PT2110435E

PT2110435E - Método de preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos

Info

Publication number: PT2110435E
Application number: PT09004736T
Authority: PT
Inventors: Jan Van Den Brulle; Markus Fuhrmann; Ralf Strohner
Original assignee: Sloning Biotechnology Gmbh
Priority date: 2008-03-31
Filing date: 2009-03-31
Publication date: 2012-03-15
Also published as: ATE538200T2; DK2110435T3; SI2110435T1; EP2110435A1; US20100022410A1; ES2378790T3; DK2110435T4; SI2110435T2; EP2110435B2; JP5642939B2; EP2110435B1; ES2378790T5; US9115352B2; JP2009240310A

Description

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DESCRIÇÃO

"MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA BIBLIOTECA DE ÁCIDOS NUCLEICOS" A presente invenção relaciona-se com um método de preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos compreendendo um conjunto de elementos e uma biblioteca assim obtida. A geração de novo de moléculas de ácidos nucleicos é cada vez mais usada na investigação biofarmacêutica em vez dos procedimentos de clonagem, frequentemente bastante complexos, necessários para a produção de construções de ADN desejadas com propriedades optimizadas, por ex. um nivel elevado de expressão proteica em sistemas in vivo ou in vitro adequados. Há uma variedade de métodos conhecidos para sintetizar tais moléculas de ADN. Praticamente todos estes procedimentos dependem da síntese, emparelhamento e subsequente ligação de oligonucleótidos sintéticos de cadeia simples para montar de moléculas de ADN de cadeia dupla mais longas que, tipicamente, consistem em mais de uma centena e até vários milhares de pares de bases. No entanto, a eficiência destes métodos é limitada por vários factores: (i) a qualidade dos oligonucleótidos usados, (ii) o tamanho da construção desejada (iii) a proporção de sequências "difíceis", por exemplo, aquelas com regiões auto complementares, elevado conteúdo em GC, tétradas G, torções de ADN ou blocos de sequências repetitivas. Os próprios blocos de construção de oligonucleótidos estão contaminados com vários produtos de terminação e deleções internas. São especialmente problemáticos os produtos n-1 (oligonucleótidos contendo deleções internas de um nucleótido que ocorrem como resultado de reacções incompletas de "capping") que dificilmente podem ser separados dos oligonucleótidos de 2 extensão completa desejados. Como muitos oligonucleótidos têm de ser montados com a finalidade de gerar um gene completo, a probabilidade de obter um clone sem erros, isto é, que não incorporem nenhum oligonucleótido defeituoso com uma troca de base ou deleção interna, aproxima-se de 0%. Por exemplo, se um gene foi montado a partir de cinquenta oligonucleótidos, cada um com uma pureza de 90%, a probabilidade de criar um produto livre de erros seria de aproximadamente, 0,950 = 0,005. Geralmente, os procedimentos entediantes de correcção de erros têm que ser utilizados para a obtenção de uma contrução 100% livre de defeitos. Em muitos casos, produtos de síntese defeituosos não podem ser tolerados pois os erros na sequência de codificação podem gerar produtos de transcrição ou tradução mais curtos devido, por ex., a desvios na grelha da grelha de leitura aberta. Enquanto os primeiros dois problemas se podem atenuar com o uso de oligonucleótidos de pureza muito elevada, a formação de estruturas secundárias indesejáveis que possam causar deleções no produto de síntese pode, em muitos casos, ser suprimida somente se forem permitidas alterações na sequência de ADN.

Conhecem-se do estado da técnica variados métodos para produção de ADN sintético. Há quase 30 anos, o trabalho pioneiro de Khorana et al. (Sekiya T, Brown EL, Belagaje R, Fritz HJ, Gait MJ, Lees RG, Ryan MJ, Khorana HG, Norris KE. (1979), J Biol Chem. 254 (13):5781-6, e 5787 - 801) demonstrou a síntese de novo completa de um gene supressor de ARNt via ligação de pares de oligonucleótidos emparelhados. Neste, e em métodos relacionados, os oligonucleótidos de cadeia simples complementares, compreendendo a sequência completa de ADN desejada, são emparelhados em pares para proporcionar fragmentos de cadeia dupla, que são alinhados na ordem correta em virtude das protrusões de cadeia simples complementares (Stabinsky, Patente dos Estados Unidos 4.652.639). Os fragmentos 3 resultantes são depois ligados sequencialmente ou numa reacção de um tubo (Jayaraman, Patente dos Estados Ligados 5.132.215) quer enzimatica ou quimicamente. Após a purificação e/ou clonagem estes fragmentos de genes podem juntar-se para formar construções de ADN mais longas. Na denominada "síntese de cassete", cada par de oligonucleótidos emparelhado é clonado separadamente num vector de plasmídeo antes da junção dos fragmentos usando endonucleases de restrição (Richards et al., Patente dos Estados Ligados 5.093.251).

Alternativamente, as construções de ADN podem ser montadas a partir de oligonucleótidos parcialmente emparelhados, os quais após hibridação contêm lacunas de cadeia simples que necessitam ser preenchidos por polimerases de ADN; este método é vulgarmente referido como método de "preenchimento de lacunas". De acordo com este método, é sintetizada uma variedade de oligonucleótidos parcialmente sobrepostos, que são purificados e subsequentemente, hibridados, geralmente em pares ou subgrupos. Após a síntese das cadeias respectivamente opostas usando uma polimerase de DNA os fragmentos individuais são ligados entre si. Os produtos de ligação de cadeia dupla gerados desta maneira podem ser clonados como fragmentos parciais ou amplificados numa reacção de polimerase em cadeia (PCR) com iniciadores de oligonucleótidos terminais. Contudo, este método é atormentado frequentemente por eventos de má iniciação e deleções internas devido à formação de estruturas secundárias.

Ambos os métodos são de uso limitado já que com o aumento do comprimento da molécula de ácido nucleico a ser sintetizada, aumenta a probabilidade de que haja incorporação no produto final de um ou mais oligonucleótidos com uma sequência incorrecta. Estes erros são posteriormente copiados na reacção da polimerase de 4 ADN. Para além disso, também podem ser introduzidos erros de sequenciação na reacção de PCR. É descrita uma combinação dos métodos mencionados acima na Patente dos Estados Unidos 6.472.184 na qual uma série de oliqonucleótidos ligáveis representando regiões adjacentes numa cadeia da sequência alvo é hibridada com oligonucleótidos não ligáveis que são complementares às terminações 3' ou 5' dos oligonucleótidos ligáveis a unir. Este método é relativamente simples e linear mas também é atormentado pelos problemas comuns partilhados por todos os procedimentos que usam oligonucleótidos de cadeia simples como blocos de construção: a formação de estruturas secundárias indesejadas e a incorporação de oligonucleótidos nx, ambas levando a deleções internas.

Para além destes procedimentos padrão, existem mais métodos conhecidos no estado da técnica para a produção de moléculas sintéticas de ADN. A Solicitação da Patente Internacional WO 98/15567 e da Patente dos Estados Unidos 6.110.668 ensinam um método orientado como modelo de acoplamento de oligonucleótidos para proporcionar construções de ADN sintéticos por ligação de vários oligonucleótidos, que são pelo menos parcialmente complementares do ADN molde de cadeia simples, e as terminações desses oligonucleótidos são ligadas na ordem correta em etapas sucessivas de emparelhamento e desnaturação. Contudo, um pré-requisito para a aplicação deste método é a existência prévia de um molde de ADN adequado, excluindo o seu uso na síntese de novo. A Solicitação de Patente Internacional WO 99/47536 divulga um método de síntese de gene em fase sólida no qual oligonucleótidos de cadeia simples são ligados sequencialmente a uma molécula de iniciação imobilizada numa orientação definida. Uma desvantagem deste método é que se requerem muitas etapas para a síntese de genes mais longos o que resulta em baixa produtividade e 5 aumento de sequências defeituosas. Este método é também, dificil de automatizar o que é um pré-requisito para uma síntese rápida e padronizada. A Solicitação de Patente Internacional WO 00/75368 divulga uma síntese combinatória em fase sólida de ácidos nucleicos usando uma biblioteca de oligonucleótidos de cadeia dupla como blocos de construção padronizados. O uso de blocos de construção padronizados torna desnecessária a sintese de novos conjuntos de oligonucleótidos para cada nova síntese. Estes oligonucleótidos de cadeia dupla da biblioteca partilham geralmente, uma estrutura geral idêntica evitando-se assim problemas de síntese comuns causados pela formação de estruturas secundárias alternativas dos blocos de construção de oligonucleótidos, tais como a introdução de deleções. Numa versão preferida, eles contêm uma ansa terminal, um corpo de cadeia dupla e uma curta protrusão de cadeia simples. Há duas classes diferentes de bibliotecas de oligonucleótidos que se caracterizam pela presença de diferentes locais de reconhecimento das enzimas de restrição tipo IIS na sua sequência e pela sua presença ou ausência ou pelo tipo de uma modificação interna. Os nucleótidos na cadeia suspensa e na região imediatamente adjacente formam a porção variável que realmente contribui para o ácido nucleico a ser sintetizado; a sequência restante é geralmente idêntica em todos os oligonucleótidos que pertençam à mesma classe.

Para construir um ácido nucleico de cadeia dupla, primeiro rompe-se a sua sequência em fragmentos mais pequenos (geralmente entre 6 e 30 pares de bases cada). Estes denominam-se blocos de elongação e são depois, sintetizados em reacções paralelas. Em cada uma dessas reacções, dois oligonucleótidos de cadeia dupla da biblioteca, um de cada classe, são ligados por meio da correspondência das protrusões de cadeia simples. Os 6 produtos de ligação dos mesmos são, subsequentemente clivados com a enzima de restrição tipo IIS, especifica do oligonucleótido que doa os nucleótidos. 0 efeito prático de tal ciclo de ligação/restrição é a adição de um pequeno número de pares de bases (tipicamente, entre uma e cinco) ao oligonucleótido de iniciação. Este processo é então, repetido até a síntese do bloco de elongação desejado estar completa.

Numa segunda fase da reacção, a denominada transposição, esses os blocos de elongação que são adjacentes no ácido nucleico a sintetizar, são ligados aos pares depois de cada bloco ter sido clivados com uma enzima de restrição tipo IIS diferente. Repetindo este procedimento várias vezes o comprimento dos produtos intermédios de transposição duplicam em cada etapa enquanto o número de reacções é reduzido a metade. Assim, uma molécula de ácido nucleico definida pode ser gerada em muito poucos ciclos. A vantagem deste método reside na montagem combinada em pares dos fragmentos da molécula de ácido nucleico a ser sintetizada e de forma independente da sequência. Qualquer bloco de elongação desejado pode assim ser gerado a partir de uma biblioteca de ácidos nucleicos padronizada com um número definido de elementos. 0 número de elementos de tal biblioteca depende do comprimento das cadeias suspensas geradas pelo tipo individual de enzima de restrição IIS bem como, do número de nucleótidos que são adicionados aos oligonucleótidos em desenvolvimento em cada ciclo de elongação.

Este método oferece várias vantagens: pode ser completamente automatizado uma vez que não é necessário sintetizar e purificar novos oligonucleótidos para construir genes ou fragmentos de ADN maiores, os blocos de construção são preparados em grande escala e podem ser usados para muitas montar muitas construções diferentes até ao fornecimento inicial ser usado reduzindo assim, o custo 7 de oligonucleótidos numa ou duas ordens de magnitude.

Em várias áreas como a da enzimologia e da terapêutica com base em anticorpos, no entanto, há necessidade de optimizar as respectivas proteínas, isto é, enzimas e anticorpos, respectivamente. Tipicamente, tal optimização faz-se alterando a sequência de aminoácidos dessas proteínas. No caso as ditas proteínas são produtos de tradução de uma molécula de ácido nucleico, essa molécula de ácido nucleico codificante pode estar sujeita a esse processo de optimização em termos de alteração da sequência de ácidos nucleicos. No estado da técnica, são descritas várias abordagens para manipular a sequência de aminoácidos dessa proteína e a sequência de ácidos nucleicos, respectivamente, que codifica essa proteína. No entanto, mutar a sequência de tipo selvagem não é geralmente suficiente para conseguir uma proteína optimizada. Em vez disso, um conjunto de sequências mutadas que providenciem um conjunto de sequências de aminoácidos mutados e daí, proteínas, também referidas como muteínas, são requeridas para que se possa(m) identificar a(s) muteína(s) com a(s) característica(s) desejadas. Esta abordagem mais heurística é ainda promissora e amplamente procurada apesar do aumento de informação disponível sobre a estrutura cristalina das moléculas alvo das proteínas referidas. Ainda assim, o código de acordo com o qual uma sequência de aminoácidos se dobra e a sequência de aminoácidos necessária para gerar uma estrutura proteica tridimensional distinta, ainda pouco se conhecem.

No estado da técnica, essas muteínas geravam-se por mutagénese. À parte da mutagénese aleatória também é realizada mutagénese de locais específicos. Apesar da mutagénese aleatória, por ex., PCR propensa a erros, ser um meio potente que proporciona pelo menos uma variedade de muteínas partindo de uma sequência básica de aminoácidos, tipicamente, a sequência de aminoácidos de tipo selvagem, o 8 o resultado da mutagénese aleatória é pouco previsível. Para além disso, o uso de métodos de mutagénese em local específico dirigidos para controlar o nível de aleatoriedade para posições específicas não é necessariamente adequado para proporcionar uma variedade bem definida dessas muteínas (revisto em Neylon (2004), NAR, 1448-59). Como mínimo, a geração dessa variedade é trabalhosa. Sem dúvida que a geração de uma biblioteca de muteínas com mutações distintas e bem caracterizadas em comparação com o tipo selvagem ou a sequência de partida é o mais desejável pois terá um impacto directo no esforço necessário para identificar os clones com as características desejadas num processo de selecção subsequente. É também, desejável controlar a composição dessas bibliotecas no que concerne à representação relativa de sequências individuais. Dependendo do uso ou da aplicação pretendidos, dita biblioteca pode ter uma distribuição equitativa das várias sequências ou uma distribuição tendenciosa, isto é, uma em que as sequências individuais estão presentes com frequências maiores ou menores. 0 método para síntese de ácidos nucleicos tal como divulgado na Solicitação de Patente Internacional WO 00/75368 pode, certamente, também, ser útil na geração de várias sequências de ácidos nucleicos que serão posteriormente traduzidas nas correspondentes muteínas. Contudo, a respectiva biblioteca terá então, que ser gerada agrupando as sequências de ácido nucleico individuais ou sequências de aminoácidos individuais. Este procedimento, embora fornecendo as sequências de ácidos nucleicos e sequências de aminoácidos especificas, é dispendioso, reduz a produtividade global do processo e exige um grande número de etapas de reacção. Adicionalmente, quando se combinam as várias sequências de aminoácidos e sequências de ácidos nucleicos, respectivamente, de novo uma tendência 9 indesejável das sequências individuais pode ocorrer.

Consequentemente, há a necessidade de, nesta matéria, fornecer um método de preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos compreendendo um conjunto de elementos onde os elementos difiram em, pelo menos, uma posição que pode ser um único nucleótido, mas pode ser, no caso de um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos, um triplete de nucleótidos que codifiquem um aminoácido, pelo qual o aminoácido assim codificado seja diferente em pelo menos, alguns dos elementos. Mais especificamente, há necessidade, nesta matéria, de fornecer um método de preparação desse tipo de biblioteca, em que a biblioteca de ácidos nucleicos tenha uma distribuição distinta dos vários elementos individuais dessa biblioteca de ácidos nucleicos em termos de frequência.

Este e outros problemas são resolvidos nos temas tratados pelas reivindicações independentes. As formas de realização preferidas devem ser tomadas das reivindicações dependentes.

Mais especificamente, num primeiro aspecto, o problema subjacente ao presente depósito de patente é resolvido por um método de preparação de biblioteca de ácidos nucleicos compreendendo uma pluralidade de elementos, onde cada elemento da biblioteca de ácidos nucleicos mencionada compreende uma primeira extensão de nucleótidos, uma segunda extensão de nucleótidos e uma terceira extensão de nucleótidos, em que a sequência da primeira extensão de nucleótidos e da terceira extensão de nucleótidos são idênticas em cada elemento da biblioteca de ácidos nucleicos e os elementos da biblioteca de ácidos nucleicos diferem na sequência da segunda extensão de nucleótidos, sendo que o método compreende as etapas seguintes: a) Fornecer um primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia 10 dupla contendo uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples fornece uma sequência de nucleótidos correspondente às sequências da primeira ou da terceira extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos, em que o oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um primeiro tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento, b) Fornecer uma primeira biblioteca de oligonucleótidos compreendendo diversos membros, em que cada membro é um segundo oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla, em que o segundo oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um segundo tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento, e uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples, ou parte desta, é a mesma que para os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos e em que essa protrusão de cadeia simples é essencialmente complementar à protrusão de cadeia simples do primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente, de cadeia dupla cuja estrutura da cadeia dupla compreende uma extensão de nucleótidos sendo que os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos diferem na sequência da dita extensão de nucleótidos e a sequência da dita extensão de nucleótidos dos membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos corresponde à sequência, ou parte desta, da segunda extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos, c) Combinar o primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla e a primeira biblioteca de oligonucleótidos e ligar uma molécula do primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla com uma molécula de cada membro da primeira biblioteca de oligonucleótidos por meio das suas protrusões de cadeia 11 simples, formando assim um primeiro produto de ligação, d) Cortar o primeiro produto de ligação com o referido segundo tipo de enzima de restrição IIS, em que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do membro da primeira biblioteca de oligonucleótidos, em que essa clivagem fornece um conjunto de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e segundos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e) Retirar os segundos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, f) Fornecer uma segunda biblioteca de oligonucleótidos que compreenda vários membros, em que cada membro é um terceiro oligonucleótido pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla em que o terceiro oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um terceiro tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento, e uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples, ou parte desta, difere dos membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos e em que essas protrusões de cadeia simples ou parte dessas, do terceiro oligonucleótido são essencialmente complementares às protrusões de cadeia simples dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e em que os membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos compreendem uma extensão de nucleótidos na estrutura de cadeia dupla que é idêntica em todos os membros e corresponde à sequência, ou parte desta, da terceira ou primeira extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos, g) Combinar o conjunto dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e a segunda biblioteca de oligonucleótidos e ligar cada molécula do conjunto dos primeiros oligonucleótidos 12 alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, a uma molécula de cada um dos membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos, em que a protrusão de cadeia simples do primeiro oligonucleótido alongado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é essencialmente complementar à cadeia suspensa do terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, após o que é formado um segundo produto de ligação, h) Cortar o segundo produto de ligação com o terceiro tipo de enzima de restrição IIS, sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos dos terceiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, originando um conjunto de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e de terceiros oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, i) Retirar os terceiros oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, j) Fornecer um quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla, com uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples fornece uma sequência de nucleótidos essencialmente complementar à protrusão de cadeia simples do segundo oligonucleótido alongado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em que o oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um quarto tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento, k) Combinar o quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e o conjunto dos segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e ligar uma molécula do quarto oligonucleótido e cada molécula do conjunto dos segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, formando um terceiro produto de ligação, 13 l) Cortar o terceiro produto de ligação com o quarto tipo de enzima de restrição IIS, sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, fornecendo um conjunto de terceiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e um quarto oligonucleótido encurtado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e m) Retirar o quarto oligonucleótido encurtado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla.

Numa forma de realização do primeiro aspecto, o método compreende ainda as etapas de: n) Repetir as etapas j) a m) como atapas ja) a ma), onde o quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, da etapa j) é um outro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, na etapa ja), o terceiro produto de ligação na etapa k) é um produto de ligação adicional na etapa ka) , o conjunto dos terceiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, na etapa 1) é um conjunto de oligonucleótidos alongados adicionais, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, na etapa la), e o quarto oligonucleótido encurtado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, da etapa 1) é um oligonucleótido encurtado adicional, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, na etapa la).

Numa forma de realização do primeiro aspecto, após a etapa de ligação ka) o produto de ligação adicional é clivado sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do oligonucleótido alongado adicional, pelo menos parcialmente de cadeia dupla.

Num segundo aspecto, o problema subjacente ao presente depósito de patente é resolvido por um método de preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos compreendendo um conjunto de elementos, de onde cada elemento da biblioteca mencionada compreende uma primeira 14 extensão de nucleótidos, uma segunda extensão de nucleótidos e uma terceira extensão de nucleótidos, em que as sequências da primeira extensão de nucleótidos e da terceira extensão de nucleótidos são idênticas em cada elemento da biblioteca de ácidos nucleicos e em que os elementos da biblioteca de ácido nucleicos diferem na sequência da segunda extensão de nucleótidos, sendo que o método compreende as etapas seguintes: a) Fornecer um primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla que tem uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples fornece uma sequência de nucleótidos correspondente à sequência da primeira ou da terceira extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos, em que o oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para o primeiro tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento, b) Fornecer uma primeira biblioteca de oligonucleótidos compreendendo diversos membros, em que cada membro é um segundo oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla, em que o segundo oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um segundo tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento, e uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples, ou parte desta, é a mesma que para os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos e em que essa protrusão de cadeia simples é essencialmente complementar à protrusão de cadeia simples do primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente, de cadeia dupla em que a estrutura da cadeia dupla compreende uma extensão de nucleótidos sendo que os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos diferem na sequência da dita extensão de nucleótidos e a dita extensão 15 de nucleótidos dos membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos corresponde à sequência, ou parte desta, da segunda extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos, c) Combinar o primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla e a primeira biblioteca de oligonucleótidos e ligar uma molécula do primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla com uma molécula de cada membro da primeira biblioteca de oligonucleótidos por meio das suas protrusões de cadeia simples, formando assim um primeiro produto de ligação, d) Cortar o primeiro produto de ligação com o referido segundo tipo de enzima de restrição IIS, sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do membro da primeira biblioteca de oligonucleótidos, em que essa clivagem fornece um conjunto de primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e segundos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em que esse conjunto de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, consiste em várias espécies de moléculas que diferem na sequência da protrusão de cadeia simples, e) Retirar os segundos oligonucleótidos de pelo menos, cadeia dupla parcial encurtados, f) Fornecer uma segunda biblioteca de oligonucleótidos compreendendo vários subgrupos de oligonucleótidos e cada subgrupo compreendendo vários membros, em que cada membro é um terceiro oligonucleótido, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla, em que o terceiro oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um terceiro tipo de enzima de restrição IIS, que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento, e uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples, ou parte desta, é diferente para os vários subgrupos de oligonucleótidos da 16 segunda biblioteca de oligonucleótidos e em que a protrusão de cadeia simples, ou parte desta, de cada subgrupo da segunda biblioteca de oligonucleótidos é essencialmente complementar à protrusão de cadeia simples de cada espécie de moléculas dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e em que os membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos compreendem uma extensão de nucleótidos na estrutura de cadeia dupla que é diferente nos membros de cada subgrupo da segunda biblioteca de oligonucleótidos e corresponde à sequência, ou parte desta, da segunda extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos, g) Combinar o conjunto dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e a segunda biblioteca de oligonucleótidos e ligar cada molécula do conjunto dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com cada molécula dos membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos, sendo que essas moléculas estão ligadas e as suas protrusões de cadeia simples são essencialmente complementares entre si, formando-se por conseguinte, segundos produtos de ligação, h) Cortar os segundos produtos de ligação com o terceiro tipo de enzima de restrição IIS, sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, originando um conjunto de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e de terceiros oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em que esse conjunto de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, consiste em vários subgrupos que diferem nas suas protrusões de cadeia simples, i) Retirar os terceiros oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, 17 j) Fornecer uma terceira biblioteca de oligonucleótidos compreendendo vários membros, em que cada membro é um quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla com uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples fornece uma sequência de nucleótidos essencialmente complementar às protrusões de cadeia simples dos segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e uma extensão, preferencialmente, adjacente à referida cadeia suspensa que é idêntica nos vários membros e gera a terceira ou primeira extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos, sendo que os membros da terceira biblioteca de oligonucleótidos diferem suas protrusões de cadeia simples e as cadeias suspensas correspondem à segunda extensão, ou parte desta, da biblioteca de ácidos nucleicos, onde os oligonucleótidos compreendem um local de reconhecimento, ou parte deste, para um quarto tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento, k) Combinar o conjunto de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e a terceira biblioteca de oligonucleótidos e ligar cada molécula dos membros da terceira biblioteca de oligonucleótidos com cada molécula do conjunto dos segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, sendo que essas moléculas estão ligadas e as suas protrusões de cadeia simples são essencialmente complementares entre si, após o que é formado um terceiro produto de ligação; l) Cortar o terceiro produto de ligação com o tipo de enzima de restrição IIS, sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do membro da terceira biblioteca de oligonucleótidos, originando um conjunto de terceiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e quartos oligonucleótidos 18 encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, m) Opcionalmente, retirar os quartos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, n) Fornecer um quinto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla com uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples fornece uma sequência de nucleótidos essencialmente complementar à protrusão de cadeia simples do conjunto de terceiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em que o quinto oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um quinto tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento, o) Combinar o conjunto dos terceiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e a quarta biblioteca de oligonucleótidos e ligando cada molécula do conjunto dos terceiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma molécula do quinto oligonucleótido pelo menos de cadeia dupla, após o que é formado um quarto produto de ligação; p) Cortar o quarto produto de ligação com o quinto tipo de enzima de restrição IIS, sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do quinto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, originando um conjunto de quartos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e o quinto oligonucleótido encurtado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, q) Opcionalmente, retirar o quinto oligonucleótido encurtado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla.

Numa forma de realização do segundo aspecto, o método compreende ainda as etapas de: r) Repetir as etapas n) a q) como etapas na) a qa), em que o quinto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de 19 cadeia dupla, da etapa n) é um oligonucleótido adicional pelo menos, de cadeia dupla, na etapa na) , em que o quarto produto de ligação na etapa o) é um produto de ligação adicional na etapa oa) , o conjunto dos quartos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, na etapa p) é um conjunto de oligonucleótidos alongados adicionais, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, na etapa pa), e o quinto oligonucleótido encurtado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, da etapa p) é um oligonucleótido encurtado adicional, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, na etapa pa).

Numa forma de realização do segundo aspecto, após a etapa de ligação oa) o produto de ligação adicional é clivado sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do oligonucleótido alongado adicional, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla.

Numa forma de realização do primeiro e segundo aspecto, o primeiro tipo de enzima de restrição IIS é seleccionado do grupo compreendendo Bpil, Bbsl, Esp3l, BsmBI, Eco31I, Bsal, BfuAI, Fokl, BseRI, Bbvl e Bsgl.

Numa forma de realização do primeiro e segundo aspecto, o segundo, terceiro, quarto, quinto e qualquer tipo adicional de enzima de restrição IIS é seleccionado individualmente do grupo compreendendo EarI, Eamll04I, SapI. LguI, Ksp632I e BspQI.

Numa forma de realização do primeiro e segundo aspecto, o ácido nucleico é de cadeia simples e o comprimento da segunda extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos consiste em dois nucleótidos, três nucleótidos, quatro nucleótidos, cinco nucleótidos, seis nucleótidos, sete nucleótidos, oito nucleótidos ou múltiplos de três nucleótidos.

Numa forma de realização do primeiro e segundo aspecto, o ácido nucleico é de cadeia dupla e o comprimento da segunda extensão de nucleótidos dos elementos da 20 biblioteca de ácidos nucleicos consiste em dois nucleótidos, três nucleótidos, quatro nucleótidos, cinco nucleótidos, seis nucleótidos, sete nucleótidos, oito nucleótidos ou múltiplos de três nucleótidos.

Numa forma de realização do primeiro e segundo aspecto, a segunda extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos codifica um ou vários aminoácidos.

Numa forma de realização do primeiro e segundo aspecto, o segundo oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, o terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, o quarto oligonucleótido, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, o quinto e qualquer oligonucleótido adicional, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, compreende uma modificação, sendo que essa modificação permite a imobilização do oligonucleótido numa superfície.

Numa forma de realização do primeiro e segundo aspecto, a modificação é seleccionada do grupo compreendendo um resíduo de biotina, um resíduo de digoxigenina, um resíduo de isocianato de fluoresceína, um composto de amino ou um sucinil-éster.

Numa forma de realização do primeiro e segundo aspecto, a biblioteca de ácidos nucleicos é uma biblioteca de moléculas de ácidos nucleicos que codificam um ácido nucleico funcional, onde esse ácido nucleico é seleccionado do grupo compreendendo aptâmeros, promotores, ribossomas e moléculas mediadoras de RNAi.

Numa forma de realização do primeiro e segundo aspecto, a biblioteca de ácidos nucleicos é uma biblioteca de moléculas de ácidos nucleicos que codifica um péptido, polipéptido ou proteína.

Numa forma de realização do primeiro e segundo aspecto, o péptido, polipéptido e proteína são seleccionados do grupo compreendendo aptâmeros peptídicos, 21 enzimas, enzimas de restrição, domínios de ligação ao ADN, vacinas, anticorpos, proteínas farmaceuticamente activas, anticalinas, "DARPins", nanocorpos e "AdNectines".

Numa forma de realização do primeiro e segundo aspecto, a biblioteca de ácidos nucleicos é uma biblioteca de moléculas de ácidos nucleicos que codifica um polipéptido, em que o polipéptido é um suporte que compreende uma ou várias regiões constantes, uma ou várias regiões variáveis, e em que uma ou várias dessas regiões variáveis é/são codificada(s) pela sequência da segunda extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos.

Numa forma de realização do primeiro e segundo aspecto, a segunda extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos é a única diferença entre os elementos referidos.

Num terceiro aspecto, o problema subjacente ao presente depósito de patente é resolvido por uma biblioteca de ácidos nucleicos que pode ser obtidas por um método de acordo com com o primeiro e/ou segundo aspecto.

Numa forma de realização do terceiro aspecto os membros da biblioteca diferem numa posição de nucleótido, em que essa posição de nucleótido compreende, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5 e 6 nucleótidos.

Num quarto aspecto, o problema subjacente ao presente depósito de patente é resolvido por um método de fabrico de uma biblioteca de moléculas de ácidos nucleicos, no qual a biblioteca de moléculas nucleicas compreende um conjunto de elementos, em que os elementos compreendem, pelo menos, uma extensão constante e, pelo menos, uma extensão variável, em que, a pelo menos uma extensão constante compreende uma sequência de nucleótidos, que é a mesma em todos os elementos, e a pelo menos uma extensão variável compreende uma sequência de nucleótidos que difere em todos os elementos, sendo que o método compreende as 22 etapas seguintes: a) Fornecer um primeiro oligonucleótido, em que o primeiro oligonucleótido ou é um oligonucleótido, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, com uma protrusão de cadeia simples que compreende um local de reconhecimento para um primeiro tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior da sua sequência de reconhecimento, ou uma biblioteca de ácidos nucleicos compreendendo um conjunto de elementos, em que a biblioteca de ácidos nucleicos é uma biblioteca de ácidos nucleicos de acordo com o primeiro, segundo e/ou terceiro aspecto e os elementos da biblioteca de ácidos nucleicos têm uma protrusão de cadeia simples, e os elementos do biblioteca de ácidos nucleicos compreendem um local de reconhecimento para um primeiro tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior da sua sequência de reconhecimento; b) Fornecer um segundo oligonucleótido, em que esse segundo oligonucleótido é uma biblioteca ácidos nucleicos compreendendo um conjunto de elementos, em que a biblioteca de ácidos nucleicos é uma biblioteca de ácidos nucleicos de acordo com qualquer do primeiro, segundo e/ou terceiro aspecto e os elementos da biblioteca de ácidos nucleicos têm uma protrusão de cadeia simples que é, pelo menos, parcialmente complementar à protrusão de cadeia simples do oligonucleótido fornecido na etapa a) , os elementos da biblioteca de ácidos nucleicos compreendem um local de reconhecimento para um segundo tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior da sua sequência de reconhecimento, em que o segundo tipo de enzima de restrição IIS dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos é diferente do primeiro tipo de enzima de restrição IIS do oligonucleótido fornecido na etapa a); c) Combinar os oligonucleótidos da etapa a) e da etapa b) e ligar uma molécula do oligonucleótido da etapa a) com cada molécula de cada elemento da biblioteca de ácidos 23 nucleicos da etapa b) por meio das suas protrusões de cadeia simples com a condição de que o oligonucleótido da etapa a) seja diferente da biblioteca de ácidos nucleicos de acordo com qualquer dos primeiro, segundo e/ou terceiro aspectos; ou combinar os oligonucleótidos da etapa a) e da etapa b) e ligar cada molécula de cada elemento da biblioteca de ácidos nucleicos da etapa a) com cada molécula de cada elemento de uma biblioteca de ácidos nucleicos da etapa b) por meio das suas protrusões de cadeia simples com a condição de que o oligonucleótido da etapa a) seja uma biblioteca ácidos nucleicos de acordo com qualquer dos primeiro, segundo e/ou terceiro aspectos; d) Opcionalmente, retirar reagentes e enzimas que não tenham reagido, e) Clivar o produto de ligação da etapa c) com um tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior da sua sequência de reconhecimento, em que a clivagem ocorre no oligonucleótido da etapa a) ou na etapa b) fornecendo uma biblioteca de moléculas de ácido nucleico estendidas; e f) Opcionalmente, separar as moléculas de ácido nucleico estendidas da mistura de reacção.

Numa forma de realização do quarto aspecto as etapas a) a f) são repetidas, com a condição de que o oligonucleótido da etapa a) seja um quarto oligonucleótido que, ou seja a biblioteca de moléculas de ácido nucleico estendidas, fornecidas na etapa e) , ou um quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma protrusão de cadeia simples que compreende um local de reconhecimento para um quarto tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior da sua sequência de reconhecimento; o oligonucleótido da etapa b) é um terceiro oligonucleótido que é uma biblioteca de moléculas de ácido nucleico estendidas, fornecidas na etapa e), onde o terceiro e o quarto oligonucleótido compreendem, cada um, uma protrusão de cadeia simples e em que ambas as cadeias suspensas são, pelo menos, parcialmente complementares entre si; ao combinar os oligonucleótidos da etapa a) e da etapa b) e ligar uma molécula do oligonucleótido da etapa a) com cada molécula de cada elemento da biblioteca de ácidos nucleicos da etapa b) por meio das suas protrusões de cadeia simples, o oligonucleótido da etapa a) é diferente da biblioteca de moléculas de ácido nucleico estendidas da etapa b); ou ao combinar os oligonucleótidos da etapa a) e da etapa b) e ligar cada molécula de cada elemento de uma biblioteca de ácidos nucleicos da etapa a) com cada molécula de cada elemento de uma biblioteca de ácidos nucleicos da etapa b), por meio das suas protrusões de cadeia simples, o oligonucleótido da etapa a) é a biblioteca de moléculas de ácido nucleico estendidas da etapa b) ; e em que na etapa e) uma biblioteca adicional de moléculas de ácido nucleico estendidas é obtida.

Numa forma de realização do quarto aspecto a extensão variável, ou parte desta, é fornecida pela segunda extensão dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos de acordo com qualquer dos primeiro, segundo e/ou terceiro aspectos. Numa forma de realização do quarto aspecto a extensão constante, ou parte desta, é fornecida pela primeira e/ou terceira extensão dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos, como descrito em qualquer dos primeiro, segundo e/ou terceiro aspectos.

Numa forma de realização do primeiro, segundo e/ou terceiro aspecto, a proporção dos vários elementos e membros das bibliotecas usadas em qualquer desses métodos é equimolar.

Numa forma de realização do primeiro, segundo e/ou terceiro aspecto, a proporção dos vários elementos e membros das bibliotecas usadas em qualquer desses métodos é não equimolar ou tendenciosa.

Os presentes inventores concluíram, surpreendentemente, que é possível usar o método, descrito 25 na Solicitação de Patente Internacional WO 00/75368, para a preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos compreendendo um conjunto de elementos, em que os vários elementos, ou moléculas de ácidos nucleicos, diferem, de forma controlada, numa ou mais posições nucleotídicas distintas. Preferencialmente, a biblioteca tem uma composição definida, isto é, os elementos individuais da biblioteca, isto é, as várias sequências de ácidos nucleicos estão contidas na biblioteca com uma frequência definida e, preferencialmente, controlada. Entenda-se que a sequência individual de ácidos nucleicos, também aqui referida como um elemento da biblioteca de ácidos nucleicos, como espécie de ácido nucleico, está presente pelo menos uma vez na biblioteca, preferencialmente, presente várias vezes.

Até agora, os presentes inventores afastaram-se do conceito básico subjacente ao método descrito na Solicitação de Patente Internacional WO 00/75368 que fornece, explicitamente, uma única e definida sequência de ácidos nucleicos e, como tal, uma sequência de aminoácidos definida se essa sequência de ácidos nucleicos for uma sequência de ácidos nucleicos de codificação, o que será o caso preferencial. Dada a meticulosidade do método referido, não era óbvio, para os presentes inventores, usá-lo e modifica-lo de modo a obter uma biblioteca de ácidos nucleicos, tal como aqui definida. É mérito dos presentes inventores que tenham modificado o método, como descrito na Solicitação de Patente Internacional WO 00/75368, de forma a preparar uma biblioteca de ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, com as vantagens inerentes ao método da WO 00/75368 reflectidas no método da presente invenção, até agora, uma vez que as sequências individuais, isto é, os elementos individuais da biblioteca se conseguem com a meticulosidade exigida embora simultaneamente, se oferece uma composição da biblioteca que é bem definida e 26 efectivamente, controlada em termos de frequência com que os elementos individuais e, mais especificamente, as espécies individuais de ácidos nucleicos estão presentes na referida biblioteca. Até agora, apesar de fornecer uma diversidade de sequências que se reflectem numa biblioteca de ácidos nucleicos compreendendo um conjunto de elementos, o método, de acordo com a presente invenção, fornece as vantagens inerentes à Solicitação de Patente Internacional WO 00/75368 em termos de qualidade, produtividade e fiabilidade das sequências de ácidos nucleicos a sintetizar. O método, de acordo com a presente invenção, é utilizado vantajosamente para o desenho de proteínas e, mais especificamente, para a optimização de proteínas através da selecção de uma espécie de proteína optimizada de uma variedade de muteínas. O campo de uso de tais bibliotecas e muteinas, respectivamente, é o das enzimas industriais de no campo dos alimentos, da alimentação, dos biocombustíveis e afins, e no fabrico proteínas terapêuticas como anticorpos, nanocorpos, suportes ou moldes, como as anticalinas, "DARPins" e "AdNectines" (revisto em Binz et al. (2005), Nature Biotechnology, 1257-68) e de aptâmeros peptídicos, como, por ex., descrito em Crawford M et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics, Vol. 2, No. 1, 72-79, Abril de 2003. Um campo adicional de utilização é na optimização de vacinas, optimização e produção de compostos biofarmacêuticos, optimização de enzimas de restrição, fabrico de domínios de ligação de ADN específicos e optimização de vias metabólicas. Será, no entanto, reconhecido por especialista na matéria que a aplicação dos métodos, de acordo com a invenção, não está limitada ao referido .

Apesar de ser evidente que a presente invenção é particularmente vantajosa na criação de uma biblioteca de sequências de ácidos nucleicos que codificam uma variedade 27 de proteínas, em que essa variedade de proteínas difere numa ou várias posições de aminoácidos quando comparada com um material de partida que é, preferencialmente, a sequência de tipo selvagem, está dentro da presente invenção que a biblioteca de ácidos nucleicos, preparada de acordo com a presente invenção, pode ser usada para ácidos nucleicos não codificantes. Preferencialmente, esses ácidos nucleicos não codificantes são aptâmeros como, por exemplo, descrito na Patente Europeia EP 0 533 838, promotores, ribozimas, ARN de cadeia simples e de cadeia dupla e construções de RNAi.

Será reconhecido que os produtos de reacção do método, de acordo com a presente invenção, são, tipicamente, produtos de elongação, particularmente, produtos de elongação no sentido da Solicitação de Patente Internacional WO 00/75368, que podem ter usos adicionais, particularmente, usados na segunda fase de reacção, isto é, a denominada de transposição, do método de acordo com a Solicitação de Patente Internacional WO 00/75368. Preferencialmente, o produto de reacção fornecido pelo método, de acordo com a presente invenção, é um elemento de um par de moléculas de ácidos nucleicos que é usado em pares e essas moléculas de ácidos nucleicos diferem, pelo menos, numa protrusão de cadeia simples que permite a ligação das duas moléculas mencionadas.

Qualquer dos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, usado em conexão com os métodos, de acordo com o presente depósito de patente, senão explicitamente contrariamente aqui indicado, pode ser formado de um único oligonucleótido, em que sua extensão de cadeia dupla é formada por uma parte do oligonucleótido dobrada para trás sobre outra parte do oligonucleótido, ou ser formado de dois ou mais oligonucleótidos. No último caso, é suficiente que a extensão de cadeia dupla do referido oligonucleótido seja formada, sem correspondência 28 com o número de oligonucleótidos envolvidos na reacção. No entanto, é preferível que esse oligonucleótido seja formado por dois oligonucleótidos emparelhados entre si, preferencialmente através do emparelhamento de bases de Watson-Crick. Também, é do âmbito da presente invenção que esse oligonucleótido seja formado por um oligonucleótido ramificado. Novamente, esse oligonucleótido ramificado é adequado para o uso no método, de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, desde que siga os critérios definidos na etapa a) deste método. 0 oligonucleótido ramificado tanto pode ser gerado juntando um oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e um oligonucleótido de cadeia simples, ou a partir do emparelhamento de bases dos dois ou mais oligonucleótidos de cadeia simples para formar o referido oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com protuberância ou protrusão de cadeia simples. 0 ponto de ramificação é um nucleótido, que se localiza, preferencialmente, na região da ansa, e que tem uma fracção química que permite a acoplagem quimica de um nucleótido adicional ou oligonucleótido. Essas fracções químicas que permitem a ramificação de um oligonucleótido ou um ácido nucleico, respectivamente, são conhecidas dos especialistas na matéria. São exemplos dessas fracções químicas são amino ou carboxi ligadores que podem ser activados com EDC (1-etil-3-(3-dimetilanimopropil)carbodiimida) e NHS (N- hidroxisulfosuccinimida) descritos por Hoare e Koshland jr. (Hoare D G, Koshland D E, Jr. (1967), J. Biol. Chem. 242: 2447 - 2453) e Johnsson et al. (Johnsson B, Lofas S, Lindquist G. (1991), Anal Biochem. 198:268-77.),respectivamente. 0 referido primeiro oligonucleótido da etapa a) é, aqui, também, referido como "iniciador esquerdo", enquanto o primeiro oligonucleótido análogo da etapa b) é também apelidado de "iniciador direito".

Sobre o comprimento das várias cadeias suspensas, 29 como aqui descrito, esse comprimento é, preferencialmente, seleccionado do grupo que compreende uma cadeia suspensa de 1 nucleótido, uma cadeia suspensa de 2 nucleótidos, uma cadeia suspensa de 3 nucleótidos, uma cadeia suspensa de 4 nucleótidos ou uma cadeia suspensa de 5 nucleótidos. Como regra geral, o comprimento da cadeia suspensa é determinado pela enzima(s) de restrição usada(s) na fase de elongação, isto é, a primeira etapa do método de fabrico de um ácido nucleico. Os nucleótidos da protrusão de cadeia simples juntamente com os nucleótidos adjacentes distais ao local de clivagem da enzima de restrição especifica para o segundo oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, conformam os nucleótidos que são transferidos em cada etapa de elongação. 0 número de nucleótidos transferidos determina, por sua vez, o tamanho da biblioteca de oligonucleótidos necessário para construir todas as sequências possíveis. Por exemplo, se seis nucleótidos forem transferidos em cada etapa, então, será necessária uma biblioteca de 46 = 4096 oligonucleótidos diferentes para representar todas as possíveis permutações de hexâmeros. Será reconhecido que a cadeia suspensa, particularmente, preferida em relação aos métodos da presente invenção consiste em 3 nucleótidos, em que esses 3 nucleótidos codificam um aminoácido.

Numa forma de realização, a modificação dos oligonucleótidos usados em conexão com o método de acordo com a presente invenção, é um elemento de um par de interacções especifico tal como, a biotina e avidina, estreptavidina, extravidina e qualquer mutante ou derivado do mesmo, incluindo os locais de ligação artificiais da biotina. Pares específicos adicionais de interacção incluem, mas não estão limitados a, anticorpos FITC e anti-FITC (Serke S, Pachmann K (1988), J Immunol Methods. 112(2):207-11) e anticorpos digoxigenina e anti-digoxigenina (Kessler C, Holtke HJ, Seibl R, Burg J, 30

Muhlegger K. (1990), Biol Chem Hoppe Seyler. 371(10):917-27) .

Será também, reconhecido por um especialista na matéria que tal modificação pode ser um nucleótido ou sequência de nucleótidos que permite uma imobilização especifica a uma superfície.

Em conexão com o tipo de enzimas de restrição IIS, as combinações seguintes são, em princípio, adequadas para levar a cabo presente invenção.

Um grupo do tipo de enzimas de restrição IIS que é, preferencialmente, usado como primeiro tipo de enzima de restrição IIS em conexão com os métodos da presente invenção, compreende as seguintes enzimas: Bpil, Bbsl, Esp3l, BsmBI, Eco31I, Bsal, BfuAI, Fokl, BseRI, Bbvl e Bsgl.

Outro grupo do tipo de enzimas de restrição IIS que é, preferencialmente, usado como segundo, terceiro, quarto, quinto ou tipo de enzima de restrição IIS subsequente, em conexão com os métodos da presente invenção, compreende as seguintes enzimas: EarI, Earsll04I, SapI. LguI, Ksp632l e BspQI. Em conexão com este grupo, a enzima de restrição 11041 é particularmente, preferida. A presente invenção é agora melhor ilustrada referindo as figuras anexas das quais características, formas de realização e vantagens adicionais podem ser retiradas. A Fig. 1 mostra uma ilustração do método para a preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, sendo que os membros da biblioteca de ácidos nucleicos diferem numa posição da sequência e essa posição fornece um aminoácido diferente aquando da tradução; A Fig. 2 mostra uma ilustração do método para a preparação da biblioteca de ácidos nucleicos de acordo com 31 o segundo aspecto da presente invenção, sendo que os membros da biblioteca de ácidos nucleicos diferem numa posição da sequência e essa posição compreende dois tripletos consecutivos de nucleótidos cada um codificando um aminoácido; A Fig. 3 mostra uma ilustração do método para a preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, sendo que os membros da biblioteca de ácidos nucleicos diferem numa posição da sequência e essa posição fornece diferentes aminoácidos aquando da tradução, em que a posição variável é uma posição terminal; A Fig. 4 mostra uma ilustração do método para a preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos de acordo com o segundo aspecto da presente invenção, sendo que os membros da biblioteca de ácidos nucleicos diferem em duas posições da sequência e essas duas posições fornecem dois aminoácidos diferentes aquando da tradução, em que as posições variáveis são duas posições terminais consecutivas; A Fig. 5 é um histograma indicando as frequências de codões obtidos na síntese de uma biblioteca de ácidos nucleicos usando o método de acordo com o primeiro aspecto do presente depósito de patente; A Fig. 6 é um histograma indicando as frequências de codões, em duas posições consecutivas, obtidos na síntese de uma biblioteca de ácidos nucleicos usando o método de acordo com o segundo aspecto do presente depósito de patente; A Fig. 7 é um histograma indicando as frequências de codões, numa posição variável, com distribuição igual dos codões, obtidos na síntese de uma biblioteca de ácidos nucleicos usando o método de acordo com o primeiro aspecto do presente depósito de patente; e A Fig. 8 é um histograma indicando as frequências de 32 codões numa posição variável com distribuição desigual dos codões, obtidos na síntese de uma biblioteca de ácidos nucleicos, usando o método de acordo com o primeiro aspecto do presente depósito de patente.

Será reconhecido por um especialista na matéria que o seguinte é uma descrição dos métodos de acordo com a presente invenção de preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos compreendendo um conjunto de elementos, em que apenas as etapas essenciais são descrito mais detalhadamente. Detalhes adicionais para a realização do método de acordo com a presente invenção são óbvios para um especialista na matéria perante a divulgação do presente depósito de patente e dos princípios de reacção subjacentes que se baseiam no método tal como definido na Solicitação de Patente Internacional WO 00/75368. Método de preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos como ilustrado na Fig. 1 O método da presente invenção é descrito em relação à síntese de uma sequência alvo que é representada na Fig. 1. Essa sequência alvo compreende quatro tripletos, em que, lendo da esquerda para a direita, que é, tipicamente, na direcção 5' -> 3', o segundo trio é variado, tanto ao nível dos ácidos nucleicos bem como, e em particular, ao nível do aminoácido. Os primeiro, terceiro e quarto tripletos são os mesmos para os vários elementos da biblioteca de ácidos nucleicos a ser preparada, assim como são, preferencialmente, os outros nucleótidos, não especificamente representados, e preferencialmente, tripletos e, como tal, sequência (s) de aminoácidos a ser sintetizada(s) de acordo com o método de acordo com a presente invenção. A biblioteca de ácidos nucleicos, de acordo com a 33 presente invenção, compreende um conjunto de elementos, em que cada elemento da referida biblioteca de ácidos nucleicos compreende uma primeira extensão de nucleótidos, que corresponde ao primeiro tripleto, uma segunda extensão de nucleótidos que corresponde ao segundo tripleto e uma terceira extensão de nucleótidos que corresponde ao terceiro e quarto tripleto. As sequências da primeira extensão de nucleótidos e da terceira extensão de nucleótidos são idênticas em cada elemento de uma biblioteca de ácidos nucleicos e os elementos de uma biblioteca de ácidos nucleicos diferem na sequência da segunda extensão de nucleótidos. Na sequência alvo, a primeira extensão é então, uma extensão que compreende CAC, e a terceira extensão é uma extensão que compreende os dois tripletos, GAG e ACA. A segunda extensão é, de forma concordante, aquela que compreende tanto, ATG, TAT ou GAG. Como frisado acima, os elementos de uma biblioteca de ácidos nucleicos diferem, pelo menos, no que respeita à segunda extensão. De forma concordante, numa forma de realização preferida, a biblioteca, de acordo com a presente invenção, compreende três elementos, com o primeiro elemento compreendendo a sequência CACATGGAGACA, o segundo elemento compreendendo a sequência CACTATGAGACA, e o terceiro elemento compreendendo a sequência de ácidos nucleicos CACGAGGAGACA. Será, no entanto, entendido que a segunda extensão pode compreender tripletos alternativos adicionais que se somam à complexidade da biblioteca de ácidos nucleicos.

Na etapa 1, é fornecido um primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla. Esse oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, tem uma protrusão de cadeia simples e é, aqui, também, referido como "splinker". A protrusão de cadeia simples fornece uma sequência de nucleótidos correspondendo a uma sequência da 34 primeira ou da terceira extensão de nucleótidos, ou parte desta, dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos. Se a protrusão de cadeia simples corresponder a uma porção da primeira ou terceira extensão, tal correspondência dá-se, preferencialmente, com a parte ou partes terminais da primeira e da terceira extensão, respectivamente. Como preferencialmente, aqui utilizada, a expressão de que as sequências correspondem uma à outra significa que as sequências são complementares uma da outra, emparelhando-se, preferencialmente, segundo o emparelhamento de Watson-Crick, as sequências são complementares uma da outra, preferencialmente completamente complementares, isto é, encaixam-se perfeitamente. Numa forma de realização preferida, o oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um primeiro tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento. No presente caso, esse primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, tem uma protrusão de cadeia simples que compreende GTG e assim, é complementar ao primeiro tripleto e,assim, à primeira extensão da sequência alvo. 0 primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, consiste na representação ilustrada na Fig. 1 (1) de um único oligonucleótido que é formado por uma parte desse oligonucleótido único dobrando-se para trás em direcção a outra parte do oligonucleótido formando, assim, uma ansa. No entanto, também, é do âmbito da presente invenção que o oligonucleótido, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, seja formado por dois oligonucleótidos, de cadeia simples, separados, cujas bases se emparelham entre os dois gerando esse oligonucleótido, pelo menos, parcialmente, e a protrusão de cadeia simples supradescrita. Numa forma de realização preferida, a terminação desse último oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, que não fornece a protrusão de cadeia simples exigida para 35 a ligação é bloqueada para evitar qualquer ligação ou reacção, potencialmente, possível, nas etapas subsequentes do método, de acordo com a presente invenção.

Na etapa 2, uma primeira biblioteca de oligonucleótidos é fornecida que compreende vários membros. Cada membro dessa primeira biblioteca de oligonucleótidos é, aqui, também, referido como um segundo oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e tem uma estrutura de cadeia dupla. A estrutura de cadeia dupla pode, como quando em conexão com o primeiro oligonucleótido, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, ser formada por duas cadeias simples que tem a modificação adicional, como descrito acima. Os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos compreendem um local de reconhecimento, ou parte deste, para um segundo tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento. Para além disso, esse segundo oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, fornece uma protrusão de cadeia simples. Os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos têm a mesma protrusão de cadeia simples e essa protrusão de cadeia simples é, essencialmente, ou parcialmente, complementar à protrusão de cadeia simples do primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. No presente caso, essa protrusão de cadeia simples é CAC. Subsequentemente à protrusão de cadeia simples, os segundos oligonucleótidos, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, compreendem uma estrutura de cadeia dupla que compreende uma extensão de nucleótidos, sendo que os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos diferem na sequência da referida extensão de nucleótidos e as sequências da referida extensão de nucleótidos correspondem às sequências, ou parte destas, da segunda extensão dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção. De forma concordante, como ilustrado na Fig. 1 (1), uma primeira 36 biblioteca de oligonucleótidos é fornecida, onde a parte de cadeia dupla dos membros subsequentes à protrusão de cadeia simples compreende as várias sequências concernentes à segunda extensão dos nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos. É do âmbito da presente invenção que a estrutura de cadeia dupla compreenda nucleótidos adicionais que, numa forma de realização, pode ou pode não conter nucleótidos adicionais da sequência alvo. No uso especifico ilustrado na Fig. 1, estas sequências são ATG, TAT e GAG cujas bases se emparelham com as suas sequências complementares, isto é, TAC, ATA e CTC (no sentido 3' -> 5') que pode aqui, também, ser representado por ATG/TAC, TAT/ATA e GAG/CTC. Os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos diferem assim, na sequência da referida extensão de nucleótidos e a sequência dessa extensão de nucleótidos dos elementos da primeira biblioteca de nucleótidos correspondem à sequência, ou parte desta, da segunda extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos. De forma concordante, a complexidade de uma biblioteca de ácidos nucleicos a ser preparada, usando o método de acordo com a presente invenção, que no caso da Fig. 1 é de três, isto é, consiste em três elementos diferentes, é reflectida e preferencialmente, realmente, a mesma que a complexidade da primeira biblioteca de oligonucleótidos, que também consiste em três membros diferentes.

Adicionalmente, os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos compreendem uma modificação. Neste caso, tal modificação permite a imobilização dos vários membros numa superfície, tipicamente, uma superfície de um suporte ou um de um transportador. A imobilização é especificamente, mediada por uma interacção entre a modificação e um parceiro de interacção de tal modificação. No presente caso, a modificação é a biotina que interage com a estreptavidina, como sua parceira de interacção, 37 originando um complexo estável que permite a imobilização dos membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos e dos produtos de reacção de qualquer reacção de ligação que os use. Os membros, uma vez que está presente uma modificação, também, são aqui referidos por âncoras ou moléculas âncora.

Na Fig. 1 o local de reconhecimento para o tipo de enzima de restrição IIS dos membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos é indicado por uma caixa preta ilustrando o facto de que, para este tipo de enzima de restrição, o local de reconhecimento é exterior ao local de clivagem.

Na etapa 3, o primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente, de cadeia dupla, e a primeira biblioteca de oligonucleótidos, e os seus despectivos membros, respectivamente, são combinados. Após essa combinação, uma molécula do primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, emparelha-se e é, subsequentemente, ligada a uma molécula de um membro da primeira biblioteca de oligonucleótidos, preferencialmente, por meio de uma ligase ou de actividade de ligase. Essa ligação ocorre após a formação de um primeiro produto de pré-ligação através da hibridação das protrusões de cadeia simples de dois tipos de moléculas, em que as cadeias suspensas funcionam como "sticky ends". 0 produto de reacção da ligação é mencionado por o primeiro produto de ligação. Devido a que a primeira biblioteca de oligonucleótidos compreende vários elementos e espécies, respectivamente, da reacção de ligação origina-se um pool de primeiros produtos de ligação ou um conjunto de primeiros produtos de ligação. Também, neste conjunto de produtos de ligação, que realmente constitui uma biblioteca adicional, os membros diferem, pelo menos, e, preferencialmente, apenas no exemplo presente, na sequência correspondente ao segundo tripleto e, como tal, à segunda 38 extensão da sequência alvo, enquanto, tipicamente, o restante do primeiro produto de ligação, em termos de sequência de nucleótidos, é preferencialmente, o mesmo para os vários elementos da, assim formada, primeira biblioteca de produtos de ligação. 0 conjunto de primeiros produtos de ligação compreende, no presente caso, três produtos de ligação diferentes como é determinado pelo número de diferentes segundos oligonucleótidos, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, que formam a primeira biblioteca de oligonucleótidos. Deve ser reconhecido que no método, de acordo com o primeiro aspecto, o primeiro produto de ligação compreende várias espécies de moléculas que diferem na sua sequência correspondente à segunda extensão da sequência alvo. A variedade das sequências de ácidos nucleicos dessas espécies é fornecida pela primeira biblioteca de oligonucleótidos.

Na etapa 4, os primeiros produtos de ligação são cortados com um tipo de enzima de restrição IIS. 0 local de reconhecimento desse tipo de enzimas de restrição IIS é o fornecido pelos segundos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e é aqui, referido como um segundo tipo de enzima de restrição IIS. 0 corte dos primeiros produtos de ligação é realizado no pool e na biblioteca, respectivamente, consistindo nos primeiros produtos de ligação. De forma concordante, o corte ou clivagem dos primeiros produtos de ligação resulta num conjunto de moléculas assim, cortadas, em que o produto de reacção desse corte é um conjunto de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, consistindo em diferentes espécies de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e numa variedade de segundos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla.

Será reconhecido que o desenrolar das etapas 3 e 39 4, respectivamente, pode ser feito com diferentes condições de reacção em relação à imobilização, ou não, dos membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos consistindo no primeiro produto de ligação da biblioteca, respectivamente. Em cada caso, as respectivas moléculas fornecem uma modificação que, como frisado acima, permite a imobilização das moléculas num suporte que compreende o parceiro de interacção da modificação. De forma concordante, qualquer sequência, em relação a uma etapa de imobilização, pode, em principio, ser realizada em várias formas de realização. De forma concordante, é do âmbito da presente invenção realizar a reacção de ligação a que se refere a etapa 3, numa fase liquida, isto é, com os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos não imobilizados. Subsequentemente, pode ocorrer o corte do primeiro produto de ligação. Numa forma de realização, esse corte é, também, realizado na fase liquida com o primeiro produto de ligação não sendo imobilizado num suporte por meio da sua modificação. Após o corte, o segundo oligonucleótido encurtado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é retirado da mistura de reacção por meio da sua modificação, ligando-se ao suporte. Alternativamente, após a ligação, o primeiro produto de ligação pode ser imobilizado numa superfície e o corte do primeiro produto de ligação é realizado com o primeiro produto de ligação sendo imobilizado nessa superfície. Em qualquer caso, o segundo oligonucleótido encurtado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é, finalmente, retirado da reacção imobilizando-o através da sua modificação num suporte. Será reconhecido que devido à modificação que permite uma interacção específica com o seu parceiro de interacção, como a biotina com a estreptavidina, para efeito de imobilização, a reacção será transferida para um contentor de reacção, preferencialmente, em que as paredes do mesmo, constituem um suporte que contém o parceiro de interacção 40 da modificação, no exemplo presente, sendo a modificação biotina, estreptavidina. Devido à elevada afinidade da biotina e estreptavidina, a ligação da molécula, contendo a modificação, ao suporte ocorre imediatamente. Por outras palavras, se uma reacção, como a reacção de ligação, for realizada com uma molécula tendo tal modificação, o contentor de reacção ou qualquer superfície disponível nessa reacção não deve conter um parceiro de interacção da modificação, enquanto no caso de se pretender imobilização, é usado um contentor de reacção em que a sua superfície fornece o parceiro de interacção da modificação, tanto através do contentor de reacção ou de outras superfícies que existam nessa reacção.

