ES2344337T3 - Oligomeros no agregantes y sin bloqueo de la fluorescencia que comprenden analogos de nucleotidos; metodos de sintesis y uso de los mismos. - Google Patents
Oligomeros no agregantes y sin bloqueo de la fluorescencia que comprenden analogos de nucleotidos; metodos de sintesis y uso de los mismos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2344337T3 ES2344337T3 ES00980769T ES00980769T ES2344337T3 ES 2344337 T3 ES2344337 T3 ES 2344337T3 ES 00980769 T ES00980769 T ES 00980769T ES 00980769 T ES00980769 T ES 00980769T ES 2344337 T3 ES2344337 T3 ES 2344337T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- pna
- conjugate
- dna
- fluorescence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
- C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D487/04—Ortho-condensed systems
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
- C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
Un conjugado que comprende: (a) un polímero que comprende una serie de unidades de monómero; y (b) un fluoróforo unido covalentemente a ellos, en el que uno o más de las unidades de monómero comprende un análogo de base, en el que el análogo de base se selecciona de entre el grupo que consiste de pirazolopirimidinas, como el análogo de bases retiene la especificidad de emparejamiento de bases de las bases para las que se sustituyen, y conduce a una reducción en el bloqueo de la fluorescencia del fluoróforo y/o auto-asociación del polímero reducida.
Description
Oligómeros no agregantes y sin bloqueo de la
fluorescencia que comprenden análogos de nucleótidos; métodos de
síntesis y uso de los mismos.
La descripción se refiere al uso de análogos de
nucleótidos para proporcionar propiedades mejoradas a las sondas de
hibridación, que incluye sondas de DNA y RNA y sondas de ácidos
nucleicos modificados, como péptidos de ácidos nucleicos (PNA), y
sondas quiméricas que contienen dos o más tipos de ácidos nucleicos
y/o ácidos nucleicos modificados.
El análisis de hibridación es central para una
serie de técnicas en biología molecular y diagnóstico, incluyendo
el clonaje de genes, identificación de genes, análisis forense,
farmacogenómica e identificación de polimorfismos genéticos. Puede
utilizarse la hibridación como objetivo de un ensayo, en el que la
presencia de sondas hibridadas constituye la lectura para el
ensayo; o la hibridación puede utilizarse como el paso inicial en un
ensayo, en el que un evento posterior a la hibridación (como, por
ejemplo, extensión de un cebador hibridado o hidrólisis de una
sonda hibridada) se utiliza como lectura.
Tradicionalmente, las sondas de hibridación y
los cebadores han sido moléculas de DNA; no obstante, existen
ciertas desventajas en el uso de DNA como sonda o cebador. Por
ejemplo, la composición de bases de una molécula de DNA puede
afectar a su efectividad como sonda o cebador de varias maneras. Una
molécula de DNA con una alta concentración de residuos G es a
menudo difícil de manejar (por ejemplo, problemas con la agregación
y pobre solubilidad) y puede proporcionar un gran ruido de fondo en
las reacciones de hibridación. También se sabe que las moléculas de
DNA ricas en G son propensas a la producción de artefactos en el
análisis de las secuencias de DNA mediante electroforesis en gel,
presumiblemente debido a la adopción de estructuras secundarias
mediante estas moléculas, a pesar de las condiciones
desnaturalizantes bajo las que se realizan dichos análisis.
Se han utilizado varias formas modificadas de
DNA y análogos de DNA para intentar de superar algunas de las
desventajas de la utilización de moléculas de DNA como sondas y
cebadores. Entre estas están los péptidos de ácidos nucleicos (PNA,
también conocidos como poliamidas de ácidos nucleicos). Nielsen
et al. (1991) Science 254:1497-1500. Los PNA
contienen unidades de bases heterocíclicas, como se encuentran en el
DNA y RNA, que están unidos mediante un esqueleto de poliamida, en
lugar del esqueleto característico de azúcar-fosfato
del DNA y RNA. Los PNA son capaces de hibridar con secuencias diana
complementarias de DNA y RNA y, de hecho, hibridan más fuertemente
que la correspondiente sonda de ácido nucleico. Además, los PNA son
resistentes a muchos tipos de nucleasas que atacan los esqueletos
de azúcar-fosfato del DNA y RNA. Otras ventajas de
los PNA incluye la capacidad de los PNA modificados específicamente
para cruzar la barrera hematoencefálica y la observación que los
PNA inyectados por vía intratecal pueden mediar efectos antisentido
in vivo. During et al. (1999) Nature Biotechnol.
17:753-754.
La síntesis de oligómeros de PNA y monómeros
reactivos utilizados en la síntesis de oligómeros de PNA se ha
descrito en las Patentes Estadounidenses Nº 5.539.082; 5.714.331;
5.773.571; 5.736.336 y 5.766.855. Las aproximaciones alternativas a
la síntesis de PNA y, los monómeros para la síntesis de PNA se
resumen en Uhlmann et al. (1998) Angew. Chem. Int. Ed 37:
2796-2823.
No obstante, como se han empezado a utilizar
ampliamente, también se han visto las desventajas de los PNA. Por
ejemplo, los oligómeros de PNA largos, dependiendo de su secuencia,
son propensos a agregarse, difíciles de purificar y difíciles de
caracterizar. Además, los oligómeros de PNA ricos en purinas tienden
a agregar y son poco solubles en medio acuoso. Gangamani et
al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm.
240:778-782; Egholm, Cambridge Healthtech
Institute's Seventh Annual nucleic acid-Based
Technologies, 21-23 de Junio de 1999, Washington,
D.C.; Uhlmann, Cambridge Healthtech Institute's Seventh Annual
nucleic acid -Based Technologies, 21-23 Junio de
1999, Washington, D.C. Como consecuencia, el uso efectivo de los PNA
en la hibridación está limitado a las secuencias en las que no hay
más de 4-5 purinas consecutivas, no más de 6 purinas
en cualquier porción de 10 bases de la secuencia, y/o no más de 3
residuos G consecutivos. Véase, por ejemplo,
http://www.resgen.com/perseptivedesign.html. Además, ya que las
interacciones PNA-PNA son aún más fuertes que las
interacciones PNA-DNA, las sondas que contienen PNA
y los cebadores que contienen secuencias autocomplementarias no
pueden utilizarse generalmente para la hibridación de una secuencia
diana. Otra consecuencia de la fuerte interacción entre PNA y las
moléculas de DNA y/o RNA complementarias es que es difícil obtener
una discriminación de desemparejamiento sencillo de nucleótido
utilizando sondas de PNA. Demidov et al. (1995) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 92:2637-2641.
Uhlmann et al., supra revisan las
aproximaciones para aumentar la solubilidad de los PNA, que incluye
la síntesis de quimeras de PNA/DNA y la adición de residuos
terminales de lisina a un oligómero de PNA. No describen el uso de
análogos de nucleótidos para aumentar la solubilidad y mejorar las
propiedades de hibridación de los oligómeros de PNA.
Restricciones similares de diseño se requieren
en la síntesis de sondas y cebadores de oligonucleótidos que no
contienen PNA. Véase, por ejemplo, la publicación titulada "Diseño
de Ensayo Cuantitativo y Optimización de los Sistemas de Detección
de Secuencias", PE Biosystems, Nº de reserva.
117MI02-01. En estos casos, el contenido de G/C de
un oligómero debe mantenerse dentro del rango de
20-80% y debe evitarse la utilización de un
nucleótido idéntico, particularmente guanina (G). En particular, la
publicación mencionada advierte sobre los tramos de cuatro o más
residuos G y frente a la presencia de un residuo G en el extremo 5'
terminal de una sonda marcada con fluorescencia en 5'. En el caso
de los cebadores, los cinco nucleótidos en el extremo 3' no pueden
comprender más de dos residuos G y/o C.
Se ha descrito la síntesis de nucleósidos
pirazolo[3,4-d]pirimidina y
7-deazapurina, así como sus monómeros de
fosforamidita para su uso en la síntesis de oligómeros. Seela et
al. (1985) Nucl. Acids Res. 13:911-926; Seela
et al. (1986a) Helv Chim. Acta 69:1191-1198;
Seela et al. (1986b) Helv. Chim. Acta
69:1813-1823; y Seela et al. (1987) Biochem.
26:2232-2238. Se describen los nucleósidos de
pirazolo[3,4-d]pirimidina y
7-deazapurina para su uso en la secuenciación de
DNA y como agentes antivirales en la PE 286 028. La publicación
compartida PCT WO 99/51775 describe el uso de oligonucleótidos que
contienen pirazolo[3,4-d]pirimidina
para hibridación y discriminación de desemparejamientos. Se ha
descrito que la incorporación de
2'-deoxi-7-deazaguanosina
en el DNA elimina la compresión de bandas en los tramos ricos en GC
durante el análisis de la secuencia de DNA mediante electroforesis
en gel (Patente Estadounidense Nº 5.844.106), disminuye la formación
de tetraplex por secuencias ricas en G (Murchie et al.
(1994) EMBO J. 13:993-1001) y reduce la formación de
agregados característicos de moléculas de DNA que contienen
2'-deoxiguanosina (Patente Estadounidense Nº
5.480.980). No obstante, la sustitución de oligonucleótidos con
7-deazaadenosina (en lugar de A) o
7-deazaguanosina (en lugar de G) disminuye la Tm de
los híbridos formados por dichos oligonucleótidos sustituidos, con
más de un grado de reducción en la Tm por base sustituida. Seela
et al. (1987) supra; y Seela et al. (1986)
Nucl. Acids Res. 14:2319-2332.
Por otro lado, se ha descrito la estabilización
de los duplex mediante análogos de la base pirazolopirimidina.
Seela et al. (1988) Helv. Chim. Acta.
71:1191-1198; Seela et al. (1988) Helv. Chim
Acta. 71:1813-1823; y Seela et al. (1989)
nucleic acid Res. 17:901-910. Los oligonucleótidos
en los que uno o más residuos de purina se han sustituido por
pirazolo[3,4-d]pirimidinas muestran la
capacidad mejorada de formación de duplex y triplex, como se
describe, por ejemplo, en Belousov et al. (1998) nucleic acid
Res. 26:1324-1328; Patente Estadounidense Nº
5.594.121 y publicación PCT compartida WO 98/49180. Los residuos
pirazolo[3,4-d]pirimidina en los
oligonucleótidos son también útiles como sitios de unión de varios
grupos colgantes a oligonucleótidos. Véase publicación compartida
PCT WO 90/14353, 29 Noviembre, 1990 y Patente Estadounidense Nº
5.824.796. Ninguna de estas referencias describe el uso de
pirazolopirimidinas o cualquier otro tipo de análogo de base para
reducir la agregación y/o aumentar la solubilidad de un oligómero,
o para disminuir el bloqueo de la fluorescencia de un fluoróforo
conjugado a un oligómero.
Los conjugados que comprenden un ligando de
unión al surco menor (MGB), un oligonucleótido en el que uno o más
residuos de purina se sustituyen por un residuo de
pirazolo[3,4-d]pirimidina (PZP), un
fluoróforo y un bloqueador de la fluorescencia se describen en las
publicaciones compartidas PCT WO 99/51621 y WO 99/51775. Dichos
conjugados se utilizan, entre otras cosas, como sondas de
hibridación, cebadores y sondas hidrolizables en los ensayos de
amplificación basados en 5'-nucleasa. La inclusión
de un MGB en estos conjugados aumenta la estabilidad de los
híbridos formados por la porción de oligonucleótido del conjugado,
permitiendo el diseño de sondas más cortas. Además, ambos MGB y la
PZP contribuyen a la capacidad de dichos conjugados de presentar
una discriminación mejorada del desemparejamiento. Ninguna de las
publicaciones mencionadas antes describe el uso de PZP o cualquier
otro tipo de análogo de base para reducir la agregación y/o aumento
de la solubilidad de un oligómero, o para disminuir el bloqueo de
la fluorescencia de un fluoróforo conjugado a un oligómero.
En un primer aspecto de la presente invención se
proporciona un conjugado que comprende:
(a) un polímero que comprende una serie de
unidades de monómero; y
(b) un fluoróforo unido covalentemente a
ellos,
en el que uno o más de las unidades de monómero
comprende un análogo de base, en el que el análogo de base se
selecciona de entre el grupo que consiste de pirazolopirimidinas,
como el análogo de bases retiene la especificidad de emparejamiento
de bases de las bases para las que se sustituyen, y conduce a una
reducción en el bloqueo de la fluorescencia del fluoróforo y/o
auto-asociación del polímero reducida.
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporcionan los oligómeros en los que al
menos una de las subunidades comprende un análogo de base
pirazolopirimidina. Los oligómeros pueden comprender DNA, RNA, PNA,
o cualquier combinación o quimera de los mismos. Cualquier número
de residuos de purina en el oligómero puede sustituirse mediante un
análogo de base. Cualquiera de estos oligómeros anteriormente
mencionados puede comprender porciones adicionales como fluoróforos,
bloqueadores de fluorescencia y/o ligandos de unión al surco
menor.
Los oligómeros en los que al menos una de las
subunidades comprende un análogo de base de pirazolopirimidina,
cuando se utiliza para hibridación, tienen menos tendencia a la
agregación y autoasociación, son más solubles, tienen capacidad
aumentada de discriminación del desemparejamiento, y no bloquean la
emisión de marcajes fluorescentes conjugados.
\newpage
También se proporcionan los oligómeros que
comprenden uno o más residuos de PNA en los que al menos uno de los
residuos de PNA comprende un análogo de base pirazolopirimidina. Los
oligómeros pueden comprender exclusivamente residuos de PNA, o los
oligómeros pueden comprender ambos residuos de nucleótido de PNA y/o
DNA y/o RNA para constituir una quimera de PNA/DNA, PNA/RNA o
PNA/DNA/RNA. Cualquier número de residuos de purina en el oligómero
puede sustituirse mediante un análogo de base. Cualquiera de los
oligómeros anteriormente mencionados puede comprender porciones
adicionales como fluoróforos, bloqueadores de fluorescencia y/o
ligandos de unión al surco menor.
Se proporcionan las composiciones que comprenden
un polímero y un fluoróforo, en los que uno o más residuos que
contienen purina del polímero están sustituidos con un residuo que
comprende un análogo de base de pirazolopirimidina. Los polímeros
pueden comprender PNA, DNA, RNA o cualquier combinación o quimera de
los mismos; y el análogo de base puede estar presente en cualquiera
de las porciones de PNA, DNA o RNA de polímero quimérico. Cualquier
número de residuos de purina en el polímero puede sustituirse
mediante un análogo de base, en cualquiera de las porciones de PNA,
DNA y/o RNA. Las composiciones anteriormente mencionadas pueden
comprender opcionalmente un bloqueador de la fluorescencia y/o
ligandos de unión al surco menor.
En las composiciones
polímero-fluoróforo recién descritas, el bloqueo del
fluoróforo mediante residuos de purina en el polímero se reduce
cuando una o más purinas se sustituye con un análogo de base. Dichas
composiciones que comprenden de forma adicional un bloqueador de la
fluorescencia son útiles, por ejemplo, como sondas en ensayos de
sonda hidrolizable, en los que el bloqueo del fluoróforo por el
bloqueador de la fluorescencia se reduce mediante la hidrólisis
dependiente de la hibridación de la sonda. La reducción en el
bloqueo proporcionada por la sustitución de un análogo de base para
una purina conduce a una mayor emisión de fluorescencia tras la
hidrólisis y, por lo tanto, una mayor sensibilidad en dichos
ensayos.
También se describen los nuevos intermediarios
para la síntesis de oligómeros que contienen PNA que comprenden
análogos de bases. En una realización, se proporcionan los derivados
del ácido acético de análogos de bases de pirazolopirimidina y
pirrolopirimidina, en el que el N1 de la pirazolopirimidina o
pirrolopirimidina está unido al C2 de una porción de ácido acético
y los grupos funcionales están bloqueados. Estos derivados son
útiles para la preparación de monómeros para la síntesis
automatizada de PNA sustituidas y quimeras de PNA/DNA. Las
realizaciones preferibles de estos intermediarios incluyen ácido
2-{6-[(1E)-1-aza-2-(dimetilamino)vinil]-4-hidroxipirazolo[5,4-d]pirimidinil}acético;
ácido
2-(6-amino-4-hidroxipirazolo[5,4-d]pirimidinil)acético;
y ácido
2-(-4-aminopirazolo[5,4-d]pirimidinil)acético.
También se describen derivados de
aminoetilglicil de los anteriormente mencionados derivados de
acético ácido de análogos de bases de pirazolopirimidina y
pirrolopirimidina, en el que el grupo \alpha-amino
de una porción glicilo bloqueada se deriva al C1 del acético ácido
del acetato y al C2 de una porción de etilamina. Estos derivados
también son conocidos como "monómeros de PNA". Dichos
compuestos son útiles para la síntesis automatizada de los
oligómeros y polímeros anteriormente mencionados. Las realizaciones
preferibles de monómeros de PNA que contienen PPG (también conocido
como PPPG) incluye ácido
5-[4-hidroxi-6-(2-metilpropanoilamino)pirazolo[5,4-d]pirimidinil]-3-(2-{[(4-metoxifenil)difenilmetil]amino}etil)-4-oxopentanoico
y
1-{6-[(1E)-aza-2-(dimetilamino)vinil]-4-hidroxipirzolo[5,4-d]pirimidinil}-N-(2-{[(4-metoxifenil)difenilmetil]amino}etil)-N-(2-oxipropil)acetamida.
Una realización preferible de un monómero de PNA que contiene PPA es
el ácido
2-[N-(2-{[(4-metoxifenil)difenilmetil]amino}etil)-2-{4-[(4-metoxifenil)carbonilamino]pirazolo[5,4-d]pirimidinil}acetil-amino]acético.
También se describen los métodos para la
síntesis de oligómeros que comprenden PNA, DNA, RNA y/o quimeras de
los mismos, en los que los anteriormente mencionados monómeros de
PNA se utilizan en uno o más pasos en la síntesis. Los oligómeros
sintetizados por estos métodos también se proporcionan.
En otra realización, se proporcionan los métodos
para detectar una secuencia diana en un polinucleótido mediante
hibridación a una sonda que comprende un oligómero de DNA, PNA, o
PNA/DNA, en el que uno o más residuos en la sonda comprende un
análogo de base de pirazolopirimidina. En la práctica de estos
métodos, la sonda puede comprender adicionalmente uno o más de un
ribonucleósido, un fluoróforo, un bloqueador de la fluorescencia
y/o un ligando de unión al surco menor.
En otra realización, se proporcionan los métodos
para la detección de una secuencia diana en un polinucleótido que
utiliza composiciones que comprenden una porción polimérica (que
comprende un polímero) y una porción fluorogénica (que comprende
uno o más fluoróforos), en el que uno o más residuos que contienen
purina del polímero están sustituidos por un residuo que comprende
un análogo de base de pirazolopirimidina. Los polímeros para
utilizar en el método pueden comprender PNA, DNA, RNA o quimeras de
los mismos; y el análogo de base puede estar presente en cualquiera
de las porciones de PNA, DNA o RNA de un polímero quimérico.
Cualquier número de residuos de purina en el polímero puede
sustituirse mediante un análogo de base. En una realización
preferible, el método se practica utilizando una composición en la
que un residuo de purina en la porción polimérica que está
directamente adyacente a la porción fluorogénica se sustituye con
una pirazolopirimidina. En otra realización preferible, los
oligómeros que contienen tres o más residuos de G consecutivos
tienen sus residuos G consecutivos sustituidos por PPG. Las
composiciones para utilizar en este método pueden comprender
opcionalmente un bloqueador de la fluorescencia y/o un ligando de
unión al surco menor.
\newpage
En realizaciones adicionales, se proporcionan
los métodos para detectar una secuencia diana en una reacción de
amplificación, utilizando las composiciones de la invención. En una
realización preferible, la reacción de amplificación comprende un
ensayo de sonda hidrolizable.
También se proporcionan microchips de oligómeros
en los que al menos uno de los oligómeros descritos aquí está
presente en el chip.
También se proporcionan los métodos para
detectar una secuencia diana en un polinucleótido, en el que el
polinucleótido está presente en una muestra, mediante hibridación a
una composición como se ha descrito aquí. En una realización
preferible, la secuencia diana presenta un desemparejamiento de
nucleótido único respecto a la secuencia relacionada que también
está presente en la muestra, y la composición forma un híbrido con
la secuencia diana pero no con la secuencia relacionada.
La Figura 1 muestra el análisis de la
fluorescencia a tiempo real de una serie de ensayos de sonda
hidrolizable en los que se utilizan las sondas que contienen G
entre 2 y 9 nucleótidos (Id. de Sec Nº 1-8) como
sondas fluorescentes y se compara con sondas en las que los
residuos G se sustituyen por PPG (Id. de Sec Nº
9-16).
La práctica de la invención empleará, a no ser
que se indique de otra manera, técnicas convencionales en química
orgánica, bioquímica, síntesis y modificación de oligonucleótidos,
química de bioconjugados, hibridación de ácidos nucleicos, biología
molecular, microbiología, genética, DNA recombinante, y campos
relacionados a los expertos en la materia. Estas técnicas se
explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo,
Maniatis, Fritsch & Sambrook, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY
MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982); Sambrook,
Fritsch & Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL,
Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);
Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John
Wiley & Sons (1987 y actualizaciones anuales); Gait (ed.),
OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESES: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1984);
Eckstein (ed.), OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL
APPROACH, IRL Press (1991).
Las descripciones de todas las publicaciones y
patentes citadas aquí se incorporan en su totalidad por
referencia.
Los términos deazapurina y pirrolopirimidina se
utilizan intercambiablemente para indicar un núcleo heterocíclico
que comprende anillos pirimidina y pirrol fusionados, de acuerdo con
la siguiente fórmula general:
El término pirazolopirimidina se refiere a un
núcleo heterocíclico que comprende anillos pirimidina y pirazol
fusionados, de acuerdo con la siguiente fórmula general:
Un "monómero" se refiere a una composición
que comprende una base o un análogo de base unido de forma covalente
a una porción reactiva, de forma que el monómero pueda
incorporarse, mediante la porción reactiva, como parte de un
oligómero o polímero. En ciertos casos, los grupos funcionales en la
porción base/análogo de base y/o en la porción reactiva se bloquean
para que no sean reactivas durante la polimerización. En
realizaciones preferibles, la porción reactiva es una porción
aminoetilglicina, en cuyo caso el monómero puede describirse como
"monómero de PNA".
Un "oligómero" es un polímero que comprende
unidades de monómero unidas. Los oligómeros pueden sintetizarse
mediante unión secuencial de los monómeros, mediante sus porciones
reactivas, como se conoce en la técnica. Un oligómero puede
comprender un oligómero de DNA, un oligómero de RNA, un oligómero de
PNA, o cualquier oligómero quimérico compuesto de monómeros de DNA,
RNA, y/o PNA.
Un "grupo bloqueador" o "grupo
protector" es cualquier porción química capaz de prevenir la
reactividad de un átomo de N, S o O al que está unido, bajo
condiciones en las que dichos átomos de N, S o O pueden de otra
manera ser reactivos. Ejemplos de grupos protectores incluye, pero
no se limita a grupos terc-butiloxicarbonilo
(tBoc), 4-metoxifenildifenilmetilo (MMTr),
isobutirilo (iBu), 9-fluoronilmetiloxicarbonilo
(Fmoc), -C_{6}H_{5} (bencilo), difenilcarbamoilo (DPC),
2-N-dimetilvinilo (Dmv),
bencilooxicarbonilo (Cbz), benzoilo (bz), isobutanoilo, acetilo, y
anisoilo (An). Estos y otros grupos protectores útiles en la
síntesis de ácidos nucleicos y oligómeros de PNA son conocidos en
la materia. Uhlmann et al. (1998) Angew. Chem. Int. Ed
37:2796-2823; Green, et al. en Protective
Groups in Organic Synthesis, 2ª Edición, John Wiley y Sons, Inc,
NY., pp. 441-452. 1991.
La invención proporciona oligómeros en los que
uno o más bases de purina están sustituidos con un análogo de base
la misma especificidad de emparejamiento de base que la purina a la
que sustituye. Los análogos pueden ser pirazolopirimidinas o
pirrolopirimidinas. Los oligómeros pueden comprender
oligonucleótidos de DNA, oligonucleótidos de RNA, oligómeros de
PNA, o quimeras de los mismos. Una quimera se refiere a un oligómero
que comprende más de un tipo de subunidad, por ejemplo, una quimera
de RNA/DNA, una quimera de PNA/DNA, una quimera de RNA/PNA o una
quimera de PNA/DNA/RNA. Para los oligómeros quiméricos, un análogo
de base puede estar presente en cual-
quier porción de la quimera (es decir, en una porción del DNA, en una porción del RNA y/o a una porción del PNA).
quier porción de la quimera (es decir, en una porción del DNA, en una porción del RNA y/o a una porción del PNA).
Los métodos para la síntesis de oligómeros de
DNA, RNA y PNA son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo,
Patente Estadounidense Nº 5.419.966; Gait, supra; Eckstein
(ed.) "Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach",
1991, IRL Press, Oxford; Ogilve et al. (1988) Proc. Natl.
Acad Sci. USA 85:5746-5748; Nielsen et al.
(1991) supra; Uhlmann et al. (1998) supra;
Patentes Estadounidenses Nº 5.539.082; 5.714.331; 5.773.571;
5.736.336 y 5.766.855. Otros oligómeros modificados de DNA y/o RNA
también pueden utilizarse. Por ejemplo, se han descrito los métodos
para la síntesis de oligoribonucleótidos
2'-O-metilo. Sproat et al.
(1989) Nucleic acid Res. 17:3373-3386.
En general, los métodos para la síntesis de
oligómeros comprende ciclos secuenciales de adición de monómeros a
una cadena creciente de oligómeros que está opcionalmente unida a un
soporte sólido, en el que la cadena creciente de oligómero contiene
opcionalmente grupos funcionales protegidos y un extremo creciente
bloqueado. Normalmente, en cada ciclo de adición de monómero, la
cadena creciente unida al soporte se somete primero a condiciones
que desbloquean el extremo creciente, se condensa después con un
monómero, el cual está opcionalmente activado por condensación. Las
condiciones y reactivos de desbloqueo, así como las condiciones y
reactivos activadores, son conocidas en la técnica. El paso de
adición de monómeros se repite tan a menudo como sea necesario, con
la identidad del monómero añadido a cada paso que corresponde con la
secuencia deseada del oligómero. Cuando la secuencia deseada se ha
obtenido, el oligómero naciente se somete a condiciones que
desprotegen los grupos funcionales y/o escinden el oligómero
completo del soporte, después se purifica, si es necesario.
Los oligómeros de PNA se utilizan a menudo como
sustitutos de oligonucleótidos de DNA en técnicas de hibridación y
otras. No obstante, los oligómeros de PNA tienden a la agregación y
a menudo presentan una solubilidad reducida en solventes acuosos,
especialmente PNA ricos en G. En una realización preferible, un
oligómero de PNA comprende uno o más residuos en los que una base
de purina se sustituye mediante un análogo de base de
pirazolopirimidina o pirrolopirimidina; por ejemplo, G se sustituye
por PPG o 7-deazaguanina, A se sustituye por PPA o
7-deazaadenina, y G o A se sustituye por PPI o
7-deazahipoxantina. De esta manera el análogo de
base retiene la especificidad de emparejamiento de base de la base
para la que se sustituye. En una realización más preferible, se
proporciona un oligómero de PNA con uno o más residuos G
sustituidos por PPG. Dichos PNA sustituidos por PPG presentan
autoasociación intermolecular e intramolecular reducida si se
compara con los oligómeros que contienen G. Esto facilita la
purificación y el manejo de oligómeros y proporciona propiedades de
hibridación mejoradas (por ejemplo, aumento de la sensibilidad),
especialmente para las secuencias de sonda que contienen tres o más
residuos G consecutivos.
Ya que un análogo de base retiene la
especificidad de emparejamiento de base de la base a la que
sustituye, los oligómeros de la invención son capaces de una unión
específica de secuencia a secuencias complementarias y puede
presentar un aumento en la formación de duplex y triplex a dianas de
cadena sencilla y dobles, respectivamente.
Sin pretender adherirse a ninguna teoría, los
solicitantes remarcan que, cuando se compara con bases de purina
que aparecen de forma natural, los análogos de bases
pirazolopirimidina y pirrolopirimidina tienen menos probabilidad de
formar pares de base no canónicas (como los emparejamientos
G-T y G-G), reteniendo aún la
capacidad de formar los emparejamientos canónicas característicos
de las purinas a las que sustituyen (es decir, emparejamientos
PPG-C, 7PG-C, PPA-T
y 7PA-T).
Se proporcionan los análogos de bases en los
oligómeros y en los intermediarios para la síntesis de oligómero.
El análogo de base posee una estructura como la indicada en la
Fórmula 1, en el que R1 y R2 son independientemente -H, -OH, -SH, o
-NH2; R3 es -H, -CN, halógeno (F, Cl, Br o I), o
-R12-Y, en el que R11 es C1-C12
alquilo, alquenilo o alquinilo y Y es -H, -OH, -NH2 o -SH; X es
=CH- o =N-; y L es el enlace a un esqueleto de oligómero, como DNA,
RNA, PNA o cualquier quimera de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando X es =N-, el análogo de base es
pirazolopirimidina y cuando X es =CH-, el análogo de base es
pirrolopirimidina (también conocido como
7-deazapurina). Por ejemplo, cuando X es =N-, R1 es
-OH, R2 es -NH2, y R3 es -H, el análogo de base es
pirazolopirimidinilguanina (PPG). Cuando X es =N-, R1 es -NH2, y R2
y R3 son -H, el análogo de base es pirazolopirimidiniladenina
(PPA). Cuando X es =N-, R1 es -OH, y R2 y R3 son -H, el análogo de
base es pirazolopirimidinilhipoxantina (PPI).
Cuando X es =C-, R1 es -OH, R2 es -NH2, y R3 es
-H, el análogo de base es 7-deazaguanina (7PG).
Cuando X es =C-, R1 es -NH2, y R2 y R3 son -H, el análogo de base
es 7-deazaadenina (7PA). Cuando X es =C-, R1 es -OH,
y R2 y R3 son -H, el análogo de base es
7-deazahipoxantina (7PI).
PPG y 7-deazaguanina poseen las
mismas propiedades de emparejamiento de bases que la guanina (es
decir, se empareja con C), mientras que PPA y
7-deazaadenina poseen las mismas propiedades de
emparejamiento de bases que la adenina (es decir, se empareja con T
y U). PPI y 7-deazahipoxantina poseen las
propiedades de emparejamiento de bases equivalentes a ambos G y A y
por lo tanto se empareja con C, T y U.
Los análogos de bases que comprenden los
oligonucleótidos se sintetizan mediante métodos automatizados que
son bien conocidos en la técnica, que utilizan precursores
("monómeros de PNA") de acuerdo con la Fórmula 3. Los
monómeros se producen utilizando intermediarios que poseen la
estructura representada en la Fórmula 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los grupos funcionales permitidos en las
Fórmulas 1 y 2 son los siguientes. R1 y R2 son independientemente
-H, -OH, -OR6, -SH, -NH2 o -NHR7; R3 es -H, -CN, halógeno (F, Cl, Br
o I), o -R12-Y, en el que R12 es alquilo
C1-C12, alquenilo o alquinilo y Y es -H, -OH, -NH2 o
-SH, R4 es -H o un grupo protector seleccionado del grupo que
consiste en el grupo terc-butiloxicarbonilo (tBoc),
4-metoxifenildifenilmetilo (MMTr), isobutirilo (iBu)
y 9-fluoronilmetiloxicarbonilo (Fmoc); R5 es -H o
-C6F4H (TFP); R6 es -H, -C6H5 (bencilo) o un grupo difenilcarbamoilo
(DPC); R7 es un grupo protector seleccionado del grupo que consiste
en 2-N-dimetilvinilo (Dmv),
bencilooxicarbonilo (Cbz), monometoxitritilo (MMtr), benzoilo (bz),
isobutirilo (iBu), isobutanoilo, acetilo, y grupos anisoilo (An); y
X es =CH- o =N-.
Estas fórmulas incluyen todos los isómeros y
tautómeros de las moléculas que simbolizan. Las realizaciones
preferibles de los precursores para la síntesis de PNA y los
intermediarios utilizados en la síntesis de estos precursores son
los siguientes. Cuando R1 es -OH, R2 es -NH2, R3 es -H y X es =N- en
la Fórmula 2, la estructura resultante es ácido
2-(6-amino-4-hidroxipirazolo[5,4-d]pirimidinil)acético
(PPGA). Cuando R1 es -NH2, R2 es -H, R3 es -H y X es =N- en la
Fórmula 2, la estructura resultante es ácido
2-(4-aminopirazolo[5,4-d]pirimidinil)acético
(PPAA). Los correspondientes derivados de Fórmula 3, en los que R4 y
R5 son -H, se abrevian MPPGA y MPPAA, respectivamente. Los
derivados de bloqueo de estos compuestos también se proporcionan,
como se describe más adelante.
La denominación
"pirazolo[5,4-d]pirimidina" tal
como se utiliza aquí, se refiere a las mismas estructuras que las
denominadas pirazolo[3,4-d]pirimidinas
en anteriores publicaciones compartidas, patentes y solicitudes de
patente. Véase, por ejemplo, Patente Estadounidense Nº 5.824.796;
PCT WO 99/51621 y PCT WO 99/51775. La razón para este cambio en la
nomenclatura es para que los nombres por los que se identifica las
estructuras cumplan con los asignados a las estructuras mediante
los programas de nomenclatura NamExpert y Nomenclator,
proporcionados por ChemInnovation Software, San Diego, CA.
La síntesis de bases de pirazolopirimidina y
pirrolopirimidina se logra mediante los métodos conocidos en la
técnica. Seela et al. (1985) supra; Seela et
al. (1986a), supra; Seela et al. (1986b),
supra; y Seela et al. (1987) supra. Utilizando
las reacciones descritas por Uhlmann et al. (1998)
supra para la síntesis de derivados de ácido purina acético
2-sustituida,
4-aminopirazolo[5,4-d]pirimidina
apropiadamente protegida (PPA) y
6-amino-4-hidroxipirazolo[5,4-d]pirimidina
(PPG) pueden reaccionar con 2-bromoacetato de
alquilo para proporcionar productos de Fórmula 2. Ya que la
alquilación puede ocurrir en ambos átomos 1 y 2 de nitrógeno de
pirazolopirimidinas, es necesaria la separación de isómeros y la
purificación del isómero 1-sustituido. En el caso
de las 7-deazapurinas y las pirrolopirimidinas
relacionadas, la reacción con 2-bromoacetato de
alquilo proporciona solo el producto
N1-sustituido.
De acuerdo con esto, la PPGA (3) puede
sintetizarse a partir de 4-metoxipirazolo
[5,4-d]pirimidina-6-ilamina
(4) (Seela et al. (1985) Heterocycles
23:2521-2524) mediante alquilación con
2-cloroacetato de etilo en presencia de hidruro
sódico, seguido de la separación de los isómeros (Esquema de
reacción 1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Otra aproximación a la síntesis de PPGA se
muestra en el Esquema de reacción 2. En este caso,
2-amino-4-6-dicloropirimidina-5-carboxialdehído
(1) reacciona con acetato de etilo 2-(hidrazinol)acético
para proporcionar
2-(6-amino-4-{2-[(etoxicarbonil)metil]hidrazino}pirazolo
[5,4-d]pirimidinil)acetato de etilo
(2). Tratamiento de (2) con hidróxido sódico seguido de peróxido de
hidrógeno proporciona al producto PPGA deseado (3). Una ventaja de
este procedimiento sintético es que proporciona sólo el isómero
N1-sustituido. Véase Ejemplo 1, infra.
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
Para el uso en la síntesis química automatizada
de los oligómeros, los grupos reactivos en los análogos de bases,
como los grupos amino, deben protegerse. En una realización, los
derivados de PPGA bloqueados se sintetizan como se describe en el
Esquema de reacción 3. La PPGA (3) reacciona con cloruro de
isobutanoilo en dimetilformamida y trietilamina para generar un
derivado de PPGA con un grupo amino bloqueado con isobutirilo (14).
Véase Ejemplo 2, infra.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los métodos para la síntesis de derivados
aminoetilglicilo de PPGA, PPAA, ácido
2-(2-amino-4-hidroxipirrolo[2,3-d]pirimidin-7-il)acético
(7PGA) y ácido
2-(4-aminopirrolo[2,3-d]pirimidin-7-il)acético
(7PAA), para su uso como monómeros en la síntesis automatizada de
oligómeros, son conocidos en la técnica. Uhlmann et al.,
supra. Estos métodos implican la condensación de
aminoetilglicina apropiadamente protegida, por ejemplo,
2-[(2-{[(4-metoxifenil)difenilmetil]amino}etil)amino]acetato
de metilo (MMTrAeg, Will et al. (1995) Tetrahedron
51:12069-12082) con cualquiera de PPGA, PPAA, 7PGA
o 7PAA (también protegidos, si es necesario) en presencia de un
reactivo de condensación como hexafluorofosfato de
(O-7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(HATU), hexafluorofosfato de
(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(HBTU), o tetrafluoroborato de
O-[(ciano(tetoxicarbonil)metilen)amino]-1,1,3,3-tetrametiluronio
(TOTU), como se muestra en el Esquema de reacción 4. El R_{5}
grupo protector se elige de forma que pueda eliminarse de forma
selectiva, (es decir, sin eliminar otros grupos de bloqueo) para
proporcionar el compuesto 7 en el que R_{5} es -H y, por ejemplo,
R_{1} es -NHCbz, R_{2}, y R_{3} son -H y R_{4} es -MMTr.
Este derivado protegido de MPPAA se utiliza en la síntesis de un
oligómero de PNA o una quimera de PNA/DNA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos de síntesis de un monómero de PPG
bloqueado para la síntesis de PNA se logra de acuerdo con el Esquema
de reacción 5. La PPG (15) reacciona con cloruro de isobutanoilo
para generar una PPG bloqueada con amino (16), que se trata con
hidruro sódico y después reacciona con bromoacetato de alquilo para
generar, por ejemplo, un derivado de acetato de metilo (17). La
hidrólisis alcalina de éster de metilo 17 proporciona el derivado
de ácido acético 18. Otra reacción de 18 con
2-[(2-{[(4-metoxifenil)difenilmetil]amino}etil)amino]acetato
de metilo (MMTrAeg) genera un éster de alquilo (en este ejemplo, el
éster de metilo) de un derivado aminoetilglicilo bloqueado con MMTr
con un grupo amino protegido por MMTr (19), que, tras la hidrólisis
alcalina del éster, proporciona el derivado de aminoetilglicina
protegido por MMTr 20. Véase Ejemplo 3, infra.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Un ejemplo de método para la síntesis de un
monómero de PNA que comprende el análogo de base PPA se muestra en
el Esquema de reacción 6.
4-aminopirazolo[5,4-d]pirimidina
(PPA, Compuesto 8) reacciona con cloruro de
4-metoxibenzoilo en piridina para proporcionar el
derivado PPA protegido por amino (9). Éste reacciona con hidruro
sódico seguido del éster de 2-bromoacetato de
metilo, y se aísla el derivado metilacetato
N1-sustituido (10). El tratamiento de 10 con
hidróxido sódico convierte el éster de metilo en el derivado de
acetato protegido por N-Bz de PPAA (Compuesto 11).
Véase Ejemplo 4 para más detalles.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Continuando con el Esquema de reacción 6, la
conversión de N-Bz PPAA (11) en un monómero reactivo
para la síntesis de PNA procede mediante condensación de 11 con
monometoxitritilaminoetilaminoacetato (MMTrAeg =
monometoxitritilaminoetilglicina) para formar 12, seguido por el
tratamiento de 12 con álcali para generar el derivado
aminoetilglicina protegido por MMTr 13. Véase Ejemplo 5 para más
detalles.
