JP5219837B2 - A.ガルバジネンシスおよびa.リグリエに由来するランチビオティック生合成遺伝子クラスター - Google Patents
A.ガルバジネンシスおよびa.リグリエに由来するランチビオティック生合成遺伝子クラスター Download PDFInfo
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Description
本発明は、ランチビオティックアクタガルジン(actagardine)の生合成遺伝子クラスターの特徴付け、アクタガルジンの新規な変異体およびその生合成クラスターの同定、ならびに特徴付けられた生合成遺伝子クラスターに由来する遺伝子を用いて、アクタガルジン、A.リグリエ株において作製される新規なアクタガルジン変異体、および本発明に従って作製されるこれらの両方の変異体を作製および使用する方法に関する。
ランチビオティックスは、グラム陽性細菌によって産生される、抗生活性および他の活性を有するペプチドである。これらは、修飾残基の中でも特に、チオエーテルアミノ酸のランチオニンおよびメチルランチオニンを含み、これらは、ペプチド鎖を架橋して多環構造体にする。これらは2つのクラス、A型およびB型に分類されているが、このような分類は問題がない。A型ランチビオティックスは、一般に、細菌膜および他の形質膜中に小孔を形成することができる細長い両親媒性物質である。例は、ナイシンおよびサブチリンである。一方、B型ランチビオティックスは、酵素機能を阻害する、球状の立体配置的に定義されたペプチドである。例は、シンナマイシンおよびデュラマイシンである。
本発明は、アクチノプラネス・ガルバジネンシスおよびA.リグリエに由来するB型ランチビオティックのアクタガルジンの生合成遺伝子クラスターに関連する、クローン化され、配列決定され、かつ解明された構造情報および調節情報に関する。
読者の利便性のために、以下のとおり、本出願の配列に非連続的に番号を付けた。
SEQ ID NO:1は、アクタガルジンBの一次ポリペプチド配列である。
SEQ ID NO:2は、アクタガルジンB変異体VVの一次ポリペプチド配列である。
SEQ ID NO:3は、アクタガルジンB変異体LIの一次ポリペプチド配列である。
SEQ ID NO:4は、アクタガルジンの一次ポリペプチド配列である。
SEQ ID NO:11は、Ala-アクタガルジンBの一次ポリペプチド配列である。
SEQ ID NO:12は、Ala-アクタガルジンB変異体VVの一次ポリペプチド配列である。
SEQ ID NO:13は、Ala-アクタガルジンB変異体LIの一次ポリペプチド配列である。
SEQ ID NO:14は、Ala-アクタガルジンの一次ポリペプチド配列である。
SEQ ID NO:212は、プレプロアクタガルジンBの一次ポリペプチド配列である。
SEQ ID NO:22は、プレプロアクタガルジンB変異体VVの一次ポリペプチド配列である。
SEQ ID NO:23は、プレプロアクタガルジンB変異体LIの一次ポリペプチド配列である。
SEQ ID NO:119は、プレプロアクタガルジンの一次ポリペプチド配列である。
SEQ ID NO:100は、コスミドCosAG14の非ベクター、A.ガルバジネンシス由来のヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:101〜SEQ ID NO:132は、それぞれ、SEQ ID NO:100のオープンリーディングフレームorf1〜orf32のポリペプチド配列である。
SEQ ID NO:200は、コスミドCosAL02の非ベクター、A.リグリエ由来のヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:201〜SEQ ID NO:231は、それぞれ、SEQ ID NO:200のオープンリーディングフレームorf1〜orf31のポリペプチド配列である。
SEQ ID NO:300〜SEQ ID NO:312は、本明細書において以下に説明するプライマー配列である。
本発明は、SEQ ID NO:100およびSEQ ID NO:200の遺伝子クラスター、ならびにこれらのクラスターによってコードされるポリペプチドおよびそれらの変異体に関する。SEQ ID NO:119のポリペプチドは、プレプロアクタガルジンであり、SEQ ID NO:212のポリペプチドは、プレプロアクタガルジンBである。残りのポリペプチドおよびそれらの変異体(本明細書において定義する)は、本明細書において総称的に「クラスターポリペプチド」と呼ばれる。SEQ ID NO:100に由来するクラスターポリペプチドは、「1xxポリペプチド」と呼ばれ、SEQ ID NO:200に由来するものは、「2xxポリペプチド」と呼ばれる。配列および長さの両方がクラスターポリペプチドと100%同一であるポリペプチドは、「野生型」ポリペプチドと呼ばれる。SEQ ID NO:100またはSEQ ID NO:200に由来するクラスターポリペプチドは、野生型または変異体でよい。
本発明において、ランチビオティックAポリペプチドまたはLanAポリペプチド、ランチビオティックA遺伝子またはLanA遺伝子への言及は、総称的に、B型ランチビオティックポリペプチドまたはそのようなペプチドをコードする遺伝子を指す。したがって、これらへの言及は、シンナマイシン、メルサシジン、アクタガルジンおよびアクタガルジンB、ならびにこれらの産物をコードする遺伝子への言及を含む。ランチビオティックを産生する宿主細胞への言及は、本明細書において下記にさらに定義するように、ネイティブな形態でLanAポリペプチドを産生する任意の宿主細胞を指す。
本明細書において使用される場合、「LanM」ポリペプチドへの言及は、ポリペプチド前駆体からランチビオティック化合物への変換に必要とされる修飾因子である、ランチビオティック遺伝子クラスターに由来するポリペプチドである。LanMポリペプチドには、SEQ ID NO:120(ActM)もしくはその変異体、SEQ ID NO:213(LigM)もしくはその変異体のもの、WO02/088367において定義されるcinMポリペプチド、Altena et al, 2000において開示されるmrsMポリペプチド、またはB型ランチビオティックを産生する細菌の別の遺伝子クラスターに由来する相同ポリペプチドが含まれる。
1つの局面において、本発明は、SEQ ID NO:101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、および231のいずれか一つより選択される、単離されたクラスターポリペプチドを提供する。別の局面において、本発明は、前述の配列のうちいずれかの変異体であるクラスターポリペプチドを提供する。
別の局面において、本発明は、本発明の化合物またはアクタガルジンの前駆体である、好ましくは単離型のポリペプチドを提供する。ポリペプチド前駆体には、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11〜SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、およびSEQ ID NO:119のいずれか一つのポリペプチド、ならびにランチビオティックポリペプチドに変換され得るその変異体または誘導体が含まれる。
1つの局面において、本発明は、式(I)の化合物または薬学的に許容されるその塩を提供する:
式中、
-X1-X2-は、-Leu-Val-、-Val-Val-、または-Leu-Ile-を表し、
Yは-S-または-S(O)-であり、かつ
Zは、H2N-またはAla-のいずれかである。
別の局面において、本発明は、これらの化合物の変異体および生物学的に活性な誘導体を提供する。