Por outras palavras, numa forma de realização do método, de acordo com o primeiro aspecto, após a formação do produto de ligação, é possível cortar o produto de ligação com o respectivo tipo de enzima de restrição IIS, sendo a sequência de reconhecimento da mesma, fornecida pela respectiva biblioteca de oligonucleótidos ou qualquer oligonucleótido que forneça uma modificação que permita a imobilização do produto de ligação num suporte, em que pelo corte se obtém uma variedade de oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em que o referido oligonucleótido encurtado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é retirado da mistura de reacção por imobilização no suporte mencionado por meio da modificação. Numa forma de realização alternativa, após a formação do produto de ligação, o produto de ligação, referido como o produto de ligação é imobilizado num suporte por meio da modificação e o produto de ligação assim, imobilizado é cortado por um tipo de enzima de restrição IIS sendo a sequência de reconhecimento da mesma, fornecida pela respectiva biblioteca de oligonucleótidos ou qualquer oligonucleótido que forneça uma modificação que 41 permita a imobilização do produto de ligação num suporte, em que pelo corte se obtém uma variedade de oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em que os referidos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, são ligados ou permanecem ligados ao suporte. A etapa 5 da reacção consiste na remoção dos segundos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, que é preferencialmente feita por imobilização do segundo oligonucleótido encurtado, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla.

Devido a esta sequência de reacção, a reacção e preferencialmente, o sobrenadante dessa contém um conjunto de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Numa etapa adicional, que é, tipicamente, a etapa 6, uma segunda biblioteca de oligonucleótidos, que compreende vários membros, é fornecida. Cada membro dessa segunda biblioteca de oligonucleótidos é um terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e compreende uma estrutura de cadeia dupla. A estrutura de cadeia dupla pode ser desenhada, como aqui delineado, em conexão com outros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, como o primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Mais especificamente, o terceiro oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um terceiro tipo de enzima de restrição IIS, que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento, e uma protrusão de cadeia simples. A protrusão de cadeia simples, ou parte desta, é diferente para os membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos. Essas protrusões de cadeia simples, ou parte dessas, da segunda biblioteca de oligonucleótidos, são essencialmente complementares às protrusões de cadeia simples dos 42 primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Será entendido por um especialista na matéria que devido ao mecanismo subjacente ao método da presente invenção, a cadeia suspensa de uma espécie do conjunto dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é complementar a um membro da segunda biblioteca de oligonucleótidos. Será também, reconhecido que as cadeias suspensas das várias espécies do conjunto dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e a cadeia suspensa dos vários membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos, são, se forem consideradas na sua globalidade, complementares uma da outra, no entanto, nem todas as cadeias suspensas dos vários primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, serão complementares a cada cadeia suspensa do membro da segunda biblioteca de oligonucleótidos. A segunda biblioteca de oligonucleótidos fornece assim, as protrusões de cadeia simples de ATG, TAT e GAG, respectivamente. De forma concordante, neste caso, a segunda biblioteca de oligonucleótidos compreende três membros. Os membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos compreendem ainda, uma extensão de nucleótidos na estrutura de cadeia dupla que é idêntica em todos os membros e corresponde à sequência, ou parte desta, da terceira ou primeira extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos. Os membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos compreendem uma modificação, em que tal modificação é, preferencialmente, a mesma, como quando em conexão com a primeira biblioteca de oligonucleótidos.

Na etapa 7, o conjunto dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e a segunda biblioteca de oligonucleótidos, são combinados. Devido à complementaridade das cadeias 43 suspensas, uma molécula de uma espécie do conjunto dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é ligada a uma molécula de um membro da segunda biblioteca de oligonucleótidos. 0 respectivo par de moléculas a ser ligado é definido pela complementaridade das cadeias suspensas definindo um par de reacção. Assim que os dois oligonucleótidos correspondentes, tal como definidos pelas suas protrusões de cadeia simples, forem hibridados ou emparelhados, ocorre ligação, tipicamente. 0 produto de ligação dessa reacção de ligação é denominado de segundo produto de ligação. Neste caso, o segundo produto de ligação compreende um total de três diferentes sequências e, como tal, três diferentes espécies, em que as sequências dessas espécies diferem, pelo menos, e, tipicamente, exclusivamente, na sequência correspondente à segunda extensão da sequência alvo. Os segundos produtos de ligação formam novamente, uma biblioteca.

As próximas etapas, isto é, a etapa 8 que consiste em cortar o segundo produto de ligação com o terceiro tipo de enzima de restrição IIS , sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é, em principio, desenhado da mesma forma, descrita em conexão com o primeiro produto de ligação.

Isto aplica-se particularmente, em relação à potencial sequência de ligação e de corte e de remoção por imobilização, respectivamente. Como resultado da etapa 8 em conexão com o corte do segundo produto de ligação pelo terceiro tipo de enzima de restrição IIS, é fornecida uma variedade de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, que compreende um total de três diferentes espécies de oligonucleótidos, e terceiros oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Novamente, os terceiros 44 oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, então libertos do segundo produto de ligação, são retirados da reacção por uma a modificação e sua interacção com um parceiro de interacção, como a estreptavidina em conexão com a biotina como modificação ligada a uma superfície.

Na etapa 9, um quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é fornecido. 0 quarto oligonucleótido de cadeia dupla tem uma protrusão de cadeia simples e de outra forma, o esquema deste quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, pode ser, numa forma de realização, semelhante às formas de realização descritas em conexão com outros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, descritos em conexão com a Fig. 1. A protrusão de cadeia simples do quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, fornece uma sequência de nucleótidos essencialmente complementar à protrusão de cadeia simples do segundo oligonucleótido alongado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. A cadeia suspensa do segundo oligonucleótido alongado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é a mesma e, como tal, idêntica para as três espécies do segundo oligonucleótido alongado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, uma vez que essa cadeia suspensa corresponde ao primeiro tripleto da terceira extensão. Adicionalmente, o quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um quarto tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento. A protrusão de cadeia simples desse quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é, como ilustrada na Fig. 1 (2), GAG e, como tal, idêntica ao primeiro tripleto da terceira extensão. Esse quarto oligonucleótido e o conjunto dos segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de 45 cadeia dupla, são combinados e ligados. Novamente, uma molécula do quarto oligonucleótido é emparelhada com uma molécula dos segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, devido à complementaridade da cadeia suspensa de ambos oligonucleótidos. As moléculas então, emparelhadas são então ligadas originando um terceiro produto de ligação. Como em conexão com outras reacções, devido à complementaridade das cadeias suspensas, uma reacção uma-a-uma, isto é, uma reacção entre uma molécula de cada espécie de reagente contido na reacção, ocorre. 0 terceiro produto de ligação compreende por fim, a sequência alvo, como ilustrado na Fig. 1 (1) . Esse terceiro produto de ligação pode ser cortado pelo quarto tipo de enzima de restrição IIS, sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do(s) quarto(s) oligonucleótido(s), pelo menos parcialmente de cadeia dupla e fornece uma variedade de terceiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e quartos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Novamente, o esquema da sequência de reacções adicionais pode variar, como delineado em conexão com o primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e a primeira biblioteca de oligonucleótidos.

Como será entendido com respeito às sequências representadas especificamente, na Fig. 1, o tipo de enzima de restrição IIS usado para a clivagem é o fornecido pelas moléculas âncora, isto é, aquelas moléculas que fornecem uma modificação que permite a interacção com um parceiro de interacção e, como tal, a imobilização da molécula incluindo qualquer fracção que possa ter sido adicionada através da ligação ou removida por clivagem. 0 tipo especifico de enzima de restrição IIS inerente a todas as várias sequências âncora usado em conexão com o exemplo descrito na Fig. 1 é Eamll04I. 46

Esse terceiro oligonucleótido alongado, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, pode ser submetido a etapas de reacção adicionais que são também, referidas como etapas de elongação, como frisado acima.

Será também, reconhecido pelas pessoas especialistas na matéria que, alternativamente, a sequência alvo então, obtida e, mais especificamente, o terceiro oligonucleótido alongado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, pode então, ser usada numa etapa de transposição, como descrito em conexão com a Solicitação de Patente Internacional WO 00/75368. Método de preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos como ilustrado na Fig. 2

Em conexão com o método para a preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos, em que os seus elementos contêm uma posição variável consistindo de dois tripletos de nucleótidos subsequentes, a seguinte sequência de etapas é, tipicamente, aplicada. Como ilustrado na Fig. 2 (1), a sequência alvo compreende como primeira extensão, CAC, como segunda extensão, cuja sequência é variável, compreende no exemplo presente, tanto (no sentido 5'-*3') ATGCTC, ATGGAG, ATGTTT, TATGAG, TATCTC, TATTTT, GAGTTT, GAGCTC, ou GAGGAG, uma sequência de ácidos nucleicos que é assim, diferente para cada elemento de uma biblioteca de ácidos nucleicos, mas em qualquer caso, uma sequência definida por uma sequência de nucleótidos conhecida em vez de uma sequência arbitrária e variável, e como terceira extensão, ACA. A segunda extensão variável compreende, no caso ilustrado, uma primeira metade da segunda extensão e uma segunda metade da segunda extensão, em que a primeira metade da segunda extensão exibe um dos seguintes tripletos: ATG, TAT, ou GAG, e a segunda metade da segunda extensão compreende os seguintes diferentes tripletos: CTC, GAG, ou TTT. A particularidade deste aspecto do método da 47 presente invenção é que a primeira metade da segunda extensão e a segunda metade da segunda extensão são fornecidas ou incorporadas no ácido nucleico em diferentes etapas de reacção. Será reconhecido que o comprimento da primeira metade da segunda extensão e da segunda metade da segunda extensão pode variar, dependendo das caracteristicas do corte do tipo de enzimas de restrição IIS usado. É particularmente, preferido se o comprimento, de cada, primeira metade e segunda metade consistir em três nucleótidos consecutivos que codificam um aminoácido.

Numa primeira etapa, um primeiro oligonucleótido, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla é fornecido. Esse oligonucleótido, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, tem uma protrusão de cadeia simples e é, aqui, também, referido como "splinker". A protrusão de cadeia simples fornece uma sequência de nucleótidos correspondendo a uma sequência da primeira ou da terceira extensão de nucleótidos ou parte desta, dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos. Mais especificamente, a sequência da protrusão de cadeia simples é complementar à referida primeira ou terceira extensão, respectivamente. Numa forma de realização preferida, o primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um primeiro tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento. Neste caso, esse primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, tem uma protrusão de cadeia simples que compreende GTG e assim, é complementar ao primeiro tripleto da sequência alvo. 0 oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, na representação ilustrada na Fig. 2 (1), é formado por uma parte do oligonucleótido de cadeia simples dobrando-se para trás em direcção a outra parte do oligonucleótido formando, assim, uma ansa e a estrutura de cadeia dupla. No entanto, também, 48 é do âmbito da presente invenção que o oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, seja formado por dois oligonucleótidos de cadeia simples separados, cujas bases se emparelham entre os dois, produzindo então, esse oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, processo também aqui, descrito. A terminação do oligonucleótido de cadeia simples, supradescrito, que não fornece a protrusão de cadeia simples exigida para a ligação é bloqueada para evitar qualquer ligação ou reacção, potencialmente, possível, nas etapas subsequentes do método, de acordo com a presente invenção.

Na etapa 2, uma primeira biblioteca de oligonucleótidos é fornecida e compreende vários membros. Cada membro dessa primeira biblioteca de oligonucleótidos é, aqui, também, referido como um segundo oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e tem uma estrutura de cadeia dupla. Este tipo de segundo oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é, aqui, também, referido como âncora ou molécula âncora. A estrutura de cadeia dupla pode, como quando em conexão com o primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, ser formada por duas cadeias simples tendo uma modificação que permite a imobilização dos segundos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, como descrito acima, e particularmente, em conexão com a representação ilustrada na Fig. 1. Os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos compreendem um local de reconhecimento, ou parte deste, para um segundo tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento. Para além disso, esse segundo oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, fornece uma protrusão de cadeia simples. Os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos têm uma protrusão de cadeia simples, ou parte desta, que é a mesma para os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos, e em 49 que essa protrusão de cadeia simples é essencialmente complementar à protrusão de cadeia simples do primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Neste caso, essa protrusão de cadeia simples é CAC. Subsequente à protrusão de cadeia simples, a estrutura de cadeia dupla compreende uma extensão de nucleótidos e, mais especificamente, a estrutura de cadeia dupla do elemento com estrutura de cadeia dupla, sendo que os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos diferem na sequência da referida extensão, ou estrutura de cadeia dupla nos nucleótidos, e as sequências da referida extensão de nucleótidos corresponde às sequências, ou parte destas, da primeira metade da segunda extensão dos nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção. De forma concordante, como ilustrado na Fig. 2 (1), uma primeira biblioteca de oligonucleótidos é fornecida e os seus membros, isto é, os segundos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, são caracterizados de tal forma que, de preferência, a parte de cadeia dupla dos elementos, subsequente à protrusão de cadeia simples, compreende as várias sequências da primeira metade da segunda extensão dos nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos. Em conexão com isso, deve ser reconhecido que um membro da primeira biblioteca de oligonucleótidos compreende uma das respectivas sequências possíveis da primeira metade da segunda extensão também, contidas num elemento, isto é, o elemento correspondente de uma biblioteca de ácidos nucleicos. É do âmbito da presente invenção que a estrutura de cadeia dupla compreenda nucleótidos adicionais podem, numa representação, ou não podem, numa representação diferente, conter nucleótidos adicionais da sequência alvo. Neste caso, as respectivas sequências são ATG, TAT e GAG cujas bases se emparelham às sequências complementares, isto é, (no sentido 3' -> 5') 50 TAC, ATA e CTC formando parte da estrutura de cadeia dupla dos segundos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos diferem então, na sequência da referida extensão de nucleótidos e a sequência dessa extensão de nucleótidos dos elementos da primeira biblioteca de nucleótidos corresponde à sequência, ou parte desta, da primeira metade da segunda extensão dos nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos.

Adicionalmente, os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos compreendem uma modificação, como descrito aqui, que permite imobilizar essas moléculas num ou sobre um suporte que pode ser um transportador ou superfície que compreende um parceiro de interacção da dita modificação. Devido à presença da tal modificação, este tipo de oligonucleótido é também, referido como âncora ou molécula âncora. A imobilização é especificamente, mediada por uma interacção entre a modificação e um parceiro de interacção de tal modificação. Neste caso, a modificação é a biotina que interage com a estreptavidina como sua parceira de interacção, originando um complexo estável que permite a imobilização dos membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos. Na Fig. 2, o local de reconhecimento para o tipo de enzima de restrição IIS dos membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos é indicado por uma caixa preta, ilustrando o facto de que, para este tipo de enzima de restrição, o local de reconhecimento é exterior ao local de clivagem. Todos os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos têm o mesmo local de reconhecimento, ou parte deste, para um tipo de enzima de restrição IIS. uma

Na etapa 3, o primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e a primeira biblioteca de oligonucleótidos, e os seus respectivos membros são, respectivamente, combinados. Após essa combinação, 51 molécula do primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é ligada a uma molécula de um membro da primeira biblioteca de oligonucleótidos, preferencialmente por meio de uma ligase ou de actividade de ligase. Essa ligação ocorre após a formação de um primeiro produto de pré-ligação através da hibridação das protrusões de cadeia simples de dois tipos de moléculas, em que as cadeias suspensas funcionam como "sticky ends". 0 produto de reacção da ligação é mencionado por o primeiro produto de ligação. Devido à complexidade da primeira biblioteca de oligonucleótidos que é, no caso actual, 3, também, os primeiros produtos de ligação compreendem 3 espécies que diferem, pelo menos, na sequência correspondente à primeira metade da segunda extensão. Tipicamente, o resto dos primeiros produtos de ligação, em termos das sequências de nucleótidos é, preferencialmente, o mesmo para os vários elementos e, como tal, espécie da, assim formada, primeira biblioteca de produtos de ligação.

Na etapa 4, o primeiro produto de ligação é cortado com um tipo de enzima de restrição IIS. 0 local de reconhecimento desse tipo de enzimas de restrição IIS é o fornecido pelo segundo oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e é aqui, referido como um segundo tipo de enzima de restrição IIS. 0 corte do primeiro produto de ligação é realizado no pool e na biblioteca, respectivamente, consistindo nos primeiros produtos de ligação. De forma concordante, o corte ou clivagem do primeiro produto de ligação resulta numa variedade de moléculas assim, cortadas, em que o produto de reacção desse corte é um conjunto de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e uma variedade de segundos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Será reconhecido que a variedade de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, 52 consiste em várias espécies de moléculas que diferem na sequência da protrusão de cadeia simples,

Será também, reconhecido que o desenrolar das etapas 3 e 4, respectivamente, pode ser feito com diferentes condições de reacção em relação à imobilização, ou não, dos membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos e do primeiro produto de ligação, respectivamente. Em cada caso, as respectivas moléculas fornecem uma modificação que, como frisado acima, permite a imobilização. De forma concordante, qualquer sequência com referência à etapa de imobilização pode, em principio, ser realizada em várias representações. De forma concordante, é do âmbito da presente invenção realizar a reacção de ligação a que se refere a etapa 3, na fase liquida, isto é, com os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos não imobilizados. Subsequentemente, o corte do primeiro produto de ligação ocorre. Numa representação, ou execução, esse corte será, também, realizado na fase liquida com o primeiro produto de ligação não imobilizado num suporte por meio da sua modificação. Após o corte, o segundo oligonucleótido encurtado, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, é retirado da mistura de reacção por meio da sua modificação, ligando-se ao suporte. Alternativamente, após a ligação, o primeiro produto de ligação pode ser imobilizado num ou sobre um suporte e a etapa do corte do primeiro produto de ligação é realizado, com o primeiro produto de ligação imobilizado a esse suporte. Em qualquer caso, o segundo oligonucleótido encurtado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é retirado da reacção, imobilizado através da sua modificação, num suporte. Será reconhecido que devido à modificação que permite uma interacção especifica, como a que há entre a biotina e a estreptavidina, para efeito de imobilização, a reacção será transferida para um contentor de reacção, preferencialmente, em que as paredes do qual têm um 53 parceiro de interacção da modificação, no exemplo presente sendo a modificação biotina, estreptavidina. Devido à elevada afinidade da biotina e estreptavidina, a ligação da molécula, contendo a modificação, à superfície que contém a estreptavidina, actuando como um suporte, ocorre imediatamente. Por outras palavras, se uma se uma reacção é realizada com uma molécula tendo tal modificação, o contentor de reacção ou qualquer suporte disponível nessa reacção, não deve conter um parceiro de interacção da modificação, enquanto no caso de se pretender imobilização, é usado um contentor de reacção em que a sua superfície fornece esse parceiro de interacção da modificação, tanto através do contentor de reacção ou por outras superfícies ou suportes existentes nessa reacção. A etapa 5 da reacção consiste na remoção dos segundos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, que é preferencialmente feita por imobilização do segundo oligonucleótido encurtado, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla.

