KR101573536B1 - 악티노플레인스 가르바디넨시스 및 악티노플레인스리구리애로부터의 란티바이오틱 생합성 유전자 클러스터 - Google Patents

악티노플레인스 가르바디넨시스 및 악티노플레인스리구리애로부터의 란티바이오틱 생합성 유전자 클러스터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 란티바이오틱 액타가르딘에 대한 생합성 유전자 클러스터의 특성 규명, 액타가르딘의 신규한 변이체 및 그의 생합성 클러스터의 동정과, 특성 규명된 생합성 유전자 클러스터로부터의 유전자를 이용하여, 액타가르딘, 본원에서 액타가르딘 B로도 지칭되는 신규한 액타가르딘 변이체, 및 본 발명에 따라 제조된 이들 둘 모두의 변이체를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

악티노플레인스 가르바디넨시스 및 악티노플레인스 리구리애로부터의 란티바이오틱 생합성 유전자 클러스터{LANTIBIOTIC BIOSYNTHETIC GENE CLUSTERS FROM A. GARBADINENSIS AND A. LIGURIAE}
본 발명은 란티바이오틱 액타가르딘에 대한 생합성 유전자 클러스터의 특성 규명, 액타가르딘의 신규한 변이체 및 그의 생합성 클러스터의 동정과, 특성 규명된 생합성 유전자 클러스터로부터의 유전자를 이용하여, 액타가르딘, 악티노플레네스 리구리애(A. liguriae) 균주에서 제조된 신규한 액타가르딘 변이체, 및 본 발명에 따라 생산된 이들 둘 모두의 변이체를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.
란티바이오틱(lantibiotic)은 그램 양성 박테리아에 의해 생산되며, 항생제 활성 및 기타 활성을 갖는 펩티드이다. 다른 변형된 잔기들 중에서 티오에테르 아미노산 란티오닌 및 메틸란티오닌을 함유하는데, 이는 폴리사이클릭 구조로 펩티드 쇄를 가교-결합시킨다. 다음과 같이 분류하는 것이 전혀 문제가 없는 것은 아니지만, 란티바이오틱은 2 부류, A형 및 B형으로 분류된다. A형 란티바이오틱은 일반적으로 박테리아 및 다른 원형질막에 구멍을 형성할 수 있는 긴 양친매체이다. 대조적으로 B형 란티바이오틱은 효소 기능을 저해하며, 입체 형태적으로 한정된 구형의 펩티드이다. 예로는 신나마이신 및 듀라마이신이 있다.
예로서, 신나마이신과 같은 B형 란티바이오틱에 관한 활성으로는 항미생물 활성(항생제로서 효능이 있는 적용성을 제공한다), 안지오텐신 전환 효소 저해(혈압 조절에서 효능이 있는 적용성을 제공한다), 포스포리파제 A2의 저해를 통한 면역조절(소염제로서의 효능이 있는 적용성을 제공한다), 및 프로스타글란딘 및 류코트리엔 생합성 간섭을 포함한다.
B형 란티바이오틱은 각각의 기질을 차단함으로써 효소 활성을 간섭하여 그의 활성을 발휘하는 것으로 보인다. 예를 들면, B형 란티바이오틱, 예로서, 머사시딘 및 액타가르딘이 펩티도글리칸의 생합성을 저해하는 것으로 밝혀졌고; 글리코실 전이반응이 표적 반응으로서 동정되었다. 이들 반응에 대한 기질은 지질-결합 세포벽 전구체 지질 II이다. 이는 란티바이오틱 반코마이신에 대한 표적이 되는 반면, 작용 부위는 상이하고, 임의의 현 항균제에 의해 사용되지 않는 신규한 표적 결합 부위이다.
신나마이신 부류의 B형 란티바이오틱의 경우, 항균제 활성이 특히, 바실러스(Bacillus) 균주에서 관찰되었는데, 막 기능, ATP 의존성 양성자 전이 및 Ca2+-흡수, 및 ATP아제에 미치는 효과가 기재되었다. 또한, 포스파티딜에탄올아민-함유 평면막내 한정된 구멍 형성이 보고되었다. 이러한 효과는 이들 B형 란티바이오틱이 포스파티딜에탄올아민에 특이적으로 결합하기 때문일 수 있다.
란티바이오틱은 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 및 문제가 되는 병원균, 예컨대, 보편적으로 사용되고 있는 다수의 항생제에 대하여 내성을 갖고 있거나, 내성을 발생시키고 있는, 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA: methicillin-resistant Staphylococcus aureus), 및 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)에 대한 항균제 및 식품 첨가제로서의 효능과 유용성을 갖는 것으로 나타났다. 리뷰를 위해, 문헌 ([Sahl and Bierbaum (1998) Annual Rev. Microbiol. 52:41-79]; [Jack and Sahl (1995) TIBTECH 13:269 278]; [Gasson (1995) Chapter 10, Lantibiotics, in Vining and Stuttard (eds) Biotechnology Series: Genetics and Biochemistry of Antibiotic Production, Biotechnological I 30 Series 28, pages 283-306])을 참조할 수 있다.
항생제 분야에 있어서, 내성, 생체적합성, 독성 등과 같은 문제를 극복하기 위해 새로운 항생제 화합물 공급에 대해서 계속적으로 요구되고 있다. 따라서, 란티바이오틱을 생산하는 방법, 및 란티바이오틱의 변이체 형태(이는 천연 형태와 상이한 활성 프로파일을 가질 수 있다)의 생산이 바람직할 수 있다.
액타가르딘은 공지된 B형 란티바이오틱이며, 테트라사이클릭이고, 길이는 19개(1890 Da)의 아미노산이다. 이는 시험관내 모델 및 생체내 모델, 둘 모두에서 스타필로코커스 아우레우스 및 스트렙토코커스(Streptococcus) 발열원과 같이 중요한 그램 양성 병원체에 대하여 강력한 활성을 갖는다. 액타가르딘의 구조는 도 4에 제시되어 있다. 본 화합물은 프리-프로-펩티드로부터 생산되며, 그의 C-말단부는 SSGWVCTLTIECGTVICAC(서열 번호 4)의 폴리펩티드 서열을 갖는다. 서열 번호 4의 폴리펩티드는 하기 가교결합: 가교결합 1-6, 란티오닌(Ser-Cys); 가교결합 7-12, 베타-메틸란티오닌(Thr-Cys); 가교결합 9-17, 베타-메틸란티오닌(Thr-Cys); 가교결합 14-19, 베타-메틸란티오닌 설폭시드(Thr-Cys)에 의해 2차 및 3차 구조를 형성함으로써 변형된다.
액타가르딘은 2개의 악티노플레인스(Actinoplanes) 종; 악티노플레인스 가르바디넨시스(A. garbadinensis) 및 악티노플레인스 리구리애(A. liguriae)에 의해 생산된다고 보고되었다. 가교결합 14-19는 산화되어 있고, 즉, 메틸란티오닌 설폭시드가 아닌, 베타-메틸란티오닌인, 본원에서는 데옥시-액타가르딘으로 명명되는 유도체도 함께 생산된다.
US 6,022,851에는 악티노플레인스 가르바디넨시스 및 악티노플레인스 리구리애의 단리된 균주로부터 액타가르딘을 단리하는 것이 기재되어 있다.
[발명의 개시]
본 발명은 악티노플레인스 가르바디넨시스 및 악티노플레인스 리구리애로부터의 B형 란티바이오틱, 액타가르딘에 대한 생합성 유전자 클러스터와 관련하여 클로닝되고, 서열 분석되고, 해명된 구조 및 조절 상의 정보에 관한 것이다.
본 발명자는 또한 놀랍게도, 본원에서 악티노플레인스 리구리애 NCIMB 41362로 명시된 악티노플레인스 리구리애 단리물에서, 본 발명자가 액타가르딘 B로 명명하는, 신규한 형태의 액타가르딘, 또는 비산화된 형태로 데옥시-액타가르딘 B가 생산된다는 것을 발견하게 되었다. 이러한 형태는 액타가르딘과 유사한 항미생물 활성을 갖고, 서열 번호 1의 1차 폴리펩티드 서열로부터 생성되며, 이는 액타가르딘과 유사한 가교-결합을 이룬다. 변이체는 액타가르딘에 대하여 신규하고 유용한 대안을 제공한다. 추가로, 액타가르딘과 상이한 액타가르딘 B중의 잔기를 동정함으로써 이들 차이에 기초한 추가의 란티바이오틱을 제공하게 된다.
본 발명자는 또한 액타가르딘 및 액타가르딘 B 생산에 관한 유전자를 포함하는 액타가르딘 생산 악티노플레인스 가르바디넨시스 및 악티노플레인스 리구리애 NCIMB 41362, 둘 모두로부터 유전자 클러스터를 단리하였다.
하나의 측면에서, 본 발명은 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 1차 폴리펩티드 서열에 기초한 변이체 뿐만 아니라, 그의 변이체를 비롯한, 신규한 액타가르딘 B 및 그의 변이체를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 액타가르딘 B 및 그의 변이체를 코딩하는 핵산, 핵산 및 상기-언급한 유전자 클러스터로부터 유래된 그의 변이체 세트, 액타가르딘 B 및 그의 변이체 제조 방법, 및 액타가르딘 B의 신규한 변이체를 생산하는 방법을 제공한다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은 악티노플레인스 가르바디넨시스로부터 단리된 액타가르딘 코딩 및 조절 유전자 클러스터 지도를 제공한다.
도 2는 본원에서 액타가르딘 B로 언급되는, 액타가르딘 B의 신규한 변이체를 코딩하는, 악티노플레인스 리구리애로부터 단리된, 코딩 및 조절 유전자 클러스터 지도를 제공한다.
도 3은 악티노플레인스 가르바디넨시스 또는 악티노플레인스 리구리애로부터 단리된 핵산 서열을 사용하여 액타가르딘 변이체를 생성하기 위한, 본원에서 개시된 방법을 제시하는 개략도이다.
도 4는 성숙한 액타가르딘의 1차 구조에 대한 대표도이다(여기서, X1-X2는 Val-Ile를 나타내고, Y는 -S(O)-이고, Z는 NH2이다). "데옥시-액타가르딘 B"는 AbuS14와 AlaS19 사이에 비산화된 메틸란티오닌 브릿지를 갖는 Val15Leu Ile16Val 변이체이다.
서열 설명
독자의 편의를 위해, 본 출원의 서열에 하기와 같이 비연속적으로 번호를 매겼다:
서열 번호 1은 액타가르딘 B의 1차 폴리펩티드 서열이다: SSGWVCTLTIECGTLVCAC.
서열 번호 2는 액타가르딘 B 변이체 VV의 1차 폴리펩티드 서열이다: SSGWVCTLTIECGTVVCAC.
서열 번호 3은 액타가르딘 B 변이체 LI의 1차 폴리펩티드 서열이다: SSGWVCTLTIECGTLICAC.
서열 번호 4는 액타가르딘의 1차 폴리펩티드 서열이다: SSGWVCTLTIECGTVICAC;
서열 번호 11은 Ala-액타가르딘 B의 1차 폴리펩티드 서열이다: ASSGWVCTLTIECGTLVCAC.
서열 번호 12는 Ala-액타가르딘 B 변이체 VV의 1차 폴리펩티드 서열이다: ASSGWVCTLTIECGTVVCAC.
서열 번호 13은 Ala-액타가르딘 B 변이체 LI의 1차 폴리펩티드 서열이다: ASSGWVCTLTIECGTLICAC.
서열 번호 14는 Ala-액타가르딘의 1차 폴리펩티드 서열이다: ASSGWVCTLTIECGTVICAC.
서열 번호 212는 프리-프로-액타가르딘 B의 1차 폴리펩티드 서열이다: MSAITVETTWKNTDLREDLTAHPAGLGFGELSFEDLREDRTIYAASSGWVCTLTIECGTLVCAC.
서열 번호 22는 프리-프로-액타가르딘 B 변이체 VV의 1차 폴리펩티드 서열이다: MSAITVETTWKNTDLREDLTAHPAGLGFGELSFEDLREDRTIYAASSGWVCTLTIECGTVVCAC.
서열 번호 223은 프리-프로-액타가르딘 B 변이체 LI의 1차 폴리펩티드 서열이다: MSALAIEKSWKDVDLRDGATSHPAGLGFGELTFEDLREDRTIYAASSGWVCTLTIECGTLICAC.
서열 번호 119는 프리-프로-액타가르딘의 1차 폴리펩티드 서열이다: MSALAIEKSWKDVDLRDGATSHPAGLGFGELTFEDLREDRTIYAASSGWVCTLTIECGTVICAC.
서열 번호 100은 벡터가 아닌, 코스미드 CosAG14의 악티노플레인스 가르바디넨시스-유래 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 101-132는 각각 서열 번호 100의 오픈 리딩 프레임 orf1 - orf32의 폴리펩티드 서열이다.
서열 번호 200은 벡터가 아닌, 코스미드 CosAL02의 악티노플레인스 리구리애-유래 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 201-231은 각각 서열 번호 200의 오픈 리딩 프레임 orf1 - orf31의 폴리펩티드 서열이다.
서열 번호 300-312는 본원 하기에 기술하는 프라이머 서열이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 서열 번호 100 및 서열 번호 200의 유전자 클러스터, 및 이들 클러스터에 의해 코딩되는 폴리펩티드 및 그의 변이체에 관한 것이다. 서열 번호 119의 폴리펩티드는 프리-프로-액타가르딘이고, 서열 번호 212의 폴리펩티드는 프리-프로-액타가르딘 B이다. 나머지 폴리펩티드 및 그의 변이체(본원에서 정의되는 바와 같은 것)는 본원에서 총칭적으로 "클러스터 폴리펩티드"로 지칭된다. 서열 번호 100으로부터 유래된 클러스터 폴리펩티드는 "1xx 폴리펩티드"로서 지칭되며, 서열 번호 200으로부터 유래된 것은 "2xx 폴리펩티드"로서 지칭된다. 서열 및 길이, 둘 모두에서 클러스터 폴리펩티드와 100% 동일한 폴리펩티드를 "야생형" 폴리펩티드로 지칭한다. 서열 번호 100 또는 서열 번호 200으로부터 유래된 클러스터 폴리펩티드는 야생형 또는 변이체일 수 있다.
폴리펩티드는 실질적으로 단리된 형태일 수 있다. 본 발명의 단리된 폴리펩티드는, 천연적으로 그와 결합하는 있는 물질, 예로서, 세포 내에서 그와 함께 발견되는 다른 폴리펩티드가 존재하지 않거나 실질적으로 존재하지 않는, 상기 정의된 바와 같이 단리된 형태의 것일 것이다. 물론, 예를 들면, 폴리펩티드는 희석제 또는 애부번트와 함께 제제화될 수 있고, 여전히 실제 목적을 위해 단리될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 실질적으로 정제된 형태일 수 있으며, 이 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 일반적으로 시료내 90% 초과, 예컨대, 95%, 98% 또는 99% 초과의 폴리펩티드가 본 발명의 폴리펩티드인 것인, 시료내 폴리펩티드를 포함한다.
란티바이오틱 폴리펩티드 및 란티바이오틱A 유전자
본 발명에서, 란티바이오틱A 또는 LanA 폴리펩티드, 란티바이오틱A 또는 LanA 유전자에 대한 언급은 총칭적으로 B형 란티바이오틱 폴리펩티드 또는 상기 펩티드를 코딩하는 유전자를 지칭하는 것이다. 따라서, 그에 관한 언급은 신나마이신, 머사시딘, 액타가르딘 및 액타가르딘 B 및 이들 산물을 코딩하는 유전자에 관한 언급을 포함한다. 란티바이오틱를 생산하는 숙주 세포에 관한 것은 그의 천연 형태로 LanA 폴리펩티드를 생산하는 임의의 숙주 세포를 지칭하는 것이며, 이는 본원 하기에서 추가로 정의된다.
LanA 폴리펩티드는 항미생물 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 항미생물 활성은 기준 유기체, 예컨대, 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에 대한 MIC 값을 측정함으로써 검사될 수 있다. LanA 폴리펩티드의 MIC가 동일한 기준 미생물 균주에 대하여 16배 초과로 액타가르딘의 것보다 더 작거나 그와 동일할 경우, LanA 폴리펩티드는 항미생물 활성을 나타내는 것으로 간주된다. 본 발명에서, 악티노플레인스 가르바디넨시스 LanA 유전자는 actA로 지칭되고, 악티노플레인스 리구리애 LanA 유전자는 LigA로 지칭된다.
기타 Lan 폴리펩티드
본원에서 사용되는 바, "LanM" 폴리펩티드에 관한 언급은, 전구체 폴리펩티드를 란티바이오틱 화합물로 전환시키는데 필요한 변형 인자로서, 란티바이오틱 유전자 클러스터로부터 유래된 폴리펩티드에 관한 것이다. LanM 폴리펩티드는 서열 번호 120의 것(ActM) 또는 그의 변이체, 서열 번호 213의 것(LigM) 또는 그의 변이체, WO02/088367에서 정의된 것과 같은 cinM 폴리펩티드, 문헌 [Altena et al, 2000]에 개시된 mrsM 폴리펩티드, 또는 B형 란티바이오틱을 생산하는 박테리아의 또다른 유전자 클러스터로부터의 상동성 폴리펩티드를 포함한다.
"LanR" 폴리펩티드에 관한 언급은, 전구체 폴리펩티드의 생산 조절에 필요한 조절 인자로서, 란티바이오틱 유전자 클러스터로부터 유래된 폴리펩티드에 관한 것이다. LanR 폴리펩티드는 서열 번호 122의 것(ActR) 또는 그의 변이체, 서열 번호 216의 것(LigR) 또는 그의 변이체, WO02/088367에서 정의된 것과 같은 cinR1 폴리펩티드, 문헌 [Altena et al, 2000]에 개시된 mrsR1 폴리펩티드, 또는 B형 란티바이오틱을 생산하는 박테리아의 또다른 유전자 클러스터로부터의 상동성 폴리펩티드를 포함한다.
"LanT" 폴리펩티드에 관한 언급은, 전구체 폴리펩티드를 란티바이오틱 화합물로 생산하는데 필요한 수송 인자로서, 란티바이오틱 유전자 클러스터로부터 유래된 폴리펩티드에 관한 것이다. LanT 폴리펩티드는 서열 번호 123의 것(ActT) 또는 그의 변이체, 서열 번호 214의 것(LigT) 또는 그의 변이체, WO02/088367에서 정의된 것과 같은 cinT 폴리펩티드, 문헌 [Altena et al, 2000]에 개시된 mrsT 폴리펩티드, 또는 B형 란티바이오틱을 생산하는 박테리아의 또다른 유전자 클러스터로부터의 상동성 폴리펩티드를 포함한다.
"LanO" 폴리펩티드에 관한 언급은, 본 발명의 데옥시 형태의 액타가르딘 및 화합물을 본 발명의 액타가르딘 또는 화합물(여기서, Y는 -S(O)-이다)로 산화시키는데 관여하는 것으로 여겨지는 인자로서, 란티바이오틱 유전자 클러스터로부터 유래된 폴리펩티드에 관한 것이다. LanO 폴리펩티드는 서열 번호 122의 것(ActO) 또는 그의 변이체, 서열 번호 215의 것(LigO) 또는 그의 변이체, 또는 B형 란티바이오틱을 생산하는 박테리아의 또다른 유전자 클러스터로부터의 상동성 폴리펩티드를 포함한다.
클러스터 폴리펩티드
하나의 측면에서, 본 발명은 서열 번호 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230 및 231중 어느 하나로부터 선택된 단리된 클러스터 폴리펩티드를 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 상기-언급된 서열 중 어느 것의 변이체인 클러스터 폴리펩티드를 제공한다.
특히 관심의 대상이 되는 클러스터 폴리펩티드는 LanM, LanR, LanT 또는 LanO 폴리펩티드인, 1xx 및 2xx 폴리펩티드이다.
클러스터 폴리펩티드와 관련하여 "변이체"는 기준 폴리펩티드(이러한 경우, 임의의 야생형 클러스터 폴리펩티드), 또는 폴리펩티드의 단편의 아미노산 서열과 상이하지만, 상기 아미노산 서열과 유의적인 아미노산 서열 동일성을 나타내는 아미노산을 갖는 임의의 폴리펩티드를 의미한다.
구체적으로 언급하지 않는 한, 유의적인 아미노산 서열 동일성은 바람직하게 80% 이상, 더욱 바람직하게 85%, 90% 또는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게 98% 또는 99% 이상이다. 변이체의 길이는 바람직하게 야생형 클러스터 폴리펩티드 길이와 동일하거나, 그의 70% 이상이고, 바람직하게, 80% 이상, 더욱 바람직하게, 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 95% 이상이다.
"아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"란 서열을 정렬시키고, 필요한 경우, 서열 동일성 퍼센트의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 보존적 치환을 서열 동일의 일부로서 간주하지 않은 상태에서, 비교시 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 본원에서 사용된 동일성(%) 값은 문헌 [Altschul et al. (1996)]; hppt://balst.wust/edu/blast/README.html의 WU-BLAST-2에 의해 얻었다. WU-BLAST-2는 여러 파라미터를 사용하는데, 이들 중 대부분은 디폴트 값으로 정해져 있다. 조정가능한 파라미터는 하기와 같다: 오버랩 스팬 = 1. 오버랩 분율 = 0.125, 단어 역치수(T) = 11. HSPS 및 HSP S2 파라미터는 역동적인 값으로서 검색되는 서열에 대한 특정 데이타 베이스의 서열 및 조성의 조합에 달려있다. 그러나, 이 값들은 민감도가 증가되도록 조정될 수 있다. 아미노산 서열 동일성 퍼세튼는 일치하는 잔기 수를 정렬된 영역에서 "보다 긴" 서열의 전체 잔기 수로 나눔으로써 결정된다. "보다 긴" 서열은 정렬된 영역(정렬을 최대화하기 위하여 WU-BLAST-2에 의해 도입된 갭은 무시됨)에서 대부분의 실제 잔기를 갖는 것을 말한다.
바람직하게, 변이체는 기준 폴리펩티드의 생물학적 기능을 보유할 것이다. 본 발명에서, 변이체가 그의 클러스터의 다른 구성원들과 함께 숙주 세포내 존재할 때, 변이체가 란티바이오틱을 생산할 수 있는 생물학적 기능은 유지된다. 이는 예를 들면, 1xx 클러스터 폴리펩티드 변이체인 경우에는 서열 번호 100, 및 2xx 클러스터 폴리펩티드 변이체인 경우에는 서열 번호 200을 함유하는 숙주 세포를 제공하는데, 여기서, 숙주 세포는 각각 액타가르딘 또는 액타가르딘 B를 생산하는 것이며, 서열을 변형시켜 변이체를 코딩하도록 하고, 란티바이오틱 폴리펩티드가 여전히 생산되는지 여부를 측정함으로써 측정될 수 있다.
