ES2378090T3 - Clústeres de genes biosintéticos lantibióticos a partir de A. garbadinensis y A. liguriae - Google Patents

Abstract

Compuesto de fórmula: **Fórmula** donde: -X1-X2- representan -Leu-Val-;-Y- es -S-;Z es o bien un aminoácido o -NH2 donde el último representa la N-terminal de Ala en la posición 1;R representa -OH o-NR1R2, donde R1 y R2 independientemente representa: (i) hidrógeno; (ii) un grupo de fórmula - (CH2) n-NR3R4, en la que n representa un entero de 2 a 8 y R3 y R4 independientemente representan hidrógeno o alquilo C1-4, o R3 y R4 conjuntamente representan un grupo - (CH2) 3-, - (CH2) 4-, (CH2) 2-O- (CH2) 2-,- (CH2) 2-S- (CH2) 2 o- (CH2) -;o R1 y R2 conjuntamente con el átomo de nitrógeno adyacente representan una mitad de piperazina que puede estar substituida en la posición 4 con un substituyente seleccionado a partir de:(a) alquilo C1-4;(b) cicloalquilo C5-7;(c) piridil, (d) - (CH2) p-NR5R6 en el que p representa un entero de 1 a 8 y R5 y R6 independientemente representan hidrógeno o alquilo C1-4;(e) piperidinil;(f) piperidinil substituido, donde el piperindinil substituido lleva un substituyente N que es alquilo C1-4; (g) bencil;y (h) bencil substituido, donde el grupo fenil lleva 1 ó 2 substituyentes seleccionados entre cloro, bromo, nitro, alquilo C1-4 y alcoxi C1-4 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

Clústeres de genes biosintéticos lantibióticos a partir de A. Garbadinensis y A. Liguriae

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a la caracterización del clúster del gen biosintético para la actagardina como lantibiótico, a la identificación de una nueva variante de la actagardina y a sus clústeres biosintéticos y a los procedimientos para su preparación y a la utilización de la actagardina, a una nueva variante de la actagardina producida en una cepa de A. liguriae, y a variantes de ambos de estos obtenidas según la presente invención, utilizando genes a partir de clústeres de genes biosintéticos caracterizados.

Antecedentes de la invención

[0002] Los lantibióticos son péptidos que tienen actividad antibiótica y otras, producidos por bacterias Grampositivas. Estos contienen entre otros residuos modificados, los aminoácidos lantionina y metillantionina de tioéter, que entrecruzan la cadena del péptido en una estructura policíclica. Están clasificados en dos clases, tipo-A y tipo-B, aunque dicha clasificación no es problemática. Generalmente, los lantibióticos de tipo-A son anfifílicos alargados que son capaces de formar poros en la membrana bacteriana u otras membranas plasmáticas. Ejemplos son nisin and subtilin. Los lantibióticos de tipo-B, por contra, son globulares, péptidos definidos conformacionalmente que inhiben las funciones enzimáticas. Ejemplos son cinnamicina y duramicina.

[0003] Las actividades atribuidas a los lantibióticos tipo-B tales como cinnamicina incluyen actividades antimicrobianas (proporcionando aplicación potencial como antibióticos), inhibición de la enzima convertidora de la angiotensina (proporcionando una aplicación potencial en la regulación de la presión sanguínea), inmunomodulación vía inhibición de la fosfolipasa A2 (proporcionando una aplicación potencial con anti-inflamatorios), e interferencia con la biosíntesis de la prostaglandina y la leucotriena.

[0004] Los lantibióticos de tipo-B parecen ejercer su actividad mediante la interferencia con las actividades enzimáticas mediante el bloqueo de las substancias respectivas. Por ejemplo, se ha encontrado que los lantibióticos de tipo-B, tales como la mersacidina y la actagardina, inhiben la biosíntesis del peptidoglican; la transglicosilación se identificó como la reacción diana. El sustrato para esta reacción es la pared celular del enlace lipídico del precursor lípido II. Aunque ests es una diana para el lantibiótico vancomicina, el sitio de acción es diferente y es un nuevo sitio de unión a diana no utilizado por ningún fármaco antibacteriano actual.

[0005] Para la clase cinnamicina de lantibióticos de tipo B se ha observado actividad antibacteriana, en particular con cepas de Bacillus, con efectos descritos en las funciones de membrana, translocación de protones dependientes de ATP y aceptación Ca2+ y en ATPasas. También, se ha descrito la formación de poros definidos en membranas planares que contienen fosfatidiletanolamina. Estos efectos pueden atribuirse a la unión específica de estos lantibióticos de tipo B para la fosfatidiletanolamina.

[0006] Los lantibióticos han mostrado tener eficacia y utilidad como aditivos alimentarios y agentes antibacterianos contra acnés propionibacterios y patógenos problemáticos, por ejemplo Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), que es o está desarrollando resistencia a muchos antibióticos habitualmente utilizados, y Streptococcus pneumoniae. Para revisar, véase Sahl y Bierbaum (1998) Rev. Anual Microbiol. 52:41-79; Jack y Sahl (1995) TIBTECH 13:269 278; Gasson (1995) Capítulo 10, Lantibióticos, en Vining y Stuttard (eds) Series de Biotecnología: Genética y Bioquímica de Fabricación de Antibióticos, Biotechnological I 30 Serie 28, páginas 283-306.

[0007] En el campo de los antibióticos existe una continua necesidad de proporcionar nuevos compuestos antibióticos para superar cuestiones tales como la resistencia, bio-compatibilidad, toxicidad y semejantes. En consecuencia, es deseable encontrar procedimientos para la preparación de lantibióticos y la fabricación de formas variantes de lantibióticos (que puedan tener un perfil de actividad diferente comparado con las formas naturales).

[0008] La actagardina es un lantibiótico tetracíclico conocido de tipo B de 19 aminoácidos de longitud (1890 Da). Tiene potente actividad contra patógenos Gram positivos importantes tales como Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes ambos en modelos de animal in vitro e in vivo. La estructura de la actagardina se muestra en la Figura 4. El compuesto se obtiene a partir de un prepro-péptido, la parte C-terminal del cual tiene la secuencia polipeptídica SSGWVCTLTIECGTVICAC (SEQ ID NO: 4). El polipéptido de SEQ ID NO:4 se modifica mediante las siguientes reticulaciones, creando la estructura secundaria y terciaria: RETICULACIÓN 1-6, Lantionina (Ser-Cys); RETICULACIÓN 7-12, Beta-metillantionina (Thr-Cys); RETICULACIÓN 9-17, Betametillantionina (Thr-Cys); RETICULACIÓN 14-19, Beta-metillantionina sulfóxido (Thr-Cys).

[0009] Se ha descrito que la actagardina se produce por dos especies de Actinoplanes; A. garbadinensis y A. liguriae. También se coproduce un análogo en el cual la RETICULACIÓN 14-19 no está oxidada, es decir, es un sulfóxido de betametillantionina no beta-metillantionina que se denomina aquí desoxi-actagardina.

[0010] La patente americana US 6.022.851 describe el aislamiento de la actagardina a partir de las cepas aisladas de A. garbadinensis y A. liguriae.

Descripción de la Invención

[0011] La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula:

donde: -X1-X2- representan -Leu-Val-; -Y- es -S-; Z es o bien un aminoácido o -NH2 donde el último representa la N-terminal de la Ala en la posición 1; R representa -OH o -NR1R2, donde R1 y R2 independientemente representan:

(i)

hidrógeno;

(ii)

un grupo de formula -(CH2)nNR3R4, en el que n representa un número entero de 2 a 8 y R3 y R4 representan independientemente hidrógeno o un alquilo C1-4, o R3 y R4 tomados conjuntamente representa un grupo -(CH2)3-, (CH2)4-, (CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)2-S-(CH2)2 o -(CH2)5-; o R1 y R2 tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno adyacente representan un grupo piperacina que puede estar substituido en la posición 4 con un substituyente seleccionado entre:

(a)

alquilo C1-4;

(b)

cicloalquilo C5-7;

(c)

piridilo,

(d)

-(CH2)p-NR5R6 en el que p representa un número entero de 1 a 8 y R5 y R6 representan independientemente hidrógeno o alquilo C1-4;

(e)

piperidinil;

(f)

piperidinil substituido, donde el piperidinil substituido lleva un substituyente-N que es alquilo C1-4;

(g)

bencilo; y

(h)

bencilo substituido, donde la mitad fenilo lleva 1 ó 2 substituyentes seleccionados entre cloro, bromo, nitro, alquilo C1-4 y alcoxi C1-4,

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0012] En otro aspecto, la invención se refiere a la información normativa estructurada, aclarada, secuenciada y clonada pertinente para el clúster de genes biosintéticos para el lantibiótico de tipo B, actagardina, a partir de

Actinoplanes garbadinensis y A. liguriae.

[0013] También sorprendentemente se ha encontrado que en un aislamiento de A. liguriae, designado aquí como A. liguriae NCIMB 41362, se ha producido una nueva forma de actagardina que los presentes inventores han calificado actagardina B o, en la forma no oxidada, desoxiactagardina B. Estas formas tienen actividad antimicrobiana parecida para la actagardina y están generadas a partir de la secuencia polipeptídica primaria de SEQ ID NO:1, que experimenta reticulación parecida a la actagardina. Las variantes proporcionan nuevas y útiles alternativas a la actagardina. Además, la identificación de los residuos en actagardina B que son diferentes de la actagardina conducen a la fabricación de otros lantibióticos basados en estas diferencias.

[0014] Los inventores también han aislado clústeres de genes aislados a partir de actagardina que produce A. garbadinensis y A. liguriae NCIMB 41362 que comprende los genes para la fabricación de actagardina y actagardina

B.

[0015] En un aspecto, la presente invención proporciona la nueva actagardina B y variantes de la misma, que incluyen variantes basadas en las secuencias polipeptídicas primarias de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3, así como las variantes de las mismas.

[0016] En otro aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican para la actagardina B y sus variantes, juegos de ácidos nucleicos y variantes de los mismos derivados de los clústeres de genes mencionados más arriba, procedimientos de fabricación de actagardina B y sus variantes y procedimiento de generar nuevas variantes de actagardina B.

Descripción de las Figuras

[0017] La Figura 1 proporciona un mapa de la actagardina para codificar y regular el clúster de genes aislado de A. garbadinensis. La Figura 2 proporciona un mapa de la codificación y regulación del clúster de genes aislado de A. liguriae que codifica una nueva variante de actagardina, aquí denominada actagardina B. La Figura 3 proporciona un esquema que muestra un procedimiento descrito en la invención para la generación de variantes de actagardina que utilizan secuencias de ácido nucleico aisladas a partir de A. garbadinensis o a partir de

A. liguriae. La Figura 4 es una representación de la estructura primaria de la actagardina madura donde X1-X2 representa Val-Ile, Y es -S (O)- y Z es NH2. "Desoxi-actagardina B" es la variante Val15Leu Ile16Val con un puente metillantionina no oxidado entre AbuS14 y AlaS19.

Descripción de las secuencias

[0018] Para facilitar la lectura, las secuencias de la presente solicitud se han enumerado de forma no seguida tal y como siguen:

SEQ ID NO:1 es la secuencia peptídica primaria de Actagardina B: SSGWVCTLTIECGTLVCAC.

SEQ ID NO:2 es la secuencia peptídica primaria de Actagardina B variante VV: SSGWVCTLTIECGTVVCAC.

SEQ ID NO:3 es la secuencia peptídica primaria de Actagardina B variante LI SSGWVCTLTIECGTL1CAC.

SEQ ID NO:4 es la secuencia peptídica primaria de Actagardina: SSGWVCTLTIECGTVICAC;

SEQ ID NO:11 es la secuencia peptídica primaria de Ala- Actagardina B: ASSGWVCTLTI ECGTLVCAC.

SEQ ID NO:12 es la secuencia peptídica primaria de Ala- Actagardina B variante VV: ASSGWVCTLTIECGTVVCAC.

SEQ ID NO:13 es la secuencia peptídica primaria de Ala- Actagardina B variante LI ASSGWVCTLTIECGTLICAC.

SEQ ID NO:14 es la secuencia peptídica primaria de Ala- Actagardina: ASSGWVCTLTIECGTVICAC.

SEQ ID NO:212 es la secuencia peptídica primaria de pre-pro- Actagardina B: MSAITVETTWKNTDLREDLTAHPAGLGFGELSFEDLREDRTIYAASSGWVCTLTIECG TLVCAC.

SEQ ID NO:22 es la secuencia peptídica primaria de pre-pro- Actagardina B variante VV: MSAITVETTWKNTDLREDLTAHPAGLGFGELSFEDLREDRTIYAASSGWVCTLTIECG TWCAC.

SEQ ID NO:23 es la secuencia peptídica primaria de pre-pro- Actagardina B variante LI MSALAIEKSWKDVDLRDGATSHPAGLGFGELTFEDLREDRTIYAASSGWVCTLTIECG TLICAC.

SEQ ID NO:119 es la secuencia peptídica primaria de pre-pro- Actagardina: MSALAIEKSWKDVDLRDGATSHPAGLGFGELTFEDLREDRTIYAASSGWVCTLTIECG TVICAC.

SEQ ID NO:100 es el no vector, secuencia de nucleótidos derivada de A. garbadinensis del cósmido CosAG14.

SEQ ID NOs:101 - 132 son secuencias polipeptídicas de los marcos de lectura abiertos orf1 - orf32 de SEQ ID NO:100 respectivamente.

SEQ ID NO:200 es el no vector, secuencia de nucleótidos derivada de A. liguriae del cósmido CosAL02.

10 SEQ ID NOs:201 - 231 son las secuencias polipeptídicas de los marcos de lectura abiertos orf1 - orf31 de SEQ ID NO:200 respectivamente.

SEQ ID NOs:300-312 son las secuencias de iniciadores descritas aquí más abajo.

Descripción Detallada de la Invención

Compuestos

20 [0019] En un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I):

donde: -X1-X2- representan -Leu-Val-; -Val-Val- o -Leu-Ile-; Y es -S- o -S(O)-; y

25 Z es H2N- o Ala-,

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otro aspecto, la invención proporciona variantes y derivados biológicamente activos de estos compuestos.

[0020] Donde -X1-X2- representan -Leu-Val-, Y es -S(O)- y Z es NH2 el compuesto de la invención también se 30 denomina actagardina B.

[0021] Donde -X1-X2- representan -Leu-Val-, Y es -S(O)- y Z es Ala- el compuesto de la invención también se denomina ala-actagardina B.

35 [0022] Donde -X1-X2- representan -Leu-Val-, Y es -S- y Z es NH2 el compuesto de la invención también se denomina desoxi-actagardina B.

[0023] Donde -X1-X2- representan -Leu-Val-, Y es -S- y Z es Ala- el compuesto de la invención también se denomina ala-desoxi-actagardina B.

[0024] Es bien entendido respecto de Z siendo un grupo H2N-, que esta mitad representa la N-terminal del residuo alanina en la posición 1 del compuesto de más arriba. Haciendo referencia al grupo Z siendo Ala-, se entenderá que esta mitad representa una alanina, convencionalmente referida en el estado de la técnica como Ala(0), unida a la alanina en la posición 1 vía

45 un enlace amida.

[0025] En una realización, Z es un aminoácido, por ejemplo seleccionado entre Ala, Ile-, Lys-, Phe-, Val-, Glu-, Asp-, His-, Leu, Arg-, Ser-y Trp- y dichos aminoácidos tienen la configuración L- o D-. En una realización, el aminoácido es Ala.

Variantes

[0026] Una variante de un compuesto de fórmula (I) es un compuesto en el que uno o más, por ejemplo de 1 a 5, tal como 1, 2, 3 ó 4 aminoácidos están substituidos por otro aminoácido. Preferiblemente, el aminoácido está en una posición seleccionada entre las posiciones 2, 3, 4, 5, 8, 10, 11, 13 ó 18 del compuesto de fórmula (I).

[0027] Una variante también puede comprender una substitución en la posición 15 ó 16, siempre que cuando ambas posiciones 15 y 16 estén substituidas y ninguna de las otras posiciones tengan cambios, 15 y 16 no son Val y Ile, respectivamente.

[0028] Donde Z es Ala-, las variantes de los compuestos de la invención incluyen aquellas en las que Ala- está reemplazada por otro aminoácido (especialmente un aminoácido que está de forma natural codificado por el código genético o su isoforma D-), más especialmente, un aminoácido seleccionado a partir del grupo Ile-, Lys-, Phe-, Val-, Glu-, Asp-, His-, Leu, Arg-, Ser- y Trp-. En otro aspecto, el aminoácido puede seleccionarse a partir del grupo Ile-, Lys-, Phe-, Val-, Glu-, Asp-, His-, Leu-, Arg- y Ser-. Dichas variantes pueden obtenerse por adición química del residuo a los compuestos donde Z = H2N, tal y como se describe en US 6.022.851. Podrá apreciarse que la adición química de un aminoácido permite que el aminoácido esté en la configuración L- o D-. Esto incluye D-Ala, además de las formas D- de otros aminoácidos tales como los mencionados más arriba.