式(I)の化合物の変異体は、1つまたは複数、例えば、1個〜5個、例えば1個、2個、3個、または4個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている化合物である。好ましくは、アミノ酸は、式(I)の化合物の2位、3位、4位、5位、8位、10位、11位、13位、または18位より選択される位置にある。
本発明の化合物(変異体を含む)の誘導体は、本発明の化合物の1つまたは複数のアミノ酸側鎖が、例えば、エステル化、アミド化、または酸化によって修飾されているものである。
式中、Rは、-NR1R2基を表し、
式中、R1およびR2は、独立に、
(i)水素、
(ii)式中のnが2〜8の整数を表し、かつR3およびR4が、独立に、水素もしくは(C1〜C4)アルキルを表すか、またはR3およびR4が、共に-(CH2)3-基、-(CH2)4-基、(CH2)2-O-(CH2)2-基、-(CH2)2-S-(CH2)2-基、もしくは-(CH2)5-基を表す、式-(CH2)n-NR3R4の基
を表すか、または
R1およびR2は、隣接する窒素原子と共にピペラジン部分を表し、ピペラジン部分の4位は、以下より選択される置換基で置換されてもよい:
(a)(C1〜C4)アルキル、
(b)(C5〜C7)-シクロアルキル、
(c)ピリジル、
(d)式中のpが1〜8の整数を表し、かつR5およびR6が、独立に、水素または(C1〜C4)アルキルを表す、-(CH2)p-NR5R6
(e)ピペリジニル、
(f)(C1〜4)アルキルであるN置換基を有する、置換されたピペリジニル
(g)ベンジル、および
(h)クロロ、ブロモ、ニトロ、(C1〜C4)アルキル、および(C1〜C4)アルコキシより選択される1つまたは2つの置換基をフェニル部分が有する、置換されたベンジル。
誘導体が、C末端が式-COR(式中、Rは-NR1R2基を表す)を有する化合物である場合、いくつかの態様において、R1はHであり、かつR2は、式-(CH2)n-NR3R4の基を表す(式中、nは2〜8の整数を表し、かつR3およびR4は、独立に、水素もしくは(C1〜C4)アルキルを表すか、またはR3およびR4は、共に-(CH2)3-基、-(CH2)4-基、(CH2)2-O-(CH2)2-基、-(CH2)2-S-(CH2)2-基、もしくは-(CH2)5-基を表す)。これらの態様において、R3およびR4は、好ましくは、水素または(C1〜C4)アルキルを表す。より好ましくは、R3およびR4は、(C1〜C2)アルキル、例えばメチルを表す。整数nは、好ましくは、2〜5、およびより好ましくは2〜4、例えば3でよい。
(a)(C1〜C4)アルキル、
(b)(C5〜C7)-シクロアルキル、
(d)式中のpが、1〜8の整数を表し、かつR5およびR6が、独立に、水素または(C1〜C4)アルキルを表す、-(CH2)p-NR5R6、
(e)ピペリジニル、および
(f)(C1〜4)アルキルであるN置換基を有する、置換されたピペリジニル。
(d)式中のpが、1〜8の整数を表し、かつR5およびR6が、独立に、水素または(C1〜C4)アルキルを表す、-(CH2)p-NR5R6、および
(f)(C1〜4)アルキルであるN置換基を有する、置換されたピペリジニル。
本発明の核酸は、DNAまたはRNAでよいが、好ましくはDNAでよい。本発明の核酸は、一本鎖または二本鎖でよい。1つの局面において、本発明は、クラスターポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。別の局面において、本発明は、ポリペプチド前駆体またはその変異体もしくは断片をコードする単離された核酸を提供する。
本発明のさらなる局面において、プロモーターに機能的に連結された、本発明のクラスターポリペプチドまたはランチビオティックポリペプチドをコードする核酸を含む発現構築物が提供される。
別の局面において、本発明の1種または複数種の発現構築物を含む組換えベクターが提供される。代替の局面において、本発明の発現構築物のセットを含む、組換えベクターのセットが提供される。必要な場合には、付加的なプロモーター、ターミネーター断片、エンハンサーエレメント、マーカー遺伝子、および必要に応じた他のエレメントを含む、適切な付加的調節エレメントを含む、細菌中に導入するための核酸を含む適切なベクターを、選択または構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、またはファージミドでよい。さらなる詳細については、例えば、Sambrook et al(1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harborを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞中へのDNAの導入および遺伝子発現における核酸の操作ならびにタンパク質の解析のための多くの公知の技術およびプロトコールは、Ausubel et al.(1995)Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers,(1995)に詳細に記載されている。ストレプトマイセス(Streptomyces)種においてこれらの技術を使用する多くの局面は、Hopwood et al(1985) Genetic manipulation of Streptomyces a laboratory manual(Norwich:John Innes Foundation)およびPractical Streptomyces Genetics(2000) Kieser T. et al., The John Innes Foundation 386頁に詳細に記載されている。Sambrook et al、Ausubel et al、Hopwood et alおよびKieser et alの開示内容は、これらの目的および他のすべての目的のために、参照により本明細書にすべて組み入れられる。
別の局面において、本発明者らは、アクタガルジンBのランチビオティック誘導体を作製およびスクリーニングするために有用なベクター系を開発した。これは、発現カセット系を作製するために、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11、またはSEQ ID NO:212をコードするLanA遺伝子中に1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を導入することによって実現される。したがって、別の局面において、本発明は、アクタガルジンBポリペプチド前駆体をコードするヌクレオチド配列を含む組換えDNAカセットを提供し、該配列は、
コード配列のN末端コード領域にあるかまたはそれに隣接している第1の制限部位、
任意で、第1の制限部位の下流かつコード配列内の第2の制限部位、および
コード配列のC末端コード領域にあるかまたはそれに隣接している第3の制限部位
を含み、
前記制限部位の少なくとも1つは、SEQ ID NO:200として示されるLanAコード配列内に出現しない。
該配列は、
コード配列のN末端コード領域にあるかまたはそれに隣接している第1の制限部位、
任意で、第1の制限部位の下流かつコード配列内の第2の制限部位、および
コード配列のC末端コード領域にあるかまたはそれに隣接している第3の制限部位
を含み、
前記制限部位の少なくとも1つは、SEQ ID NO:100として示されるLanAコード配列内に出現しない。
本発明の発現カセットは、ランチビオティックをコードする遺伝子のライブラリーを提供するのに使用され得る。このようなライブラリーは、カセットの第1の制限部位と第2の制限部位の間、第1の制限部位と第3の制限部位の間、または第2の制限部位と第3の制限部位の間に、SEQ ID NO:100またはSEQ ID NO:200のプロペプチド部分と比較して、1個〜15個、例えば、1個〜10個、好ましくは1個〜6個、例えば、1個〜3個のヌクレオチド変化を有することは別として、対応するActAまたはLigA配列にそれぞれが対応する多種多様の配列を導入することによって作製することができる。好ましくは、このような変化は、その配列によってコードされるタンパク質の変化をもたらす。しかしながら、非コード性の変化は除外されない。