전구체 폴리펩티드
또다른 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드를, 바람직하게는, 단리된 형태의 폴리펩티드를 제공하는데, 이는 본 발명의 화합물 또는 액타가르딘의 전구체이다. 전구체 폴리펩티드는 서열 번호 1-4, 서열 번호 11-14, 서열 번호 212, 22, 23 및 119 중 어느 하나의 폴리펩티드 뿐만 아니라, 란티바이오틱 폴리펩티드로 전환될 수 있는 그의 변이체 또는 유도체를 포함한다.
서열 번호 1-4 중 어느 하나의 전구체 폴리펩티드의 변이체는 하나 이상, 예를 들면, 1 내지 5개, 예로서, 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산이 또다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다. 바람직하게, 아미노산은 서열 번호 1-4 중 어느 하나의 2, 3, 4, 5, 8, 10, 11, 13 또는 18번 위치로부터 선택되는 위치에 존재한다.
서열 번호 11-14 중 어느 하나의 전구체 폴리펩티드의 변이체는 하나 이상, 예를 들면, 1 내지 5개, 예로서, 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산이 또다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다. 바람직하게, 아미노산은 서열 번호 11-14 중 어느 하나의 3, 4, 5, 6, 9, 11, 12, 14 또는 19번 위치로부터 선택되는 위치에 존재한다.
서열 번호 212, 22, 23 및 119 중 어느 하나의 전구체 폴리펩티드의 변이체는, 각각 서열 번호 1-4에 상응하는 C-말단부(잔기 46-64)의 1 내지 5개, 예로서, 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산이 또다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다. 바람직하게, 아미노산은 서열 번호 1-4 중 어느 하나의 2, 3, 4, 5, 8, 10, 11, 13 또는 18번 위치에 상응하는 위치로부터 선택된 위치에 존재한다. 그러한 변이체는 추가로 N-말단부(잔기 1-45)의 70% 이상, 예를 들면, 80% 이상, 바람직하게, 90% 이상, 예를 들면, 95% 이상을 보유하는 N-말단부에 변화를 포함한다. 예를 들면, 서열 번호 212 또는 서열 번호 119의 N-말단부의 변이체는, 본 발명의 데이타에서 서열 번호 212와 119 사이에 차이가 존재한다고 나타난, 4, 5, 6, 8, 9, 12, 13, 17, 18, 19, 21 및 32번 위치에 하나 이상의 치환, 예컨대, 1 내지 12개, 예로서, 1 내지 5개, 예컨대, 1, 2 또는 3개의 치환을 포함한다.
치환은 하나의 아미노산이 천연적으로 발생된 또다른 아미노산에 의해 이루어지는 것일 수 있고, 이는 보존적 또는 비-보존적 치환일 수 있다. 보존적 치환은 하기 표에 제시된 것을 포함하는데, 여기서, 두번째 칸의 같은 블록내 있는 아미노산, 바람직하게는, 세번째 칸의 같은 줄에 있는 아미노산은 서로서로 치환될 수 있다:
지방족




 비극성
 G A
I L V
극성 - 전하를 띠지 않음
 C S T M
N Q
극성 - 전하를 띰
 D E
K R
방향족 H F W Y
서열 번호 212의 경우, 치환은 서열 번호 119의 상응하는 위치에 위치하는 아미노산 잔기와 상이한 아미노산의 것일 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다. 어느 경우든, 치환은 서열 번호 119 아미노산을 서열 번호 212로, 또는 그 반대로 도입하고자 하는 것일 수 있다(예컨대, 서열 번호 212의 4번 위치의 Ile가 Leu로 치환될 수 있는 것 등).
전구체 폴리펩티드는 란티바이오틱을 생산하지 못하는 비생산자인 세포에서 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 발현시킴으로써 수득할 수 있다.
화합물
하나의 측면에서, 본 발명은 하기 화학식(I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
Figure 112008052958573-pct00001
상기 식에서,
-X1-X2-는 -Leu-Val-; -Val-Val- 또는 -Leu-Ile-을 나타내고;
Y는 -S- 또는 -S(O)-이고;
Z는 H2N- 또는 Ala-이다. 추가의 측면에서, 본 발명은 이들 화합물의 변이체 및 생물학적으로 활성인 유도체를 제공한다.
-X1-X2-가 -Leu-Val-을 나타내고, Y는 -S(O)-이고, Z는 NH2인, 본 발명의 화합물은 또한 액타가르딘 B로 지칭된다.
-X1-X2-가 -Leu-Val-을 나타내고, Y는 -S(O)-이고, Z는 Ala-인, 본 발명의 화합물은 또한 ala-액타가르딘 B로 지칭된다.
-X1-X2-가 -Leu-Val-을 나타내고, Y는 -S-이고, Z는 NH2인, 본 발명의 화합물은 또한 데옥시-액타가르딘 B로 지칭된다.
-X1-X2-가 -Leu-Val-을 나타내고, Y는 -S-이고, Z는 Ala-인, 본 발명의 화합물은 또한 ala-데옥시-액타가르딘 B로 지칭된다.
Z가 NH2인 것과 관련하여 이 부위는 상기 화합물의 1번 위치의 알라닌 잔기의 N-말단을 나타낸다는 것을 이해할 것이다. Z가 Ala-인 것과 관련하여 이 부위는 당업계에서 통상 Ala(0)으로 지칭되는 것으로서, 아미드 결합을 통해 1번 위치의 알라닌에 연결된 알라닌을 나타낸다는 것을 이해할 것이다.
변이체
화학식(I)의 화합물의 변이체는 여러 개의, 예를 들면, 1 내지 5개, 예로서, 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산중 하나가 또다른 아미노산에 의해 치환된 화합물이다. 바람직하게, 아미노산은 화학식(I)의 화합물의 2, 3, 4, 5, 8, 10, 11, 13 또는 18번 위치로부터 선택되는 위치에 존재한다.
변이체는 또한 15번 또는 16번 위치에 치환을 포함할 수 있는데, 단, 15번 및 16번 위치, 둘 모두가 치환되고, 그 외의 다른 어떤 위치에서는 변화가 없을 때, 15 및 16은 각각 Val 및 Ile이 아니다.
Z가 Ala-일 경우, 본 발명의 화합물의 변이체는 Ala-가 또다른 아미노산 (특히, 유전자 코드에 의해 코딩된 천연적으로 발생된 아미노산 또는 그의 D-이소폼), 더욱 특히, Ile-, Lys-, Phe-, Val-, Glu-, Asp-, His-, Leu, Arg-, Ser- 및 Trp-기로부터 선택되는 아미노산에 의해 대체된 것을 포함한다. 하나의 측면에서, 아미노산는 Ile-, Lys-, Phe-, Val-, Glu-, Asp-, His-, Leu-, Arg- 및 Ser-기로부터 선택될 수 있다. 그러한 변이체는 US 6,022,851에 기재되어 있는 바와 같이, Z = H2N인 화합물에 잔기를 화학적으로 가함으로써 생산될 수 있다. 아미노산을 화학적으로 가함으로써 아미노산이 L 또는 D 배열(configuration)로 존재하게 된다는 것을 이해할 것이다. 이는 예로서, 상기 언급한 것과 같은 D 형태의 기타 아미노산 이외에도 D-Ala를 포함한다.
유도체
본 발명의 화합물의 유도체(변이체 포함)는 본 발명의 화합물의 하나 이상의 아미노산 측쇄가 예를 들면, 에스테르화, 아미드화 또는 산화에 의해 변형된 것이 다.
본 발명의 화합물의 유도체는 액타가르딘의 카복시 작용기들 중 하나, 특히 C-말단에서의 모노아미드 유도체일 수 있다. 더욱 특히, 유도체는, 본 발명의 화합물의 C-말단이 식 -COR이고, 여기서, R은 -NR1R2 기를 나타내며, 여기서, R1 및 R2는 독립적으로
(i) 수소;
(ii) 식 -(CH2)n-NR3R4(여기서, n은 정수 2 내지 8을 나타내고, R3 및 R4는 독립적으로 수소 또는 (C1-C4)알킬을 나타내거나, R3 및 R4는 함께 -(CH2)3-, -(CH2)4-, (CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)2-S-(CH2)2- 또는 -(CH2)5- 기를 나타낸다)의 기를 나타내거나;
R1 및 R2는 인접한 질소 원자와 함께,
(a) (C1-C4)알킬;
(b) (C5-C7)-사이클로알킬;
(c) 피리딜;
(d) -(CH2)p-NR5R6(여기서, p는 정수 1 내지 8을 나타내고, R5 및 R6은 독립적으로 수소 또는 (C1-C4)알킬을 나타낸다);
(e) 피페리디닐;
(f) 치환된 피페리디닐(여기서, 치환된 피페리디닐은, (C1-4)알킬인 N-치환기를 보유한다);
(g) 벤질; 및
(h) 치환된 벤질(여기서, 페닐 부분은 클로로, 브로모, 니트로, (C1-C4)알킬 및 (C1-C4)알콕시로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기를 보유한다)로부터 선택되는 치환기로 4번 위치에서 치환될 수 있는 피페라진 부분을 나타내는 화합물일 수 있다.
하나의 실시태양에서, 식 -COR에서의 R은 -NR1R2 기를 나타내고, 여기서, R1 및 R2는 독립적으로 수소, 식 -(CH2)n-NR3R4(여기서, n은 정수 2 내지 8을 나타내고, R3 및 R4는 독립적으로 수소 또는 (C1-C4)알킬을 나타내거나, R3 및 R4는 함께 -(CH2)3-, -(CH2)4-, (CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)2-S-(CH2)2- 또는 -(CH2)5- 기를 나타낸다)의 기를 나타내거나, R1 및 R2는 인접한 질소 원자와 함께, (C1-C4)알킬, (C5-C7)-사이클로알킬, 피리딜, 벤질, 및 치환된 벤질(여기서, 페닐 부분은 클로로, 브로모, 니트로, (C1-C4)알킬 및 (C1-C4)알콕시로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기를 보유한다)로부터 선택되는 치환기로 4번 위치에서 치환될 수 있는 피페라진 부분을 나타낸다.
추가로, 유도체는 내부 잔기 측쇄의 카복시 작용기, 예컨대, 잔기 Glu11의 것이 -COOH로부터 -COOR5(여기서, R5는 수소, (C1-C4)알킬 또는 (C1-C4)알콕시 (C2-C4)알킬을 나타낸다)의 기로 변형된 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물의 N-말단 유도체는 N-말단 아미노 기 -NH2가 대신 -NHR6(여기서, R6은 C1-C4알킬을 나타낸다)의 기인 것일 수 있다.
용어 "(C1-C4)알킬"은 1 내지 4개 탄소 원자의 직쇄형 또는 분지쇄형의 알킬 쇄, 예로서, 메틸, 에틸, 프로필, 1-메틸에틸, 부틸, 1-메틸프로필 또는 1,1-디메틸에틸을 나타내는 반면, 용어 "(C2-C4)알킬"은 2 내지 4개 탄소 원자의 직쇄형 또는 분지쇄형의 알킬 쇄, 예로서, 에틸, 프로필, 1-메틸에틸, 부틸, 1-메틸프로필 또는 1,1-디메틸에틸을 나타낸다. 용어 "(C5-C7)사이클로알킬"은 사이클로펜틸, 사이클로헥실 및 사이클로헵틸로부터 선택되는 사이클로알킬 기를 나타낸다.
용어 "(C1-C4)알콕시"는 1 내지 4개 탄소 원자의 직쇄형 또는 분지쇄형의 알콕시 쇄, 예로서, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 1-메틸에톡시, 부톡시, 1-메틸프로폭시 및 1,1-디메틸에톡시를 나타낸다.
본 발명에 따른 유도체는 EP-0195359(그의 개시 내용이 본원에서 참고로 인 용된다)에서 액타가르딘의 유도체 제조를 위해 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
추가의 실시태양
유도체가, C-말단이 식 -COR이고, 여기서, R은 -NR1R2 기를 나타내는 화합물일 경우, 몇몇 실시태양에서, R1은 수소이고, R2는 식 -(CH2)n-NR3R4(여기서, n은 정수 2 내지 8을 나타내고, R3 및 R4는 독립적으로 수소 또는 (C1-C4)알킬을 나타내거나, R3 및 R4는 함께 -(CH2)3-, -(CH2)4-, (CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)2-S-(CH2)2- 또는 -(CH2)5- 기를 나타낸다)의 기를 나타낸다. 이들 실시태양에서, R3 및 R4는 바람직하게 수소 또는 (C1-C4)알킬을 나타낸다. 더욱 바람직하게, R3 및 R4는 (C1-C2)알킬, 예컨대, 메틸을 나타낸다. 정수 n은 바람직하게 2 내지 5일 수 있고, 더욱 바람직하게 2 내지 4, 예컨대, 3일 수 있다.
다른 실시태양에서, R1 및 R2는 인접한 질소 원자와 함께 피페라진 부분을 나타낸다. 4번 위치의 N-치환기는 바람직하게
(a) (C1-C4)알킬;
(b) (C5-C7)-사이클로알킬,
(d) -(CH2)p-NR5R6(여기서, p는 정수 1 내지 8을 나타내고, R5 및 R6은 독립적으로 수소 또는 (C1-C4)알킬을 나타낸다);
(e) 피페리디닐; 및
(f) 치환된 피페리디닐(여기서, 치환된 피페리디닐은, (C1-4)알킬인 N-치환기를 보유한다)로부터 선택될 수 있다.
피페리디닐 및 치환된 피페리디닐 기는 바람직하게 4번 위치에 그의 질소 원자를 갖는다.
N-치환기는 더욱 바람직하게,
(d) -(CH2)p-NR5R6(여기서, p는 정수 1 내지 8을 나타내고, R5 및 R6은 독립적으로 수소 또는 (C1-C4)알킬을 나타낸다); 및
(f) 치환된 피페리디닐(여기서, 치환된 피페리디닐은, (C1-4)알킬인 N-치환기를 보유한다)로부터 선택될 수 있다.
N-치환기가 -(CH2)p-NR5R6일 경우, 이때 R5 및 R6은 바람직하게 (C1-C4)알킬일 수 있고, 더욱 바람직하게는 (C1-C2)알킬, 예컨대, 메틸일 수 있다. 정수 p는 바람직하게 1 내지 4, 예컨대, 3이다.
N-치환기가 치환된 피페리디닐일 경우, 이때, N-치환기는 바람직하게 (C1- C2)알킬, 예컨대, 메틸이다. 상기 언급한 바와 같이, N은 바람직하게 4번 위치에 존재한다.
핵산
본 발명의 핵산은 DNA인 것이 바람직할 수 있지만, DNA 또는 RNA일 수 있다. 본 발명의 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 하나의 측면에서, 본 발명은 클러스터 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 전구체 폴리펩티드, 또는 그의 변이체 또는 단편을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은, 본원에 개시된 유전자간 영역을 포함하는 단편을 비롯한, 서열 번호 100 또는 서열 번호 200 모두 또는 그의 단편을 포함할 수 있는 단리된 핵산을 제공한다. 그러한 영역은 본 발명의 클러스터 폴리펩티드 또는 전구체 폴리펩티드의 발현을 위한 프로모터 또는 기타 조절 요소를 포함할 수 있다.
당업자에 의해 25개의 뉴클레오티드가 본원에 개시된 바와 같이 특정 유전자 또는 유전자 클러스터, 또는 그의 부분 서열에 특이적인 충분한 갯수의 뉴클레오티드로서 인지된다. 따라서, 단편은 서열 번호 100 또는 서열 번호 200의 단편, 또는 유의적인 서열 동일성을 갖는 그의 변이체로서, 뉴클레오티드 길이가 25개 이상, 예컨대, 30개 이상, 예컨대, 50개 이상, 예컨대, 100개 이상, 예컨대, 250개 이상인 것을 포함한다.
상기 유전자간 서열의 변이체인 프로모터 또한 포함되며, 특이적인 유전자간 서열(또는 그의 일부분)은 바람직한 실시태양이다. orf, 유전자, 핵산, 폴리펩티드 또는 프로모터의 바람직한 실시태양이 특정 서열과 관련하여 정의되는 모든 경우에 있어서, 보다 넓은 의미로 본 발명은 상기 특정 서열의 변이체를 갖는 실시태양도 포함하도록 하고자 한다.
특정 핵산(기준 핵산)과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "변이체"는 기준 핵산의 서열과 상이한 서열을 갖지만, 그의 보체이거나, 기준 핵산 또는 그의 보체, 또는 기준 핵산 또는 그의 보체의 단편과 유의적인 핵산 서열 동일성을 나타내거나, 엄격한 조건하에 그와 혼성화를 나타내는 임의 핵산; 또는 기준 핵산, 또는 상기 핵산의 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열과 유의적인 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 임의 핵산을 의미한다. 용어 "변이체"는 또한 오직 유전자 코드의 축퇴성에만 기인하여 서로 상이하고, 그러므로, 유추되는 아미노산 서열이 동일한 것인, 아미노산 서열을 코딩하는 핵산도 지칭한다. 본 발명의 변이체 핵산은 추가로 하기와 같이 정의된다. 본 발명의 변이체 핵산이 변이체인 그의 서열을 대신하여 본원에서 동정된 유전자 클러스터 내로 도입되고, 재조합 단편이 란티바이오틱 생산에 적합한 조건(예컨대, 실시예에 제시되는 것과 같은 조건)하에 적합한 숙주 세포 내로 도입될 경우, 이때, 하나 이상의 란티바이오틱 활성(특히, 항생제 활성)을 갖는 분자가 생산될 것이다. 바람직하게, 생산은 고도한세포 밀도로 존재하도록 조절될 것이다.
유의적인 핵산 서열 동일성은 바람직하게 50% 이상, 더욱 바람직하게 60% 이 상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상이고, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상이다. 유의적인 핵산 서열 동일성은 바람직하게 변이체 핵산(또는 그의 일부분)과, 기준 핵산의 30개 이상의 잔기인 단편, 더욱 바람직하게, 60개 이상, 90개 이상 또는 120개 이상의 잔기인 단편, 더욱 더 바람직하게는, 180개 이상, 240개 이상 또는 300개 이상의 잔기인 단편, 더욱 바람직하게, 전체 기준 핵산 사이에서 제시된다.
"핵산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 비교시 서열의 뉴클레오티드 잔기와 동일한, 후보 서열의 뉴클레오티드 잔기의 비율로서 정의된다. 본원에서 사용되는 동일성 값은 오버랩 스팬 및 오버랩 분획이 각각 1 및 0.125로 설정되고, 디폴트 파라미터로 설정된 WU BLAST-2의 BLASTN 모듈에 의해 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 프로모터의 변이체와 관련하여, 핵산 서열 동일성은 바람직하게, 30개 이상의 잔기, 더욱 바람직하게, 40개 또는 50개 이상의 잔기, 더욱 더 바람직하게, 60개 이상의 잔기의 서열에 걸쳐 평가된다.
본원에서 정의되는 "엄격한 조건" 또는 "고도로 엄격한 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도와 고온을 이용하는 것, 예를 들면, 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 황산도데실나트륨을 이용하는 조건; (2) 혼성화시 변성화제, 예로서, 포름아미드, 예를 들면, 42℃에서 750mM 염화나트륨, 75mM 시트르산나트륨이 포함된, 0.1% 우혈청 알부민/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)과 함께 50% (v/v) 포름아미드를 사용하는 조건; 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5 x SSC(0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산 나트륨), 50mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 덴하트(Denhardt's) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50g/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트를 사용하고, 42℃에서 0.2 x SSC(염화나트륨/시트르산나트륨)에서, 그리고 55℃에서 50% 포름아미드로 세척한 후, 55℃에서 EDTA가 포함된 0.1 x SSC를 이용한 고엄격 세척을 수행하는 조건으로 간주될 수 있다.
관심의 대상이 되는 핵산이 프로모터 또는 조절 서열과 "작동 결합" 상태로 있다고 언급되는 경우, 이는 프로모터/조절 서열이 적절한 발현 시스템에서 관심의 대상이 되는 핵산의 전사를 지시할 수 있고, 관심의 대상이 되는 핵산은 번역을 위해 정확한 리딩 프레임에 존재한다는 것을 의미한다. 바람직하게, 관심의 대상이 되는 핵산이 프로모터/조절 서열과 작동 결합 상태로 있는 경우, 관심의 대상이 되는 핵산의 전사체는 적절한 발현 시스템에서 관심의 대상이 되는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 것으로서, 적절하게 위치하는 리보좀 결합 부위를 포함한다. 예를 들면, 문헌 ([Sambrook et al. (1989)] 및 [Ausubel et al. 25 (1995)]를 참조할 수 있다.
핵산이 "단리된" 것으로 지칭되는 경우, 이는 보통 악티노플레인스 가르바디넨시스 및/또는 악티노플레인스 리구리애에 존재하는 다른 핵산 중 일부 또는 그 모두, 특히, 본원에서 동정된 유전자 클러스터 세그먼트 외의 핵산 중 일부 또는 그 모두로부터 실질적으로 또는 완전하게 단리된 것을 의미할 수 있다.
상기 개시 내용에 비추어 볼 때, 본 발명이 액타가르딘 또는 액타가르딘 B 생합성 유전자 클러스터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 제공한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 전체 유전자 클러스터 또는 25개 이상의인접 뉴클레오티드인 그의 일부분이 매우 다양한 용도로 사용될 수 있고, 상기 용도로는 액타가르딘 또는 액타가르딘 B의 발현; 관련 분자 등에 대하여 다른 유기체를 스크리닝하는 프로브로서의 용도; 유전자 침묵화를 유도하는 용도 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
발현 작제물
본 발명의 추가의 측면에서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 본 발명의 클러스터 폴리펩티드 또는 란티바이오틱 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 작제물을 제공한다.
추가의 측면에서, 발현 작제물 세트를 제공한다. 발현 작제물 세트는 본 발명의 2개 이상의 폴리펩티드 코딩 서열, 및 상기 서열의 발현에 적합한 1 이상의 프로모터를 포함한다. 프로모터(들)는, 폴리펩티드 유전자가 천연적으로 그와 함께 결합되어 있는 프로모터일 수 있거나(또는 변이체일 경우, 변이체가 유도되는 유전자의 프로모터), 숙주 세포에서 기능성인, 구성적 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 따라서, 프로모터는 표 1 및 2에 열거된 오픈 리딩 프레임들 중 어느 것의 상류에 있는 서열 번호 100 또는 서열 번호 200의 유전자간 영역을 포함한다.
프로모터(들)는 발현 작제물 세트의 핵산에 작동 가능하게 연결될 것이다. "작동 가능하게 연결된다"라는 것은 프로모터가 적절한 발현 시스템에서 관심의 대상이 되는 핵산의 전사를 지시할 수 있고, 관심의 대상이 되는 핵산은 번역을 위해 정확한 리딩 프레임에 존재한다는 것으로 이해될 것이다. 바람직하게, 관심의 대상 이 되는 핵산이 프로모터/조절 서열과 작동 결합 상태로 있는 경우, 관심의 대상이 되는 핵산의 전사체는 적절한 발현 시스템에서 관심의 대상이 되는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 것으로서, 적절하게 위치하는 리보좀 결합 부위를 포함한다. 예를 들면, 문헌 ([Sambrook et al. (1989)] 및 [Ausubel et al. 25 (1995)]를 참조할 수 있다.