Derivados

[0029] Los derivados de los compuestos de la invención (incluyendo variantes) son aquellos en los que una o más cadenas laterales de los aminoácidos del compuesto de la invención ha sido modificada, por ejemplo, por esterificación, amidación u oxidación.

[0030] Los derivados de los compuestos de la invención pueden ser derivados monoamida en una de las funciones carboxi de la actagardina, especialmente en la C-terminal. Más especialmente, un derivado puede ser un compuesto en el que la C-terminal del compuesto de la invención es de fórmula -COR, en el que R representa el grupo -NR1R2, donde R1 y R2 representan independientemente:

(i)

hidrógeno;

(ii)

un grupo de fórmula -(CH2)n-NR3R4, en el que n representa un entero de 2 a 8 y R3 y R4 representan independientemente hidrógeno o alquilo (C1-C4) o R3 y R4 tomados juntos representan un grupo -(CH2)3-, -(CH2)4-, (CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)2-S-(CH2)2- o -(CH2)5-; o R1 y R2 tomados juntos con el átomo del nitrógeno adyacente representan una mitad piperazina que puede estar substituida en la posición 4 con un substituyente seleccionado entre:

(a)

alquilo (C1-C4);

(b)

cicloalquilo (C5-C7),

(c)

piridilo,

(d)

-(CH2)p-NR5R6 en el que p representa un número entero de 1 a 8 y R5 y R6 representan independientemente hidrógeno

o alquilo (C1-C4);

(e)

piperidinilo;

(f)

piperidinilo substituido, donde el piperidinilo substituido lleva un substituyente N que es alquilo (C1-4);

(g)

bencilo; y

(h)

bencilo substituido, donde la mitad fenilo lleva 1 ó 2 substituyentes seleccionados entre cloro, bromo, nitro, alquilo (C1-C4) y alcoxi(C1-C4).

[0031] En una realización, en la fórmula -COR, R representa el grupo -NR1R2, donde R1 y R2 representan independientemente hidrógeno, un grupo de fórmula -(CH2)n-NR3R4, en el que n representa un número entero de 2 a 8 y R3 y R4 representan independientemente hidrógeno o alquilo (C1-C4) o R3 tomados conjuntamente representan un grupo -(CH2)3-, -(CH2)4-, (CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)2-S-(CH2)2- o -(CH2)5-, o R1 y R2 tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno adyacente representan una mitad piperazina que puede estar substituida en la posición 4 con un substituyente seleccionado entre alquilo (C1-C4), cicloalquilo(C5-C7), piridilo, bencilo y bencilo substituido donde la mitad fenilo lleva 1 ó 2 substituyentes seleccionados entre cloro, bromo, nitro, alquilo(C1-C4) y alcoxi(C1-C4).

[0032] Además, un derivado puede contener un compuesto en el que la función carboxi de una cadena lateral de un residuo interno, por ejemplo el del residuo Glu11, se modifica de -COOH a un grupo -COOR5 en el que R5 representa hidrógeno, alquilo (C1-C4) o alcoxi (C1-C4) alquilo (C2-C4).

[0033] Los derivados N-terminal de los compuestos de la invención pueden ser aquellos en los que el grupo amino N-terminal -NH2 está en lugar de un grupo -NHR6 donde R6 representa alquilo C1-4.

[0034] En una realización R es OH.

[0035] En otra realización R1 y R2 del aminoácido en el compuesto representan independientemente:

(i)

hidrógeno;

(ii)

un grupo de fórmula -(CH2)nNR3R4, en el que n representa un número entero de 2 a 8 y R3 y R4 representan independientemente hidrógeno o alquilo C1-4.

[0036] En una realización, el compuesto se selecciona entre el grupo que consiste en: desoxiactagardina B N-[3-dimetilaminopropil]monocarboxamida; desoxiactagardina B N-[1-(1-metil-4-piperidinil)piperazina]monocarboxamida; desoxiactagardina B [1-(3-dimetilaminopropil)piperazina]monocarboxamida; desoxiactagardina B; D-Ala(0)desoxiactagardina B; L-Ile(0)desoxiactagardina B; L-Val(0)desoxiactagardina B; L-Phe(0)desoxiactagardina B; L-Lys(0)desoxiactagardina B; or L-Tryp(0)desoxiactagardina B.

[0037] El término "alquilo (C1-C4)" representa una cadena alquílica lineal o ramificada de 1 a 4 átomos de carbono, tal como: metil, etil, propil, 1-metiletil, butil, 1-metilpropil o 1,1-dimetiletil mientras el término "alquilo (C2-C4) " representa una cadena alquílica lineal o ramificada de 2 a 4 átomos de carbono tal como: etil, propil, 1-metiletil, butil, 1-metilpropil o 1,1-dimetiletil. El término "cicloalquilo (C5-C7) " representa un grupo cicloalquilo seleccionado entre ciclopentil, ciclohexil y cicloheptil.

[0038] El término "alcoxi (C1-C4)" representa una cadena alcoxi lineal o ramificada de 1 a 4 átomos de carbono tal como metoxi, etoxi, propoxi, 1-metiletoxi, butoxi, 1-metilpropoxi y 1,1-dimetiletoxi.

[0039] Los derivados según la presente invención pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos descritos para la fabricación de derivados de actagardina en EP-0195359, la descripción de la cual se incorpora aquí por referencia.

Otras Realizaciones

[0040] Cuando el derivado es un compuesto donde la C-terminal es de fórmula -COR, en el que R representa el grupo -NR1R2, en algunas realizaciones, R1 es H y R2 representa un grupo de fórmula -(CH2)n-NR3R4, en el que n representa un número entero de 2 a 8 y R3 y R4 representan independientemente hidrógeno o alquilo (C1-C4) o R3 y R4 tomados conjuntamente representan un grupo -(CH2)3-, -(CH2)4-, (CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)2-S-(CH2)2- o -(CH2)5-. En estas realizaciones, R3 y R4 preferiblemente representan hidrógeno o alquilo (C1-C4). Más preferiblemente, R3 y R4 representan alquilo (C1-C2), por ejemplo, metil. El número entero n puede ser preferiblemente de 2 a 5, y más preferiblemente de 2 a 4, por ejemplo, 3.

[0041] En otras realizaciones, R1 y R2 tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno adyacente representa una mitad piperazina. El substituyente N en la posición 4 preferiblemente puede seleccionarse entre:

(a)

alquilo (C1-C4);

(b)

cicloalquilo (C5-C7),

(d)

-(CH2)p-NR5R6 en el que p representa un número entero de 1 a 8 y R5 y R6 representan independientemente hidrógeno o alquilo (C1-C4);

(e)

piperidinil; y

(f)

piperidinil substituido, donde el piperidinil substituido lleva un substituyente de N que es alquilo (C1-4).

[0042] Los grupos piperidinil y piperidinil substituido tienen preferiblemente sus átomos de nitrógeno en la posición 4.

[0043] El substituyente N, más preferiblemente, puede seleccionarse entre:

(d)

-(CH2)p-NR5R6 en el que p representa un número entero de 1 a 8 y R5 y R6 representan independientemente hidrógeno

o alquilo (C1-C4); y (f) piperidinil substituido, donde el piperidinil substituido lleva un substituyente N que es alquilo(C1-4).

[0044] Si el substituyente N es -(CH2)p-NR5R6, entonces R5 y R6 preferiblemente pueden ser alquilo (C1-C4), más preferiblemente alquilo (C1-C2), por ejemplo, metilo. Preferiblemente, el número entero p es de 1 a 4, por ejemplo 3.

[0045] Si el substituyente N es piperidinil substituido, entonces, preferiblemente el substituyente N es alquilo (C1-C2), por ejemplo metilo. Tal y como se ha mencionado más arriba, preferiblemente N está en la posición 4.

[0046] La presente invención se refiere a los clústeres de genes de SEQ ID NO:100 y SEQ ID NO:200 y a los polipéptidos codificados por estos clústeres y variantes de los mismos. El polipéptido de SEQ ID NO:119 es pre-proactagardina y el polipéptido de SEQ ID NO:212 es pre-pro-actagardina B. Los polipéptidos restantes y sus variantes (tal y como se definen aquí) se denominan aquí de forma general "polipéptidos de clústeres ". Los polipéptidos de clústeres derivados de SEQ ID NO:100 se denominan "1xx polipéptidos" y aquellos derivados de SEQ ID NO:200 se denominan "2xx polipéptidos". Los polipéptidos que son 100% idénticos en ambas secuencias y longitud a un polipéptido de clúster se denominan polipéptidos de"tipo salvaje". Un polipéptido de clúster derivado de SEQ ID NO:100 o SEQ ID NO:200 puede ser de tipo salvaje o una variante.

[0047] Un polipéptido puede estar en forma substancialmente aislada. Los polipéptidos aislados de la invención serán aquellos definidos más arriba en forma aislada, libres o substancialmente libres de material con el que está asociado de forma natural tal como otros polipéptidos con el que se encuentran en la célula. Por ejemplo, los polipéptidos pueden por supuesto formularse con diluyentes o adyuvantes y todavía aislarse con fines prácticos.

[0048] Un polipéptido de la invención puede también estar en una forma substancialmente purificada, en cuyo caso generalmente comprenderá el polipéptido en una preparación en la que más del 90%, por ejemplo 95%, 98% o 99% del polipéptido en la preparación es un polipéptido de la invención.

Polipéptido lantibiótico y lantibiótico A gen

[0049] En la presente invención, la referencia a un lantibióticoA o polipéptido LanA, Lantibiótico A o gen LanA se refiere de forma general a un polipéptido lantibiótico de tipo B o al gen que codifica para dicho péptido. Así, la referencia a estos incluye la referencia a cinnamicina, mersacidina, actagardina y actagardina B y los genes que codifican para estos productos. La referencia a un lantibiótico que produce células huésped se refiere a cualquier célula huésped que en su forma natural produce un polipéptido LanA, tal y como se define más detalladamente a continuación.

[0050] Un polipéptido LanA es un polipéptido con actividad anti-microbiana. La actividad anti-microbiana puede conocerse mediante la determinación del valor MIC frente un organismo de referencia, por ejemplo Micrococcus luteus. Un polipéptido LanA se considera que muestra actividad anti-microbiana si tiene un valor MIC de menos de o igual a 16 veces superior a la de actagardina frente a la misma cepa del microorganismo de referencia. En la presente invención, el gen Lan A A. garbadinensis se refiere como actA y el gen LanA A. liguriae se refiere como LigA.

Otris Polipéptidos Lan

[0051] Tal y como se utiliza aquí, la referencia a un polipéptido "LanM" es un polipéptido derivado de un clúster de gen lantibiótico que es un factor de modificación requerido para la conversión de un polipéptido precursor a un compuesto lantibiótico. Los polipéptidos LanM incluyen los de SEQ ID N0:120 (ActM) o una variante de los mismos, SEQ ID NO:213 (LigM) o una variante de los mismos, un polipéptido cinM tal y como se define en WO02/0883, un polipéptido mrsM tal y como se define en Altena y otros, 2000, o un polipéptido homólogo a partir de otro clúster de gen de una bacteria que produce un lantibiótico de tipo B.

[0052] La referencia a un polipéptido "LanR" es un polipéptido derivado de un clúster de gen lantibiótico que es un factor de regulación requerido para la regulación de la producción de un polipéptido precursor. Los polipéptidos LanR incluyen los de SEQ ID NO:122 (ActR) o una variante de los mismos, SEQ ID NO:216 (LigR) o una variante de los mismos, un polipéptido cinR1 tal y como se define en WO02/088367, un polipéptido mrsR1 tal y como se describe en Altena y otros, 2000, o un polipéptido homólogo a partir de otro clúster de gen de una bacteria que produce un lantibiótico de tipo B.

[0053] La referencia a un polipéptido "LanT" es un polipéptido derivado de un clúster de gen lantibiótico que es un factor transportador requerido para la producción de un polipéptido precursor a un compuesto lantibiótico. Los polipéptidos LanT incluyen los de SEQ ID NO:123 (ActT) o una variante de los mismos, SEQ ID NO:214 (LigT) o una variante de los mismos, un polipéptido cinT tal y como se define en WO02/088367, un polipéptido mrsT tal y como se describe en Altena y otros, 2000, o un polipéptido homólogo a partir de otro clúster de gen de una bacteria que produce el lantibiótico tipo B.

[0054] La refencia a un polipéptido "LanO" es un polipéptido derivado de un clúster de gen lantibiótico que es un factor que se cree que está involucrado en la oxidación de la forma desoxi de la actagardina y compuestos de la invención para la actagardina

o para compuestos de la invención en los que Y es - S(O)-.

[0055] Los polipéptidos LanO incluyen los de SEQ ID NO:122 (ActO) o una variante de las mismas, SEQ ID NO:215 (LigO) o una variante de las mismas, o un polipéptido homólogo a partir de otro clúster de gen de una bacteria que produce un lantibiótico de tipo B.

Polipéptidos de clústeres

[0056] En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido de clúster aislado seleccionado entre cualquiera de las SEQ ID NOs: 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230 y 231. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido de clúster que es una variante de cualquiera de las secuencias más arriba mencionadas.

[0057] Los polipéptidos de clústeres de particular interés incluyen polipéptidos 1xx y 2xx que son polipéptidos LanM, LanR, LanT o LanO.

[0058] Una "variante", en relación a un polipéptido de clúster, denota: cualquier polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos que sea diferente, pero que muestre identidad significativa de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia (en este caso cualquier polipéptido de clúster de tipo salvaje), o un fragmento de este polipéptido.

[0059] A menos que se especifique lo contrario, una identidad de secuencia de aminoácidos significativa es por lo menos preferiblemente 80%, más preferiblemente 85%, 90% o 95%, todavía más preferiblemente 98% o 99%. Preferiblemente, una variante tiene una longitud igual o al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% y más preferiblemente al menos 95% a la de la longitud del polipéptido de clúster de tipo salvaje.

[0060] "Identidad de secuencia de aminoácidos en porcentaje (%)" se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que es idéntico a los residuos de aminoácidos en la secuencia con la que se compara después de alinear las secuencias e introducir los huecos, si es necesario, para conseguir la máxima identidad de secuencia porcentual, y no considerar ninguna substitución conservadora como parte de la identidad de la secuencia. Los valores de identidad en % utilizados aquí se han generado por BLAST- 2 que se obtuvo a partir de Altschul y otros (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README. html. WU-BLAST- 2 utiliza diversos parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales son valores por defecto. Los parámetros ajustables son los siguientes valores: intervalo de solapamiento =1, fracción por solapamiento=0,125, umbral de palabra (T)=11. Los parámetros HSPS y HSPS2 son valores dinámicos y se establecen por el programa en sí dependiendo de la composición de la secuencia particular y la composición de la base de datos particular frente la cual se busca la secuencia de interés; sin embargo, los valores pueden ajustarse para aumentar la sensibilidad. Un valor de identidad de secuencia de aminoácidos % se determina por el número de residuos idénticos que coinciden dividido por el número total de residuos de la secuencia "más larga” en la región alineada, multiplicado por 100. La secuencia "más larga" es la que tiene la mayoría de los residuos reales en la región alineada (se ignoran los huecos introducidos por WU BLAST-2 para maximizar la puntuación de alineamiento).

[0061] Es deseable que una variante retenga una función biológica del polipéptido de referencia. En la presente invención, se retiene una función biológica donde la variante, cuando está presente en una célula huésped con los otros miembros de su clúster, es capaz de producir un lantibiótico. Esto puede determinarse, por ejemplo, proporcionando una célula huésped que contiene SEQ ID NO: 100 en el caso de una variante del polipéptido de clúster 1xx, o SEQ ID NO:200 en el caso de una variante del polipéptido 2xx, donde las células húesped producen actagardina o actagardina B respectivamente, modificando la secuencia que codifica para la variante, y determinando si todavía se produce un polipéptido lantibiótico.

Polipéptidos precursores

[0062] En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos, preferiblemente en forma aislada, que son precursores de los compuestos de la presente invención o de la actagardina. Los polipéptidos precursores incluyen los polipéptidos de cualquiera de las SEQ ID NOs:1-4, SEQ ID NOs:11-14, SEQ ID NOs:212, 22, 23 y 119, así como las variantes o derivados de los mismos que pueden convertirse a un polipéptido lantibiótico.

[0063] Una variante de un polipéptido precursor de cualquiera de las SEQ ID NOs:1-4 es un polipéptido en el que uno o más, por ejemplo de 1 a 5, tal como 1, 2, 3 ó 4 aminoácidos están substituidos por otro aminoácido. Preferiblemente, está en una posición seleccionada entre las posiciones 2, 3, 4, 5, 8, 10, 11, 13 ó 18 de cualquiera de las SEQ ID NOs:1-4.

[0064] Una variante de un polipéptido precursor de cualquiera de las SEQ ID NOs:11-14 es un polipéptido en el que uno o más, por ejemplo de 1 a 5, tal como 1, 2, 3 ó 4 aminoácidos están substituidos por otro aminoácido. Preferiblemente, el aminoácido está en una posición seleccionada entre las posiciones 3, 4, 5, 6, 9, 11, 12, 14 ó 19 de cualquiera de las SEQ ID NOs:11-14.