2種の主なタイプの宿主細胞が、本発明によって構想される。第1のタイプの宿主細胞は、ランチビオティックを産生する宿主細胞である。あるいは、宿主細胞は、非産生細胞でよく、すなわち、LanA遺伝子も、LanAポリペプチドを産生するのに必要とされる関連したそのクラスター遺伝子も含まない。
1つの態様において、宿主細胞は、ランチビオティックを産生する宿主細胞でよい。ランチビオティックを産生する宿主細胞は、LanA遺伝子を含む発現構築物が、任意のクラスター遺伝子の不在下で細胞中に導入された場合に、発現され、かつLanAポリペプチドが産生されると考えられる細胞である。このような細胞には、ランチビオティックを産生する桿菌、放線菌(actinomycete)、またはストレプトマイセス科の菌(streptomycete)(例えば、S.リビダンス(S. lividans)もしくはS.セリカラー(S. coelicolor)の任意の株のような、任意のB型ランチビオティック産生細胞が含まれる。このような細胞の例には、シンナマイシンを産生する宿主細胞(ストレプトマイセス・シナモネウス・シナモネウス(Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus) DSM40005)、またはアクタガルジンを産生するアクチノプラネス・ガルバジネンシスもしくはA.リグリエNCIMB41362が含まれる。
非産生細胞は、LanA遺伝子が、ポリペプチド前駆体をアクタガルジンもしくはその変異体、または本発明の化合物に変換することができる発現構築物のセットの一部分として細胞中に導入されるという条件で、アクタガルジンもしくはその変異体、または本発明の化合物に変換されることができるポリペプチド前駆体をコードするLanA遺伝子の発現により、そのような産物を産生することができる任意の宿主細胞でよい。
本発明の化合物は、例えば、組換え発現ベクター中に保有されるポリペプチド前駆体をコードする発現構築物の形態で、必要な場合には、ポリペプチド前駆体を産物に変換するのに必要とされる関連するクラスター遺伝子と共にLanA遺伝子を有する宿主細胞において、核酸を発現させることによって作製することができる。上記のように、本発明が、式(I)(式中、-X1-X2-は-Leu-Val-を表す)の化合物の作製に関する場合、宿主細胞は、それ以上の任意の改変はせずに、A.リグリエNCIMB41362でよい。
「薬学的に許容される塩」は、塩基が化合物の生物学的な有効性および特性を保持し、かつ生理学的に許容される、酸付加塩でよい。このような塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸などの無機酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、およびサリチル酸などの有機酸により形成されるものが含まれる。
本発明のランチビオティックスは、限定されるわけではないが、薬学的に許容される担体、補助剤、賦形剤、希釈剤、増量剤、緩衝剤、保存剤、抗酸化剤、滑沢剤、安定化剤、可溶化剤、界面活性剤(例えば、湿潤剤)、マスキング剤、着色剤、矯味剤、および甘味剤を含む、当業者に周知である1種または複数種の他の薬学的に許容される成分と共に製剤化され得る。製剤は、他の活性物質、例えば、他の治療的物質または予防的物質をさらに含んでよい。したがって、本発明はさらに、上記に定義した薬学的組成物、および上記に定義した少なくとも1種の活性化合物を、当業者に周知である1種または複数種の他の薬学的に許容される成分、例えば、担体、補助剤、賦形剤などと共に混合する段階を含む、薬学的組成物を作製する方法を提供する。個別の単位(例えば錠剤など)として製剤化される場合、各単位は、所定の量(投薬量)の活性化合物を含む。
本発明のランチビオティック化合物および組成物は、医学的な治療または予防の方法において被験体に投与され得る。被験体はヒトまたは動物被験体でよい。動物被験体は、哺乳動物、または他の脊椎動物でよい。
A.ガルバジネンシスおよびA.リグリエに由来するアクタガルジン生合成遺伝子クラスターの同定およびクローニング
O/SBDIG-1は、48塩基から構成される、ジゴキシゲニン(DIG)で標識された縮重オリゴヌクレオチドである。これは、アクタガルジンの公知のアミノ酸配列を翻訳し、かつアクチノプラネス属のコドン使用を考慮することによって設計した。A.ガルバジネンシスから単離し、かつ制限酵素NcoIを用いて消化したゲノムDNAのサザンハイブリダイゼーション解析により、O/SBDIG-1にハイブリダイズする〜3kbの断片が同定された。ゲノムDNAのNcoI消化を繰り返し、かつ〜3kbのDNA断片を単離し、かつNcoI切断pLITMUS28(NEB)中にクローニングした。結果として生じるプラスミドを大腸菌(E. coli)DH10B細胞中に導入し、次いで、プローブO/SBDIG-1を用いてサザンハイブリダイゼーションによって解析した。ハイブリダイズするクローンを同定し、かつ配列解析にかけた。配列決定により、pLITAG01と呼ばれるこのプラスミドが、アクタガルジン生合成のためのLanA構造遺伝子をコードするDNA(actA)、ならびにABC糖輸送体の一部分をコードすると考えられる上流領域およびlanMを部分的にコードする下流領域(actM)からなることが明らかにされた。
株
本発明において使用される細菌株を表5にまとめる。
コスミドSuperCos1は、Stratagene社から入手した。プラスミドpLITMUSは、New England Biolabs社から入手した。
DNAプローブの標識
Rocheによって供給されているDigoxygenin(DIG)PCR DNA標識および検出キットを取扱い説明書に従って用いて、DNAハイブリダイゼーションプローブを調製した。
関心対象のDNAをアガロースゲル電気泳動によって最初に分離し、かつバキュームブロッター(Q BIO gene)を用いてナイロン膜(Hybond-N、Amersham Int.、UK)に移した。0.5M HClによるDNAの脱プリンにかかる時間を、ブロモフェノールブルーマーカーのバンドが完全に黄色に変わるのにかかる時間(典型的には、0.7%アガロースゲルの場合に15分〜20分)に基づいて判断した。次いで、1.5 M NaCl、1.5 M NaOHを用いてDNAを意図的に変性させ、次いで、0.5M Tris、1.5M NaCl、pH8.0をそれぞれさらに15分〜20分間用いて中和した。最低60分間20×SSCで浸すことによって、DNAの完全なブロッティングを容易にした。ブロットした膜をバキュームから取り出した後、室温で放置して風乾させた。UVトランスイルミネーター(UVP)上に膜(DNA側を下に向けて)置き、かつそれを365nmの波長で5分間、UVに曝露することによって、DNAを架橋した。
ハイブリダイゼーションによって選択しようとするコロニーをナイロン膜(Roche diagnostics)上に移した。これは、正に帯電したナイロン膜をコロニーの上に置き、かつ1分間しっかりと押して効果的な移動を徹底することによって、達成した。コロニーに関する位置を示すために、膜上に参照点をマークした。この後、膜を取り外し、かつRoche社のユーザーマニュアル(フィルターハイブリダイゼーション用のDIGアプリケーションマニュアル)に指示されているように、ハイブリダイゼーション用に準備した。