본 발명에 따른 발현 작제물 세트는 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 전구체 및 클러스터 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 다수의 치환을 포함한다. 본 발명의 다양한 측면에서, 세트는 적어도 LanA 유전자를 포함할 것이다. 그러한 세트의 일례로는 하기의 "세트 1" 내지 "세트 7"로서 기재되며, 단, 이들 세트는 단순히 예시적인 것이며, 제한적인 것으로 이해되어서는 안된다.
세트 1: 전구체 폴리펩티드, 바람직하게는, 본 발명의 화합물로 전환될 수 있는 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 LanA 유전자와, LanM 폴리펩티드를 코딩하는 LanM 유전자. LanM 폴리펩티드는 바람직하게 서열 번호 120의 LanM, 또는 그의 변이체, 또는 서열 번호 213의 LanM, 또는 그의 변이체이다.
세트 2: 전구체 폴리펩티드, 바람직하게는, 본 발명의 화합물로 전환될 수 있는 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 LanA 유전자와, LanR 폴리펩티드를 코딩하는 LanR 유전자. LanR 폴리펩티드는 바람직하게 서열 번호 122의 LanR, 또는 그의 변이체, 또는 서열 번호 216의 LanR, 또는 그의 변이체이다.
세트 3: 전구체 폴리펩티드, 바람직하게는, 본 발명의 화합물로 전환될 수 있는 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 LanA 유전자와, LanM 폴리펩티드를 코딩하는 LanM 유전자와, LanR 폴리펩티드를 코딩하는 LanR 유전자. LanM 폴리펩티드는 바람직하게 서열 번호 120의 LanM, 또는 그의 변이체, 또는 서열 번호 213의 LanM, 또는 그의 변이체이다. LanR 폴리펩티드는 바람직하게 서열 번호 122의 LanR, 또는 그의 변이체, 또는 서열 번호 216의 LanR, 또는 그의 변이체이다.
세트 4: LanO 폴리펩티드를 코딩하는 LanO 유전자와 함께, 세트 3의 유전자. LanO 폴리펩티드는 바람직하게 서열 번호 122의 LanO, 또는 그의 변이체, 또는 서열 번호 215의 LanR, 또는 그의 변이체이다.
세트 5: LanT 폴리펩티드를 코딩하는 LanT 유전자와 함께, 세트 3 또는 세트 4의 유전자. LanT 폴리펩티드는 바람직하게 서열 번호 123의 LanT, 또는 그의 변이체, 또는 서열 번호 214의 LanT, 또는 그의 변이체이다.
세트 6: 서열 번호 116 내지 127의 유전자 또는 그의 변이체.
세트 7: 서열 번호 206 내지 220의 유전자 또는 그의 변이체.
하나의 측면에서, 세트는, 모두가 1xx 폴리펩티드를 코딩하거나, 모두가 2xx 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 것이다. 그러나, 1xx 및 2xx 폴리펩티드, 둘 모두로 구성된 세트가 본 발명으로부터 제외되는 것은 아니다.
재조합 발현 벡터
또다른 측면에서, 본 발명의 하나 이상 발현 작제물을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 대체 측면에서, 본 발명의 발현 작제물 세트를 포함하는 재조합 벡터 세트를 제공한다. 박테리아 내로의 도입을 위한 핵산을 포함하는 적합한 벡터를 선택하거나 작제할 수 있으며, 이는 필요하다면, 추가의 프로모터, 종결 인자 단편, 인핸서 요소, 마커 유전자 및 적절한 기타 요소를 비롯한, 적절한 추가 조절 요소를 함유한다. 벡터는 적절하게 플라스미드, 바이러스성, 예컨대, 파지, 또는 파지미드일 수 있다. 추가의 상세한 설명을 위해 예를 들면, 문헌 [Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor]를 참조할 수 있다. 예를 들면, 핵산 작제물 제조, 돌연변이 유발, 서열 분석, 세포 내로 DNA 도입, 및 유전자 발현, 및 단백질 분석에서 핵산을 조작하는 공지된 다수의 기법 및 프로토콜은 문헌 [Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)]에 상세히 기재되어 있다. 스트렙토마이세스 종과 관련된 이들 기법 사용에 관한 다수 측면들은 문헌 ([Hopwood et al (1985) Genetic manipulation of Streptomyces a laboratory manual (Norwich: John Innes Foundation)] 및 [Practical Streptomyces Genetics (2000) Kieser T. et al., The John Innes Foundation p.386])에 기재되어 있다. (Sambrook et al, Ausubel et al, Hopwood et al 및 Kieser et al.)의 개시 내용은 모두 이러한 목적 및 모든 다른 목적을 위해 참고로 인용된다.
발현 카세트
또다른 측면에서, 본 발명자들은 액타가르딘 B의 란티바이오틱 유도체를 생산하고 스크리닝하는데 유용한 벡터 시스템을 개발하게 되었다. 이는 발현 카세트 시스템을 생산하기 위해 이는 서열 번호 1, 11 또는 212를 코딩하는 LanA 유전자 내로 하나 이상의 제한 엔도뉴클라제를 도입함으로써 달성된다. 따라서, 또다른 측 면에서, 본 발명은 액타가르딘 B 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 카세트를 제공하는데, 여기서, 상기 서열은
코딩 서열의 N-말단 코딩 영역에 있거나 그에 인접한 제1 제한 부위;
경우에 따라, 제1 제한 부위 하류 및 코딩 서열 내의 제2 제한 부위; 및
코딩 서열의 C-말단 코딩 영역에 있거나 그에 인접한 제3 제한 부위
(여기서, 상기 제한 부위들 중 적어도 하나는 서열 번호 200으로 제시된 LanA 코딩 서열내 존재하지 않는다)를 포함한다.
추가의 측면에서, 액타가르딘 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 카세트를 제공하는데, 여기서, 상기 서열은
코딩 서열의 N-말단 코딩 영역에 있거나 그에 인접한 제1 제한 부위;
경우에 따라, 제1 제한 부위 하류 및 코딩 서열 내의 제2 제한 부위; 및
코딩 서열의 C-말단 코딩 영역에 있거나 그에 인접한 제3 제한 부위;
(여기서, 상기 제한 부위들 중 적어도 하나는 서열 번호 100으로 제시된 LanA 코딩 서열내 존재하지 않는다)을 포함한다.
일반적으로, 2개 또는 3개의 모든 부위는 서로서로 상이할 것이다. 또한, 카세트가 벡터에 의해 운반될 때, 상기 부위는 당해 벡터에 대하여 독특한 것이 바람직할 수 있다.
바람직한 측면에서, 비자연발생적으로 생성된 제한 효소 부위는 제2 제한 부위이고, 서열 번호 1 또는 서열 번호 4의 코딩 서열의 5번 내지 16번 코돈 사이, 예로서, 6번 내지 15번 코돈 사이에 위치한다.
카세트는 또한 바람직하게 LanA 리더 서열 및 LanA 프로모터를 포함할 것이고, 특히, 클러스터 유전자가 등가의 숙주 세포 유전자 손실을 보완하기 위하여 필요한 경우에는 하나 이상 클러스터 유전자도 추가로 포함할 수 있다.
상기 기술된 본 발명의 카세트는 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 예를 들면, 제1 제한 부위와 제2 제한 부위 사이, 제1 제한 부위와 제3 제한 부위 사이, 또는 제2 제한 부위와 제3 제한 부위 사이의 카세트를 절단함으로써 얻은 단편을, 란티바이오틱 A 변이체를 코딩하는 변이체 코딩 서열로 대체할 수 있다. 따라서, 본 발명은 코딩 서열의 코딩 영역 내 1 내지 15개의 뉴클레오티드 치환을 갖는, 본 발명의 카세트의 변이체를 제공한다.
상기 변이체 생산의 중간체로서 제1 제한 부위와 제2 제한 부위 사이, 제1 제한 부위와 제3 제한 부위 사이, 또는 제2 제한 부위와 제3 제한 부위 사이의 서열은 보다 큰 스터퍼(stuffer) 단편에 의해 대체될 수 있다.
또다른 측면에서, 예를 들면, 숙주 세포의 항균 성질을 평가하기 위해 란티바이오틱 유도체를 코딩하는 카세트를 사용하여 유도체를 발현시키도록 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다.
하나의 측면에서, 다수의 발현 카세트를 제조하여 상이한 유도체의 라이브러리를 제공하고, 이어서, 활성에 대하여 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 발현 카세트는 당업계에서 사용되는 것으로서, 숙주 세포에서 유전자를 발현시키기 위해 사용되는 임의의 클로닝과 발현 벡터에 기초할 수 있다. 그러한 벡터는 하나 이상의 복제 기점을 포함할 것이며, 이는 감온성일 수 있다. 벡터는 선별가능한 마커, 예로서, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자, 에리트로마이신 내성 유전자, 아프라마이신 내성 유전자 또는 테트라사이클린 내성 유전자를 포함할 수 있다. 벡터는 또한 LanA 유전자 클러스터 밖의, 숙주 세포내 존재하는 게놈 서열에 상동성인 표적 부위를 포함할 수 있다. 그러한 벡터를 사용하여 카세트를, 표적 부위에 상동성인 게놈 서열 내로 통합시킬 수 있다.
발현 카세트는 또한 LanA 유전자 또는 그의 유도체 이외에, 하나 이상 클러스터 유전자를 포함할 수 있다. 숙주 세포는, 그중의 LanA 유전자가 상기 클러스터 유전자를 불활성화시키기도 하는 방식으로 불활성화된 ΔLanA 숙주 세포일 경우(예컨대, 문헌 [Altena et al, 2000]에 개시된 균주의 경우), 이러한 유전자 또는 등가의 유전자가 발현 카세트에 제공하는 것이 바람직할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "N-말단 코딩 영역에 있거나 그에 인접한다"라는 것은 제한 부위의 제1 염기가 LanA 리더 서열의 ATG 코돈으로부터 잔기 6개 만큼의 상류로부터 프로펩티드의 제1 코돈으로부터 코돈 6개 이하 만큼의 하류까지의 위치에 위치한다는 것을 의미한다. 바람직하게, 제한 부위의 제1 염기는 잔기 12개, 바람직하게는, 6개 만큼의 상류로부터 프로펩티드를 코딩하는 서열의 제1 코돈으로부터 잔기 6개 만큼의 하류까지의 위치에 위치한다.
하나의 측면에서, 제1 제한 부위는 BglII 부위이다.
유사하게, "C-말단 코딩 영역에 있거나 그에 인접한다"라는 것은 제한 부위의 제1 염기가 프로펩티드의 종결 코돈의 뉴클레오티드를 1개 이상을 포함하거나, 제한 부위의 5' 또는 3' 뉴클레오티드가 각각 종결 코돈으로부터 잔기 12개, 바람 직하게는, 6개 만큼의 하류 또는 상류에 존재한다는 것을 의미한다.
하나의 측면에서, 제3 제한 부위는 AvrII 부위이다.
존재한다면 제2 제한 부위는 제1과 제3 제한 부위 사이에 존재하게 될 것이다. 바람직하게, 상기 제한 부위는 프로펩티드 코딩 서열의 5번 내지 16번 코돈, 바람직하게, 8번 내지 16번 코돈 사이에 존재하는 뉴클레오티드를 1개 이상 포함한다. 첨부된 실시예에서, BsrG1 부위는 ActA-코딩 서열의 6번 내지 7번 코돈을 변경시킴으로써 도입되었다. 그러나, 다른 변화 또한 본 발명에 의해 고려된다.
또한 1 초과의 변화도 도입함으로써 발현 카세트가 제1와 제3 제한 부위 사이에 2개 이상의 부위를 포함하도록 할 수 있다.
카세트는 2개 또는 3개의 비자연발생적으로 생성된 제한 부위를 포함할 수 있다. 첨부된 실시예에서, 보통은 3개 부위 모두가 서열 번호 100에 의해 코딩되는 ActA 서열내 존재하지 않는다.
발현 카세트는 본원 하기에서 추가로 논의되는 바와 같이, 란티바이오틱 유도체의 신속한 생산을 간소화시킨다.
하나의 측면에서, 제1 부위와 제2 부위 사이, 제1 부위와 제3 부위 사이, 또는 제2 부위와 제3 부위 사이의 영역은 스터퍼 단편으로 대체될 수 있다. 제1 부위와 제3 부위 사이에 2개 이상의 부위가 존재할 경우, 그러한 부위의 임의 쌍 사이에 있는 영역 또한 스터퍼 단편으로 대체될 수 있다. 스터퍼 단편은 그가 대체하는서열보다 더 큰 DNA 조각이다. 스터퍼 단편 50 내지 5000개의 뉴클레오티드 크기, 예를 들면, 약 500 내지 2000개의 뉴클레오티드 크기일 수 있다. 이들 스터퍼 DNA 단편을 도입하는 것이 갖는 가치는, 상기 영역을 란티바이오틱 코딩 올리고뉴클레오티드로 대체할 때 플라스미드 크기가 유의적으로 감소한다는데 있다. 따라서, 생성된 플라스미드는 임의의 최소 군집의 비제한적 플라스미드로부터 용이하게 정제될 수 있고, 이로써, 임의의 배경도 제거할 수 있다.
본 발명의 카세트를 사용하여 벡터내 ActA 서열에 특이적인 변화를 도입할 수 있는데, 이는 이후 란티바이오틱 발현을 위해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 이를 달성하기 위하여, 서열을 바람직하게는 LanA(예컨대, ActA 또는 LigA) 리더 서열에 작동 가능하게 연결시키고, 이를 다시 LanA 프로모터(예컨대, ActA 또는 LigA)에 작동 가능하게 연결시킨다. 추가로 또는 별법으로서, 카세트를 포함하는 벡터는 또한 LanR 유전자를 포함할 수 있다. LanR 유전자는 란티바이오틱 A 코딩 서열의 하류에 위치하고, 란티바이오틱 A 코딩 서열과 직렬로 위치할 것이다.
발현 라이브러리
본 발명의 발현 카세트를 사용하여 란티바이오틱 코딩 유전자 라이브러리를 제공할 수 있다. 그러한 라이브러리는, 카세트 내의, 제1 제한 부위와 제2 제한 부위 사이, 제1 제한 부위와 제3 제한 부위 사이, 또는 제2 제한 부위와 제3 제한 부위 사이로 복수의 서열을 도입함으로써 제조될 수 있는데, 상기 복수의 서열들 각각은 프로펩티드는 서열 번호 100 또는 200의 프로펩티드 일부와 비교하여 1 내지 15개, 예를 들면, 1 내지 10개, 바람직하게는, 1 내지 6개, 예를 들면, 1 내지 3개의 뉴클레오티드 변화를 갖는 것 이외에는, 상응하는 ActA 또는 LigA 서열과 일치한다. 바람직하게, 그러한 변화가 서열에 의해 코딩되는 단백질을 변화시킨다. 그 러나, 비-코딩 변화를 제외시키는 것은 아니다.
라이브러리는 본 발명의 추가의 측면을 형성한다. 그러한 라이브러리는 발현 카세트의 란티바이오틱 A 코딩 서열의 변이체인, 10 내지 100,000개, 예로서, 10 내지 10,000개, 예를 들면, 10 내지 1,000개의 상이한 코딩 서열을 포함할 수 있다.
란티바이오틱 유도체를 코딩하는 발현 카세트는 란티바이오틱 발현을 위해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 라이브러리는 숙주 세포 내로 도입될 수 있고, 콜로니는 단리되고/거나 항균 활성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 그러한 활성을 나타내는 개개의 콜로니에 의해 발현된 란티바이오틱 A의 서열을 측정할 수 있다. 란티바이오틱 A가 활성을 나타내는 경우, 본 발명은 추가로 본 발명의 방법에 의해 수득된 란티바이오틱을 제공한다.
숙주 세포
2가지 주요 유형의 숙주 세포가 본 발명에 포함된다. 첫번째 유형의 숙주 세포는 란티바이오틱 생산 숙주 세포이다. 별법으로, 숙주 세포는 비생산자 세포일 수 있고, 즉, LanA 폴리펩티드 생산에 필요한 LanA 유전자 또는 이와 관련된 클러스터 유전자를 함유하지 않는다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 발현 작제물 세트로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 작제물 세트는 상기 정의된 세트 1 내지 7중 어느 하나일 수 있거나, 전구체 및 클러스터 폴리펩티드-코딩 핵산의 임의의 다른 조합에 기초 한 세트일 수 있다. 또다른 실시태양에서, 숙주 세포는 본 발명의 발현 카세트로 형질전환될 수 있다.
추가의 실시태양에서, 각각 본 발명의 상이한 발현 카세트를 포함하는, 숙주 세포 라이브러리를 제공한다.
란티바이오틱 생산 숙주 세포
하나의 실시태양에서, 숙주 세포는 란티바이오틱 생산 숙주 세포일 수 있다. 란티바이오틱 생산 숙주 세포는, LanA 유전자를 포함하는 발현 작제물이 임의의 클러스터 유전자의 부재하에 세포 내로 도입되었다면, 그가 발현되고 LanA 폴리펩티드가 생산되는 것이다. 그러한 세포로는 임의의 B형 란티바이오틱 생산 세포, 예로서, 란티바이오틱을 생산하는 바실러스(bacillus), 악티노마이세트(actinomycete) 또는 스트렙토마이세트(streptomycete)(예컨대, 스트렙토마이세스 리비단스(S. lividans) 또는 스트렙토마이세스 코엘리컬러(S. coelicolor))의 임의의 균주를 포함한다. 그러한 세포의 일례로는 신나마이신 생산 숙주 세포(스트렙토마이세스 신나모뉴스 신나모뉴스(Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus) DSM 40005), 또는 액타가르딘 생산 악티노플레인스 가르바디넨시스 또는 악티노플레인스 리구리애 NCIMB 41362를 포함한다.
본 발명이, -X1-X2-가 -Leu-Val-인 화학식(I)의 화합물 생산에 관한 것인 경우, 숙주 세포는 임의의 추가 변형이 없는 악티노플레인스 리구리애 NCIMB 41362일 수 있다.
하나의 측면에서, 이러한 부류의 숙주 세포는 유전자가 발현되지 않거나 유 전자 산물이 불활성화되도록, 그의 내인성 란티바이오틱 A 유전자 내에 돌연변이를 포함할 수 있다. 그러한 숙주 세포는 숙주 세포의 LanA 유전자를 결실시키거나 돌연변이화시키는 표적화된 상동성 재조합에 의해 수득될 수 있다. 이를 달성하는 방법은 그 자체로서 당업계에 공지되어 있으며, 문헌 [Altena et al, (2000)] 및 WO2005/093069(상기의 개시 내용은 본원에서 참고로 인용된다)에 설명되어 있다. 생성된 숙주 세포를 ΔLanA 숙주 세포로 지칭한다. 하나의 특정 실시태양에서, 숙주 세포는, ligA 유전자가 예를 들면, 돌연변이화 또는 결실, 예컨대, 상동성 재조합에 의해 일어나는 결실에 의해 불활성화된 ΔLanA 악티노플레인스 리구리애 NCIMB 41362 숙주 세포이다. 또다른 실시태양에서, 숙주 세포는 ActA 유전자가 예를 들면, 돌연변이화 또는 결실, 예컨대, 상동성 재조합에 의해 일어나는 결실에 의해 불활성화된 ΔActA 악티노플레인스 가르바디넨시스 숙주 세포이다.
숙주 세포가 lanA 생산에 필요한 클러스터 유전자를 제공하는 경우, 그러한 클러스터 유전자를 제공하는 것이 임의적이기는 하지만, 이러한 유형의 숙주 세포를 다른 클러스터 유전자로 형질전환시키는 것 또한 본 발명에 의해 고려된다.
비생산자 세포
비생산자 세포는 액타가르딘 또는 그의 변이체로, 또는 본 발명의 화합물로 전환될 수 있는 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 LanA 유전자의 발현을 통해 상기 산물을 생산할 수 있지만, 단, LanA 유전자가, 전구체 폴리펩티드를 액타가르딘 또는 그의 변이체로, 또는 본 발명의 화합물로 전환시킬 수 있는 발현 작제물 세트의 일부로서 세포 내로 도입된 것인 임의의 숙주 세포일 수 있다.
비생산자 숙주 세포는 박테리아 숙주 세포일 수 있다. 박테리아 숙주 세포로는 악티노마이세트, 또는 스트렙토마이세트, 예컨대, 스트렙토마이세스 리비단스, 스트렙토마이세스 코엘리컬러 또는 스트렙토마이세스 신나모뉴스를 포함한다.
숙주 세포는, 숙주 세포 그 내에서 lanO 유전자가 돌연변이화 또는 결실에 의해 불활성화되어 있는 것(또는 비생산자 세포의 경우에는 존재하지 않는 것), 또는 그 내에서 lanO 유전자의 발현이 예컨대, 2 이상의 유전자 카피 공급에 의해, 또는 숙주 세포에서 발현을 증진시키는 프로모터에 유전자를 연결시킴으로써 증가하는 것일 수 있다. 숙주 세포에서 생산되는 본 발명의 산화된 형태(Y = -S(O))의 화합물 및 환원된 형태(Y = -S-)의 화합물의 상대적인 수준을 변경시키기 위해서는 이러한 방식으로 lanO 유전자를 조절하는 것인 바람직할 수 있다.
본 발명 화합물의 생산
본 발명의 화합물은 예를 들면, LanA 유전자와, 필요하다면, 전구체 폴리펩티드를 산물로 전환시키는데 필요한 관련 클러스터 유전자를 함께 수반하는 숙주 세포에서 재조합 발현 벡터내 수반되는 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 발현 작제물의 형태로 핵산의 발현에 의해 생산될 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명이, -X1-X2-가 -Leu-Val-인 화학식(I)의 화합물 생산에 관한 것인 경우, 숙주 세포는 임의의 추가 변형이 없는 악티노플레인스 리구리애 NCIMB 41362일 수 있다.
발현 카세트, 또는 벡터(들)를 숙주 세포 내로 도입하는 것(특히, 시험관내 도입의 경우)은 일반적으로 제한없이 "형질전환"으로서 지칭될 수 있다. 이는 임의의 이용가능한 기법을 사용할 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 적합한 기법으로는 염화칼륨 형질전환, 폴리에틸렌글리콜 보조 형질전환, 전기천공, 접합 및 박테리오파지를 사용하는 형질감염 또는 형질도입을 포함할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 관심의 대상이 되는 핵산을 발현시키기 위하여 숙주 세포(또는 다른 발현시스템)를 제공하고, 상기 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본 발명의 핵산을 발현시키는 방법을 제공한다. 관심의 대상이 되는 핵산은 발현 카세트 내에 존재하는 바, 숙주 세포 배양으로 본 발명의 산물이 생산된다.
