물이 알칼리 금속 양이온; 알칼리 토금속 양이온; 암모늄; 치환기가 동일하거나 상이하며 C1-C16-알킬, 아릴, 치환된 C1-C4-알킬로부터 선택된 것인 일-, 이-, 삼- 또는 사치환된 암모늄으로부터 선택된 양이온이고/거나,
    이온성 화합물이 포스페이트; 히드로겐 포스페이트; 디히드로겐 포스페이트; 카르보네이트; 히드로겐 카르보네이트; 보레이트; 유기 C1-C16-함유 선형 또는 분지형 알킬 카르복실레이트, 디카르복실레이트, 트리카르복실레이트 또는 테트라카르복실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 약산의 음이온이고, 여기서 알킬은 1 내지 3개의 히드록시 기, 1 내지 2개의 아미노 기, 메르캅토 또는 메틸메르캅토 기 또는 페닐 기로 임의로 치환된 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 양이온 및/또는 음이온 교환 기술에서, 용리액이 저급 지방족 산의 알칼리 염의 용액을 포함하는 것인 방법.
  12. 40 g/l의 농도로 물 중에 용해시 파장 405 nm에서 80% 초과의 투과도를 갖는 것을 특징으로 하는, 제1항 또는 제2항에 따른 방법에 의해 수득되는 테이코플라닌.
  13. 제12항의 테이코플라닌을 포함하는 제약 조성물.
  14. 제12항에 정의된 바와 같은 테이코플라닌을 제공하고, 제공된 테이코플라닌을 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 담체와 혼합하는 것을 포함하는, 제약 조성물의 제조 방법.
  15. 삭제
KR1020147015311A 2011-11-11 2012-11-09 테이코플라닌의 정제 방법 KR102040344B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11188776.6A EP2592090A1 (en) 2011-11-11 2011-11-11 Process of purification of teicoplanin
EP11188776.6 2011-11-11
PCT/EP2012/072226 WO2013068517A1 (en) 2011-11-11 2012-11-09 Process of purification of teicoplanin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140091738A KR20140091738A (ko) 2014-07-22
KR102040344B1 true KR102040344B1 (ko) 2019-11-04

Family

ID=47172623

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147015311A KR102040344B1 (ko) 2011-11-11 2012-11-09 테이코플라닌의 정제 방법

Country Status (10)

Country Link
EP (2) EP2592090A1 (ko)
KR (1) KR102040344B1 (ko)
CN (1) CN104080798A (ko)
DK (1) DK2776453T3 (ko)
ES (1) ES2558603T3 (ko)
HU (1) HUE026336T2 (ko)
IN (1) IN2014KN01208A (ko)
PL (1) PL2776453T3 (ko)
SI (1) SI2776453T1 (ko)
WO (1) WO2013068517A1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100474653B1 (ko) 2004-04-16 2005-03-14 동국제약 주식회사 타이코플라닌의 고순도 생산방법
WO2006045627A1 (en) * 2004-10-27 2006-05-04 Alpharma Aps Purification of glycopeptides

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1496386A (en) 1975-03-05 1977-12-30 Lepetit Spa Antibiotics
GB8608798D0 (en) 1986-04-11 1986-05-14 Lepetit Spa Recovery of glycopeptide antibiotics from aqueous solutions
US4845194A (en) 1987-02-27 1989-07-04 Eli Lilly And Company Glycopeptide recovery process
DE69112750T2 (de) 1990-10-01 1996-09-19 Lepetit Spa Verfahren zur Gewinnung von Teicoplanin.
KR100321304B1 (ko) 1999-04-16 2002-03-18 박호군 테이코플라닌의 정제방법
KR100367890B1 (ko) 2000-03-02 2003-01-14 은언기 랩핑/폴리싱 휠 및 그 제조방법
KR20030017067A (ko) 2001-08-23 2003-03-03 정용진 변이주 액티노플라네스 테이코마이세티커스 지안네시스 및이로부터 테이코플라닌을 생산하는 방법
KR100459289B1 (ko) 2002-05-30 2004-12-03 이연제약주식회사 발효액으로부터 테이코플라닌ａ₂의 회수방법
KR100476818B1 (ko) * 2002-07-19 2005-03-17 종근당바이오 주식회사 테이코플라닌 에이 투 정제 방법
KR100652320B1 (ko) * 2004-02-16 2006-11-29 근화제약주식회사 테이코플라닌의 분리 및 정제 방법
KR100554481B1 (ko) * 2004-06-30 2006-03-03 씨제이 주식회사 반코마이신 염산염의 정제방법
EP1798237A1 (en) * 2005-12-16 2007-06-20 Pharmatex Italia Srl Process for the purification of macrolide antibiotics

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100474653B1 (ko) 2004-04-16 2005-03-14 동국제약 주식회사 타이코플라닌의 고순도 생산방법
WO2006045627A1 (en) * 2004-10-27 2006-05-04 Alpharma Aps Purification of glycopeptides

Also Published As

Publication number Publication date
HUE026336T2 (en) 2016-05-30
KR20140091738A (ko) 2014-07-22
PL2776453T3 (pl) 2016-03-31
EP2776453A1 (en) 2014-09-17
ES2558603T3 (es) 2016-02-05
DK2776453T3 (en) 2016-01-18
CN104080798A (zh) 2014-10-01
WO2013068517A1 (en) 2013-05-16
SI2776453T1 (sl) 2016-04-29
EP2592090A1 (en) 2013-05-15
IN2014KN01208A (ko) 2015-10-16
EP2776453B1 (en) 2015-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1252179B1 (en) High purity lipopeptides, lipopeptide micelles, processes for preparing same and pharmaceutical compositions containing them
RU2526391C2 (ru) Способ очистки липопептидов
KR101925695B1 (ko) 고순도 반코마이신 염산염의 분리 정제방법
EP1735337B1 (en) Method of producing highly pure teicoplanin
EP2776452B1 (en) Process of purification of teicoplanin
KR102040344B1 (ko) 테이코플라닌의 정제 방법
US20210355160A1 (en) Process for the purification of lipopolypeptide antibiotics
KR101844833B1 (ko) 테이코플라닌 정제방법
KR101802191B1 (ko) 테이코플라닌 회수방법
IT201800006314A1 (it) Uso di resine a scambio cationico per la purificazione di antibiotici lipopolipeptidici

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant