ES2378790T5 - Procedimiento de preparación de una genoteca de ácidos nucleicos - Google Patents
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Description
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En una realización del primer y del segundo aspecto, la primera enzima de restricción de tipo IIS se selecciona del grupo que comprende BpiI, BbsI, Esp3I, BsmBI, Eco31I, BsaI, BfuAI, FokI, BseRI, BbvI y BsgI.
En una realización del primer y del segundo aspecto, la segunda, tercera, cuarta, quinta y cualquier enzima de restricción de tipo IIS adicional se selecciona cada una e individualmente del grupo que consiste EarI, Eam1104I, SapI, LguI, Ksp632I y BspQI.
En una realización del primer y del segundo aspecto, el ácido nucleico es un ácido nucleico monocatenario y la longitud de la segunda extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácidos nucleicos consiste en dos nucleótidos, tres nucleótidos, cuatro nucleótidos, cinco nucleótidos, seis nucleótidos, siete nucleótidos, ocho nucleótidos o múltiplos de tres nucleótidos.
En una realización del primer y del segundo aspecto, en la que el ácido nucleico es un ácido nucleico bicatenario y la longitud de la segunda extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácidos nucleicos consiste en dos nucleótidos, tres nucleótidos, cuatro nucleótidos, cinco nucleótidos, seis nucleótidos, siete nucleótidos, ocho nucleótidos o múltiplos de tres nucleótidos.
En una realización del primer y del segundo aspecto, la segunda extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácidos nucleicos está codificando uno o varios aminoácidos.
En una realización del primer y del segundo aspecto, el segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, el tercer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, el cuarto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, el quinto y el oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario adicional comprenden una modificación, por lo que dicha modificación permite la inmovilización del oligonucleótido en una superficie.
En una realización del primer y del segundo aspecto, la modificación se selecciona del grupo que comprende un resto de biotina, un resto de digoxigenina, un resto de isotiocianato de fluoresceína, un compuesto amino o un éster de succinilo.
En una realización del primer y del segundo aspecto, la genoteca de ácidos nucleicos es una genoteca de moléculas de ácido nucleico que codifican un ácido nucleico funcional, por lo que dicho ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende aptámeros, promotores, ribozimas y moléculas de mediación de iARN.
En una realización del primer y del segundo aspecto, la genoteca de ácidos nucleicos es una genoteca de moléculas de ácido nucleico que codifican un péptido, polipéptido o proteína.
En una realización del primer y del segundo aspecto, el péptido, polipéptido y proteína se seleccionan del grupo que comprende aptámeros peptídicos, enzimas, enzimas de restricción, dominios de unión a ADN, vacunas, anticuerpos, proteínas farmacéuticamente activas, anticalinas, DARPinas, nanocuerpos y AdNectinas.
En una realización del primer y del segundo aspecto, la genoteca de ácidos nucleicos es una genoteca de moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido, por lo que el polipéptido es un armazón que comprende una o varias regiones constantes, por lo que una o varias regiones variables y una o varias de las regiones variables están codificadas por la secuencia de la segunda extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácidos nucleicos.
En una realización del primer y del segundo aspecto, la segunda extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácidos nucleicos es la única diferencia entre dichos elementos.
En un tercer aspecto el problema subyacente a la presente solicitud se resuelve mediante una genoteca de ácidos nucleicos que puede obtenerse mediante un procedimiento de acuerdo con el primer y/o segundo aspecto.
En una realización del tercer aspecto los miembros de la genoteca difieren en una posición de nucleótido, por lo que dicha posición de nucleótido comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 nucleótidos.
En un cuarto aspecto el problema subyacente a la presente solicitud se resuelve mediante un procedimiento de fabricación de una genoteca de moléculas de ácido nucleico, por lo que la genoteca de moléculas de ácido nucleico comprende una pluralidad de elementos, por lo que los elementos comprenden al menos una extensión constante y al menos una extensión variable, y por lo que la al menos una extensión constante comprende una secuencia de nucleótidos que es la misma en todos los elementos, y la al menos una extensión variable comprende una secuencia de nucleótidos que es diferente en todos los elementos, por lo que el procedimiento comprende las etapas siguientes:
a) proporcionar un primer oligonucleótido, por lo que el primer oligonucleótido es un oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene un saliente monocatenario y que comprende un sitio de reconocimiento para una primera enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su secuencia de reconocimiento, o una genoteca de ácidos nucleicos que comprende una pluralidad de elementos, por lo que la genoteca de ácidos nucleicos es la genoteca de ácidos nucleicos de acuerdo con el primer, segundo y/o tercer aspecto y los elementos de la genoteca de ácidos nucleicos tienen un saliente monocatenario, y los elementos de la genoteca
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bucle. Sin embargo, también se incluye en la presente invención que el oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario esté formado por dos oligonucleótidos monocatenarios separados cuyas bases se emparejan entre sí, generando de este modo dicho oligonucleótido al menos parcialmente y el saliente monocatenario descrito anteriormente. En una realización preferida, el extremo de dicho último oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que no está proporcionando el saliente monocatenario necesario para la ligación se bloquea para evitar cualquier ligación o reacción que sea potencialmente posible en las etapas posteriores del procedimiento de acuerdo con la presente invención.
En la etapa 2, se proporciona una primera genoteca de oligonucleótidos que comprende varios miembros. Cada miembro de dicha primera genoteca de oligonucleótidos se denomina también en el presente documento segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario y tiene una estructura bicatenaria. La estructura bicatenaria, como en relación con el primer oligonucleótido al menos bicatenario, puede estar formada por dos cadenas sencillas que tengan la modificación adicional que se ha descrito anteriormente. Los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos comprenden un sitio de reconocimiento, o parte del mismo, para una segunda enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento. Además, dicho segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario proporciona un saliente monocatenario. Los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos tienen el mismo saliente monocatenario y dicho saliente monocatenario es esencialmente o parcialmente complementario al saliente monocatenario del primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario. En el presente caso, dicho saliente monocatenario es CAC. Posterior al saliente monocatenario, los segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios comprenden una estructura bicatenaria que comprende una extensión de nucleótidos, por lo que los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos difieren en la secuencia de dicha extensión de nucleótidos y las secuencias de dicha extensión de nucleótidos corresponden a las secuencias, o parte de las mismas, de la segunda extensión de los elementos de la genoteca de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Por consiguiente, como se representa en la Fig. 1 (1), se proporciona una primera genoteca de oligonucleótidos en la que la parte bicatenaria de los miembros posterior al saliente monocatenario comprende las diversas secuencias sujetas a la segunda extensión de los nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácidos nucleicos. Dentro de la presente invención se incluye que la estructura bicatenaria comprenda nucleótidos adicionales que, en una realización, puedan o no contener nucleótidos adicionales de la secuencia diana. En el uso particular representado en la Fig. 1, estas secuencias son ATG, TAT y GAG que están formando emparejamiento de bases con sus secuencias complementarias, es decir, TAC, ATA y CTC (en dirección 3’ → 5’), que también puede estar representadas en el presente documento como ATG/TAC, TAT/ATA y GAG/CTC. Los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos difieren por lo tanto en la secuencia de dicha extensión de nucleótidos y la secuencia de dicha extensión de nucleótidos de los miembros de la primera genoteca de nucleótidos corresponde a la secuencia o parte de la misma de la segunda extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácidos nucleicos. Por consiguiente, la complejidad de la genoteca de ácidos nucleicos a preparar usando el procedimiento de acuerdo con la presente invención, que en el caso de la Fig. 1 es de tres, es decir, consiste en tres elementos diferentes, está reflejada y preferentemente es en realidad la misma que la complejidad de la primera genoteca de oligonucleótidos, que también consiste en tres miembros diferentes.
Además, los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos comprenden una modificación. En el presente caso dicha modificación permite la inmovilización de los diversos miembros en una superficie, típicamente una superficie de un soporte o vehículo. La inmovilización está específicamente mediada por una interacción entre la modificación y un compañero de interacción de dicha modificación. En el presente caso, la modificación es biotina que está interaccionando con estreptavidina como su compañero de interacción y proporciona un complejo estable que permite la inmovilización de los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos y los productos de reacción de cualquier reacción de ligación usando los mismos. Los miembros, debido a la presencia de la modificación, también se denominan en el presente documento anclajes o moléculas de anclaje.
En la Fig. 1, el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción de tipo IIS de los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos se indica como un recuadro en negro que ilustra el hecho de que para esta clase de enzima de restricción, el sitio de reconocimiento se encuentra fuera del sitio de escisión.
En la etapa 3, el primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario y la primera genoteca de oligonucleótidos y los miembros de la misma, respectivamente, se combinan. Tras dicha combinación, una molécula del primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario se aparea y posteriormente se liga con una molécula de un miembro de la primera genoteca de oligonucleótidos, preferentemente por medio de una ligasa o actividad de ligasa. Dicha ligación se produce tras la formación de un primer producto de preligación a través de la hibridación de los salientes monocatenarios de las dos clases de moléculas, actuando dichos salientes como “extremos cohesivos”. El producto de reacción de la ligación se denomina producto de primera ligación. Debido a que la primera genoteca de oligonucleótidos comprende diversos elementos y especies, respectivamente, la reacción de ligación da como resultado una combinación de productos de primera ligación o una pluralidad de productos de primera ligación. Además, en esta pluralidad de productos de ligación que en realidad constituye una genoteca adicional, los miembros difieren al menos y, preferentemente únicamente en el presente ejemplo, en la secuencia correspondiente al segundo triplete y, por lo tanto, la segunda extensión de la secuencia diana, mientras que típicamente el resto del producto de primera ligación en términos de secuencia de nucleótidos es preferentemente igual para los diversos elementos de la genoteca de productos de primera ligación así formada. La pluralidad de productos de primera
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debido a la complementariedad de los salientes, se produce una reacción de uno en uno, es decir, una reacción entre una molécula de cada especie de reactivo contenido en la reacción. El producto de tercera ligación comprende en última instancia la secuencia diana que se representa en la Fig. 1 (1). Dicho producto de tercera ligación puede cortarse por la cuarta enzima de restricción de tipo IIS, por lo que la escisión se produce en la secuencia de ácido nucleico del cuarto o cuartos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios y proporciona una pluralidad de terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y cuartos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados. De nuevo, el diseño de la secuencia de reacciones adicionales puede variar como se ha resumido en relación con el primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario y la primera genoteca de oligonucleótidos.
Como se entenderá con respecto a las secuencias representadas específicamente en la Fig. 1, la enzima de restricción de tipo IIS usada para la escisión es una proporcionada por las moléculas de anclaje, es decir, las moléculas que proporcionan la modificación que permite la interacción con un compañero de interacción y, por lo tanto, la inmovilización de la molécula incluyendo cualquier resto que pueda haberse añadido por ligación o eliminado por escisión. La enzima de restricción de tipo IIS específica intrínseca a todas las diversas secuencias de anclaje usadas en relación con el ejemplo descrito en la Fig. 1 es Eam1104I.
Dicho tercer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario alargado puede someterse a etapas de reacción adicionales que también se denominan etapas de alargamiento, como se ha resumido anteriormente.
Los expertos en la materia reconocerán que, como alternativa, la secuencia diana así obtenida y más específicamente el tercer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario alargado pueden usarse después en una etapa de transposición como se describe en relación con la Solicitud de Patente Internacional WO 00/75368.
Procedimiento de preparación de una genoteca de ácidos nucleicos como se ilustra en la Fig. 2
En relación con el procedimiento de preparación de una genoteca de ácidos nucleicos, por lo que los elementos de la misma contienen una posición variable que consiste en dos tripletes de nucleótidos posteriores, se aplica típicamente la siguiente secuencia de etapas. La secuencia diana como se representa en la Fig. 2 (1) comprende como primera extensión CAC, como segunda extensión que es variable en secuencia y comprende en el presente ejemplo (en dirección 5’ → 3’) ATGCTC, ATGGAG, ATGTTT, TATGAG, TATCTC, TATTTT, GAGTTT, GAGCTC o GAGGAG una secuencia de ácido nucleico que por lo tanto es diferente para cada elemento de la genoteca de ácidos nucleicos, pero en cualquier caso una secuencia definida por una secuencia de nucleótidos conocida más que una extensión variable de secuencia arbitraria, y como una tercera extensión ACA.
La segunda extensión variable comprende en el caso ilustrado una primera mitad de la segunda extensión y una segunda mitad de la segunda extensión, por lo que la primera mitad de la segunda extensión presenta uno de los triplete siguientes: ATA, TAT o GAG, y la segunda mitad de la segunda extensión comprende los diferentes tripletes siguientes: CTC, GAG o TTT.
La particularidad de este aspecto del procedimiento de la presente invención es que la primera mitad de la segunda extensión y la segunda mitad de la segunda extensión se proporcionan o incorporan en el ácido nucleico en etapas de reacción diferentes. Se reconocerá que la longitud de la primera mitad de la segunda extensión y de la segunda mitad de la segunda extensión puede variar, dependiendo de las características de corte de las enzimas de restricción de tipo IIS usadas. Se prefiere particularmente si la longitud de cada una de la primera mitad y la segunda mitad consiste en tres nucleótidos consecutivos que codifican un aminoácido.
En una primera etapa se proporciona un primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una estructura bicatenaria. Dicho oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario tiene un saliente monocatenario y también se denomina en el presente documento esplínquer. El saliente monocatenario proporciona una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de la primera o la tercera extensión de nucleótidos, o parte de la misma, de los elementos de la genoteca de ácidos nucleicos. Más específicamente, la secuencia de saliente monocatenario es complementaria a dicha primera o tercera extensión, respectivamente. En una realización preferida, el primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario comprende un sitio de reconocimiento o parte del mismo para una primera enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento. En el presente caso, dicho primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario tiene un saliente monocatenario que comprende GTC y que por lo tanto es complementario al primer triplete de la secuencia diana. El oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario en la realización representada en la Fig. 2 (1) está formado por una parte del oligonucleótido monocatenario que se pliega hacia atrás hacia otra parte del oligonucleótido, formando de este modo un bucle y la estructura bicatenaria. Sin embargo, también se incluye en la presente invención que el oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario esté formado por dos oligonucleótidos monocatenarios separados cuyas bases se emparejan entre sí generando de este modo dicho oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario como se describe en el presente documento. El extremo del oligonucleótido monocatenario descrito anteriormente que no está proporcionando el saliente monocatenario necesario para la ligación se bloquea para evitar cualquier ligación o reacción que sea potencialmente posible en las etapas posteriores del procedimiento de acuerdo con la presente invención.
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miembros de la segunda genoteca de oligonucleótidos. La diversidad con respecto a esta extensión se obtiene como resultado de las posibilidades combinatorias de la primera mitad de la segunda extensión y la segunda mitad de la segunda extensión de la secuencia diana. En el presente ejemplo, la primera mitad de la segunda extensión y la segunda mitad de la segunda extensión comprenden cada una tres tripletes diferentes, de modo que el número de terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios debe ser de 3 x 3, es decir, nueve moléculas diferentes. Si la primera mitad consistía en tres tripletes diferentes y la segunda mitad consistía en cuatro tripletes diferentes, la complejidad de la segunda genoteca de oligonucleótidos sería de 3 x 4, es decir, 12, y dicha genoteca proporcionaría 12 especies de oligonucleótidos diferentes. Por consiguiente, en el presente caso la segunda genoteca de oligonucleótidos consiste en 9 miembros, proporcionando de este modo cualquier combinación que surja de la variabilidad de la segunda extensión de la secuencia diana, más específicamente que surja del hecho de que dicha segunda extensión consiste en una primera y una segunda mitad que contribuyen a la secuencia diana mediante moléculas diferentes, por lo que y cada una de dichas primera y segunda extensión comprende tres formas o secuencias diferentes que dan como resultado las 9 especies diferentes. De nuevo, los miembros de la segunda genoteca de oligonucleótidos comprenden una modificación, por lo que dicha modificación es preferentemente la misma que se describe en relación con la primera genoteca de oligonucleótidos.
En la etapa 7, la pluralidad de los primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados que consiste en tres especies diferentes, y la segunda genoteca de oligonucleótidos se combinan. Debido a la complementariedad de los salientes como se ha resumido anteriormente, cada molécula de la pluralidad, es decir, cada una de las tres especies diferentes de los primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados se liga con una molécula de un miembro de la segunda genoteca de oligonucleótidos. La pareja de moléculas respectiva a ligar está definida por la complementariedad de sus salientes que definen una pareja de reacción. Una vez que se hibridan o aparean las dos moléculas correspondientes, la ligación típicamente se produce tras la adición o presencia de una actividad de ligasa respectiva. En dichos productos de ligación, la primera mitad de la segunda extensión y la segunda mitad de la segunda extensión de la secuencia diana ya están contenidas en el producto de ligación y recuadradas en la representación de la Fig. 2 (2). Los nueve productos de ligación diferentes comprenden, como una extensión bicatenaria, ya la primera mitad de la segunda extensión del ácido nucleico diana y la segunda mitad de la segunda extensión del ácido nucleico diana.
En el presente caso, el producto de segunda ligación comprende un total de nueve secuencias diferentes, por lo que las secuencias difieren en el saliente monocatenario introducido en el producto de segunda ligación por los primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y, en el presente ejemplo, el primer triplete de la estructura bicatenaria proporcionado por los miembros de la segunda genoteca de oligonucleótidos. En otras realizaciones, diferencias adicionales pueden residir en partes adicionales del producto de ligación, sin embargo, se prefiere que las dos diferencias mencionadas anteriormente en los diversos miembros de la genoteca que consisten en el producto de segunda ligación sean, por otra parte, las mismas. De nuevo, los diversos miembros de la genoteca que consiste en los productos de segunda ligación tienen un sitio de reconocimiento de enzima de restricción de tipo IIS, o parte del mismo, que corresponde a uno de los segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios.
Las siguientes etapas, es decir, la etapa 8, consiste en el corte del producto de segunda ligación con la tercera enzima de restricción de tipo IIS, por lo que la escisión se produce en la secuencia de ácido nucleico del tercer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que está, en principio, diseñado y generado, respectivamente, del mismo modo que se ha descrito en relación con el producto de primera ligación. Esto es aplicable particularmente con respecto a la secuencia potencial de unión y corte y la eliminación por inmovilización, respectivamente. Como resultado de la etapa 8 en el transcurso de la cual el producto de segunda ligación se corta con la tercera enzima de restricción de tipo IIS, se proporciona una pluralidad de segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados. De nuevo, los terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados así liberados del producto de segunda ligación se eliminan de la reacción por la modificación y su interacción con un compañero de interacción tal como estreptavidina, en relación con que sea biotina la modificación unida a una superficie.
Los nueve segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados diferentes así obtenidos se representan en la Fig. 2 (2).
En la etapa 9, se proporciona una tercera genoteca de oligonucleótidos con una diversidad de cuartos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios. Dichos cuartos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios difieren en sus salientes. Por otra parte, el diseño de este cuarto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario puede ser, en una realización, similar a las realizaciones descritas en relación con otros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios descritos en relación con las Fig. 1 y 2, respectivamente. El saliente monocatenario proporciona una secuencia de nucleótidos que es esencialmente complementaria a los salientes monocatenarios de los diversos segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados. El número de las especies respectivas de la tercera genoteca de oligonucleótidos surge de y corresponde a la variabilidad de la segunda mitad de la segunda extensión del ácido nucleico a preparar, y por lo tanto los diversos segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados. Dichos segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados tienen, en el presente caso, tres salientes monocatenarios diferentes, si se toman en su conjunto. Más específicamente, estos salientes son AAA, CTC y GAG, siendo complementarios a la
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para dicha modificación. En un ejemplo preferido, la modificación es biotina y el compañero de interacción de dicho soporte es estreptavidina. Los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos comprenden un sitio de reconocimiento, o parte del mismo, para una segunda de enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento. Además, dichos segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios proporcionan un saliente monocatenario. Los miembros y especies, respectivamente, de la primera genoteca de oligonucleótidos difieren entre sí en la medida en que el saliente monocatenario o parte del mismo sea diferente para los miembros o especies de la primera genoteca de oligonucleótidos, y por lo que dichos salientes monocatenarios son esencialmente o parcialmente complementarios al saliente monocatenario de los primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios. En el presente caso, dichos salientes monocatenarios son ATG, TAT y GAG, respectivamente. De nuevo, la complejidad de la genoteca se define por la variabilidad de la primera extensión del ácido nucleico a preparar. Por consiguiente, si la complejidad era, como se representa en el ejemplo, de tres debido a las tres secuencias diferentes, la pluralidad de los primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios y de la primera genoteca de oligonucleótidos será de tres. Posterior al saliente monocatenario, la estructura bicatenaria de los segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios comprende una extensión de nucleótidos, por lo que los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos tienen la misma secuencia. Inmediatamente después de los tres nucleótidos que comprenden el saliente, los segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios tienen una extensión que corresponde a la secuencia de la segunda extensión de la secuencia diana. En los segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios, sin embargo, dicha segunda extensión de la secuencia diana está presente en una forma bicatenaria. La pluralidad de los primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios y la primera genoteca de oligonucleótidos y sus miembros, es decir, los segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios, se representa en la Fig. 3 (1).
Los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos comprenden una modificación. En el presente caso, dicha modificación permite la inmovilización de los diversos miembros de la genoteca en un soporte que típicamente es la superficie de un tubo de reacción o de un pocillo. La inmovilización está específicamente mediada por una interacción por la modificación y el compañero de interacción de dicha modificación que está típicamente presente en el soporte o vehículo. En el presente caso, la modificación es biotina que está interaccionando con estreptavidina ya que su compañero de interacción proporciona un complejo estable que permite la inmovilización de los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos.
Como en relación con los procedimientos representados en la Figs. 1 y 2, el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción de tipo IIS de los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos está indicado como un recuadro en negro que ilustra el hecho de que para esta clase de enzima de restricción el sitio de reconocimiento se encuentra fuera del sitio de escisión.
En la etapa 3, los primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios y los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos se combinan. Tras dicha combinación, una molécula del primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario se liga con una molécula de los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos, preferentemente por medio de una ligasa o actividad de ligasa. Dicha ligación se produce formando un primer producto de preligación a través de la hibridación de los salientes monocatenarios de las dos clases de moléculas, actuando dichos salientes como “extremos cohesivos”. El producto de reacción de la ligación se denomina, en su totalidad, producto de primera ligación como se representa en la Fig. 3 (1). Como se indica en la Fig. 3 (1), dicho producto de primera ligación varía y representa las posiciones variables de la secuencia diana. En otras palabras, el producto de primera ligación forma por sí mismo una genoteca que comprende, en el presente ejemplo, tres especies diferentes de producto de ligación que difieren en la posición que representa la posición variable de la secuencia diana. Dicho producto de ligación comprende además la segunda extensión de la secuencia diana que es, en el presente caso, GAG. Hasta ahora, los miembros de esta combinación de productos de ligación al menos, y preferentemente, difieren únicamente en la secuencia correspondiente al primer triplete de la secuencia diana que es la posición variable, mientras que típicamente el resto del producto de primera ligación en términos de secuencia de nucleótidos es preferentemente el mismo para los diversos elementos de la genoteca de productos de primera ligación así formada.
En la etapa 4, el producto de primera ligación se corta con una enzima de restricción de tipo IIS. Dicha enzima de restricción de tipo IIS es una cuyo sitio de reconocimiento se proporciona por las moléculas de anclaje, es decir, por los segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios. El corte de los productos de primera ligación se realiza en la combinación y la genoteca, respectivamente, que consisten en los productos de primera ligación. Por consiguiente, el corte o escisión de los productos de primera ligación da como resultado una diversidad de moléculas así cortadas, por lo que el producto de reacción de dicho corte es una pluralidad de primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y una pluralidad de segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados. En cada caso, en el presente ejemplo, se proporcionan tres especies diferentes de las moléculas respectivas.
Como se ha descrito en relación con los procedimientos sujetos a las Figs. 1 y 2, la realización de la etapa 4 puede llevarse a cabo en escenarios diferentes en términos de inmovilización o no inmovilización de los miembros del producto de primera ligación, respectivamente. La divulgación respectiva se incorpora en el presente documento por referencia.
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