Un monómero de PPG preferible es el derivado de
MMTr-aminoetilglicina protegido por
2-N-dimetilvinilo (24), cuya
síntesis se muestra en el Esquema de reacción 7.
4-metoxipirazolo[5,4]pirimidina-6-ilamina
(21) reaccionó primero con KOH en metanol seco, seguido por la
reacción con bromoacetato de metilo para proporcionar el derivado
de acetato de metilo (22). La hidrólisis alcalina para proporcionar
el derivado de ácido acético 23 fue precedida por la reacción con
(dimetoximetil)dimetilamina para proporcionar (24). La
reacción de (24) con MMTrAeg proporcionó el monómero PPG protegido
25.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Un monómero PPA preferible es el derivado de
MMTr-aminoetilglicina protegido por
2-N-dimetilvinilo (29), cuya
síntesis se muestra en el Esquema de reacción 8.
Pirazolo[5,4]pirimidin-4-ilamina
(8) reaccionó primero con KOH en metanol seco seguido por la
reacción con bromoacetato de metilo para proporcionar el derivado
acetato de metilo (26). Éste reaccionó con
(dimetoximetil)dimetilamina para proporcionar (27), que se
trató con NaOH para proporcionar (28). La reacción de (28) con
MMTrAeg proporcionó el monómero de PPA (29).
La síntesis de los derivados reactivos de PPI
sigue procedimientos similares.
Pirazolo[5,4-d]pirimidin-4-ol
(PPI, Tominaga et al. (1990) J. Heterocycl. Chem.
27:775-783) puede alquilarse directamente con
bromoacetato de metilo, seguido por hidrólisis alcalina, para
proporcionar ácido
2-(4-hidroxipirazolo[5,4-d]pirimidinil)acético,
que puede convertirse como se ha descrito (Uhlmann et al.
(1998) supra) para el derivado de aminoetilglicina bloqueado
por MMTr. Alternativamente, el grupo hidroxilo de PPI puede
bloquearse con un grupo difenilcarbamoilo antes de la reacción con
acetato bromoacético de metilo.
Las mismas aproximaciones sintéticas utilizadas
para sintetizar los derivados reactivos de las
pirazolo[5,4-d]pirimidinas pueden
utilizarse para sintetizar los derivados reactivos de las
7-deazapurinas para su uso en la síntesis de
oligómeros que contienen PNA. La diferencia básica entre la síntesis
de estos dos tipos de compuestos es que en el último caso sólo un
isómero se genera tras la alquilación con bromoacetato de
metilo.
Además de los monómeros y precursores descritos
antes, la invención incluye oligómeros de PNA, oligonucleótidos de
DNA y/o quimeras de PNA/DNA que comprenden al menos una unidad
monomérica de Fórmula 4, opcionalmente unida de forma covalente a
uno o más ligandos, porciones de colas o grupos colgantes. Un
oligómero de PNA comprende dos o más monómeros de PNA que están
covalentemente unidos mediante enlaces peptídicos, como se ilustra
en la Fórmula 4, en el que B es una base (es decir, una base
heterocíclica A, G, C, T o U como se encuentran normalmente en los
ácidos nucleicos o un derivado modificado de las mismas) o análogo
de base; k está entre 0 y 50, preferiblemente entre 0 y 40, más
preferiblemente entre 0 y 30, y aún más preferiblemente entre 0 y
20; y R_{21} son independientemente -H, -OH, -NH_{2},
-NHR_{22}, -N(R_{22})_{2}, un grupo protector,
un grupo reactivo o un oligómero, en el que R_{22} es -H o
C_{1-6} alquilo, alquenilo o alquinilo.
La síntesis de oligómeros de PNA a partir de
precursores monoméricos se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo,
Uhlmann et al., supra. La síntesis comienza con una
resina de CPG u otro soporte sólido, que contiene un grupo amino
conjugado. Un monómero bloqueado de forma apropiada (que corresponde
con el monómero terminal del oligómero deseado) está acoplado
covalentemente al grupo amino con la ayuda de un reactivo de
acoplamiento. Tras la desprotección del extremo creciente bloqueado
del primer monómero, se acopla un segundo monómero. El proceso se
repite hasta que se obtiene un oligómero de la longitud deseada y
secuencia, en dicho momento el oligómero se escinde del soporte
sólido y se elimina cualquier grupo protector de base.
En una realización, un oligómero de PNA
contienen un grupo -NH_{2} en el extremo que se ha escindido del
soporte sólido, y un grupo -COOH o -OH en el extremo opuesto. Los
grupos terminales funcionales proporcionan sitios para la unión de
moléculas adicionales y grupos colgantes para los oligómeros que
contienen PNA.
Las estrategias para la síntesis de oligómeros
quiméricos de PNA/DNA son bien conocidos en la técnica. Véase, por
ejemplo, Uhlmann et al., supra. Las dos estrategias
principales para la síntesis de quimeras de PNA/DNA son
condensación de bloques de oligómeros de PNA y DNA presintetizados
en solución y síntesis secuencial en fase sólida con precursores
monoméricos de PNA y DNA protegidos de forma adecuada. Los expertos
en la materia apreciarán que, dependiendo del método de síntesis,
son posibles diferentes grupos de conexión entre las porciones de
PNA y DNA. Ejemplos de enlaces incluye, pero no se limita a, los
enlaces N-(2-hidroxietil)glicina y
5'-amino-2',5'-dideoxinucleósido
fosforamidita. Uhlmann et al., supra.
Los reactivos de acoplamiento (o agentes
activadores) para su uso en la condensación de monómeros de PNA para
formar un oligómero de PNA incluye, pero no se limita a,
hexafluorofosfato de
benzotriazolil-1-oxi-trispirrodinofosfonio
(PyBOP), hexafluorofosfato de
O-(7-'azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(HATU), hexafluorofosfato de
O-(7-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(HBTU), diciclohexilcarbodiimida
(DCC)/1-hidroxibenzotriazol (HOBt),
N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC),
hexafluorofosfato de bromo tris(pirrolidino) fosfonio
(ByBrop), y tetrafluorborato de O-[(ciano
(etoxicarbonil)metilen)amino}1,1,3,3-tetrametiluronio
(TOTU). Éstos y otros agentes activadores y condensadores son
conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo,
Uhlmann et al., supra.
Otras moléculas que pueden acoplarse de forma
covalente a un oligómero incluye, pero no se limita a,
intercalantes, grupos lipofílicos, ligandos de unión al surco
menor, ligandos de unión al surco mayor, grupos marcadores
(incluyendo marcadores fluorescentes, quimioluminescentes y
radioactivos), proteínas, enzimas, anticuerpos, agentes quelantes
y/o agentes de entrecruzamiento. Estas moléculas pueden enlazarse
internamente y/o a uno o ambos extremos del oligómero. La
naturaleza y unión de dichas moléculas a los oligonucleótidos son
bien conocidos en la técnica actual, y están descritos, por
ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nº 5.512.667 y 5.419.966 y
en la publicación PCT WO 96/32496, que se incorporan aquí mediante
referencia.
Los oligómeros de la invención pueden también
tener una porción de cola de peso molecular relativamente bajo
unida a uno o ambos extremos. A modo de ejemplo, una molécula de
cola puede ser un fosfato, un éster de fosfato, un grupo alquilo,
un grupo aminoalquilo, un grupo hidrofílico o un grupo lipofílico.
La porción de cola puede también unir un intercalante, grupo
lipofílico, ligando de unión al surco menor, grupo marcador, agente
quelante y/o funcionalidad de entrecruzamiento a los oligómeros de
la invención. La naturaleza de las porciones de cola y los métodos
para obtener oligonucleótidos con varias porciones de cola también
se describen en las Patentes Estadounidenses Nº 5.512.667 y
5.419.966, anteriormente mencionadas.
Las moléculas pueden unirse a un oligómero de la
invención para modificar su solubilidad en solventes acuosos.
Dichas moléculas incluyen, pero no se limitan a, sacáridos y
moléculas cargadas como aminoácidos, ligandos de unión al surco
menor cargados, y similares.
En una realización preferible, los oligómeros de
la invención que contienen PPG sustituido por guanina y/o PPA
sustituido por adenina también comprenden un ligando de unión al
surco menor conjugado (MGB). La discriminación de desemparejamiento
de nucleótido simple óptima se obtiene utilizando oligonucleótidos
conjugados a MGB que contiene PPG en lugar de guanina, como se
describe en la publicación compartida PCT WO 99/51775. Son
preferibles los MGB polares; las porciones MGB más preferibles
incluyen el trímero de
3-carbamoil-1,2-dihidro-(3H)-pirrolo[3,2-e]indol-7-carboxilato
(CDPI3) y el pentámero de
N-metilpirrol-4-carbox-2-amida
(MFC). Otras porciones MGB que podemos darle uso en la práctica de
la presente invención se describen en la Patente Estadounidense Nº
5.801.155 y la publicación compartida PCT WO 99/51621, cuyas
descripciones se incorporan aquí por referencia.
Los oligómeros pueden comprender análogos de
bases además de los análogos de purina descritos aquí como, por
ejemplo, pirimidinas modificadas y análogos de pirimidina.
Además, los oligómeros de la invención pueden
comprender esqueletos diferentes de los esqueletos de péptidos, o
pueden comprender esqueletos heterogéneos hechos de péptidos
mezclados y enlaces no peptídicos. Por ejemplo, pueden utilizarse
oligómeros con esqueletos basados en ésteres de metil glicina,
ornitina, prolina, diaminociclohexano y la fosforamidita de
2-aminopropanodiol. Uhlmann et al.,
supra. Además, pueden utilizarse los PNA en los que el
enlace peptídico está sustituido por un puente de ácido fosfónico,
como N-(2-aminoetil)fosfonoglicina y
N-(2-hidroxietil) fosfonoglicina. Peyman et
al. (1997) Angew. Chem. Intl. Ed Engl.
36:2809-2812; Efimov et al. (1998) Nucl.
Acids. Res. 26:566-577. Otros enlaces de oligómero
serán evidentes para los expertos en la materia.
Los oligómeros que contienen PNA son útiles para
la detección de ambas dianas de ácido nucleico de cadena única y de
cadena doble. Para la detección de los ácido nucleicos de cadena
doble, un oligómero se une al surco mayor de una diana de cadena
doble mediante un emparejamiento de bases de tipo Hoogsteen,
Hoogsteen reverso o emparejamiento de bases equivalente, como se
conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Fresco, Patente
Estadounidense Nº 5.422.251; Hogan, Patente Estadounidense Nº
5,176,996; y Lampe (1997) Nucleic acid Res.
25:4123-4131. La sustitución de purinas mediante
análogos de bases en un oligómero que contiene PNA, como se ha
descrito aquí, facilita la formación de triplex. Los
oligonucleótidos formadores de triplex opcionalmente contienen
grupos conjugados, como fluoróforos, bloqueadores de la
fluorescencia y cualquiera de las moléculas adicionales descritas
más arriba. En una realización preferible, un oligómero que contiene
PNA formador de triplex con una o más purinas sustituido por un
análogo de base comprende un ligando de unión al surco menor
conjugado. Véase más arriba para la descripción de ligandos de unión
al surco menor útiles en los oligómeros de la invención.
En una realización, un grupo marcador unido es
un marcaje fluorescente o un par fluoróforo/bloqueador de la
fluorescencia. En una realización preferible, la sustitución se uno
o más residuos de purina por análogos de bases de
pirazolopirimidina y/o pirrolopirimidina, en una sonda que contiene
un marcaje fluorescente, resulta en un bloqueo reducido del
marcaje. De acuerdo con esto, se proporcionan las sondas marcadas
con fluorescencia que comprenden uno o más análogos de purina,
opcionalmente que comprende un bloqueador de la fluorescencia.
Los marcajes fluorescentes incluyen, pero no se
limitan a, colorantes como fluoresceínas, rodaminas, naftilaminas,
coumarinas, xantenos, acridinas, benzoxadiazoles, estilbenos,
pirenos, cianinas, ficoeritrinas, proteínas verdes fluorescentes, y
similares. Otros marcajes fluorescentes, y métodos para su
conjugación a ácidos nucleicos y sondas de PNA, se conocen por los
expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Haugland (1996) Handbook
of Fluorescent probes and Research Chemicals, Sexta edición,
Molecular Probes, Inc., Eugene, o y publicación PCT WO 99/40226. En
general, los métodos para la unión de un marcaje fluorescente y/o un
bloqueador de la fluorescencia a un oligómero de PNA o una porción
de PNA de un oligómero quimérico son similares a los utilizados
para la conjugación de un fluoróforo y/o bloqueador de la
fluorescencia a un oligonucleótido de DNA. El fluoróforo o
bloqueador de la fluorescencia también está unido a una porción de
cola que comprende un grupo reactivo como, por ejemplo, -OH o
-NH_{2}; o está unido a una base, por ejemplo, en la posición 5 de
una pirimidina, la posición 7 de una purina, o la posición 3 de una
pirazolopirimidina o pirrolopirimidina.