DNAを、HB-1000ハイブリダイゼーションオーブン(UVP)中、68℃で一晩(約16時間)、調製されたプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、2×クエン酸ナトリウム塩(SSC)+0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を用いて、室温で5分間の膜洗浄を2回実施した。これらの洗浄に続いて、SBDIG-1の存在下でハイブリダイズさせた膜の場合は1×SSC+0.1%SDS、およびSBDIG-2を用いてスクリーニングした膜の場合は0.1×SSC+0.1%SDSを用いて、68℃で、2回目の一連の15分洗浄2回を実施した。次いで、Roche社のユーザーマニュアル(フィルターハイブリダイゼーション用のDIGアプリケーションマニュアル)において推奨されているように、膜を発色させた。
FramePlotバージョン2.3.2、BioEdit配列アラインメントエディタ、ClustalW(EMBL-EBI)、およびBasic Local Alignment Search Tool(BLAST、NCBI)を用いて、コンセンサス配列を解析した。
CosAG14
コスミドCosAG14は、A.ガルバジネンシスから単離されたゲノムDNAの38168bp断片を含む。配列解析により、リーダーおよびアクタガルジンプレペプチドをコードするDNAが同定され、この遺伝子にactAという名称が割り当てられた。2つのアラニン残基が、アクタガルジンプレペプチドのすぐ上流に存在する。これらの残基は、アクタガルジンからリーダーペプチドをプロテアーゼが切断する際の認識部位に相当すると考えられている。この位置で部分的に切断されて、アラニンが維持されると、A.ガルバジネンシスの発酵ブロス中でルーチン的に観察されるala-アクタガルジンの産生がもたらされると考えられている。actA遺伝子の下流に、いくつかのlanMタンパク質、例えば、メルサシジン遺伝子クラスター由来のmrsMとの高い配列類似性(30%の同一性)を有する3162bpのDNA領域が存在する。この推定上の遺伝子は、actMと呼ばれ、アクタガルジンプレペプチドの修飾、脱水の触媒、およびチオエーテル形成に関与していると考えられている。actMの11bp下流に位置している、actOと呼ばれるオープンリーディングフレームは、いくつかのルシフェラーゼ型モノオキシゲナーゼとの配列類似性(〜39%の同一性)を有する314アミノ酸のタンパク質をコードする。モノオキシゲナーゼ、ActOの役割は、酸素の組込みを触媒して、デオキシ-アクタガルジンからアクタガルジンを生成させることであると考えられている。actOと逆の向きに、かつ62bp下流に位置して、actRと名付けられたオープンリーディングフレームが存在する。このorfのタンパク質産物は、いくつかの2成分応答調節因子と配列類似性(〜37%の同一性)を示す。789bp下流に位置し、かつactRと同じ向きに、ABC輸送体透過酵素との配列類似性(〜25%の同一性)を示す、推定上の812アミノ酸タンパク質が存在する。actTと呼ばれるこの推定上のタンパク質は、修飾されたランチビオティックの細胞からの搬出を担っている可能性がある。actTの下流の第2のorfおよび第4のorfのアミノ酸配列は、それぞれ、応答調節因子キナーゼおよびペニシリン結合タンパク質に対する類似性(〜30%の同一性)を示す。リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)中のナイシン生合成遺伝子クラスターに関する最近の研究(Gravesen et al., 2004)により、ヒスチジンキナーゼは、ペニシリン結合タンパク質および機能が不明のタンパク質と共に、ナイシン耐性の付与に関与していることが実証された。actAに極めて近い範囲内に類似遺伝子が存在することから、これらの遺伝子がアクタガルジン耐性メカニズムに関与していることが示唆され得る。
コスミドCosAL02は、アクチノプラネス・リグリエから単離されたゲノムDNAの40402bp断片を含む。配列解析により、コスミドCosAG14において同定されたactA遺伝子と高い配列相同性(50残基が同一)を有する64アミノ酸タンパク質をコードするlanA遺伝子を同定した。本発明者らは、lanA遺伝子のこの種をligAと呼んだ。このlanAのプレペプチドのアミノ酸配列は、アクタガルジンの配列と、以下に示す2種の遺伝子(SEQ ID NO:119およびSEQ ID NO:212)のアライメントにおいて示される2つの残基が異なる。
発現カセットの作製
本実施例では、本発明による発現カセットの作製を例示する。この発現カセット、プラスミドpAGvarXは、本発明の変異体lanA遺伝子の効率的な作製のために設計され、次いで、野生型actAが除去されたA.ガルバジネンシス株(A.ガルバジネンシスΔactA)のような宿主細胞中に導入され得る。このプラスミド、すなわちベクターpSET152の誘導体(Bierman et al., 1992)は、attP付着部位を介して宿主の染色体中に組み込まれる。アクタガルジン生合成遺伝子クラスターの残存する野生型遺伝子と共に、変異actA遺伝子を宿主生物によって発現させると、アクタガルジン変異体が生じるはずである。
別段の記載が無い限り、引用されるすべての位置は、SEQ ID NO:100に関する。プラスミドpAGvarXを構築するためのスキームは図3に示す。21237位のactAの上流に位置するorfに隣接した残基から21672位のactAコード領域内のロイシン残基までを、プライマーO/AGvar01bFおよびO/AGvar02bR(プライマー表)ならびに鋳型としてのpLITAG01を用いてPCRによって増幅した。これらのプライマーは、隣接するXbaI部位を5'末端に、およびactAをコードする3'ロイシン領域にサイレント変異によってBglIIを導入するように設計した。この断片を、SmaIを用いて予め消化した脱リン酸化pUC19中に導入して、pAGvar1を得た。
本実施例では、lanA遺伝子が不活性化されたランチビオティック産生宿主細胞の作製を例示する。本実施例において、宿主細胞は、actA遺伝子を欠失させられたA.ガルバジネンシスである。
A.ガルバジネンシスΔactA株を、アクタガルジン構造遺伝子actAの変異体を発現するための宿主として使用する。この株は、Gust et al., 2002によって開発されたリダイレクト技術を用いて、野生型A.ガルバジネンシスから作製した。初めに、actAをコードするコスミドCosAG14由来のDNA領域をカセットSBdel-1で置き換えた。SBdel-1は、FLP認識標的(FRT)部位にはさまれたアプラマイシン耐性遺伝子(aac(3)IV)およびoriTからなり、これを、SEQ ID NO:100の21536位および21802位にそれぞれ結合するプライマーO/SB50FおよびプライマーO/SB51Rと共に鋳型としてのプラスミドpIJ773を用いてPCRによって増幅した。リダイレクトプロトコール(Gust et al., 2004)に従って、CosAG14のactAをSBdel-1で置換して、コスミドCosAG14ΔAを作製した。続いて、SBdel-1カセットの中央部分を、リダイレクトプロトコールのステップ7に従い、FLPを介した切出しによってCosAG14ΔAから除去して、CosAG14ΔBを作製した。この領域を除去することにより、無極性かつ無標識のインフレーム欠失の作製、ならびに同じ耐性マーカーの反復使用が可能になる(Gust et al., 2003)。
本実施例では、非産生細胞S.リビダンスである宿主細胞におけるSEQ ID NO:100遺伝子クラスターからのアクタガルジン発現を例示する。このような宿主細胞は、これら2種のペプチドの活性変異体を作製する代替手段を提供する。