Devido a esta sequência de reacção, a reacção e preferencialmente, o sobrenadante da mesma, contém um conjunto de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Os vários primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, definem, através da sua protrusão de cadeia simples, várias espécies ou subgrupos de oligonucleótidos. No presente caso, a variedade de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, compreende três espécies diferentes ou subgrupos. Cada subgrupo por sua vez, compreende vários tipos de moléculas que diferem, preferencialmente, no que se refere à extensão de nucleótidos formando uma extensão de cadeia dupla ou parte desta e que corresponde à segunda extensão de nucleótidos, ou parte desta, do ácido nucleico alvo. Será reconhecido que os vários subgrupos contêm, 54 preferencialmente, moléculas que, na sua globalidade, têm a mesma extensão de nucleótidos formando uma extensão de cadeia dupla ou parte desta que corresponde à segunda extensão de nucleótidos, ou parte desta, do ácido nucleico alvo. Numa etapa adicional, que é, tipicamente, a etapa 6, uma segunda biblioteca de oligonucleótidos que compreende vários membros, é fornecida. Cada membro dessa segunda biblioteca de oligonucleótidos é um terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e tem uma estrutura de cadeia dupla. Essa estrutura de cadeia dupla pode ser desenhada como aqui, delineada em conexão com outros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, tal como, e preferencialmente, o primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Mais especificamente, o terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, compreende um local de reconhecimento ou parte deste, para um terceiro tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento e uma protrusão de cadeia simples. A protrusão de cadeia simples ou parte desta é diferente para os membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos. No exemplo presente, essa cadeia suspensa é ATG, TAT ou GAG. Essas protrusões de cadeia simples ou parte destas, dos terceiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, são essencialmente complementares à protrusão de cadeia simples dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Será reconhecido por um especialista na matéria que apenas uma espécie dos primeiros oligonucleótidos alongados, de cadeia dupla, pode reagir e finalmente, ligar-se a uma espécie dos terceiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, nomeadamente, as de protrusões de cadeia simples, preferencialmente, essencialmente ou parcialmente, complementares uma da outra. Apenas na sua globalidade é que as cadeias suspensas das várias espécies dos primeiros 55 oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e das várias espécies dos terceiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, são complementares uma da outra. Os membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos compreendem ainda, uma extensão de nucleótidos na estrutura de cadeia dupla que é diferente nos vários membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos. A diversidade desta extensão resulta das possibilidades combinatórias da primeira metade da segunda extensão e da segunda metade da segunda extensão da sequência alvo. No exemplo actual, a primeira metade da segunda extensão e a segunda metade da segunda extensão compreendem, cada uma, três diferentes tripletos de modo que o número de terceiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, tem que ser 3x3, isto é, nove diferentes moléculas. Se a primeira metade consistisse em três diferentes tripletos e a segunda metade consistisse em quatro diferentes tripletos, a complexidade da segunda biblioteca de oligonucleótidos seria de 3 x 4, isto é, 12 e essa biblioteca forneceria 12 espécies diferentes de oligonucleótidos. De forma concordante, no caso actual, a segunda biblioteca de oligonucleótidos consiste em 9 membros, originando qualquer combinação que surja da variabilidade da segunda extensão da sequência alvo, mais especif icamente, que surja do fato de que tal segunda extensão consiste num primeira e uma segunda metade contribuindo para a sequência alvo com diferentes moléculas em que cada uma das primeira e segunda extensões compreende três diferentes formas ou sequências, resultando nas 9 espécies diferentes. Novamente, os membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos compreendem uma modificação, em que tal modificação é, preferencialmente, a mesma, como descrito em conexão com a primeira biblioteca de oligonucleótidos.

Na etapa 7, o conjunto dos primeiros 56 oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, consistindo em três espécies diferentes, e a segunda biblioteca de oligonucleótidos são combinados. Devido à complementaridade das cadeias suspensas, como frisado acima, cada uma das moléculas da variedade, isto é, cada uma das três espécies diferentes dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é ligada a uma molécula de um membro da segunda biblioteca de oligonucleótidos. 0 respectivo par de moléculas a ser ligado é definido pela complementaridade das suas cadeias suspensas definindo um par de reacção. Assim que as duas moléculas correspondentes forem hibridadas ou emparelhadas, ocorre tipicamente, ligação, na presença ou adição da respectiva actividade de ligase. Nesses produtos de ligação, a primeira metade da segunda extensão e a segunda metade da segunda extensão da sequência alvo estão já contidas no produto de ligação como mostrado na representação da Fig. 2 (2). Os nove produtos de ligação diferentes compreendem já, como extensão de cadeia dupla, a primeira metade da segunda extensão do ácido nucleico alvo e a segunda metade da segunda extensão do ácido nucleico alvo.

Neste caso, o segundo produto de ligação compreende um total de nove sequências diferentes, em que as sequências diferem na protrusão de cadeia simples introduzida no segundo produto de ligação pelos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e, no exemplo presente, compreende o primeiro tripleto da estrutura de cadeia dupla fornecido pelos membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos. Noutras representações, diferenças adicionais podem residir em partes adicionais do produto de ligação, no entanto, é preferível que as duas diferenças supracitadas, nos vários membros da biblioteca consistindo no segundo produto de ligação sejam de outra forma, as mesmas. Novamente, os 57 vários membros da biblioteca consistindo nos segundos produtos de ligação têm um local de reconhecimento do tipo de enzima de restrição IIS, ou parte deste, que corresponde àquele dos segundos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla.

As próximas etapas, isto é, a etapa 8, consiste no corte do segundo produto de ligação com o terceiro tipo de enzima de restrição IIS, sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, que é, em princípio, esquematizada e gerada, respectivamente, da mesma forma, como descrito em conexão com o primeiro produto de ligação. Isto aplica-se particularmente, em relação à potencial sequência de ligação e de corte e de remoção por imobilização, respectivamente. Como resultado da etapa 8, no decurso do qual, o segundo produto de ligação é cortado com o terceiro tipo de enzima de restrição IIS, uma variedade de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e de terceiros oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é fornecida. Novamente, os terceiros oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, então libertos do segundo produto de ligação são retirados da reacção por uma a modificação e sua interacção com um parceiro de interacção, como a estreptavidina em conexão com biotina, que é uma modificação ligada a uma superfície.

Os nove diferentes segundos oligonucleótidos alongados, assim obtidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, estão representados na Fig. 2 (2).

Na etapa 9, uma terceira biblioteca de oligonucleótidos com uma variedade de quartos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é fornecida. Esses quartos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, diferem nas suas cadeias 58 suspensas. De outra forma, o esquema deste quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, pode ser, numa representação, semelhante às representações descritas em conexão com outros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, descrito em conexão com a Fig. 1 e 2, respectivamente. A protrusão de cadeia simples fornece uma sequência de nucleótidos que é essencialmente complementar às protrusões de cadeia simples dos vários segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. 0 número de espécies respectivas, da terceira biblioteca de oligonucleótidos surge da, e corresponde à, variabilidade da segunda metade da segunda extensão do ácido nucleico a ser preparada, e, como tal, dos vários segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Esses segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, têm, no caso actual, três protrusões de cadeia simples diferentes, se conjuntamente consideradas. Mais especificamente, estas cadeias suspensas são AAA, CTC, e GAG, sendo complementares à segunda metade da segunda extensão do ácido nucleico alvo, nomeadamente TTT, GAG, e CTC. Adicionalmente, o quarto oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, compreendem um local de reconhecimento, ou parte deste, para um quarto tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento. Esses quartos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, isto é, no exemplo presente, três destes oligonucleótidos diferentes, e o conjunto dos segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, no caso atual, nove espécies diferentes desses oligonucleótidos, são combinados entre si e ligados por meio de uma actividade de ligase de emparelhamento das duas moléculas, por hibridação através das suas protrusões de cadeia simples complementares. Novamente, uma molécula dos quartos oligonucleótidos, pelo 59 menos parcialmente de cadeia dupla, e uma molécula dos vários segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, são emparelhadas devido à complementaridade das suas cadeias suspensas. Até agora, um desses três diferentes quartos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é, em principio, reactivo com três dos segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, nomeadamente aqueles de cadeia simples que é complementar à cadeia simples do respectivo quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Obtém-se assim, novamente, um total de nove oligonucleótidos diferentes. As moléculas então, emparelhadas são então, ligadas por meio de uma de actividade de ligase originando um terceiro produto de ligação. Esse terceiro produto de ligação consiste em nove espécies diferentes de produtos de ligação, em que os produtos de ligação contêm a primeira e a segunda metade da segunda extensão do ácido nucleico alvo, sendo, cada uma dessas sequências, ladeada de ambos lados por outro grupo, no caso atual, três nucleótidos. Será reconhecido que a complexidade das bibliotecas e oligonucleótidos usados no método do presente depósito de patente, resulta imediatamente, da, e corresponde, à variabilidade da primeira metade e da segunda metade da segunda extensão do ácido nucleico a ser preparada, ou da multiplicação de produtos dai proveniente. Como quando em conexão com outras reacções, devido à complementaridade das cadeias suspensas, uma reacção uma-a-uma, isto é, uma reacção entre uma molécula de cada espécie de reagente contida na reacção, ocorre. 0 terceiro produto de ligação finalmente, compreende então, a sequência alvo como ilustrado na Fig. 2 (1). a sequência variável da sequência alvo, isto é, aquela que é diferente nas várias espécies do produto de ligação, é enquadrada na Fig. 2 (3).

Novamente, como descrito em conexão com o método 60 da Fig. 1, essa molécula tanto poder ser cortada com um tipo de enzima de restrição IIS recorrendo à respectiva sequência de reconhecimento fornecida pelo quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e ser objecto de reacções adicionais usando os mesmos esquemas de reacção, como frisado acima, ou ser objecto de clivagem usando um tipo de enzima de restrição IIS que é então fornecido pelo terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, que permite libertar a sequência alvo. Na última alternativa, o terceiro produto de ligação passa a poder ser cortado para que seja introduzido na reacção de transposição com outras moléculas, tipicamente, preparadas de forma similar para permitir a reacção de transposição, como descrito em conexão com a WO 00/75368. Método de preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos, como ilustrado na Fig. 3

Na alternativa adicional dos métodos, de acordo com a presente invenção, e mais especificamente, do método de acordo com o primeiro aspecto, a sequência alvo a ser sintetizada, como ilustrado na Fig. 3 (1), em que a primeira posição, isto é, o primeiro tripleto no caso representado, é variável e, no caso actual, consiste em três nucleótidos. Essa posição variável é também, referida como a primeira extensão, enquanto os tripletos subsequentes são referidos como a segunda e a terceira extensão, respectivamente. Exceptuando os pontos discutidos seguidamente, as etapas e as moléculas usadas nesse método correspondem àqueles descritos aqui, em conexão com o método de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, são incorporados aqui, por referência de modo a evitar qualquer repetição desnecessária. menos

Numa primeira etapa, um conjunto de primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é fornecida. Esses oligonucleótidos, pelo 61 parcialmente de cadeia dupla, têm estrutura de cadeia dupla e uma protrusão de cadeia simples. Este tipo de moléculas é, aqui, também, referido como "splinker". Estes primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, diferem no que respeita à sequência da protrusão de cadeia simples. A diversidade das protrusões de cadeia simples corresponde a uma diversidade da posição variável, em que as cadeias suspensas das várias espécies dos primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, são complementares das sequências dos vários elementos de uma biblioteca de ácidos nucleicos a ser preparada e, como tal, complementar à primeira extensão. No exemplo actual, a cadeia suspensa tanto é (no sentido 3'-> 5') TAC, ATA, como CTC. Numa representação, os primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, compreendem um local de reconhecimento, ou parte deste, para um primeiro tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento.

Num segundo etapa, uma primeira biblioteca de oligonucleótidos é fornecida e compreende vários membros e várias espécies, respectivamente. Cada membro dessa primeira biblioteca de oligonucleótidos é, aqui, também, referido como um segundo oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e tem uma estrutura de cadeia dupla. A estrutura de cadeia dupla pode, como quando em conexão com o primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, ser formada por duas cadeias simples com uma modificação adicional, como descrito acima, que em princípio, permite a imobilização dessa primeira biblioteca de oligonucleótidos num suporte, em que esse suporte compreende ou fornece um parceiro de interacção à tal modificação. Num exemplo preferido, a modificação é a biotina e o parceiro de interacção desse suporte é estreptavidina. Os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos compreendem um local de reconhecimento, ou 62 parte deste, para um segundo tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento. Para além disso, esses segundos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, fornecem a protrusão de cadeia simples. Os membros e espécies, respectivamente, da primeira biblioteca de oligonucleótidos diferem até agora uns dos outros porquanto a protrusão de cadeia simples ou parte desta é diferente para os membros ou espécies da primeira biblioteca de oligonucleótidos e em que essas protrusões de cadeia simples são essencialmente ou parcialmente, complementares à protrusão de cadeia simples dos primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Neste caso, essas protrusões de cadeia simples são ATG, TAT e GAG, respectivamente. Novamente, a complexidade da biblioteca é definida pela variabilidade da primeira extensão do ácido nucleico a ser preparada. De forma concordante, se a complexidade fosse, como ilustrada no exemplo, três porque das três diferentes sequências, o conjunto dos primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e da primeira biblioteca de oligonucleótidos será três. Subsequentemente à protrusão de cadeia simples, a estrutura de cadeia dupla dos segundos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, compreendem uma extensão de nucleótidos, sendo que os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos têm a mesma sequência. Seguindo-se imediatamente os três nucleótidos que compreendem cadeias suspensas, os segundos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, têm a extensão que corresponde à sequência da segunda extensão da sequência alvo. Nos segundos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, no entanto, essa segunda extensão da sequência alvo está presente na forma de cadeia dupla. 0 conjunto dos primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e a primeira biblioteca de oligonucleótidos e os seus membros, isto é, 63 os segundos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, estão representados na Fig. 3(1).

Os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos compreendem uma modificação. Neste caso, tal modificação permite a imobilização dos vários membros da biblioteca num suporte que é, tipicamente, a superfície de um tubo de reacção. A imobilização é especificamente, mediada por uma interacção entre a modificação e o parceiro de interacção de tal modificação que está, tipicamente, presente no suporte ou transportador. Neste caso, a modificação é a biotina que interage com a estreptavidina como sua parceira de interacção fornecendo um complexo estável que permite a imobilização dos membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos.

Como quando em conexão com os métodos representados nas Figs. 1 e 2, o local de reconhecimento para o tipo de enzima de restrição IIS dos membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos é indicado por uma caixa preta, ilustrando o facto de que, para este tipo de enzima de restrição, o local de reconhecimento é exterior ao local de clivagem.

Na etapa 3, os primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos são combinados. Após essa combinação, uma molécula do primeiro oligonucleótido, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, é ligada a uma molécula dos membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos, preferencialmente por meio de uma ligase ou de actividade de ligase. Essa ligação ocorre formando um primeiro produto de pré-ligação através da hibridação das protrusões de cadeia simples dos dois tipos de moléculas em que as cadeias suspensas funcionam como "sticky ends". 0 produto de reacção da ligação é referido, na sua globalidade, como o primeiro produto de ligação, como ilustrado na Fig. 3 (1). Como indicado na Fig. 3 (1), 64 esse primeiro produto de ligação varia e representa as posições variáveis da sequência alvo. Por outras palavras, o primeiro produto de ligação forma a biblioteca em si que compreende, no exemplo actual, três espécies diferentes de produtos de ligação que diferem na posição representando a posição variável da sequência alvo. Esse produto de ligação compreende adicionalmente, uma segunda extensão da sequência alvo que é, neste caso, GAG. Até agora, os membros deste pool de produtos de ligação diferem, pelo menos, e preferencialmente, apenas na sequência correspondente ao primeiro tripleto da sequência alvo que é a posição variável, enquanto, tipicamente, o restante primeiro produto de ligação, em termos de sequência de nucleótidos, é preferencialmente, o mesmo para os vários elementos da, assim formada, primeira biblioteca de produtos de ligação.

Na etapa 4, o primeiro produto de ligação é cortado com um tipo de enzima de restrição IIS. Esse tipo de enzima de restrição IIS é aquele para o qual o local de reconhecimento é fornecido pelas moléculas âncora, isto é, pelos segundos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. 0 corte dos primeiros produtos de ligação é realizado no pool e na biblioteca, respectivamente, consistindo nos primeiros produtos de ligação. De forma concordante, o corte ou clivagem dos primeiros produtos de ligação resulta numa variedade de moléculas assim, cortadas, em que o produto de reacção desse corte é um conjunto de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e uma variedade de segundos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Em cada caso, no exemplo presente, uma terceira espécie diferente das respectivas moléculas, é fornecida.

Como descrito em conexão com os métodos figurados nas Figs. 1 e 2, a execução da etapa 4 pode ser levada a 65 cabo sob diferentes cenários em termos de imobilização ou não-imobilização dos elementos do primeiro produto de ligação, respectivamente. A respectiva divulgação é incorporada aqui, por referência. 0 seguinte etapa da reacção consiste na remoção dos segundos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, o que é preferencialmente feito por imobilização dos segundos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla.

Devido ao esquema de reacção, a reacção, preferencialmente o sobrenadante desta, contém uma variedade de oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, que são também, referidos como primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Essa variedade de oligonucleótidos consiste em três espécies diferentes que têm a mesma sequência na protrusão de cadeia simples, mas diferem na sequência dos três nucleótidos adjacentes que correspondem à sequência alvo, enquadrada na Fig. 3(2). Numa etapa adicional, que é, tipicamente, a etapa 6, um terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é fornecido. 0 terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, tem uma estrutura de cadeia dupla que pode ser desenhada como aqui delineado, em conexão com outros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e preferencialmente, como o primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Mais especificamente, esse terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um terceiro tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento e uma protrusão de cadeia simples. A protrusão de cadeia simples, ou parte desta, é complementar à protrusão de cadeia simples dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Porque este 66 terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, consiste numa única espécie. 0 terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, compreende então, uma extensão de nucleótidos na estrutura de cadeia dupla que é idêntica à terceira extensão da sequência alvo, isto é, neste caso, ACA. Este terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, que, devido à conter uma modificação, permite a sua imobilização, como descrito acima, e que pode também, então, ser referida como molécula âncora, é ligada aos três membros da biblioteca formando um conjunto de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Novamente, o emparelhamento e ligação são realizados, de modo semelhante àquele descrito em conexão com outros procedimentos de ligação. Adicionalmente, esses procedimentos de ligação podem variar de acordo com o que foi dito acima. Por outras palavras, devido à complementaridade das cadeias suspensas, cada molécula do conjunto dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é ligada a uma única molécula do terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. 0 produto de ligação, dessa reacção de ligação então formado, também, é referido como segundo produto de ligação e encontra-se representado na Fig. 3 (2) com a extensão variável da sequência alvo enquadrada. Esse produto de ligação compreende assim, a sequência alvo global, em que a sua primeira posição mostra a variabilidade da sequência alvo, representada pelas diferentes espécies do segundo produto de ligação. Método de preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos como ilustrado na Fig. 4

Noutra forma de realização do método, de acordo com a presente invenção e, mais especificamente, da suo segundo aspecto, a sequência alvo é como ilustrada na Fig. 4 (1), isto é, compreende duas posições variáveis formando 67 uma primeira extensão, mais especificamente, uma primeira metade da primeira extensão e uma segunda metade da primeira extensão, e a segunda extensão. Excetuando os pontos discutidos seguidamente, as etapas e as moléculas usadas nesse método correspondem àqueles descritos aqui, em conexão com o método de acordo com o segundo aspecto da presente invenção, são incorporados aqui, por referência de modo a evitar qualquer repetição desnecessária.

No exemplo atual, a primeira metade da primeira extensão consiste num dos três tripletos ATG, TAT e GAG, e uma segunda metade da primeira extensão consiste em CTC, GAG ou TTT. A segunda extensão consiste em ACA.