En ciertas realizaciones de la presente
invención, se utilizan los oligómeros que comprenden ambos un
marcaje fluorescente (fluoróforo) y un bloqueador de la
fluorescencia. Un bloqueador de la fluorescencia también se refiere
como una porción bloqueadora de la fluorescencia de una sonda o
polímero. Los bloqueadores de la fluorescencia incluyen aquellas
moléculas cuyo espectro de absorción se solapa con el espectro de
emisión fluorescente de un fluoróforo particular, de forma que son
capaces de absorber la energía emitida por un fluoróforo para
reducir la cantidad de fluorescencia emitida (es decir, bloquear la
emisión del marcaje fluorescente). Los diferentes fluoróforos se
bloquean mediante diferentes agentes bloqueadores. En general, las
propiedades espectrales de una pareja en concreto de
fluoróforo/bloqueador de la fluorescencia son aquellos en que una o
más de las longitudes de onda de absorción del bloqueador de la
fluorescencia se solapa con una o más de las longitudes de onda de
emisión del fluoróforo.
Las parejas adecuadas de fluoróforo/bloqueador
de fluorescencia, cuya emisión por el fluoróforo se absorbe por el
extintor, son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Haugland,
supra. Ejemplos de parejas de bloqueador de
fluorescencia/fluoróforo que pueden utilizarse en la práctica de la
invención son los siguientes. Una pareja preferible de
fluoróforo/bloqueador de fluorescencia es la fluoresceína y la
tetrametilrodamina. El azul de nitrotiazol bloquea la emisión de
fluorescencia de seis tipos diferentes de colorantes, que son
6-FAM, dR110, dR6G, dTMR, dROX y JAZ. Lee et
al. (1999) Biotechniques 27:342-349. La
6-carboxitetrametilrodamina (TAMRA) bloquea la
emisión de la 6-carboxifluoresceína (FAM) y de la
6-carboxi-4,7,2',7'-fluoresceína
(TET). Lee et al. (1993) Nucl. Acid Res.
21:3671-3766. El ácido
6-(N-[7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il]amino)hexanoico
bloquea la fluorescencia del
7-dimetilaminocoumarin-4-acetato.
Bicket et al. (1994) Ann. NY. Acad. Sci. (Sep.
6)732:3 51-355. La
6-carboxi-X-rodamina
(ROX) y la eritromicina B bloquean la emisión de FAM. Li et
al. (1999) Bioconj. Chem. 10:241-245. El grupo
2,4-dinitrofenilo bloquea el ácido
(R,S)-2-amino-3-(7-metoxi-4-coumaril)propanoico.
Hawthorne et al. (1997) Anal. Chem.
253:13-17. Se utiliza dabcilo como bloqueador de
fluorescencia de sulfonamida de dansilo en quimiosensores y en
péptidos fluorogénicos como un bloqueador de fluorescencia para el
fluoróforo EDANS. Rothman et al. (1999) Bioorg. Med Chem.
Left. 22:509-512 y Matayoshi et al. (1990)
Science 247:954-958. QSY-7 es un
bloqueador de la fluorescencia de tetrametilrodamina. Haugland
supra. Pueden seleccionarse parejas adicionales de
fluoróforo/bloqueador de la fluorescencia por los expertos en la
materia si se compara las longitudes de onda de emisión y absorción
de acuerdo con las propiedades establecidas anteriormente.
Aunque cualquier marcaje fluorescente es útil en
la práctica de la invención, los fluoróforos preferibles presentan
una emisión máxima entre 400 y 800 nm. De forma similar, aunque
cualquier bloqueador de la fluorescencia es útil, los bloqueadores
preferibles de la fluorescencia poseen una absorción máxima entre
400 y 800 nm.
En otra realización, un oligómero comprende una
pareja de fluoróforos capaz de realizar transferencia de energía
por resonancia fluorescente (FRET). En este caso, se utilizan dos
fluoróforos en una serie de FRET. El primer fluoróforo (donante de
fluorescencia) presenta un espectro de emisión que se solapa con el
espectro de excitación del segundo fluoróforo (aceptor de
fluorescencia). De acuerdo con esto, la irradiación en las
longitudes de onda de excitación del donante de fluorescencia
resulta en una fluorescencia en la longitud de onda de emisión del
aceptor. Está claro que cualquier número de fluoróforos, que posee
un solapamiento adecuado de sus longitudes de onda de emisión y
excitación, puede formar una serie de FRET de tres, cuatro o más
fluoróforos.
En una realización, un fluoróforo es un
fluoróforo latente, tal como se describe en la Solicitud de Patente
Estadounidense compartida Nº 09/_,_, titulada "Hybridation
triggered fluorescent detection of nucleic acids" (Procurador de
expediente Nº 34469-20006.00), depositada el 26 de
octubre de 1999.
Cuando un oligómero se utiliza como una sonda o
cebador, la sustitución de los análogo de bases para purines reduce
la agregación del oligómero sustituido, con sigo mismo y con otras
moléculas de oligómeros. La reducción de la agregación se demuestra
mediante las sondas ricas en G como se describe en el Ejemplo 6,
infra. Como consecuencia, los métodos mejorados para la
detección de secuencias diana mediante hibridación, se obtienen al
utilizar oligómeros como sondas, utilizando los oligómeros descritos
aquí. Las secuencias diana pueden comprender DNA, RNA, o cualquier
oligonucleótido o polinucleótido.
La sustitución de purines mediante análogos de
bases en sondas marcadas con fluorescencia reduce el bloqueo del
marcaje que ocurre en las sondas no sustituidas. Véanse los Ejemplos
7 y 8, infra. En particular, los inventores han determinado
que la detección del producto de amplificación utilizando sondas que
contienen más de tres residuos G consecutivos adyacentes a un
marcaje fluorescente es ineficiente y, para las sondas que
contienen 5 o más residuos G consecutivos adyacentes a un marcaje
fluorescente, no se observa detección del producto. Los inventores
también han determinado que, cuando se sustituye la PPG por G, las
sondas fluorescentes que contienen hasta 9 residuos PPG
consecutivos adyacentes a un marcaje fluorescente proporcionan una
detección altamente eficiente de los productos de amplificación. De
acuerdo con esto, se obtienen métodos mejorados para detectar una
secuencia diana que utiliza sondas que comprenden una porción
polimérica (normalmente un oligómero, preferiblemente un oligómero
de PNA o una quimera PNA/DNA, más preferiblemente un oligómero de
DNA) y una porción fluorescente utilizando las composiciones
descritas aquí.
Así, los oligómeros de DNA, RNA, PNA y
quiméricos, que comprenden análogos de bases de pirazolopirimidina
y pirrolopirimidina como se ha descrito aquí, son útiles en las
técnicas que incluyen, pero no se limitan a, hibridación, extensión
del cebador, ensayos de sonda hidrolizable, métodos de amplificación
(por ejemplo, PCR, SSSR, NASBA), discriminación del
desemparejamiento de nucleótidos únicos, hibridación de
oligonucleótido específicos de alelo, análisis de la secuencia de
nucleótidos, hibridación a chips de oligonucleótidos, hibridación
in situ y técnicas relacionadas. Los oligómeros descritos
aquí pueden utilizarse como oligómeros inmovilizados en chips de
oligómeros como los descritos en, por ejemplo, las patentes
Estadounidenses Nº 5.492.806; 5.525.464; 5.556.752 y las
publicaciones PCT WO 92/10588 y WO 96/17957. La especificidad y
sensibilidad mejoradas probablemente resultan del aumento de la
solubilidad, disminución de la tendencia a la agregación, bloqueo
reducido de la fluorescencia por parte de los marcajes
fluorogénicos conjugados, y/o alguna combinación de estos y otros
factores.
El rendimiento mejorado de las sondas
sustituidas con PPG en un ensayo de sonda hidrolizable a tiempo real
se demuestra en el Ejemplo 9, infra.
En otra realización de la invención, se utiliza
un oligómero que contiene PNA con uno o más residuos de purina
sustituidos por un análogo de base como un fármaco, por ejemplo como
un reactivo anti-gen o antisentido, como componente
de una ribozima, o para la terapia génica. Los usos terapéuticos
incluye formación de bucles D in vivo o ex vivo.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar, pero no para limitar la invención.
El
2-amino-4-6-dicloropirimidina-5-carboxialdehído
(Compuesto 1) (10 g; 52 mmol) se trató con una solución de 10,1 g
(64,8 mmol) de clorhidrato de acetato de etilo
2-(hidrazinol)acético en 100 ml de agua. Se añadió
trietilamina (15 ml; 107 mmol) y la mezcla se calentó a 60ºC durante
10 min., después se agitó a temperatura ambiente durante 3 días.
Aunque el clorhidrato de acetato de etilo
2-(hidrazinol)acético no se disolvió completamente, la TLC
sobre SiO_{2} (CH_{2}Cl_{2}:CH_{3}OH 10:1) mostró la
formación de un nuevo producto. La mezcla se evaporó hasta secarse,
se recogió en tolueno (100 ml) y se evaporó hasta secarse. El sólido
se suspendió en alrededor de 300 ml de CH_{3}CN y se filtró a
través de una columna de SiO2 (49x6 cm), se lavó con 0,71 de
CH_{3}CN y alrededor de 300 ml de CHCl_{3}. El filtrado se
evaporó hasta secarse, se disolvió en 120 ml de CH_{3}OH caliente
y cristalizó durante la noche a 4ºC. El producto, un sólido incoloro
(3,2 g) se recogió y se secó. La TLC y la HPLC de fase reversa
indicó un compuesto puro y el análisis por RMN certificó la
estructura.
El compuesto 2 (3,16 g; 9,4 mmol) se disolvió en
100 ml de metanol caliente, después se añadió 100 ml de un solución
2N de NaOH, y la mezcla se sometió a reflujo durante 6 horas,
transcurrido el cual, el análisis por TLC indicó la hidrólisis del
éster. El producto 3 (PPGA) se formó por la adición de 2 ml de
H_{2}O_{2} al 30% (en porciones de 0,5 ml) a la mezcla de
reacción, seguido de un calentamiento hasta 80ºC, hasta que se
completó la generación de O_{2} por la degradación del exceso de
H_{2}O_{2}. El metanol se eliminó al calentar a
100-120ºC, seguido por un enfriamiento a temperatura
ambiente y la adición de 17 ml de HCl concentrado para proporcionar
un pH de alrededor de 4. La precipitación del producto se inició en
este momento, y se facilitó mediante la adición de hielo. El
producto se filtró, se lavó con agua fría y se secó sobre NaOH y
P_{2}O_{5} (rendimiento 3,9 g). La RMN confirmó la estructura e
indicó la presencia de alrededor de 4-8 moléculas de
H_{2}O por molécula de producto.
\vskip1.000000\baselineskip
El PPGA (Compuesto 3, 5,58 g; 20 mmol) se
suspendió en DMF anhidro (40 ml) y trietilamina (4,29 ml; 30,8
mmol). Se añadió por goteo con una jeringa cloruro de isobutanoilo
(2,12 g; 19,9 mmol). La mezcla se agitó a 100ºC durante 3 horas,
después se trató con metanol y se evaporó hasta secarse. El residuo
se trató con 20 ml de HCl 1N y después con metanol y se evaporó
hasta secarse. El residuo se trató con isopropanol caliente y el
producto precipitado se eliminó por filtración y se secó al vacío.
El producto (14) se analizó mediante TLC y HPLC y, si fue
necesario, se purificó mediante cromatografía.
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto 15 (PPG, 3,02 g; 20 mmol) se
resuspendió en DMF anhidro (40 ml) y trietilamina (1,45 ml, 10,4
mmol), y se añadió cloruro de isobutanoilo (2,12 g, 19,9 mmol) gota
a gota utilizando una jeringa. La mezcla se agitó a 100ºC durante 3
horas. La mezcla de reacción se trató luego con metanol y se evaporó
hasta la sequedad. El residuo se trató con metanol y se evaporó
hasta la sequedad. El residuo se trató luego con isopropanol
caliente y el producto precipitado (16) se eliminó por filtración y
se secó al vacío. El producto se analizó mediante TLC y HPLC y, en
caso de ser necesario, se purificó posteriormente mediante
cromatografía.
El compuesto 16 (4,42 g; 20 mmol) se resuspendió
en DMF seco (40 ml), se añadió hidruro sódico (0,5 g; 20,8 mmol) en
porciones, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 60
min. Luego se añadió bromoacetato de metilo (1,9 ml; 20,6 mmol) a
temperatura ambiente, mediante una jeringa, y se continuó la
agitación a temperatura ambiente. Tras completarse la reacción
(monitorizada mediante TLC), la mezcla de reacción se trató con una
pequeña cantidad de dióxido de carbono en metanol. Luego se evaporó
el solvente y el residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2}, se lavó
una vez con agua y luego se evaporó hasta la sequedad. El producto
se purificó mediante cromatografía para proporcionar el isómero
deseado (17).
El compuesto 17 (4,41 g; 15 mmol) se resuspendió
en 25 ml de agua, y se añadió gota a gota una solución acuosa 2N de
hidróxido sódico a 0ºC, mientras se mantiene el pH a 11, hasta que
el éster de metilo está completamente hidrolizado. Luego se filtró
la solución de reacción, y el filtrado se llevó hasta pH 3
utilizando una solución de KHSO_{4} 2M, después se extrajo con
acetato de etilo. La fase acuosa se evaporó y el producto (18) se
purificó mediante cromatografía.