コスミドpMJCOS1(JIC(Norwich)によって供給される)は、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子が、oriT、attP、インテグラーゼ(int)、およびアプラマイシン耐性遺伝子(aac(3)IV)をコードするDNAを含むカセット(HEapra)で置換されているSuperCos1(Stratagene)の誘導体である。pMJCOS1をSspIで消化し、かつアガロースゲルからDNAを回収することによって、カセットHEapraを単離した。Gust et al., 2004によって説明されているリダイレクトプロトコールに従って、このカセットをCosAG14およびCosAL02と共に使用して、コスミドCosAG14HEapraおよびコスミドCosAL02HEapraをそれぞれ作製した。
MICの決定
本明細書において上記に開示したようにして作製した、選択された変異体を、一連の細菌に対する活性に関してさらに試験した。肺炎連鎖球菌は例外として、すべての生物に対する最小阻止濃度(MIC)は、カルシウム最終濃度400μg/mlまで無水塩化カルシウムを添加したミュラー・ヒントンブロス(MHB)中の2倍の抗生物質段階希釈物によって決定した。肺炎連鎖球菌(S.pneumoniae)に対する最小阻止濃度(MIC)は、400μg/ml塩化カルシウム二水和物を添加した脳‐心臓浸出物(BHI)ブロス中の2倍の抗生物質段階希釈物によって決定した。NCCLS基準M7-A6に従って、抗微生物物質ストック溶液を調製し、かつ保存した。
アクタガルジンおよびデオキシアクタガルジンに関するNMR研究
NMR分光法(COSY、TOCSY、HSQC、およびNOESY)を首尾良く使用して、アクタガルジン(A.ガルバジネンシス)およびデオキシアクタガルジンB(A.リグリエ)の産生株から得られる配列決定の結果を確認した。得られたデータは、全残基の完全に明瞭な割付は可能ではなかったが、図4に示す構造と一致しており、かつA.リグリエ由来のデオキシアクタガルジンBが15位および16位にそれぞれ残基Leuおよび残基Valを有することを確認するのに十分であった。
デオキシアクタガルジンBの以下の誘導体を作製した。式中、Z基およびC末端アミドは以下のとおりであった。
デオキシアクタガルジンB(20mg、11nmol)、適切なアミン(11nmol)、およびジイソプロピルエチルアミン(7.2μl、70nmol)の乾燥ジメチルホルムアミド(0.8ml)溶液に、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyBop)(70mg、134nmol)の乾燥ジメチルホルムアミド(1.0ml)溶液200μlを添加した。この混合物をHPLCによって解析して、反応の進行を追跡し、出発原料がすべて消費されるまで、一定分量のPybop溶液をさらに添加した。この段階でのHPLC解析により、ジアミドの多様な量(5%〜20%)も示された。反応の完了後、混合物を、20mM Kpiリン酸緩衝水溶液(pH7)(10ml)中30%アセトニトリルで希釈し、かつ表4に記載した条件を用いて、分離用HPLCによってモノアミドを精製した。適切な画分を初めの体積の25%まで濃縮し、かつ前準備されたC18 Bond Elutカラム(500mg)に添加することによって脱塩し、続いて、このカラムを2カラム容量の30%、40%、70%、および90%メタノール水溶液を用いた連続溶出によって洗浄した。適切な画分を蒸発させて、所望の産物を白色固形物として得た。
一般的手順1に従ってデオキシアクタガルジンBおよび3-(ジメチルアミノ)プロピルアミンを結合させることによって得た。収量18mg、収率85%。[M+2H 2+]計算値979.0。実測値980.2。
一般的手順1に従ってデオキシアクタガルジンBおよび4-(ピペリジノ)ピペラジンを結合させることによって得た。収量8mg、収率37%。[M+2H 2+]計算値1019.5。実測値1020.0;[M+3H 3+]計算値680.0。実測値680.0。
一般的手順1に従ってデオキシアクタガルジンBおよび1-(3-ジメチルアミノプロピル)ピペラジンを結合させることによって得た。収量10mg、収率46%。[M+2H 2+]計算値1013.5。実測値1014.0。
Fmocで保護された適切なアミノ酸(34nmol)の乾燥ジメチルホルムアミド(0.4ml)溶液を、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyBop)(11.4mg、22nmol)およびジイソプロピルエチルアミン(11μl、68nmol)の乾燥ジメチルホルムアミド(0.4ml)溶液で処理した。次いで、この混合物を、デオキシアクタガルジンB(2mg、11nmol)の乾燥ジメチルホルムアミド(0.5ml)溶液に添加した。この混合物を室温で1時間放置した。1時間後、分析用HPLC(20mM Kpiリン酸緩衝水溶液(pH7)中30%〜65%アセトニトリル)は、出発原料の完全な変換を示した。この反応混合物を40%メタノール水溶液(20ml)で希釈し、この混合物を、2カラム容量の100%メタノール、続いて2カラム容量の水で洗浄することによって前準備しておいたC18 Bond Eluteカラム(500mg)に通した。このカラムを、2カラム容量の40%、50%、60%、70%、80%、90%、および100%メタノール水溶液で順次溶出させた。画分をHPLCによって解析し、かつFmocで保護された結合産物を含む画分を蒸発乾固させた。残渣をジメチルホルムアミド(1ml)中に溶解し、かつピペリジン(50μl)を添加して、Fmoc保護基を除去した。反応の進行をHPLCによってモニターし、出発原料が完全に消費された後、溶液を30%メタノール水溶液(20ml)中に希釈した。次いで、前述したように、この混合物をC18 Bond Elutカートリッジ(500mg)に通して溶出させ、かつ適切な画分の蒸発後に得られる産物を、表4に記載する条件を用いる分離用HPLCによってさらに精製した。適切な画分を初めの体積の25%まで濃縮し、かつ前準備されたC18 Bond Elutカラム(500mg)に添加することによって脱塩し、続いて、このカラムを2カラム容量の30%、40%、70%、および90%メタノール水溶液を用いた連続溶出によって洗浄した。適切な画分を蒸発させて、所望の産物を白色固形物として得た。
一般的手順2に従ってデオキシアクタガルジンBおよびFmoc-D-アラニンから収率74%で調製した。[M+2H 2+]計算値972.5、実測値973.0。043/188
一般的手順2に従って、デオキシアクタガルジンBおよびFmoc-L- イソロイシンから収率27%で調製した。[M+2H 2+]計算値993.5。実測値993.8。
一般的手順2に従って、デオキシアクタガルジンBおよびFmoc-L-バリンから収率55%で調製した。[M+2H 2+]計算値986.5。実測値985.9。
一般的手順2に従って、デオキシアクタガルジンBおよびFmoc-L-フェニルアラニンから収率22%で調製した。[M+2H 2+]計算値1010.5。実測値1010.9。
一般的手順2に従って、デオキシアクタガルジンBおよびBis(Fmoc)-L-リシンから収率45%で調製した。[M+2H 2+]計算値1001.0。実測値1001.6。
一般的手順2に従って、デオキシアクタガルジンBおよびFmoc-L-トリプトファンから収率55%で調製した。[M+2H 2+]計算値1030.0。実測値1029.9。
MIC決定
ブドウ球菌種、連鎖球菌種、腸球菌(Enterococcus)種
