PT97390A

PT97390A - Processo de producao de derivados da eritromicina e de microorganismos geneticamente modificados

Info

Publication number: PT97390A
Application number: PT97390A
Authority: PT
Inventors: J Mark Weber; James B Mcalpine
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 1990-04-18
Filing date: 1991-04-17
Publication date: 1992-01-31
Also published as: KR960705835A; EP0525083A1; EP0525083A4; JP2587562B2; US5141926A; CA2080583A1; JPH05504890A; IE911188A1; KR960008668B1; WO1991016334A1

Description

ί'Ζ 468 4802«PG»01 -2-

MEMORIA.....DESCRILIVA CAMPO.....TÉCNICO. 0 presente invento refere-se a uma nova classe cie derivados da eritromicina. Em particular» o presente invento refere-se a compostos de 6-desoxi-eritromicina» à utilização destes compostos como antibióticos e a um processo para a sua preparação* ANTECEDENTES... OO....INyENTO.

As eritromicinas, e em particular a eritromicina A, são antibióticos macrolidos de largo espectro, clinicamente úteis» produzidos pela bactéria gram-positíva Saccharopolvepora ervthraea (anteriormente Streptomyces erythreus)* Contudo, uma grande desvantagem das eritromicinas é a sua fraca estabilidade em meios ácidos* a qual pode ocasionar absorção oral irregular e diminuída»

Sintetizaram-se quimicamente numerosos derivados da eritromicina numa tentativa de produzir compostos com estabilidade em meios ácidos melhorada sem perda da actividade antibacteriana. Descreveu-se a (98)-9-di-hidro-eritromicína A (a qual possui um grupo 9-hidroxi em vez do grupo 9-ceto) (Wiley e colab», J......Amer»

77::3676-3677 (1955)). Também foram descritas a eri- tromicilamina e a oxima de eritromicina rias quais o grupo 9-ceto é substituído, respectivamente, por um grupo amino ou um grupo oxima (6B 1 100 504; Massey e colab.» Tetrahedron........Letters* 2; 157-160 (1970)), assim como vários éteres de oxima de eritromicina (U.S» 3 681 326, U.S* 3 869 445 e U.S. 4 063 014),. A 6-0-me-til-eritromicina (claritromicína) e a 6,ll-di-0-meti1-eritromici-na A estão descritas na U.S» 4 743 593.

Embora os derivados anteriores apresentem estabilidade em meios ácidos melhorada, os processos sintéticos pelos quais eles são produzidos são dispendiosos e podem produzir rendimentos baixos» Alem disso, a instabilidade em meios ácidos do material de partida (isto é, a eritromicina) dificultou os esforços para sintetizar derivados mais activos»

Existe» consequemtemente» uma necessidade dei derivados da eritromicina com estabilidade em meios ácidos melhorada e» além disso, de derivados que sejam produzidos por microorganismos e que» desse modo, rodeiam a ineficácia dos processos sintéticos anteriormente mencionados ou que, pelo menos, proporcionem um material de partida mais favorável para a preparação de derivados sintéticos»

SUMáRIQ.....00 ...INVENTO

Os compostos e misturas do presente invento incluem 6-deso-xi-eritromicinas e 6-desoxi-15-noreritromicinas» as quais são re- pres&ntadas pe1a Fórmu1a estrutural In

na qual R-t é seleccionado de entre OH e M, e FT?. e são selec-cionados» índependentemente um do outro, de entre H e CH^., Tam bém se encontram incluídos me d iário b i o s s intéti co 3 assim como os ésteres e os entre os compostos do invento o inter~ -α-mi ca rosi1-6-desoxi-eri t rono i i do g s a i s f a r m a c e u t i c a m e n t e a c e i t ã v e i s q 0 s

c o m p o s t o s d e F o r rn u 1 a I 0 processo do presente invento inclui a modificação genética de um microorganismo produtor de eritromicina» de modo que o croorganismo é transformado numa estirpe produtora dos compostos do invento, 0 genoma do microorganismo é modificado geneticamente numa região que é essencial para a hidroxilaçao em C-e q,*

72 468 4802PQ „ 01 -4— um intermediário na via biossintétíca da eritromicina» Numa con~ cretizaçâo particular do invento» o AON do microorganismo a ser modificado encontrasse na regi ião genomica responsável pela hidro-xilacâo do 6-desoxí-erítronai ido B em erítronoiido β polo sistema do citocromo P450 mono-oxigenase de 8».....ervthraea.

Oe acordo com um aspecto do processo do invento., a transformação de um microorganismo produtor de eritromicina numa estirpe produtora de 6-desoxi-eritromicina é alcançada por integração» por meio de recombinação homologa» de um plasmideo mutagénico numa porção do AON do microorgariismo que è responsável pela hí-droxilaçâo em C-6» Este plasmideo de integração é construído para ser capaz de ser mantido de forma estável no microorganismo, isto é» de ser passado de uma célula transformada para a sua pro-genia transi ormada de modo semelhante,. Numa concretização particular do invento., o plasmideo de integração é construído utilizando um fragmento de AON que é homólogo a uma porção do AON essencial para a operação do sistema do citocromo P4S0 mono-oxi-genase em 8».....ervthraea»

Ue acordo com um aspecto adicionai do processo do invento» um transformante de S».........e.rvthraea produtor de 6-desoxi-eritromi- eina é cruzado geneticamente com uma segunda estirpe de s. ery-t.b.L.a.fêaa q u a 1 f o i d esen v o 1 v i. d a s e 1 e c 11 v a m en t e p a r a p r o d u z i r n i — veis elevados de eritromicina A., Oe entre a progériia deste cruzamento são seleccionados microorganísmos recombinantes que conservam a capacidade de produzir ó~desoxi-eritromicina, mas que alcançam rendimentos mais elevados do que aqueles possíveis com a estirpe transformante original»

Um microorganismo concretizando o presente invento é uma nova estirpe de ........erythraea.» a qual produz» após cultura num meio aquoso contendo fontes assimiláveis de azoto e de carbono» um composto seleccionado de entre 6-desoxi-eritromicinas A, B» C e D» e 6-desoxi-i5-noreritromicinas A» 8» e e 0.. Mais preferivelmente» o microorganismo deste invento é aquele que foi cruzado com um produtor de eritromicina de elevado rendimento e que demonstra urna capacidade aumentada para produzir os compostos do / í& 72 468 4802 „ PC3 „ ΟΧ invento

BREVE.....DESCRIÇÃO.....DOS.....DESENHOS 0 presente invento serei ruais prontamente entendido em conexão com os desenhos em anexo., nos quaisϊ a Figura X é uma vía metabólica proposta para a biossintese da eritromicina A em SL.....ervthraeas a Figura 2 e um fiuxograma representando a construção do piasmideo pMW56-~H23 a partir do plasmideo pMW27; a Figura á e a sequência de AON do gene eryF responsável pela nidr oxilação em C—ó na. 3., erythraeaij a Figura 4 e a sequencia de AON de um fragmento de 503 pb utilizado como sequência de reconhecimento num plasmideo de integração do invento;;

a Figura 5 é um mapa de restrição do plasmideo pMW56~H23S igura 6 ~ uma r cptação esquemática da transformação ^ —LU.lLa&i. UWXXO peia integração do plasmideo pMW56~H23 contendo uma sequência de adn homólogas a i igura .· é um mapa eromossõmico da região genómica de s, .«.Lt.UlLi.lw contvrido o cacho qe genes biossintétíco da eritromici- na;; as Figuras 8 e 9 sao o» espectros de RMN de 1H a 500 MHz das 6-desoxi-X5-noreritromicinas A e ϋ,, reapectivamente.

DESCRIÇÃO... DETALHADA.....DO.....INVg^Q 0 presuntw in^ento Proporciona novos derivados da eritromi-cin^ e oeub esteies « saís farmaceutícamente aceitáveis., bem como a utilização Jev»tew compostos como antibióticos e um processo P«i <3. a eua preparação,. Os compostos do invento têm fórmula es- 72 468 4802 -PO„01 trutural I: >. >u

r ~6~

(I) na qual R.j é seleccionado de entre OH e H, © R,··, e R3 sâo selec~.

cionados, independentemente um do outro, de entre H e ch3- Os compostos de Fórmula I também aqui são designados como 6~desoxi ~eritromicinas A a 0 e e-desoxi-lS “-norerítromicínas A a r~:i» como se segues &1 1¾ 6 ~D e so x i-e ritromic i na A OH CH3 ch3 6~Desoxi~eritromicina B t H ch3 CH; v> 6 - 0 e s o x i e r i t r o m i c i n a C OH H CH,- O ó-Oesoxi-erítromicina D H H CM, o ó-Desexí-lS-noreritrornicina A OH CH'5 H 60esox i ~ 15~η orer i t romicina B H CH·* s..1 H 6~ΰesox i ” 15η o r e r i t r om i c i n a C OH H H 6 ™ D e s o x i-x5-η o reritrom icina D H H H