Numa primeira etapa, um conjunto de primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é fornecida. Essa variedade de primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, mostrada na Fig. 4(1) compreende três espécies diferentes de primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. As espécies diferentes ou membros deste tipo de biblioteca diferem, pelo menos, e preferencialmente, na protrusão de cadeia simples. Os vários primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, diferem mais especificamente, de modo que a protrusão de cadeia simples é (no sentido 3' -> 5') TAC, ATA, e CTC, sendo complementar às várias sequências da sequência variável da primeira metade da primeira extensão da sequência alvo. A parte, este tipo de primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, tem uma estrutura similar ou idêntica àquela descrita em conexão com as outras representações do método da presente invenção, e, mais especificamente, aquelas do segundo aspecto dos métodos de acordo com a presente invenção, mais concretamente, compreendem uma sequência de reconhecimento ou parte desta de um primeiro tipo de enzima de restrição IIS. uma

Na etapa 2, uma primeira biblioteca de 68 oligonucleótidos é fornecida e compreende vários membros. Cada membro dessa primeira biblioteca de oligonucleótidos é, aqui, também, referido como um segundo oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e tem uma estrutura de cadeia dupla. A estrutura de cadeia dupla pode, como quando em conexão com o primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, ser formada por duas cadeias simples sofrendo uma modificação adicional, como descrito acima. Os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos compreendem um local de reconhecimento, ou parte deste, para um segundo tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento. Para além disso, esse segundo oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, fornece uma protrusão de cadeia simples. Os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos diferem, pelo menos, até agora uns dos outros porquanto a protrusão de cadeia simples ou parte desta é a mesma para um subgrupo dos membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos e em que essa protrusão de cadeia simples é, essencialmente, ou parcialmente, complementar à protrusão de cadeia simples de uma espécie dos vários primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Por outras palavras, a complexidade da primeira biblioteca é determinada pela complexidade do biblioteca de ácidos nucleicos a ser preparada e pode ser calculada multiplicando a variabilidade da primeira metade da primeira extensão com a variabilidade da segunda metade da primeira extensão. De forma concordante, na sua globalidade, todos os oligonucleótidos do conjunto dos primeiros, oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, têm uma cadeia suspensa que, novamente, na sua globalidade, será complementar às cadeias suspensas dos oligonucleótidos da primeira biblioteca de oligonucleótidos. Mais especificamente, essa protrusão de cadeia simples pode ser 69 ATG, correspondente à protrusão de cadeia simples do primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, TAC, TAT, correspondente à protrusão de cadeia simples do primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, ATA, e GAG correspondente à protrusão de cadeia simples do primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, CTC. Até agora, esta primeira biblioteca de oligonucleótidos fornece três espécies diferentes em termos de diferentes cadeias suspensas. Cada espécie compreende três espécies adicionais que se caracterizam até agora, por, imediatamente a seguir às protrusões de cadeia simples, a sequência de acordo com a segunda metade da primeira extensão da sequência alvo, ser repetida. Essa sequência de nucleótidos é parte da estrutura de cadeia dupla. Até agora, o primeiro subgrupo da primeira biblioteca de oligonucleótidos consiste em ATG CTG/GAG, ATG GAG/CTC e ATG TTT/AAA, a segunda subespécie consiste em TAT CTC/GAG, TAT GAG/CTC e TAT TTT/AAA e a terceira subespécie consiste em GAG CTC/GAG, GAG GAG/CTC e GAG TTT/AAA, em que os nucleótidos colocados após "/" são indicativos dos três nucleótidos, sendo complementares aos três nucleótidos imediatamente seguinte. Até agora, a primeira biblioteca de oligonucleótidos consiste em nove membros que são formados pela variabilidade da primeira metade da primeira extensão multiplicada pelas variantes da segunda metade da primeira extensão. Por outras palavras, o número dos membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos é o produto do número de diferentes sequências da primeira metade da primeira extensão multiplicando com o número de diferentes sequências da segunda metade da primeira extensão do ácido nucleico alvo.

De forma semelhante à dos membros das primeiras bibliotecas de oligonucleótidos, como quando em conexão com outras representações da invenção eminente, os segundos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, 70 compreendem uma modificação tal como especificado, em conexão com as mesmas.

Na etapa 3, os vários primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e a primeira biblioteca de oligonucleótidos, e os seus membros, são respectivamente, combinados. Após essa combinação, uma molécula do primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente, de cadeia dupla, é ligada a uma molécula de um membro da primeira biblioteca de oligonucleótidos, preferencialmente por meio de uma ligase ou de actividade de ligase. Essa ligação ocorre logo após a formação de um primeiro pré-produto de ligação, através da hibridação de dois tipos de moléculas das protrusões de cadeia simples, correspondentes, em que as cadeias suspensas funcionam como "sticky ends". O produto de reacção da ligação é mencionado por primeiro produto de ligação. Devido à variedade dos primeiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e da primeira biblioteca de oligonucleótidos da reacção de ligação, origina-se um conjunto de primeiros produtos de ligação, neste caso, de nove espécies diferentes desses primeiros produtos de ligação. Esses produtos de ligação diferem na sua sequência até ao momento, porque contêm uma segunda extensão variável consistindo na primeira metade e na segunda metade da primeira extensão do ácido nucleico alvo, como é numa caixa da Fig. 4 (2). À parte, os produtos de ligação que efetivamente, constituem uma biblioteca adicional diferem até agora e preferencialmente, nesta sequência, enquanto, tipicamente, o restante primeiro produto de ligação, em termos de sequência de nucleótidos, é preferencialmente, o mesmo para os vários elementos da primeira biblioteca de produtos de ligação, assim formada.

Na etapa 4, os vários primeiros produtos de ligação são cortados com um tipo de enzima de restrição IIS. Esse tipo de enzima de restrição IIS é aquele para o 71 qual o local de reconhecimento é fornecido pelos segundos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, marcados numa caixa preta nas Figs. 4(1,2) . 0 corte do primeiro produto de ligação é realizado na reacção e na biblioteca, respectivamente, que compreende o(s) primeiro (s) produto(s) de ligação. De forma concordante, o corte ou clivagem do primeiro produto de ligação resulta numa variedade de moléculas assim, cortadas, em que o produto de reacção desse corte é um conjunto de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e uma variedade de segundos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. Nas várias outras representações descritas em conexão com as Figs. 1 a 3, esse segundo tipo de enzima de restrição IIS é Eaml1041.

Novamente, será reconhecido que a execução da etapa 4 pode ser levada a cabo sob diferentes cenários em termos de imobilização ou não-imobilização dos membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos, como descrito em conexão com as outras representações do método de, acordo com a invenção.

Devido ao corte do primeiro produto de ligação, um total de nove diferentes primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é gerado, tipicamente, a espécie individual da gerada variedade ou conjunto de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, compreende nove espécies diferentes definidas pelas várias sequências alvo, em que existem três diferentes subgrupos de moléculas que são definidos através da sua protrusão de cadeia simples que é complementares à segunda metade da primeira extensão da sequência alvo. Mais especificamente, no exemplo atual, os três subgrupos são os que são definidos pela protrusão de cadeia simples GAG, sendo um definido pela protrusão de cadeia simples CTC e outro, 72 definido pela protrusão de cadeia simples AAA. Cada subgrupo, por sua vez, varia na extensão e em particular, nos três nucleótidos a seguir ou anteriores, respectivamente, à protrusão de cadeia simples, que formam a primeira extensão de cadeia dupla da estrutura de cadeia dupla e que correspondem à primeira metade da primeira extensão da sequência alvo e, então, são ATG/TAC, TAT/ATA, e GAG/CTC, respectivamente, para cada subgrupo mencionado.

Na etapa seguinte, uma segunda biblioteca de oligonucleótidos consistindo em terceiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é adicionada, como ilustrado na Fig. 4 (2). Os membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos diferem no que respeita às suas protrusões de cadeia simples que correspondem à segunda metade da primeira extensão da sequência alvo, isto é, neste caso, CTC, GAG, e TTT. De outra forma, os membros são os mesmos, como descrito em conexão com a primeira biblioteca de oligonucleótidos, em que estes compreendem uma sequência de reconhecimento de um terceiro tipo de enzima de restrição IIS, ou parte desta, e compreendem uma modificação. A primeira parte da estrutura de cadeia dupla dos terceiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, a seguir à protrusão de cadeia simples é a mesma em todos os elementos da segunda biblioteca de oligonucleótidos e corresponde à segunda extensão da sequência alvo, que é neste caso, ACA. Como esta extensão dos terceiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é parte da estrutura de cadeia dupla desses terceiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, a respectiva estrutura de cadeia dupla nos vários membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos é então, ACA/TGT para cada e qualquer dos elementos dessa segunda biblioteca de oligonucleótidos.

Os membros da segunda biblioteca de 73 oligonucleótidos são então ligados, tipicamente, após um etapa de emparelhamento, com os vários primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e até agora, as etapas adicionais correspondem àquele descrito em conexão com cada e qualquer das outras representações do método de acordo com a invenção eminente. 0 respectivo produto de reacção é o segundo produto de ligação que consiste, tal como determinado pela complexidade de uma biblioteca de ácidos nucleicos a ser preparada, com nove espécies diferentes.

Será entendido pelas pessoas especialistas na matéria, que é possivel variar a concentração com que os vários oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, são adicionados às reacções individuais. À parte de qualquer proporção equimolar relativa entre si, a proporção pode ser enviesada o que provocará uma sobre- ou sub-representação da posição variável introduzida na molécula de ácido nucleico pelo(s) respectivo(s) oligonucleótido(s). De acordo com a biblioteca de ácidos nucleicos, preparada pelos métodos de acordo com a invenção eminente, esta reflete, em termos de prevalência dos vários elementos, a proporção enviesada dos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, usados como moléculas âncora.

Será reconhecido que os métodos, de acordo com a presente invenção, podem ser usados para a preparação de um ácido nucleico de cadeia simples bem como de ácidos nucleicos de cadeia dupla. A preparação de um ácido nucleico de cadeia simples é, tipicamente, baseada na preparação de um ácido nucleico de cadeia dupla, após o que a cadeia dupla do ácido nucleico é desnaturada originando os respectivos ácidos nucleicos de cadeia simples. A separação das duas cadeias simples pode ser afetada no caso dos vários oligonucleótidos usados na preparação da cadeia dupla de ácido nucleico, consistirem, cada um, de duas cadeias simples que não se encontram ligadas de forma 74 covalente uma à outra. Alternativamente, as cadeias simples ligadas de forma covalente originando as duplas cadeias podem ser separadas por clivagem covalente.

Será também, reconhecido que os métodos, de acordo com a presente invenção, podem ser usados para a preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos, em que os elementos de uma biblioteca de ácidos nucleicos diferem na sequência, particularmente, na segunda extensão, e em que essa extensão consiste em mais de seis nucleótidos, como ilustrado aqui. De facto, a repetição individual de etapas, isto é, repetição das etapas n) a q) como etapas na) a qa) , em que os quintos oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, da etapa n) são um oligonucleótido adicional, pelo menos, de cadeia dupla na etapa na) , o quarto produto de ligação na etapa o) é um produto de ligação adicional na etapa oa) , o conjunto dos quartos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, na etapa p) é um conjunto de oligonucleótidos alongados adicionais, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, na etapa pa) e o quinto oligonucleótido encurtado, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, da etapa p) é um oligonucleótido encurtado adicional, pelo menos, de cadeia dupla na etapa pa), não é limitante do número dos nucleótidos que são diferentes nos vários elementos de uma biblioteca de ácidos nucleicos. Em vez disso, os métodos, de acordo com a presente invenção, permitem a preparação de extensões significativamente mais longas, dependendo do propósito para o qual a biblioteca de ácidos nucleicos é preparada. No caso de fornecer um centro activo optimizado de uma enzima ou um anticorpo com um local de ligação otimizado, o comprimento da extensão, que é diferente nos vários membros de uma biblioteca de ácidos nucleicos, corresponde ao comprimento da sequência de aminoácidos que formam o centro activo dessa enzima ou o local de ligação desse anticorpo, e dos ácido nucleicos que os codificam, 75 respectivamente.

Finalmente, será reconhecido que o comprimento da segunda extensão de nucleótidos dos elementos de uma biblioteca de ácidos nucleicos, ou qualquer extensão de nucleótidos correspondente, preferencialmente, correspondente em termos de função, pode consistir, em principio, de qualquer comprimento. Preferencialmente, consiste em dois nucleótidos, três nucleótidos, quatro nucleótidos, cinco nucleótidos, seis nucleótidos, sete nucleótidos ou oito ou múltiplos de três nucleótidos.

Exemplo 1

Fabrico de uma Biblioteca de Ácidos Nucleicos com uma única posição variável

Como frisado acima, a invenção fornece um método altamente eficiente para a síntese de uma biblioteca de ácidos nucleicos. Um exemplo de geração de uma biblioteca com uma única posição variável, como também, representado na Fig. 1 é descrito abaixo, em mais detalhe. A posição variável cobre 20 codões diferentes (em vez de três como ilustrado nas figuras) representando todos os aminoácidos possíveis, a utilização do codão foi adaptada a E. coli. 1) Primeira Ligação 20-200 μπιοί de uma molécula "splinker", isto é, um primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma cadeia suspensa GTG foram fornecidos num contentor de reacção, em 25 a 200 μΐ de tampão de reacção. Depois, 20-200 pmol da mistura de 20 moléculas âncora, isto é, a primeira biblioteca de oligonucleótidos, foram adicionadas. Estas âncoras estão presentes na mistura em quantidades equimolares e todas têm a mesma protrusão de cadeia simples (CAC, correspondente à primeira extensão) que é complementar à cadeia suspensa da molécula "splinker" mas diferem na sua parte variável adjacente representando os codões dos 20 aminoácidos diferentes (ver Quadro 1). Após a adição de 10 a 50 U de T4-DNALigase as moléculas 76 foram ligadas durante 60 minutos a 25°C, originando um conjunto de primeiros produtos de ligação. 2) Isolamento de um conjunto de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla,

Um conjunto de primeiros produtos de ligação foi imobilizada, por meio da sua fracção de biotina, a um contentor revestido de estreptavidina durante 15 minutos a temperatura ambiente. 0 material nãc ' ligado foi retirado por três lavagens com tampão de lavagem (33 mM de Tris/Acetato, 10 mM de Acetato de Magnésio, 6 6 mM de acetato de Potássio, com pH de 7, 9) . Depois, 10 a 100 U de uma enzima de restrição, como a Eamll04I que é o segundo tipo de enzima de restrição IIS foram adicionadas em 25 a 200 μΐ de tampão de reacção seguida de uma incubação de 15 a 90 minutos a 37°C. A variedade de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, então, libertada, foi transferida para um novo contentor. 3) Segunda ligação 20-200 pmol de uma mistura de 20 moléculas âncora, isto é, uma segunda biblioteca de oligonucleótidos, foram adicionadas a um conjunto de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em 25 a 200 μΐ de tampão de reacção. As moléculas âncora estão presentes na mistura em quantidades equimolares e diferem nas suas protrusões de cadeia simples (correspondente à segunda extensão da sequência alvo) que são complementares às cadeias suspensas fornecidas pela variedade de primeiros oligonucleótidos alongados mas são todas idênticas na sua parte adjacente. Após a adição de 10 a 50 U de T4-ADN-Ligase, as moléculas foram ligadas durante 60 minutos a 25°C, originando uma variedade de segundos produtos de ligação. 4) Isolamento de uma variedade de segundos 77 oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla,

Uma variedade de segundos produtos de ligação foi imobilizada, por meio da sua fracção de biotina, a um contentor revestido de estreptavidina durante 15 minutos a temperatura ambiente. 0 material não ligado foi retirado por três lavagens com tampão de lavagem. Depois foram adicionadas, 10 a 100 U de uma enzima de restrição, como a Eamll04I que é o segundo tipo de enzima de restrição IIS, em 25 a 200 μΐ de tampão de reacção, seguindo-se uma incubação de 15 a 90 minutos a 37°C. 0 conjunto de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, então, libertado, foi transferido para um novo contentor. 5) Terceira ligação 20-200 pmol de uma molécula âncora, isto é, um quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma cadeia suspensa (GAG, correspondente à primeira metade da terceira extensão) que é complementar à cadeia suspensa fornecida pelo conjunto de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, (CTC) foi adicionado ao conjunto de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em 25 a 200 μΐ de tampão de reacção. Após a adição de 10 a 50 U de T4-ADN-Ligase, as moléculas foram ligadas durante 60 minutos a 25°C, originando uma variedade de terceiros produtos de ligação. 6) Síntese de Um Bloco de Elongação

Um ciclo de elongamento que compreende a ligação do terceiro produto de ligação a uma superfície de estreptavidina, em que se clivou o produto imobilizado através da Eamll04I e se ligaram os oligonucleótidos alongados então, libertados com uma âncora apropriada foi repetido três vezes começando no terceiro produto de ligação da etapa 5, obtendo-se uma variedade de sextos 78 produtos de ligação, também, referidos como blocos de elongação. As condições de cada etapa de reacção foram as descritas acima. 7) Sintese do produto final 0 bloco de elongação sintetizado foi usado na sintese subsequente do produto genético completo através do método de transposição anteriormente, descrito (Solicitação de Patente Internacional WO 00/75368) 8) Avaliação de qualidade do produto final O produto final, isto é, a biblioteca de ácidos nucleicos com uma única posição variável, foi clonado num vector normalizado (pPCR-Script, Stratagene) e 96 clones individuais foram sequenciados. As sequências dos elementos da desejada biblioteca de ácidos nucleicos aparentaram ser idênticas excepto nas suas particulares posições variáveis. A distribuição dos 20 codões, diferentes na posição variável, obtida é mostrada na Quadro 1. QUADRO 1

Protrusão da Aminoácido Número de

Cadeia Simples_sequências

Total 96 GAA E 3 ATT I 3 CTT L 7 GTG V 3 TTT F 7 ATG M 1 TGC C 7 GCA A 9 GGC G 2 CCT P 9 ACA T 3 AGC s 3 TAT Y 7 79 TGG W 6 CAA Q 7 AAC N 4 GAT D 4 CAT H 5 AGG K 1 AGA R 5

Os respectivos valores e a análise estatística são indicados na Fig. 5 que é um histograma de frequências de codões obtidas numa única posição permutada. 0 valor esperado de μ de cada de cada um dos 2 0 codões, numa amostra de 96, é 4,8, se for assumida uma distribuição equitativa. Neste caso, é esperado que mais de 95% de todos os codões estejam contidos num intervalo de dois desvios padrões (μ+/-2σ). Neste exemplo, todas as frequências observadas estão completamente contidas no intervalo de 2 desvios padrões da distribuição normal, sustentando a hipótese de que a distribuição das frequências de codões é equitativa.