바람직하게, 관심의 대상이 되는 핵산은 숙주 세포 배양물이 높은 세포 밀도에 도달하였을 때에만, 더욱 바람직하게, 숙주 세포 배양물이 고정상에 도달하였을 때 또는 그에 근접하게 도달하였을 때에만 실질적으로 발현된다. 고정상에 도달하였거나, 그에 근접하게 도달한 세포 배양물은 1-20 범위의 OD650 값을 가질 수 있다. 세포를 배양하는 공지 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 문헌 [(Sambrook et al (1989)], [Ausubel et al (2002)], 및 (특히, 스트렙토마이세스종의 경우) [Kieser et al (2000)])와 같이 잘 알려져 있다. 발현 시스템의 발현 산물을 수집하고, 정제할 수 있다. 단리 방법은 용매 추출 기법, 흡착 수지, 예로서, 소수성 수지 또는 침전 방법, 예로서, 황산암모늄 침전을 사용하여 발효 배지로부터 포획할 수 있다. 정제 방법은 크로마토그래피 기법, 예로서, 이온 교환, 소수성 상호작용, 역상, 순상, 고체상 추출 및 HPLC, 예컨대, 머사시딘 단리에 대하여 US 5,112,806에 기재되어 있는 것을 포함할 수 있다.
세포 배양 이후, 본 발명의 화합물은 숙주 세포 배양물로부터 회수될 수 있 다. 회수된 화합물은 약제학적 조성물 형태로, 임의로는 약제학적으로 허용 가능한 염 형태로 제제화될 수 있다.
숙주 세포가 본 발명의 화합물의 혼합물, 예컨대, Y가 -S- 또는 -S(O)-인 것, 또는 Z가 NH2 또는 Ala-인 것, 또는 4가지 유형 모두의 혼합물을 생산하는 경우, 산물은 예컨대, 액타가르딘 및 Ala-액타가르딘 생산에 대하여 US 6,022,851에 기재되어 있는 바와 같이, 예로서, hplc와 같은 표준 분리 기법을 사용하여 단리될 수 있다.
회수된 화합물은 약제학적 조성물 형태로, 임의로는 약제학적으로 허용 가능한 염 형태로 제제화될 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 염
"약제학적으로 허용 가능한 염"은 염기가 본 화합물의 생물학적 효능과 성질을 보유하고는 생리학적으로 허용 가능한 산 부가염일 수 있다. 그러한 염은 무기산, 예로서, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등으로 형성된 것, 및 유기산, 예로서, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탈설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등과 함께 형성된 것을 포함한다.
염은 또한 염기성 염, 예로서, 알칼리 또는 알칼리토 금속 염, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 또는 마그네슘 염을 포함한다.
약제학적 조성물
본 발명의 란티바이오틱은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 애주번트, 부형제, 희석제, 충전제, 완충제, 방부제, 항산화제, 활택제, 안정화제, 가용화제, 계면활성제(예컨대, 습윤제), 차폐제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업자에게 잘 알려져 있는, 하나 이상의 다른 약제학적으로 허용 가능한 성분과 함께 제제화될 수 있다. 제제는 추가로 다른 활성제, 예를 들면, 기타 치료제 또는 예방제를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 상기 정의된 바와 같은 약제학적 조성물과, 상기 정의된 바와 같은 1종 이상의 활성 화합물을 당업계에 잘 알려져 있는 하나 이상의 다른 약제학적으로 허용 가능한 성분들, 예컨대, 담체, 애주번트, 부형제와 함께 혼합하여 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 개별 단위(예컨대, 정제 등)로 제제화되는 경우, 각각의 단위는 미리 결정된 양(용량)의 활성 화합물을 함유한다.
본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한"이라는 용어는, 타당한 의학적 판단 범주 내에서 과도한 독성, 가려움증, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 당해 피험체(예컨대, 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 적당한 이익/위험 비를 갖는, 화합물, 성분들, 물질, 조성물, 제형 등에 관련하는 것이다. 각 담체, 애주번트, 부형제 등은 또한 제제의 다른 성분들과 상용성이라는 의미에서 "허용 가능"하여야 한다.
조성물은 임의의 적합한 투여 경로 및 수단용으로 제제화될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제는 경구, 직장, 비내, 국소(협측 및 설하 포함), 질내 또는 비경우(피하, 근육내, 정맥내, 진피내, 경막내 및 경막외 포함) 투 여에 적합한 제제에 사용되는 것을 포함한다. 제제는 편의상 단위 제형 형태로 제시될 수 있고, 약학 분야에 잘 알려져 있는 임의 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러한 방법은 하나 이상의 부속 성분들을 구성하는 담체와 활성 성분들을 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로 제제는 활성 성분을 액상 담체 또는 미분화된 고체 담체, 또는 둘 모두와 함께 균일하고 밀접하게 회합시킨 후, 필요하다면, 제품으로 성형화하여 제조될 수 있다.
고체 조성물의 경우, 통상의 비독성 고체 담체는 예를 들면, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 전분, 스테아린산 마그네슘, 나트륨사카린, 활석, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등이 포함되며, 이들이 사용될 수 있다. 상기 정의된 바와 같은 활성 화합물은 담체로서 예를 들면, 폴리알킬렌 글리콜, 아세틸레이트 트리글리세리드를 사용함으로써 좌제로 제제화될 수 있다. 액상의 약제학적으로 허용 가능한 조성물은 예를 들면, 상기 정의된 바와 같은 활성 화합물과 임의의 약제학적 애주번트를 담체, 예로서, 물, 염수, 수용성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등에 용해시키거나 분산시키는 등을 하여 액제 또는 현탁제로 제조함으로써 제조될 수 있다. 원하는 경우, 투여하고자 하는 약제학적 조성물은 또한 최소량의 비독성 보조제, 예로서, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등, 예를 들면, 아세트산나트륨, 소르비탄 모노라울레이트, 트리에탄올아민 아세트산나트륨, 소르비탄 모노라울레이트, 트리에탄올아민 올레이트 등을 함유할 수 있다. 그러한 제형을 제조하는 실제 방법은 공지되어 있거나, 당업자에게는 자명할 것이다; 예를 들면, 문헌 ["Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins]을 참조할 수 있다. 어떻든 투여하고자 하는 조성물 또는 제제는 치료하고자 하는 대상의 증상을 완화시키는데 유효한 양으로 다수의 활성 화합물(들)을 함유할 것이다.
0.25 내지 95% 범위의 활성 성분과, 그 잔여량으로는 비독성 담체를 함유하는 제형 또는 조성물이 제조될 수 있다.
경구 투여용의 약제학적으로 허용 가능한 비독성 조성물은 보통 사용되는 부형제, 예를 들면, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 크로스카르멜로오스 나트륨, 전분, 스테아린산 마그네슘, 나트륨사카린, 활석, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등의 혼입에 의해 제조된다. 그러한 조성물은 액제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 분제, 지효성 방출 제제 등의 형태를 취한다. 그러한 조성물은 1%-95% 활성 성분, 더욱 바람직하게는 2-50%, 가장 바람직하게는 5-8%를 함유할 수 있다.
비경구 투여는 일반적으로, 피하, 근육내, 또는 정맥내 주사를 특징으로 한다. 주사제는 통상의 형태인 액상 용액제 또는 현탁제로서, 주사 이전에 액상의 액제 또는 현탁제로 제조되기에 적합한 고체 제형으로서, 또는 에멀젼으로서 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들면, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 추가로, 원하는 경우, 투여하고자 하는 약제학적 조성물은 또한 최소량의 비독성 보조제, 예로서, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등, 예를 들면, 아세트산나트륨, 소르비탄 모노라울레이트, 트리에탄올아민 올레이트, 트리에탄올아민 아세트산나트륨 등을 함유할 수 있다.
국소 적용을 위한 약제학적으로 허용 가능한 조성물은 하나 이상의 담체에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 함유하는 적합한 연고 또는 겔로 제제화될 수 있다. 본 발명의 화합물의 국소 투여를 위한 담체로는 광유, 액상 바셀린, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 별법으로, 약제학적으로 허용 가능한 조성물은 하나 이상 약제학적으로 허용 가능한 담체에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 함유하는 적합한 로션제 또는 크림제로 제제화될 수 있다. 적합한 담체로는 광유, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알코올 및 물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기의 비경구용 또는 국소용 조성물에 함유되는 활성 화합물의 비율은 그의 특이적인 성질 뿐만 아니라, 화합물의 활성과 피험체의 필요에 고도로 의존적이다. 그러나, 활성 성분은 0.1% 내지 10% w/w의 비율로 사용될 수 있고, 조성물이 고체이고, 이후 상기 비율로 희석되는 것이라면, 상기 비율은 이보다 높을 것이다. 바람직하게, 조성물은 용액내 0.2-2% w/w의 활성 성분을 포함할 것이다.
적합한 담체, 애주번ㅌ, 부형제 등에 관한 추가의 교시는 표준 약제학적 텍스트, 예를 들면, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipient, 2nd edition, 1994]에서 찾아볼 수 있다.
화합물 투여
본 발명의 란티바이오틱 화합물 및 조성물은 의학적 치료법 또는 예방법으로 피험체에게 투여될 수 있다. 피험체는 인간 또는 동물 피험체일 수 있다. 동물 피험체는 포유동물, 또는 기타 척추동물일 수 있다.
따라서, 피험체를 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다. 또한, 피험체를 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.
치료 방법은 피부, 점막, 장 또는 전신 감염을 비롯한 박테리아 감염을 위한 것일 수 있다.
상기 변이체 및 조성물은 균혈증(카테터 관련 균혈증 포함), 폐렴, 피부 및 피부 구조 감염(수술 부위 감염), 심장내막염 및 골수염의 전신 치료에 사용될 수 있다. 이와 그 밖의 치료법은 원인 물질, 예로서, 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스에 대한 것일 수 있다. 본 발명의 화합물, 또는 그의 조성물은 또한 여드름(즉, 프로피오니박테리움 아크네스)을 비롯한 피부 감염의 국소 치료에 사용될 수 있다. 상기 변이체 및 그의 조성물은 또한 눈 감염, 예로서, 결막염 치료에 사용될 수 있고, 장 중복 감염(gut super-infection), 예로서, 다중 내성 클로스트리듐 디피실리를 비롯한 클로스트리듐 디피실리에 의해 유발된 것(위막성 대장염), 또는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)와 관련된 장 감염의 경구 치료를 위해 사용될 수 있다.
변이체는 또한 상처 또는 화상시 피부 감염을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 추가로, 변이체 및 그의 조성물은 예로서, MRSA의 전파를 방지하기 위해 콧구멍을 청소하는 예방법에도 사용될 수 있다. 이는 감염 위험이 있는 피험체(예컨대, 병원에 입원하는 환자), 또는 의료 종사자 또는 그러한 감염 보균자가 될 위험이 있는 다른 간호인에 대해 실행될 수 있다. 복부 수술 이전에 창자 균무리를 예방학적으로 제거하는 것 또한 고려된다.
본 발명에 따른 화합물은 장내(경구적으로), 비경구적으로(근육내로 또는 정맥내로), 직장 또는 국부적으로(국소적으로). 이는 액제, 분제(정제, 마이크로캡슐제를 비롯한 캡슐제), 연고제(크림제 또는 겔제), 또는 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 유형의 제제에 가능한 보조제는 약제학적으로 통상의 액상 또는 고체 충전제 또는 증량제, 용매, 유화제, 활택제, 향미제, 교정제, 착색제 및/또는 완충 물질이다. 적당량 용량으로서 0.1-1000, 바람직하게는 0.2-100mg/kg (체중)이 투여된다. 이는 1일 유효량, 예컨대, 30-3000, 바람직하게 50-1000mg으로 본 발명에 따른 화합물을 함유하는 1회 복용 단위로 적당히 투여된다.
이하에서는, 첨부하는 도면을 참조하여, 본 발명의 최적의 실시양태를 비롯하여 본 발명의 실험 원리를 추가로 상세히 설명할 것이나, 이는 단지 예로서 제시된 것이다.
실시예 1 - 유전자 클러스터 클로닝
악티노플레인스 가르바디넨시스 및 악티노플레인스 리구리애로부터의 액타가르딘 생합성 유전자 클러스터 동정 및 클로닝
O/SBDIG-1은 48개의 염기로 구성된, 디곡시제닌(DIG: digoxigenin)-표지된 축퇴성 올리고뉴클레오티드이다. 이는 액타가르딘의 공지된 아미노산 서열을 번역시키고, 악티노플레인스에 대한 코돈 사용 빈도를 고려하여 디자인되었다. 악티노플레인스 가르바디넨시스로부터 단리되고, 제한 효소 NcoI를 사용하여 분해된 게놈 DNA의 써던 혼성화 분석을 통해 O/SBDIG-1에 혼성화되는 ~3kb 단편을 동정하였다. 게놈 DNA의 NcoI 분해를 반복하고, ~3kb의 DNA 단편을 단리하고, NcoI으로 절단된 pLITMUS28 (NEB) 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 E. 콜라이 DH10B 세포 내로 도입한 후, 프로브 O/SBDIG-1을 사용하여 써던 혼성화 분석을 실시하였다. 혼성화하는 클론을 동정하고, 서열을 분석하였다. 서열 분석을 통해 pLITAG01로 명명되는 상기 플라스미드는 액타가르딘 생합성에 대한 lanA 구조 유전자를 코딩하는 DNA(actA)와, ABC 당 수송체의 일부를 코딩하는 것으로 간주되는 상류 영역 및 lan M을 부분적을 코딩하는 하류에 있는 영역(actM)으로 구성된다는 것이 밝혀졌다.
프라이머 O/ACT08F 및 O/ACT09R은 pLITAG01로부터의 서열에 기초하여 디자인되었다. DIG-표지된 dNTPs(Roche) 및 주형으로서 pLITAG01과 함께 PCR 반응에서 상기 프라이머를 사용함으로써 2296bp DIG-표지된 DNA 단편을 생성하고, 이를 SBDIG-2로 명명하였다.
BamHI를 사용하여 앞서 분해된 코스미드 SuperCos1(Stratagene) 내로 악티노플레인스 가르바디넨시스 ATCC 31049 및 악티노플레인스 리구리애 NCIMB 41362로부터 얻은, Sau3AI로 분해된 게놈 DNA를 클로닝하여 2개의 코스미드 라이브러리를 생성하였다. 각 코스미드 라이브러리는 SBDIG-1를 사용하여 써던 혼성화로 분석하였다. SBDIG-1에 혼성화하는 것으로 간주되는 것으로, 각 라이브러리로부터 얻은 25 개의 코스미드를 선별하고, 프로브 O/SBDIG-1 및 SBDIG-2를 사용하여 써던 혼성화로 재분석하였다. 악티노플레인스 가르바디넨시스로부터 얻은 게놈 DNA로부터 유래된 9개의 코스미드, 및 악티노플레인스 리구리애로부터 얻은 게놈 DNA로부터 유래된 11개의 코스미드는 2개의 프로브 모두에 혼성화되었다. 각 코스미드로부터 DNA를 단리하고, 프라이머 T3 및 T7을 사용하여 서열 분석하였다. 이어서, 코스미드 CosAL02 및 CosAG14의 전체 선열을 분석하였다(Sequencing facility, Department of Biochemistry, University of Cambridge).
재료 및 방법
균주
본 발명에 사용한 박테리아 균주는 도 5에 요약되어 있다.
벡터
코스미드 SuperCos1은 스트라진(Stratagene)으로부터 입수하였다.
플라스미드 pLITMUS는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터 입수하였다.
프라이머
Figure 112008052958573-pct00002
써던 혼성화
DNA 프로브 표지화
로슈(Roche)로부터 공급받은 디곡시제닌(DIG) PCR DNA 표지 및 검출용 키트를 그의 설명서에 따라 사용함으로써 DNA 혼성화 프로브를 제조하였다.
DNA를 나일론 막으로 옮김
먼저, 관심의 대상이 되는 DNA를 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, 진공 블로터(Q BIO gene)를 사용하여 나일론 막(Hybond-N, 영국에 소재하는 Amersham Int.)으로 옮겼다. 0.5 M HCl를 사용한 DNA의 탈퓨린 반응에 소요되는 시간은 브로모페놀 블루 마커 밴드가 완전하게 황색으로 변색될 때까지 걸린 시간(전형적으로, 0.7% 아가로스 겔의 경우 15-20분)에 의해 판단하였다. 이어서, 1.5 M NaCl, 1.5 M NaOH를 사용하여 DNA를 전체적으로 변성시키고, 각각 추가의 15-20분 동안 0.5 M Tris, 1.5 M NaCl(pH 8.0)을 사용하여 중화시켰다. 최소 60분 동안 20 x SSC를 충분히 제공하여(flooding) DNA의 완전한 블롯팅을 촉진시켰다. 블롯팅된 막을 진공 상태로부터 수거한 후, 이를 실온에 방치하여 대기 건조시켰다. UV 투과조명기(UVP) 상에 막(DNA 면이 아래로 향하게)을 놓고, 5분 동안 365 nm의 파장에서 UV에 노출시켜 DNA를 가교 결합시켰다.
콜로니 리프트 및 혼성화
혼성화에 의해 스크리닝하고자 하는 콜로니를 나일론 막(Roche diagnostics)으로 옮겼다. 양 전하를 띤 나일론 막을 콜로니 위에 놓고, 효과적으로 옮겨지도록 하기 위하여 1분간 단단히 눌렀다. 기준점을 막 위에 마킹하여 콜로니와 관련된 그의 배향을 표시하였다. 이후, 막을 수거하고, 로슈의 사용자 설명서(필터 혼성화용 DIG 사용 설명서)에서 지시하는 바에 따라 혼성화용으로 제조하였다.
혼성화 및 막 현상
68℃의 HB-1000 혼성화용 오븐(UVP)에서 밤새도록(~16hr) DNA를 제조된 프로브와 함께 혼성화시켰다. 혼성화 이후, 막을 2 x 염 시트르산나트륨(SSC: salt sodium citrate) + 0.1% 황산도데실나트륨(SDS: sodium dodecyl sulphate)을 사용하여 실온에서 5분간의 2주기 동안 막을 세척하였다. 상기와 같이 세척한 후, SBDIG-1 존재하에 혼성화된 막에 대해서 1 x SSC + 0.1% SDS를 사용하여, 그리고, SBDIG-2를 사용하여 스크리닝된 막에 대해서 0.1 x SSC + 0.1% SDS를 사용하여 68℃에서 2 x 15분으로 2차의 일련의 세척을 실시하였다. 이어서, 로슈의 사용자 설명서(필터 혼성화용 DIG 사용 설명서)에서 권고된 바에 따라 막을 현상시켰다.
소프트웨어
일치 서열은 프레임플로트(FramePlot) 버전 2.3.2, 바이오에디트(BioEdit) 서열 정렬 편집기, 클러스탈W(ClustalW)(EMBL-EBI) 및 베이직 로컬 얼라이먼트 서치 툴(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST, NCBI)을 사용하여 분석하였다.
결과 및 고찰
CosAG14
코스미드, CosAG14는 악티노플레인스 가르바디넨시스로부터 단리된 게놈 DNA의 38168bp 단편을 함유한다. 서열 분석을 통해 리더 및 액타가르딘 프리펩티드를 코딩하는 DNA를 동정하고, 이 유전자를 명칭 actA로 명명하였다. 2개의 알라닌 잔기는 액타가르딘 프리펩티드의 상류 바로 앞에 존재한다. 이들 잔기가 액타가르딘 으로부터 리더 펩티드의 프로테아제 절단에 대한 인식 부위를 나타내는 것으로 간주된다. 이 위치에서의 부분적인 절단으로 알라닌은 유지되는데, 이것이 악티노플레인스 가르바디넨시스의 발효 브로쓰에서 통상 관찰되는 ala-액타가르딘을 생산시킨다고 간주된다. actA 유전자 하류에는 3162bp의 DNA 영역이 존재하는데, 이는 예를 들면, 머사시딘 유전자 클러스터로부터의 mrsM(30% 동일성)과 같은 수개의 lanM 단백질과 강한 서열 유사성을 갖는다. 이러한 추정 유전자를 actM으로 명명하고, 이는 액타가르딘 프리펩티드의 변형, 촉매적인 탈수, 및 티오에테르 형성에 관여하는 것으로 간주된다. actO로 명명되는 것으로서, actM으로부터 11bp 만큼 하류에 위치하는 오픈 리딩 프레임은 수개의 루시퍼라제형 모노옥시게나제와 서열 유사성(~39% 동일성)을 갖는 341-아미노산 단백질을 코딩한다. ActO인 모노옥시게나제는 산소를 혼입시켜 데옥시-액타가르딘으로부터 액타가르딘을 생성하는 것으로 촉진시키는 역할을 하는 것으로 간주된다. actR로 명명되는 오픈 리딩 프레임은 actO에 대해 역 배향으로 존재하고, 62bp 하류에 위치한다. 이러한 orf의 단백질 산물은 수개의 2-성분 반응 조절 인자와 서열 유사성(~37% 동일성)을 보인다. ABC 수송체 퍼미아제에 대하여 서열 유사성(~25% 동일성)을 보이는 추정 812개의 아미노산 단백질은 789bp 하류에 위치하고, actR과 동일한 배향으로 존재한다. actT로 명명되는 이러한 추정 단백질이 잠재적으로 세포로부터 변형된 란티바이오틱을 유출시킨다. actT로부터 하류에 있는 2번째 및 4번째 아미노산 서열은 각각 반응 조절 인자 키나제 및 페니실린 결합 단백질과 유사성(~30% 동일성)을 나타낸다. 리스테리아 모노사이코겐(Listeria monocytogene)에서 니신 생합성 유전자 클러스터에 관한 최근 연구(문헌 [Gravesen et al., 2004])를 통해 페니실린-결합 단백질과, 기능이 알려져 있지 않은 단백질과 함께 히스티딘 키나제가 니신 내성을 부여하는데 관여한다고 입증되었다. actA에 매우 근접한 위치 내에 유사한 유전자가 존재한다는 것은 이들 유전자가 액타가르딘 내성 기전에 관여한다는 것을 지시할 수 있다.