[0065] Una variante de un polipéptido precursor de cualquiera de las SEQ ID NOs:212, 22, 23 y 119 es un polipéptido en el que uno o más, por ejemplo de 1 a 5, tal como 1, 2, 3 ó 4 aminoácidos de la región C-terminal

(residuos 46-64) que corresponden a las SEQ ID NOs:1-4 están respectivamente substituidos por otro aminoácido. Preferiblemente, el aminoácido está en una posición seleccionada entre las posiciones que corresponden a 2, 3, 4, 5, 8, 10, 11, 13 ó 18 de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-4. Dichas variantes pueden además incluir cambios en la región N-terminal que retienen por lo menos 70%, por ejemplo por lo menos 80%, preferiblemente por lo menos 90%, por ejemplo por lo menos 95% de las regiones Nterminal (residuos 1-45). Por ejemplo, una variante de la región N-terminal de la SEQ ID NO:212 o SEQ ID NO:119 puede comprender uno o más substituyentes (por ejemplo de 1 a 12, tal como de 1 a 5, por ejemplo 1, 2 ó 3 substituciones en las posiciones 4, 5, 6, 8, 9, 12, 13, 17, 18, 19, 21 y 32 que según los datos muestra variaciones entre SEQ ID NO:212 y 119.

[0066] Las substituciones pueden ser de un aminoácido por otro aminoácido que tiene lugar de forma natural y puede conservar o no las substituciones. Las substituciones conservadas incluyen aquellas que se muestran en la siguiente tabla, donde los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y, preferiblemente, en la misma

[0067] Para la SEQ ID NO:212, las substituciones pueden ser de un aminoácido que difiere del residuo de aminoácido localizado en la localización correspondiente de la SEQ ID NO:119, o viceversa. En cualquier caso, la substitución puede ser introducir el aminoácido de SEQ ID NO:119 en la SEQ ID NO:212, o viceversa (por ejemplo, Ile en la posición 4 de la SEQ ID NO:212 puede estar substituida por Leu, y así sucesivamente).

[0068] Puede obtenerse un polipéptido precursor por la expresión de un ácido nucleico que codifica para el polipéptido en una célula que no es productora de un lantibiótico.

�?cido Nucleico

[0069] Un ácido nucleico de la invención puede ser un DNA o RNA, aunque preferiblemente un DNA. Un ácido nucleico de la invención puede ser de cadena simple o doble. En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido de clúster. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido precursor o una variante o fragmento del mismo.

[0070] En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que puede comprender toda o un fragmento de la SEQ ID NO:100 o SEQ ID NO:200, incluyendo un fragmento que comprende una región intergénica descrita aquí. Estas regiones pueden incluir un promotor u otro elemento regulador de la expresión de un polipéptido clúster o un polipéptido precursor de la presente invención.

[0071] Los expertos en la materia reconocen veinti-cinco nucleótidos como un número suficiente de nucleótidos para ser específicos de un gen concreto o un clúster de gen o subsecuencia del mismo tal y como se describe aquí. Así, los fragmentos incluyen fragmentos de la SEQ ID NO:100 o SEQ ID NO:200, o variantes de los mismos que tienen identidad de secuencia significativa, que son por lo menos 25, por ejemplo, por lo menos 30, por ejemplo, por lo menos 50, por ejemplo, por lo menos 100, por ejemplo, por lo menos 250 nucleótidos de longitud.

[0072] Los promotores que son variantes de las secuencias intergénicas también están incluidos y son realizaciones preferidas las secuencias intergénicas específicas (o partes de las mismas). En todos los casos, cuando una realización preferida de un orf, gen, ácido nucleico, polipéptido o promotor se defina por referencia a una secuencia específica, la invención en su sentido más amplio pretende incluir realizaciones que tienen variantes de esta secuencia específica.

[0073] El término "variante" tal y como se utiliza aquí en relación a un ácido nucleico específico (ácido nucleico de referencia) denota: cualquier ácido nucleico que tenga una secuencia que es diferente de la del ácido nucleico de referencia, pero que es su complementario o que muestra una identidad de secuencia de ácido nucleico significativa con, o hibridación bajo condiciones rigurosas al ácido nucleico de referencia o su complemento o un fragmento del ácido nucleico de referencia o su complementario; o cualquier ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos significativa con la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de referencia, o un fragmento de este ácido nucleico. El término “variante" también se refiere a ácidos nucleicos que difieren de los otros debido sólo a la degeneración del código genético y que, por lo tanto, codifica secuencias de aminoácidos deducidos idénticos. Las variantes de ácidos nucleicos de la invención se definen adicionalmente como sigue. Si una variante de ácido nucleico de la invención se introduce en los clústeres de gen identificados aquí, en lugar de la secuencia de la cual es una variante, y el fragmento recombinante se introduce en una célula huésped adecuada baja condiciones adecuadas para la fabricación de lantibióticos (por ejemplo, tal y como se muestra en los ejemplos), entonces dará lugar a la fabricación de una molécula que tiene una

o más actividades de un lantibiótico (especialmente actividad antibiótica). Preferiblemente, la fabricación estará regulada para que tenga lugar a una elevada densidad celular.

[0074] Es preferible una identidad de secuencia de ácido nucleico significativa de por lo menos 50%, más preferiblemente 60%, 70%, 80% o 90%, todavía más preferiblemente 95%, 98% o 99%. Preferiblemente, una identidad de secuencia de ácido nucleico significativa se da entre el ácido nucleico de la variante y un fragmento de por lo menos 30 residuos del ácido nucleico de referencia, más preferiblemente un fragmento de por lo menos 60, 90 ó 120 residuos, todavía más preferiblemente un fragmento de 180, 240 ó 300 residuos, más preferiblemente el ácido nucleico de referencia entero.

[0075] "Identidad de secuencia de ácido nucleico porcentual (%)" se define como el porcentaje de residuos nucleicos en una secuencia candidata que es idéntico a los residuos nucleótidos en la secuencia bajo comparación. Los valores de identidad utilizados aquí se generaron por el módulo BLASTN de WU BLAST-2 con los parámetros por defecto, con intervalo de solapamiento y fracción de solapamiento de 1 y 0,125, respectivamente.

[0076] Con relación a las variantes de los promotores utilizados en la presente invención, la identidad de secuencia de ácidos nucleicos preferiblemente se calcula sobre una secuencia de por lo menos 30 residuos, más preferiblemente 40 ó 50 residuos, todavía más preferiblemente 60 residuos.

[0077] "Condiciones Rigurosas " o "condiciones de alto rigor", tal y como se definen aquí, pueden identificarse mediante aquellas que: (1) utilizan baja fuerza iónica y elevada temperatura para el lavado, por ejemplo 0,015 M de cloruro sódico /0,0015M citrato sódico / 0,1% dodecilsulfato sódico a 50°C; (2) utilizan un agente desnaturalizante durante la hibridación, tal como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) formamida con 0,1% albúmina de suero bovino /0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirrolidona/50mM tampón fosfato sódico a pH 6,5 con 750 mM cloruro sódico, 75 mM citrato sódico a 42°C; o (3) utilizan 50% formamida, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrato sódico), 50 mM fosfato sódico (pH 6,8), 0,1% pirofosfato sódico, 5 x solución de Denhardt, espermatozoide de salmon sónico DNA (50 g/ml), 0,1 % SDS, y 10% sulfato dextrano a 42°C, con lavados a 42°C en 0,2 x SSC (cloruro sódico / citrato sódico) y 50% formamida a 55°C, seguido por un lavado de alto rigor que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55°C.

[0078] Cuando un ácido nucleico de interés se dice que está en "asociación operativa " con un promotor o secuencia reguladora, esto significa que el promotor / secuencia reguladora es capaz de transcripción directa del ácido nucleico de interés en un sistema de expresión apropiado, con el ácido nucleico de interés en el marco de lectura correcto para la translación. Preferiblemente, cuando un ácido nucleico de interés está en asociación operativa con un promotor / secuencia reguladora, la transcripción del ácido nucleico de interés contiene un sitio de unión a ribosoma apropiadamente localizado para la expresión en un sistema de expresión apropiado del polipéptido codificado por el ácido nucleico de interés. Véase, por ejemplo, Sambrook y otros (1989) y Ausubel y otros 25 (1995).

[0079] Cuando un ácido nucleico se considera "aislado", esto puede significar aislado substancialmente o completamente de alguno o de todo el resto de ácidos nucleicos normalmente presentes en A. garbadinensis y/o A. liguriae, especialmente ácido nucleico del exterior de los segmentos de clúster de gen identificados aquí.

[0080] A la vista de la descripción anterior, se apreciará que la invención proporciona secuencias nucleotídicas o un juego de secuencias nucleotídicas que codifican para la actagardina o el clúster del gen biosintético de la actagardina B. Consecuentemente, el clúster del gen entero o porciones del mismo de por lo menos veinti-cinco nucleótidos contiguos pueden utilizarse para una amplia variedad de aplicaciones, que incluyen pero no se limitan a: expresión de actagardina o actagardina B; utilización como sondas para escanear otros organismos para moléculas relacionadas y semejantes; utilización para inducir silencio de gen y semejantes.

Construcción de la expresión

[0081] En otro aspecto de la invención, se proporciona una construcción de la expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido clúster o un polipéptido lantibiótico de la invención unido operativamente a un promotor.

[0082] En otro aspecto, se proporciona un juego de constructores de la expresión. Un juego de constructores de la expresión comprende dos o más polipéptidos que codifican las secuencias de la presente invención y por lo menos un promotor adecuado para la expresión de dichas secuencias. El promotor (s) puede ser un promotor con el que el gen polipéptido está asociado de forma natural (o en el caso de una variante, el promotor del gen a partir del que se deriva la variante), o puede ser constituir un promotor o inducir un promotor funcional en la célula huésped. Así, los promotores incluyen regiones intergénicas de SEQ ID NO:100 o SEQ ID NO:200 aguas arriba de cualquier marco de lectura abierto listado en las Tablas 1 y 2.

[0083] El promotor(es) estará unido de forma operativa a los ácidos nucleicos del juego de constructores de la expresión. Por "unido de forma operativa" se entiende que el promotor será capaz de transcripción directa del ácido nucleico de interés en un sistema de expresión apropiado, con el ácido nucleico de interés en el marco de lectura correcto para la translación. Preferiblemente, cuando un ácido nucleico de interés está en asociación operativa con un promotor / secuencia reguladora, la transcripción del ácido nucleico de interés contiene un sitio de unión a ribosoma apropiadamente localizado para la expresión en un sistema de expresión apropiado del polipéptido codificado por el ácido nucleico de interés. Véase, por ejemplo, Sambrook y otros (1989), Ausubel y otros (2002) y Kieser (2000).

[0084] Los juegos de constructores de expresión según la invención incluyen numerosas permutaciones de genes que codifican para un precursor y polipéptidos de clúster de la invención tal y como se ha definido más arriba. En diferentes aspectos, el juego incluirá por lo menos un gen LanA. Ejemplos de dichos juegos se muestran como "Set 1" a "Set 7" a continuación, aunque debe entenderse que dichos juegos son solamente ilustrativos y no limitativos.

Set 1: Un gen LanA que codifica para un polipéptido precursor, preferiblemente un polipéptido precursor capaz de convertirse a un compuesto de la invención, más un gen LanM que codifica para un polipéptido LanM. El polipéptido LanM preferiblemente es un LanM de SEQ ID NO:120 o una variante del mismo, o SEQ ID NO:213 o una variante del mismo.

Set 2: Un gen LanA que codifica para un polipéptido precursor, preferiblemente un polipéptido precurso capaz de convertirse en un compuesto de la invención, más un gen LanR que codifica para un polipéptido LanR. El polipéptido LanR preferiblemente es un LanR de SEQ ID NO:122 o una variante del mismo, o SEQ ID NO:216 o una variante del mismo.

Set 3: Un gen LanA que codifica para un polipéptido precursor, preferiblemente un polipéptido precurso capaz de convertirse en un compuesto de la invención, más un gen LanM que codifica para un polipéptido LanM, más un gen LanR que codifica para un polipéptido LanR. El polipéptido LanM preferiblemente es un LanM de SEQ ID NO:120 o una variante del mismo, o SEQ ID NO:213 o una variante del mismo. El polipéptido LanR preferiblemente es un LanR de SEQ ID NO:122 o una variante del mismo, o SEQ ID NO:216 o una variante del mismo.

Set 4: Los genes del Set 3 conjuntamente con un gen LanO que codifica para un polipéptido LanO. El polipéptido LanO preferiblemente es SEQ ID NO:122 o una variante del mismo, o SEQ ID NO:215 o una variante del mismo.

Set 5: Los genes del Set 3 o Set 4 conjuntamente con un gen LanT que codifica para un polipéptido LanT. El polipéptido LanT preferiblemente es SEQ ID NO:123 o una variante del mismo, o SEQ ID NO:214 o una variante del mismo.

Set 6: Los genes de SEQ ID NOs:116 a 127 o variantes de los mismos.

Set 7: Los genes de SEQ ID NOs:206 a 220 o variantes de los mismos.

[0085] En un aspecto, un juego comprenderá secuencias que todas codifican polipéptidos 1xx o que todas codifican polipéptidos 2xx. Sin embargo, los juegos preparados de ambos polipéptidos 1xx y 2xx no están excluidos de la presente invención.

Vector de expresión recombinante

[0086] En otro aspecto, se proporciona un vector recombinante que comprende uno o más constructores de expresión de la invención. En un aspecto alternativo, se proporciona un juego de vectores recombinantes que comprenden un juego de constructores de expresión de la invención. Los vectores adecuados que comprenden ácido nucleico para la introducción en una bacteria pueden escogerse o construirse, conteniendo elementos reguladores adicionales y apropiados, cuando sean necesarios, que incluyen promotores adicionales, fragmentos terminales, elementos mejoradores, genes marcadores y otros elementos que sean apropiados. Los vectores pueden ser plásmidos, víricos, por ejemplo, bacteriófago o fagémidos, que sean apropiados. Para más detalles, véase, por ejemplo, Sambrook y otros (1989) Clonación Molecular, Manual de Laboratorio, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. Se han descrito con detalle muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de constructores de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciamiento, introducción de DNA en células y expresión de genes y análisis de proteínas en Ausubel y otros (1995) Protocolos actuales en Biología Molecular, Wiley Interscience Publishers, (1995). Se han descrito con detalle muchos aspectos de la utilización de estas técnicas en el contexto de Streptomyces spp. en Hopwood y otros (1985) Manipulación genética de Streptomyces un manual de laboratorio (Norwich: John Innes Foundation) y Practical Streptomyces Genetics

(2000) Kieser T.y otros, John Innes Foundation p.386. Las descripciones de Sambrook y otros, Ausubel y otros, Hopwood y otros y Kieser y otros se incorporan aquí por referencia para estos y otros propósitos.

Casetes de expresión

[0087] En otro aspecto, los inventores han desarrollado un sistema de vectores útil para producir y cribar derivados lantibióticos de actagardina B. Esto se ha conseguido mediante la introducción de uno o más sitios de reconocimiento endonucleasa de restricción en el gen LanA que codifica SEQ ID NO:1, 11 ó 212 con el fin de producir un sistema de casete de expresión. Así, en otro aspecto, la invención proporciona un casete DNA recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido precursor de actagardina B, donde dicha secuencia comprende un primer sitio de restricción en o adyacente a la región codificadora N-terminal de la secuencia codificadora; opcionalmente, un segundo sitio de restricción aguas abajo del primer sitio de restricción dentro de la secuencia codificadora; y un tercer sitio de restricción en o adyacente a la región codificadora C-terminal de la secuencia codificadora, donde por lo menos uno de estos sitios de restricción no se produce en la secuencia codificadora LanA mostrada como SEQ ID NO:200.

[0088] En otro aspecto, se proporciona un casete DNA recombinante que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido precursor de actagardina, donde dicha secuencia comprende un primer sitio de restricción en o adyacente a la región codificadora N-terminal de la secuencia codificadora; opcionalmente, un segundo sitio de restricción aguas abajo del primer sitio de restricción y dentro de la secuencia codificadora; y un tercer sitio de restricción en o adyacente a la región codificadora C-terminal de la secuencia codificadora, donde por lo menos uno de dichos sitios de restricción no tiene lugar dentro la secuencia de codificación LanA mostrada como SEQ ID NO:100.

[0089] Generalmente, los dos o tres sitios serán todos diferentes entre ellos. También es deseable que cuando el casete lo lleve un vector, los sitios sean únicos para este vector.

[0090] En un aspecto preferido, el sitio enzimático de restricción que ocurre de forma no natural es el segundo sitio de restricción y está situado entre los codones 5 y 16, tal como entre 6 y 15, de la secuencia codificadora de SEQID NO:1 o SEQID NO:4.