Estes compostos sâo obtidos por crescimento de um microor~~ ganismo produtor de eritromícina rnodif ícado geneticamente , em cultura.:, e, em seguida., ©xtracção dos mesmos do meio de cultura,. Numa concretização do invento aqui descrito, o microorganismo utilizado é a bactéria Saccharopol.yspox.&....er^t.jb.tã.f.^··· 0 presente invento também proporciona um processo para a produção dos compostos anteriores, compreendendo a transformação de um microorganismo produtor de eritromicina do tipo selvagem °u natural., numa variante produtora dos compostos desejados» Num& concretização do invento, o transformante resultante é defici®nte

72 468 4802.PQ.0JL s:à~ “' no oieterna do eitrocromo P450 mono-oxigenase, o qual no microorgan ismo Saccharopolvs&ora do tipo selvagem é responsável pela hidroxilação do 6-desox i-e r i trono1ido B na posição C-6 durante a biossíntese da eritromicina» Dado que os restantes passos da via biossintética da eritromicina continuam a funcionar, são produzidos os compostos do presente inventa em vez das eritromicinas a a D „ 0 invento também proporciona, como um exemplo, urn processo particular para interrupção da hidroxilação em C-6, compreendendo a integração, por meio de reconnbinação homóloga, de um plasmideo no genoma do microorganísmo» 0 plasmideo de integração e cons truído compreendendo uma sequência de nucleótidos a qual é homologa com uma porção do genoma do microorganismo- Numa concretização do invento, a homologia é com uma subsérie do gene a qual, no microorganismo do tipo selvagem, é responsável pela hidroxí-laçáo na posição 0-6., A integração do plasmideo no local de homologia separa o gene em duas sequências incompletas, nenhuma das quais é suficiente para a hidroxilação em C-6. A hidroxilação é, consequentemente, interrompida desde que o plasmideo de integração seja mantido de forma estável dentro do genoma do microorgan ismo.

Dado que não é provável que um microorganísmo do tipo selvagem produza rendimentos ©lavados de eritromicina, é improvável, de modo semelhante que os transformantes do referido organismo produzam quantidades comercialmente úteis de 6-desoxi-erítromicí~ na. Assim, o presente invento ainda proporciona a utilização de estirpes de elevada produção para aumentar os rendimentos obtidos por fermentação das estirpes produtoras de 6-desoxi-eritromicina.. As referidas variantes de elevada produção, as quais estão disponíveis comercialmente ou podem ser obtidas por criação selectiva de microorganismos do tipo selvagem, podem, por exemplo, ser cruzadas com transformantes produtores de 6-desoxi-eritromicina ou, alternativamente, serem elas próprias transformadas em produtores de 6-desoxi-eritromicina de nível elevado.

Numa concretização preferida do processo do invento, um transformante de um microorganísmo Saccharopolvspora do tipo

72 468 4802.PQ„01 “8~ selvagem é cruzado geneticamente com um produtor de nível ©levado de eritromicina» 8 progenia recombinante deste cruzamento é se- leccionada quanto a retenção da capacidade de produzir 6-desoxí-•'eritromicina bem como quanto à capaci.da.de para produzir níveis elevados dos compostos desejados,. 0 transtorrnante do tipo selvagem e a progenia recombinante cão representativos dos mieroorganismos do presente invento, os quais incluem quaisquer produtores de eritromicina que foram mo-dificados geneticament© para produzir 6-desoxi~eritromicina. uma concretização preferida dos mieroorganismos do invento, preparados de acordo com os Exemplos abaixo, é Saccharopq 1 vsdora e.ry-fehraea 4IR. Esta estirpe cruzada., a qual produz quantidades significativamente mais elevadas de 6-desoxí~eritromicina do que o seu progenitor transformante, foi depositada sob os termos do tratado de Budapeste na Agricultura! Research Culture Collection, Northern Regional Research Center, U„S„ Department of Agricultura 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, United States, e foi-lhe conferido o número de acesso NRRL 18643,

Os processos do presente invento sâo amplamente aplicáveis a todos os mieroorganismos produtores de eritromicina, dos quais uma lista não exaustiva inclui.......Saccha..rop.Qly.sjp.ora. species, Strep- tomyçes griseop 1 anus, Nocardia sp,„ Hiçromonpsppra Arthrp- feacter sp,,. e Strep tom vees antibioticus» Destes, o mais preferido e Sacharopo1vspora ervthraea, Acredita-se que na biossintese da eritromicina por 8„erythraea» o composto é produzido de acordo com a via apresentada na Figura 1, ria qual os passos (i) e (2) sâo a construção da macrolactona de 14 membros, 6-desoxi-eritrono lido B a partir dos tioés teres de propioniio e de 2-me ti. ima lo-nilo, seguida pela sua hidroxilação em eritronolido B; os passos (3) e (4) são a formação dos desoxi-açúcares micarose e desosami-na a partir da glucose e a sua adição ao eritronolido B para formar a eritromicina D; e os passos (5J e (6 j [ou (6 ) & (5J) 3 sao a hidroxilação em C-12 e a 0-metilação em C-3" para produzir a eritromicina A„ 0 intermediário mais precoce identificado na biossintese da /'*1 -9- /'*1 -9- Ψ 72 468 4802.PG«01 “9~ JT.....-> eritromicína por 8,,......ervthraea é o 6-desoxi~eritronolido B, o qual é hidroxilado como o passo seguinte na via biossíntática» Esta hídroxilação é catalisada por um sistema do citocromo P450 mono-' -oxigenas© que necessita de duas flavoproteinas e de uma proteína com ferro e enxofre (eritrodoxina), a qual actua em conjunto com a 6-hídroxílase (Shafíee © colb» , J» Baeterlol„ 170π 1548-1553 (1988))„ A interrupção deste passo de hídroxilaçao em C-ó durante a biossíntese da eritromicína origina a formação de 6-desoxi-eri-tromicina A, bem como de outros intermediários 6-desoxi da via biossintética. Uma forma de interrupção da hidroxilação é atra...... vés da rutura de um gene celular necessário para a operação do sistema do citocromo P4S0 morio-oxígenase,. Isto pode ser alcançado por inserção no referido gene de um plasmídeo de integração9 o qual é mantido no microorganismo de forma estável, transformando deste modo9 o microorganismo num mutante produtor de 6-deeoxi-- © r i t r o m i c i n a» P o d e s e r u t i 1 i z a d o q u a 1 q u e r p 1 a s m i d e o q u e p o s s a ser integrado no genoma do microorganismo e que origine- a íntei— rupção da hídroxilaçao do 6-desoxi-eritronolido« Contudo, o processo do invento não está de forma alguma limitado à utilização da ruptura do gene para produzir mutantes deficientes na hidroxi-iação do 6-desoxi-eritronolido, Também podem ser utilizados outros processos que rompam o sistema da hidroxilase, tais como a substituição do gene (que envolve a remoção de sequências especificas do gene) ou a mutagénese induzida pela luz ou quimícamente„ para produzir o microorganismo geneticamente modificado desejado, h m b o r a s e j a m c o n h e c í d o s n a a r t e d i v e r s o s p r o c e s s o s p a r a í n— serçâo do AON estranho num plasmídeo para formar um plasmídeo ín-tegrativo, o processo preferido de acordo com este invento encon— tra-se representado esquematicamente na Figura 2 e demonstrado nos Exemplos abaixo. Numa concretização preferida do presente invento, é construído uma plasmídeo d© AON seleccionável, o qual compreende l,a) um IragmenLo do plasmídeo piJ702 contendo uma determinante para a rep11cação © um fragmento de AON conferindo resistência ao antibiótico tíoestreptona (tsr), cada um dos quais é I uncíonal em 31r_©ptomyç©sL; (b) uma origem de replicaçâo funcional .....10- 72 468 4802«PQμ01 e um fragmento de AON conferindo resistência ao antibiótico atnpi-cílina (amp), cada um dos quais é funcionai em E.,.çoli., e (c) um fragmento de AON da. região ermE de 3«.........erythraea- contendo uma porção da um gene responsável pela operação do sistema do cito-cromo P450 mono-oxigenase e capaz de actuar como uma sequência de reconhecimento para a integração do plasmideo,, Uma cultura de eoH que contém um plasmideo concretizando o invento, designado por pMW56-H23, foi depositada como anteriormente na Agricultural Research Culture Collection e foi-lhe conferido o número de acesso NRRL B-18628

Os genes da resistência a antibióticos particulares e as origens de replicação funcionais são apenas necessários visto que permitem a selecção e replicação dos plasmideos recombinantes desejados» Na prática do invento podem ser utilizados outros marcadores e origens de rep li cação, sempre que exequível.. Da mesma maneira, pode ser utilizada qualquer sequência de reconhecimento que permita que o plasmideo recombinante seja integrado numa. porção do genoma do microorganismo necessária para a hidro-xilaçâo em C-6 e que resulte na interrupção da hídroxilação,. No organismo preferido s„........erythraea, a sequência de reconhecimento p o d e s e r u rn f r a g m e n t o c o m pre e n d e n d o u m a s u b s é r i e d a s e q u ê n c i a d e nueleótidos representada na Figura 3, a qual se acredita representar o gene eryF que codifica a C-6 hidroxilase e as sequências fianquedoras adjacentes»

Uma sequência de reconhecimento operativa, utilizada nos Exemplos abaixo, está representada na Figura 4» Este fragmento 3au3A-8au3A de 503 pb é obtido a partir do fragmento Hind III--EcoRl de 10 Kb do cosmideo pJl de acordo com o processo dos Exemplos»

Podem-se identificar outras sequências as quais estão localizadas noutros lugares no genoma de 8,,......ervthraeas também estas são consideradas como estando dentro do âmbito do presente invento,, Além disso, naqueles casos em que foi sequenciada uma porção do genoma. do microorganismo responsável pela hidroxllacâo em C-6, o plasmideo do invento pode ser construído sem a utilização de um

72 468 '3302 μ Ptí .. 01

"~4.Χ £ diferido genómico parcial como no exemplo anterior» Em vez disso B urna sequência de reconhecimento pode ser sintetizada de.......novo e ligada aos fragmentos de origem e de resistência necessários para formar um plasmideo de integração,.