CosAL02
코스미드 CosAL02는 악티노플레인스 리구리애로부터 단리된 게놈 DNA의 40402bp 단편을 함유한다. 서열 분석을 통해 코스미드 CosAG14에서 동정된 actA 유전자와 강력한 서열 상동성(50개의 잔기가 동일)을 갖는, 64-아미노산 단백질을 코딩하는 lanA 유전자를 동정하게 되었다. 본 발명자들은 이러한 lanA 유전자 종을 ligA로 명명하였다. 이러한 ligA의 프리펩티드 서열은 하기 나타낸 두 유전자(서열 번호 119 및 서열 번호 212)의 정렬에서 표시되어 있는 2개의 잔기가 액타가르딘의 것과 상이하다:
Figure 112008052958573-pct00003
V15L 및 I16V 돌연변이는 액타가르딘과 동일한 질량을 갖는 단백질을 생성할 수 있는 바, 질량 분광법(lc-ms) 분석에 의해서는 식별되지 못할 것이다. CosAL02에서 동정된 lanA 유전자의 잠재적인 산물이 신규한 란티바이오틱을 나타낸다. ligA으로부터 321bp 만큼 상류에 존재하는 오픈 리딩 프레임은 스트렙토마이세스 글라우체센스(Streptomyces glaucescens)의 StrR 단백질과 서열 유사성(46% 동일 성)을 보이는 추정 286-아미노산 단백질을 코딩한다. StrR 단백질은 스트렙토마이신 유전자 발현 조절에 관여하는 경로-특이성 DNA 결합 활성 인자이다. ligA 하류에 존재하는 orf의 서열 유사성(31% 동일성)은, 잠재적으로 ligA 프리펩티드의 변형에 관여하는 1046-아미노산 lanM 폴리펩티드(하기에서 "ligM"으로 명명됨)를 코딩한다는 것을 제안한다. 다음의 하류에 있는 오픈 리딩 프레임의 개시 코돈인 lanT(ligT)는 ligM의 개시 코돈과 중복된다. LigT는 수개의 ABC-수송체와 서열 유사성을 갖는 575개의 아미노산 단백질이다. LanT 단백질은 최종의 성숙한 산물 또는 여전히 그의 리더 서열에 부착된, 번역후 변형된 산물을 분비시킨다. 코스미드, CosAG14에서 관찰되는 바와 같이, ligT로부터 하류에 있는 다음 orf는 루시퍼라제형 모노옥시게나제와 서열 유사성(~38% 동일성)을 갖는 347개의 아미노산 단백질을 코딩한다. 이러한 추정 모노옥시게나제(ligO)가 산소 혼입과 설폭시드 결합 형성에 관여하는 것으로 간주된다. 수개의 2-성분 반응 조절 인자와 서열 유사성(~37%)을 보이는 추정 217개의 아미노산 단백질은 ligO 하류에 위치하고 역 배향으로 존재한다. 이러한 추정 조절 인자를 ligR로 명명하였다.
표 1. CosAG14 주석(악티노플레인스 가르바디넨시스로부터 단리된 38168bp 단편. SuperCos1 벡터 골격 서열은 생략한다)
Figure 112008052958573-pct00004
Figure 112008052958573-pct00005
표 2. CosAL02 주석(악티노플레인스 리구리애로부터 단리된 40402bp 단편. SuperCos1 벡터 골격 서열은 생략한다)
Figure 112008052958573-pct00006
Figure 112008052958573-pct00007
실시예 2 - 발현 카세트
발현 카세트 생성
본 실시예는 본 발명에 따른 발현 카세트의 생산에 관하여 예시한다. 본 발명의 변이체 lanA 유전자를 효과적으로 생성하기 위하여 이러한 발현 카세트, 플라스미드 pAGvarX를 디자인하고, 이후, 예로서, 야생형 actA가 제거된 악티노플레인스 가르바디넨시스 균주(악티노플레인스 가르바디넨시스 ΔactA)와 같은 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 벡터 pSET152(문헌 [Bierman et al., 1992])의 유도체는 이러한 플라스미드를 attP 부착 부위를 통해 숙주의 염색체 내로 통합될 것이다. 숙주 유기체에 의해서 액타가르딘 생합성 유전자 클러스터의 남은 야생형 유전자와 함께 돌연변이화된 actA 유전자가 발현됨으로써 액타가르딘 변이체가 생성되어야 한다.
플라스미드 pAGvarX 작제
달리 언급하지 않는 한, 인용되는 모든 위치는 서열 번호 100에 관한 것이다. 플라스미드 pAGvarX 작제에 관한 도식은 도 3에 제시되어 있다. 21237번 위치에 있는 actA 상류에 위치하는 orf에 인접한 염기부터 21672번 위치에 있는 actA 코딩 영역 내의 루신 잔기까지를 프라이머 O/AGvar01bF 및 O/AGvar02bR(프라이머 표)와, 프라이머로서 pLITAG01을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 5' 말단 측면에 위치하는 XbaI 부위 및 BglII 부위를 침묵 돌연변이화를 통해 actA를 코딩하는 3' 루신 부위에 도입하기 위하여 프라이머를 디자인하였다. SmaI를 사용하여 앞서 분해된, 탈인산화된 pUC19로 상기 단편을 도입하여 pAGvar1을 수득하였다.
actA의 C-말단으로부터 인접한 하류 orf(21758과 21836을 포함하여 (21758-21836)에 이르는 DNA 영역을, 프라이머 O/AGvar05F 및 O/AGvar06R과, 주형으로서 pLITAG01을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 5' 위치의 측면에 위치하는 AvrII 부위 및 3' 말단의 EcoRI 부위를 도입하기 위하여 프라이머를 디자인하였다. SmaI를 사용하여 앞서 분해된, 탈인산화된 pUC19로 생성된 PCR 산물을 클로닝하여 pAGvar2를 수득하였다. 이어서, 플라스미드 pAGvar1 및 pAGvar2를 XbaI를 사용하여 분해하고, pAGvar1로부터 PCR 단편을 회수하고, 탈인산화되고, XbaI를 사용하여 분해된 pAGvar2로 클로닝하고, 이입된 단편의 정확한 배향은 제한 분석에 의해 측정하였다. 이어서, BglII 및 AvrII를 사용하여 생성된 플라스미드 pAGvar3을 분해하고, 어닐링된 올리고뉴클레오티드 O/AGvar03F 및 O/AGvar04R에 결찰시켜 pAGvar4를 생성하였다. 이어서, EcoRI 및 XbaI를 사용하여 플라스미드 pAGvar4를 분해하고, EcoRI 및 XbaI를 사용하여 앞서 분해된 pSET152 내로 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 생성된 ~620bp 단편을 도입하여 벡터 pAGvarX를 수득하였다.
각각의 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 작제된 pAGvarX 영역은 액타가르딘 펩티드와 관련하여 아미노산 6과 7(각각 C 및 T)에 침묵 돌연변이화를 통해 BsrGI 부위를 도입한다. 이 부위는 상류의 BglII 부위 또는 하류의 AvrII 부위와 함께, 표적된 돌연변이를 코딩하는 DNA를 actA 펩티드내 코딩되는 임의의 아미노산으로 도입하는데 사용될 수 있다.
실시예 3 - 숙주 세포
본 실시예은 lanA 유전자가 불활성화되어 있는 란티바이오틱 생산 숙주 세포 생산에 관하여 예시한다. 본 실시예에서, 숙주 세포는 actA 유전자가 결실되어 있는 악티노플레인스 가르바디넨시스이다.
균주 악티노플레인스 가르바디넨시스 ΔactA
액타가르딘 구조 유전자 actA의 변이체를 발현시키는데 숙주로서 균주 악티노플레인스 가르바디넨시스 ΔactA가 사용된다. 이러한 균주는 (Gust et al., 2002)에 의해 개발된 리디렉트(Redirect) 기술을 사용하여 야생형 악티노플레인스 가르바디넨시스로부터 생성되었다. 먼저, actA를 코딩하는 코스미드 CosAG14로부터의 DNA 영역을 카세트 SBdel-1로 대체하였다. SBdel-1는 아프라마이신 내성 유전자(aac(3)IV) 및 FLP 인식 표적(FRT: FLP recognition target) 부위 측면에 위치하 는 oriT로 구성되고, 이는, 주형으로서 플라스미드 pIJ773과 함께, 각각 서열 번호 100의 21536 및 21802에 결합하는 프라이머 O/SB50F 및 O/SB51R를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 리디렉트 프로토콜(문헌 [Gust et al., 2004])에 따라 CosAG14의 actA를 SBdel-1로 대체시켜 코스미드 CosAG14ΔA를 생성하였다. 이어서, 리디렉트 프로토콜 단계 7에 따라 FLP-매개 절단에 의해 SBdel-1 카세트의 중심부를 CosAG14ΔA로부터 제거하여 CosAG14ΔB를 생성하였다. 이러한 영역을 제거함으로써 비극성의 비마킹된 프레임내 결실을 생성할 수 있을 뿐만 아니라 동일한 내성 마커를 반복적으로 사용할 수 있다(문헌 [Gust et al., 2003]).
작제 제2 단계는 코스미드를 조작하여 접합에 의해 상기 코스미드를 악티노플레인스 가르바디넨시스 내로 도입할 수 있도록 하는 것이었다. 먼저 형질전환에 의해 CosAG14ΔB를 E. 콜라이 균주 BW25113/pIJ790 내로 삽입시킴으로써 이를 개시하였다. 이어서, 리디렉트 프로토콜(문헌[Gust et al., 2004])에 따라 CosAG14ΔB의 앰피실린 유전자를 SBdel-2로 대체하여 코스미드 CosAG14ΔC를 생성하였다. SBdel-1과 유사한, 카세트 SBdel-2는 아프라마이신 내성 유전자(aac(3)IV) 및 FRT 부위 측면에 위치하는 oriT를 수용하지만, 주형 pIJ773과 함께 프라이머 O/SB52F 및 O/SB53R을 사용하여 생성되었다.
리디렉트 프로토콜(문헌 [Gust et al., 2004]; 또한, 하기 문단을 참조할 수 있다)에 따라 악티노플레인스 가르바디넨시스와 접합시키기 이전에 CosAG14ΔC를 사용하여 E. 콜라이 ET12567/pUZ8002의 전기적격 세포를 형질전환시켰다. actA 유전자가 야생형 생산자의 염색체로부터 제거된, 생성된 균주는 악티노플레인스 가르 바디넨시스 ΔactA이다.
더욱 상세하게, 상기 악티노플레인스 가르바디넨시스 ΔactA 균주를 수득하기 위하여 악티노플레인스 가르바디넨시스와 접합시키기 이전에 CosAG14ΔC를 사용하여 E. 콜라이 ET12567/pUZ8002의 전기적격 세포를 형질전환시켰다. 아프라마이신 내성 외부 접합체를 수득하고, 아프라마이신을 포함하지 않는 TSB에서 6회에 걸쳐 반복적으로 성장시켜 계대배양하였다. 배양물 6으로부터의 세포를 배지 65 상에 플레이팅시키고 30℃에서 인큐베이션하였다. 5일 경과 후, 배지 65 상의 대략 1㎠ 면적에 걸쳐 콜로니를 옮기고 패치 아웃하였다. 30℃에서 3일간 인큐베이션한 후, 최종 농도 50㎍/ml로 아프라마이신을 함유하는 배지 65로 패치된 세포를 옮겼다. 30℃에서 72시간 동안 인큐베이션한 후, 아프라마이신에 감수성인 세포를 선별하고, 각 패치를 사용하여 10ml TSB를 함유하는 50ml 플라스크에 접종하고 30℃, 250rpm에서 4일 동안 배양하였다. 각 배양물로부터 게놈 DNA를 제조하고, 올리고뉴클레오티드 O/AGvar01bF 및 O/AGvar06r을 사용하여 PCR에 의해 분석하였다. actA 유전자가 결실된 것과 일치하는 크기를 갖는 PCR 산물이 생성되었다. 동시에 hplc에 의해 발효 브로쓰를 분석함으로써 이들 동일 샘플은 액타가르딘을 생산하지 않았음이 입증되었다.
실시예 4 - 이종성 발현
본 실시예는 비생산자 세포, 스트렙토마이세스 리비단스인 숙주 세포에서 서열 번호 100 유전자 클러스터로부터 액타가르딘 발현에 관하여 예시한다. 상기 숙주 세포는 이들 2개의 펩티드의 활성 변이체를 생산하는 대안적 수단을 제공한다.
액타가르딘 및 데옥시-액타가르딘 B의 생산을 코딩하는 생합성 유전자 클러스터를 함유하는 코스미드 CosAG14 및 CosAL02는, 이종성 숙주로의 접합 전달을 촉진시키는데 필요하는 전달 기점(oriT)을 갖고 있지 않다. 리디렉트 기술(문헌 [Gust et al., 2002])을 사용하여, 네오마이신 내성 유전자, neo를 대체함으로써 파지 부착 부위 attP 및 인테그라제(int)와 함께 oriT를 CosAG14 및 CosAL02의 SuperCos1 골격 내로 도입할 수 있다.
이종성 발현용 벡터 작제
코스미드 pMJCOS1(노리치에 소재하는 JIC)은, 네오마이신 내성을 코딩하는 유전자가 oriT, attP, 인테그라제(int) 및 아프라마이신 내성 유전자(aac(3)IV)를 코딩하는 DNA를 포함하는 카세트(HEapra)로 대체된 SuperCos1(Stratagene)의 유도체이다. pMJCOS1을 SspI로 분해하고, 아가로스 겔로부터 DNA를 회수하여 카세트 HEapra를 단리하였다. 문헌 [Gust et al., 2004]에 기재된 바와 같은 리디렉트 프로토콜에 따라 CosAG14 및 CosAL02와 함께 상기 카세트를 사용하여 각각 코스미드 CosAG14HEapra 및 CosAL02HEapra를 생성하였다.
이어서, 접합을 통해 코스미드 CosAG14HEapra를 스트렙토마이세스 리비단스 내로 도입하였다. 스트렙토마이세스 리비단스/CosAG14HEapra의 아프라마이신 내성 외부 접합체를 단리하였다. 3개의 외부 접합체를 사용하여 TSB 시드 배지에 접종하였다. 대조군을 제공하기 위하여 스트렙토마이세스 리비단스, 악티노플레인스 가르바디넨시스 및 악티노플레인스 리구리애를 동시에 배양하였다. 48시간 동안 인큐베이션한 후, 시드 배양물을 사용하여 각종의 상이한 생산 배지 4개, 즉, AAS1, GM1, GM3 및 TSB에 접종하였다. 이들 배양물을 총 9일간 30℃에서 인큐베이션하였으며, 5, 7 및 9일간 인큐베이션한 후에는 각 플라스크로부터 1.5ml의 분취량을 수거하였다. 분취량을 10분 동안 14000rpm(IEC 마이크로맥스 벤치탑 원심분리기)에서 원심분리시킨 후, 상등액을 버리고, 생물검정법 및 HPLC-MS 분석에는 희석시키지 않고 사용하였다.
생물학적으로 활성인 화합물(들)의 존재를 표시하는 억제대(무리(haloes))는, 코스미드 CosAG14HEapra를 함유하는 스트렙토마이세스 리비단스(스트렙토마이세스 리비단스/CosAG14HEapra)의 상등액이 로딩된 모든 웰 주위에서 관찰되었는데, 단, 예외적으로, TSB중 발효물로부터의 상등액이 로딩된 웰에서는 어떤 무리도 생성되지 않았다. 4개의 배지중 임의의 것에서 배양된 스트렙토마이세스 리비단스의 발효물로부터의 상등액이 로딩된 웰 주위에서는 어떤 생물학적 활성도 관찰되지 않았다. 성장이 입증된 악티노플레인스 리구리애 및 악티노플레인스 가르바디넨시스의 배양물로부터의 상등액이 로딩된 모든 웰 주위에서 무리가 뚜렷이 나타났다. 일반적으로 무리의 직경은 감소한 것이 뚜렷이 나타났지만, 5일째의 샘플링 첫째날부터 9일째까지 무리는 모두 일관되게 생성되었다.
스트렙토마이세스 리비단스/CosAG14HEapra의 발효물로부터의 상등액의 HPLC-MS 분석을 통해 ala(O)액타가르딘에 상응하는 체류 시간과 질량을 갖는 피크가 존재함을 확인하였다. 스트렙토마이세스 리비단스만의 상등액에는 이와 동일한 피크는 존재하지 않았다. 표 3은 스트렙토마이세스 리비단스, 스트렙토마이세스 리비단스/CosAG14HEapra, 악티노플레인스 가르바디넨시스 및 악티노플레인스 리구리애를 5일 동안 인큐베이션한 후, 그의 발효물로부터의 상등액을 HPLC-MS 분석한 결과를 요약한다.
표 3:
Figure 112008052958573-pct00008
실시예 5 - 항균 활성
MIC 측정
본원 상기에 개시되어 있는 바와 같이 생산된 변이체 선별물을 각종 박테리아에 대한 활성에 대하여 추가로 시험하였다. 스트렙토코커스 뉴모니애를 제외한 모든 유기체의 최소 억제 농도(MIC: minimum inhibitory concentration)는 최종 칼슘 농도 400㎍/ml로 무수 염화칼륨으로 보충된 뮐러-힌톤 브로쓰(MHB: Mueller-Hinton broth)에서 2배로 희석된 일련의 항생제 희석액에 의해 측정하였다. S. 뉴 모니애에 대한 최소 억제 농도(MIC)는 400㎍/ml 염화칼륨 이수화물로 보충된 뇌-심장 침출배지(BHI: Brain Heart Infusion) 브로쓰에서 2배로 희석된 일련의 항생제 희석액에 의해 측정하였다. 항미생물제 저장액을 제조하고, NCCLS 표준 M7-A6에 따라 저장하였다.
McFarland 0.5 표준과 등가인 것으로서, 600nm에서의 흡광도가 0.2 - 0.3이 되도록 조정하여 활성 배양 브로쓰 배양물을 105 내지 106 CFU/ml 함유하도록 희석시켰다. 이어서, 브로쓰중 1:100으로 추가 희석시켰다. 본 검정법은 64㎍/ml 내지 0.06㎍/ml 범위의 농도 범위에서 총 용량 200㎕(160㎕ 브로쓰, 20㎕ 항생제, 20㎕ 접종물)로 멸균 96웰 미량적정 플레이트에서 이중으로 실시하였다. 미량적정 플레이트중 12번째 웰은 항미생물제를 함유하지 않았다. 정성 대조군에 대한 기준 항생제로서 반코마이신을 사용하였다. 플레이트를 18 - 20시간 동안 37℃에서 진탕시키면서 호기성 조건하에 인큐베이션하였으며, MIC는 가시적 성장을 일으키지 않는 약물의 최소 농도로서 정의된다.
Figure 112008052958573-pct00009
실시예 6 - NMR 분석
액타가르딘 및 데옥시 - 액타가르딘에 대한 NMR 연구
성공적으로 NMR 분광법(COSY, TOCSY, HSQC 및 NOESY)을 사용함으로써 액타가르딘(악티노플레인스 가르바디넨시스) 및 데옥시-액타가르딘 B(악티노플레인스 리구리애) 생산자로부터 수득한 서열 분석 결과를 확인하였다. 수득한 데이타를 통해 모든 잔기를 완벽하게 명백히 지정할 수는 없었지만, 이는 도 4에 나타낸 구조와 일치하였고, 악티노플레인스 리구리애로부터의 데옥시-액타가르딘 B가 15번 및 16번 위치에 각각 Leu 및 Val을 갖는다는 것을 확인하는데는 충분하였다.
실시예 7 - 유도체 합성
Z 기와 C-말단 아미드는 하기와 같은 데옥시-액타가르딘 B의 하기 유도체를 제조하였다:
Figure 112008052958573-pct00010
화합물 I - XI의 합성법은 하기와 같았다:
일반적인 방법 1. 화합물 I - III의 제조
건식 디메틸포름아미드(0.8ml)중 데옥시-액타가르딘 B(20mg, 11nmol), 적절한 아민(11nmol) 및 디이소프로필에틸아민(7.2㎕, 70nmol) 용액에 건식 디메틸포름아미드(1.0ml)중 200㎕의 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사프루오로포스페이트(PyBop)(70mg, 134nmol) 용액을 가하였다. 출발 물질 모두가 소비될 때까지 추가 분취량의 Pybop 용액을 가하면서 반응 진행 과정에 따라 HPLC에 의해 혼합물을 분석하였다. 이 단계에서 HPLC 분석은 또한 가변량(5-20%)의 디아미드를 나타내었다. 반응 종결 후, 혼합물을 20mM Kpi의 수성 인산염 완충액(pH 7)(10ml)중 30% 아세토니트릴로 희석시키고, 표 4에 기술된 조건을 사용하여 분취용 HPLC에 의해 모노아미드를 정제하였다. 적절한 분획을 그의 원 용량의 25%까지 농축시키고, 미리조절된 C18 본드 엘루트(C18 Bond Elut) 칼럼(500mg)에 로딩하여 탈염시킨 후, 이어서 2 칼럼 용량의 30, 40, 70 및 90% 수성 메탄올을 사용하여 순차적으로 용리시킴으로써 세척하였다. 적절한 분획을 증발시킴으로써 백색 고체로서 원하는 산물을 수득하였다.
화합물 I : 데옥시 - 액타가르딘 B N-[3-디메틸아미노프로필] 모노카복스아미 드 는 일반적인 방법 1에 따라 데옥시액타가르딘 B와 3-(디메틸아미노)프로필아민을 커플링함으로써 수득하였다.
수득량 18mg, 85% 수율. [M+2H 2+] 계산치 979.0, 관측치 980.2
화합물 II : 데옥시 - 액타가르딘 B N-[1-(1- 메틸 -4- 피페리디닐 )피페라진] 모 노카복스아미드 는 일반적인 방법 1에 따라 데옥시액타가르딘 B와 4-(피페리디노)피 페라진을 커플링함으로써 수득하였다.
수득량 8mg, 37% 수율. [M+2H 2+] 계산치 1019.5, 관측치 1020.0;
[M+3H 3+] 계산치 680.0, 관측치 680.0
화합물 III : 데옥시 - 액타가르딘 B [1-(3-디메틸아미노프로필)피페라진] 모노카복스아미드 는 일반적인 방법 1에 따라 데옥시-액타가르딘 B와 1-(3-디메틸아미노프로필)피페라진을 커플링함으로써 수득하였다.
수득량 10mg, 46% [M+2H 2+] 계산치 1013.5, 관측치 1014.0
일반적인 방법 2. 화합물 IV - IX 의 제조
건식 디메틸포름아미드(0.4ml)중 적절한 Fmoc 보호된 아미노산(34nmol) 용액을 건신 디메틸포름아미드(0.4ml)중 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사프루오로포스페이트(PyBop)(11.4mg, 22nmol) 및 디이소프로필에틸아민(11㎕, 68nmol) 용액으로 처리하였다. 이어서 혼합물을 건식 디메틸포름아미드(0.5ml)중 데옥시-액타가르딘 B(2mg, 11nmol) 용액에 가하였다. 혼합물을 시간 동안 실온에 방치한 후, 분석 HPLC(20mM Kpi 수성 인산염 완충액(pH 7)중 30-65% 아세토니트릴)를 통해 출발 물질이 완전하게 전환되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 40% 수성 메탄올(20ml)로 희석시키고, 2 칼럼 용량의 100% 메탄올에 이어, 2 칼럼 용량의 물로 세척함으로써 미리조절된 C18 본드 엘루트 칼럼(500mg)에 혼합물을 통과시켰다. 순차적으로 2 칼럼 용량의 40, 50, 60, 70, 80, 90 및 100% 수성 메탄올을 사용하여 칼럼을 용리시켰다. HPLC에 의해 분획을 분석하고, Fmoc-보호된 커플링 산물을 함유하는 분획을 증발건조시켰다. 잔류물을 디메틸포름아미드(1ml)에 용해시키고, 피페리딘(50㎕)을 가하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 반응 진행 과정을 HPLC에 의해 모니터하고, 출발 물질이 완전히 소비된 후에 용액을 30% 수성 메탄올(20ml)로 희석시켰다. 이어서, 앞서 기술된 바와 같이 C18 본드 엘루트 카트리지(500mg)를 통해 혼합물을 용리시키고, 적절한 분획을 증발시킨 후에 수득한 산물은 표 4에 기술된 조건을 사용하여 분취용 HPLC에 의해 추가로 정제하였다. 적절한 분획을 그의 원 용량의 25%까지 농축시키고, 미리조절된 C18 본드 엘루트 칼럼(500mg)에 로딩하여 탈염시킨 후, 이어서 2 칼럼 용량의 30, 40, 70 및 90% 수성 메탄올을 사용하여 순차적으로 용리시킴으로써 세척하였다. 적절한 분획을 증발시킴으로써 백색 고체로서 원하는 산물을 수득하였다.