Exemplo 2: Fabrico de Biblioteca de Ácidos Nucleicos com uma Extensão de Posições Variáveis 0 exemplo 2 é um exemplo de geração de uma biblioteca com uma extensão de duas posições variáveis compreendendo cada uma três nucleótidos subsequentes, formando um tripleto que codifica um aminoácido como, também, representado na Fig. 2 sendo descrito abaixo, em mais detalhe. As posições variáveis contêm 10 codões diferentes cada um conferindo uma complexidade à biblioteca de 100 (10 x 10), em vez de três diferentes codões, como ilustrado na Fig. 2. A utilização do codão foi adaptada a E. coli. 1) Primeira Ligação 20-200 μπιοί de uma molécula "splinker", isto é, um primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de 80 cadeia dupla, com uma cadeia suspensa GTG foram fornecidos num contentor de reacção em 25 a 200 μΐ de tampão de reacção. Depois, foram adicionados 20-200 pmol da mistura de 10 moléculas âncora, isto é, a primeira biblioteca de oligonucleótidos. Estas âncoras estão presentes na mistura em quantidades equimolares e todas têm a mesma protrusão de cadeia simples (CAC, correspondente à primeira extensão da sequência alvo), que é complementar à cadeia suspensa da molécula "splinker", mas diferem na sua parte variável adjacente representando os codões de 10 diferentes aminoácidos (ver Quadro 2) . Após a adição de 10 a 50 U de T4-ADN-Ligase, as moléculas foram ligadas durante 60 minutos a 25°C, originando um conjunto de primeiros produtos de ligação. 2) Isolamento de um conjunto de primeiros Oligonucleótidos Alongados, pelo menos Parcialmente de Cadeia Dupla, A variedade de primeiros produtos de ligação foi imobilizada, por meio da sua fracção de biotina, a um contentor revestido de estreptavidina durante 15 minutos, a temperatura ambiente. 0 material não ligado foi retirado por três lavagens com tampão de lavagem (33 mM de Tris/Acetato, 10 mM de Acetato de Magnésio, 66 mM de acetato de Potássio r com pH de 7,9). Depois foram adicionadas, 10 a 100 u de uma enzima de restrição, como a

Eamll04I, que é o segundo tipo de enzima de restrição IIS, em 25 a 200 μΐ de tampão de reacção, seguindo-se uma incubação de 15 a 90 minutos, a 37°C. A variedade de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, então, libertada, foi transferida para um novo contentor. 3) Segunda Ligação

Foram adicionadas 20-200 pmol da mistura de 100 diferentes moléculas de ancoragem (10 tripletos como os da primeira metade da segunda extensão multiplicados por 10 81 tripletos como os da segunda metade da segunda extensão, em que a segunda extensão é a extensão da biblioteca de ácidos nucleicos a ser preparada e que fornece as posições variáveis), isto é, a segunda biblioteca de oligonucleótidos, ao conjunto dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em 25 a 200 μΐ de tampão de reacção. Todas as moléculas âncora estavam presentes na mistura em quantidades equimolares sendo que diferem nas suas protrusões de cadeia simples (correspondentes à primeira metade da segunda extensão da sequência alvo) que são complementares às 10 diferentes cadeias suspensas fornecidas pela variedade de primeiros oligonucleótidos alongados bem como, na sua parte adjacente. Na parte adjacente também se forneceram, 10 codões diferentes obtendo-se uma mistura combinatória de 100 âncoras. Após a adição de 10 a 50 U de T4-ADN-Ligase, as moléculas foram ligadas durante 60 minutos a 25°C, originando uma variedade de segundos produtos de ligação. 4) Isolamento de uma variedade de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, A variedade de segundos produtos de ligação foi imobilizada, por meio da sua fracção de biotina, a um contentor revestido de estreptavidina durante 15 minutos, a temperatura ambiente. O material não ligado foi retirado por três lavagens com tampão de lavagem. Depois, foram adicionadas 10 a 100 U de uma enzima de restrição, como a Eamll04I, que é o segundo tipo de enzima de restrição IIS em 25 a 200 μΐ de tampão de reacção, seguindo-se uma incubação de 15 a 90 minutos, a 37°C. 0 conjunto de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, então, libertado, foi transferido para um novo contentor. 5) Terceira ligação 82

Foram adicionadas 20-200 μπιοί da mistura de 10 moléculas âncora, isto é, a terceira biblioteca de oligonucleótidos, ao conjunto de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em 25 a 200 μΐ de tampão de reacção. As moléculas âncora estiveram presentes na mistura em quantidades equimolares sendo que diferem nas suas protrusões de cadeia simples (correspondentes à segunda metade da segunda extensão da sequência alvo) que são complementares às cadeias suspensas fornecidas pela variedade de primeiros oligonucleótidos alongados mas são todas idênticas na sua parte adjacente conformando a terceira extensão da sequência alvo. Após a adição de 10 a 50 U de T4-ADN-Ligase, as moléculas foram ligadas durante 60 minutos a 25°C, originando um terceiro produto de ligação que consiste, efectivamente, numa variedade de terceiros produtos de ligação. 6) Isolamento de uma Variedade de Segundos Oligonucleótidos Alongados, pelo menos Parcialmente de Cadeia Dupla A variedade de terceiros produtos de ligação foi imobilizada por meio do seu resíduo de biotina, a um contentor revestido de estreptavidina, durante 15 minutos, a temperatura ambiente. 0 material não ligado foi retirado por três lavagens com tampão de lavagem. Depois, foram adicionadas 10 a 100 U de uma enzima de restrição, como a Eamll04I, que é o segundo tipo de enzima de restrição IIS, em 25 a 200 μΐ de tampão de reacção, seguindo-se uma incubação de 15 a 90 minutos, a 37°C. O conjunto dos terceiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, então, libertado, foi transferido para um novo contentor. 7) Quarta ligação

Foram adicionadas 20-200 pmol de uma molécula âncora, isto é, o quinto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma cadeia suspensa (ACA, 83 correspondente à terceira extensão da sequência alvo) que é complementar à cadeia suspensa fornecida pelo conjunto dos terceiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, (TGT) , a uma variedade de terceiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, a um tampão de reacção de 25 a 200 μΐ. Após a adição de 10 a 50 U de T4-ADN-Ligase, as moléculas foram ligadas durante 60 minutos, a 25°C, originando um quarto produto de ligação que consiste, efetivamente, numa variedade de quartos produtos de ligação. 8) Síntese de Um Bloco de Elongação

Este ciclo de elongamento que compreende a ligação do produto de ligação a uma superfície de estreptavidina, em que se clivou o produto imobilizado através da Eamll04I e se ligaram os oligonucleótidos alongados então, libertados com uma âncora apropriada, foi repetido duas vezes obtendo-se uma variedade de sextos produtos de ligação, também, referidos como blocos de elongação. As condições de cada etapa de reacção foram as descritas acima. 9) Síntese do Produto Final O bloco de elongação sintetizado foi usado na síntese subsequente do produto genético completo através do método de transposição anteriormente, descrito (Solicitação de Patente Internacional WO 00/75368) 10) Avaliação de Qualidade do Produto Final 0 produto final, isto é, a biblioteca de ácidos nucleicos com uma extensão variável que compreende dois tripletos, em que cada tripleto codifica um, num total de 10 aminoácidos possíveis na respectiva posição, foi clonado num vector normalizado sequenciando-se 62 clones

individuais. As sequências aparentaram ser idênticas exceto nas suas duas posições variáveis particulares. A nas distribuição obtida para os 10 codões diferentes, 84 posições variáveis, é mostrada na Quadro 2. QUADRO 2

Tripleto Tripleto variável 1 Tripleto variável 2 AAA 3 5 ATG 9 5 ACT 8 5 CCC 6 7 CCG 10 7 CTG 9 10 GAT 7 2 GCA 4 7 TTA 4 7 TGG 2 7 TOTAL 62 62

Os respectivos valores e a análise estatística são indicados na Fig. 6 que é um histograma de frequências de codões obtidas em dois tripletos consecutivos. 0 valor de μ esperado para cada um dos 10 codões numa amostra de 62 é 6.2, se for assumida uma distribuição equitativa. Observando igualmente ambos tripletos, todas as frequências observadas estão completamente contidas no intervalo de 2 desvios padrões da distribuição normal. Este resultado sustenta a hipótese de uma distribuição equitativa uma vez que, neste caso, mais de 95% das frequências devem estar presentes neste intervalo. A hipótese é confirmada pelo resultado de que 13 das 20 frequências (65%) estão contidas num intervalo de 1 desvio padrão de uma distribuição equitativa estando novamente, de acordo com os requisitos estatísticos de uma distribuição equitativa.

Exemplo 3: Fabrico de Biblioteca de Ácidos Nucleicos com uma Única Posição Variável com Proporções Definidas

Um exemplo de geração de uma biblioteca com uma única posição variável em que os codões ocorrem em 85 proporções definidas, é descrito abaixo, em mais detalhe. Até agora, o exemplo actual ilustra uma execução do método de acordo com o primeiro aspecto da invenção eminente. A posição variável contém 10 codões diferentes. A utilização do codão foi adaptada a E. coli. 1) Primeira Ligação

Numa primeira reacção (Rl), foram fornecidas 20-200 μπιοί de uma molécula "splinker", isto é, um primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma cadeia suspensa GCC (no sentido 5' -> 3', correspondente à primeira extensão da sequência alvo) num contentor de reacção com um tampão de reacção de 25 a 200 μΐ. Depois, foram adicionadas 20-200 μπιοί da mistura de 10 moléculas âncora, isto é, a primeira biblioteca de oligonucleótidos. Todas estas âncoras têm a mesma protrusão de cadeia simples (GGC; no sentido 5' -> 3') que é complementar à cadeia suspensa da molécula "splinker" mas diferem na sua parte variável adjacente, representando os codões de 10 diferentes aminoácidos (ver Quadro 1). Todas as moléculas âncora estiveram presentes em quantidades equimolares (representando cada âncora, 10% da quantidade total) . Após a adição de 10 a 50 U de T4-ADN-Ligase, as moléculas foram ligadas durante 60 minutos, a 25°C, originando um conjunto de primeiros produtos de ligação.

Numa reacção paralela (R2), foram novamente fornecidas, 20-200 μπιοί de uma molécula "splinker", isto é, um primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma cadeia suspensa GCC (no sentido 5' -> 3', correspondente à primeira extensão da sequência alvo) num contentor de reacção em 25 a 200 μΐ de tampão de reacção. Depois, foram adicionadas 20-200 pmol da mistura de 10 moléculas âncora, isto é, a primeira biblioteca de oligonucleótidos. Todas estas âncoras têm a mesma protrusão de cadeia simples (GGC; no sentido 5' -> 3') que é complementar à cadeia suspensa da molécula "splinker" mas 86 diferem na sua parte variável adjacente, representando os codões de 10 diferentes aminoácidos (ver Quadro 1) . Em contraste com a primeira reacção, desta vez uma das moléculas âncora (ostentando uma cadeia suspensa TTT após restrição com a Eamll04I, 30% da quantidade total) está presente em excesso em relação às outras nove âncoras (cada uma representando 7,8% da quantidade total). Após a adição de 10 a 50 U de T4-ADN-Ligase, as moléculas foram ligadas durante 60 minutos, a 25°C, originando um conjunto de primeiros produtos de ligação. 2) Isolamento de um conjunto de primeiros Oligonucleótidos Alongados, pelo menos Parcialmente de Cadeia Dupla, A variedade de primeiros produtos de ligação foi imobilizada, por meio da sua fracção de biotina, a um contentor revestido de estreptavidina durante 15 minutos, a temperatura ambiente. 0 material não ligado foi retirado por três lavagens com tampão de lavagem (33 mM de Tris/Acetato, 10 mM de Acetato de Magnésio, 66 mM de acetato de Potássio, com pH de 7,9). Depois, 10 a 100 U de uma enzima de restrição, como a Eamll04I que é o segundo tipo de enzima de restrição IIS, foram adicionadas em 25 a 200 μΐ de tampão de reacção, μΐ seguindo-se uma incubação de 15 a 90 minutos, a 37°C. A variedade de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, então, libertada, foi transferida para um novo contentor.

As reacções RI e R2 foram corridas em paralelo. 3) Segunda Ligação

Foram adicionadas 20-200 pmol da mistura de 10 moléculas âncora, isto é, a segunda biblioteca de oligonucleótidos, a primeira reacção (Rl) contendo o conjunto de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, a um tampão de reacção de 25 a 200 μΐ. As moléculas âncora diferem nas suas 87 protrusões de cadeia simples (correspondentes à segunda extensão da sequência alvo) que são complementares às cadeias suspensas fornecidas pela variedade de primeiros oligonucleótidos alongados mas são todas idênticas na sua parte adjacente. Todas as moléculas âncora estiveram presentes em quantidades equimolares (representando cada âncora, 10% da quantidade total). Após a adição de 10 a 50 U de T4-ADN-Ligase, as moléculas foram ligadas durante 60 minutos, a 25°C, originando uma variedade de segundos produtos de ligação.

Em paralelo, adicionaram-se 20-200 pmol da mistura de 10 moléculas âncora, isto é, a segunda biblioteca de oligonucleótidos, à segunda reacção (R2) contendo o conjunto de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em 25 a 200 μΐ de tampão de reacção. As moléculas âncora diferem nas suas protrusões de cadeia simples (correspondentes à segunda extensão da sequência alvo) que são complementares às cadeias suspensas fornecidas pela variedade de primeiros oligonucleótidos alongados mas são todas idênticas na sua parte adjacente. Uma das moléculas âncora continha uma cadeia suspensa (AAA) que é complementar à cadeia suspensa fornecida pelo membro do conjunto dos primeiros oligonucleótidos alongados presente, numa quantidade de 30% da quantidade total, na primeira ligação e esta âncora esteve também, presente, numa quantidade de 30%, da segunda biblioteca de oligonucleótidos. As outras nove âncoras estiveram presentes em quantidades de 7,8%, cada uma. Após a adição de 10 a 50 U de T4-ADN-Ligase, as moléculas foram ligadas durante 60 minutos, a 25°C, originando uma variedade de segundos produtos de ligação. 4) Isolamento de uma Variedade de Segundos Oligonucleótidos Alongados, pelo menos Parcialmente de Cadeia Dupla A variedade de segundos produtos de ligação foi 88 imobilizada, por meio da sua fracção de biotina, a um contentor revestido de estreptavidina, durante 15 minutos, a temperatura ambiente. 0 material não ligado foi retirado por três lavagens com tampão de lavagem. Depois, adicionaram-se 10 a 100 U de uma enzima de restrição, como a Eamll04I, que é o segundo tipo de enzima de restrição IIS, em 25 a 200 μΐ de tampão de reacção, seguindo-se uma incubação de 15 a 90 minutos, a 37°C. 0 conjunto de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, então, libertado, foi transferido para um novo contentor.

As reacções RI e R2 foram corridas em paralelo. 5) Terceira Ligação

Adicionaram-se 20-200 μπιοί de uma molécula âncora, com uma cadeia suspensa que é complementar à cadeia suspensa fornecida pelo conjunto de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e que é o quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, ao conjunto de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em 25 a 200 μΐ de tampão de reacção. Após a adição de 10 a 50 U de T4-DNALigase as moléculas foram ligadas durante 60 minutos, a 25°C, originando uma variedade de terceiros produtos de ligação.

As reacções RI e R2 foram corridas em paralelo. 6) Sintese de Um Bloco de Elongação

Este ciclo de elongamento que compreende a ligação dos produtos de ligação a uma superfície de estreptavidina, clivagem dos produtos imobilizados pela Eamll04I e ligação dos oligonucleótidos alongados daí, libertados com uma âncora apropriada, foi repetido três vezes resultando numa variedade de sextos produtos de ligação, também, referidos como blocos de elongação. As condições de cada etapa de reacção foram as descritas acima. 89

As reacções RI e R2 foram corridas em paralelo. 7) Síntese do Produto Final

Usaram-se os blocos de elongação sintetizados na sintese subsequente dos produtos genéticos completos, isto é, a biblioteca de ácidos nucleicos a ser preparada, através do método de transposição anteriormente, descrito (Solicitação de Patente Internacional WO 00/75368) S) Avaliação de Qualidade do Produto Final

Os produtos finais, isto é, bibliotecas de ácidos nucleicos com uma única posição variável, em que podem ocorrer 10 codões diferentes em proporções equimolares (Rl) ou não equimolares ou enviesadas, (R2), foram clonados num vector normalizado e 96 clones individuais foram sequenciados. Como por preferência, aqui usado, o termo enviesada refere-se à mistura que compreende vários tipos de moléculas, em que um ou vários tipos de moléculas, estão contidos em proporção não equimolar quando comparados com um ou vários outros tipos de moléculas. As sequências aparentaram ser idênticas exceto nas suas posições variáveis particulares. A distribuição obtida para os 10 codões diferentes na posição variável é mostrada na Quadro 3 . QUADRO 3 TRIPLETO R 1 R 2 AAA 12 30 ATG 4 5 ACT 7 9 CCC 9 6 CCG 11 10 CTG 14 6 GAT 9 8 GCA 8 7 TTA 15 4 TGG 7 11

Total 96 96 90

Os respectivos valores e a análise estatística são indicados na Figs. 7 e 8 que são histogramas de frequências de codões obtidas numa única posição variável. A Fig. 7 mostra a ocorrência de diferentes codões numa biblioteca com distribuição equimolar (Ri), a Fig. 8 mostra a ocorrência de diferentes codões numa biblioteca em que o tripleto AAA está presente num excesso de três vezes em relação aos outros codões (R2).

Na Rl, o valor de μ esperado para cada um dos 10 codões numa amostra de 96 é 9.6, se for assumida uma distribuição equitativa. Neste caso, é esperado que mais de 95% de todos os codões estejam contidos num intervalo de dois desvios padrão (μ+/-2σ). Neste exemplo, todas as frequências observadas estão contidas num intervalo de 2 desvios padrões da distribuição normal, sustentando a hipótese de que a distribuição das frequências de codões é equitativa. A hipótese é confirmada pelo resultado de que 7 das 10 frequências (70%) estão contidas num intervalo de 1 desvio padrão de uma distribuição equitativa, estando novamente, de acordo com os requisitos estatísticos de uma distribuição equitativa (mais de 65% de frequências num intervalo de 1 desvio padrão).

Na R2, o valor de μ esperado para o codão AAA numa amostra de 96 é 28.8, se se assumir que a distribuição segue as especificações aplicadas. Correspondentemente, o valor esperado para os outros nove codões é 7.5. No caso de uma distribuição especificada é espectável que mais de 95% de todos os codões estejam contidos num intervalo de dois desvios padrão (μ+/-2σ). Neste exemplo, todas as frequências observadas estão contidas num intervalo de 2 desvios padrões em relação ao respectivo valor esperado, sustentando a hipótese da ocorrência da distribuição especificada para as frequências dos codões. A hipótese é confirmada pelo resultado de que 8 das 10 frequências (80%) estão contidas num intervalo de 1 desvio padrão da 91 distribuição especificada estando novamente, de acordo com os requisitos estatísticos de uma distribuição especificada (mais de 65% das frequências no intervalo de 1 desvio padrão).

