ES2316776T3 - Acidos nucleicos de peptidos de pirrolidinilo. - Google Patents

Abstract

Dispositivo de indicación visual, que comprende dos o más discos (1, 2), presentando cada disco una discontinuidad radial (3, 4) para formar, de este modo, una superficie de la cual el plano progresa de un modo helicoidal, estando dichos discos superpuestos y entrelazados y apoyándose en unos planos helicoidales paralelos entre sí, siendo cada disco giratorio, con independencia, alrededor de un eje común por unos medios de accionamiento adaptados para hacer girar, de modo selectivo, uno u otro de los discos, de manera que los discos, cuando se ven axialmente de frente, muestran unos segmentos de solape y contraste visual, que tienen un área o posición representativa de las posiciones relativas de rotación de los discos y que representan un valor de un parámetro que se pretende visualizar por el dispositivo, caracterizado porque un disco está montado para extenderse lateralmente desde un eje giratorio (5) o cilindro, estando montado el otro disco para extenderse lateralmente desde la superficie exterior de un cilindro giratorio (6) dentro del que gira el eje (5) o el cilindro, estando montado dicho eje o cilindro, de forma coaxial, dentro del cilindro que presenta una ranura helicoidal (7) en su pared y a través de la cual se extiende una parte interna del disco adyacente al eje, produciendo la rotación del eje relativo al cilindro un movimiento axial relativo entre el eje y el cilindro en virtud del desplazamiento del disco en la ranura en el cilindro y haciendo que el disco que está suprayacente con el otro disco enmascare o exponga el otro disco en una magnitud que depende de las posiciones de rotación relativas.

Description

Ácidos nucleicos de péptidos de pirrolidinilo.

Esta invención se refiere al uso de ácidos nucleicos de péptidos homólogos en análisis genéticos.

El ácido péptido-nucleico (PNA1) es un análogo de DNA con el fosfato de desoxirribosa sustituido con una cadena principal de poliamida derivada de N-aminoetilglicina. A pesar de este enorme cambio estructural, el PNA muestra una elevada afinidad hacia DNA y RNA de una forma específica para las secuencias. Exhibe también propiedades de unión únicas que no se encuentran en otros análogos de DNA, por ejemplo, el PNA se puede unir a DNA de cadena doble mediante un mecanismo de desplazamiento de cadenas. Debido a su gran capacidad potencial como una herramienta en muchas aplicaciones biológicas, que incluyen investigación de antisentido, los análogos de PNA se convirtieron en una diana de investigación atractiva poco después de que se describiera el PNA. Se han hecho diversas modificaciones de PNA con el fin de buscar una mejor afinidad, especifidad, solubilidad y penetración de membranas, pero tan solo se ha descrito un éxito limitado.

En el documento WO 98/16550 se describen PNAs de fórmula:

1

en la que n es 1 ó 2-200

B es una base heterocíclica protegida o sin proteger capaz de un emparejamiento de Watson-Crick o de Hoogsteen.

R es H, alquilo C_{6}-C_{12} o heteroarilo C_{6}-C_{12} que puede portar uno o más sustituyentes preferentemente seleccionados entre hidroxilo, carboxilo, amino, amido, tiol, tioéter o fenol,

X es OH o OR''' en el que OR''' es un grupo protector o un grupo activante o un grupo lipófilo o un aminoácido o amino, amido o nucleósido,

Y es H o un grupo protector o un grupo lipófilo o un grupo amino-acilo o nucleósido.

Cuando n es 1, estos compuestos son análogos de péptidos-nucleótidos. Cuando n es 2 a aproximadamente 30, estos compuestos son análogos de péptidos-oligonucleótidos y pueden ser hibridados a oligo- o poli-nucleótidos ordinarios. Normalmente estas dos cadenas están hibridadas una a otra en una relación en moles 1:1 mediante un emparejamiento de bases de Watson-Crick específico para las bases.

Se cree que debería ser posible mejorar adicionalmente la unión de estos PNAs a oligonucleótidos complementarios sustituyendo el residuo de glicina con un separador alternativo con una rigidez conformacional apropiada. La modelación molecular sugirió que si el separador de glicina era sustituido con un \beta-aminoácido en el que el ángulo del diedro entre el grupo amino y el ácido carboxílico es próximo a 0º, debería resultar una geometría muy favorable para la hibridación a un oligonucleótido complementario.