[0091] Preferiblemente, el casete también incluirá una secuencia guía LanA y un promotor LanA, y puede incluir además uno o más genes clúster, especialmente cuando dicho gen clúster es necesario para complementar la pérdida del gen de la célula huésped equivalente.

[0092] El casete de la invención descrito más arriba puede diseñarse por ingeniería en una variedad de maneras. Por ejemplo, el fragmento obtenido por corte del casete entre el primer y segundo, primer y tercer, o segundo y tercer sitio de restricción puede reemplazarse con una variante que codifica la secuencia que codifica para una variante lantibiótica A. Así, la invención proporciona una variante del casete de la invención donde dicha variante tiene de 1 a 15 substituciones nucleótidas dentro de la región codificadora de la secuencia codificadora.

[0093] Como intermedio para la producción de dicha variante, la secuencia entre el primer y segundo, primer y tercer

o segundo y tercer sitios de restricción puede reemplazarse por un fragmento largo.

[0094] En otro aspecto, el casete que codifica un derivado lantibiótico puede utilizarse para transformar una célula huésped para expresar el derivado, por ejemplo para valorar sus propiedades anti-bacterianas.

[0095] En otro aspecto, una multiplicidad de casetes de expresión puede prepararse para proporcionar una biblioteca de diferentes derivados que entonces pueden filtrarse por actividad.

[0096] Un casete de expresión de la invención puede estar basado en cualquier vector de expresión y clonación utilizado en el estado de la técnica para la expresión de genes en células huésped. Dichos vectores incluirán uno o más orígenes de replicación, que puede ser sensible a la temperatura. Los vectores pueden incluir un marcador seleccionador, tal como el gen de transferasa cloramfenicol acetilo, el gen de resistencia eritromicina, el gen de resistencia a la apramicina o el gen resistente a la tetraciclina. El vector puede contener una región de marcaje, siendo esta región homóloga a una secuencia genómica presente en la célula huésped fuera del cluster de gen LanA. Dicho vector puede utilizarse para integrar el casete en la secuencia genómica homóloga a la región de marcaje.

[0097] El casete de expresión puede también comprender uno o más genes cluster además del gen LanA o un derivado del mismo. Cuando la célula huésped es una célula huésped LLanA en la que el gen LanA se ha inactivado de tal manera que también inactiva dicho gen clúster (por ejemplo, en la cepa descrita en Altena y otros, 2000), es deseable que este gen o un gen equivalente esté en el casete de expresión.

[0098] Tal y como se utiliza aquí, mediante "en o adyacente a la región codificadora N-terminal" significa que la primera base del sitio de restricción se sitúa en una posición a partir de seis residuos aguas arriba del codón ATG de la secuencia guía LanA a no más de seis codones aguas abajo del primer codón del polipéptido. Preferiblemente, la primera base del sitio de restricción se sitúa en una posición de doce, preferiblemente seis, residuos aguas arriba de los seis residuos del primer codón de la secuencia codificadora del polipéptido.

[0099] En un aspecto, el primer sitio de restricción es un sitio Bg/II.

[0100] De forma similar, por "en o adyacente a la región codificadora C-terminal" significa que la primera base del sitio de restricción o bien incluye por lo menos uno de los nucleótidos del codón de terminación del polipéptido o bien el nucleótido 5’ o 3’ del sitio de restricción no es más de doce, preferiblemente seis, residuos aguas abajo o aguas arriba respectivamente del codón de terminación.

[0101] En un aspecto, el tercer sitio de restricción es un sitio AvrII.

[0102] El segundo sitio de restricción, cuando esté presente, se ubicará entre el primer y tercer sitio de restricción. Preferiblemente, el sitio de restricción incluye por lo menos un nucleótido presente desde el codón 5 hasta el codón 16, preferiblemente desde el codón 8 hasta el codón 16 de la secuencia codificadora del polipéptido. En los ejemplos que se acompañan, se ha introducido un sitio BsrG1 mediante modificación de codones 6 y 7 de la secuencia codificadora de ActA. Sin embargo, también se contemplan otros cambios mediante la presente invención.

[0103] También es posible introducir más de un cambio de manera que el casete de expresión incluye dos o más sitios entre el primer y el tercer sitio de restricción.

[0104] El casete puede incluir dos o más sitios de restricción que no tienen lugar de forma natural. En los ejemplos que se acompañan, todos los tres sitios no ocurren de forma natural en la secuencia ActA codificada por la SEQ ID NO:100.

[0105] El casete de expresión simplifica la producción rápida de los derivados lantibióticos, tal y como se discutirá más adelante.

[0106] En un aspecto, la región entre el primero y segundo sitio, el primero y el tercero o el segundo y el tercer sitio, puede reemplazarse por un fragmento largo. Cuando estén presentes dos o más sitios entre el primer y el tercer sitio, la región entre cualquier par de dichos sitios también puede estar reemplazada por un fragmento largo. Un fragmento largo es un trozo de DNA que es mayor que la secuencia que sustituye. El fragmento largo puede ser de 50 a 5000 nucleótidos de tamaño, por ejemplo, desde aproximadamente 500 a 2000 nucleótidos de tamaño. El significado de introducir estos fragmentos largos de DNA es que cuando la región está sustituida por un oligonucleótido que codifica para un lantibiótico existe una disminución significativa del tamaño del plásmido. Así, el plásmido resultante puede fácilmente purificarse de cualquier pequeña población de plásmidos no restringidos eliminando así cualquier anterioridad.

[0107] Puede utilizarse un casete de la invención para introducir cambios específicos en la secuencia ActA en un vector que entonces puede introducirse en una célula huésped para la expresión de un lantibiótico. Para conseguir esto, es deseable que la secuencia opere unida a la secuencia líder LanA (por ejemplo, ActA o LigA), que a continuación opera unido al promotor LanA (por ejemplo, ActA o LigA).

[0108] Además o como una alternativa, el vector que comprende el casete también puede incluir un gen LanR. El gen LanR se situará aguas abajo de, y en tandem con, la secuencia que codifica el lantibiótico A.

Librerías de expresión

[0109] Los casetes de expresión de la invención pueden utilizarse para proporcionar librerías de genes que codifican lantibióticos. Estas librerías pueden hacerse introduciendo en el casete, entre el primer y segundo sitio de restricción, el primer y el tercer sitio de restricción o el segundo y tercer sitio de restricción, una multiplicidad de secuencias cada una de las cuales corresponde a la correspondiente secuencia ActA o LigA manteniendo de 1 a 15, por ejemplo de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 6, por ejemplo de 1 a 3 cambios de nucleótido comparado con la porción polipéptida de la SEQ ID NOs:100 ó 200. Preferiblemente, dichos cambios resultan en un cambio de la proteína codificada por la secuencia. Sin embargo, los cambios no codificados no están excluidos.

[0110] Las librerías forman otro aspecto adicional de la invención. Dichas librerías pueden comprender de 10 a 100.000, tal como de 10 a 10.000, por ejemplo de 10 a 1.000 secuencias codificadoras diferentes que son variantes de la secuencia que codifica el lantibiótico A de un casete de expresión.

[0111] Puede introducirse un casete de expresión que codifica un derivado lantibiótico A en una célula huésped para la expresión del lantibiótico.

[0112] En una realización, la librería puede transformarse en células huésped y en colonias aisladas y/o cribadas para actividad antibacteriana. Pueden determinarse las secuencias del lantibiótico A expresado por colonias individuales que muestran tal actividad. Cuando el lantibiótico A muestra actividad, la invención proporciona además un lantibiótico obtenido por el método de la invención.

Célula huésped

[0113] La presente invención prevé dos tipos principales de células huésped. El primer tipo de célula huésped es un lantibiótico que produce célula huésped. Opcionalmente, la célula huésped puede ser una célula no productora, es decir, que no contiene un gen LanA o sus genes clúster asociados requeridos para la producción de un polipéptido LanA.

[0114] En una realización, la invención proporciona una célula huésped transformada con un juego de constructores de expresión de la invención. El juego de constructores puede ser cualquiera de los juegos 1 a 7 tal y como se han definido más arriba, o un juego basado en cualquier otra combinación de precursor y ácidos nucleicos que codifican polipéptido. En otra realización, la célula huésped puede transformarse en un casete de expresión de la invención.

[0115] En una realización adicional, se proporciona una librería de células huésped, comprendiendo cada una un casete de expresión diferente de la invención.

Una célula huésped que produce lantibiótico.

[0116] En una realización, la célula huésped puede ser una célula huésped que produce lantibiótico. Una célula huésped que produce lantibiótico es una en la que un constructor de expresión que comprende un gen LanA, si se introduce en la célula en ausencia de cualquier gen clúster, se expresaría y se obtendría un polipéptido LanA. Dichas células incluyen cualquier lantibiótico tipo-B que produce células tal como cualquier cepa de un bacillus, un actinomiceto o un estreptomiceto, (por ejemplo, S. lividans o S. coelicolor) que produce un lantibiótico. Los ejemplos de dichas células incluyen una célula huésped productora de cinnamicina (Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005), o una Actinoplanes garbadinensis productora de actagardina o A. liguriae NCIMB 41362.

[0117] Cuando la invención se refiere a las fabricaciones de compuestos de fórmula (I) en los que -X1-X2representan -Leu-Val-, la célula huésped puede ser A. liguriae NCIMB 41362 sin ninguna modificación adicional.

[0118] En un aspecto, una célula huésped de esta clase puede comprender una mutación en su gen endógeno LantibióticoA de manera que el gen no se expresa o el producto del gen es inactivo. Dicha célula huésped puede obtenerse por recombinación homóloga específica para suprimir o mutar el gen LanA de la célula huésped. En el estado de la técnica se conocen métodos para conseguir esto y están recogidos en Altena y otros, (2000) y WO2005/093069, las descripciones de los cuales están incorporadas aquí por referencia. La célula huésped resultante se denomina célula huésped LLanA. En una realización particular, la célula huésped es una célula huésped LlignA A. liguriae NCIMB 41362 en la cual el gen ligA se ha inactivado, por ejemplo, por mutación o supresión, por ejemplo, supresión producida por recombinación homóloga. En otra realización, la célula huésped es una célula huésped LActA A.garbadinensis en la que el gen ActA se ha inactivado, por ejemplo, por mutación o supresión, por ejemplo, supresión producida por recombinación homóloga.

[0119] La transformación de una célula huésped de este tipo con otros genes clúster también está contemplada por la presente invención, aunque cuando la célula huésped proporciona genes clúster necesarios para la obtención de un lanA, la condición de estos genes clúster es opcional.

Células no productoras

[0120] Una célula no productora puede ser cualquier célula huésped en la que la expresión de un gen LanA que codifica para un polipéptido precursor capaz de convertirse a actagardina o una variante del mismo o a un compuesto de la invención puede dar dicho producto siempre que el gen LanA se introduzca en la célula como parte de un juego de constructores de expresión que son capaces de convertir un polipéptido precursor a la actagardina o una variante del mismo o a un compuesto de la invención. Una célula huésped no productora puede ser una célula huésped bacteriana. Las células huésped bacterianas incluyen un actinomiceto o un estreptomiceto, por ejemplo S. lividans, S. coelicolor o S. cinnamoneus.

[0121] Las células huésped pueden ser aquellas en las que el gen IanO se ha inactivado por mutación o supresión (o en el caso de células no productoras, no está presente), o aquellas en las que la expresión del gen IanO se ha aumentado, por ejemplo, proporcionado dos o más copias del gen o uniendo el gen a un promotor que mejora la expresión en la célula huésped. La modulación del gen IanO de esta forma puede ser deseable para alterar los

niveles relativos de formas oxidadas (Y = -S(O)-) y reducidas (Y = -S-) de los compuestos de la invención obtenidos en la célula huésped.

Obtención de compuestos de la invención

[0122] La invención también proporciona un procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula:

donde:

-

X1-X2- representa -Leu-Val-;

-Y- es -S-;

[0123] Z es Ala o -NH2 donde el último representa la N-terminal del Ala en la posición 1, comprendiendo el procedimiento la expresión de un ácido nucleico que codifica para una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 11, y opcionalmente cuando sea necesario, genes de clústeres asociados requeridos para la conversión del polipéptido precursor al producto. El ácido nucleico puede expresarse en A. liguriae. El A. liguriae puede ser el A. liguriae depositado bajo el Tratado de Budapest número de depósito: NCIMB 41362. Los compuestos de la invención pueden obtenerse mediante la expresión de un ácido nucleico, por ejemplo en forma de un constructor de expresión que codifica para un polipéptido precursor llevado en un vector de expresión recombinante, en una célula huésped que lleva un gen LanA conjuntamente con, cuando sea necesario, genes de clústeres asociados necesarios para la conversión del polipéptido precursor al producto. Tal y como se ha destacado más arriba, cuando la invención se refiere a la obtención de compuestos de fórmula (I) en la que -X1-X2- representan -Leu-Val-, la célula huésped puede ser A. liguriae NCIMB 41362 sin ninguna otra modificación.

[0124] La introducción del casete de expresión o vector(es) en una célula huésped puede (especialmente para la introducción in vitro) generalmente atribuirse sin limitación tal como una "transformación". Puede utilizarse cualquier técnica disponible. Para las células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir la transformación por cloruro de calcio, transformación asistida por polietilenglicol, electroforación, conjugación y transfección o transducción utilizando bacteriófagos.

[0125] En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de expresión de ácido nucleico de la invención, comprendiendo el procedimiento proporcionar una célula huésped (u otro sistema de expresión) de cultivo de la célula huésped, de manera que expresa el ácido nucleico de interés. El ácido nucleico de interés estará en un casete de expresión, de tal manera que el cultivo de la célula huésped conduce a la fabricación de un producto de la invención.

[0126] Preferiblemente, el ácido nucleico de interés se expresa sustancialmente sólo cuando el cultivo de la célula huésped alcanza una densidad de células elevada, más preferiblemente en o cerca de la fase estacionaria del cultivo de células huésped. Los cultivos de células en o cerca de la fase estacionaria pueden tener valores de OD650 en el margen de 1-20. En el estado de la técnica son bien conocidos los métodos de cultivo celular, por ejemplo de Sambrook y otros (1989), Ausubel y otros (2002), y (en particular para Streptomyces spp.) Kieser y otros (2000). Los productos de expresión de los sistemas de expresión pueden recogerse y purificarse. Los métodos de aislamiento pueden comprender la captura a partir del medio de fermentación utilizando técnicas de extracción de disolvente, resina de adsorción tal como resinas hidrofóbicas o métodos de precipitación tal como precipitación por sulfato de amonio. Los métodos de purificación pueden incluir técnicas de cromatografía tal como intercambio iónico, interacción hidrofóbica, fase inversa, fase normal, extracción de fase sólida y HPLC, por ejemplo tal y como se ha descrito en US 5.112.806 para el aislamiento de mersacidina.

[0127] Seguido del cultivo de la célula, los compuestos de la invención pueden recuperarse a partir del cultivo de las células huésped. Los compuestos recuperados pueden formularse en forma de una composición farmacéutica, opcionalmente en forma de una sal farmacéuticamente aceptable.

[0128] Cuando las células huésped producen una mezcla de compuestos de la invención, por ejemplo aquellos en los que Y es -S- o -S(O)- o aquellos en los que Z es NH2 o Ala- o mezclas de los cuatro tipos, los productos pueden aislarse utilizando técnicas de separación estándares tales como HPLC, por ejemplo tal y como se describe en US 6.022.851, para la producción de Actagardina y Ala-Actagardina.

[0129] Los compuestos recuperados pueden formularse en forma de una composición farmacéutica, opcionalmente en forma de una sal farmacéuticamente aceptable.

Sal farmacéuticamente aceptable

[0130] Una "sal farmacéuticamente aceptable" puede ser una sal de adición de ácido en la que la base retiene la eficacia biológica y propiedades del compuesto y que sea fisiológicamente aceptable. Dichas sales incluyen aquellas formadas con ácidos inorgánicos tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y semejantes, y ácidos orgánicos tal como el ácido acético, ácido propiónico, ácido gliclólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinnámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido ptoluensulfónico, ácido salicílico y semejantes.

[0131] Las sales también incluyen sales básicas, tal como una sal alcalina o una sal de metales alcalinotérreos, por ejemplo, una sal de sodio, potasio, calcio o magnesio.

Composiciones farmacéuticas

[0132] Los lantibióticos de la presente invención pueden formularse conjuntamente con uno o más ingredientes farmacéuticamente aceptables bien conocidos por un experto en la materia, que incluyen, pero no se limitan a portadores, adyuvantes, excipientes, diluyentes, cargas, tampones, conservantes, anti-oxidantes, lubricantes, estabilizantes, solubilizantes, tensioactivos (por ejemplo, agentes humectantes), agentes enmascaradores, agentes colorantes, agentes de sabor y agentes edulcorantes farmacéuticamente aceptables. La formulación puede además comprender otros agentes activos, por ejemplo, otros agentes terapéuticos o profilácticos. Así, la presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas, tal y como se ha definido más arriba y procedimientos de preparación de una composición farmacéutica que comprende el mezclado de al menos un compuesto activo, tal y como se ha definido más arriba, conjuntamente con uno o más ingredientes faramacéuticamente aceptables bien conocidos por el experto en la materia, tal como portadores, adyuvantes, excipientes, etc… Si se formula como unidades discretas (por ejemplo, comprimidos, etc.), cada unidad contiene un cantidad (dosi) predeterminada del compuesto activo.