最小阻止濃度(MIC)を決定し、かつ好気性細菌に関するNCCLS基準の微量希釈ブロス法(M7-A6、2003)に従って、抗微生物物質ストック溶液を調製し、かつ保存した。MICは、ミュラー・ヒントンブロス(MHB)または脳‐心臓浸出物(BHI)ブロス(肺炎連鎖球菌)中の2倍の抗生物質段階希釈物によって決定した。活発に増殖しているブロス培養物を、無菌ブロス中で、または直接的なコロニー懸濁によって(肺炎連鎖球菌)、マックファーランド0.5標準液に等価である濁度(1×108CFU/ml)に調整し、次いで、無菌ブロス中にさらに希釈して、無菌96ウェルマイクロタイタープレート中の約5×105CFU/mlの最終接種物を得た。これらのアッセイ法は、参照対照株として含まれるエンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)ATCC29212および精度管理のための参照抗生物質としてのバンコマイシンと共にデュプリケートで実施した。37℃で18〜20時間、振盪しながら、プレートを好気的にインキュベートし、眼に見える増殖をもたらさない薬物の最低濃度としてMICを定めた。
C.ディフィシレに対する最小阻止濃度(MIC)を決定し、かつ嫌気性細菌に関するNCCLS基準の寒天希釈法(M11-A5、2001)に従って、抗微生物物質ストック溶液を調製し、かつ保存した。2倍の抗生物質段階希釈物をウィルキンス・チャルグレン(Wilkens-Chalgren)寒天(WCA)中で調製した。試験生物を、ブレジャ(C.C.E.Y.)寒天上で48時間増殖させた後に選択し、シェドラー(Schaedler)ブロス中でマックファーランド0.5標準液に等価な密度(約1×108CFU/ml)まで継代培養し、WCAプレート上への最終接種物を約105CFU/スポットとした。バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)ATCC 25285を参照対象株として含み、かつメトロニダゾールを精度管理のための参照抗生物質として使用した。操作はすべて、酸素に短時間しか曝露されないように、前還元培地中、周囲雰囲気、デュプリケートで実施した。プレートを嫌気的に37℃で48時間インキュベートし、薬物濃度としてMICを定めた。この際、嫌気的な対照プレートでの増殖と比べて、試験プレートでの増殖の出現に著しい減少が生じた。
試験生物を、フラゾリドン(1〜2μg/ml)を添加したウィルキンス・チャルグレン寒天(WCA)上で3日〜7日間増殖させてから選択した。新鮮なウィルキンス・チャルグレンブロス(WCB)に、直接的なコロニー懸濁によって、P.アクネスの単一コロニーを接種し、かつマックファーランド0.5標準液に等価な密度(1×108CFU/ml)に調整し、次いで、無菌WCB中でさらに希釈して、無菌96ウェルマイクロタイタープレート中の約105CFU/mlの最終接種物を得た。NCCLS標準(M11-A5、2001)に従って調製および保存したストック溶液を用いて、2倍の抗生物質段階希釈を滅菌水中で実施した。これらのアッセイ法は、精度管理のための参照抗生物質として使用したバンコマイシンおよびクリンダマイシンと共にデュプリケートで実施した。プレートを嫌気的に37℃で48時間〜72時間インキュベートし、薬物濃度としてMICを定めた。この際、嫌気的な対照プレートでの増殖と比べて、試験プレートでの増殖の出現に著しい減少が生じた。操作はすべて、酸素に短時間しか曝露されないように、前還元培地中、周囲雰囲気、デュプリケートで実施した。
上記の実施例2〜7において使用した材料および方法は以下のとおりである。
ミクロコッカス・ルテウスを凍結したストックからミュラー・ヒントンブロス10ml中に接種し、かつ200rpmで振盪しながら30℃で一晩増殖させた。この培養物1mlを用いて、ミュラー・ヒントン寒天300ml中に接種し、次いでペトリ皿中にこれを注いだ。コルクボーラーを用いて、等距離の間隔を空けて置いたウェル(直径6mm)を作製し、続いて、各試料50μlを添加した。このバイオアッセイ法プレートを、添加した試料が拡散するまで、層流中に入れ、拡散した時点でプレートを30℃インキュベーターに移し、一晩放置した。
制限酵素によるDNAの消化を、供給される緩衝液中で、かつ製造業者のガイドラインに従って実施した。典型的には、予備消化物の場合、推奨される温度で3時間、12ユニットの酵素でDNA 5μgを消化した。分析用消化物の場合、推奨される温度でさらに2時間〜3時間、2ユニットの酵素でDNA 0.5μgを消化した。消化したDNAをアガロースゲル電気泳動によって解析した。
寄せ集めた接合完了体の寒天プラグを用いて、8ml TSBおよびガラスビーズ2個を含む50mlフラスコに接種した。これらの培養物を30℃、250rpmで10日間インキュベートし、次いで、100μlを取り出し、かつガラスビーズ2個を含む50mlフラスコ中のTSB 10mlに添加した。これらのフラスコを2日間インキュベートし、次いで1mlを取り出し、TSB 10mlを含む50mlフラスコに接種するのに使用した。接種物1mlを用いて、合計6回の連続的な増殖(それぞれ、30℃、250rpmで2日間のインキュベーション)を実施した。6回目の継代培養から得られる細胞を、4000rpmで20分間、遠心分離(Heraeus Sepatech Megafuge)することによって沈殿させ、次いで、TSB中で30秒間、超音波処理して(MSE Sanyo Soniprep 150、振幅10ミクロン〜15ミクロン)、菌糸体を破壊した。超音波処理した細胞の段階希釈物(TSB中10-1〜10-5)を培地65に播種し、かつ30℃でインキュベートした。
ガラスビーズ2個ならびにナリジクス酸および適切な選択用抗生物質を添加したTSBまたはAAS1培地8mlをそれぞれ含む50ml円錐フラスコに、寒天プラグまたは-80℃のグリセロールストック250μlを用いて接種した。30℃、200rpmで2日〜4日間インキュベーションした後、播種培養物当たり1.2ml(3%)を用いて、ガラスビーズ2個を含む250ml円錐フラスコ中の各産生用培地40mlに接種した。これらの培養物を30℃、200rpmで9日間、インキュベートした。バイオアッセイ法による解析および/またはHPLC-MS解析のために、全ブロスのアリコート1.5mlを各培養物から周期的に取り出した。
ガラスビーズ2個およびSV2培地50mlをそれぞれ含む250ml円錐フラスコに、グリセロールストックから得たA.リグリエ細胞500μl(1%)を接種した。30℃、250rpmで4日間インキュベーションした後、播種培養物当たり12ml(3%)を用いて、2L円錐フラスコ中のGM3 400mlに接種した。これらの培養物を30℃、225rpmで9日間、インキュベートした。4000rpmで30分間の遠心分離(Heraeus Sepatech Megafuge)によって培養ブロスを回収し、その後、細胞沈殿物から上清をデカントした。
ガラスビーズ2個およびAAS培地50mlをそれぞれ含む250ml円錐フラスコに、グリセロールストックから得たA.ガルバジネンシス細胞500μl(1%)を接種した。30℃、250rpmで9日間インキュベーションした後、播種培養物当たり12ml(3%)を用いて、2L円錐フラスコ中のAAS 400mlに接種した。これらの培養物を30℃、200rpmで8日間インキュベートした。4000rpmで30分間の遠心分離(Heraeus Sepatech Megafuge)によって培養ブロスを回収し、その後、細胞沈殿物から上清をデカントした。