Os plasmídeos de integração do presente invento podem ser utilizados em conjunção com S,.......ervthraea ou outras estirpes hospedeiras, Os plasmídeos são úteis porque são pequenoss versáteis e podem ser introduzidos numa diversidade de estirpes hospedeiras, incluindo 3».....erythraea e E,......coli.,,

Uma concretização dos plasmídeos de integração deste invento está representada no mapa de restrição da Figura 5, Designado aqui como PMW56-H23, o plasmideo contém o fragmento Sau3A~Sau3A da Figura 4,, inserido num novo plasmideo formado pela combinação dos plasmídeos pUC.18 e pIJ702. A sequência Sau3A é inserida num local BglII único representado na Figura 5 no fundo do plasmideo. A integração dum plasmideo representativo do presente invento num microorganismo hospedeiro produtor de erítromicina está ilustrada esquematicamente na Figura 6, A sequência de reconhecimento (sombreada) é homóloga com uma subsérie do gene hospedeiro para o enzima C-6-hidroxilase, A recombinação por entrecruza-mento ("crossing-over") entre as sequências homologas origina a integração estável do plasmideo e é acompanhada pela perda da 6--hidroxilação durante a biossíntese da eritromicina. 0 presente invento é suficíeritemente versátil para que qualquer sequência de nucleótidos que seja capaz de ser integrada no genoma de $„.....ervthraea por meio de recomb inação homóloga, de modo a produzir um transformante que seja deficiente no sistema do citocromo P450 mono-oxigenase possa ser substituída pela sequência de nucleótidos exemplificada acima,. Deverá compreender-se que a sequência de AON inserida como uma sequência de reconhecimento no local de restrição seleccionado do plasmideo de integração pode incluir nucleótidos que não façam parte dos genes estruturais efectivos para o sistema do citocromo P4S0 mono-oxi-genase ou pode apenas incluir um fragmento desses genes estrutu- *

72 46S 4802PG. 01 -12-rais» Quaisquer genes reguladores que controlem a biossintese da eritromicina podem» do mesmo modo,, ser interrompidos através da utilização de um plasmídeo de integração ou doutra técnica muta-géníca., sem haver afastamento do âmbito do invento,. 0 presente invento proporciona ainda composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento em combinação com um transportador farmacêutico., Por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições do invento» elas podem ser utilizada© para o tratamento e prevenção de ínfecçoes bacterlanas ou outra© em humanos e em outros doentes mamíferos»

Os compostos do presente invento incluem ésteres e saís far— rnaceuticamente aceitáveis dos compostos de Fórmula I» os quais podem ser preparados utilizando técnicas preparativas convencionais» Os sais do invento incluem aqueles formados pela reacçâo com ácidos orgânicos» tais como um ácido carboxilico orgânico (como os ácidos tartárico, cítrico» esteárico ou succínico) ácido metanossulf ónico,, ácido amino-etanossulf ónico» um aminoácido (como o ácido aspartico ou o ácido glutâmico), ou similares» Estes sais podem ser obtidos por tratamento de um composto de Fórmula 1 com o acido correspondente» Os compostos anteriores são úteis para o tratamento e prevenção da ínfecçâo patogénica em doentes humanos e animais,, da mesma maneira como as eritromicinas foram anteriorm&nte empregues,,

Os compostos do invento também incluem o intermediário bios-sintético 3-a-mucarosi1-6-desoxi-eritronoiido B o qual» tal como aqueles descritos anteriormerite,, pode servir como um reagente na síntese de mais macrolidos com interesse»

As composições do presente invento são preparada© por formulação de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento em conjunto com um transportador farmaceuticamente eficaz para injecção parentérica, administração oral na forma sólida ou liquida» administração rectal, e similares» "Quantidade terapeuticamen te eficaz" significa uma quantidade do composto suficiente

72 468 4802,, PG, 0.1 -.13- “«" ,W ' para tratar ou prevenir uma ínfecção bacteriana ou por outro mi-croorganismo com uma razão risco/benefício razoável- As doses diárias totais administradas a um doente em doses únicas ou divididas podem ser em quantidades,, por exemplo, de 1 a 100 mg/kg e, ma is geral mente, de 5 a 50 mg/kg. A composição de dosagem unitária pode conter submúltiplos da mesma para completar a dose d i ar i a desej ada. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com os materiais transportadores para produzir uma forma de dosagem unitária única variará, dependendo do doente tratado e do modo de administração particular,. Além disso, deverá compreender-se que a quantidade eficaz de um composto deste invento variará. com o organismo particular a ser tratado ou prevenido; com a gravidade da infecçâo; com a duração do tratamento; com o composto especifico,, éster ou sal, a ser empregue; com a idade © o peso do doente; e com factores semelhantes bem conhecidos na arte médica.

As composições para administração parentética podem incluir soluções, suspensões ou emulsões estéreis, aquosas ou não aquosas, farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de transportadores,, diluentes, solventes ou veículos não aquosos adequados incluem propilenoglicolj, polietílenoglícol,, óleos vegetais, como azeite, e ésteres orgânicos ínjectáveis, como oleato de etilo. As referidas composições também podem conter adjuvantes tais como agentes conservantes, molhantes, emulsíonarites e dispersantes., Podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através dum filtro de retenção de bactérias,, ou por incorporação de agentes esteri-lizadores nas composições. Também podem ser produzidos sob a forma de composições sólidas estareis as quais podem ser dissolvidas em água estéril, ou em qualquer outro meio injectável esté r i 1, í med i atameri te antes da u t i 1 i zaçâo.

As formas de dosagem sólidas para administração oral incluem cápsulas, comprimidos., pílulas, pós, e grânulos. Nas referidas formas de dosagem solidas, o composto activo pode ser misturado com pelo menos um díluente inerte, tal como sacarose, lactose ou 72 468 4802Pfâ ,. 01

~14" amido., As referidas formas de dosagem também podem incluir, tal como é prática habitual,, substancias adjuvantes farmacêuticas,, tais como agentes lubrificantes de esteai.rato- No caso das cápsulas, comprimidos 8 pílulas., as formas de dosagem também podem incluir agentes tamponantes.. As preparações orais sólidas também podem ser preparadas com revestimentos entéricos ou outros, os quais modulam a libertação dos ingredientes activos.

As formas de dosagem liquidas para administração orai incluem emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuti-camente aceitáveis contendo diluentes inertes não tóxicos habi-almente utilizados na arte, tais como água e álcool,. As referidas composições também podem incluir adjuvantes, tais como agentes molhantes, emulsionantes, de suspensão, edulcorantes, sabori-zante s @ perfumantes,. 0 termo "sistema do citocromo P450 mono-oxigenase" „ tal como aqui utilizado, refere-se a um grupo de proteínas (duas flavopro-teínas, uma proteína com ferro e enxofre (eritrodoxina) e o enzima C-6-hidroxilase), as quais actuam em conjunto para produzir a hídroxilaçao do 6-desoxí-eritronolido B em S.».....erythraea. 0 termo "plasmídeo" 9 tal como aqui utilizado,, refere-se a uma pequena forma circular de AON que transporta certos genes ou porções de genes e que é capaz de se replicar independentemente num microorganismo hospedeiro, 0 termo "cacho do gene bíossxntético da eritromicina"„ tal como aqui utilizado, refere-se a genes envolvidos na biossxntsse da eritromicina A localizados na vizinhança do gene que confere a resistência à eritromicina. 0 te rmo "entrecruzamen to" ("crossing-over"), ta 1 como aqu i utilizado, refere~se a um mecanismo para a permuta de genes entre um cromossoma, do microorganismo e AON homologo contido num plasmídeo, através dum processo envolvendo a quebra e reunião de segmentos de AON. -15- 72 468 4802,, Ptâ.Ol 0 termo "recombinação homóloga", tal como aqui utilizado* refere-se a empareihamento de bases complementares e entrecruza-mento entre cadeias de AON contendo sequências idênticas ou quase idênticas,, 0 termo "origem de replicação de E.,.........coli" * tal como aqui utilizado., refere-se a uma sequência de AON que controla e permite a replicação e manutenção de um plasmídeo ou de outro vector em E......coli. 0 termo "origem de replicaçao de Streptomvces"* tal como aqui utilizado, refere-se a urna sequência de AON que controla e permite a replicaçao e manutenção de um plasmídeo ou outro vector Streptomvces,. 0 termo "fragmento de restrição", tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer AON linear produzido pela acçáo de um ou rnaís enzimas de restrição» 0 termo “transformação" tal como aqui utilizado refere-se à introdução de AON num microorganismo receptor que altera o gene-tipo e, consequentemente, origina uma alteração no microorganismo,.