[0133] El término "aceptable farmacéuticamente” tal y como se utiliza aquí pertenece a compuestos, ingredientes, materiales, composiciones, formas de dosificación, etc, que son, dentro del alcance de un juicio médico, adecuados para su utilización en contacto con los tejidos del sujeto en cuestión (por ejemplo, un humano) sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones, que corresponde a una relación razonable de beneficio/riesgo. Cada portador, adyuvante, excipiente, etc, debe también ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación.

[0134] Las composiciones pueden formularse mediante cualquier ruta adecuada y cualquier medio de administración. Los portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen aquellos utilizados en formulaciones adecuadas para la administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (que incluye subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural). Estas formulaciones pueden convenientemente presentarse en forma de dosis unitaria y pueden prepararse por cualquier método bien conocido en el campo farmacéutico. Dichos métodos incluyen la etapa de poner en asociación el compuesto activo con el portador que constituye uno o más de los ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan poniendo uniformemente e íntimamente en asociación el compuesto activo con los portadores líquidos o los portadores sólidos finamente divididos o ambos y, a continuación, si es necesario, darle forma al producto.

[0135] Para composiciones sólidas, los portadores sólidos convencionales no tóxicos incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, celulosa, derivados de celulosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y semejantes. El compuesto activo tal y como se ha definido más arriba puede formularse como supositorios utilizando, por ejemplo, glicoles de polialquileno, triglicéridos acetilados y semejantes, como portador. Las composiciones farmacéuticamente administrables líquidas pueden, por ejemplo, prepararse mediante disolución, dispersión, etc, de un compuesto activo, tal y como se ha definido más arriba, y, opcionalmente, adyuvantes farmacéuticos en un portador tal como, por ejemplo, agua, dextrosa acuosa salina, glicerol, etanol y semejantes para así formar una solución o suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica a administrar puede también contener pequeñas cantidades de substancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes tampón de pH y semejantes, por ejemplo, acetato sódico, monolaurato de sorbitán, acetato sódico de trietanolamina, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc. Los métodos actuales de preparación de dichas formas de dosificación son conocidos o serán aparentes para aquellos expertos en la materia; por ejemplo, véase "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20ª Edición, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins. La composición o formulación a administrar contendrá, en cualquier caso, una cantidad del compuesto o compuestos activos en una cantidad eficaz para aliviar los síntomas del sujeto a tratar.

[0136] Las formas o composiciones de dosificación que contienen el ingrediente activo en el rango de 0,25 a 95% pueden prepararse en equilibrio con el portador no tóxico.

[0137] Para la administración oral, una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable se forma mediante la incorporación de cualquier excipiente normalmente empleado, tal como, por ejemplo, diferentes grados farmacéuticos de manitol, lactosa, celulosa, derivados de celulosa, croscarmelosa sódica, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, glucosa, sacarosa, magnesio, carbonato y semejantes. Tales composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación controlada y semejantes. Tales composiciones pueden contener del 1%-95% de compuesto activo, más preferiblemente 2-50%, todavía más preferiblemente 5-8%.

[0138] La administración parenteral generalmente se caracteriza por la inyección o bien subcutánea, intramuscular o intravenosa. Las inyectables pueden prepararse en formas convencionales, ya bien sea soluciones o suspensiones líquidas o en forma sólida adecuada para soluciones o suspensiones en un líquido antes de la inyección o como emulsiones. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, sal marina, dextrosa, glicerol, etanol o semejantes. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas a administrar también pueden contener pequeñas cantidades de substancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes tampón de pH y semejantes, como por ejemplo, acetato sódico, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, acetato sódico de trietanolamina, etc.

[0139] Para aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en un ungüento o gel adecuado que contiene el compuesto activo suspendido o disuelto en uno o más portadores. Los portadores para la administración tópica de los compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, polioxietileno, compuestos polioxipropileno, cera emulsificante y agua. Alternativamente, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en una loción o crema adecuada que contiene los componentes activos suspendidos o disueltos en uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Los portadores adecuados incluyen pero no se limitan a aceite mineral, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, cera de ésteres de cetilo, alcohol cetearilo, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.

[0140] El porcentaje de compuesto activo contenido en dichas composiciones parenterales o tópicas es altamente dependiente de la naturaleza específica del mismo, así como de la actividad del compuesto y las necesidades del sujeto. Sin embargo, los porcentajes del ingrediente activo de 0,1% a 10% p/p útiles y que serán superiores si la composición es un sólido que a continuación se diluirá a los porcentajes de más arriba. Preferiblemente, la composición comprenderá 0,2-2% p/p del componente activo en solución.

[0141] Otras enseñanzas en relación a adecuados portadores, adyuvantes, excipientes, etc. pueden encontrarse en textos farmacéuticos estándares como, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 2ª Edición, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2ª edición, 1994.

Administración de los compuestos

[0142] Los compuestos y composiciones lantibióticas de la invención pueden administrarse a un sujeto con un método de tratamiento o profilaxis. El sujeto puede ser un sujeto humano o animal. El sujeto animal puede ser un mamífero u otro vertebrado.

[0143] Así, se proporciona un compuesto de la invención para utilizarlo en un método de tratamiento o profilaxis de un sujeto. También se proporciona la utilización de un compuesto de la invención para la fabricación de un medicamento para su utilización en un método de tratamiento o profilaxis de un sujeto.

[0144] El método de tratamiento puede ser una infección bacteriana que incluya una infección de piel, mucosa, entérica o sistémica.

[0145] Las variantes y composiciones pueden utilizarse para el tratamiento sistémico de bacterias (incluyendo catéter relacionado con bacteriemia), neumonía, infecciones de la piel o de la estructura de la piel (que incluyen infecciones del sitio con cirugía), endocarditis y osteomielitis. Estos y otros de dichos tratamientos pueden aplicarse contra los agentes causantes tales como staphylococci, streptococci, enterococci. Los compuestos de la invención o composiciones de los mismos también pueden utilizarse para el tratamiento tópico de infecciones de la piel que incluyen el acné, por ejemplo, acnés Propionibacterium. Las variantes y composiciones de los mismos también pueden utilizarse para el tratamiento de infecciones en los ojos, tal como conjuntivitis y para el tratamiento oral para

fuertes infecciones del intestino tales como las provocadas por Clostridium difficile que incluyen multiresistencia C. difficile (pseudomembranous colitis), o infecciones del intestino asociadas con Helicobacter pilori.

[0146] Las variantes también pueden utilizarse en el tratamiento o prevención de infecciones de la piel en heridas o quemadas. Además, las variantes y composiciones de las mismas pueden utilizarse en métodos profilácticos, tales como para la limpieza nasal para prevenir la transmisión de MRSA. Esto puede practicarse en sujetos con riesgo de infección (por ejemplo, pacientes que entran a un hospital) o en profesionales de la salud u otros cuidadores en riesgo de ser portadores de tales infecciones. También se contempla la compensación profiláctica del desgarre de la flora intestinal de la cirugía abdominal.

[0147] Los compuestos según la invención pueden administrarse entéricamente (oralmente), parenteralmente (intramuscularmente o intravenosamente), rectalmente o localmente (tópicamente). Estos pueden administrase en forma de soluciones, polvos, (comprimidos, cápsulas que incluyen microcápsulas), ungüentos (cremas o geles), o supositorios. Los auxiliares posibles para las formulaciones de este tipo son rellenos y cargas farmacéuticamente habitualmente líquidos o sólidos, disolventes, emulsificantes, lubricantes, correctores de sabor, colorantes y/o substancias tampones. Como dosis de un excipiente se administran 0,1-1000, preferiblemente 0,2-100 mg/kg del peso corporal. Estos se administran oportunamente en unidades de dosificación que contienen por lo menos la cantidad diaria eficaz de los compuestos según la invención, por ejemplo, 30-3000, preferiblemente 50-1000 mg.

[0148] La base experimental de la presente invención, que incluye su mejor realización, se describirá a continuación en detalle, mediante sólo el ejemplo con referencia a las figuras que se acompañan.

EJEMPLO 1 – Clonación de clústeres de genes

Identificación y clonación de clústeres biosintéticos de actagardina a partir de A. garbadinensis y A. liguriae.

[0149] O/SBDIG-1 es un oligonucleótido degenerado marcado con digoxigenin (DIG) compuesto de 48 bases. Se diseñó por traducción de la secuencia de aminoácidos conocida de actagardina y considerando el uso del codón para Actinoplanes. El análisis de hibridación Southern del ADN genómico aislado de A. garbadinensis y digerido utilizando el encima de restricción Ncol, identificó un fragmento -3kb que se híbridó a O/SBDIG-1. El NcoI digerido del ADN genómico se repitió y se aislaron los fragmentos de DNA de ~3kb y se clonaron en Ncol corte pLITMUS28 (NEB). Los plásmidos resultantes se introdujeron en células E. coli DH10B y, a continuación, se analizaron mediante hibridación Southern utilizando la sonda O/SBDIG-1. Se identificó un clón de hibridación y se suministró para el análisis de la secuencia. La secuenciación reveló que este plásmido denominado pLITAG01 consiste de DNA que codifica para el gen estructural IanA para la biosíntesis de la actagardina (actA) conjuntamente con una región aguas arriba que se cree que codifica una porción de un transportador de azúcar ABC y una región aguas abajo que codifica parcialmente Ian M (actM).

[0150] Los iniciadores O/ACT08F y O/ACT09R se diseñaron basados en la secuencia de pLITAG01. Utilizando estos iniciadores en una reacción PCR conjuntamente con el marcador DIG dNTPs (Roche) y pLITAG01 como plantilla, se generó un fragmento de DNA marcado DIG 2296bp y se denominó SBDIG-2.

[0151] Se generaron dos librerías de cósmidos por clonación del DNA genómico digerido Sau3AI a partir de A. garbadinensis ATCC 31049 y A. liguriae NCIMB 41362, en el cósmido SuperCos1 (Stratagene) previamente digerido utilizando BamHI. Se analizó cada librería de cósmidos mediante hibridación Southern utilizando SBDIG-1. Se seleccionaron y reanalizaron veinticinco cósmidos de cada librería que se cree que hidrolizan SBDIG-1 vía hibridación Southern utilizando las sondas O/SBDIG-1 y SBDIG-2. Se aislaron nueve cósmidos derivados del DNA genómico a partir de A. garbadinensis y once cósmidos derivados del DNA genómico a partir de A. liguriae hibridados a ambas sondas. El DNA se aisló de cada cósmido y se secuenció utilizando los iniciadores T3 y T7. A continuación, se secuenciaron completamente los cósmidos CosAL02 y CosAG14 (Sequencing facility, Departamento de Bioquímica, Universidad de Cambridge).

Materiales y Métodos

Cepas

[0152] Las cepas bacterianas utilizadas en la presente invención se recogen en la Tabla 5.

Vectores

[0153] El cósmido SuperCos1 se obtuvo a partir de Stratagene.

[0154] El plásmido pLITMUS se obtuvo a partir de New England Biolabs.

Hibridación Southern

Marcaje de la sonda de DNA

[0155] Se prepararon sondas de hibridación de DNA utilizando el marcaje de DNA por PCR con Digoxygenin (DIG) y el equipo de detección suministrado por Roche, de acuerdo con sus instrucciones.

Transferencia de DNA a membrana de nylon

[0156] El DNA de interés se separó inicialmente mediante electroforesis de gel de agarosa y se transfirió a una membrana de nylon (Hybond-N, Amersham Int., UK) utilizando un cono de vacío (Q BIO gene). El tiempo para la depuración del DNA utilizando 0,5 M HCl se calculó mediante el tiempo tomado para que el marcador de azul de bromofenol se volviera completamente amarillo (generalmente 15-20 min para un gel de agarosa 0,7%). A continuación, el DNA se desnaturalizó sistemáticamente con 1,5 M NaCl, 1,5 M NaOH y, a continuación, se neutralizó utilizando 0,5MTris, 1,5MNaCl, pH 8,0 durante otros 15-20 min cada uno. Se favoreció una completa transferencia del DNA mediante inundación con 20 x SSC durante un mínimo de 60 min. Después de retirar la membrana transferida del vacío, esta se dejó secar al aire a temperatura ambiente. El DNA se reticuló colocando la membrana (DNA con la cara hacia abajo) en un transiluminador de UV (UVP) y exponiéndolo a UV a una longitud de onda de 365 nm durante 5 min.

Recogida de colonias e hibridación

[0157] Las colonias a analizar por hibridación se transfirieron a una membrana de nylon (Roche diagnostics). Esto se consiguió colocando la membrana de nylon cargada positivamente sobre las colonias y presionando firmemente durante 1 min para asegurar la transferencia eficaz. Los puntos de referencia se marcaron en la membrana para indicar su orientación con respecto a las colonias. Siguiendo esto, la membrana se retiró y se preparó para la hibridación tal y como describe el manual del usuario de Roche (DIG Application manual for filter hybridisation).

Hibridación y desarrollo de membranas

[0158] El DNA se hidrolizó con la sonda preparada durante toda la noche (~16h) a 68°C en un horno de hibridación HB-1000 (UVP). Después de la hibridación, la membrana se lavó durante 2 periodos de 5 min a temperatura ambiente utilizando 2 x sal de citrato sódico (SSC) + 0,1% dodecilsulfato sódico (SDS). Estos lavados fueron seguidos de segundos lavados de 2 x 15 min a 68°C utilizando 1 x SSC + 0,1% SDS para la membrana hibridada en presencia de SBDIG-1 y 0,1 x SSC + 0,1% SDS para la membrana analizada utilizando SBDIG-2. A continuación, las membranas se desarrollaron tal y como se recomienda en el manual del usuario de Roche (DIG Application manual for filter hybridisation).

Software

[0159] Las secuencias consensuadas se analizaron utilizando FramePlot versión 2.3.2, editor de alineamiento de secuencias BioEdit, ClustalW (EMBL-EBI) y la herramienta de búsqueda de alineamiento básica local (BLAST, NCBI).

Resultados y discusión

CosAG14

[0160] El cósmido, CosAG14, contiene un fragmento de 38168bp del DNA genómico aislado de A. garbadinensis. El análisis de secuencia identificó DNA que codifica para el líder y péptido de actagardina, este gen se designó con el nombre actA. Dos residuos de alanina reposan inmediatamente aguas arriba del péptido de actagardina. Se cree que estos residuos representan los sitios de reconocimiento para el corte de la proteasa del péptido líder a partir de la actagardina. El corte parcial en esta posición que conlleva la retención de una alanina se pensaba que daba la

fabricación de la ala-actagardina de rutina observada en los caldos de fermentación de A. garbadinensis. Aguas abajo del gen actA reposa una región de 3162bp de DNA con una similitud de secuencia fuerte a cualquiera de las proteínas IanM, por ejemplo, mrsM (30% identidad) a partir del clúster del gen de mersacidina. Este gen putativo se ha designado con el nombre actM y se piensa que está involucrado en la modificación del péptido de la actagardina, catalizando la deshidratación y la formación del tioéter. Luego la lectura de la estructura denominada actO, que está situada 11 bp aguas debajo de actM codifica una proteína de 341-amino-ácidos con una similitud de secuencia (~39% identidad) a varias monooxigenasas de tipo luciferasa. El papel de la monooxigenasa, ActO, se cree que es catalizar la incorporación del oxígeno que genera la actagardina a partir de la desoxi-actagardina. En orientación inversa a actO y localizada 62bp aguas abajo está la estructura de lectura abierta denominada actR. El producto de proteína de este marco de lectura abierta muestra similitud de secuencia (~37% identidad) a varios reguladores de respuesta de dos componentes. Situados 789bp aguas abajo y en la misma orientación a actR reposa una proteína putativa de 812 amino-ácidos que muestra similitud de secuencia (~25% identidad) a permeasas de transportador ABC. Esta proteína putativa denominada actT es potencialmente responsable de exportar el lantibiótico modificado de la célula. Las secuencias de aminoácidos del segundo y cuarto marco de lectura abierta aguas abajo de actT muestra similitud (~30% identidad) a las proteínas de unión de quinasa y penicilina reguladoras de respuesta, respectivamente. Los trabajos recientes en el clúster de gen biosintético nisin en monocitogenes Listeria (Gravesen. y otros, 2004) han demostrado que una quinasa histidina conjuntamente con una proteína de unión a penicilina y una proteína de función desconocida están implicadas en conferir resistencia nisin. La presencia de genes análogos con proximidad cercana a la actA puede indicar que estos genes están implicados en un mecanismo de resistencia a la actagardina.