Diaion HP-20樹脂(50g/L)を添加し、A.リグリエの発酵物から単離した上清と混合し、かつ4℃で一晩放置した。懸濁液を等分してBond Elutカラム(60ml)に添加し、かつ4カラム床容量の水とそれに続く3カラム床容量の25%、50%、75%、および100%メタノールで順次、樹脂を洗浄した。HPLC解析により、50%、75%、および100%メタノール画分中のデオキシアクタガルジンBの存在を確認した。これらの画分を合一し、次いで、出発時プールの約4分の1の体積まで濃縮した。ブロス1Lからの濃縮物を、2カラム容量の100%メタノール、続いて2カラム容量の水で洗浄することによって前準備しておいた2つのC18 Bond Eluteカラム(5g)に添加した。これらのカラムを、2カラム容量の50%、60%、70%、80%、90%メタノール、続いて2カラム容量の100%メタノールで順次溶出させた。HPLC解析により、80%、90%、および100%メタノール画分中のデオキシアクタガルジンBの存在を確認し、これらの画分を集め、かつ出発時の体積の3分の1まで濃縮した。50%メタノールに溶かした等体積の40mMリン酸カリウム(pH2.5)を添加し、次いで、前もって平衡化したSCX Bond Elutカラム(1g)3つに均等に濃縮物を添加した。50%メタノールに溶かした40mMリン酸カリウム(pH2.5)でSCXカラムを最初に洗浄し、次いで、1.5カラム容量の50%メタノールに溶かした250mMリン酸カリウム(pH7.0)を用いて溶出させた。2カラム容量のメタノール、続いて2カラム容量の水で前準備しておいたC18 Bond Eluteカラム(5g)に添加することによって、溶出液を脱塩した。2カラム容量の50%メタノール、次いで60%メタノールでカラムを洗浄した。それぞれ2カラム容量の70%、80%、90%、および100%メタノールを添加した後に、デオキシアクタガルジンBを溶出させた。HPLC解析およびLC-MS解析によって確認された、精製したデオキシアクタガルジンBを含む画分を集め、かつ蒸発乾固させた。
Diaion HP-20樹脂(50g/L)を、A.リグリエの発酵物4リットルから得られた上清と混合し、かつ4℃で一晩放置した。懸濁液をガラス焼結漏斗中に集め、かつ4カラム床容量の水とそれに続く4カラム床容量の50%メタノールで順次、樹脂を洗浄した。5カラム床容量の100%メタノールで洗浄することによって、デオキシアクタガルジンBおよびAla(0)-デオキシアクタガルジンBを樹脂から溶離させた。100%メタノール画分を元の体積の3分の1まで濃縮し、次いで、最終濃度が60%メタノールになるまで水を添加することによって希釈した。結果として生じる溶液を4つの10g C18 Bond Elutカラムに添加した後、2カラム容量の50%メタノールで洗浄した。2カラム容量のメタノール/0.5%ギ酸を用いて、デオキシアクタガルジンBに関連した成分をカラムから溶出させた。結果として生じる溶出液を蒸発によって40mlまで濃縮し、かつ下記の表に記載する条件を用いる分離用HPLCによってデオキシアクタガルジンBからAla(0)デオキシアクタガルジンBを分離した。
SCX Bond Elut段階の後にAla(0)アクタガルジンおよびアクタガルジンを分離するために調製用HPLCが必要とされる点を除いては、A.リグリエからのデオキシアクタガルジンB精製に関して説明した方法を用いて、アクタガルジンおよびAla(0)-アクタガルジンを精製した。SCX Bond Elutカラムからの溶出液を回転式蒸発によって70mlから18mlまで濃縮し、かつ結果として生じる濃縮物を、表4に記載した条件を用いて、調製用HPLCによって精製した。(HPLC解析およびLC-MS解析によって確認された)アクタガルジンおよびAla(0)アクタガルジンを含む各画分を、前述したようにC18 Bond Elutカラムを用いて脱塩した後、蒸発乾固させた。
Sambrook et al., 1989に説明されているようにして、DNAの電気泳動を実施した。最終濃度0.1μg/mlの臭化エチジウムを含むTAE緩衝液中でアガロースゲル(0.7%〜1%)を調製して、紫外線光によるDNAの可視化を可能にした。0.1体積の10×アガロースゲル添加溶液を試料と混合した。試料を、100bp、1kb、またはλDNA-HindIII消化物ラダー(NEB)の横に並べてゲル上に添加し、かつ1V/cm〜5V/cmで泳動させた。ゲルをλ=300nmで可視化し、かつUVPビデオカメラを用いて撮影した。
DNAをアガロースゲルから切り出し、Qiaquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いて回収し、かつ滅菌済み逆浸透精製水、Tris-HCI(10mM、pH8.5)、またはTE緩衝液のいずれかに溶出させた。
制限酵素によるDNA消化によって作り出された、窪んだ3'末端の充填は、大腸菌DNAポリメラーゼクレノウ断片を用いて実施した。典型的な反応において、1μgDNA当たり1ユニットの酵素を250μMの各dNTPと共に加えた。反応物を25℃で15分〜30分間インキュベートし、かつEDTAを最終濃度10mMまで添加することによって反応を停止した。
Sambrook et al., 1989によって説明されている方法に従って、37℃で30分間、T4ポリヌクレオチドキナーゼでPCR産物を処理した。65℃で20分間インキュベートすることによって酵素を不活性化した。
直線状にされたベクターの自己ライゲーションを回避するために、製造業者のガイドラインに従ってエビアルカリホスファターゼ(SAP)を用いて、5'-リン酸基を除去した。典型的な反応において、DNA制限反応の最後の1時間、1ユニットのSAPを制限混合物に加えた。65℃で20分間インキュベートすることによって酵素を不活性化した。
Sambrook et al.,(1989)によって説明されているように、総体積15μlのT4 DNAリガーゼ1ユニット(U)を用い、かつ16℃で12時間〜16時間インキュベーションして、DNAライゲーションを実施した。
生細胞は、各培養物0.5mlを最終濃度10%のグリセロールと共に-80℃で凍結することによって、グリセロール懸濁物として保存した。発酵ブロスまたはグリセロールストックに由来する50μlを培地65またはABB13プレートのいずれかに画線することによって、A.ガルバジネンシスおよびA.リグリエの単一コロニーを得た。
Stratagene Robocycler Gradient96を用いてポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)を実施した。典型的な反応において、鋳型DNA100ng〜200ngを、各オリゴヌクレオチドプライマー20pmolおよび各250μMのdNTPと混合した。製造業者によって供給される好熱性のDNAポリメラーゼ緩衝液およびDMSOは、最終体積50μlまたは100μlの反応混合物のそれぞれ10%(v/v)を構成した。典型的な反応は、1分間の変性(94℃)、1分、Y℃(アニーリング)、および30秒〜3分間の伸長(72℃)の初回サイクルで開始し、伸長終了時に、5ユニットの好熱性DNAポリメラーゼを添加した。これに続いて、94℃で1分間、Y℃(アニーリング)で1分間、および72℃でX分間を30サイクル、ならびに72℃で2X分間の最終サイクルを実施した。伸長時間Xは、Taqポリメラーゼを使用する場合は産物1kb当たり1分であり、Pfuポリメラーゼを使用する場合は産物1kb当たり2分であった。アニーリング温度Yは、pAGvar1およびpAGvar2を作製する際、それぞれ55℃および49℃であった。SBdel-1およびSBdel-2を作製するために使用する条件は、リダイレクトプロトコール(Gust et al., 2004)に説明されているとおりであった。
プラスミドDNAは、適切な抗生物質を含む3mlの無菌2TYまたはLBに、2TY(またはLA)寒天プレートから採取した単一コロニーを接種することによって、小規模(20μg未満の調製)で調製した。培養物を37℃および250rpmで一晩(12時間〜16時間)インキュベートした。これらの細胞を12,000×gで1分間の遠心分離によって回収し、かつ製造業者のガイドラインに従ってWizard(Promega)Miniprepキットを用いて、プラスミドDNAを得た。プラスミドDNA最大100μgのより多量の調製物の場合、2TY培養物30mlを増殖させ、かつ製造業者の取扱い説明書に従ってQiagen Midi-prepキットを用いてプラスミドDNAを抽出した。制限解析および/または配列解析の組合せによって、すべてのプラスミド調製物を検査した。