Estirpes bacterianas»......vectores plasmidicos e meios de crescimento.

Os microorganismos produtores de erítromícina utilizados para pôr em prática os exemplos seguintes do invento eram derivados de S........erythraea de tipo selvagem, anteriormente streptomvces. ervthreus NRRL 2338 (I.JW22, Weber e col.b,,, J„ Bacteriol. 164s425--433 (1985)),, A estirpe hospedeira na qual foi levada a cabo a transformação integrativa foi s,.........erythraea uwiio (met-4 leu-ΐβ rif-63). A estirpe hospedeira na. qual os derivados de pKí702 foram replicados era Streptpmyces lividans TK21, a qual foi obtida de John Innes Instituto, Norwich, UK. A estirpe hospedeira para o crescimento dos plasmídeos derivados de Esc. he ri chia coli foi E.„. coli DH5-a de Bethesda Research Laboratories (BRL), Qaithersburg* Maryland„ ./

72 468 4802. Ρβ., 01 -16™ 0 plasmídeo pIJ702 (Katz e colb. , JLMicrobiol „ 129. 2703--2714 (1983)..1 foi obtido de John Innes Institute» ΰ plasmídeo plJ018 foi obtido de Í3RL. 0 cosmídeo pJl, o qual inclui o ADN ue â*.....-t.cyt.hr.aea de tipo selvagem contendo o gene errnE, foi forneci do por L. Katz, J- Tuan e M. S ta ver de Abbott Laboratories» 0 plasmídeo pMW27, um vector multifuncional progenitor para a transformação integrativa em 8.».......erythraea. foi construído a par tir de pIJ702 e pUQ.18 reunidos nos seus locais Kpril únicos na orientação com o local. EcoRI de pUC18 ma is próximo do local BglII do pIJ702. ........orythraea. foi cultivada em cultura líquida em 50 ml de

Tryptic Soy Broth (TSB, Sigma, St. Louis, MO) suplementado com 2% de glicina, em balões de agitação de 500 ml a 32*0. Foram utilizadas placas de ãgar R2T2 (Weber e colab», 1988) para regeneração de micélios a partir de protoplastos ou como um meio gerai de esporulaçao. Os transformantes de S......ervthraea foram selecciona- dos utilizando tioestreptona a 5 pg/ml (cultura liquida) ou a 10 pg/m 1 (cu 1 tu ra só 11 da).. I3ea.gent.es.....e.....Processos.....Oeraís

Utilizaram-se reagentes disponíveis comercialmente parai preparar os compostos, plasmídeos e variantes genéticas do presente invento, incluindo ampicilína, endonucieases de restrição, 14--DNA-ligase e fosfatase alcalina intestinal de vitelo.. Os enzimas de restrição e a T4-DNA-ligase foram utilizados de acordo com as instruções do fornecedor no que diz respeito às condições de reacção. A tioestreptona foi obtida de E. R» Squibb and Sons, P r í n c e t o η, N e w J e r s e y.

Durante a preparação do plasmídeo de integração, foram utilizados processos padrão para o crescimento e transformação do hospedeiro intermediário ......coli (Maniatis e colab. , "Molecular

Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)).. A transformação final de 3. ervthraea foi efectuada por uma variação do processo de Weber e colab», (Qene 68:173-180 (1988)), tal. como detalhado abaixo» 4802„Ρ8»01

“1 0 precedente pode ser melhor compreendido por referência aos exemplos seguintes» os quais são fornecidos como ilustrações não limitativas da prática do invento,, EXEMPLO.....1.

Construção do.....PlasmideoP.MW27 0 plastrudeo pMW27 foi construído utilizando processos padrão da tecnologia de ADN recombínante de acordo com o esboço esquemático representado na Figura 2„ 0 plasmideo pUC18 de E..........coli fYariisch-Perron e coiab., Gen®* 33:103-119 (1985)) foi completa-mente digerido com a endonuclease de restrição Kpnl. 0 fragmento ΚρηI resultante foi ligado ao plasmideo pU702» que também tinha sido clivado com Kpnl (Katz e coiab., J..........fâen.»iliçroMo.L,.. 129: 2703-2714 (1983))„ Os produtos da ligação foram utilizados para transformar E. coli DH5-a (Bethesda Research Labs., Gaithersberg, MO)a a qual foi cultivada em presença de ampicilina a fim de se-leccionar a© célula© hospedeiras portadoras de um plasmideo re~ combinante» 0 ADN plasmidico foi isolado a partir de transfor-mantes individuais e caracterizado em relação a locais de restrição marcadores» confirmando a formação do plasmideo recombi-nante pMW27 de 8,5 Kb« EXEMPLO.....2

Isolamento de.....Fragmento.....da.....região.....ermE de 3 ervthraea

Uma porção do genoma de s.........ervthraea responsável peia ope ração do sistema do citocromo P450 mono-oxigenase foi isolada utilizando exploração da ruptura de gene a qual é modelada segundo a clonação mutacional descrita por Chater e coiab,.» Gene» 2.6:07-78 (1983)» Esta técnica foi utilizada, para sondar a região contendo ermE do cromossoma de S„.....ervthraea.

Tal como é o caso de outros organismos produtores de antibióticos, pensou-se que os genes para a biossíntese da eritromi-cina se encontravam agrupados em cachos em torno do gene da resi stên cia à er í t romicina, e rmE. Pa ra conf í rma r esta oP iní ao e 72 4é>8 ✓ 4802PO κ 01 -18 para isolar as sequências de nucleótídos responsáveis pela hidra-xiiaçâo em C~6, fragmentos de AON clonados do cromossoma de s, erythraea que cobrem a região com interesse foram digeridos par— cialmente utilizando as endonucleases de restrição EcoPI e MíndIII, Os fragmentos de AON resultantes foram separados porei ect rotor ese em gel, purificados a partir do gel de agarose por Cieneelean (Bio 101, La Jolla, CA) e parcialmente digeridos com o enzima 8au3A„ Foram produzidos fragmentos de AON na gama de tamanhos de 0,2 a 1,0 kb e foram novamente separados por electrofo-rese em gel, purificados com Qeneclean e ligados ao pHW27, o qual tinha sido digerido com BglII. A ligação foi facilitada por pre-- tratamento do digerido de pMW27 com fosfatase alcalina intestinal de vitelo.

Os plasmídeos recombinantes ligados foram então utilizados para transformar as células DHS-α de E. coli, as quais foram então cultivadas em ágar LB suplementado com ampicilina (100 pg/ml) e X-gal (5*-bromo~4”-cloro-3*-indolil~d~D-galactósido) para se-leccionar os transformantes portadores de plasmídeos com inserções, Estes transformantes foram identificado© por hibridaçao de mancha de colónia (Haniatis e colab., 1982) utilizando, como son-das, fragmentos radiomarcados da sequência de AON EcoRI-HindIII original,, Os plasmídeos com inserções foram, em seguida, transformados integrativamente em protoplastos de 8,......erythraea UW110.

Os transformantes primários de S,_________erythraea foram seleccionados com 10 mg/ml de tioestreptaria ern placas R2T2 e os esporos foram recolhidos e combinados em glicerol„ Os transformantes integrados foram isolados quer (a) colocação ern placa de uma porção dos esporos combinados de transformantes primários em R2T2, recolha do campos de esporos e reco locação em placas das colori ias simples em R2T2 com tioestreptona; quer por (b) passagem dos esporos combinados de transformantes primários através de duas a três purificações de colónia simples em R2T2 com tioestreptona.