CosAL02

[0161] El cósmido CosAL02 contiene un fragmento de 40402bp del DNA genómico aislado de Actinoplanes liguriae. El análisis de la secuencia ha identificado un gen lanA que codifica para una proteína de 64-amino-ácidos con una fuerte homología de secuencia (50 residuos idénticos) al gen actA identificado en el cósmido CosAG14. Se han denominado estas especies de gen lanA como ligA. La secuencia de aminoácidos del péptido de este lanA difiere de esta actagardina por dos residuos indicados en la alineación de los dos genes que se muestran a continuación (SEQ. ID 119 y SEQ. ID 212): AG actA MSALAIEKSWKDVDLRDGATSHPAGLGFGELTFEDLREDRTIYAASSGWVCTLTIECGTVICAC 64 AL lanA MSAITVETTWKNTDLREDLTAHPAGLGFGELSFEDLREDRTIYAASSGWVCTLTIECGTLVCAC 64 *** : : :* . : ** : . * * * : . * : * * * * * * * * * * : * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * : : * * *

[0162] Las mutaciones V15L y I16V generarían una proteína con una masa idéntica a la actagardina y, por lo tanto, no se distinguirían por análisis de espectroscopia de masas (Ic-ms). El producto potencial del gen lanA identificado en CosAL02 representa un nuevo lantibiótico. Un marco de lectura abierto que reside 321 bp aguas arriba de ligA codifica una proteína putativa de 286-aminoácidos que muestra similitud de secuencia (46% identidad) a la proteína StrR de Streptomyces glaucescens. La proteína StrR es una ruta específica de unión DNA activadora implicada en la regulación de la expresión del gen estreptomicina. La similitud de secuencia (31 % identidad) del marco de lectura abierta que reside aguas abajo de ligA sugiere que codifica para un polipéptido de 1046-aminoácidos IanM (denominado "ligM" a continuación) potencialmente implicado en la modificación del prepéptido ligA. El codón de partida del marco de lectura abierta aguas abajo que sigue, lanT (ligT), solapa el codón de terminación de ligM. LigT es una proteína de 575 aminoácidos con similitud de secuencia a varios transportadores ABC. Las proteínas LanT son responsables de la secreción de o bien el producto maduro final o el producto posttraducido modificado todavía unido a su secuencia líder. Tal y como se observa en el cósmido, CosAG14, el siguiente marco de lectura abierta aguas abajo de ligT codifica para una proteína de 347 aminoácidos con similitud de secuencia (~38% identidad) a monooxigenasas de tipo luciferasa. Esta monooxigenasa putativa (ligO) se cree que está implicada en la incorporación de oxígeno y formación del enlace sulfóxido. Situado aguas abajo de ligO y en orientación inversa reside una proteína putativa de 217 aminoácidos que muestra similitud de secuencia (~37%) a varios reguladores de respuesta de dos componentes. Este regulador putativo se ha designado ligR.

Tabla 1- Anotación de CosAG14 (fragmento aislado de 38168bp a partir de A. garbadinensis. Se omite la secuencia principal del vector SuperCos1)

Tabla 2 - Anotación de CosAL02 (fragmento aislado de 40402bp a partir de A.liguriae. Se omite la secuencia principal del vector SuperCos1)

EJEMPLO 2 – Casete de expresión

5 Formación de un casete de expresión

[0163] Este ejemplo muestra la fabricación de un casete de expresión de acuerdo con la presente invención. Este casete de expresión, plásmido pAGvarX, se ha designado para la generación eficaz de una variante de genes lanA de la presente invención que a continuación pueden introducirse en una célula huésped, tal como una cepa de A.

10 garbadinensis en la que la cepa natural actA se ha suprimido (A. garbadinensis L actA). Este plásmido, un derivado del vector pSET152 (Bierman y otros, 1992) se integrará en el cromosoma del huésped vía el sitio de unión attP. La expresión del gen mutado actA mediante el organismo del huésped conjuntamente con los genes de cepa natural restantes del clúster del gen biosintético de actagardina deberá generar variantes de actagardina.

Construcción del plásmido pAGvarX

[0164] A menos que se especifique lo contrario todas las posiciones citadas se refieren a SEQ ID NO:100. El esquema para la construcción del plásmido pAGvarX se muestra en la Figura 3. La base adyacente al marco de lectura abierta (orf) que reside aguas arriba de actA en la posición 21237 respecto el residuo de leucina dentro de actA que codifica para la región en la posición 21672 se amplificó por PCR utilizando los iniciadores O/AGvar01bF y O/AGvar02bR (tabla de iniciadores) y pLITAG01 como una plantilla. Los iniciadores se diseñaron para introducir un flanqueador Xbal en la terminación 5’ y un sitio Bg/II vía una mutación silenciosa en la región leucina 3’ que codifica para la actA. Este fragmento se introdujo en el pUC19 desfosforilado previamente digerido utilizando Smal para dar pAGvar1.

[0165] La región de DNA que se expande des de la C-terminal del actA hasta el marco de lectura abierta (orf ) contiguo aguas abajo (21758-21836 inclusivo) se amplificó por PCR utilizando los iniciadores O/AGvar05F y O/AGvar06R y pLITAG01 como plantilla. Los iniciadores se diseñaron para introducir un sitio AvrII flanqueador en la posición 5’ y un sitio EcoRI en la posición final 3. El producto de PCR resultante se clonó en pUC19 desfosforilado previamente digerido utilizando SmaI para dar AGvar2. A continuación, los plásmidos pAGvar1 y pAGvar2 se digirieron utilizando Xbal y el fragmento de PCR de pAGvar1 recuperó y clonó en el pAGvar2 digerido Xbal y desfosforilado, la orientación correcta del fragmento entrante se determinó por análisis de restricción. El plásmido resultante pAGvar3 se digirió a continuación utilizando Bg/II y AvrII y se ligó a los oligonucleótidos recocidos O/AGvar03F y O/AGvar04R generando pAGvar4. A continuación, el plásmido pAGvar4 se digirió utilizando EcoRI y Xbal y el fragmento resultante �620bp que incluye los oligonucleótidos recocidos introducido en pSET152 previamente digerido utilizando EcoRI y XbaI proporcionando el vector pAGvarX.

[0166] La región del pAGvarX construido recociendo los oligonucleótidos respectivos, introduce un sitio BsrGI vía una mutación silenciosa en los aminoácidos 6 y 7 (C y T respectivamente) con respecto al péptido de actagardina. Este sitio puede utilizarse conjuntamente con o bien el sitio aguas arriba Bg/II o el sitio aguas abajo AvrII para introducir DNA que codifica para las mutaciones marcadas a cualquiera de los aminoácidos codificados con el péptido actA.

EJEMPLO 3 – Célula Huésped

[0167] Este ejemplo ilustra la fabricación de células huésped productoras de lantibiótico en las que el gen lanA se ha inactivado. En este ejemplo, la célula huésped es A. garbadinensis en la que el gen actA se ha suprimido.

Construcción de la cepa A. garbadinensis L actA

[0168] La cepa A. garbadinensis L actA se utiliza como un huésped para la expresión de variantes del gen estructural de la actagardina actA. Esta cepa se generó a partir de la cepa natural A. garbadinensis utilizando la tecnología de redireccionamiento desarrollada por Gust y otros, 2002. Primeramente, la región de DNA a partir del cósmido CosAG14 que codifica para actA se sustituyó con el casete SBdeI-1. SBdel-1 consiste en el gen resistente a la apramicina (aac(3)IV) y oriT flanqueada por los sitios (FRT) de blanco de reconocimiento FLP y se amplificó por PCR utilizando el plásmido plJ773 como plantilla juntamente con los iniciadores O/SB50F y O/SB51R que unen a 21536 y 21802 de la SEQ ID NO:100 respectivamente. Siguiendo el protocolo de redireccionamiento (Gust y otros, 2004), actA de CosAG14 se sustituyó con SBdel-1 generando el cósmido CosAG14LA. La parte central del casete SBdel-1 se eliminó a continuación de CosAG14LA mediante escisión mediada por FLP a continuación de la etapa 7 del protocolo de redireccionamiento generando CosAG14LB. La eliminación de esta región permite la generación de supresiones en el marco no marcado no polar así como el uso repetido del mismo marcador de resistencia (Gust y otros, 2003).

[0169] La segunda etapa de construcción fue diseñar el cósmido de manera que pudiera introducirse en A. garbadinensis

vía conjugación. Esto empezó primero insertando CosAG14LB en E. coli la cepa BW25113/pIJ790 por transformación. El gen de ampicilina de CosAG14LB a continuación se sustituyó con SBdel-2 seguido del protocolo de redireccionamiento (Gust y otros, 2004) generando el cósmido CosAG14LC. El casete SBdel-2, tipo SBdel-1, alberga el gen de resistencia a la apramicina (aac (3)IV) y oriT flanqueado por los sitios FRT pero se generó utilizando los iniciadores O/SB52F y O/SB53R conjuntamente con la plantilla pIJ773.

[0170] El CosAG14LC se utilizó para transformar células electrocompetentes de E. coli ET12567/pUZ8002 antes de conjugarse con A. garbadinensis seguido del protocolo de redireccionamiento (Gust y otros, 2004; véase también el siguiente párrafo). La cepa resultante en la que el gen actA gene se ha suprimido del cromosoma del productor de cepa natural es A. garbadinensis L actA.

[0171] Con más detalle, para obtener la cepa A. garbadinensis L actA de más arriba, se utilizó el CosAG14LC para transformar las células electrocompetentes de E. coli ET12567/pUZ8002 antes de conjugarse con A. garbadinensis. Los exconjugados resistentes a Apramicina se obtuvieron y se sub-cultivaron a través de seis rondas sucesivas de crecimiento en TSB sin apramicina. Las células del cultivo 6 se colocaron en una placa sobre el medio 65 y se incubaron a 30°C. Después de 5 días las colonias se transfirieron e interconectaron en un área de aproximadamente 1 cm2 sobre el medio 65. Después de 3 días de incubación a 30°C las células interconectadas se transfirieron al medio 65 que contenía apramicina a una concentración final de 50 mg/ml. Siguiendo 72 h de incubación a 30°C, se seleccionaron las células sensibles a la apramicina y las interconexiones respectivas utilizadas para inocular frascos de 50 ml que contenían 10 ml TSB y crecieron a -30°C, 250 rpm durante 4 días. El DNA genómico se preparó a partir de cada cultivo y se analizó por PCR utilizando oligonucleótidos O/AGvar01bF y O/AGvar06r. Se generaron productos de PCR de un tamaño compatible con la supresión del gen actA. En paralelo, los análisis de caldos de fermentación por HPLC demostraron que estas mismas muestras no produjeron actagardina.

EJEMPLO 4 – Expresión Heteróloga

[0172] Este ejemplo ilustra la expresión de la actagardina a partir del clúster gen de SEQ ID NO:100 en una célula huésped que es una célula no productora, S. lividans. Dichas células huésped proporcionan medios alternativos de generación de variantes activas de estos dos péptidos.

[0173] Los cósmidos CosAG14 y CosAL02 que contienen los clústeres de genes biosintéticos que codifican para la fabricación de actagardina y desoxi-actagardina B no poseen un origen de transferencia (oriT) necesario para facilitar la transferencia conyugal a un huésped heterólogo. Utilizando la tecnología de redireccionamiento (Gust y otros, 2002) un oriT conjuntamente con un sitio de unión a bacteriófago attP e integrasa (int) puede introducirse en el esqueleto SuperCos1 del CosAG14 y CosAL02 sustituyendo el gen resistente a la neomicina, neo.

Construcción de vectores para la expresión heteróloga.

[0174] El cósmido pMJCOS1 (suministrado por JIC, Norwich) es un derivado de SuperCos1 (Stratagena) en el que el gen que codifica para la resistencia a la neomicina se ha sustituido por un casete (HEapra) que incluye DNA que codifica para un oriT, attP, integrasa (int) y el gen resistente a apramicina (aac(3)IV). Se aisló el casete HEapra mediante la digestión de pMJCOS1 con Sspl y la recuperación del DNA a partir del gel de agarosa. Este casete conjuntamente con CosAG14 y CosAL02 se utilizaron para generar el cósmido CosAG14HEapra y CosAL02HEapra respectivamente seguido del protocolo de redireccionamiento tal y como se describe en Gust y otros, 2004.

[0175] A continuación, se introdujo el cósmido CosAG14HEapra en S. lividans vía conjugación. Se aislaron los exconjugados resistentes a apramicina de S. lividans/CosAG14HEapra. Se utilizaron tres exconjugados para inocular medios de inoculación TSB. S. lividans, A. garbadinensis y A. liguriae crecieron en paralelo para proporcionar controles. Después de 48 h de incubación se utilizaron los cultivos inoculados para inocular un margen de cuatro medios de fabricación diferentes, es decir, AAS1, GM1, GM3 y TSB. Se incubaron estos cultivos durante un total de nuevo días a 30°C con 1,5 ml partes alícuotas eliminándose de cada frasco después de 5, 7 y 9 días de incubación. Las partes alícuotas se centrifugaron a 14000 rpm (IEC micromax benchtop centrifuge) durante 10 minutos y, entonces, el sobrenadante se decantó y utilizó sin diluir para el bioensayo y análisis de HPLC-MS.

[0176] Las zonas de inhibición (haloes) indicativas de la presencia de un compuesto activo biológico se observaron alrededor de todos los pocillos con supernadantes de S. lividans que contenían el cósmido CosAG14HEapra (S. lividans/CosAG14HEapra) excepto para los pocillos con supernadante de las fermentaciones en TSB donde no se generaron haloes. No se observó actividad biológica alrededor de los pocillos cargados con supernadante de las fermentaciones de S. lividans crecidas en cualquiera de los cuatro medios. Los haloes se manifestaron alrededor de todos los pocillos cargados con supernadante de cultivos de A. liguriae and A.garbadinensis donde se mantuvo el crecimiento. Todos los haloes se generaron sistemáticamente del primer día del muestreo al día 5 hasta el día 9 aunque se evidenció una reducción general del diámetro de los haloes.

[0177] El análisis HPLC-MS de los supernadantes de las fermentaciones de S. lividans/CosAG14HEapra confirmaron la presencia de picos con tiempos de retención y masas correspondientes a la ala(O)actagardina. Estos mismos picos estaban ausentes sólo en los supernadantes de S. lividans. La Tabla 3 resume los análisis de HPLC-MS de supernadantes de la fermentación de S. lividans, S. lividans/CosAG14HEapra, A. garbadinensis y A. liguriae seguido de la incubación durante 5 días.

Tabla 3

EJEMPLO 5 – Actividades Antibacterianas

Determinación MIC

[0178] Se ensayó una selección de las variantes producidas tal y como se ha descrito aquí más arriba además para la actividad contra un rango de bacterias. Las concentraciones inhibidoras mínimas (MICs) para todos los 10 organismos con la excepción de Streptococcus pneumoniae se determinaron mediante diluciones de antibiótico a la mitad en caldo de Mueller-Hinton (MHB) complementado con cloruro de calcio deshidratado hasta una concentración final de calcio de 400mg/ml. Las concentraciones inhibidoras mínimas (MICs) para S. Pneumoniae se determinaron mediante diluciones de antibiótico a la mitad en caldo de cerebro y corazón (BHI) complementado con 400 mg/ml de cloruro de calcio dihidratado. Se prepararon soluciones de reserva de agente antimicrobiano y se almacenaron

15 según la normativa NCCLS M7-A6.

[0179] Se diluyeron los cultivos de caldo con crecimiento activo para contener de 105 a 106 CFU/ml ajustando a la absorbancia de 0,2 – 0,3 a 600nm, equivalente al 0,5 de la normativa McFarland. A continuación, se diluyeron de nuevo en caldo 1:100. Los ensayos se realizaron por duplicado en placas de microtítulo de 96 pocillos estériles en

20 un volumen total de 200 ml (160 ml caldo, 20 ml antibiótico, 20 ml inóculo) en un margen de concentración de 64 mg/ml a 0,06 mg/ml. El pocillo 12ª de la placa de microtítulo no contenía agente antimicrobiano. Se utilizó vancomicina como antibiótico de referencia para el control de calidad. Se incubaron las placas aeróbicamente agitando durante 18 - 20 h a 37°C con el MIC definido como la concentración más baja del fármaco que no produjo crecimiento visible.

EJEMPLO 6 – Análisis NMR

5 Estudios NMR en Actagardina y Desoxi-actagardina

[0180] Se utilizó con éxito espectroscopia de NMR (COSY, TOCSY, HSQC and NOESY) para confirmar los resultados de secuenciación obtenidos a partir de los productores de actagardina (A. garbadinensis) y desoxiactagardina B (A. liguriae). Mientras los datos obtenidos no permitieron una asignación no ambigua de forma

10 completa de todos los residuos, fueron coherentes con las estructuras mostradas en la Figura 4 y suficientes para confirmar que la desoxi-actagardina B de A. liguriae tiene en las posiciones 15 y 16 los residuos Leu y VaI, respectivamente.