コスミドDNAは、適切な抗生物質を含む50mlの無菌2TYまたはLBに、2TY(またはLA)寒天プレートから採取した単一コロニーを接種することによって調製した。培養物を37℃および250rpmで一晩(12時間〜16時間)インキュベートした。これらの細胞を4,000rpm(Heraeus sepatech Megafuge 2.0R)で20分間の遠心分離によって回収し、かつ製造業者のガイドラインに従ってQiagen Midi-prepキットを用いて、コスミドDNAを単離した。
Dower et al.,(1988)の方法によって、エレクトロコンピテントな大腸菌DH10Bを調製した。コンピテント細胞のアリコート(60μl)を氷上で解凍し、かつ1.8μlのライゲーション混合物またはプラスミドDNAを添加した。混合物をエレクトロポレーションキュベット(Sigma 0.1cm)中に入れ、かつエレクトロポレーター(Stratageneエレクトロポレーター-1000に移した。1.8kV/mm(25μF、200Ω)の電位差を加え、続いて、0.5mlの2TY培地またはLB培地を加えた。次いで、これらの細胞を37℃で45分〜60分間インキュベートして、抗生物質耐性遺伝子を発現させた後、適切な選択培地に播種した。
Kieser et al.(2000)によって説明されている手順を用いて、ゲノムDNA鋳型を調製した。
大腸菌株ET12567/pUB307(Flett et al., 1997)の代わりに大腸菌株ET12567/pUB8002(Kieser et al., 2000)を使用した以外は、Heinzelmann et al.(2003)によって説明されている手順に従って、大腸菌とアクチノプラネス種の属間接合を実施した。接合完了体を、50μg/mlのナリジクス酸および妥当な選択用抗生物質を含む培地65またはABB13の約1 cm2の領域に移動し、かつ寄せ集めた。これらのプレートを30℃で4日〜7日間インキュベートした後、ブロス培養物に対する接種物として使用した。
Kieser et al., 2000によって説明されている手順に従って、大腸菌とストレプトマイセス種の属間接合を実施した。接合完了体を、50μg/mlのナリジクス酸および妥当な選択用抗生物質を含むSFMの約1cm2の領域に移動し、かつ寄せ集めた。これらのプレートを30℃で4日〜7日間インキュベートした後、ブロス培養物に対する接種物として使用した。
抗生物質ストック溶液を(別段の記載が無い限り)水中で調製し、かつ0.22μm Milliporeフィルターを通過させることによってろ過滅菌した。エタノール中に溶解した溶液は、滅菌しなかった(Sambrook et al., 1989)。抗生物質はすべて-20℃で保存した。アプラマイシンを使用した培地では、(2.5Mのストック溶液から)最終濃度10mMになるまでMgCl2を添加した。
Micromass Platform LC(MassLynx 3.5バージョンソフトウェアを用いて操作)に連結したHewlett Packard 1050シリーズのHPLCシステムを、以下のパラメーターと共に用いて、HPLC-MS解析を実施した。
カラム:Agilent Zorbax SB-C18 150 x 4.6mm 5μ
流速:1ml/分
移動相:A 10%アセトニトリル、0.1%ギ酸、90%水
B 90%アセトニトリル、0.1%ギ酸、90%水
10分間に渡るAからBへの直線勾配、1分間維持、B-A
波長:200nm〜400nm
注入体積:10μl
ポストカラムスプリット比:1:10
質量分析計:Micromass Platform LC
モード:エレクトロスプレー陽性
窒素流量:380 l/時間
キャピラリー電圧:40V
スキマーレンズ(Skimmer lens)オフセット:5V
NCIMB41362は、ブダペスト条約のもと、Novacta Biosystems Limitedによって、2005年12月7日にNCIMB Ltd、Aberdeen、AB21 9YA、スコットランド(英国)に寄託した。
Claims (15)
- 下記式の化合物:
式中、
-X1-X2-は-Leu-Val-を表し、
Yは-S-であり、
Zは、アミノ酸または-NH2のいずれかであり、ここで-NH2は、1位のAlaのN末端を表し、
Rは-OHまたは-NR1R2を表し、
式中、R1およびR2は、独立に、
(i)水素、
(ii)式中のnが2〜8の整数を表し、かつR3およびR4が、独立に、水素もしくはC1〜4アルキルを表すか、またはR3およびR4が、共に-(CH2)3-基、-(CH2)4-基、(CH2)2-O-(CH2)2-基、-(CH2)2-S-(CH2)2基、もしくは-(CH2)5-基を表す、式-(CH2)n-NR3R4の基
を表すか、あるいは
R1およびR2は、隣接する窒素原子と共にピペラジン部分を表し、ピペラジン部分の4位は、
(a)C1〜4アルキル、
(b)C5〜7シクロアルキル、
(c)ピリジル、
(d)式中のpが1〜8の整数を表し、かつR5およびR6が、独立に、水素またはC1〜4アルキルを表す、-(CH2)p-NR5R6、
(e)ピペリジニル、
(f)C1〜4アルキルであるN置換基を有する、置換されたピペリジニル
(g)ベンジル、ならびに
(h)クロロ、ブロモ、ニトロ、C1〜4アルキル、およびC1〜4アルコキシより選択される1つまたは2つの置換基をフェニル部分が有する、置換されたベンジル
より選択される置換基で置換されてもよい;
またはその薬学的に許容される塩。 - Zがアミノ酸である、請求項1記載の化合物。
- アミノ酸がAlaである、請求項2記載の化合物。
- Zが-NH2である、請求項1記載の化合物。
- RがOHである、請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物。
- R1およびR2が、独立に、
(i)水素、
(ii)式中のnが2〜8の整数を表し、かつR3およびR4が、独立に、水素もしくはC1〜4アルキルを表す、式-(CH2)n-NR3R4の基
を表す、
請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物。 - デオキシアクタガルジンB N-[3-ジメチルアミノプロピル]モノカルボキシアミド(monocarboxamide);
デオキシアクタガルジンB N-[1-(1-メチル-4-ピペリジニル)ピペラジン]モノカルボキシアミド;
デオキシアクタガルジンB[1-(3-ジメチルアミノプロピル)ピペラジン]モノカルボキシアミド;
デオキシアクタガルジンB;
D-Ala(0)デオキシアクタガルジンB;
L-Ile(0)デオキシアクタガルジンB;
L-Val(0)デオキシアクタガルジンB;
L-Phe(0)デオキシアクタガルジンB;
L-Lys(0)デオキシアクタガルジンB;および
L-Trp(0)デオキシアクタガルジンB
からなる群より選択される、請求項1記載の化合物。 - 薬学的に許容される担体と共に、請求項1〜7のいずれか一項記載の化合物を含む、薬学的組成物。
- 経口投与のための、請求項8記載の薬学的組成物。
- 治療における使用のための、請求項1〜7のいずれか一項記載の化合物または請求項8もしくは9記載の薬学的組成物。
- 細菌感染の治療における使用のための、請求項1〜7のいずれか一項記載の化合物または請求項8もしくは9記載の薬学的組成物。
- 細菌感染の治療における使用のための薬剤の調製における、請求項1〜7のいずれか一項記載の化合物の使用。
- 核酸がA.リグリエ(A. liguriae)において発現される、請求項13記載の方法。
- A.リグリエが、ブダペスト条約のもと、受託番号:NCIMB41362で寄託されている、請求項14記載の方法。
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