Para determinar a localização da inserção do piasmídeo, foi preparado AON cromossómico a partir de estirpes transformadas in-tegrativamente e da estirpe progenitora, Os AON foram comparados por análise de Southern sondando com o fragmento de AON que cobre 72 468 4802 «Pa ..01

3. região na qual as inserções tinham sido feitas. A ' integração por recomoinação homologa foi identificada pelo desaparecimento de uma banda no ADN progenitor e o aparecimento de duas novas bandas de junção no AON transformante. A biblioteca resultante consistia em ap rox i madamen te 350 clones, que se mostrou* através das anteriores analises de mancha de Southern o de restrição,, conterem fragmentos com tamanho de o.,4 a 1*0 kb» Verificou-se que os fragmentos eram homólogos com uma região de 10 kb do cromossoma de erythraea* representada no mapa cromossómico da Figura ? e situando—se entre os genes eryCI e eryClI.. Verificou-se que o gene responsável pela hidro-xilação em C-6, pósteriormente designado eryF* se posicionava entre os genes eryH e eryfâ» EXiMPLQ.....3

Constru5.ao....do.....Plasmídeo.....pMW56-H23

Um plasmídeo de integração concretizando o invento foi preparado a partir do plasmídeo pHW27 de acordo com o esboço esquemático da Figura 2. 0 cosmideo pJl* o qual continha a região do gene ermE de S».....ervthraea e aproximadamente 30 kb de AON fianque- dor, foi digerido completamente com os enzimas de restrição Hindill e EcoRI. Dos produtos de digestão,, foi isolado um fragmento de AON de 10 kb* o qual foi identificado como compreendendo a região desde o local Hindill de ermE e sequências a jusante de ermE* até ao primeiro local EcoRI para além do gene eryQ (Weber e colab., 1989) (ver Fig» 5)» Utilizando condições padrão (Mania-tis e colab», 1982), o fragmento de AON de 10 kb foi submetido a digestão parcial com Sau3A. Os fragmentos de AON de 0*4 a 1*0 kb foram separados utilizando um gel de agarose preparativo e isolados com fâeneclean (BiolOl, LaJolla* CA). Os fragmentos de AON foram ligados ao pMW27, o qual tinha sido clivado com o enzima de restrição BglII e tratado com fosfatas© alcalina (de intestino de vitelo). F o i s eleccionado um plasmídeo,, d e signado p M W5o—H 2 3 * para análise adicional baseada na sua capacidade de originar transfor-

^Igt nifK 72 468 4802., PGt, 01 -20- mantes produzindo um composto com interesse tal como identificado por cromatografia de camada fina (TLC). Verificou-se que o plasmideo pMW56-H23 continha urn fragmento de AON de 505 pb com origem na região eryF do cromossoma de S......ervthraea e representado na Figura 4 dos desenhos em anexo,, A análise adicional do plasmideo pMW56~H23 permitiu a construção do local de restrição e do mapa funcional do plasmideo pMW56~H23, o qual está representado na Figura 5„ EXFHPLO.....4

Construção de.....Saccharopolyspora.....ervthraea.....UWllOz ;pliW56~H23

Um exemplo do microorganismo produtor de ó~desaxi~eritromi~ cina do presente invento foi preparado por transformação de células de S*.....ervthraea com o plasmideo recombinante do Exemplo ante rior,, A transformação foi rebalizada utilizando protoplastos de S. ervthraea de acordo com o processo seguinte.. Sob condições estéreis e um volume de cultura de 50 ml,, foram cultivadas três culturas de Saccharopolyspora ervthraea UW110 (Weber e colab.,„ J, Bacteriol.. 164s425-433 (1985)), com agitação., em Tryptic Soy

Broth (TSBi Sigma, St Louis» MO) com 2% de glicina» a 32*C, durante 3, 4 e 5 dias, respectivamente, e, em seguida, lavadas separadamente em 25 ml de sacarose a 10,3% . As células lavadas foram então suspensas em 25 ml de tampão PT contendo 2-5 mg/mi de lisozima, após o que as suspensões foram combinadas e incubadas a 30°C durante 30-60 minutos até que a maioria dos fragmentos mice-lóides tivessem sido convertidos em protoplastos esféricos, (tampão PT por 1 litro de solução aquosa;: 100 g de sacarose, 5,08 g de MgCl2.6H20, 0,25 g de K2S04, 2 ml de elementos vestigiais (Hopwood e colab-, Methods Manual, 1985), e água destilada até 875 ml, com a adição, após esterilização e na altura da utilização, de 25 ml de CaCl2»2H20 1M e 100 ml de TES 0,25M (pM 7,2).,)

Os protoplastos foram lavados uma vez e suspensos em 10 ml de tampão PT- Os protoplastos de 1 ml da suspensão foram recolhidos sob centrifugação suave (1 000 x g durante 15 minutos) e ressuspensos suavamente no liquido restante após decantação do 72 468 4802 ..PC5.01

”21“ sobrenadante de PT, A transformação foi realizada por adição de cerca de 5 μΐ (5 pg) do plasmideo pMW56~H23 e 0,5 ml de PEG a 25% (.polietilenoglicol„ PH 3350, Sigma, St- Louis, HO) à suspensão dos protoplastos. Os protopiastos foram lavados e ressuspensos em 0,5-1,0 ml de tampão PT. Volumes de 200 μΐ dos protopiastos transformados foram colocados em placas sobre 25 ml de ãgar de regeneração R2T2 (Weber e colab.,, 1989), As placas foram incubadas durante toda a noite a 32'O, de seguida foram revestidas com 2,5 ml de ágar nutriente mole (bacto-ágar a 0,3%, caldo nutriente de difco a 0,8%) contendo 100 pg/ml de tioestreptona e re-incuba-das a 32*0 até os transformantes aparecerem e esporularem. A fim de isolar uma estirpe transformarte integrada pura, foram recolhidos os esporos dos transformantes primários, e foram cultivados em cultura em linha ("streaked") duas vezes para pesquisa de colónias simples em ãgar R2T2 contendo 10 pg/ml de tioestreptona-As colónias resultantes foram cultivadas da forma convencional e constituíam os transformantes de 8,ervthraea UWllOs:pMW56~H23 d^sej ados. EXEHPLO.....5.

Qcnstruç|o.....de...J3aççharopolyspora.....erythraea....41R.

Um exemplo preferido do microorganismo produtor de 6-desoxí---eritromícina do presente invento foi preparado por condução de um cruzamento genético entre o transformante anterior de S......erv thraea U W110 r.: p m w 5 6 - H 2 3 e o u t r a e s t i r p e e o n h e c i d a p o r p r o d u z i r níveis elevados de ©ritromicína A. 0 cruzamento foi executado como se segue;: suspensões de esporos de cada uma das duas estirpes progenitoras (10^ esporos/ml em glicerol a 20%) foram misturadas em proporções iguais, e porções de 0,1 ml da mistura foram colocadas em placas sobre meio de ágar E20A- (meio E20A por 1 litro de solução aquosas 5 g de bacto-soytone, 5 g de amido solúvel, 3 g de CaCC^, 2,1 g de M0P8, e 20 g de ágar). As placas foram incubadas a 32°C até que a esporulação ocorresse (5-7 dias),. Os esporos resultantes foram recolhidos, suspensos em glicerol a 20% a 10^' esporos/ml, e colocados em placas para pesquisa de recombinantes sobre meio AVMM contendo 10 pg/rnl de tioestreptona (meio AVMM por 1 litro de solução aquosa;; l g de 72 468 4802.Pfâ.01 Κ2ΠΡ04, i g de KH2PQ4, 0,1 g de MgSQ4, 10 mg de FeS04„ e 5 g de asparagma, aos quais foram adi-cionados, apos esterilização, 20 ml de glucose a 50%, 0,5 mg, de cada um, de tiamina, riboflavina, acido pantoténico, ácido nicotinico e piridoxina, e 0,05 mg, de cada um, de ácido fólico, bío~ tina e vitamina B-12). h progénia produzindo 6~desox i ~e r i t r-om i c i n as. foi seleceíona™ da gradas â sua capacidade de crescer em meio AVMM em presença de liuwoti eptona. isolou-se um certo numero de recombinantes examinai am se, por fLu, quanto a níveis elevados de produção de 6-desoxi~eritromicinas. Verificou-se que um isolado, designado 41R, prociuzia os compostos do invento em niveis sigriificativamen™ Le maio elevados do que aqueles obtidos a partir do transformante progenitor. iXHMPLD.....6.

fermentação.....de„MccM.{^Polys.pora. erythraea 41R ^ ........âllV.thraea 41R recombínante produzida no Exemplo ante rior, foi. cultivada em maiores quantidades utilizando o processo de fermentação seguinte. Esporos de .....erythraea 41R foram reti rados das placas do meio de ágar E20A do organismo e adicionados a 50 mi qe meio E29F num baião de Erlenmeyer com agitação de 500 ml uneio E29F por 1 litro de solução aquosa; 22 g de farinha de soja, li> g de amido de milho, 3 g de CaCOg, 0,5 g de MgS04.7H20, 15 mg de FeS04.7H20 e 50 ml de óleo de soja).. A cultura de primeiro estádio foi então incubada, sob agitação, durante 48 horas a. 32*0. Após a incubação, foram utilizadas porções de i ml da cultura de primeiro estádio para inocular 50 balões de fermentação de segundo estádio, contendo também meio E29F. Estas culturas foram então incubadas, sob agitação, durante 5 dias a 32°C.,

Ao quinto dia, as culturas foram combinadas e as células separadas do caldo de cultura por centrifugação., 0 caldo de cultura foi ajustado até pH 10 com uma solução de NaOH 4N e tratado com um volume igual de acetato de etilo para extrair os compostos d ο ρ r e s e n t e i n v e n t o „ 72 468 4802 ηPQ-01 ;:ê-‘ ·~·ί«*ΪΒ%