El
2-[(2-{[(4-metoxifenil)difenilmetil]amino}etil)amino]acetato
de metilo (MMTrAeg, 1,26 g; 3,1 mmol) se disolvió en DMF (8 ml). A
esta solución se añadieron N-etilmorfolina (1,07 g;
6,28 mmol),
3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihiro-1,2,3-benzotrazina
(HOObt) (0,505 g; 3,1 mmol), el compuesto 18 (0,91 g; 3,1 mmol) y
diisopropilcarbodiimida (DIPC) (0,59 g; 3,72 mmol). La mezcla de
reacción se agitó durante 48 horas a 4ºC, en cuyo momento el
solvente se evaporó y el residuo se disolvió en acetato de etilo.
La solución de acetato de etilo se lavó con agua y se lavó una vez
más con una solución saturada de KCl. Luego se secó la fase orgánica
sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se evaporó. El residuo se
disolvió en un pequeño volumen de acetato de etilo y se enfrió sobre
hielo para inducir la cristalización de diisopropilurea, dejando el
producto 19 en la fase acuosa. Alternativamente, la diisopropilurea
se separó del compuesto 19 mediante cromatografía en gel de
sílice.
El compuesto 19 (1,33 g; 2 mmol) se disolvió en
10 ml de dioxano. Esta solución se enfrió hasta 0ºC y se añadió
gota a gota NaOH acuoso 1 M (8,66 ml) en 5 alícuotas a lo largo de
2,5 horas. Tras 2 horas adicionales a temperatura ambiente la
solución se ajustó a pH 5 mediante la adición gota a gota de
KHSO_{4} 2M. Las sales precipitadas se eliminaron por filtración
y se lavaron con dioxano, y los filtrados combinados se evaporaron.
El residuo se co-evaporó con etanol y
metanol/CH_{2}Cl_{2}, luego se purificó mediante cromatografía
en gel de sílice para proporcionar a (20).
\vskip1.000000\baselineskip
La
pirazolo[5,4-d]pirimidin-4-ilamina
(8) (13,5 g; 0,10 mol) se resuspendió en piridina seca (250 ml), y
se añadió cloruro de 4-metoxibenzolilo (17,1 g; 0,1
mol) gota a gota utilizando una jeringa. La mezcla se calentó hasta
100ºC hasta que la TLC mostró que la reacción se había completado
(entre 1 y 3 horas). La reacción enfriada se trató luego con
metanol y el solvente se evaporó. El residuo se
co-evaporó dos veces con tolueno y luego se agitó
con isopropanol caliente. Esta mezcla se enfrió lentamente y el
producto precipitado (9) se separó por filtración y se evaluó su
pureza mediante TLC y HPLC. En caso de ser necesario, el producto se
purificó posteriormente mediante cromatografía.
El compuesto (9) (6.7 g; 25 mmol) se resuspendió
en 75 ml de DMF seco. Se añadió hidruro sódico (0,65 g; 27 mmol) en
porciones, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30
min. Se añadió bromoacetato de metilo (2,44 ml; 26,5 mmol) a
temperatura ambiente utilizando una jeringa. La agitación se mantuvo
a temperatura ambiente hasta que el análisis mediante TLC indicó
que la reacción se había completado, en cuyo momento se trató la
mezcla de reacción con una pequeña cantidad de dióxido de carbono en
metanol. El solvente se evaporó y el residuo se disolvió en
CH_{2}Cl_{2}, se lavó una vez con agua y luego se evaporó hasta
la sequedad. El producto se purificó mediante cromatografía para
proporcionar el isómero deseado (10).
El compuesto (10) (5,13 g; 15 mmol) se
resuspendió en 120 ml de agua, y se añadió gota a gota una solución
acuosa de hidróxido sódico 2N a 0ºC para mantener el pH a 11, hasta
que el éster de metilo se hidrolizó completamente. La solución de
reacción se filtró y el pH del filtrado se llevó hasta 3, utilizando
una solución de KHSO_{4} 2M, lo que llevó a la precipitación del
producto (11). El precipitado se lavó con una pequeña cantidad de
agua, se secó al vacío, y se analizó su pureza. En caso de ser
necesario, el producto (11) se purificó posteriormente mediante
cromatografía.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió
2-(2-{[(4-metoxifenil)difenilmetil]-amino}etil)amino]acetato
de metilo (MMTrAeg, 1,26 g; 3,1 mmol) en DMF (8 ml). A esta
solución se añadieron N-etilmorfolina (1,07 g; 6,28
mmol),
3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihiro-1,2,3-benzotrazina
(HOObt) (0,505 g; 3,1 mmol), compuesto 11 (1,01 g; 3,1 mmol) y
diisopropilcarbodiimida (DIPC) (0,59 g; 3,72 mmol). La mezcla de
reacción se agitó durante 48 horas a 4ºC, luego se eliminó el
solvente al vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo.
Esta solución se lavó con agua y se lavó una vez más con una
solución de KCl saturado. La fase orgánica se secó sobre
Na_{2}SO_{4}, se filtró y se evaporó. El residuo se disolvió en
un pequeño volumen de acetato de etilo y se enfrió en hielo hasta
inducir la cristalización de la diisopropilurea, dejando el
producto (12) en solución. Alternativamente, la diisopropilurea se
separó de (12) mediante una cromatografía en gel de sílice.
El compuesto (12) (1,43 g; 2 mmol) se disolvió
en dioxano (10 ml). La solución se enfrió hasta 0ºC, y se añadió
gota a gota NaOH acuoso 1M (8,66 ml) en 5 alícuotas a lo largo de
2,5 horas. Tras 2 horas adicionales a temperatura ambiente, el pH
se ajustó a 5 mediante la adición gota a gota de HKSO_{4} 2M. Las
sales precipitadas se eliminaron por filtraron, se lavaron con
dioxano, luego los filtrados combinados se secaron al vacío. El
residuo (13) se co-evaporó con etanol y
metanol/CH_{2}Cl_{2}, luego se purificó mediante cromatografía
en gel de sílice.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, oligonucleótidos conjugados
13-meros y 14-meros, que contienen
entre dos y nueve residuos de G, se analizaron mediante
electroforesis en gel no desnaturalizante y se compararon con
oligonucleótidos de secuencia idéntica, con la excepción de que
todos los residuos de G se reemplazaron por PPG. Las longitudes y
secuencias de los oligonucleótidos se proporcionan en la Tabla 1. La
electroforesis se realizó en geles de poliacrilamida al 8% que se
corrieron en tampón TBE 1X durante 45 min. a 40ºC. Los geles se
tiñeron con Daiichi 2D Silver Stain II® y los valores de R_{f} de
las bandas de oligonucleótidos teñidas se determinaron utilizando
dos oligonucleótidos control como estándares. El oligonucleótido
control A posee la secuencia
5'-ACCTGTATTCCTTGCC-3' (Id. de Sec.
Nº 22) y el oligonucleótido control B posee la secuencia
5'-ZTACAZCAAATZZAA-3' (Id. de Sec.
Nº 23), en la que Z representa PPG.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados del análisis se muestran en la
Tabla 2. Los valores R_{f} se midieron separadamente para los
oligonucleótidos que contenían G y PPG respecto de los
oligonucleótidos control A y B, respectivamente. Sin embargo, la
distancia a la que migraron los oligonucleótidos control A y B fue
esencialmente idéntica. Los oligonucleótidos que contienen tres o
más residuos G (oligonucleótidos 1-6) muestran una
reducción en un Rf comparado con oligonucleótidos de tamaño similar
que contienen dos residuos G o menos (por ejemplo, los
oligonucleótidos 7 y 8 y el oligonucleótido control A), lo que
indica la agregación de los oligonucleótidos ricos en G. Por el
contrario, los oligonucleótidos que contienen entre dos y nueve
residuos PPG poseen Rf que son similares entre ellos y a los de un
oligonucleótido control que contiene dos residuos PPG. También se
observó que los oligonucleótidos que contienen G mostraron bandas
difusas tras la electroforesis (los valores Rf de estos
oligonucleótidos se determinaron midiendo desde el centro de la
banda). Además, la comparación de un oligonucleótido que contiene G
con un oligonucleótido del mismo tamaño y secuencia, pero con G
sustituida por PPG, muestra que la reducción del Rf característica
de los oligonucleótidos que contienen tres o más residuos G no se
observa con oligonucleótidos que contienen PPG, lo que sugiere una
agregación baja o inexistente de los oligonucleótidos que contienen
hasta nueve residuos de PPG consecutivos.
\vskip1.000000\baselineskip
La fluoresceína se acopló a GMP y a PPGMP (es
decir, los derivados monofosfato de G y PPG) y se determinó la
fluorescencia de soluciones 200 nM de estos conjugados. La
excitación se realizó a 494 nm y la emisión de fluorescencia se
midió a 522 nm. La emisión de fluorescencia del conjugado GMP fue de
15.447 unidades; mientras que la emisión de fluorescencia del
conjugado PPGMP fue de 32.767 unidades. Así, el bloqueo del
fluoróforo por la guanina se reduce cuando se sustituye la guanina
por PPG, lo que conduce a un aumento del rendimiento de la
fluorescencia del conjugado PPGMP a casi el doble comparado con el
conjugado G.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó el efecto en los conjugados
fluoresceína-oligonucleótido, en rendimiento de
fluorescencia, de sustituir G con PPG. La porción oligonucleótido
de los conjugados contenía una G o un residuo PPG
5'-terminal, al cual se acopló una molécula de
fluoresceína. Los conjugados opcionalmente contenían una molécula de
CDPI_{3} acoplada covalentemente a su extremo 3'. Las secuencias
se proporcionan en la Tabla 3. Se midió la fluorescencia de una
solución 200 nM de los conjugados, en Tris-HCl 20
mM, pH 7, NaCl 40 mM, MgCl_{2} 5 mM, a temperatura ambiente, con
una excitación a 494 nm y la emisión se detectó a 522 nm. Los
resultados se proporcionan en la
Tabla 3.
Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados indicaron que la sustitución de G
con PPG aumentan la fluorescencia (es decir, reducen el bloqueo) en
un 24% y 38% en los oligonucleótidos conjugados MGB y conjugado no
MGB, respectivamente.
\newpage
Los oligonucleótidos conjugados cuyas secuencias
se muestran en la Tabla 1 se utilizaron como sondas fluorescentes
en un ensayo de sonda hidrolizable. Patente Estadounidense Nº
5.210.015; Livak et al. (1995) PCR Meth. App.
4:357-362; Wittwer et al. (1997a)
Biotechniques 22:130-138; y Wittwer et al.
(1997b) Biotechniques 22:176-181. El funcionamiento
de las sondas que contienen G se comparó con el de las sondas que
contienen PPG. Las sondas contenían un fluoróforo conjugado en su
extremo 5', junto con un bloqueador de la fluorescencia y un ligando
de unión al surco menor conjugado con el extremo 3' de la sonda,
como se describe en la publicación PCT compartida WO 99/51775. La
secuencia diana era
5'-CACCTCAGCCTCCCAAGTAACTTTTAACCCCCCCCCATTTGTTGTGCTG
TTTTCATACCTGTAATCCTGGCACTTT-3' (Id. de Sec. Nº 17). Las porciones subrayadas de la secuencia diana corresponden a las secuencias cebador.
TTTTCATACCTGTAATCCTGGCACTTT-3' (Id. de Sec. Nº 17). Las porciones subrayadas de la secuencia diana corresponden a las secuencias cebador.
La amplificación se realizó en un
LC-24 LightCycler® de Idaho Technologies con
monitorización a tiempo real de la fluorescencia. Las reacciones de
amplificación contenían 10^{5} copias/\mul del
76-mero diana (como la anterior), 100 nM de cada
cebador, 10 nM de sonda fluorescente (como la anterior),
Tris-HCl 20 mM, pH 7, NaCl 40 mM, MgCl_{2} 5 mM,
albúmina sérica bovina al 0,05%, 0,5 mM de cada dNTP, 0,038
Unidades/\mul de Taq polimerasa y 0,01 Unidades/\mul de
uracil-N-glucosilasa. El programa de
termociclado fue un ciclo a 50ºC durante 3 min., luego 95ºC durante
2 min., seguido de 50 ciclos a 95ºC durante 2 s., luego 60ºC durante
30 s.
Los resultados se muestran en la Figura 1. En
este método, la producción de producto de amplificación viene
indicada por un aumento de la fluorescencia con el tiempo, causada
por la hidrólisis de la sonda hibridada con el producto de
amplificación. Los resultados obtenidos aquí muestran que la
detección de los productos de amplificación utilizando sondas que
contienen más de tres residuos de G consecutivos fue ineficiente y,
de hecho, para sondas que contienen 5 o más residuos de G
consecutivos, no se observó detección del producto. Por el
contrario, cuando se sustituyó G con PPG en la sonda fluorescente,
las sondas que contienen hasta 9 residuos de PPG consecutivos
proporcionaron una detección altamente eficiente a tiempo real del
producto de amplificación. Las descripciones y ejemplos precedentes
no pretenden ser limitantes del alcance de la invención.