Según la presente invención, se proporciona un método para analizar una secuencia de polinucleótidos que comprende incubar la secuencia con dos sondas bajo condiciones de hibridación adecuadas, en el que esta sonda comprende un compuesto de fórmula (2):

2

en la que n es 20 a 200, en cuyo caso cada unidad recurrente puede ser igual o diferente,

B es una base protegida o sin proteger capaz de un emparejamiento de Watson-Crick o Hoogsteen,

C es OH o OR''' en el que R''' es un grupo protector o un grupo activante o un grupo lipófilo o un aminoácido o amino-amida o nucleósido,

D es H o un grupo protector o un grupo lipófilo o un grupo amino-acilo o nucleósido,

cada uno de R' y R'', que pueden ser iguales o diferentes, es un grupo alquilo o arilo o R' y R'' conjuntamente representan 2 o más átomos de la cadena necesarios para completar un anillo insaturado o saturado con X e Y, estando opcionalmente sustituido dicho anillo y estando opcionalmente condensado al menos a otro anillo,

X representa 100 e Y representa 101 en el que Y' representa hidrógeno o adicionalmente, cuando R' y R'' no completan conjuntamente un anillo, un grupo alquilo o arilo, y X', cuando R' y R'' conjuntamente completan un anillo, representan hidrógeno o forman un puente con otro átomo del anillo, o cuando R' y R'' no completan conjuntamente un anillo, representa hidrógeno o un grupo alquilo o arilo;

y detectar la presencia o ausencia de cualquier híbrido formado, en el que las bases B de una de las sondas se seleccionan para que sean complementarias respecto a una secuencia diana y las bases B de la otra sonda se seleccionan para que tengan una o más desadaptaciones con respecto a dicha secuencia diana y en el que los estudios de hibridación se llevan a cabo bajo condiciones que permitan que una secuencia complementaria a la sonda se distinga de una secuencia que contiene una desadaptación con respecto a la sonda.

B es una base capaz de un emparejamiento de Watson-Crick o de Hoogsteen. Esta puede ser una nucleobase que se produce de forma natural seleccionada entre A, C, G, T y U; o un análogo de base que puede ser específica o degenerada, por ejemplo, teniendo la capacidad de emparejarse a bases con dos pirimidinas (T/C) o dos purinas (A/G) o universal, formando pares de bases con cada una de las bases naturales sin discriminación. Muchos de estos análogos de bases son conocidos, por ejemplo, hipoxantano, 3-nitropirrol, 5-nitroindol y las citadas en Nucleic Acids Research, 1989, 17, 10373-83 y todos están destinados a ser usados en la presente invención.

La estereoquímica de los compuestos se cree que es importante.

Uno cualquiera de B, C y D puede incluir un resto señalizador, que puede ser, por ejemplo, un radioisótopo, un isótopo detectable por espectrometría de masas o RMN, un hapteno, un grupo fluorescente o un componente de un sistema quimioluminiscente o fluorescente o cromógeno. El resto señalizador puede estar unido al análogo de nucleótido péptido directamente o bien a través de una cadena conectora de hasta 30 átomos, como es bien conocido en este campo.

Cuando R' y R'' completan un anillo en X e Y, este anillo posee normalmente 4 a 7 átomos, es decir, 4, 5, 6 ó 7 átomos. Los átomos que completan en anillo pueden ser todos átomos de carbono, aunque no está excluida la presencia de heteroátomos, por ejemplo, átomos de oxígeno, nitrógeno y azufre. El anillo generalmente está saturado.

Como se indicó anteriormente, el anillo puede estar condensado a uno o más de otros anillos, normalmente de 4 a 7 átomos, por ejemplo, átomos de carbono, como en un sistema bicíclico. Aunque este anillo puede ser saturado, puede ser tanbien insaturado y normalmente aromático, por ejemplo, benceno.

El anillo o anillos puede(n) estar opcionalmente sustituido(s), generalmente no en orto respecto a los átomos de la cadena de X e Y o respecto a los puntos de condensación y, preferentemente, por lo tanto, en meta o para. La naturaleza de los sustituyentes no es particularmente crítica.