Λ’ίίνλ

Isolamento dos Compostos

Os diversos compostos do presente invento foram isolados utilizando o processo seguinte,, 0 extracto de acetato de etilo cte 1150 ml do caldo de fermentação completo, preparado tal como descrito no Exemplo anterior, foi ajustado até pH 9 e concentrado atê um óleo- 0 concentrado foi submetido a partição entre 150 mi de cada um de heptano e metanol, e a camada inferior de metanol foi concentrada até 1,74 g de resíduo., 0 resíduo foi submetido a cromatografia numa coluna Sephadex LH-20 (3,2 cm x 73 cm), a qual foi pré~intumescida com uma mistura de clorofórmio, heptano e etanol (10:10:1, v/v/v), e carregada e eluida com o mesmo solvente,, Fracções de dez mililitros foram recolhidas e analisadas por TL.C em placas de sílica-gel (Merck Kieselgel 6OF254) e reveladas com um sistema solvente de éter isopropilico, metanol e hidróxido de amónio concentrado (150:70:4, v/v/v),. Os pontos foram visualizados nas placas secas por aquecimento da placa após pulverização com ariisaldeído a 5% em etanol: ácido sulfúrico (19:1, v/v)„ As fracções números 30-32 apresentavam um ponto magenta possuindo um Rf semelhante ao da eritromicina A, cujo Rf varia de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 0,6- Estas fracções foram combinadas e concentradas até um resíduo, daqui em diante designado por resíduo A (38 mg)As fracções subsequentes numeros 33-38 foram concentradas até um resíduo, daqui em diante designado par resíduo B (77,5 mg)- 0 resíduo A foi submetido a cromatografia, em duas porções, numa centrífuga Jto Coil Planet Centrífuge, num sistema solvente constituído por tetracloreto de carbono, metanol e tampão de fosfato de potássio aquoso 0,01M, pH 7,0 (1:1:1), sob as condições seguintes: fase superior móvel; cauda como entrada; caudal de aproximadamente 3 ml/min a 800 rpm; e retenção de fase estacionária de aproximadamente 60% „ Foram recolhidas fracções de 10 ml- 0 aparecimento da fase movei ocorreu na fracçâo 12,. As fracções foram analisadas quanto à bioactividade com um ensaio de difusão em disco de ágar em placas de pH 8 semeadas com Sta&hvlo- 72 468 4802»PG-01 -24- --24-

SfiÊCjJt aureus 6538P e por TLC como anteriormente- As fracções semelhantes foram combinadas,, concentradas e submetidas a partição entre diclorometario e hidróxido de amónio diluído (ph 9). Αί& camadas de diclorometano foram concentradas até resíduos sólidos. As fracçôes números 32 a 42 produziram um total de 9 mg de um só1ido branco poste ri ormente i dentif icado como 6-ctesox i-¾ ri tro-micina C„ as fracçôes 100 a 135 produziram um total de .1.:3,,4 mg de um solido branco» pósterfermente identificado como 6-desoxi--eritro-mxcina A * 0 resíduo B foi submetido a cromatografia, sob condições idênticas, numa centrífuga Ito Coíl Planet Centrifuge. As frac-~ ç õ e s n li m e r o s .10 -15 produzira m 1»8 m g d e 6 - d e s o x i -15 - η o r e r i t r o m i -c i n a C t. p o s s u i n d o o e s p e c t r o d e R Μ P r e p r e s e n t: a d o n a F í. g u r a 9) H enquanto que as fracçôes 32-40 produziram 4,2 mg de 6-desoxi--eritromicina 0, e as fracçôes 125-135 produziram 10,1 mg de 6--desox1-eri tromicina A„ EXEMPLO.....8

Isolamento de.....Compostos.....Adicionais

Novas culturas de 8,,.....ervthraea 41R foram cultivadas de acor do com as técnicas do Exemplo 6, com a excepçâo de ter sido empregue uma forma 1,25 vezes mais concentrada do meio E29F, utilizando 40 ml em vez: de 50 ml por balão,. Após o crescimento, as culturas foram combinadas e extractadas com acetato de etílo. A fracçâo de acetato de etilo foi concentrada até um resíduo (3,71 g), e o resíduo foi submetido a cromatografia numa coluna sepha-dex LH-20 (65 x 5 cm), carregada e eiuida com n-heptario, cloro-f ó r m i o e e t a ηo1 (10:10:1, v/v/v). A s f racções f o ram analisadas tal como descrito no Exemplo 7. As fracçôes precoces foram combinadas para originarem 220 mg de um resíduo vítreo branco, daqui em diante designado por resíduo 0, As fracçôes tardias foram combinadas para originar um segundo resíduo vítreo branco, daqui em diante designado por resíduo 0., 0 resíduo C foi submetido a cromatografia numa centrífuga Ito Coíl Planet Centrifuge num sistema solvente de tetracloreto -25- 72 468 4802. PGi „ 01 de carbono., metanol e tampão de fosfato de potássio aquoso Ο,ΟΙΜ, pH 7,0 (1:11:1, v/v/v), utilizando as condições seguintes: fase inferior móvel; cauda como entrada; caudal de aproxímadamente 5 ml/min a 800 rpm; foram recolhidas fracções de 10 ml., 0 desloca™ mento da fase superior a partir de uma coluna de aproximadamente 325 ml foi de cerca de 50 ml., Foram analisadas fracções de aproxímadamente 10 ml cada por TLC, e combinadas adequadamente, A fracção N£2 6 foi concentrada e produziu 6~desoxi~eritromícina B (20.,4 mg) „ As f racções números 8 e 9 foram combinadas e concentradas até produzirem 6-desoxi-15-noreritromicina B (21,4 mg). 0 resíduo 0 foi submetido a cromatografia numa coluna Sepha-dex LH-20 em metanol,. As fracções foram recolhidas e analisadas por TLC,. As fracções iniciais foram combinadas para produzirem um resíduo brilhante, o qual foi submetido a cromatografia numa centrífuga Ito Coil Planet Centrífuge num sistema solvente de tetracloreto de carbono,, metanol e tampão de fosfato de potássio aquoso 0,05M, pH 6,0 (1:1:1,, v/v/v) com a fase inferior móvel no modo cauda para cabeça,, Foram recolhidas fracções de aproximada™ m e n t e 10 m 1.. A s f r a c ç Õ e s f o r a m a n a 1 i s a d a s p o r T L 0 e c o m b i n a d a s adequadamente- As fracções 46-58 foram combinadas e concentradas para produzir 6-desoxi-eritromicina 0 (26,2 mg)- EXEMPLO.....9

Isolamento ...de.....Compostos.....Adicionais U t i i. í zarido a s t e c n i ca s d o s E x e mp 1 o s p r e c e d e n t e s, f o i u s a d o acetato de ©tilo para extractar aproxímadamente 1200 ml, de caldo de fermentação completo duma cultura de um recombinarits cruzado produtor em níveis elevados do invento,. A fracção de acetato de etii.o foi concentrada até um resíduo oleoso, o qual foi submetido a partição entre 200 ml de n-heptano e 200 ml de metanol,. A camada metanolica foi concentrada até um resíduo oleoso (3,98 g) „ Uma porção de 2,o g deste resíduo foi submetida a cromatografia numa coluna Sephadex LH-20, a qual foi pré-intumescida com uma mistura de clorofórmio, heptano e etanol (10:10:1, v/v/v), e carregada e eluída com o mesmo solvente,, Foram recolhidas e ana— iisauas i racções (de aproxímadamente 10 ml cada), tal. como no -26- 72 468 4802-PQ.01

Exemplo 7. As fracções 70-160 produziram 350 mg de um sólido vítreo branco, daqui em diante designado por resíduo E. 0 resíduo E foi submetido a cromatografia numa centrífuga Ito Coil Planet Centrifuge num sistema solvente constituído por tetracloreto de carbono, metanol e tampão de fosfato de potássio aquoso Q,01M, pH 7,0 (Isisi, v/v/v), sob as condições seguintes; fase superior móvel; cauda como entrada; 800 rpm; caudal de apra-ximadamente 3 mi/miri; retenção estacionária de aproximadamente 80% « Foram recolhidas fracções de 10 ml- As fracções foram analisadas por TLC como descrito no Exemplo 7, e combinadas adequadamente.. As fracções combinadas foram ajustadas até pH 9, com hidróxido de amónio aquoso concentrado e extractadas duas vezes com volumes iguais de diclorometano- Os extractos de diclorome-tano foram lavados uma vez com água e, em seguida, concentrados para produzir os produtos seguintes como sólidos vítreos límpidos; as fracções 38-40 produziram 3,2 mg de 6-desoxi-eritromicina C; as fracções 48-50 produziram 1,9 mg de 6-desoxi~15-norerítro-micina A; as fracções 75-80 produziram 0,9 mg de 6-desoxi~15-no-reritromicina 0; e as fracções 95-121 produziram 3,8 mg de 6--desoxi-eritromicina A« EXEHPL0...10

Cara.ster.ímgl.a„dJL^.^Qósox.i.-órltróml.elnas. A.».....8,......c.....e.....Qu.....e das

ó-DesoxlrlS-noreritromicinas B e D

Os compostos isolados nos exemplos precedentes foram identificados utilizando espectrometria de massa de bombardeamento atómico rápido (Fast Atom Bombardment) (FAB) de alta resolução, RMN de protão e ^C-RHN- Os resultados desses estudos, incluindo os dados dos desvios químicos de ressonância magnética de ^·ώϋ e de protão, foram sumariados para as 6-desoxi-erítromicinas A, B, C e D e para as 6-desoxi~15-norfôritromicinas B e D, e estão registados nas Tabelas 2 e 3, respectivamente- As atribuições para as ressonâncias magnéticas do carbono e do protão foram efeetuadas com o auxílio de experiências de 20-RMN.. Os espectros de RMN do protão para as 6-desoxi-15-norerítromicirias A e C não foram colocados em tabelas, mas estão representados nas Figuras 8 e 9, respecti vamente,. /2 4ò6 4802.PQ.01 -27- έ