<110> Gall, Alexander Kutyavin, Igor
Vermeulen, Nicholaas Dempcy, Robert
\vskip0.400000\baselineskip
<120> OLIGÓMEROS NO AGREGANTES Y SIN
BLOQUEO DE LA FLUORESCENCIA QUE COMPRENDEN ANÁLOGOS DE NUCLEÓTIDOS;
MÉTODOS DE SÍNTESIS Y USO DE LOS MISMOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 344692000700
\vskip0.400000\baselineskip
<140> SIN ASIGNAR
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-11-22
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaatggggg gggg
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaaatgggg gggg
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacaaatggg gggg
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacaaatgg gggg
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaacaaatg gggg
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacaacaaat gggg
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacaacaaat ggg
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcacaacaa atgg
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = PPG
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaatnnnnn nnnn
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = PPG
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaaatnnnn nnnn
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = PPG
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacaaatnnn nnnn
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = PPG
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacaaatnn nnnn
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = PPG
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaacaaatn nnnn
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = PPG
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacaacaaat nnnn
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = PPG
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacaacaaat nnn
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = PPG
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcacaacaa atnn
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcctgattt tac
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = PPG
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipntcctgattt tac
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcctgattt tac
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = PPG
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipntcctgattt tac
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacctgtattc cttgcc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = PPG
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = PPG
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = PPG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipntacancaaa tnnaa
\hfill15
Claims (15)
1. Un conjugado que comprende:
(a) un polímero que comprende una serie de
unidades de monómero; y
(b) un fluoróforo unido covalentemente a
ellos,
en el que uno o más de las unidades de monómero
comprende un análogo de base, en el que el análogo de base se
selecciona de entre el grupo que consiste de pirazolopirimidinas,
como el análogo de bases retiene la especificidad de emparejamiento
de bases de las bases para las que se sustituyen, y conduce a una
reducción en el bloqueo de la fluorescencia del fluoróforo y/o
auto-asociación del polímero reducida.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El conjugado de la reivindicación 1, en el
que el análogo de base posee la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en el que R_{1} y R_{2} son
independientemente -H, -OH, -SH, o -NH_{2}; R_{3} es -H, -CN,
halógeno (F, Cl, Br o I), o -R_{12}-Y, en el que
R_{12} es C_{1}-C_{12} alquilo, alquenilo o
alquinilo y Y es -H, -OH, -NH_{2} o -SH; y X es
N.
\vskip1.000000\baselineskip
3. El conjugado de la reivindicación 1, que
comprende además un bloqueador de la fluorescencia.
4. El conjugado de la reivindicación 1, en el
que el polímero comprende DNA.
5. El conjugado de la reivindicación 1, en el
que el polímero comprende un péptido de ácido nucleico (PNA) o una
quimera PNA/DNA.
6. El conjugado de la reivindicación 4 o 5, en
el que el análogo de base está presente independientemente en la
porción de DNA o PNA del polímero.
7. El conjugado de cualquiera de las
reivindicaciones 2-6, en el que el análogo de base
se selecciona de entre el grupo que consiste en
pirazolopirimidiniladenina (PPA), pirazolopirimidinilguanina (PPG) y
pirazolopirimidinilhipoxantina (PPI).
8. El conjugado de cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, que posee al menos cuatro
residuos consecutivos de purina en el polímero, en el que al menos
uno de los cuatro residuos consecutivos de purina en el polímero
esté sustituido por un análogo de base.
9. El conjugado de la reivindicación 8, en el
que el polímero contiene tres o más guaninas consecutivas que están
sustituidas por PPG.
10. El conjugado de la reivindicación 3, en el
que el fluoróforo emite entre 400 y 800 nm y en el que el bloqueador
de la fluorescencia absorbe entre 400 y 800 nm.
11. El conjugado de cualquiera de las
reivindicaciones 1-10, que comprende además un
ligando de unión al surco menor.
12. El uso del conjugado de cualquiera de las
reivindicaciones 1-11 como sonda para detectar una
secuencia diana en una reacción de amplificación (ensayo de sonda
hidrolizable).
13. Un microchip de oligómeros, que comprende
uno o más oligómeros de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-11.
\newpage
14. El uso del oligómero de cualquiera de las
reivindicaciones 1-11 como una sonda para detectar
una secuencia diana en un polinucleótido mediante hibridación.
15. El uso de la reivindicación 12 o 14, en el
que la secuencia diana se distingue de una secuencia relacionada
que tiene un desemparejamiento de nucleótido sencillo con respecto a
la secuencia diana.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/447,936 US6660845B1 (en) | 1999-11-23 | 1999-11-23 | Non-aggregating, non-quenching oligomers comprising nucleotide analogues; methods of synthesis and use thereof |
| US447936 | 1999-11-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2344337T3 true ES2344337T3 (es) | 2010-08-25 |
Family
ID=23778351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00980769T Expired - Lifetime ES2344337T3 (es) | 1999-11-23 | 2000-11-21 | Oligomeros no agregantes y sin bloqueo de la fluorescencia que comprenden analogos de nucleotidos; metodos de sintesis y uso de los mismos. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6660845B1 (es) |
| EP (1) | EP1232157B1 (es) |
| JP (1) | JP2003527579A (es) |
| AT (1) | ATE466864T1 (es) |
| AU (1) | AU1798901A (es) |
| CA (1) | CA2392033C (es) |
| DE (1) | DE60044367D1 (es) |
| ES (1) | ES2344337T3 (es) |
| WO (1) | WO2001038584A2 (es) |
Families Citing this family (95)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2407731A1 (en) * | 2000-05-02 | 2001-11-08 | Centre National De La Recherche Scientifique | Identification of genetic markers |
| US7671036B2 (en) * | 2000-06-23 | 2010-03-02 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Positively-charged peptide nucleic acid analogs with improved properties |
| US7354707B2 (en) * | 2000-06-27 | 2008-04-08 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Nucleic acid probes, method for determining concentrations of nucleic acid by using the probes, and method for analyzing data obtained by the method |
| US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| US20030082547A1 (en) | 2001-08-27 | 2003-05-01 | Ewing Gregory J. | Non-fluorescent quencher compounds and biomolecular assays |
| US8569516B2 (en) * | 2001-09-07 | 2013-10-29 | Elitech Holding B.V. | Compounds and methods for fluorescent labeling |
| US6972339B2 (en) | 2001-09-07 | 2005-12-06 | Epoch Biosciences, Inc. | Compounds and methods for fluorescent labeling |
| EP2336133A1 (en) | 2001-10-30 | 2011-06-22 | Conforma Therapeutics Corporation | Purine analogs having HSP90-inhibiting activity |
| WO2003040395A2 (en) | 2001-11-07 | 2003-05-15 | Applera Corporation | Universal nucleotides for nucleic acid analysis |
| EP1448800A4 (en) | 2001-11-21 | 2007-05-16 | Applera Corp | DIGITAL ASSAY |
| US20040063109A2 (en) | 2002-01-25 | 2004-04-01 | Applera Corporation | Single-tube, ready-to-use assay kits, and methods using same |
| US6818420B2 (en) | 2002-02-27 | 2004-11-16 | Biosource International, Inc. | Methods of using FET labeled oligonucleotides that include a 3′-5′ exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same |
| CA2472554A1 (en) * | 2002-02-27 | 2003-09-04 | Biosource International Inc. | Methods of using fet labeled oligonucleotides that include a 3' 5' exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same |
| ATE398455T1 (de) | 2003-01-14 | 2008-07-15 | Gilead Sciences Inc | Zusammensetzungen und verfahren zur antiviralen kombinationstherapie |
| US7429596B2 (en) * | 2003-06-20 | 2008-09-30 | The Regents Of The University Of California | 1H-pyrrolo [2,3-D] pyrimidine derivatives and methods of use thereof |
| AU2004260789B2 (en) | 2003-07-30 | 2011-06-30 | Gilead Sciences, Inc. | Nucleobase phosphonate analogs for antiviral treatment |
| BRPI0414533A (pt) * | 2003-09-18 | 2006-11-07 | Conforma Therapeutics Corp | composto, composição farmacêutica, e, métodos para inibir um hsp90 e para tratar um indivìduo tendo um distúrbio mediado por hsp90 |
| US7541454B2 (en) * | 2003-10-24 | 2009-06-02 | Epoch Biosciences, Inc. | Compounds and methods for fluorescent labeling |
| AU2004286352A1 (en) * | 2003-10-28 | 2005-05-12 | Epoch Biosciences, Inc. | Fluorescent probes for DNA detection by hybridization with improved sensitivity and low background |
| US7504495B2 (en) | 2003-11-20 | 2009-03-17 | Exiqon A/S | Quencher compositions comprising anthraquinone moieties |
| EP1697534B1 (en) | 2003-12-01 | 2010-06-02 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same |
| US9512125B2 (en) | 2004-11-19 | 2016-12-06 | The Regents Of The University Of California | Substituted pyrazolo[3.4-D] pyrimidines as anti-inflammatory agents |
| EP2813581B1 (en) | 2005-01-06 | 2018-06-27 | Applied Biosystems, LLC | Use of polypeptides having nucleic acid binding activity in methods for fast nucleic acid amplification |
| US20060153745A1 (en) * | 2005-01-11 | 2006-07-13 | Applera Corporation | Fluid processing device for oligonucleotide synthesis and analysis |
| US20070059713A1 (en) | 2005-09-09 | 2007-03-15 | Lee Jun E | SSB-DNA polymerase fusion proteins |
| JP5438320B2 (ja) | 2005-10-03 | 2014-03-12 | アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー | 核酸を増幅するための組成物、方法およびキット |
| EP1994182B1 (en) | 2006-03-15 | 2019-05-29 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Degenerate nucleobase analogs |
| DK2004654T3 (da) * | 2006-04-04 | 2013-07-22 | Univ California | Pyrazolopyrimidin derivater til anvendelse som kinase antagonister |
| US7842672B2 (en) | 2006-07-07 | 2010-11-30 | Gilead Sciences, Inc. | Phosphonate inhibitors of HCV |
| EP2484781B1 (en) | 2006-08-01 | 2017-08-23 | Applied Biosystems, LLC | Detection of analytes and nucleic acids |
| US9938641B2 (en) | 2006-12-18 | 2018-04-10 | Fluidigm Corporation | Selection of aptamers based on geometry |
| WO2009046448A1 (en) | 2007-10-04 | 2009-04-09 | Intellikine, Inc. | Chemical entities and therapeutic uses thereof |
| WO2009067628A1 (en) | 2007-11-20 | 2009-05-28 | Applied Biosystems Inc. | Reversible di-nucleotide terminator sequencing |
| US8703777B2 (en) | 2008-01-04 | 2014-04-22 | Intellikine Llc | Certain chemical entities, compositions and methods |
| US8193182B2 (en) | 2008-01-04 | 2012-06-05 | Intellikine, Inc. | Substituted isoquinolin-1(2H)-ones, and methods of use thereof |
| JP5547099B2 (ja) | 2008-03-14 | 2014-07-09 | インテリカイン， エルエルシー | キナーゼ阻害剤および使用方法 |
| WO2009114874A2 (en) | 2008-03-14 | 2009-09-17 | Intellikine, Inc. | Benzothiazole kinase inhibitors and methods of use |
| US20110224223A1 (en) | 2008-07-08 | 2011-09-15 | The Regents Of The University Of California, A California Corporation | MTOR Modulators and Uses Thereof |
| AU2009268611B2 (en) | 2008-07-08 | 2015-04-09 | Intellikine, Llc | Kinase inhibitors and methods of use |
| CA2735735C (en) | 2008-09-02 | 2016-11-22 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Nanostructured microelectrodes and biosensing devices incorporating the same |
| WO2010030716A1 (en) * | 2008-09-10 | 2010-03-18 | Igor Kutyavin | Detection of nucleic acids by oligonucleotide probes cleaved in presence of endonuclease v |
| JP5731978B2 (ja) | 2008-09-26 | 2015-06-10 | インテリカイン， エルエルシー | 複素環キナーゼ阻害剤 |
| ES2570429T3 (es) | 2008-10-16 | 2016-05-18 | Univ California | Inhibidores de heteroaril quinasa de anillo condensado |
| US8476282B2 (en) | 2008-11-03 | 2013-07-02 | Intellikine Llc | Benzoxazole kinase inhibitors and methods of use |
| US8343961B2 (en) | 2009-03-31 | 2013-01-01 | Arqule, Inc. | Substituted heterocyclic compounds |
| JP5789252B2 (ja) | 2009-05-07 | 2015-10-07 | インテリカイン， エルエルシー | 複素環式化合物およびその使用 |
| EP3597657B1 (en) | 2009-05-21 | 2021-09-01 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Universal tags with non-natural nucleobases |
| US8980899B2 (en) | 2009-10-16 | 2015-03-17 | The Regents Of The University Of California | Methods of inhibiting Ire1 |
| WO2011087707A1 (en) | 2009-12-22 | 2011-07-21 | Elitech Holding B.V. | Hypertheromostable endonuclease iv substrate probe |
| AU2011255218B2 (en) | 2010-05-21 | 2015-03-12 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Chemical compounds, compositions and methods for kinase modulation |
| US8692001B2 (en) | 2010-10-27 | 2014-04-08 | Dynamix Pharmaceuticals Ltd. | Sulfonamides for the modulation of PKM2 |
| EP2637669A4 (en) | 2010-11-10 | 2014-04-02 | Infinity Pharmaceuticals Inc | Heterocyclic compounds and their use |