EJEMPLO 7 - S�?NTESIS DE DERIVADOS

15 [0181] Se prepararon los siguientes derivados de desoxi-actagardina B, en los que los grupos Z y la amida Cterminal fueron como sigue:

20 Estructuras de los compuestos

[0182]

[0183] La síntesis de los compuestos I - XI fue como sigue:

Procedimiento general 1. Preparación de los compuestos I - III

30 [0184] A una solución de desoxi-actagardina B (20mg, 11 nmol), amina apropiada (11nmol) y diisopropiletilamina (7,2ml, 70nmol) en tetrahidrofurano seco (0,8ml) se añadieron 200ml de una solución de hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-trispirrolidino-fosfonio (PyBop) (70mg, 134nmol) en dimetilformamida seca (1,0ml). La mezcla se analizó por HPLC hasta seguir el progreso de la reacción, la adición adicional de partes alícuotas de la solución Pybop hasta que todo el material de partida se hubo consumido. El análisis por HPLC en esta etapa también mostró las cantidades variables (5-20%) de la diamida. Después de completar la reacción, la mezcla se diluyó con 30% de acetonitrilo en 20mM Kpi de tampón fosfato acuoso, pH7 (10ml) y la monoamida se purificó mediante preparativos HPLC utilizando las condiciones descritas en la Tabla

4. Las fracciones apropiadas se concentraron al 25% de su volumen original y se desalaron cargando en una columna precondicionada C18 Bond Elut (500mg) que a continuación se lavó por elución secuencial con dos volúmenes de columna de 30, 40, 70 y 90% de etanol acuoso. La evaporación de las fracciones apropiadas dio el producto deseado en forma de sólidos blancos.

Compuesto I : Desoxi-Actagardina B N-[3-dimetilaminopropil] monocarboxamida

[0185] Se obtuvo a partir del acoplamiento de desoxiactagardina B y 3-(dimetilamino)propilamina de acuerdo con el Procedimiento General 1. Rendimiento 18mg, 85% de rendimiento. [M+2H 2+] calculado 979,0, encontrado 980,2

Compuesto II : Desoxi-Actagardina B N-[1-(1-metil-4-piperidinil)piperazina] monocarboxamida

[0186] Se obtuvo a partir del acoplamiento de desoxiactagardina B y 4-(piperidino)piperazina de acuerdo con el Procedimiento General 1. Rendimiento 8mg, 37% de rendimiento. [M+2H 2+] calculado 1019,5, encontrado 1020,0; [M+3H 3+] calculado 680,0, encontrado 680,0

Compuesto III: Desoxi-Actagardina B [1-(3-dimetilaminopropil)piperazina] monocarboxamida

[0187] Se obtuvo a partir del acoplamiento de desoxiactagardina B y 1-(3-dimetilaminopropil)piperazina de acuerdo con el Procedimiento General 1. Rendimiento 10mg, 46% [M+2H 2+] calculado 1013,5, encontrado 1014,0

Procedimiento General 2. Preparación de los compuestos IV-IX

[0188] Se trató una solución de aminoácidos protegidos de apropiado Fmoc (34nmol) en dimetilformamida seca (0,4ml) con una solución de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio hexafluorofosfato (PyBop) (11,4mg, 22nmol) y diisopropiletilamina (11ml, 68 nmol) en dimetilformamida seca (0,4ml). A continuación, la mezcla se añadió a una solución de desoxi-Actagardina B (2mg, 11 nmol) en dimetilformamida seca (0,5ml). La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 1h, después de cuyo tiempo el análisis HPLC (30-65% acetonitrilo en 20mM Kpi de tampón fosfato acuoso, pH7) mostró la conversión completa del producto de partida. La mezcla de reacción se diluyó con 40% de metanol acuoso (20ml) y la mezcla se pasó a través de una columna C18 Bond Elute (500mg) que se había precondicionado mediante el lavado con dos volúmenes de columna de 100% metanol seguido de dos volúmenes de columna de agua. La columna se eluyó secuencialmente con dos volúmenes de columna de 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100% de metanol acuoso. Las fracciones se analizaron por HPLC y las fracciones que contenían el producto enlazado protegido con Fmoc se evaporaron a sequedad. El residuo se recogió en dimetilformamida (1 ml) y se añadió piperidina (50ml) para retirar el grupo protector Fmoc. El avance de la reacción se monitorizó por HPLC y después del consumo completo del material de partida la solución se diluyó en 30% de metanol acuoso (20ml). A continuación, la mezcla se eluyó a través de un cartucho C18 Bond Elut (500mg) tal y como se ha descrito previamente y el producto obtenido después de la evaporación de las fracciones adecuadas se purificó de nuevo mediante HPLC preparada utilizando las condiciones descritas en la Tabla 4. Las fracciones apropiadas se concentraron al 25% de su volumen original y se desalaron cargando en una columna precondicionada C18 Bond Elut (500mg) que a continuación se lavó por elución secuencial con dos volúmenes de columna de 30, 40, 70 y 90% metanol acuoso. La evaporación de las fracciones apropiadas dio los productos deseados en forma de sólidos blancos.

Compuesto IV : D-Ala <0>desoxi-actagardina B

[0189] De acuerdo con el procedimiento general 2 se preparó a partir de desoxi-actagardina B y Fmoc-D-alanina en 74% de rendimiento. [M+2H 2+] calculado 972,5, encontrado 973,0 043/188

Compuesto V : L-Ile(0)desoxy-actagardina B

[0190] De acuerdo con el procedimiento general 2 se preparó a partir de desoxi-actagardina B y Fmoc-L-isoleucina en 27% de rendimiento. [M+2H 2+] calculado 993,5, encontrado 993.8

Compuesto VI : L-Val(0)desoxiactagardina B

[0191] De acuerdo con el procedimiento general 2 se preparó a partir de desoxi-actagardina B y Fmoc-L-valina en 55% de rendimiento. [M+2H 2+] calculado 986,5, encontrado 985,9.

Compuesto VII : L-Phe(0)desoxiactagardina B

[0192] De acuerdo con el procedimiento general 2 se preparó a partir de desoxi-actagardina B y Fmoc-L-fenilalanina en 22% de rendimiento. [M+2H 2+] calculado 1010,5, encontrado 1010,9.

Compuesto VIII : L-Lys(0)desoxiactagardina B

[0193] De acuerdo con el procedimiento general 2 se preparó a partir de desoxi-actagardina B y Bis(Fmoc)-L-lisina en 45% de rendimiento. [M+2H 2+] calculado 1001,0, encontrado 1001,6

Compuesto IX : L-Tryp(0)desoxiactagardina B

[0194] De acuerdo con el procedimiento general 2 se preparó a partir de desoxi-actagardina B y Fmoc-L-triptofan en 55% de rendimiento. [M+2H 2+] calculado 1030,0, encontrado 1029,9.

EJEMPLO 8 – DATOS ANTIBACTERIANOS ADICIONALES

Determinación MIC

Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus spp.

[0195] Las concentraciones inhibidoras mínimas (MICs) se determinaron y las soluciones patrón de agente antimicrobiano se prepararon y almacenaron de acuerdo con el método de caldo de microdilución de referencia NCCLS para bacterias aeróbicas (M7-A6, 2003). Los MICs se determinaron mediante diluciones de antibiótico a la mitad en caldo Mueller-Hinton (MHB) o caldo de infusión cerebro corazón (BHI) (S. pneumoniae). Los cultivos de caldo de crecimiento activo se regularon en caldo estéril o mediante suspensiones de colonias directa (S.pneumoniae) hasta una turbidez equivalente al 0,5 de la normativa McFarland (1 x 108 CFU/ml), a continuación de nuevo diluidas en caldo estéril para una inoculación final en placas de micro títulos de 96 pocillos estéril de aproximadamente 5 x 105 CFU/ml. Los ensayos se realizaron por duplicado con Enterococcus faecalis ATCC 29212 incluido como cepa de control de referencia y Vancomicina como antibiótico de referencia para el control de calidad. Las placas se incubaron aeróbicamente, agitando durante 18 -20 horas a 37°C con el MIC definido como la concentración más baja del fármaco que no produce crecimiento visible.

Clostridium difficile

[0196] Las concentraciones inhibidoras mínimas (MICs para C. difficile se determinaron y las soluciones patrón de agente antimicrobiano se prepararon y almacenaron de acuerdo con el método de dilución agar de referencia NCCLS para bacterias anaeróbicas (M11-A5, 2001). Las diluciones de antibióticos a la mitad se prepararon en agar Wilkens-Chalgren (WCA). Los organismo de ensayo se seleccionaron desde las 48 horas de crecimiento en agar Braziers (C.C.E.Y.), subcultivados en caldo Schaedler hasta una densidad equivalente al 0,5 de la normativa McFarland (1 x 108 CFU/ml), con una inoculación final sobre placas WCA de aproximadamente 105 CFU/mancha. Se incluyó el Bacteroides fragilis ATCC 25285 como cepa de control de referencia y se utilizó Metronidazol como antibiótico de referencia para el control de calidad. Todas las manipulaciones se realizaron por duplicado en atmósfera ambiente en un medio pre-reducido con sólo una pequeña exposición al oxígeno. Las placas se incubaron anaeróbicamente durante 48 horas a 37°C con el MIC definido como la concentración del fármaco donde una reducción marcada sucede en la aparición de crecimiento en la placa de ensayo comparada con el crecimiento en la placa control anaeróbica.

Propionibacterium acnes

[0197] Los organismos de ensayo se seleccionaron a partir de 3-7 días de crecimiento en agar Wilkens-Chalgren (WCA) complementado con furazolidona (1-2 mg/ml). El caldo fresco Wilkens-Chalgren (WCB) se inoculó por suspensión directa de colonias con colonias individuales de P. acnes y se reguló a una densidad equivalente al 0,5 de la normativa McFarland (1 x 108 CFU/ml), a continuación se diluyó de nuevo en estéril WCB para una inoculación final en placas de microtitulo de 96 pocillos estéril de aproximadamente 105 CFU/ml. Diluciones de antibiótico a la mitad se llevaron a cabo en agua estéril con soluciones patrón preparadas y almacenadas de acuerdo con la normativa NCCLS (M11-A5, 2001). Los ensayos se llevaron a cabo por duplicado con Vancomicina y Clindamicina utilizadas como antibióticos de referencia para el control de calidad. Las placas se incubaron anaeróbicamente durante 48-72 horas a 37°C con el MIC definido como la concentración del fármaco donde una reducción marcada ocurrida en la parición del crecimiento en la placa de ensayo comparado con el crecimiento en la placa control anaeróbica. Todas las manipulaciones se llevaron a cabo por duplicado en atmósfera ambiente en medio prereducido con sólo una pequeña exposición al oxígeno.

[0198] El medio de cultivo se complementó con iones de calcio (tal como cloruro de calcio) a 50mg/ml excepto donde se indiquen concentraciones más elevadas. Los valores MIC en mg/ml se muestran en las siguientes Tablas:

Tabla 6: Valores MIC frente Enterococci, Streptococci y Staphylococci Tabla 7: Valores MIC frente ácido fusídico-resistente a Staphylococcus aureus

Tabla 8: Valores MIC frente mupirocin-resistente a Staphylococcus aureus

Tabla 9: Valores MIC frente Propionibacterium acnes

Tabla 11: Valores MIC frente C.difficile

Materiales y Métodos

[0199] Los materiales y métodos utilizados en los Ejemplos 2-7 de más arriba son los que siguen:

Medios

[0200] Todos los tampones, soluciones y medios se prepararon utilizando agua en ósmosis inversa (RO) y contenido por litro de los siguientes ingredientes:

(continuación)

Bioensayos

[0201] El Micrococcus luteus se inoculó a partir de patrón congelado en 10ml de caldo Mueller-Hinton y se dejó crecer durante toda la noche a 30°C con agitación a 200 rpm. Se utilizó 1 ml de este cultivo para inocular 300 ml de agar Mueller-Hinton que a continuación se vertió en placas de Petri. Pocillos (6mm de diámetro) situados aparte equidistantes se obtuvieron utilizando una barrena y se cargaron seguidamente con 50 ml de la muestra respectiva. La placa de bioensayo se colocó en un flujo de aire laminar hasta que las muestras cargadas se difundieron, en cuyo punto las placas se transfirieron a un incubador de 30°C y se dejaron durante toda la noche.

Digestiones de restricción Endonucleasa

[0202] Las digestiones de DNA con encimas de restricción se llevaron a cabo en los tampones suministrados y de acuerdo con las normas de los fabricantes. Generalmente, para digestiones de preparación se digirieron 5 mg de DNA con 12 unidades de encima durante 3 h a la temperatura recomendada. Para digestiones de análisis, se digirieron 0,5 mg de DNA con 2 unidades de encima durante 2-3 h de nuevo a la temperatura recomendada. El DNA digerido se analizó mediante electroforesis de gel de agarosa.

Exconjugados de sub-cultivos

[0203] Los tapones agar de los exconjugados conectados se utilizaron para inocular matraces de 50 ml que contenían 8 ml TSB y 2 perlas de vidrio. Los cultivos se inocularon a 30°C, 250 rpm durante 10 días, a continuación, se retiraron 100 ml y se añadieron a 10 ml TSB en un matraz de 50 ml que contenía 2 perlas de vidrio. Los matraces se incubaron durante 2 días, a continuación, se retiró 1 ml y se utilizó para inocular un matraz de 50 ml que contenía 10 ml TSB. Utilizando 1 ml inóculo un total de seis rondas sucesivas de crecimiento se llevaron a cabo cada una incubada durante 2 días a 30°C, 250 rpm. Las células de la sexta ronda del subcultivo se pusieron en pastillas mediante centrifugación a 4000 rpm durante 20 minutos (Heraeus Sepatech Megafuge) a continuación se sonicaron (MSE Sanyo Soniprep 150, amplitud 10-15 micrones) durante 30 segundos en TSB para interrumpir el micelo. Diluciones en serie (10-1 a 10-5 en TSB) de las células sonicadas se depositaron en placas sobre el medio 65 y se incubaron a 30°C.

Fermentación para expresión heteróloga

[0204] Se incubaron matraces cónicos de 50 ml cada uno conteniendo 2 perlas de vidrio y o bien 8 ml TSB o medio AAS1 complementado con ácido nalidíxico y el antibiótico selectivo apropiado utilizando tapones agar o 250 ml de un patrón de glicerol -80°C. Después de 2 - 4 días de incubación da 30°C, 200 rpm, 1,2 ml (3%) por cultivo de siembra se utilizó para inocular 40 ml del medio de producción respectivo en matraces cónicos de 250 ml que contenían 2 perlas de vidrio. Estos cultivos se incubaron a 30°C, 200 rpm durante 9 días. Se retiraron partes alícuotas del caldo total de 1,5 ml periódicamente de cada cultivo para análisis mediante bioensayo y/o análisis HPLC-MS.

[0205] Se inocularon matraces cónicos de 250 ml conteniendo cada uno 2 perlas de vidrio y 50 ml de medio SV2 con 500 ml (1%) de células A. liguriae a partir de patrón de glicerol. Después de 4 días de incubación a 30°C, 250 rpm, 12 ml (3%) por cultivo de siembra se utilizó para inocular 400 ml de GM3 en matraces cónicos de 2L. Estos cultivos se incubaron a 30°C, 225 rpm durante nueve días. El caldo de cultivo se recolectó y mediante centrifugación a 4000 rpm (Heraeus Sepatech Megafuge) durante 30 minutos después de los cuales el supernadante se decantó de la pastilla de células.

Fermentación de A. garbadinensis para el aislamiento de actagardina y Ala(O)-actagardina

[0206] Se inocularon matraces cónicos de 250 ml conteniendo cada uno 2 perlas de vidrio y 50 ml de medio AAS con 500 ml (1%) de células A. garbadinensis a partir de un patrón de glicerol. Después de 9 días de incubación a 30°C, 250 rpm, 12 ml (3%) por cultivo de siembra se utilizó para inocular 400 ml de AAS en matraces cónicos de 2L. Estos cultivos se incubaron a 30°C, 200 rpm durante ocho días. El caldo de cultivo se recolectó por centrifugación a 4000 rpm (Heraeus Sepatech Megafuge) durante 30 minutos después de los cuales el supernadante se decantó de la pastilla de células.