Los sustituyentes adecuados incluyen halógeno, hidroxilo, alcoxi C_{1}-C_{6}, que están sin sustituir o sustituidos, alquenilo C_{2}-C_{6}, arilo, ariloxi, heteroariloxi, alquilo C_{1}-C_{6}, que está sin sustituir o sustituido, nitro, ciano, azido, amidoxima, CO_{2}R^{10}, CON(R^{12})_{2}, OCON(R^{12})_{2}, SR^{10}, SOR^{11}, SO_{2}N(R^{12})_{2}, N(R^{12})_{2}, NR^{10}SO_{2}R^{11}, N(SO_{2}R^{11})_{2}, NR^{10}(CH_{2})_{2}CN, NR^{10}COR^{11}, OCOR^{11} o COR^{10} en los que R^{10} es hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, bencilo o fenilo; R^{11} es alquilo C_{1}-C_{6}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, bencilo o fenilo; cada R^{12}, que son iguales o diferentes, son hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, cicloalquilo, bencilo o fenilo, o los dos grupo R^{12} forman, conjuntamente con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un anillo heterocíclico que contiene N saturado de 5 ó 6 miembros que puede incluir 1 ó 2 heteroátomos adicionales seleccionados entre O, N y S; y n es 1, 2 ó 3.

R' y R'' pueden representar independientemente grupos alquilo o arilo, como lo pueden representar X' e Y' cuando R' y R'' representan estos sustituyentes. Deseablemente, X' e Y' y R' y R'' deben ser escogidos de forma que se bloquee la conformación deseada de la molécula, que puede ser conseguida por lo demás formando un anillo con R' y R''. Los grupos alquilo y arilo pueden estar sustituidos. La naturaleza de los sustituyentes no es particularmente crítica. Generalmente, los grupos alquilo son de C_{1-6}.

Un grupo alquilo C_{1}-C_{6} puede ser lineal o ramificado. Un grupo alquilo C_{1}-C_{6} es normalmente un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, por ejemplo, un grupo metilo, etilo, propilo, i-propilo, n-butilo, sec-butilo o terc-butilo. Un grupo C_{1}-C_{6} que está sustituido está normalmente sustituido con uno o más átomos de halógenos, por ejemplo, con 1, 2 ó 3 átomos de halógeno. Puede ser un grupo perhaloalquilo, por ejemplo, trifluorometilo.

Un halógeno es F, Cl, Br o I. Preferentemente, es F, Cl o Br.

Un grupo alcoxi C_{1}-C_{6} puede ser lineal o ramificado. Normalmente es un grupo alcoxi C_{1}-C_{4}, por ejemplo, un grupo metoxi, etoxi, propoxi, i-propopxi, n-propoxi, n-butoxi, sec-butoxi o terc-butoxi.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, un grupo arilo es normalmente un grupo arilo C_{6-10} como fenilo o naftilo, preferentemente fenilo. Un grupo arilo puede estar sin sustituir o sustituido en cualquier posición con uno o más sustituyentes. Los sustituyentes adecuados incluyen alquilo C_{1}-C_{4}, alquenilo C_{1}-C_{4}, cada uno de los cuales puede estar sustituido con uno o más halógeno, halógeno, hidroxilo, ciano, -NR_{2}, nitro, oxo, -CO_{2}R, -SOR y -SO_{2}R en los que cada R puede ser igual o diferente y se selecciona entre hidrógeno y alquilo C_{1}-C_{4}

Como se usa en la presente memoria descriptiva, un grupo heterocíclico es un anillo de 5 a 7 miembros que contiene uno o más heteroátomos seleccionados entre N, O y S. Ejemplos típicos incluyen los grupos piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, furanilo, tienilo, pirazolidinilo, pirrolilo y pirazolilo. Un grupo heterocíclico puede estar sustituido o sin sustituir en cualquier posición, con uno o más sustituyentes. Normalmente, un grupo heterocíclico está sin sustituir o sustituido con uno o dos sustituyentes. Los sustituyentes adecuados incluyen alquilo C_{1-4}, alquenilo C_{1-4}, cada uno de los cuales puede estar sustituido con uno o más halógenos, halógeno, hidroxilo, ciano, -NR_{2}, nitro, oxo, -CO_{2}R, -SOR y -SO_{2}R en los que cada R puede ser igual o diferente y se selecciona entre hidrógeno y alquilo C_{1-4}.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, halógeno es flúor, cloro, bromo o yodo, preferentemente flúor, cloro o bromo.

Un puente puede estar formado también por X^{1} y otro átomo del primero u otro anillo. Normalmente es un anillo de -CH_{2}- o -CH_{2}-CH_{2}-.