Também foram obtidos . , . espectros de absorçao de mfra-verme lhos e as rotações óptica*» ^ destes compostas, e estão resumidos como se segue: tts rotações opticas para as 6-desoxi-eritromicirias A„ B 0 e ,v ··£· - * 0 sâO Ια3^^ρ~54.8 ÍC 0,5. CMC! -,i -ύ-ϊ i λι.~ί ·, ,, Λ u 9 ·· * » w 1U3J , -/4,0 l,.C 1,2, CHCl^J , -41.,0 (c 1,0, cHCÍ.5) e ~?7,9 (c 1,4, CHCl^), respectivamente. As rotações óptícas para as 6~desoxi·~Χ5~·ηo r-e r· i tromicinas b © d são Παί^ρ -84,1 (c 1,1, CHOI3,), e -8õ,3 (c 0,4, CHCI3), respecti vamen te

Os dados de espectroscopia de ínfra-vermelhos (IV) para a 6-desoxi-eritromicina A indicam os valores seguintes (cm"'1·) em solução de CDCl^s 3 700, 3 S50, 3 4S0 ombro largo, 1 '728 forte, 1 705, .1 685 ombro, 1 600 fraco;; 6-desoxi-eritromicinas B e 0 em 00013: 3 680 fraco 3 540 largo, 1 722, 1 702 forte; 6-desoxi-eri-tromicina C em C0013s 3 700, 3 520 forte, largo, 1 728 forte, .1 705, 1 685 ombro, 1 600 fraco; 6-desoxi-eritrorriicina 0 em solução de 000.1,3- 3 680, 3 570 forte, largo, 1. 722, 1 700 forte; e 6-desoxi“i5~noreritromicina 0 em C0C13: 3 630, 3 510 forte, largo, 1 725, 1 702 forte, largo,, (segue tabela) 72 468 4 802Pt; „01 y*-> /

jf* í<! T ABELA 1

Composto m/l. Formula calculada Peso molecular calculado. No „ 1 718,75* C37HÓ8NC)12 718,4741 No 2 702,4785 c37Hó8N011 702,4792 No - 3 704.75* C36H66N012 704,4585 No. 4 688,4650 C36H66N011 638,4636 No - 5 683„4628 ^66^11 688,4636 NO 6 674,4439 C3SH64N011 674,4479

Ho. i = ó-desaxi-eritromicina A

Ho- 2 ~ 6~desoxi~erítromicina B

No. 3 ~ 6~desoxi~eritromicina C

No. 4 - 6~desoxí~eritromicina D

No- 5 - 6-“desoxí-iS-norerítromicina B

No„ 6 - 6~desoxi~15~noreritromicina D. * ” medição de baixa resolução -29- 72 468 4802 -PG„01

Registos^.....de...±f ÇLj&argi.....aa....6~desoxi~.....eritro- micínas.....A~p.....e.....6rJ±©.sox^ A i. c D E F 1 176,8 177,4 176,5 177,1 177,0 176,7 2 45 „0 45,0 45,2 45,0 44,7 44,9 Ô 78,4 80 3 2 81,2 82,8 79,2 82,1 A 44 a 2 43,3 44,0 44,0 43,4 43,2 5 83,4 84,2 84,2 84,9 84,0 84,8 6 35,1 36,7 35,2 36,7 35,7 36,1 7 34,4 34,3 34 s 2 34,2 34,3 34,2 8 45,7 45,1 45,8 45,1 45,2 45,3 9 220,1 216,8 : 220,0 216,7 217,4 217,2 10 38 , 9 41,6 38,7 41,5 41,1 41,2 11 69,6 70,1 69,5 70,1 70,3 70,5 12 75,0 40,5 74,9 40,6 41,9 42,0 13 77,6 76,0 76,4 76,4 70,4 70,6 14 21,1 25,4 20,9 25,4 18,1 18,3 15 11.. 0 10 3 5 10,9 10,5 2CH-k, 15 a 0 15,1 15,4 15,3 14,2 14,6 4CH3 9,5 9,4 9,7 9,7 9,5 9,7 6CH3 18,7 19,9 .18,7 20,0 19,5 19,8 8CH3 17,4 16,7 17,4 16,7 16,7 16,8 10CH3 11.,0 7,8 10,9 7,7 7,9 7,8 .1..2014- 161 9,0 16,1 9,1 8,6 8,7 .1/ 104,1 104,2 104,9 103 3 0 104,2 105,0 2" 70,7 70,6 70,5 70,5 70,6 70,4 3’’ 65,6 6S36 65,7 65,8 65 3 7 65,7 4 s 28,6 29,1 28,4 28,5 28,8 28,5 5’ 69,2 69,0 69,5 69,4 69,1 69,4 éx 21,3 21,1 21,3 21,2 21,4 21,2 N ( CI I-.V ) 40,3 40,3 40,3 40,3 40,3 40,2 r 1 96,7 97,6 99,2 99,8 97,0 99,5 23 B 35 a 0 35,2 40,5 40,6 35,1 40,6 3’ u 72,6 72,5 69,5 69,5 72,5 69,6 4” 78,0 78,0 76,4 76,4 78,0 76,4 53 3 65 b 7 65,7 66,5 66 3 6 6 3,6 66 3 6 63 3 18 b 2 18,1 18,0 18,0 18,2 18,0 3 a 3Ct43 21 b 5 21,4 25,5 25,5 21,2 25,6 0CH3 49 a 4 49,3 — ^ — — -- ---- 49,3 A = 6-Desoxi- -eritromicina A & ~ ó-Desoxí· -eritromicina B C » 6-0esoxi' -eritromicina C 0 ~ 6-Desoxi- -eritromicina 0

E ~ 6-0esoxi-15-noreritromicina B F ~ 6“0fôsoxí-"i5""norfôrítromicina 0 -30' 72 468 4802„PG,01 PROJAQ A. TABELA...! Atribuições.....de... B C. -RMP 0 E / *0 M i 2 2,80 2,86 2,83 2,90 2, /8 2,82 3 3,65 3,64 3,70 3,71 3,68 3,74 4 1 , 80 1,72 1,60 1,74 1,76 1,76 5 3.,48 3,44 3,42 3,40 3,48 3,42 6 1,, 36 1,54 1,33 1,53 1,55 1,53 7a 1,69 1,81 1,68 1,81 1,80 1,80 7b 1«53 1,26 1,57 1,30 1,32 1,35 8 263 2,60 2,62 2,61 2,61 2,62 10 3,07 2,84 3,06 2,85 2,90 2,90 11 3,40 3,54 3,34 3,52 3,55 3,51. 12 — 1,69 — 1,71 1,60 i., 63 13 4,93 5,15 4,94 5,17 5,40 5,44 14 a 1,93 1,76 1,93 1/8 1,27 1,29 14b 1,50 1,48 1,50 1,49 — 15 0,89 0,90 0,88 0,91 2CH3 1,19 1 „ 19 1,22 1,22 118 1,21 4C!! ,, 1 „ 17 1,17 1,13 1,14 1,17 1,15 6CH3 1,17 1,21 1,18 1,24 1,21 1,23 1¾ L Hl 7;.( 118 1,13 1,19 1,17 1,15 1,16 10CH?; 1 „ 15 1,01 1,16 1,02 1,00 1,02 12CH;^ 1,10 0,83 1,10 0,84 0,86 0,87 l ' 4,23 4,20 4,17 4,17 4,21 4,18 2 3,25 3,24 3,22 3,21 3,23 3,20 3' 2,48 2,56 2,46 2,48 2,52 2,50 4!i a 1,25 1,28 1,25 1,25 1,26 1,26 4e 1,67 1,72 1,68 1,67 1,69 1,68 55 3,46 3,46 3,49 3,48 3,46 3,48 6’ 1,24 1,23 1,24 1,23 1 „ 23 1,23 N í CM .· 19 2,29 2,34 2,28 2,28 2,30 2,29 r* 4,88 4,83 5,03 4,99 4,81 4,98 25,a 1,55 1,55 1,83 1,86 1,54 1,84 23 ;'fô 2, 36 2,36 2,20 2,20 2,33 2,19 43 3 3,00 2,99 2,98 2,98 2,97 2,98 53 5 3,92 3,93 3,76 3,78 3,89 3,77 ó 1 3 1,28 1,27 1,34 1,34 1,26 1,34 OCH a 3,28 3,26 — — v? .·:ί! Í3* 33 3CH3 1,12 1,22 1,26 1,25 1,22 1,26 A ~ ó-Desoxi-eritrorniciria A B ™ ó-Desoxí-eritromicina B C ~ 6™Desoxi'-erítromicina C 0 - 6~0esoxí~©rítromicina 0 E - ó-Desoxi-lS-noreritromicina B F ™- 6--t)es.oxi'~15"-norerítromicína 0 ε xehplo.....ii

Estabilidade em.....maios.....áç|dos....da.....fe"dasox4r:erI.tromicina.....A A estabilidade relativa em meios ácidos de um dos compostos do presente invento foi comparada com a da wr i fcromicina o., sus-penderam-se 11,8 mg de 6-desoxi-eritromicma A numa solução de acido cítrico (pH 2,2) e deixou-se repousar a ó/°C durante g horas,. Foram removidas aliquotas aos 2, d, 10 «* 20 minutos © às 18 2, S, 4, 5, 6 e 8 horas- A degradação foi extinta por ajuste de cada aliquota a pH 9,6 com NH4OH ? #5 *VU seguida por extracção c o rn d i. c 1 o r o m e t a η o

De forma idêntica, suspenderam-se 10,5 mg de eritromícina a numa solução de ácido cítrico (pH 2,0), e deixou-se repousar a 37°t: durante 10 minutos- Foram removidas alíquotas aos 2, 5 e 10 minutos- A degradação foi extinta por ajuste de cada aliquota a pH 9,6 com NH40H 7,5 H, seguida pela extração com diclorometano.