화합물 IV : D- Ala (0) 데옥시 - 액타가르딘 B 는 일반적인 방법 2에 따라 데옥시-액타가르딘 B와 Fmoc-D-알리닌으로부터 74% 수율로 제조되었다.
[M+2H 2+] 계산치 972.5, 관측치 973.0
043/188
화합물 V : L- Ile (0)데옥시- 액타가르딘 B 는 일반적인 방법 2에 따라 데옥시-액타가르딘 B와 Fmoc-L-이소루신으로부터 27% 수율로 제조되었다.
[M+2H 2+] 계산치 993.5, 관측치 993.8
화합물 VI : L- Val (0)데옥시액타가르딘 B 는 일반적인 방법 2에 따라 데옥시-액타가르딘 B와 Fmoc-D-발린으로부터 55% 수율로 제조되었다.
[M+2H 2+] 계산치 986.5, 관측치 985.9.
화합물 VII : L- Phe (0)데옥시액타가르딘 B 는 일반적인 방법 2에 따라 데옥시-액타가르딘 B와 Fmoc-D-페닐알리닌으로부터 22% 수율로 제조되었다.
[M+2H 2+] 계산치 1010.5, 관측치 1010.9.
화합물 VIII : L- Lys (0)데옥시액타가르딘 B 는 일반적인 방법 2에 따라 데옥시-액타가르딘 B와 비스(Fmoc)-L-리신으로부터 45% 수율로 제조되었다.
[M+2H 2+] 계산치 1001.0, 관측치 1001.6
화합물 IX : L- Tryp (0)데옥시액타가르딘 B 는 일반적인 방법 2에 따라 데옥시-액타가르딘 B와 Fmoc-L-트립토판으로부터 55% 수율로 제조되었다
[M+2H 2+] 계산치 1030.0, 관측치 1029.9.
실시예 8 - 추가의 항균 데이타
MIC 측정
스타필로코커스 , 스트렙토코커스 , 엔테로코커스 종
최소 억제 농도(MIC)를 측정하고, 호기성 박테리아용의 NCCLS 항미생물제 저장액을 제조하고, NCCLS 기준 미세희석 브로쓰 방법(M7-A6, 2003)에 따라 저장하였다. MIC는 뮐러-힌톤 브로쓰(MHB) 또는 뇌-심장 침출배지(BHI) 브로쓰(S. 뉴모니애)에서 2배로 희석된 일련의 항생제 희석액에 의해 측정하였다. 활성 배양 브로쓰 배양물은 멸균 브로쓰에서, 또는 직접형 콜로니 현탁액(S. 뉴모니애)에 의해 McFarland 0.5 표준(1 x 108 CFU/ml)과 등가인 혼탁도로 조정한 후, 대략 5 x 105 CFU/ml의 멸균 96웰 미량적정 플레이트에서 최종 접종물을 위해 멸균 브로쓰에서 추가로 희석시켰다. 기준 대조군 균주로서 포함된 엔테로코커스 패칼리스 ATCC 29212와, 정성 대조군에 대한 기준 항생제로서 반코마이신을 사용하여 본 검정법을 이중으로 실시하였다. 플레이트를 18 - 20시간 동안 37℃에서 진탕시키면서 호기성 조건하에 인큐베이션하였으며, MIC는 가시적 성장을 일으키지 않는 약물의 최소 농도로서 정의된다.
클로스트리듐 디피실리
C. 디피실리에 대한 최소 억제 농도(MIC)를 측정하고, 호기성 박테리아용의 NCCLS 항미생물제 저장액을 제조하고, NCCLS 기준 아가 희석 브로쓰 방법(M11-A5, 2001)에 따라 저장하였다. 윌켄스-찰그렌 아가(WCA: Wilkens-Chalgren agar)에서 2배 희석된 일련된 항생제 희석액을 제조하였다. 48시간 동안 브라지에르(Braziers)(C.C.E.Y.) 아가에서 배양된 성장물로부터 시험 유기체을 선별하고, McFarland 0.5 표준(1 x 108 CFU/ml)과 등가인 밀도로 쇠들러(Schaedler) 브로쓰에서 계대배양하고, WCA 플레이트 상의 최종 접종물은 대략 105 CFU/스폿이었다. 박테로이데스 프라질리스(Bacteroides fragilis) ATCC 25285는 기준 대조군 균주로서 포함되었고, 메트로니다졸은 정성 대조군에 대한 기준 항생제로서 사용되었다. 모든 조작은, 단지 산소에만 잠시 노출시킴으로써 미리 환원된 배지에서 주변 대기하에 이중으로 실시하였다. 플레이트를 48시간 동안 37℃에서 혐기성 조건하에 인큐 베이션하였으며, MIC는 혐기성 조건하의 대조군 플레이트 상에서의 성장과 비교하여 시험 플레이트 상에서의 성장이 외관상 현저히 감소된 약물의 농도로서 정의된다.
프로피오니박테리움 아크네스
푸라졸리돈(1-2㎍/ml)으로 보충된 웰켄스-찰그렌 아가(WCA)에서 3-7일간 배양된 성장물로부터 시험 유기체을 선별하였다. 직접형 콜로니 현탁액에 의해 P. 아크네스의 단일 콜로니를 새로운 웰켄스-찰그렌 브로쓰(WCB)에 접종하고, McFarland 0.5 표준(1 x 108 CFU/ml)에 등가인 밀도로 조정한 후, 대략 105 CFU/ml의 멸균 96웰 미량적정 플레이트에서 최종 접종물을 위해 멸균 브로쓰에서 추가로 희석시켰다. NCCLS 표준(M11-A5, 2001)에 따라 제조된 저장액을 포함하는 멸균수중에서 2배 희석되는 일련의 항생제 희석을 실시하고, 저장하였다. 정성 대조군에 대한 기준 항생제로서 반코마이신 및 클린다마이신을 사용하여 본 검정법을 이중으로 실시하였다. 플레이트를 48-72시간 동안 37℃에서 혐기성 조건하에 인큐베이션하였으며, MIC는 혐기성 조건하의 대조군 플레이트 상에서의 성장과 비교하여 시험 플레이트 상에서의 성장이 외관상 현저히 감소된 약물의 농도로서 정의된다. 모든 조작은, 단지 산소에만 잠시 노출시킴으로써 미리 환원된 배지에서 주변 대기하에 이중으로 실시하였다.
배양 배지를 50㎍/ml(여기서, 50㎍/ml 보다 높은 농도는 표시한다)의 칼슘 이온(염화칼슘과 같은 것)으로 보충하였다. 하기에 MIC 값(㎍/ml)을 나타낸다:
표 6. 엔테로코커스, 스트렙토코커스 및 스타필로코커스에 대한 MIC 값
Figure 112008052958573-pct00011
표 7. 후시딘산 내성 스타필로코커스 아우레우스에 대한 MIC 값
Figure 112008052958573-pct00012
표 8. 무피로신 내성 스타필로코커스 아우레우스에 대한 MIC 값
Figure 112008052958573-pct00013
표 9. 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 MIC 값
Figure 112008052958573-pct00014
표 10. C. 디피실리에 대한 MIC 값
Figure 112008052958573-pct00015
표 11. C. 디피실리에 대한 MIC 값
Figure 112008052958573-pct00016
재료 및 방법
실시예 2-7에 사용된 재료 및 방법은 하기와 같다:
배지
모든 완충액, 용액, 및 배지는 역삼투압수((RO: reverse osmosis) water)를 사용하여 구성되었고, 이는 1ℓ당 하기 성분들을 함유하였다:
Figure 112008052958573-pct00017
Figure 112008052958573-pct00018
생물검정법
마이크로코커스 루테우스를 냉동 저장액으로부터 10ml의 뮐러-힌톤 브로쓰로 접종하고, 200rpm에서 진탕시키면서 30℃에서 밤새도록 배양하였다. 1ml의 상기 배양물을 사용하여 300ml의 뮐러-힌톤 아가에 접종하고, 이어서, 이를 페트리 디쉬에 부었다. 콜크 보어러(cork-borer)를 사용하여, 동일한 간격으로 거리를 두고 배치된 웰(직경 6mm)을 제작한 후, 50㎕의 각 샘플을 로딩하였다. 로딩된 샘플이 확산될 때까지 생물검정법 플레이트를 층상 공기류(laminar air flow)에 두었는데, 상기 로딩된 샘플이 확산되는 시점에 플레이트를 30℃의 인큐베이터로 옮기고 밤새도록 방치해 두었다.
엔도뉴클라제 제한 분해
공급받은 완충액에서, 제조사의 가이드라인에 따라 제한 효소로 DNA를 분해하였다. 전형적으로, 분취용 분해물를 위해 5㎍의 DNA를 권고된 온도하에 3시간 동안 12 단위의 효소를 사용하여 분해시켰다. 분석용 분해물을 위해 0.5㎍의 DNA를 권고된 온도하에 2-3시간 동안 다시 2 단위의 효소를 사용하여 분해시켰다. 분해된 DNA를 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다.
외부 접합체 계대배양
패치된 외부 접합체의 아가 플러그를 사용하여 8ml TSB 및 2개의 유리 비드를 함유하는 50ml 플라스크에 접종하였다. 배양물을 10일 동안 30℃, 250rpm에서 접종한 후, 100㎕를 수거하고, 2개의 유리 비드를 함유하는 50ml 플라스크중 10ml TSB에 가하였다. 플라스크를 2일 동안 인큐베이션한 후, 1ml를 수거하고, 이를 사용하여 10ml TSB를 함유하는 50ml 플라스크에 접종하였다. 1ml의 접종물을 사용하여 총 6회의 연속 배양을 수행하였는데, 각각은 2일 동안 30℃, 250rpm에서 인큐베이션되었다. 6회째의 계대배양으로부터 얻은 세포를 20분 동안 4000rpm에서 원심분리(Heraeus Sepatech Megafuge)하여 펠릿화시킨 후, TSB에서 30초간 초음파 처리하여(MSE Sanyo Soniprep 150, 진폭 10-15 마이크론) 균사체를 파쇄시켰다. 초음파 처리된 세포의 일련의 희석액(TSB중 10-1 내지 10-5)을 배지 65에 플레이팅하고, 30℃에서 인큐베이션하였다.
이종성 발현을 위한 발효
아가 플러그 또는 250㎕의 -80℃ 글리세롤 스톡을 사용하여 각각 2개의 유리 비드, 및 8ml TSB 또는 날리딕스산으로 보충된 AAS1 매질, 및 적절한 선택 항생제를 함유하는 50ml 삼각 플라스크에 접종하였다. 2-4일 동안 30℃, 200rpm에서 인큐베이션한 후, 시드 배양물당 1.2ml(3%)를 사용하여 2개의 유리 비드를 함유하는 50ml 삼각 플라스크중 40ml의 각 생산 매질에 접종하였다. 이들 배양물을 9일 동안 30℃, 200rpm에서 인큐베이션하였다. 생물검정법 및/또는 HPLC-MS 분석에 의한 분석을 위해 각 배양물로부터 주기적으로 1.5ml의 전체 브로쓰 분취량을 수거하였다.
데옥시-액타가르딘 B의 단리를 위한 악티노플레인스 리구리애 발효
각각 2개의 유리 비드 및 50ml SV2 매질을 함유하는 250ml 삼각 플라스크에 글리세롤 스톡으로부터의 500㎕(1%)의 악티노플레인스 리구리애 세포를 접종하였다. 4일 동안 30℃, 250rpm에서 인큐베이션한 후, 시드 배양물당 12ml(3%)를 사용하여 2L 삼각 플라스크중 400ml의 GM3에 접종하였다. 이들 배양물을 9일 동안 30℃, 200rpm에서 인큐베이션하였다. 30분 동안 4000rpm(Heraeus Sepatech Megafuge)에서 원심분리하여 배양 브로쓰를 수확한 후, 세포 펠릿으로부터 상등액을 버렸다.
액타가르딘 및 Ala (O)- 액타가르딘의 단리를 위한 악티노플레인스 가르 바디넨시스 발효
각각 2개의 유리 비드 및 50ml AAS 매질을 함유하는 250ml 삼각 플라스크에 글리세롤 스톡으로부터의 500㎕(1%)의 악티노플레인스 가르바디넨시스 세포를 접종하였다. 9일 동안 30℃, 250rpm에서 인큐베이션한 후, 시드 배양물당 12ml(3%)를 사용하여 2L 삼각 플라스크중 400ml의 AAS에 접종하였다. 이들 배양물을 8일 동안 30℃, 200rpm에서 인큐베이션하였다. 30분 동안 4000rpm(Heraeus Sepatech Megafuge)에서 원심분리하여 배양 브로쓰를 수확한 후, 세포 펠릿으로부터 상등액을 버렸다.
MIC 연구를 위한 데옥시 - 액타가르딘 단리
디아이온(Diaion) HP-20 수지(50 g/L)을 가하고, 악티노플레인스 리구리애의 발효물로부터 단리된 상등액과 혼합하고, 밤새도록 4℃에 방치하였다. 현탁액을 본드 엘루트 칼럼(60ml)으로 분취하고, 수지를 4개의 상(bed) 용량의 물, 이어서, 3개의 상 용량의 25, 50, 75 및 100% 메탄올로 순차적으로 세척하였다. HPLC 분석을 통해 50, 75 및 100% 메탄올 분획내 데옥시-액타가르딘 B가 존재한다는 것을 확인하게 되었다. 이들 분획을 조합한 후, 출발 풀 용량의 대략 ¼로 농축시켰다. 2 칼럼 용량의 100% 메탄올로 세척한 후, 이어서 2 칼럼 용량의 물로 세척함으로써 미리 조절한 2개의 C18 본드 엘루트 칼럼(5g) 상에 1L의 브로쓰로부터의 농축액을 로딩하였다. 2 칼럼 용량의 50, 60, 70, 80, 90% 메탄올에 이어, 2 칼럼 용량의 100% 메탄올을 사용하여 순차적으로 칼럼을 용리시켰다. HPLC 분석을 통해 80, 90 및 100% 메탄올 분획내 데옥시-액타가르딘 B가 존재한다는 것을 확인하게 되었고, 이들 분획을 모아, 출발 용량의 ⅓로 농축시켰다. 50% 메탄올중 동량의 40mM 인산칼륨(pH 2.5)을 가한 후, 3개의 미리 조절된 SCX 본드 엘루트 칼럼(1g) 상에 고르게 로딩하였다. SCX 칼럼을 먼저 50% 메탄올중 40mM 인산칼륨(pH 2.5)으로 세척한 후, 1.5 칼럼 용량의, 50% 메탄올중 250mM 인산칼륨(pH 7.0)을 사용하여 용리시켰다. 2 칼럼 용량의 메탄올에 이어서, 2 칼럼 용량의 물로 미리 조절된 C18 본드 엘루트 칼럼(5 g) 상에 로딩하여 용리제를 탈염시켰다. 칼럼을 2 칼럼 용량의 50%에 이어 60% 메탄올로 세척하였다. 2 칼럼 용량의 각 70, 80, 90 및 100% 메탄올을 가한 후, 데옥시-액타가르딘 B를 용리시켰다. HPLC및 LC-MS 분석에 의해 확인한 바와 같은, 정제된 데옥시-액타가르딘 B를 함유하는 분획을 모아 증발건조시켰다.
악티노플레인스 리구리애의 발효물로부터 Ala(0)-데옥시액타가르딘 B의 단리
디아이온 HP-20 수지(50 g/L)를 4ℓ의 A.리구리애의 발효물로부터 얻은 상등액을 혼합하고, 밤새도록 4℃에 방치하였다. 상등액을 유리 소결 깔때기 내로 수집하고, 수지를 4개의 상 용량의 물, 이어서, 4개의 상 용량의 50% 메탄올로 순차적으로 세척하였다. 5개의 상 용량의 100% 메탄올로 세척하여 데옥시-액타가르딘 B 및 Ala(0)-데옥시액타가르딘 B를 수지로부터 용리시켰다. 100% 메탄올 분획을 원 용량의 ⅓로 농축시킨 후, 최종 농도가 60% 메탄올이 될 때까지 물을 가하여 희석시켰다. 2 칼럼 용량의 50% 메탄올로 세척하기 전에, 4개의 10g C18 본드 엘루트 칼럼 상에 생성된 용액을 로딩하였다. 2 칼럼 용량의 메탄올/0.5% 포름산을 사용한 칼럼으로부터 데옥시-액타가르딘 B-관련 성분이 용리되었다. 40ml까지 증발시켜 생성된 용리제를 농축시키고, 하기 표에 기술된 조건을 사용하여 분취용 HPLC에 의해 데옥시-액타가르딘 B로부터 Ala(0)-데옥시-액타가르딘 B를 분리하였다.
칼럼 캐피톨 HPLC 리미티드(Capitol HPLC Ltd) C18 - BDS - HL5 - 26052 15cm x 20mm
용매 A 20mM 인산칼륨(pH 5.0)중 30% ACN
용매 B 20mM 인산칼륨(pH 5.0)중 65% ACN
검출 210nm
유속 10ml/분
시간(T) = 0분 100% A
T = 1분 100% A
T = 29분 35% B
T = 30분 100% B
T = 33분 100% B
T = 34분 100% A
T = 35분 100% A
수집 출발 10분; 종결 30분; 0.5 또는 0.25분 분획
Ala(0)-데옥시-액타가르딘 B를 함유하는 분획(HPLC 및 LC-MS 분석에 의해 확인)은 상기 기술된 바와 같은 C18 본드 엘루트 칼럼을 사용하여 탈염시킨 후, 증발건조시켰다.
Ala(0)-데옥시-액타가르딘 B는 체류 시간 = 5.04분으로 칼럼으로부터 용리되었다. MS 분석을 통해 972.2 m/z (M+2H)+2인 종을 확인하였다.
MIC 연구를 위한 액타가르딘 및 Ala (O)- 액타가르딘의 단리
악티노플레인스 리구리애로부터의 데옥시-액타가르딘 B 정제에 대하여 기술된 방법을 사용하여 액타가르딘 및 Ala(0)-액타가르딘을 정제하였지만, 단, 예외적으로, SCX 본드 엘루트 단계 후에 Ala(0)액타가르딘 및 액타가르딘을 분할하기 위해서는 분취용 HPLC가 필요하였다. SCX 본드 엘루트 칼럼으로부터 얻은 용리제를 70 내지 18ml로부터 회전식 증발에 의해 농축시키고, 생성된 농축물은 표 4에 기술된 조건을 사용하여 분취용 HPLC에 의해 정제하였다. 액타가르딘 및 Ala(0)액타가르딘을 함유하는 각각의 분획(HPLC 및 LC-MS 분석에 의해 확인)은 상기 기술된 바 와 같은 C18 본드 엘루트 칼럼을 사용하여 탈염시킨 후, 증발건조시켰다.
표 4. 액타가르딘 및 Ala(0)액타가르딘을 분리하기 위한 분취용 HPLC 조건
칼럼 캐피톨 HPLC 리미티드 C18 - BDS - HL5 - 26052 15cm x 20mm
용매 A 20mM 인산칼륨(pH 7.0)중 30% 아세토니트릴
용매 B 20mM 인산칼륨(pH 7.0)중 65% 아세토니트릴
검출 268nm
유속 10ml/분
시간(T) = 0분 100% A
T = 1분 100% A
T = 19분 25% B
T = 20분 100% B
T = 25분 100% B
T = 26분 100% A
T = 30분 100% A
수집 출발 8분; 종결 20분; 1분 분획
아가로스 겔 전기영동
문헌 [Sambrook et al., 1989]에 기재되어 있는 바와 같이 DNA의 전기영동을 수행하였다. UV 광에 의해 DNA를 시각화할 수 있도록 최종 농도로 0.1㎍/ml의 에티듐 브로마이드를 함유하는 TAE 완충액에서 아가로스 겔(0.7-1%)을 제조하였다. 0.1 용량의, 10 x 아가로스 겔 로딩 용액을 샘플과 혼합하였다. 샘플을 100bp, 1 kb, 또는 람다 DNA-HindIII 분해 래더(NEB)를 따라 겔 상에 로딩하고, 1-5V/cm로 전개시켰다. 겔을 λ = 300nm에서 시각화하고, UVP 비디오 카메라를 사용하여 사진촬영하였다.
아가로스 겔로부터의 DNA 회수
아가로스 겔로부터 DNA를 절단하고, 퀴아퀵(Qiaquick) 겔 추출용 키트(Qiagen)를 사용하여 회수하고, 멸균 역 삼투압 정제수, 트리스-HCl(10mM, pH 8.5) 또는 TE 완충액에서 용리시켰다.
말단 충전
제한 효소를 사용하여 DNA를 분해함으로써 형성된 3' 말단의 오목부를 충전시키는 것은 E. 콜라이 DNA 중합효소 클레노우 단편을 사용하여 수행되었다. 전형적인 반응에서, 250μM의 각 dNTP와 함께 1㎍ DNA당 1단위의 효소를 가하였다. 15-30분 동안 25℃에서 반응물을 인큐베이션하고, 최종 농도 10mM로 EDTA를 가하여 반응을 종결시켰다.
DNA 인산화
문헌 [Sambrook et al., 1989]에 기재된 방법에 따라 37℃에서 30분 동안 PCR 산물을 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 처리하였다. 20분 동안 65℃에서 인큐베이션하여 효소를 불활성화시켰다.
선형화된 벡터의 탈인산화
선형화된 벡터의 자가 결찰을 막기 위하여 제조사의 가이드라인에 따라 새우 알칼리성 포스파타제(SAP: shrimp alkaline phosphatase)를 사용하여 5'-인산염 기를 제거하였다. 전형적인 반응에서, DNA 제한 반응의 마지막 1시간 동안 제한 혼합물에 1단위의 SAP를 가하였다. 20분 동안 65℃에서 인큐베이션하여 효소를 불활성화시켰다.
결찰
문헌 [Sambrook et al., (1989)]에 기재되어 있는 바와 같이, 총 용량 15㎕중 1단위(U)의 T4 DNA 리가제를 사용하고, 16℃에서 12-16h 동안 인큐베이션하여 DNA 결찰을 실시하였다.