As características da presente invenção reveladas nas especificações, na lista de sequências, nas reivindicações e/ou nas figuras tanto separadamente como em qualquer combinação, podem servir de material para compreender a invenção nas suas várias formas. 92

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> Sloning BioTechnology GMBH <120> Método de preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos

<130> S 10040 EP-EP <150> EP 08 006 472.8 <151> 31-03-2008 <160> 24 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 1 cacatggaga ca 12 <210> 2 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 2 93 cactatgaga ca 2 <210> 3 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 3 cacgaggaga ca 12 <210> 4 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 4 tgtctccatg tg 12 <210> 5 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 5 tgtctcatag tg 12 94 <210> 6 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético < 4 0 0 > 6 tgtctcctcg tg 12 <210> 7 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 7 cacatgctca ca 12 <210> 8 <211> 12

<212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 8 cactatctca ca 12

<210> 9 <211> 12 <212> ADN 95 <213> Artificial <220> <223> sintético < 4 0 0 > 9 cacgagctca ca 12 <210> 10 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 10 tgtgagcatg tg 12 <210> 11 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 11 tgtgagatag tg 12 <210> 12 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> 96 <223> sintético <400> 12 tgtgagctcg tg 12

<210> 13 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <40 0> 13 cacatggaga ca 12 <210> 14 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 14 cactatgaga ca 12 <210> 15 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético 97 <400> 15 cacgaggaga ca 12 <210> 16 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 16 tgtctccatg tg 12 <210> 17 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 17 tgtctcatag tg 12 <210> 18 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 18 98 tgtctcctcg tg 12 <210> 19 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 19 cacatgttta ca 12 <210> 20 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 20 cactatttta ca 12 <210> 21 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 21 cacgagttta ca 12 99 <210> 22 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 22 tgtaaacatg tg 12 <210> 23 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 23 tgtaaaatag tg 12 <210> 24 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> sintético <400> 24 tgtaaactcg tg 12 100

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 4652639 A, Stabinsky [0003] • US 5132215 A, Jayaraman [0003] • US 5093251 A, Richards [0003] • US 6472184 B [0006] • WO 9815567 A [0007] • US 6110668 A [0007] • WO 9947536 A [0008] • WO 0075368 A [0009] [0016] [0044] [0045] [0048] [0057] [0075] [0092] [0126] [0138] [0154] • EP 0533838 A [0047] • EP 08006472 A [0160]

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos compreendendo um conjunto de elementos, em que cada elemento da referida biblioteca de ácidos nucleicos compreende uma primeira extensão de nucleótidos, uma segunda extensão de nucleótidos e uma terceira extensão de nucleótidos, em que as sequências da primeira extensão de nucleótidos e da terceira extensão de nucleótidos são idênticas em cada elemento da biblioteca de ácidos nucleicos e os elementos da biblioteca de ácidos nucleicos diferem na sequência da segunda extensão de nucleótidos, sendo que o método compreende as etapas seguintes: a) fornecer um primeiro oligonucleótido, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla com uma protrusão de cadeia simples (overhang) , em que a protrusão de cadeia simples fornece uma sequência de nucleótidos correspondendo à sequência da primeira ou terceira extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos, em que o oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um primeiro tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento, b) fornecer uma primeira biblioteca de oligonucleótidos que compreende vários membros, em que cada membro é um segundo oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla, em que o segundo oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um segundo tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento e uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples, ou parte desta, é a mesma para os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos e em que essa protrusão de cadeia simples é essencialmente complementar à protrusão de cadeia simples 2 do primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em que a estrutura de cadeia dupla compreende a extensão de nucleótidos sendo que os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos diferem na sequência dessa extensão de nucleótidos e a sequência dessa extensão de nucleótidos dos membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos corresponde à sequência, ou parte desta, da segunda extensão de nucleótidos dos elementos de uma biblioteca de ácidos nucleicos, c) combinar o primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e a primeira biblioteca de oligonucleótidos e ligar uma molécula do primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma molécula de cada membro da primeira biblioteca de oligonucleótidos por meio das suas protrusões de cadeia simples, formando assim um primeiro produto de ligação, d) cortar o primeiro produto de ligação com o referido segundo tipo de enzima de restrição IIS, em que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do membro da primeira biblioteca de oligonucleótidos, em que essa clivagem fornece um conjunto de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e segundos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e) retirar os segundos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, f) fornecer uma segunda biblioteca de oligonucleótidos que compreende vários membros, em que cada membro é um terceiro oligonucleótido, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla, em que o terceiro oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um terceiro tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento, e uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples, ou parte desta, 3 difere dos membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos e em que essas protrusões de cadeia simples, ou parte destas, do terceiro oligonucleótido são essencialmente complementares às protrusões de cadeia simples dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e em que os membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos compreendem uma extensão de nucleótidos na estrutura de cadeia dupla que é idêntica em todos os membros e corresponde à sequência, ou parte desta, da terceira ou primeira extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos, g) combinar o conjunto dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e a segunda biblioteca de oligonucleótidos e ligar cada molécula do conjunto dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma molécula de cada um dos membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos, em que a protrusão de cadeia simples do primeiro oligonucleótido alongado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, é essencialmente complementar à protrusão de cadeia simples do terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, após o que é formado um segundo produto de ligação, h) cortar o segundo produto de ligação com o terceiro tipo de enzima de restrição IIS, sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos dos terceiros oligonucleótidos, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, originando um conjunto de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e de terceiros oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, i) retirar os terceiros oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, j) fornecer um quarto oligonucleótido, pelo menos, 4 parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla, com uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples fornece uma sequência de nucleótidos essencialmente complementar à protrusão de cadeia simples do segundo oligonucleótido alongado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em que o oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um quarto tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento, k) combinar o quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e o conjunto dos segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e ligar uma molécula do quarto oligonucleótido e cada molécula do conjunto dos segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, formando um terceiro produto de ligação; l) cortar o terceiro produto de ligação com o quarto tipo de enzima de restrição IIS, sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do(s) quarto(s) oligonucleótido(s) , pelo menos parcialmente de cadeia dupla, originando um conjunto de terceiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e um quarto oligonucleótido encurtado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e m) retirar o quarto oligonucleótido encurtado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla.

2. 0 método, de acordo com a revindicação 1, compreendendo ainda, as seguintes etapas: n) repetir as etapas j) a m) como etapas ja) a ma), em que o quarto oligonucleótido, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, da etapa j) é um oligonucleótido adicional, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, na etapa ja) , o terceiro produto de ligação na etapa k) é um produto de ligação adicional na etapa ka) , a variedade de terceiros 5 oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, na etapa 1) é uma variedade de oligonucleótidos alongados adicionais, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, na etapa la) , e o quarto oligonucleótido encurtado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, da etapa 1) é um oligonucleótido encurtado adicional, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, na etapa la).

3. 0 método de acordo com a revindicação 2, em que após a etapa de ligação ka) o produto de ligação adicional é clivado sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do oligonucleótido alongado adicional, pelo menos parcialmente de cadeia dupla.

4. Um método de preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos compreendendo um conjunto de elementos, em que cada elemento da referida biblioteca de ácidos nucleicos compreende uma primeira extensão de nucleótidos, uma segunda extensão de nucleótidos e uma terceira extensão de nucleótidos, em que as sequências da primeira extensão de nucleótidos e da terceira extensão de nucleótidos são idênticas em cada elemento de uma biblioteca de ácidos nucleicos e os elementos de uma biblioteca de ácidos nucleicos diferem na sequência da segunda extensão de nucleótidos, sendo que o método compreende as etapas seguintes: a) fornecer um primeiro oligonucleótido, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla com uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples fornece uma sequência de nucleótidos correspondendo à sequência da primeira ou terceira extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos, em que o oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para 6 o primeiro tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento b) fornecer uma primeira biblioteca de oligonucleótidos que compreende vários membros, em que cada membro é um segundo oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla, em que o oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, para um segundo tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento e uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples, ou parte desta, é a mesma para os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos e em que essa protrusão de cadeia simples é essencialmente complementar à protrusão de cadeia simples do primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em que a estrutura de cadeia dupla compreende uma extensão de nucleótidos, sendo que os membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos diferem na sequência dessa extensão de nucleótidos e a sequência dessa extensão de nucleótidos dos membros da primeira biblioteca de oligonucleótidos corresponde à sequência, ou parte desta, da segunda extensão de nucleótidos dos elementos de uma biblioteca de ácidos nucleicos, c) combinar o primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e a primeira biblioteca de oligonucleótidos e ligar uma molécula do primeiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma molécula de cada membro da primeira biblioteca de oligonucleótidos por meio das suas protrusões de cadeia simples, após o que a primeiro produto de ligação é formado, d) cortar o primeiro produto de ligação com o referido segundo tipo de enzima de restrição IIS, em que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do membro da primeira biblioteca de oligonucleótidos, em que essa 7 clivagem fornece um conjunto de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e segundos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em que essa variedade de primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, consiste em várias espécies de moléculas que diferem na sequência da protrusão de cadeia simples, e) retirar os segundos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, f) fornecer uma segunda biblioteca de oligonucleótidos que compreende vários subgrupos de oligonucleótidos e em que cada subgrupo compreende vários membros, em que cada membro é um terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla, em que o terceiro oligonucleótido compreende um local de reconhecimento, ou parte deste, de um terceiro tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento, e uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples, ou parte desta, é diferente para os vários subgrupos de oligonucleótidos da segunda biblioteca de oligonucleótidos e em que a protrusão de cadeia simples, ou parte desta, de cada subgrupo da segunda biblioteca de oligonucleótidos é essencialmente complementar à protrusão de cadeia simples de cada espécie de molécula dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e em que os membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos compreendem uma extensão de nucleótidos na estrutura de cadeia dupla que é diferente nos membros de cada subgrupo da segunda biblioteca de oligonucleótidos e corresponde à sequência, ou parte desta, da segunda extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos, g) combinar o conjunto dos primeiros oligonucleótidos 8 alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e a segunda biblioteca de oligonucleótidos e ligar cada molécula do conjunto dos primeiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com cada molécula dos membros da segunda biblioteca de oligonucleótidos, sendo que essas moléculas estão ligadas e as suas protrusões de cadeia simples são essencialmente complementares entre si, formando-se por conseguinte, segundos produtos de ligação, h) cortar os segundos produtos de ligação com o terceiro tipo de enzima de restrição IIS, em que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, originando um conjunto de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e terceiros oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em que esse conjunto de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, consiste em vários subgrupos que diferem nas suas protrusões de cadeia simples, i) retirar os terceiros oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, j) fornecer uma terceira biblioteca de oligonucleótidos compreendendo vários membros, em que cada membro é um quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla com uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples fornece uma sequência de nucleótidos essencialmente complementar às protrusões de cadeia simples dos segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e uma extensão, preferencialmente, adjacente à referida protusão de cadeia que é idêntica nos vários membros e gera a terceira ou primeira extensão de nucleótidos dos elementos de uma biblioteca de ácidos nucleicos, sendo que os membros da terceira biblioteca de 9 oligonucleótidos diferem nas suas protrusões de cadeia simples e as profusões de cadeia simples correspondem à segunda extensão, ou parte desta, da biblioteca de ácidos nucleicos, onde os oligonucleótidos compreendem um local de reconhecimento, ou parte deste, para um quarto tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento, k) Combinar o conjunto de segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e a terceira biblioteca de oligonucleótidos e ligar cada molécula dos membros da terceira biblioteca de oligonucleótidos com cada molécula do conjunto dos segundos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, sendo que essas moléculas são ligadas e as suas protrusões de cadeia simples são essencialmente complementares entre si, após o que é formado um terceiro produto de ligação; l) cortar o terceiro produto de ligação com o quarto tipo de enzima de restrição IIS, sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do membro da terceira biblioteca de oligonucleótidos, originando um conjunto de terceiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e quartos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla. m) opcionalmente, retirar o quarto oligonucleótido encurtado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, um n) fornecer um quinto oligonucleótido, pelo menos, parcialmente de cadeia dupla, com uma estrutura de cadeia dupla com uma protrusão de cadeia simples, em que a protrusão de cadeia simples fornece uma sequência de nucleótidos essencialmente complementar à protrusão de cadeia simples do conjunto dos terceiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, em que o quinto oligonucleótido compreende um local de 10 reconhecimento, ou parte deste, para um quinto tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior do seu local de reconhecimento, o) combinar o conjunto dos terceiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e a quarta biblioteca de oligonucleótidos e ligar cada molécula do conjunto dos terceiros oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma molécula do quinto oligonucleótido pelo menos de cadeia dupla, após o que é formado um quarto produto de ligação; p) cortar o quarto produto de ligação com o quinto tipo de enzima de restrição IIS, sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do quinto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, originando um conjunto de quartos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, e os quintos oligonucleótidos encurtados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, q) opcionalmente, retirar o quinto oligonucleótido encurtado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla.

5. O método de acordo com a revindicação 4, compreendendo ainda as seguintes etapas: r) repetir as etapas n) a q) como etapas na) a qa) , em que o quinto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, da etapa n) é um oligonucleótido adicional, pelo menos de cadeia dupla na etapa na) , o quarto produto de ligação na etapa o) é um produto de ligação adicional na etapa oa), o conjunto dos quartos oligonucleótidos alongados, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, na etapa p) é um conjunto de oligonucleótidos alongados adicionais, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, na etapa pa), e o quinto oligonucleótido encurtado, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, da etapa p) é um oligonucleótido encurtado adicional, pelo menos 11 parcialmente de cadeia dupla, na etapa pa).

6. 0 método de acordo com a revindicação 5, em que após a etapa de ligação oa) o produto de ligação adicional é clivado sendo que a clivagem ocorre na sequência de ácidos nucleicos do oligonucleótido alongado adicional, pelo menos parcialmente de cadeia dupla.

7. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 6, onde o primeiro tipo de enzima de restrição IIS é seleccionado a partir do grupo que compreende Bpil, Bbsl, Esp31, BsmBl, Eco311, Bsal, BfuAl, Fokl, BseRl, Bbvl e Bsgl.

8. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 7, onde o segundo, terceiro, quarto, quinto e qualquer tipo adicional de enzima de restrição IIS é seleccionado, individualmente, do grupo compreendendo Earl, Eamll041, Sapl, Lgul, Ksp6321 e BspQl.

9. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 8, onde o ácido nucleico é um ácido nucleico de cadeia simples e o comprimento da segunda extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos consiste em dois nucleótidos, três nucleótidos, quatro nucleótidos, cinco nucleótidos, seis nucleótidos, sete nucleótidos, oito nucleótidos ou múltiplos de três nucleótidos.

10. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 9, onde o ácido nucleico é um ácido nucleico de cadeia dupla e o comprimento da segunda extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos consiste em dois nucleótidos, três nucleótidos, quatro nucleótidos, cinco nucleótidos, seis nucleótidos, sete 12 nucleótidos, oito nucleótidos ou múltiplos de três nucleótidos.

11. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 10, onde a segunda extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos codifica um ou vários aminoácidos.

12. 0 método de acordo com qualquer da reivindicações de 1 a 11, onde o segundo oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, o terceiro oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, o quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, o quinto e qualquer oligonucleótido adicional, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, compreende uma modificação, sendo que essa modificação permite a imobilização do oligonucleótido numa superfície.

13. O método de acordo com a revindicação 12, em que a modificação é seleccionada do grupo compreendendo um resíduo de biotina, um resíduo de digoxigenina, um resíduo de isocianato de fluoresceína, um composto de amino ou um éster de sucinilo.

14. O método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 11, onde a biblioteca de ácidos nucleicos é uma biblioteca de moléculas de ácido nucleico que codificam um ácido nucleico funcional, onde esse ácido nucleico é seleccionado do grupo compreendendo aptâmeros, promotores, ribossomas e moléculas mediadoras de ARNi.

15. O método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 14, onde a biblioteca de ácidos nucleicos é uma biblioteca de moléculas de ácido nucleico que codificam um péptido, polipéptido ou proteína. 13 16. 0 método de acordo com a revindicação 15, onde o péptido, polipéptido e proteína são seleccionados do grupo compreendendo aptâmeros peptídicos, enzimas, enzimas de restrição, domínios de ligação ao ADN, vacinas, anticorpos, proteínas farmaceuticamente activas, "anticalines", "DARPins", nanocorpos e "AdNectines". 17. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 13, onde a biblioteca de ácidos nucleicos é uma biblioteca de moléculas de ácido nucleico que codificam um polipéptido, em que o polipéptido é um polipétido "scaffold" (suporte) que compreende uma ou mais regiões constantes, em que uma ou mais regiões variáveis e em que uma ou várias dessas regiões variáveis é/são codificada(s) pela sequência da segunda extensão de nucleótidos dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos. 18. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 17, onde a segunda extensão de nucleótidos dos elementos de uma biblioteca de ácidos nucleicos é a única diferença entre os elementos referidos. 19. 0 método de fabrico de uma biblioteca de moléculas de ácidos nucleicos, no qual a biblioteca de moléculas nucleicas compreende um conjunto de elementos e estes elementos compreendem, pelo menos, uma extensão constante e pelo menos, uma extensão variável, em que, a pelo menos uma extensão constante existente compreende uma sequência de nucleótidos, que é a mesma em todos os elementos, e a pelo menos uma extensão variável compreende uma sequência de nucleótidos que difere em todos os elementos, sendo que o método compreende as etapas seguintes: a) fornecer um primeiro oligonucleótido, em que o primeiro oligonucleótido ou é um oligonucleótido, pelo 14 menos parcialmente de cadeia dupla, com uma protrusão de cadeia simples que compreende um local de reconhecimento para um primeiro tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior da sua sequência de reconhecimento, ou uma biblioteca de ácidos nucleicos compreendendo um conjunto de elementos, em que a biblioteca de ácidos nucleicos é uma biblioteca de ácidos nucleicos de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 18 e os elementos da biblioteca de ácidos nucleicos têm uma protrusão de cadeia simples, e os elementos da biblioteca de ácidos nucleicos compreendem um local de reconhecimento para um primeiro tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior da sua sequência de reconhecimento; b) fornecer um segundo oligonucleótido, em que esse segundo oligonucleótido é uma biblioteca de ácido nucleico compreendendo um conjunto de elementos, em que a biblioteca de ácidos nucleicos é uma biblioteca de ácidos nucleicos de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 18 e os elementos de uma biblioteca de ácidos nucleicos têm uma protrusão de cadeia simples que é, pelo menos, parcialmente complementar à protrusão de cadeia simples do oligonucleótido fornecido na etapa a), os elementos de uma biblioteca de ácidos nucleicos compreendem um local de reconhecimento para um segundo tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior da sua sequência de reconhecimento, em que o segundo tipo de enzima de restrição IIS dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos é diferente do primeiro tipo de enzima de restrição IIS do oligonucleótido fornecido na etapa a); c) combinar os oligonucleótidos da etapa a) e da etapa b) e ligar uma molécula do oligonucleótido da etapa a) com cada molécula de cada elemento de uma biblioteca de ácidos nucleicos da etapa b) por meio das suas protrusões de cadeia simples com a condição de que o oligonucleótido da etapa a) seja diferente da biblioteca de ácidos nucleicos 15 de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 18; ou combinar os oligonucleótidos da etapa a) e da etapa b) e ligar cada molécula de cada elemento de uma biblioteca de ácidos nucleicos da etapa a) com cada molécula de cada elemento de uma biblioteca de ácidos nucleicos da etapa b) por meio das suas protrusões de cadeia simples com a condição de que o oligonucleótido da etapa a) seja uma biblioteca de ácidos nucleicos de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 18; d) opcionalmente, retirar reagentes e enzimas que não tenham reagido, e) clivar o produto de ligação da etapa c) com um tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior da sua sequência de reconhecimento, em que a clivagem ocorre no oligonucleótido da etapa a) ou na etapa b) fornecer uma biblioteca de moléculas de ácido nucleico alongadas; e f) opcionalmente, separar as moléculas de ácido nucleico alongadas da mistura de reacção. 20. 0 método de acordo com a revindicaçao 19, em que as etapas a) a f) são repetidas com as condições de que o oligonucleótido da etapa a) seja um quarto oligonucleótido que, ou seja uma biblioteca de moléculas de ácidos nucleicos alongadas, fornecidas na etapa e) , ou um quarto oligonucleótido, pelo menos parcialmente de cadeia dupla, com uma protrusão de cadeia simples e que compreende um local de reconhecimento para um quarto tipo de enzima de restrição IIS que corta pelo exterior da sua sequência de reconhecimento; o oligonucleótido da etapa b) é um terceiro oligonucleótido que é uma biblioteca de moléculas de ácido nucleico alongadas, fornecidas na etapa e), onde o terceiro e o quarto oligonucleótido compreendem, cada um, uma protrusão de cadeia simples e em 16 que ambas as protusões de cadeias simples são, pelo menos, parcialmente complementares entre si; ao combinar os oligonucleótidos da etapa a) e da etapa b) e ligar uma molécula do oligonucleótido da etapa a) com cada molécula de cada elemento da biblioteca de ácidos nucleicos da etapa b) por meio das suas protrusões de cadeia simples, o oligonucleótido da etapa a) é diferente da biblioteca de moléculas de ácido nucleico alongadas da etapa b) ; ou ao combinar os oligonucleótidos da etapa a) e da etapa b) e ligar cada molécula de cada elemento de uma biblioteca de ácidos nucleicos da etapa a) com cada molécula de cada elemento da biblioteca de ácidos nucleicos da etapa b) por meio das suas protrusões de cadeia simples, o oligonucleótido da etapa a) é a biblioteca de moléculas de ácido nucleico alongadas da etapa b) ; e onde na etapa e) uma biblioteca adicional de moléculas de ácido nucleico é obtida. 21. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações de 19 a 20, onde a extensão variável, ou parte desta, é fornecida pela segunda extensão dos elementos da biblioteca de ácidos nucleicos, como descrito em qualquer das reivindicações de 1 a 20. 22. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações de 19 a 21, onde a extensão constante, ou parte desta, é fornecida pela primeira e/ou terceira extensão dos elementos de uma biblioteca de ácidos nucleicos, como descrito em qualquer das reivindicações de 1 a 18. 23. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 18, onde a proporção dos vários elementos e membros das bibliotecas usadas em qualquer desses métodos é equimolar. 17 24. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 18, onde a proporção dos vários elementos e membros das bibliotecas usadas em qualquer desses métodos é não equimolar ou enviesada.