| JP2014501790A (ja) | 2011-01-10 | 2014-01-23 | インフィニティー ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | イソキノリノンの調製方法及びイソキノリノンの固体形態 |
| JP5989668B2 (ja) | 2011-01-11 | 2016-09-07 | ザ ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロント | タンパク質検出方法 |
| EP3369828B1 (en) * | 2011-02-07 | 2020-07-15 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Bioprobes and methods of use thereof |
| US9295673B2 (en) | 2011-02-23 | 2016-03-29 | Intellikine Llc | Combination of mTOR inhibitors and P13-kinase inhibitors, and uses thereof |
| EP2683822B1 (en) | 2011-03-10 | 2020-04-22 | General Atomics | Diagnostic and sample preparation devices and methods |
| EP2734520B1 (en) | 2011-07-19 | 2016-09-14 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Heterocyclic compounds and uses thereof |
| AR088218A1 (es) | 2011-07-19 | 2014-05-21 | Infinity Pharmaceuticals Inc | Compuestos heterociclicos utiles como inhibidores de pi3k |
| EP2548878A1 (en) * | 2011-07-21 | 2013-01-23 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Pyrazolo[3,4-d]pyrimidine compounds, their preparation and use as sigma ligands |
| RU2014111823A (ru) | 2011-08-29 | 2015-10-10 | Инфинити Фармасьютикалз, Инк. | Гетероциклические соединения и их применения |
| JP6342805B2 (ja) | 2011-09-02 | 2018-06-13 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンおよびその用途 |
| US8940742B2 (en) | 2012-04-10 | 2015-01-27 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Heterocyclic compounds and uses thereof |
| US8828998B2 (en) | 2012-06-25 | 2014-09-09 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of lupus, fibrotic conditions, and inflammatory myopathies and other disorders using PI3 kinase inhibitors |
| EP2875131B1 (en) | 2012-07-18 | 2018-03-14 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | A method of normalizing biological samples |
| EP2885424B1 (en) * | 2012-08-17 | 2016-10-05 | The United States of America, as Represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Cyclopentane-peptide nucleic acids for qualitative and quantitative detection of nucleic acids |
| RU2015115631A (ru) | 2012-09-26 | 2016-11-20 | Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния | Модулирование ire1 |
| US10975423B2 (en) | 2013-03-11 | 2021-04-13 | Elitechgroup, Inc. | Methods for true isothermal strand displacement amplification |
| US10590474B2 (en) | 2013-03-11 | 2020-03-17 | Elitechgroup B.V. | Methods for true isothermal strand displacement amplification |
| WO2014164479A1 (en) | 2013-03-11 | 2014-10-09 | Elitech Holding B.V. | Methods for true isothermal strand displacement amplification |
| US9169256B2 (en) | 2013-03-13 | 2015-10-27 | Elitechgroup B.V. | Artificial nucleic acids |
| JP2016515216A (ja) | 2013-03-14 | 2016-05-26 | シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド | メッセンジャーｒｎａのキャップ効率の定量的評価 |
| JP2016514970A (ja) | 2013-03-14 | 2016-05-26 | シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド | メッセンジャーｒｎａのキャップ効率の定量的評価 |
| US9481667B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-11-01 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Salts and solid forms of isoquinolinones and composition comprising and methods of using the same |
| US9751888B2 (en) | 2013-10-04 | 2017-09-05 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Heterocyclic compounds and uses thereof |
| PL3052485T3 (pl) | 2013-10-04 | 2022-02-28 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Związki heterocykliczne i ich zastosowania |
| SG11201607705XA (en) | 2014-03-19 | 2016-10-28 | Infinity Pharmaceuticals Inc | Heterocyclic compounds for use in the treatment of pi3k-gamma mediated disorders |
| US20150320755A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-11-12 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Combination therapies |
| US9708348B2 (en) | 2014-10-03 | 2017-07-18 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Trisubstituted bicyclic heterocyclic compounds with kinase activities and uses thereof |
| WO2016053883A1 (en) | 2014-10-03 | 2016-04-07 | Life Technologies Corporation | Detection, identification, validation and enrichment of target nucleic acids |
| WO2016090165A1 (en) | 2014-12-03 | 2016-06-09 | Life Technologies Corporation | Charged reactive oligomers |
| WO2016115001A2 (en) | 2015-01-12 | 2016-07-21 | Life Technologies Corporation | Methods, systems and compositions thereof for nucleic acid library quality control and quantification |
| US10160761B2 (en) | 2015-09-14 | 2018-12-25 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Solid forms of isoquinolinones, and process of making, composition comprising, and methods of using the same |
| EP3368692B1 (en) | 2015-10-29 | 2021-07-21 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Modification of 3' terminal ends of nucleic acids by dna polymerase theta |
| TWI747873B (zh) * | 2016-02-01 | 2021-12-01 | 美商百歐克斯製藥公司 | 苯并吡唑化合物及其類似物 |
| WO2017161116A1 (en) | 2016-03-17 | 2017-09-21 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Isotopologues of isoquinolinone and quinazolinone compounds and uses thereof as pi3k kinase inhibitors |
| US10919914B2 (en) | 2016-06-08 | 2021-02-16 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Heterocyclic compounds and uses thereof |
| SG10201912456RA (en) | 2016-06-24 | 2020-02-27 | Infinity Pharmaceuticals Inc | Combination therapies |
| US10738346B2 (en) | 2017-03-09 | 2020-08-11 | Elitechgroup, Inc. | Nitrodiarylethenes as fluorescence quenchers for nucleic acid probes |
| WO2019036225A1 (en) | 2017-08-17 | 2019-02-21 | Elitechgroup, Inc. | FLUORESCENCE EXTINGUISHERS STABILIZING DUPLEX FOR NUCLEIC PROBES |
| WO2019231617A1 (en) | 2018-05-29 | 2019-12-05 | Elitechgroup, Inc. | Carborhodamine compounds and methods of preparation thereof |
| WO2021080629A1 (en) | 2019-10-23 | 2021-04-29 | Elitechgroup, Inc. | Methods for true isothermal strand displacement amplification |
| JP2024520636A (ja) | 2021-06-04 | 2024-05-24 | トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド | ｍＲＮＡキャッピング効率の定量的評価のためのアッセイ |
| CN115418395B (zh) * | 2022-11-07 | 2023-01-17 | 百力格生物科技(上海)股份有限公司 | Mgb探针溶解方法及其溶液 |
| WO2024104914A1 (en) | 2022-11-14 | 2024-05-23 | BioNTech SE | Rna capping efficiency assay |
Family Cites Families (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3529478A1 (de) | 1985-08-16 | 1987-02-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | 7-desaza-2'desoxyguanosin-nukleotide, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung zur nukleinsaeure-sequenzierung |
| US5422251A (en) | 1986-11-26 | 1995-06-06 | Princeton University | Triple-stranded nucleic acids |
| US5202231A (en) | 1987-04-01 | 1993-04-13 | Drmanac Radoje T | Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes |
| US6270961B1 (en) | 1987-04-01 | 2001-08-07 | Hyseq, Inc. | Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification |
| US5525464A (en) | 1987-04-01 | 1996-06-11 | Hyseq, Inc. | Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes |
| DE3739366A1 (de) | 1987-04-10 | 1988-10-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Desaza-purin-nucleosid-derivate, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung bei der nucleinsaeure-sequenzierung sowie als antivirale mittel |
| US5824796A (en) | 1988-09-28 | 1998-10-20 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Cross-linking oligonucleotides |
| US5176996A (en) | 1988-12-20 | 1993-01-05 | Baylor College Of Medicine | Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use |
| EP0472648A4 (en) | 1989-05-18 | 1992-09-16 | Microprobe Corporation | Crosslinking oligonucleotides |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| US5177196A (en) * | 1990-08-16 | 1993-01-05 | Microprobe Corporation | Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof |
| US5512667A (en) | 1990-08-28 | 1996-04-30 | Reed; Michael W. | Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides |
| DK0834575T3 (da) | 1990-12-06 | 2002-04-02 | Affymetrix Inc A Delaware Corp | Identifikation af nucleinsyrer i prøver |
| US5714331A (en) | 1991-05-24 | 1998-02-03 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility |
| US5766855A (en) | 1991-05-24 | 1998-06-16 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity and sequence specificity |
| DK51092D0 (da) * | 1991-05-24 | 1992-04-15 | Ole Buchardt | Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf |
| US5539082A (en) | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
| US5419966A (en) | 1991-06-10 | 1995-05-30 | Microprobe Corporation | Solid support for synthesis of 3'-tailed oligonucleotides |
| US5594121A (en) | 1991-11-07 | 1997-01-14 | Gilead Sciences, Inc. | Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines |
| HU9501963D0 (en) * | 1993-03-30 | 1995-08-28 | Sterling Winthrop Inc | 7-deazapurine modified oligonucleotides |
| US6077668A (en) * | 1993-04-15 | 2000-06-20 | University Of Rochester | Highly sensitive multimeric nucleic acid probes |
| US6156501A (en) | 1993-10-26 | 2000-12-05 | Affymetrix, Inc. | Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use |
| ATE191917T1 (de) * | 1994-10-14 | 2000-05-15 | Stratagene Inc | Porphyrin-markierung von polynukleotiden |
| US5556752A (en) | 1994-10-24 | 1996-09-17 | Affymetrix, Inc. | Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA |
| DE4438918A1 (de) | 1994-11-04 | 1996-05-09 | Hoechst Ag | Modifizierte Oligonukleotide, deren Herstellung sowie deren Verwendung |
| US6312894B1 (en) | 1995-04-03 | 2001-11-06 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders |
| US5801155A (en) | 1995-04-03 | 1998-09-01 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates |
| US20010018514A1 (en) * | 1998-07-31 | 2001-08-30 | Mcgall Glenn H. | Nucleic acid labeling compounds |
| US6143877A (en) | 1997-04-30 | 2000-11-07 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides including pyrazolo[3,4-D]pyrimidine bases, bound in double stranded nucleic acids |
| EP1053348B1 (en) | 1998-02-04 | 2010-06-02 | Life Technologies Corporation | Determination of a genotype of an amplification product at multiple allelic sites |
| US6127121A (en) | 1998-04-03 | 2000-10-03 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides containing pyrazolo[3,4-D]pyrimidines for hybridization and mismatch discrimination |
| JP2001013103A (ja) * | 1999-04-28 | 2001-01-19 | Fuji Photo Film Co Ltd | 走査型電気化学顕微鏡による試料核酸断片の検出方法および定量方法 |
| JP4320104B2 (ja) * | 1999-06-07 | 2009-08-26 | 富士フイルム株式会社 | 部分相補性核酸断片の検出方法 |
| US6316230B1 (en) * | 1999-08-13 | 2001-11-13 | Applera Corporation | Polymerase extension at 3′ terminus of PNA-DNA chimera |
-
1999
- 1999-11-23 US US09/447,936 patent/US6660845B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-11-21 ES ES00980769T patent/ES2344337T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-21 WO PCT/US2000/032265 patent/WO2001038584A2/en active Application Filing
- 2000-11-21 EP EP00980769A patent/EP1232157B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-21 DE DE60044367T patent/DE60044367D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-21 AT AT00980769T patent/ATE466864T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-11-21 AU AU17989/01A patent/AU1798901A/en not_active Abandoned
- 2000-11-21 CA CA2392033A patent/CA2392033C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-21 JP JP2001539925A patent/JP2003527579A/ja active Pending
-
2003
- 2003-11-04 US US10/702,007 patent/US6972328B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-05-13 US US11/129,003 patent/US20050239121A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2003527579A (ja) | 2003-09-16 |
| WO2001038584A2 (en) | 2001-05-31 |
| CA2392033C (en) | 2010-02-09 |
| DE60044367D1 (de) | 2010-06-17 |
| EP1232157B1 (en) | 2010-05-05 |
| CA2392033A1 (en) | 2001-05-31 |
| AU1798901A (en) | 2001-06-04 |
| ATE466864T1 (de) | 2010-05-15 |
| US20050239121A1 (en) | 2005-10-27 |
| US20040116689A1 (en) | 2004-06-17 |
| WO2001038584A3 (en) | 2001-10-25 |
| EP1232157A2 (en) | 2002-08-21 |
| US6972328B2 (en) | 2005-12-06 |
| US6660845B1 (en) | 2003-12-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2344337T3 (es) | Oligomeros no agregantes y sin bloqueo de la fluorescencia que comprenden analogos de nucleotidos; metodos de sintesis y uso de los mismos. | |
| JP2003527579A5 (es) | ||
| JP3326181B2 (ja) | 連結ペプチド核酸 | |
| US6884584B2 (en) | Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders | |
| US6225052B1 (en) | Method for determining a nucleic acid | |
| US7381818B2 (en) | Fluorescent probes containing 5′-minor groove binder, fluorophore and quenching moieties and methods of use thereof | |
| JP2758988B2 (ja) | ペプチド核酸 | |
| US7794945B2 (en) | Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders | |
| US6228982B1 (en) | Double-stranded peptide nucleic acids | |
| US6441130B1 (en) | Linked peptide nucleic acids | |
| JP2597698B2 (ja) | オリゴヌクレオチド‐ポリアミド コンジュゲート | |
| AU1442101A (en) | Hybridization-triggered fluorescent detection of nucleic acids | |
| ES2764226T3 (es) | Oligómeros polinucleotídicos de citosina modificados y métodos | |
| JP2001500387A (ja) | ペプチド核酸のモノマー及びオリゴマー | |
| EP0968309B1 (en) | Method for determining a nucleic acid | |
| US20030105286A1 (en) | Linked peptide nucleic acids | |
| ES2316776T3 (es) | Acidos nucleicos de peptidos de pirrolidinilo. | |
| Abdel-Aziz et al. | Synthesis and Biological Investigation of New Compounds Aiming at Immunomodulators: Development of Novel Peptide Nucleic Acids and New Topoisomerases Inhibitors | |
| JP2003219874A (ja) | Ｒｎａに選択的に結合するペプチド核酸をアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いる方法、及び該ペプチド核酸の製造方法 |