박테리아 배양물 유지
최종 농도 10%로 글리세롤과 함께 -80℃에서 0.5ml의 각 배양물을 냉동시켜 생육성 세포를 글리세롤 현탁액으로서 저장하였다. 배지 65 또는 ABB13 플레이트 상의 글리세롤 스톡 또는 발효 브로쓰로부터 50㎕를 스트리킹(streaking)하여 악티노플레인스 가르바디넨시스 및 악티노플레인스 리구리애의 단일 콜로니를 수득하였다.
중합효소 연쇄 반응
스트라타진 로보사이클러 그라디언트96(Stratagene Robocycler Gradient96) 상에서 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction)을 실시하였다. 전형적인 반응으로, 100-200ng 주형 DNA를 20pmol의 각각의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 각 250μM의 dNTP와 혼합하였다. 호열성 DNA 중합효소 완충액은 제조사로부터 공급받았고, DMSO는 각 10% (v/v)의, 최종 용량 50 또는 100㎕의 반응 혼합물로 구성되었다. 1분간 변성(94℃), 1분, Y℃(어닐링) 및 30초 - 3분 신장 (72℃)의 초기 싸이클로 전형적인 반응을 시작하였는데, 이 시점에서 5 단위의 호열성 DNA 중합효소를 가하였다. 이어서, 1분간 94℃, 1분간 Y℃(어닐링) 및 X분 동안 72℃에서 30 싸이클, 및 2X분 동안 72℃에서 최종 싸이클이 수행되었다. 신장 시간 X는, Taq 중합효소가 사용될 경우, 산물 1kb당 1분이었고, Pfu 중합효소가 사용될 경우, 산물 1kb당 2분이었다. 어닐링 온도 Y는 pAGvar1 및 pAGvar2 생성시 각각 55℃ 및 49℃였다. SBdel-1 및 SBdel-2 생성된 사용된 조건은 리디렉트 프로토콜(문헌 [Gust et al., 2004])에 기재되어 있는 바와 같았다.
프라이머
Figure 112008052958573-pct00019
플라스미드 DNA 제조
적절한 항생제를 함유하는 5ml의 멸균 2TY 또는 LB에 2TY(또는 LA) 아가 플레이트로부터 채취된 단일 콜로니를 접종하여 플라스미드 DNA를 소규모로(20㎍ 미만의 시료) 제조하였다. 배양물을 37℃, 250rpm에서 밤새도록 (12-16 h) 인큐베이션하였다. 1분 동안 12,000 x g에서 원심분리하여 세포를 수집하고, 제조사의 가이드라인에 따라 위저드(Wizard)(Promega) 미니프렙(Miniprep) 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 수득하였다. 100㎍ 이하의, 보다 큰 플라스미드 DNA 시료의 경우, 30ml의 2TY 배양물을 배양하고, 제조사의 설명서에 따라 퀴아젠 미디-프렙 키트(Qiagen Midi-prep kit)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 모든 플라스미드는 제한 분석 및/또는 서열 분석의 조합에 의해 체크하였다.
코스미드 DNA 제조
적절한 항생제를 함유하는 50ml의 멸균 2TY 또는 LB에 2TY(또는 LA) 아가 플 레이트로부터 채취된 단일 콜로니를 접종하여 코스미드 DNA를 제조하였다. 배양물을 37℃, 250rpm에서 밤새도록 (12-16h) 인큐베이션하였다. 20분 동안 4,000rpm (Heraeus sepatech Megafuge 2.0R)에서 원심분리하여 세포를 수집하고, 제조사의 가이드라인에 따라 퀴아젠 미디-프렙을 사용하여 코스미드 DNA를 단리하였다.
전기적격 E. 콜라이 세포의 제조 및 형질전환
문헌 [Dower et al.. (1988)]의 방법에 의해 전기적격 E. 콜라이 DH10B를 제조하였다. 분취량(60㎕)의 적격 세포를 얼음 상에서 해동시키고, 1.8㎕의 결찰 혼합물 또는 플라스미드 DNA를 가하였다. 혼합물을 전기천공 큐베트(Sigma 0.1cm)에 놓고, 전기천공 장치(Stratagene 천공 장치-1000)로 옮겨 놓았다. 1.8kV/mm (25 μF, 200 Ω)의 전위차를 가하고, 이어서, 0.5ml의 2TY 또는 LB 배지를 가하였다. 이어서, 세포를 45-60분 동안 37℃에서 인큐베이션하여 항생제 내성 유전자을 발현시키고, 이후, 적절한 선택성 배지 상에 플레이팅하였다.
게놈 DNA 제조
문헌 [Kieser et al., 2000]에 기재되어 있는 방법을 사용하여 게놈 DNA 주형을 제조하였다.
악티노플레인스 종을 위한 접합 방법
문헌 [Heinzelmann et al. (2003)]에 기재된 방법에 따라 E. 콜라이와 악티노플레인스 종 사이의 유전자간 접합을 실시하였는데, 단, 예외적으로, 균주 E. 콜라이 ET12567/pUB307(문헌 [Flett et al., 1997]) 대신 균주 E. 콜라이 ET12567/pUB8002(문헌 [Kieser et al., 2000])가 사용되었다. 50㎍/ml 날리딕스산 및 관련된 선택성 항생제를 함유하는 배지 65 또는 ABB13 상에서 대략 1㎠의 면적에 걸쳐 외부 접합체를 옮기고, 패치 아웃하였다. 이들 플레이트를 4-7일 동안 30℃에서 인큐베이션한 후, 브로쓰 배양용 접종물로서 사용하였다.
스트렙토마이세스 종을 위한 접합 방법
문헌 [Kieser et al., 2000]에 기재되어 있는 방법에 따라 E. 콜라이와 스트렙토마이세스 종 사이의 유전자간 접합을 실시하였다. 50㎍/ml 날리딕스산 및 관련된 선택성 항생제를 함유하는 SFM 상에서 대략 1㎠의 면적에 걸쳐 외부 접합체를 옮기고, 패치 아웃하였다. 이들 플레이트를 4-7일 동안 30℃에서 인큐베이션한 후, 브로쓰 배양용 접종물로서 사용하였다.
표 5. 박테리아 균주
명칭 설명/용도
악티노플레인스 가르바디넨시스
ATCC31049		 액타가르딘 생산을 위한
생합성 유전자 클러스터의 단리
악티노플레인스 가르바디넨시스 Δ actA 유전자가 제거된
악티노플레인스 가르바디넨시스 ATCC31049
actA 변이체 actA 유전자의 발현
악티노플레인스 리구리애 NCIMB
41362		 데옥시-액타가르딘 B. 생산을 위한 생합성 유전자 클러스터의 단리
변이체 ligA 유전자의 발현
에스케리키아 콜라이
XL1-Blue MR		 코스미드 라이브러리의 생성
에스케리키아 콜라이
DH10B		 통상적인 클로닝
에스케리키아 콜라이
ET12567		 비메틸화된 DNA의 단리
에스케리키아 콜라이
ET12567/pUZ8002		 접합을 통한 DNA의 유전자간 전달
에스케리키아 콜라이
BW25115/pIJ790		 람다 레드 재조합 플라스미드 pIJ790을 함유하는 균주. FLP 인식 부위 측면에 위치하는 카세트의 표적화된 재조합을 촉진시킨다.
에스케리키아 콜라이
DH5α/BT340		 파쇄 카세트의 FLP-매개 절단을 촉진시키는 플라스미드 BT340을 함유하는 균주
마이크로코커스 루테우스
ATCC4698		 생물검정법 시험 유기체
스트렙토마이세스
리비단스 1326		 이종성 발현을 위한 숙주 유기체
스트렙토마이세스
코엘리컬러 B757		 이종성 발현을 위한 숙주 유기체
스트렙토마이세스
신나모뉴스 DSM
40005 		이종성 발현을 위한 숙주 유기체
항생제
항생제 저장액을 물에서 제조하고(달리 언급되지 않는 한), 0.22μm 밀리포어(Millipore) 필터를 통과시켜 필터를 멸균시켰다. 에탄올에 용해된 용액은 멸균시키지 않았다(문헌 [Sambrook et al., 1989]). 모든 항생제를 -20℃에서 저장하였다. 아프라마이신가 사용되는 배지에서는 MgCl2를 10mM(2.5M의 스톡으로부터)의 최종 농도로 가하였다.
저장액 실험 농도
앰피실린(amp: Ampicillin) 100mg/ml 100㎍/ml
아프라마이신(apra: apramycin) 100mg/ml 50㎍/ml
카르베니실린(car: Carbenicillin) 100mg/ml 100㎍/ml
클로람페니콜(cm: Chloramphenicol) 에탄올중 25mg/ml 25㎍/ml
카나마이신(kan: Kanamycin) 50mg/ml 50㎍/ml
날리딕스산(na: Nalidixic acid) 25mg/ml 25㎍/ml
카세트
명칭 크기
(bp) 		공급원 설명/용도
SBdel-1 1462 프라이머 O/SB50F 및 O/SB51R, 및 주형으로서 pIJ773을 사용한 PCR 전달 기점(oriT) 및 FLP 인식 표적 부위 측면에 위치하는 아프라마이신 내성 유전자 함유. 5' 및 3' 부위는 악티노플레인스 가르바디넨시스로부터의 actA 유전자 측면에 위치하는 DAN와 상동성이다.
SBdel-2 1462 프라이머 O/SB52F 및 O/SB53R, 및 주형으로서 pIJ773을 사용한 PCR 전달 기점(oriT) 및 FLP 인식 표적 부위 측면에 위치하는 아프라마이신 내성 유전자 함유. 5' 및 3' 부위는 SuperCos1로부터의 앰피실린 내성 유전자 측면에 위치하는 DAN와 상동성이다.
HEapra 5247 pMJCOS1 pMJCOS1로부터 단리된 SspI 단편. 카세트는 아프라마이신 내성 유전자, 전달 기점(oriT), 부착 부위(attP) 및 φC31 인테그라제로 구성된다.
벡터
명칭 크기
(kb) 		내성 마커 공급원 설명/용도
pAGvar1 3.1 amp 본 연구 프라이머 O/AGvar01bF 및 O/AGvar02bR, 및 SmaI를 사용하여 앞서 분해된 pUC19로 클로닝된 주형 pLITAG01을 사용하여 생성된 449bp PCR 단편
pAGvar2 2.8 amp 본 연구 프라이머 O/AGvar05F 및 O/AGvar06R, 및 SmaI를 사용하여 앞서 분해된 pUC19로 클로닝된 주형 pLITAG01을 사용하여 생성된 91bp PCR 단편.
명칭 크기
( kb ) 		내성 마커 공급원 설명/용도
pAGvar3 3.2 amp 본 연구 XbaI를 사용하여 앞서 분해된 pAGvar2로 클로닝된 XbaI 단편(~450bp)
pAGvar4 3.3 amp 본 연구 BglII 및 AvrII를 사용하여 앞서 분해된 pAGvar3에 결찰된, 어닐링된 올리고뉴클레오티드 O/AGvar03F, O/AGvar04R
pAGvarX 6.3 apra 본 연구 EcoRI/XbaI를 사용하여 앞서 분해된 pSET152에 결찰된 pAGvar4로부터의 XbaI-EcoRI 단편(~650bp). 변이체 액타가르딘 유전자는 조립될 수 있고, 부착 부위 attP를 통해 숙주 염색체 내로 도입될 수 있다.
CosAL02 47.2 amp 및 neo. 본 연구 BamHI를 사용하여 앞서 분해된 SuperCos1로 클로닝된 악티노플레인스 리구리애로부터의 40402 bp Sau3AI DNA 단편
CosAL02HEapra 49.1 amp 및
apra.		 본 연구 네오마이신을 코딩하는 유전자가 HEapra 카세트로 대체된 CosAL02
CosAG14 45 amp 및
neo		 본 연구 BamHI를 사용하여 앞서 분해된 SuperCos1로 클로닝된 악티노플레인스 가르바디넨시스로부터의 38168 bp Sau3AI DNA 단편
CosAG14ΔA 46.3 amp, neo
및 ampra		 본 연구 actA 유전자가 카세트 SBdel-1로 대체된 CosAG14
CosAG14ΔB 44.9 amp 및
neo		 본 연구 카세트 SBdel-1이 FLP-리컴비나제에 의해 제거되어 81bp의 스카(scar)가 남아있는 CosAG14ΔA
CosAG14ΔC 45.5 neo 및
apra		 본 연구 앰피실린 내성 유전자가 카세트 SBdel-2로 대체된 CosAG14ΔB
CosAG14HEapr 46.9 amp 및
apra		 본 연구 네오마이신을 코딩하는 유전자가 HEapra 카세트로 대체된 CosAG14
pIJ773 4.3 amp 및
apra		 노리치에 소재하는 존인스센터(John Innes Centre)
(JIC)		 카세트 SBdel-1 및 SBdel-2를 생성하는데 사용되는 리디렉트 주형(문헌 [Gust et al., 2003])
pLITAG01 6.1 amp 본 연구 NcoI를 사용하여 앞서 분해된 pLITMUS28로 클로닝된, 악티노플레인스 가르바디넨시스로부터 단리된 3263bp NcoI 단편(19955-23217 CosAG14rc)
pLITMUS28 2.8 amp 뉴잉글랜드 바이오랩스
(NEB: New England BioLabs)		 통상의 클로닝
pMJCOS1 9.8 amp 및 apra 노리치에 소재하는 JIC 네오마이신을 코딩하는 유전자가 아프라마이신 내성 유전자, oriT, attP 및 øC31 인테그라제로 구성된 SspI 단편으로 대체된 SuperCos1. HEapra 카세트 공급원
pSET152 5.7 apra NRRL
B14792		 attP 부위를 통한 숙주 염색체 내로의 DNA 도입을 촉진시킬 수 있는 접합 플라스미드
SuperCos1 7.9 amp 및 neo 스트라진 독특한 클로닝 부위 측면에 위치하는 T3 및 T7 프로모터 영역
pUC19
 2.7 amp NEB 통상의 클로닝
고성능 액체 크로마토그래피
하기 기술하는 파라미터와 함께 휴렛 팩커드(Hewlett Packard) 1050 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 HPLC 분석을 실시하였다:
칼럼: 조박스(Zorbax) SB-C18, 4.6x150 mm, 5μ
이동상 A: 20mM 인산칼륨 완충액(pH 7)중 30% 아세토니트릴
이동상 B: 20mM 인산칼륨 완충액(pH 7)중 65% 아세토니트릴
유속: 1ml/분
구배: 시간 0분 100% A 0% B
시간 10분 0% A 100% B
시간 11분 0% A 100% B
시간 11.2분 100% A 0% B
주기 시간 15분
주입량: 10㎕
검출: 210nm
고성능 액체 크로마토그래피 - 질량 분광법( HPLC - MS )
하기 기술하는 파라미터와 함께, 마이크로매스 플랫폼 LC(Micromass Platform LC)(MassLynx 버전 3.5 소프트웨어로 작동)에 연결된 휴렛 팩커드(Hewlett Packard) 1050 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 HPLC 분석을 실시하였 다:
칼럼: 애질런트(Agilent) 조박스 SB-C18 150 x 4.6mm 5μ
유속: 1ml/분
이동상: A 10% 아세토니트릴, 0.1% 포름산, 90% 물.
B 90% 아세토니트릴, 0.1% 포름산, 90% 물.
10분간의 선형 구배 A 내지 B, 체류 시간 1분, B-A
파장: 200-400nm
주입량: 10㎕
포스트 칼럼 스플릿트: 1:10
질량 분광계: 마이크로매스 플랫폼(Micromass Platform) LC
모드: 전기분무 양성
질소 유속: 380l/hr
모세관 전압: 40V
스키머 렌즈 오프세트(Skimmer lens offset): 5V
기탁
노박타 바이오시스템스 리미티드(Novacta Biosystems Limited)는 부다페스트 조약 하에 2005년 12월 7일자로 영국 에이비21 9와이에이 스코틀랜드 애버딘에 소재하는 NCIMB 리미티드(NCIMB Ltd.)에 NCIMB 41362를 기탁하였다.
참고 문헌
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Figure 112008052958573-pct00052
SEQUENCE LISTING <110> Novacta Biosystems Limited Boakes, Steven Cortes Bargallo, Jesus Dawson, Michael J <120> Lantibiotic Biosynthetic Gene Clusters from A. garbadinensis and A. liguriae <130> AHBCP6415491 <140> PCT/GB2007/000138 <141> 2007-01-17 <150> GB 0600928.6 <151> 2006-01-17 <160> 318 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Actinoplanes liguriae <400> 1 Ser Ser Gly Trp Val Cys Thr Leu Thr Ile Glu Cys Gly Thr Leu Val 1 5 10 15 Cys Ala Cys <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primary polypeptide sequence of Actagardine B variant V V <400> 2 Ser Ser Gly Trp Val Cys Thr Leu Thr Ile Glu Cys Gly Thr Val Val 1 5 10 15 Cys Ala Cys <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primary polypeptide sequence of Actagardine B variant L I <400> 3 Ser Ser Gly Trp Val Cys Thr Leu Thr Ile Glu Cys Gly Thr Leu Ile 1 5 10 15 Cys Ala Cys <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Actinoplanes garbadinensis <400> 4 Ser Ser Gly Trp Val Cys Thr Leu Thr Ile Glu Cys Gly Thr Val Ile 1 5 10 15 Cys Ala Cys <210> 5 <400> 5 000 <210> 6 <400> 6 000 <210> 7 <400> 7 000 <210> 8 <400> 8 000 <210> 9 <400> 9 000 <210> 10 <400> 10 000 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Actinoplanes liguriae <400> 11 Ala Ser Ser Gly Trp Val Cys Thr Leu Thr Ile Glu Cys Gly Thr Leu 1 5 10 15 Val Cys Ala Cys 20 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primary polypeptide sequence of Ala-Actagardine B variant V V <400> 12 Ala Ser Ser Gly Trp Val Cys Thr Leu Thr Ile Glu Cys Gly Thr Val 1 5 10 15 Val Cys Ala Cys 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primary polypeptide sequence of Actagardine B variant L I <400> 13 Ala Ser Ser Gly Trp Val Cys Thr Leu Thr Ile Glu Cys Gly Thr Leu 1 5 10 15 Ile Cys Ala Cys 20 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Actinoplanes garbadinensis <400> 14 Ala Ser Ser Gly Trp Val Cys Thr Leu Thr Ile Glu Cys Gly Thr Val 1 5 10 15 Ile Cys Ala Cys 20 <210> 15 <400> 15 000 <210> 16 <400> 16 000 <210> 17 <400> 17 000 <210> 18 <400> 18 000 <210> 19 <400> 19 000 <210> 20 <400> 20 000 <210> 21 <400> 21 000 <210> 22 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primary polypeptide sequence of pre-pro-Actagardine B variant V V <400> 22 Met Ser Ala Ile Thr Val Glu Thr Thr Trp Lys Asn Thr Asp Leu Arg 1 5 10 15 Glu Asp Leu Thr Ala His Pro Ala Gly Leu Gly Phe Gly Glu Leu Ser 20 25 30 Phe Glu Asp Leu Arg Glu Asp Arg Thr Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Gly 35 40 45 Trp Val Cys Thr Leu Thr Ile Glu Cys Gly Thr Val Val Cys Ala Cys 50 55 60 <210> 23 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primary polypeptide sequence of pre-pro-Actagardine B variant L I <400> 23 Met Ser Ala Leu Ala Ile Glu Lys Ser Trp Lys Asp Val Asp Leu Arg 1 5 10 15 Asp Gly Ala Thr Ser His Pro Ala Gly Leu Gly Phe Gly Glu Leu Thr 20 25 30 Phe Glu Asp Leu Arg Glu Asp Arg Thr Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Gly 35 40 45 Trp Val Cys Thr Leu Thr Ile Glu Cys Gly Thr Leu Ile Cys Ala Cys 50 55 60 <210> 24 <400> 24 000 <210> 25 <400> 25 000 <210> 26 <400> 26 000 <210> 27 <400> 27 000 <210> 28 <400> 28 000 <210> 29 <400> 29 000 <210> 30 <400> 30 000 <210> 31 <400> 31 000 <210> 32 <400> 32 000 <210> 33 <400> 33 000 <210> 34 <400> 34 000 <210> 35 <400> 35 000 <210> 36 <400> 36 000 <210> 37 <400> 37 000 <210> 38 <400> 38 000 <210> 39 <400> 39 000 <210> 40 <400> 40 000 <210> 41 <400> 41 000 <210> 42 <400> 42 000 <210> 43 <400> 43 000 <210> 44 <400> 44 000 <210> 45 <400> 45 000 <210> 46 <400> 46 000 <210> 47 <400> 47 000 <210> 48 <400> 48 000 <210> 49 <400> 49 000 <210> 50 <400> 50 000 <210> 51 <400> 51 000 <210> 52 <400> 52 000 <210> 53 <400> 53 000 <210> 54 <400> 54 000 <210> 55 <400> 55 000 <210> 56 <400> 56 000 <210> 57 <400> 57 000 <210> 58 <400> 58 000 <210> 59 <400> 59 000 <210> 60 <400> 60 000 <210> 61 <400> 61 000 <210> 62 <400> 62 000 <210> 63 <400> 63 000 <210> 64 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gctgcagctc gccgacatgc gcaagcccgg cacgccgtca gcgacctgac ccgctgctcg 180 acgcagctcg ctcgccggtc ccgcgccgcg ccgatcaact ccggcagcac ggcgcgagct 240 tcaatcagcc ggcccggcgc accccctacg ccggtgcgac gaggcatgcc cgagaccagc 300 gcggccgcag agggccggtc ggcgccggac cggtcagcgc gcccgcaatc aggccggcag 360 gcccgcccgg agccggaccg gtcggcgcgc ccgcaatcag gccgacaggc ccgcccgggg 420 tcaggctggt cggctgcgcc gggccggcag gccggcgagc agcgcgtcga gcgtctcggc 480 atccgcccag ccgttgactg acactgcgcc tgccgccgtg accgtgacct caaggcggtc 540 cggtgtcacc gccacgtcga tcggcgcgtc ctcgatgcgg tcgctcaagc ggatgaactg 600 ctggttcgtc gagccgaccc agggccgctc gtggtccagc aggtcctgcc ggaaggggcc 660 ggccaccagc aggtccgtgg cgtcgagcag tgcggcgacg tcggcccggc cgtccgcggc 720 gagagcgcgc agacgggcgt actcgtagcc ggtgaacgtc atgaccgagc gacccgcctg 780 ccgcaccccg gcggccaccg cggcgagacc ggccgcctgc tcgaacggct cgccgccgag 840 cagggtgaca cccgtggtgc ccgtggcgag cactcggtcc accaactcgg cgggtgcggc 900 cggcacccca ccgcgtacgc cgaacaaatg cggattgaag catccggcgc accggatggt 960 gcaaccctgc 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Leu Ala Asp Thr Glu 35 40 45 Arg His Gly His Leu Pro Ala Phe Asn Ala Thr Phe Glu Gln Phe Gly 50 55 60 Leu Pro Val Arg Trp Ser Glu Glu Glu Tyr Gly Glu Lys Leu Arg Ile 65 70 75 80 Gly Gly Gly Lys Glu Arg Met Ala Ser Leu Phe Ala Asp Pro Ala Phe 85 90 95 Ala Ala Ala Ala Gly Asp Thr Asp Arg Thr Glu Leu Leu Arg Thr Trp 100 105 110 His Arg Ala Lys Thr Ala Ala Phe Thr Lys Leu Val Ala Glu Gly Arg 115 120 125 Ile Pro Ala Arg Pro Gly Thr Ala Arg Ile Ile Ser Glu Ala Leu Arg 130 135 140 Ala Gly Trp Thr Val Ala Val Ala Ser Thr Ser Ala Glu Asp Ser Val 145 150 155 160 Arg Ala Val Leu Val Asn Ala Val Gly Ala Thr Thr Ala Glu Arg Ile 165 170 175 Pro Val Phe Ala Gly Asp Val Val Pro Ala Lys Lys Pro Asp Pro Ala 180 185 190 <210> 133 <400> 133 000 <210> 134 <400> 134 000 <210> 135 <400> 135 000 <210> 136 <400> 136 000 <210> 137 <400> 137 000 <210> 138 <400> 138 000 <210> 139 <400> 139 000 <210> 140 <400> 140 000 <210> 141 <400> 141 000 <210> 142 <400> 142 000 <210> 143 <400> 143 000 <210> 144 <400> 144 000 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cagccgccct 5580 gctgctcggc tcgggcgcct gcgcgaagag cgaggactcc ggggacaccg tggcggcggg 5640 tcccgccccg tcggcggcgc aggtggtcca gtccgcctcg gccggctccg cgacctgtgc 5700 cttggatcag tacggcgcgt ccaagctcga cctgaagacc gcctccgtcg gcttctccca 5760 gtcggagaag gaggcgaacc cgttccggat cgccgagacg aagtccatca aggacgaggc 5820 cgcgaagctg ggcatcacca acctcaagac ctcgaacgcg aactcacaat tcaacaagca 5880 gatcgccgac gtcgagcaga tgatcgatgc gggcgtgcag ctgctggtga tcgcgccgct 5940 caactcggac ggctgggact cggtgttcgc caaggcgacg gcgaagcaca tcccgatcat 6000 cacgatcgac cggaagatca acgcgaccgc ctgcaaggac tacctgacct tcatcggctc 6060 cgacttcgcc gagcagggca agcgggccgc cgacgcgctg gccaagtcgc tgggcaacaa 6120 gggcgaggtg gcgatcctgc tgggcgctcc cggcaacaac gtcaccacgc tgcggaccag 6180 cggcttcaag gacgagatcg ccaaggtcgc gccggacatc aagatcacgt tcgagcagac 6240 cggcaacttc tcccgggagg acgggcagaa ggtcgccgag