Los anillos preferidos presentes en los compuestos de la invención incluyen los de las siguientes estructuras:

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3

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Por lo tanto, es preferido que Y represente 4 y que R' y R'' completen un anillo que contiene nitrógeno saturado de 4, 5 ó 6 miembros, especialmente pirrolidina.

Se describe también un procedimiento ilustrativo para preparar los compuestos descritos con anterioridad, que comprende:

(i) desproteger en grupo amino heterocíclico de un compuesto de fórmula

5

en el que R^{2} es un grupo protector, por ejemplo Dpm (difenilmetilo) o Pfp (pentafluorofenilo),

R^{3} es un grupo protector compatible con R^{2}, por ejemplo, Boc (t-butoxicarbonilo) o Fmoc (9-fluorometil-formiato), y

B es una base heterocíclica protegida o sin proteger capaz de un emparejamiento de Watson-Crick o Hoogsteen, en particular timidina N_{3}-protegida (como por benzoilo), adenina N_{6}-protegida, citosina N_{4}-protegida, guanina N_{2}-O_{6}-protegida o uracilo N_{3}-protegido,

(ii) desproteger el compuesto de fórmula

6

en la que X, Y, R^{2} y R^{3} son como se definieron anteriormente, y

(iii) acoplar los dos compuestos desprotegidos conjuntamente. Se apreciará que los compuestos de la presente invención pueden ser fácilmente preparados a partir de prolina.

Se describe también un método para convertir un análogo de nucleósido péptido anteriormente descrito, en el que n es 1, en un oligonucleótido péptido de la misma fórmula en el que n es 2-200, que comprende las etapas de:

(i) proporcionar un soporte que porta grupos aminos primarios,

(ii) acoplar un análogo de nucleótido péptido N-protegido de esta invención, en el que n es 1, al soporte,

(iii) separar el grupo protector N-terminal,

(iv) acoplar un análogo de nucleótido N-protegido de esta invención en el que n es 1 al soporte así derivado,

(v) repetir las etapas (iii) y (iv) una o más veces, y

(vi) opcionalmente, separar el oligonucleótido péptido resultante del soporte.

Un procedimiento para la síntesis de los compuestos se ilustra en el Ejemplo 1.

Los compuestos que portan una cadena principal de N-aminoetilprolina hidrófila pueden ser fácilmente sintetizados usando una química estándar de péptidos (véase, por ejemplo, Biorg. V. Med. Chem. Letters 0(2000) 1-5). El PNA es fácilmente soluble en disolventes acuosos y exhibe una fuerte interacción con oligonucleótidos, pero no con oligodesoxirribonucleótidos. Esta elevada selectividad sugiere que tiene una capacidad potencial como un agente antisentido en el que sería ventajosa una dirección a diana selectiva de mRNA.

Se describe también una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la presente invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los compuestos de la presente invención se ha encontrado que son particularmente útiles como sondas para llevar a cabo estudios de hibridación. En particular, las bases B de la sonda pueden ser seleccionadas para proporcionar una secuencia deseada y pueden ser usadas para la sonda para la presencia de esa secuencia diana en una secuencia de polinucleótido. Se ha encontrado que las sondas de la presente invención son particularmente adecuadas para distinguir entre una secuencia complementaria y una secuencia que incorpora una o más desadaptaciones con respecto a la sonda. Por tanto, la sonda puede ser proporcionada para ser usada en un método para analizar una secuencia de polinucleótidos, que comprende llevar a cabo estudios de hibridación usando un compuesto de la invención como una sonda. Preferentemente, de acuerdo con este aspecto de la invención, n es 5 o más, por ejemplo, n es entre 5 y aproximadamente 200, más preferentemente entre 5 y 30.

De acuerdo con este aspecto de la invención, una sonda de la invención es incubada con la secuencia de polinucleótidos bajo condiciones de hibridación adecuadas. Las condiciones se seleccionan de forma que para la longitud de la sonda y la longitud de la secuencia de polinucleótidos, la sonda pueda ser usada para distinguir entre una secuencia perfectamente complementaria y una secuencia que tenga una o más desadaptaciones. Normalmente, la hibridación se puede llevar a cabo calentando la muestra a aproximadamente 70ºC, más preferentemente entre aproximadamente 75ºC y 90ºC, como aproximadamente 80ºC o 85ºC y permitiendo que la muestra se enfríe lentamente de forma que los oligonucleótidos se hibriden al sitio de unión más favorable. Normalmente, la concentración de sal es bastante baja, como menos de 200 mM, como 100 mM. El pH es preferentemente de 7 o menos, ya que las sondas de la invención están parcialmente protonadas. A continuación de la hibridación de la sondas a la secuencia bajo análisis, opcionalmente, se puede incluir una etapa de lavado para separar sonda n unida de la muestra.