Os extractos de diclorometano de 6-desoxi-eritromicína a e eritromícina A foram analisados por TLC, tal como descrito no Exemplo 7. Os resultados da TLC indicam que permaneciam menos do que 10% da eritromícina A, após 2 minutos a. pH 2,2, enquanto que persistiam mais do que 50% da 6-desoxi-erÍtromícina A após 4 horas de exposição a pH 2,2- Mesmo depois; de S horas, verificou--se que aproxinadamente 40% da 6-desoxi-eritromícína A permanecia Intacta, mostrando um melhoramento substancial da solubilidade em meios ácidos dos compostos do presente invento em reiação á própria eritromícina A-

IsXlMPLO.....12

Activid^

As 6-desoxi-eritromicínas A, B e C e a ó~desoxi~I5~noreri~ tromicina B foram testadas quanto à actividade anti-bacteriana, utilizando um processo de diluição de placa de ágar padrão em caldo de infusão de coração-cérebro.. A eritromícina A foi utilizada como um controlo- Os resultados, indicados como as concentrações inibitórias mínimas (MIC), estão representados nas Tabelas 4 e 5, abaixo.

4802.PG.01 1ABELA...4

Valor.....da..MIC...do.....ro!>QCt rc?.An í;:Í.H.mic^.....Lmcg/mij.

Mic.roor.ganlsmo A dA dC Staphylococcus aureus ATCC 6538P 0 a 25 1 ··;> Staphylococcus aureus NCTC 10649 0 3 25 1 2 Staphylococcus aureus CMX 553 0 3 25 0 ,, 5 4 Staphylococcus epidermis 3519 0 3 5 1. 4 Micrococcus luteus ATCC 9341 O '·£ O iA 0,, 06 0 ,, 25 Streptococcus agalactiae CMX 508 0 ,, 06 0,12 0 3 25 Streptococcus pyogenes EES61 0 3 03 0 3 25 0,, 5 Escherichia colí JUHL 64 >128 >128 Escherlcha coli SS 1 2 16 Enteroeoccus faecium ATCC 8043 0*12 0 s 25 0,,25

A ™ Eritromicina A

dA " 6-Desoxi~-erítromicina A dC ~ 6......Oesoxi-eritromicina C LAMLA..5

Valor.....da. MIC. do.....Espectro. . An t ir bac ter i ari o. (m cg/m.1.1 M.i.ç.roor£an.ismo A B. dB dn.B. Staphylococcus aureus ATCC 6S38P 012 0 * 25 1 2 Staphylococcus aureus NCTC 10649 O.,12 0 3 25 1 ··:· -i- Staphylococcus aureus CMX 553 012 0,,25 1 ··;> Staphylococcus epidermis 3519 0 a 12 0 y 25 1 -A. Hicrococcus luteus ATCC 9341 0*015 0,,03 0 „ 12 0,, 25 Streptococcus agalactiae CMX 508 0*03 0 s 03 0*25 05 Streptococcus pyogenes EE861 0,,015 0,, 03 0 „ 12 0,,25 Escherichia coli JUHL 32 32 >128 >1 28 Eschericha coli SS 1 ·' > 4 ••'Ί· .A: Enterococcus faecium ATCC 8043 0 a 06 0,, 12 0*5

A “ Eritromicina A

B ~ Eritromicina B

dB ~ e -Desoxí-fôri tromicina B dnfâ = ó^Desoxi-XS-noreritromiclna 8 -33- 4802 „ PO .. 01

ActiyI.dade....Antizbâct .....In...v.iyo A actívidade in.....vivo da ó-desoxi-eritromicina A foi avaliada utilizando o testo de protecção do ratinho, agudo» A mortalidade do ratinho foi utilizada para calcular um valor de ED50„ isto é„ a dose de droga necessária para proteger 50% dos animais de teste contra a morte devida ao desafio do inóculo. 0 teste de protecção do ratinho, agudo, foi conduzido tal como descrito por Fernandes e colafo., (Antimicrob..,........Agen.M........Chemo- ther·. 29s201......208 (1986)), em ratinhos CF-1 fêmea, pesando 20-25 gramas. Os ratinhos foram injactados intraperitoneaimente com suspensões bacterianaS numa concentração 100 vezes superior àquela que produz uma resposta LD^q. A 6~desox i-e r i tromicina A ou a eritromicina A foram administradas oralmente 1 e 5 horas após a infecção. As doses eficazes médias para as mortalidades cumulativas no sexto dia após a infecção foram calculadas utilizando um "trimmed logit analysis" (Hamilton e calab», Enví rjon_.............Sei

Technol» 112714-719 (1977),, 0s resultados desta análise, representados na Tabela 6, abaixo, indicam que a 6-desoxi-eritromicina A é tão eficaz como a eritromicina A quando administrada oralmente contra infecçoes murinas de Staphyloçoççi. e S t rep t oçoçc j,,,

Adim

Aetiv idade.......In........vivo.......da......6™ SEfil.....(Dose Proporcionando.....Sobrevivência.....de..50%..em.....rng/kg.l istlrpe.....bacter i ana DD a. staphy1ococcus aureus 10649 90,8 119,6 Streptococcus pneumoniae 6303 24,9 24,8 Streptococcus pyogenes C203 32,4 54,5

dA % 6-desoxi-eritromicina A A - eritromicina A

Claims

72 468 4802,4¾ „01 -34“ Β.....i.....I.....V.....I.....N.....0.....1.....Ç.....A.....C.....õ.....1:,..8 1 ~ Processo de produção de um composto possuindo a formulai ÇH3 H3C^n^CH3

na qual R2 ê seleccionado de entre OH e M, e R:> e R3 são selec·"-cíonados:, iridependentemente um do outro., de entre H e CH3, ou de um seu éster ou sai farmaceuticamente aceitável, caracteriaado por compreender a interrupção da hidroxilaçâo» num microorganismo produtor de eritromicina* do 6-desoxieritronolído B na posição C~6 durante a biossintese da eritromieina,.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o microorganismo ser um membro do género S< 3 “ Processo de preparação de um composto de fórmula

na qual R-j é seleceionado de entre OH e H, e R,;;. e R3 são selec-eionados., independentemente um do outro,, de entre H e CH3 ou de -35- 72 468 4802„pQ„oi um seu sal ou éster farmaceuticamente aceitável„ caracterizado por compreender o passo de cultivar um microorganismo capa;;: de b i oss inteti zar o composto„ 4. /,auu 4 -- processo de acordo com a reivindicação 3, caracter por o microorganismo ser urn membro do género 5 ~ processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por o microorganismo ter todas as caracterlsticas identificadoras g.accharcpolvapora.....erythraea UWlJLOs ::pHW5ó~H23,.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o microorganismo ser um transformante de um microorganismo produtor de eritromicina que & deficiente na hidroxilaçâo em 06 durante a bíossintese de eritromicina.. 7 ~ Processo de acordo com a reivindicação 6„ caracterizado por o transformante ser produzido por integração de um plasmideo de AON no microorganismo,. 8 ~ Processo de preparação de 3-tt-micarosi 1-6-desoxí......eritro- nolido B, caracterizado por compreender o passo de cultivar um microorganismo capaz de biossintetizar o referido composto. 9 -· Processo de acordo com a reivindicação 8,. caracterizado por o microorganismo ser um membro do género 10 ·" Processo para a transformação de um microorganismo produtor de eritromicina num microorganismo deficiente na hidroxila-çâo em í>~6 durante a biossíntese de eritromicina, caracterizado por compreender os passos de (a) preparar um plasmideo de AON re-cornbinante compreendendo uma sequência de nucleotidos que ê homóloga a. uma porção do genoma do microorganismo e (b) integra ίο plasmideo no genoma do microorganismo.. 11 ~ Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o microorganismo ser um mernbro do gsnero Sjx.ccha . 72 468 4802.. PO01 " ò to ô. f 12 ” Processo cie acordo com a reivindicação 10., caracteri^a-cio por o plasmideo de AON ser pHW56~H23. .isboa, « M. 199). Por ABBOTT LABORATORIES ~ 0 AQENTE OFICIAL -

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