cagctgctgc agtccaagcc 6300 gaacatcaac ggcatctacg gcgagaacga cgagatggcg ctcggcgcga tcaccgcgct 6360 caagggcgcc ggcaagaagg ccggcgacgt caagatcgtc tcgatcgacg gcaccaaggg 6420 cgcggtgcag ggcatcgtgg acggctgggt ctccgcggtg atcgagtcca acccgcgctt 6480 cgggccgctg gccttcgaca ccgcgacgaa gttcttcggc ggcgagccgg tcggccagga 6540 catcgtcatc caggaccgtg cctacgacga gtcgaacgcc aagaccgaca tcggcagcgc 6600 gtactagaga gcgctcccaa tcgggtgtcc ggggatgaac cgggcacccg ccggcacgga 6660 ggagggcggc tcatgctgct ggaagtctcc ggcgtctcca agaccttccc cggcgtacgc 6720 gccctggacg gggtgtcctt caccctgaac ccgggcgagg tgcacgcgct ggtgggggag 6780 aacggcgccg gcaagtcgac gttgatcaaa gtgctcaccg gggtctacca gccggacagt 6840 ggcgagctgc gctaccgcgg cgagccggcc cggttcgcca ccccgctgga cgcccagcgg 6900 gccggtatct cgaccatcta tcaggaggtc aacctcgtcc cgctgatgag cgtggcgcac 6960 aacctgttcc tcggccggga gccgcgcaac cggttcgggc tgctggacga ggcccggatg 7020 gtcgccgagg ccaccgagat cctggccggt tacggcgtac gcaccgatgt ccgccgccgc 7080 ctcggcaccc tggccctggg cgcgcagcag atggtcgcgc tcgcccgggc cgtcatggtc 7140 gacgcccggg tcgtggtgat ggacgagccc acctcgtcgc tggagccgcg cgaggtggag 7200 accctgttcg gggtgatccg cgagctgcac accgcgggca tcggcatcgt 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Actinoplanes liguriae <400> 215 Met Leu Ser Val Leu Asp Gln Val Pro Val Phe Arg Gly Asp Asp Pro 1 5 10 15 Ala Glu Ala Val Arg Glu Ala Val Gly Leu Ala Arg Ala Ala Glu Ser 20 25 30 Leu Gly Tyr His Arg Phe Trp Ile Ala Glu His His Gly Ser Ala Ala 35 40 45 Asn Ala Cys Ala Ala Pro Glu Ile Val Ala Ala Ala Val Ala Gly Ala 50 55 60 Thr Glu Arg Ile Arg Val Gly Thr Gly Gly Val Leu Leu Pro Tyr Tyr 65 70 75 80 Ser Pro Leu Lys Val Ala Glu Ala Phe Arg Val Leu Ala Ala Leu Tyr 85 90 95 Pro Gly Arg Ile Asp Leu Gly Phe Gly Arg Gly Arg Gly Gly Pro Ala 100 105 110 Val Met Ala Glu Leu Leu Asn Pro Tyr Ala Ile Ala Thr Glu Glu Ala 115 120 125 Tyr Ala Glu Gln Val Gly Arg Leu Leu Ala Phe Leu Gly Asp Ala Arg 130 135 140 Thr Val Ser Arg Val Ser Val Thr Pro Ala Val Gln Asp Pro Pro Leu 145 150 155 160 Pro Trp Leu Leu Gly Ser Gly Val Gly Ser Ala Arg Leu Ala Gly Met 165 170 175 Leu Gly Val Pro Phe Cys Phe Ala Gln Phe Ile Ala Thr Glu Glu Cys 180 185 190 Pro Glu Ala Ile Ala Ala Tyr Gln Glu Ser Phe Arg Ser Ser Pro Trp 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<212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primer O/AGvar05F <400> 307 gcctgctgac ctaggtcgac gatcgt 26 <210> 308 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primer O/AGvar06r <400> 308 tgaattcggc tgctccccgc gcgaaat 27 <210> 309 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primer O/SB50F <400> 309 attcgcccgg gaagtccacc gaaaggaaga cacaccatga ttccggggat ccgtcgacc 59 <210> 310 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primer O/SB51R <400> 310 gggcgatgcc cgccccgggc cggaaacgat cgtcgatcat gtaggctgga gctgcttc 58 <210> 311 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primer O/SB52F <400> 311 aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatga ttccggggat ccgtcgacc 59 <210> 312 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primer O/SB53R <400> 312 gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcat gtaggctgga gctgcttc 58 <210> 313 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Compound of Formula I <220> <221> MOD_RES <222> (7, 9, 14) <223> Abu <220> <221> THIOETH <222> (1)..(6) <220> <221> THIOETH <222> (7)..(12) <220> <221> THIOETH <222> (9)..(17) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(19) <223> Linked by Y, where Y is -S- or -S(O)- <400> 313 Ala Ser Gly Trp Val Ala Xaa Leu Xaa Ile Glu Ala Gly Xaa Leu Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala <210> 314 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Compound of Formula I <220> <221> MOD_RES <222> (7, 9, 14) <223> Abu <220> <221> THIOETH <222> (1)..(6) <220> <221> THIOETH <222> (7)..(12) <220> <221> THIOETH <222> (9)..(17) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(19) <223> Linked by Y, where Y is -S- or -S(O)- <400> 314 Ala Ser Gly Trp Val Ala Xaa Leu Xaa Ile Glu Ala Gly Xaa Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala <210> 315 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Compound of Formula I <220> <221> MOD_RES <222> (7, 9, 14) <223> Abu <220> <221> THIOETH <222> (1)..(6) <220> <221> THIOETH <222> (7)..(12) <220> <221> THIOETH <222> (9)..(17) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(19) <223> Linked by Y, where Y is -S- or -S(O)- <400> 315 Ala Ser Gly Trp Val Ala Xaa Leu Xaa Ile Glu Ala Gly Xaa Leu Ile 1 5 10 15 Ala Ala Ala <210> 316 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Compound of Formula I <220> <221> MOD_RES <222> (8, 10, 15) <223> Abu <220> <221> THIOETH <222> (2)..(7) <220> <221> THIOETH <222> (8)..(13) <220> <221> THIOETH <222> (10)..(18) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(20) <223> Linked by Y, where Y is -S- or -S(O)- <400> 316 Ala Ala Ser Gly Trp Val Ala Xaa Leu Xaa Ile Glu Ala Gly Xaa Leu 1 5 10 15 Val Ala Ala Ala 20 <210> 317 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Compound of Formula I <220> <221> MOD_RES <222> (8, 10, 15) <223> Abu <220> <221> THIOETH <222> (2)..(7) <220> <221> THIOETH <222> (8)..(13) <220> <221> THIOETH <222> (10)..(18) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(20) <223> Linked by Y, where Y is -S- or -S(O)- <400> 317 Ala Ala Ser Gly Trp Val Ala Xaa Leu Xaa Ile Glu Ala Gly Xaa Val 1 5 10 15 Val Ala Ala Ala 20 <210> 318 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Compound of Formula I <220> <221> MOD_RES <222> (8, 10, 15) <223> Abu <220> <221> THIOETH <222> (2)..(7) <220> <221> THIOETH <222> (8)..(13) <220> <221> THIOETH <222> (10)..(18) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(20) <223> Linked by Y, where Y is -S- or -S(O)- <400> 318 Ala Ala Ser Gly Trp Val Ala Xaa Leu Xaa Ile Glu Ala Gly Xaa Leu 1 5 10 15 Ile Ala Ala Ala 20

Claims (43)

  1. 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    Figure 712014002617405-pct00060
    상기 식에서,
    -X1-X2-는 -Leu-Val-을 나타내고;
    Y는 -S- 또는 -S(O)-이며;
    Z는 -NH2 또는 아미노산이고, 여기서 -NH2는 1번 위치의 Ala의 N-말단을 나타내며;
    R은 -OH 또는 -NR1R2 기를 나타내며, 여기서, R1 및 R2는 독립적으로
    (i) 수소; 또는
    (ii) 식 -(CH2)n-NR3R4(여기서, n은 2 내지 8의 정수를 나타내고, R3 및 R4는 독립적으로 수소 또는 (C1-C4)알킬을 나타내거나, R3 및 R4는 함께 -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)2-S-(CH2)2- 또는 -(CH2)5- 기를 나타낸다)의 기를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, Z가 -NH2인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, Z가 아미노산인 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 아미노산은 Ala, Ile, Lys, Phe, Val, Glu, Asp, His, Leu, Arg, Ser 및 Trp 기로부터 선택되고, 상기 아미노산은 D 배열(configuration) 또는 L 배열로 존재하는 것인 화합물.
  5. 제3항에 있어서, Z가 Ile, Lys, Phe, Val, Glu, Asp, His, Leu, Arg 및 Ser 기로부터 선택되는 아미노산인 화합물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 아미노산이 Ala인 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R이 -NR1R2 기를 나타내는 것인 화합물.
  8. 삭제
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R이 -NR1R2 기를 나타내며, 여기서, R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 식 -(CH2)n-NR3R4(여기서, n은 2 내지 8의 정수를 나타내고, R3 및 R4는 독립적으로 수소 또는 (C1-C4)알킬을 나타낸다)의 기를 나타내는 것인 화합물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R이 -OH인 화합물.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 내부 잔기 측쇄의 카복시 작용기에 대해, 이 작용기가 -COOH로부터 -COOR5(여기서, R5는 수소, (C1-C4)알킬 또는 (C1-C4)알콕시 (C2-C4)알킬을 나타낸다)의 기로 변형되도록 하는 변형을 포함하는 것인 화합물.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 아미노 기에 대해, 이 -NH2 기 대신에 -NHR6(여기서, R6은 C1-C4알킬을 나타낸다)의 기가 되도록 하는 변형을 포함하는 것인 화합물.
  13. 제1항에 기재된 화합물의 2번, 3번, 4번, 5번, 8번, 10번, 11번, 13번, 또는 18번 위치로부터 선택되는 위치의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산이 Gly, Ala, Ile, Leu, Val, Cys, Ser, Thr, Met, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Phe, Trp 및 Tyr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 아미노산으로 치환되는 제1항에 기재된 화합물의 변이체로서, 항미생물 활성을 갖는 변이체.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 포함하는, 박테리아 감염 치료용 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 감염이 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)에 의해 유발되는 장 중복 감염(gut super-infection)인 약제학적 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 하기 화학식의 화합물의 제조 방법으로서,
    Figure 112013097041661-pct00062
    상기 식에서,
    -X1-X2-는 -Leu-Val-이고;
    Y는 -S-이며;
    Z는 Ala 또는 -NH2이고, 여기서 -NH2는 1번 위치의 Ala의 N-말단을 나타내며;
    상기 방법은 서열 번호 1 또는 11을 포함하는 서열을 코딩하는 핵산, 및 경우에 따라 필요한 경우, 전구체 폴리펩티드를 생성물로 전환시키는데 요구되는 관련된 클러스터 유전자를 발현시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 핵산이 악티노플레인스 리구리애(A. liguriae)에서 발현되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 악티노플레인스 리구리애는 부다페스트 조약 기탁 번호 NCIMB 41362 하에 기탁되어 있는 것인 방법.
  21. B형 란티바이오틱 펩티드 데옥시액타가르딘, 액타가르딘 또는 이의 변이체를 발현시키는 데 적합한 숙주 세포를 제조하는 방법으로서,
    액타가르딘 B, ala(0)-액타가르딘 B, 또는 이들 중 어느 하나의 아미노산 변이체로서, 폴리펩티드 서열 내의 2번, 3번, 4번, 5번, 8번, 10번, 11번, 13번 및 18번 위치에서의 1 내지 5개의 아미노산이 Gly, Ala, Ile, Leu, Val, Cys, Ser, Thr, Met, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Phe, Trp 및 Tyr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 아미노산으로 치환되는 아미노산 변이체의 전구체 펩티드를 포함하는 LanA 폴리펩티드를 코딩하는 lanA 유전자를,
    경우에 따라, 전구체 펩티드를 상기 펩티드로 전환시키는 데 적합한 하나 이상의 관련된 클러스터 유전자와 함께 도입함으로써 세포를 형질전환시켜, 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고 이것을 발현시키는 데 적합한 숙주 세포를 생성하는 단계를 포함하며, 상기 LanA 폴리펩티드는 하기 구조를 갖는 것인 제조 방법:
    Figure 112015037343707-pct00063
    상기 식에서,
    -X1-X2-는 -Leu-Val-을 나타내고;
    Y는 -S- 또는 -S(O)-이며;
    Z는 -NH2 또는 아미노산이고, 여기서 -NH2는 1번 위치의 Ala의 N-말단을 나타낸다.
  22. 제21항에 있어서, 상기 세포를 lanA 유전자 및 하나 이상의 클러스터 유전자로 형질전환시키는 것인 제조 방법.
  23. 제22항에 있어서, 관련된 유전자 클러스터가 LanR 폴리펩티드 또는 이것과 90% 이상 동일한 그의 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하고, 상기 LanR 폴리펩티드는 LanA 폴리펩티드의 생성을 조절하는 인자인 것인 제조 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 유전자 클러스터가 LanM 폴리펩티드 또는 이것과 90% 이상 동일한 그의 변이체를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하고, 상기 LanM 폴리펩티드는 란티바이오틱 유전자 클러스터로부터 유래된 것으로서, 전구체 폴리펩티드를 란티바이오틱 화합물로 전환하는 데 요구되는 변형 인자인 것인 제조 방법.
  25. 제24항에 있어서, LanM 폴리펩티드가 서열 번호 120 또는 213에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 제조 방법.
  26. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 유전자 클러스터가 LanO 폴리펩티드 또는 이것과 90% 이상 동일한 그의 변이체를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하고, 상기 LanO 폴리펩티드는 란티바이오틱 유전자 클러스터로부터 유래된 것으로서, 데옥시 형태를 이의 -S(O)- 유사체로 산화시키는 데 관여하는 인자인 것인 제조 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 LanO 폴리펩티드가 서열 번호 122 또는 215의 아미노산 서열을 갖는 것인 제조 방법.
  28. 제24항에 있어서, 관련된 유전자 클러스터가 LanT 폴리펩티드 또는 이것과 90% 이상 동일한 그의 변이체를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하고, 상기 LanT 폴리펩티드는 란티바이오틱 유전자 클러스터로부터 유래된 것으로서, 수송 인자인 것인 제조 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 LanT 폴리펩티드가 서열 번호 123 또는 214에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 제조 방법.
  30. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 숙주 세포가 란티바이오틱 생산 숙주 세포인 제조 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 숙주 세포가 LanO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하고, 상기 유전자가 불활성화되는 것인 제조 방법.
  32. 제31항에 있어서, LanO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 돌연변이 또는 결실에 의해 불활성화되는 것인 제조 방법.
  33. 제21항 또는 제22항에 있어서, 숙주 세포를 배양하여 그 안에 코딩된 란티바이오틱 펩티드를 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  34. 제33항에 있어서, 란티바이오틱을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  35. 제33항에 있어서, 모노아미드 유도체를 제공하도록 C-말단의 카복시 작용기를 유도체화하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  36. 제21항 또는 제22항의 방법으로부터 얻을 수 있는 세포로서, 상기 세포는 돌연변이된 내인성 LanA 유전자를 갖는 란티바이오틱 생산 숙주 세포 및 LanA 유전자를 발현할 수 있는 비생산자 중에서 선택되는 것인 세포.
  37. 제21항 또는 제22항에 정의된 방법에서 숙주 세포를 형질전환시키는 데 적합한 벡터로서,
    액타가르딘 B, ala(0)-액타가르딘 B, 또는 이들 중 어느 하나의 변이체로서, 폴리펩티드 서열 내의 2번, 3번, 4번, 5번, 8번, 10번, 11번, 13번 및 18번 위치에서의 1 내지 5개의 아미노산이 Gly, Ala, Ile, Leu, Val, Cys, Ser, Thr, Met, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Phe, Trp 및 Tyr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 아미노산으로 치환되는 변이체의 전구체 펩티드를 포함하는 LanA 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를,
    경우에 따라, 전구체 펩티드를 생성물 펩티드로 전환시키는 데 필요한 관련된 클러스터 유전자와 함께 포함하는 발현 작제물을 포함하며, 상기 LanA 폴리펩티드는 하기 구조를 갖는 것인 벡터:
    Figure 112015037343707-pct00064
    상기 식에서,
    -X1-X2-는 -Leu-Val-을 나타내고;
    Y는 -S- 또는 -S(O)-이며;
    Z는 -NH2 또는 아미노산이고, 여기서 -NH2는 1번 위치의 Ala의 N-말단을 나타낸다.
  38. 제37항에 있어서, 상기 발현 작제물이 lanA 프로모터 서열을 추가로 포함하는 것인 벡터.
  39. 내인성 LanA 유전자 내에 돌연변이를 포함하는 란티오바이오틱 생산 숙주 세포로서, 상기 유전자는 액타가르딘 B, ala(0)-액타가르딘 B, 또는 이들 중 어느 하나의 아미노산 변이체로서, 폴리펩티드 서열 내의 2번, 3번, 4번, 5번, 8번, 10번, 11번, 13번 및 18번 위치에서의 1 내지 5개의 아미노산이 Gly, Ala, Ile, Leu, Val, Cys, Ser, Thr, Met, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Phe, Trp 및 Tyr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 아미노산으로 치환되는 아미노산 변이체의 전구체 펩티드를 포함하는 LanA 폴리펩티드를 코딩하고, 내인성 유전자가 발현되지 않거나 내인성 유전자 생성물이 비활성화되도록 하며, 상기 LanA 폴리펩티드는 하기 구조를 갖는 것인 란티바이오틱 생산 숙주 세포:
    Figure 112015037343707-pct00065
    상기 식에서,
    -X1-X2-는 -Leu-Val-을 나타내고;
    Y는 -S- 또는 -S(O)-이며;
    Z는 -NH2 또는 아미노산이고, 여기서 -NH2는 1번 위치의 Ala의 N-말단을 나타낸다.
  40. LanA 펩티드, 또는 이의 아미노산 변이체로서, 펩티드 서열 내의 2번, 3번, 4번, 5번, 8번, 10번, 11번, 13번 및 18번 위치에서의 1 내지 5개의 아미노산이 Gly, Ala, Ile, Leu, Val, Cys, Ser, Thr, Met, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Phe, Trp 및 Tyr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 아미노산으로 치환되는 아미노산 변이체를 발현시키기 위해 숙주 세포를 사용하는 방법으로서,
    상기 세포는 LanO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 갖는 란티바이오틱 생산 세포이고,
    상기 유전자는 불활성화되거나,
    상기 유전자의 발현이 증가되며,
    상기 LanA 펩티드는 하기 구조를 갖는 것인 방법:
    Figure 112015037343707-pct00066
    상기 식에서,
    -X1-X2-는 -Leu-Val-을 나타내고;
    Y는 -S- 또는 -S(O)-이며;
    Z는 -NH2 또는 아미노산이고, 여기서 -NH2는 1번 위치의 Ala의 N-말단을 나타낸다.
  41. 제40항에 있어서, LanO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 돌연변이 또는 결실에 의해 불활성화되는 것인 방법.
  42. 액타가르딘 B, 또는 이의 아미노산 변이체로서, 폴리펩티드 서열 내의 2번, 3번, 4번, 5번, 8번, 10번, 11번, 13번 및 18번 위치에서의 1 내지 5개의 아미노산이 Gly, Ala, Ile, Leu, Val, Cys, Ser, Thr, Met, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Phe, Trp 및 Tyr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 아미노산으로 치환되는 아미노산 변이체를 제조하기 위해, LanA 펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 숙주 세포를 사용하는 방법으로서, 단, 상기 숙주는 LanA 펩티드를 코딩하는 내인성 유전자를 포함하는 란티바이오틱 생산 세포이고, 상기 내인성 유전자는 내인성 유전자가 발현되지 않거나 내인성 유전자 생성물이 불활성이 되거나 내인성 유전자가 결실되도록 돌연변이되며, 액타가르딘 B는 하기 구조를 갖는 것인 방법:
    Figure 112015037343707-pct00067
    상기 식에서,
    -X1-X2-는 -Leu-Val-을 나타내고;
    Y는 -S- 또는 -S(O)-이며;
    Z는 -NH2 또는 아미노산이고, 여기서 -NH2는 1번 위치의 Ala의 N-말단을 나타낸다.
  43. 삭제
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