Aislamiento de Desoxi-actagardina B para estudios MIC

[0207] Se añadió resina de Diaion HP-20 (50 g/L) y se mezcló con el supernadante aislado de una fermentación de

A. liguriae

y se dejó durante toda la noche a 4°C. La suspensión se dividió en partes alícuotas en columnas de Bond Elut (60 ml) y la resina se lavó secuencialmente con cuatro volúmenes de lecho de agua seguido de tres volúmenes de lecho de 25, 50, 75 y 100% de metanol. Los análisis HPLC confirmaron la presencia de desoxi-actagardina B en las fracciones de 50, 75 100% de metanol. Estas fracciones se combinaron, a continuación, se concentraron a aproximadamente un cuarto del volumen del fondo de partida. El concentrado de 1L de caldo se cargó sobre dos columnas de C18 Bond Elut (5 g) que habían sido precondicionadas mediante el lavado con dos volúmenes de columna de 100% de metanol seguido de dos volúmenes de columna de agua. Las columnas se eluyeron secuencialmente con dos volúmenes de columna de 50, 60, 70, 80, 90% de metanol seguido de dos volúmenes de columna de 100% de metanol. El análisis HPLC confirmó la presencia de desoxi-actagardina B en las fracciones 80, 90 100% de metanol, estas fracciones se juntaron y concentraron a un tercio del volumen de partida. Se añadió un volumen igual de 40 mM de fosfato potásico pH 2,5 en 50% de metanol y, a continuación, el concentrado se cargó en las tres columnas pre-equilibradas SCX Bond Elut (1g). Inicialmente, las columnas SCX se lavaron con 40 mM de fosfato potásico pH 2,5 en 50% de metanol y, a continuación, eluyeron utilizando 1,5 volúmenes de columna de 250 mM de fosfato potásico pH 7,0 en 50% de metanol. El eluyente se desaló cargando sobre una columna de C18 Bond Elut (5 g) que había sido pre-condicionada con dos volúmenes de columna de metanol seguido de dos volúmenes de columna de agua. La columna se lavó con dos volúmenes de 50% y, a continuación, 60% de metanol. Se eluyó la desoxi-actagardina B siguiendo la adición de dos volúmenes de columna 70, 80, 90 y 100% de metanol. Las fracciones conteniendo desoxi-actagardina B purificada tal y como se había confirmado por los análisis de HPLC y LC-MS se juntaron y evaporaron a sequedad.

Aislamiento de Ala(0)-Desoxiactagardina B a partir de la fermentación de A.liguriae

[0208] Se mezcló resina diaion HP-20 (50 g/L) con supernadante a partir de cuatro litros de fermentación de A. liguriae y se dejó toda la noche a 4°C. La suspensión se recogió en un cono de cocción de vidrio y la resina se lavó secuencialmente con cuatro volúmenes de lecho de agua seguido de cuatro volúmenes de lecho de 50% de metanol. La desoxi-actagardina B y Ala(0)-desoxiactagardina B se eluyeron a partir de la resina mediante lavado con cinco volúmenes de lecho de 100% de metanol. La fracción de 100% de metanol se concentró a un tercio del volumen original y, a continuación, se diluyó mediante adición de agua a una concentración final de 60% de metanol. La solución resultante se cargó en cuatro columnas 10g C18 Bond Elut antes de lavar con dos volúmenes de columna de 50% de metanol. Los componentes relacionados con la desoxi-actagardina B se eluyeron a partir de la columna utilizando dos volúmenes de columna de metanol/0,5% de ácido fórmico. El eluyente resultante se concentró por evaporación a 40 ml y la Ala(0)-desoxiactagardina B se separó de la desoxi-actagardina B mediante preparativos HPLC utilizando las condiciones descritas en la tabla que sigue.

[0209] Las fracciones conteniendo Ala(0)-desoxi-actagardina B (tal y como se confirmó por análisis HPLC y LC-MS) se desalaron utilizando columnas C18 Bond Elut tal y como se ha descrito más arriba antes de evaporación a 5 sequedad.

[0210] La Ala(0)-desoxi-actagardina B se eluyó de la columna a un tiempo de retención = 5,04 minutos. Los análisis MS confirmaron una especie de 972,2 m/z (M+2H)+2.

10 Aislamiento de actagardina y Ala(O)-actagardina para estudios MIC

[0211] La actagardina y Ala(0)-actagardina se purificaron utilizando el método descrito para la purificación de la desoxiactagardina B a partir de A. liguriae con la excepción que fue necesario HPLC de preparación para la resolución de Ala(0)actagardina y Actagardina seguido de la etapa de SCX Bond Elut. El eluyente de la columna de

15 SCX Bond Elut se concentró por evaporación rotativa a partir de 70 a 18 ml y el concentrado resultante se purificó mediante HPLC de preparación utilizando las condiciones descritas en la Tabla 4. Las fracciones respectivas que contenían Actagardina y Ala(0)actagardina (tal y como se confirmó por los análisis de HPLC LC-MS) se desalaron utilizando columnas de C18 Bond Elut tal y como se ha descrito más arriba antes de evaporarse a sequedad.

20 Electroforesis de gel de Agarosa

[0212] La electroforesis de DNA se llevó a cabo tal y como se describe en Sambrook y otros, 1989. Los geles de Agarosa (0,7-1%) se prepararon en un tampón TAE conteniendo una concentración final de 0,1 mg/ml de bromuro de etidio para permitir la visualización del DNA por luz UV. Se mezclaron 0,1 volúmenes de 10 x solución de carga

25 de gel agarosa con las mezclas. Las mezclas se cargaron sobre el gel al lado de 100bp, 1 kb, o lambda DNA-HindIII juegos de digestión (NEB) y corrieron a 1-5 V/cm. El gel se visualizó a A = 300 nm y se fotografió utilizando una cámara de video UVP.

Tabla 4: Condiciones de HPLC de preparación para la separación de Actagardina y Ala(0)actagardina.

Recuperación de DNA a partir de geles de agarosa

[0213] El DNA se extirpó de los geles de agarosa y se recuperó utilizando un equipo de extracción de gel Qiaquick 35 (Qiagen) y se eluyó en o bien agua purificada de ósmosis inversa estéril, Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) o tampón TE.

Final-carga

[0214] La carga del 3’ terminal acoplada creada por digestión de DNA con encimas de restricción se hizo utilizando un fragmento Klenow de polimerasa E. coli. En una reacción habitual 1 unidad de la encima se añadió por mg DNA a lo largo de 250 mM de cada dNTP. La reacción se incubó a 25°C durante 15-30 min y se paró añadiendo EDTA a la concentración final de 10 mM.

Fosforilación de DNA

[0215] Los productos PCR se trataron con quinasa de polinucleótidos T4 a 37°C durante 30 min, siguiendo el método descrito por Sambrook y otros, 1989. La encima se inactivó por incubación a 65°C durante 20 min.

Desfosforilación de vectores linealizados

[0216] Para evitar la propia ligadura de los vectores linealizados, los grupos 5’-fosfato se eliminaron utilizando fosfatasa alcalina de camarón (SAP) siguiendo las normas de los fabricantes. En una reacción habitual 1 unidad de SAP se añadió a la mezcla de restricción durante las cuatro últimas horas de la reacción de restricción de DNA. La encima se inactivó incubando a 65°C durante 20 min.

Ligaduras

[0217] Las ligaduras de DNA se llevaron a cabo tal y como describe Sambrook y otros, (1989) utilizando 1 unidad (U) de ligasa DNA T4 en un volumen total de 15 ml e incubando durante 12-16 h a 16°C.

Mantenimiento de cultivos bacterianos

[0218] Se almacenaron células viables como suspensiones de glicerol mediante congelación de 0,5 ml del cultivo respectivo a -80°C con glicerol a una concentración final de 10%. Se obtuvieron colonias individuales de A. garbadinensis y A. liguriae por franjas de 50 ml a partir de un caldo de fermentación o patrón de glicerol sobre o bien el medio 65 o placas ABB13.

Reacción en cadena de la polimerasa

[0219] Las reacciones en cadena de polimerasa (PCRs) se llevaron a cabo en un Stratagene Robocycler Gradient96. En una reacción habitual 100-200 ng de plantilla de DNA se mezcló con 20 pmol de cada iniciador oligonucleótido y dNTP’s a 250 mM cada uno. El tampón de polimerasa DNA termofílico tal y como se ha suministrado por el fabricante y DMSO preparado hasta 10% (v/v) cada uno de volumen final de 50 ó 100 ml de la mezcla de reacción. Una reacción habitual empezó con un ciclo inicial de 1 min de desnaturalización (94°C), 1 min, Y°C (recocido) y 30 segundos - 3 min de ampliación (72°C), en cuyo punto se añadieron 5 unidades de polimerasa de DNA termofílica. Esto fue seguido de 30 ciclos de 94°C durante 1 min, Y°C (recocido) durante 1 min y 72°C durante Xmin y un ciclo final de 72°C durante 2X min. El tiempo de ampliación X, fue de 1 min por kb de producto cuando se utilizó la polimerasa Taq y 2 min por kb de producto cuando se utilizó la polimerasa Pfu. La temperatura de recocido Y fue de 55°C y de 49°C en la generación de pAGvar1 y pAGvar2, respectivamente. Las condiciones utilizadas para la generación de SBdel-1 y SBdel-2 fueron tal y como se describen en el protocolo Redirect (Gust y otros, 2004).

Iniciadores

[0220]

Preparación del plásmido DNA

[0221] El plásmido DNA se preparó a escala pequeña (inferior a 20 mg en la preparación) inoculando 3 ml de 2TY estéril

o LB conteniendo el antibiótico apropiado con colonias individuales escogidas de las placas 2TY (o LA). Los cultivos se incubaron durante toda la noche (12-16 h) a 37°C y 250 rpm. Las células se recogieron por centrifugación a 12,000 xg durante 1 min y el plásmido DNA obtenido utilizando equipos minipreparados de Wizard (Promega) de acuerdo con las normas de los fabricantes. En el caso de preparaciones mayores de hasta 100 mg de plásmido DNA, se hicieron crecer 30 ml de cultivos 2TY y el plásmido DNA se extrajo utilizando un equipo minipreparado Qiagen, siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Todas las preparaciones de plásmidos se comprobaron por combinación de análisis de restricción y/o análisis de secuencia.

Preparación de cósmido DNA

[0222] El cósmido DNA se preparó inoculando 50 ml de 2TY o LB estéril conteniendo el antibiótico apropiado con colonias individuales escogidas de las placas agar 2TY (o LA). Los cultivos se incubaron durante toda la noche (1216 h) a 37°C y 250 rpm. Las células se recogieron por centrifugación a 4,000rpm (Heraeus sepatech Megafuge 2.0R) durante 20 min y el cósmido DNA se aisló utilizando un equipo minipreparado Qiagen de acuerdo con las normas de los fabricantes.

Preparación y transformación de células electrocompetentes de E. Coli.

[0223] Los electrocompetentes E. coli DH10B se prepararon por el método de Dower y otros (1988). Partes alícuotas (60 ml) de células competentes se deshelaron en hielo y se añadió 1,8 ml de la mezcla de ligadura o plásmido DNA. La mezcla se colocó en una cubeta de electroporación (Sigma 0,1 cm) y se transfirió a un electroporador (Stratagene electroporator-1000). Se aplicó una diferencia de potencial de 1,8 kV/mm (25 mF, 200 0) y subsiguientemente se añadió 0,5 ml de medio 2TY o LB. A continuación, las células se incubaron a 37°C durante 45-60 min para permitir la expresión de los genes resistentes al antibiótico, antes de la preparación de cultivos en placa en el medio selectivo apropiado.

Preparación del DNA genómico

[0224] Se prepararon plantillas de DNA genómico utilizando el procedimiento descrito por Kieser y otros (2000).

Procedimiento de conjugación para Actinoplanes sp.

[0225] La conjugación intergenérica entre E. coli y Actinoplanes sp. se llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito por Heinzelmann y otros (2003), excepto que se utilizó la cepa E. coli ET12567/pUB8002 (Kieser y otros, 2000) en lugar de la cepa E. coli ET12567/pUB307 (Flett y otros, 1997). Los exconjugados se transfirieron y conectaron en un área de aproximadamente 1 cm2 sobre el medio 65 o ABB13 conteniendo 50 mg/ml de ácido nalidíxico y el antibiótico selectivo pertinente. Estas placas se incubaron a 30°C durante 4-7 días antes de utilizarse como inóculo para cultivos de caldo.

Procedimiento de conjugación para Streptomyces sp.

[0226] La conjugación intergenérica entre E. coli y Streptomyces sp. se llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito por Kieser y otros, 2000. Los exconjugados se transfirieron y conectaron en un área de aproximadamente 1 cm2 sobre SFM conteniendo 50 mg/ml de ácido alidíxico y el antibiótico selectivo pertinente. Estas placas se incubaron a 30°C durante 4-7 días antes de utilizarse como inóculo para cultivos de caldo.

Tabla 5- Cepas bacterianas

Antibióticos

15 [0227] Las soluciones patrón de antibióticos se prepararon en agua (a menos que se diga otra cosa) y se esterilizaron por filtro pasando a través de un filtro 0,22 mmMillipore. Las soluciones disueltas en etanol no se esterilizaron (Sambrook y otros, 1989). Todos los antibióticos se almacenaron a -20°C. En el medio donde se utilizó apramicina, se añadió MgCl2 hasta una concentración final de 10 mM (a partir de un patrón de 2,5 M).

[0228]

Vectores

[0229]

Cromatografía líquida de alta resolución

[0230] Loa análisis HPLC se realizaron utilizando un Hewlett Packard 1050 con sistema HPLC con los parámetros que se describen a continuación:

10 Espectroscopia de masas-cromatografía líquida de alta resolución (HPLC-MS)

[0231] Los análisis de HPLC-MS se llevaron a cabo en un Hewlett Packard 1050 con sistema HPLC unido a una Micromass Platform LC (operada con MassLynx versión 3.5 software) con los siguientes parámetros:

5 Depósito

[0232] NCIMB 41362 se depositó bajo el Tratado de Budapest el 7 de Diciembre de 2005 en NCIMB Ltd, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland, UK, por Novacta Biosystems Limited.

Listado de secuencias

[0233]

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Compuesto de fórmula:

   donde: -X1-X2- representan -Leu-Val-; -Y- es -S-; Z es o bien un aminoácido o -NH2 donde el último representa la N-terminal de Ala en la posición 1; R representa -OH o-NR1R2, donde R1 y R2 independientemente representa:

   (i)

   hidrógeno;

   (ii)

   un grupo de fórmula -(CH2)n-NR3R4, en la que n representa un entero de 2 a 8 y R3 y R4 independientemente representan hidrógeno o alquilo C1-4, o R3 y R4 conjuntamente representan un grupo -(CH2)3-, -(CH2)4-, (CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)2-S-(CH2)2 o -(CH2)5-; o R1 y R2 conjuntamente con el átomo de nitrógeno adyacente representan una mitad de piperazina que puede estar substituida en la posición 4 con un substituyente seleccionado a partir de:

   (a)

   alquilo C1-4;

   (b)

   cicloalquilo C5-7;

   (c)

   piridil,

   (d)

   -(CH2)p-NR5R6 en el que p representa un entero de 1 a 8 y R5 y R6 independientemente representan hidrógeno o alquilo C1-4;

   (e)

   piperidinil;

   (f)

   piperidinil substituido, donde el piperindinil substituido lleva un substituyente N que es alquilo C1-4;

   (g)

   bencil; y

   (h)

   bencil substituido, donde el grupo fenil lleva 1 ó 2 substituyentes seleccionados entre cloro, bromo, nitro, alquilo C1-4 y alcoxi C1-4 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. 2.

   Compuesto según la reivindicación 1, donde Z es un aminoácido.

3. 3.

   Compuesto según la reivindicación 2, donde el aminoácido es Ala.

4. 4.

   Compuesto según la reivindicación 1, donde Z es -NH2.

5. 5.

   Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde R es OH.

6. 6.

   Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde R1 y R2 independientemente representan:

   (i)

   hidrógeno;

   (ii)

   un grupo de fórmula -(CH2)n-NR3R4, en el que n representa un entero de 2 a 8 y R3 y R4 independientemente representan hidrógeno o alquilo C1-4.

7. 7.

   Compuesto según la reivindicación 1, donde el compuesto se selecciona entre el grupo que consiste en: desoxiactagardina B N-[3-dimetilaminopropil]monocarboxamida; desoxiactagardina B N-[1-(1-metil-4-piperidinil)piperazina]monocarboxamida; desoxiactagardina B [1-(3-dimetilaminopropil)piperazina]monocarboxamida; desoxiactagardina B; D-Ala(0)desoxiactagardina B; L-Ile(0)desoxiactagardina B; L-Val(0)desoxiactagardina B; L-Phe(0)desoxiactagardina B; L-Lys(0)desoxiactagardina B; y L-Trp(0)desoxiactagardina B.

8. 8.

   Composición farmacéutica que comprende un compuesto tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 conjuntamente con un portador farmacéuticamente aceptable.

9. 9.

   Composición farmacéutica según la reivindicación 8, para la administración oral.

10. 10.

    Compuesto según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para utilizar en un método de tratamiento.

11. 11. Compuesto según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para utilizar en un método de 10 tratamiento de una infección bacteriana.
12. 12. Utilización de un compuesto tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la preparación de un medicamento para la utilización en el tratamiento de una infección bacteriana.

    15 13. Procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula:

    donde: -X1-X2- representa -Leu-Val-;

    20 -Y- es -S-; Z es Ala o -NH2 donde el último representa la N-terminal de Ala en la posición 1, comprendiendo el método la expresión de un ácido nucleico que codifica para una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 11, y opcionalmente cuando sea necesario, genes clúster asociados requeridos para la conversión del polipéptido precursor al producto.

13. 14.

    Procedimiento según la reivindicación 13, donde el ácido nucleico se expresa en A. liguriae.

14. 15.

    Procedimiento según la reivindicación 14, donde la A. liguriae se deposita bajo el Tratado de Budapest con el número de depósito: NCIMB41362.