La secuencia bajo análisis, o la sonda, pueden estar unidas a un soporte sólido. Preferentemente, en esta realización, se incluye una etapa de lavado para separar las sondas no unidas. Puede ser usado cualquier soporte sólido adecuado. Normalmente, cuando un PNA de la invención está unido a un soporte sólido, el soporte sólido es un polímero insoluble como poliestireno, sobre el que es injertado un polímero soluble en agua como polietilenglicol para cubrir la superficie del polímero insoluble.

Posteriormente, pueden ser detectados híbridos entre una sonda de la invención y la secuencia de polinucleótidos para establecer si la secuencia diana es perfectamente complementaria a la sonda de la invención o incorpora una secuencia con desadaptaciones. Puede ser usado cualquier marcador adecuado para marcar e identificar sondas. Por ejemplo, las sondas pueden estar provistas de un radiomarcardor, marcador fluorescente u otro marcador fácilmente detectable.

Se pueden usar cualesquiera medios adecuados para detectar híbridos entre una sonda de la invención y la secuencia de polinucleótidos. Por ejemplo, la hibridación podría ser detectada mediante la detección del cambio de la longitud de onda del máximo fluorescente y su intensidad. Los estudios se pueden llevar a cabo de forma que las condiciones de hibridación se seleccionen de forma que solamente una secuencia de nucleótidos perfectamente complementaria se hibride a la sonda, con la detección posterior de cualesquiera híbridos formados. Alternativamente, podría ser verificada la T_{m} para deducir si la sonda está hibridada a una secuencia de nucleótidos complementaria o con desadaptaciones. Opcionalmente, cuando está hibridada una secuencia con desadaptaciones, la secuencia puede ser cortada y secuenciada para establecer su secuencia.

Alternativamente, cuando se usa un soporte sólido, los marcadores podrían estar unidos a las secuencias de nucleótidos dianas o las sondas, siempre que no estén unidas al soporte sólido. Después del lavado se podría verificar el marcador asociado con el soporte sólido, como el nivel de radioactividad. Se puede usar también una espectrometría de masas para la detección. En esta realización, la sonda está unida a un soporte sólido. Después de la hibridación, el soporte se lava a fondo. Posteriormente, el híbrido es desnaturalizado a partir de la sonda sólida y es detectado mediante espectrometría de masas. Las sondas de la presente invención no actúan como cebadores PCR. Por tanto, las sondas de PNA de la presente invención pueden ser incubadas también con una muestra que incorpore otros cebadores. La inhibición de PCR se podría usar para verificar la hibridación de la sonda de PNA a una secuencia perfectamente adaptada.

El método se lleva a cabo usando dos sondas de la invención, una que es perfectamente complementaria a una secuencia diana seleccionada y una de las cuales incorpora una desadaptación. Las dos sondas son incubadas con la secuencia que va a ser analizada y los híbridos son detectados como anteriormente. Las sondas pueden ser marcadas con marcadores diferentes, de forma que sea posible establecer no solamente si la secuencia sometida a análisis tiene o no la secuencia diana seleccionada, sino también si la secuencia tiene una desadaptación seleccionada respecto a la secuencia diana seleccionada, debido a la unión a la segunda sonda. Este método es particularmente útil para la identificación de polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP).

En un aspecto de la invención, el polinucleótido que va a ser analizado o la sonda puede ser provisto primero con una etiqueta, como un miembro de un par de unión específico. Esta etiqueta podría ser usada, por ejemplo, para aislar el polinucleótido relevante de la solución de hibridación, para la detección posterior de cualquier sonda unida al polinucleótido.

Una sonda de acuerdo con la presente invención se une preferentemente a DNA en oposición a RNA. Consecuentemente, las sondas de la presente invención pueden ser usadas también para la hibridación a secuencias de DNA con el fin de ayudar al aislamiento de estas secuencias de DNA a partir de mezclas de RNA y DNA.

En una realización de la presente invención, la sonda de PNA puede comprender un oligonucleótido quimérico que incorpore un PNA de la presente invención de 5 o más bases de longitud, flanqueado en cualquiera o en los dos lados por oligonucleótidos que tienen una estructura principal alternativa. Por ejemplo, la sonda puede tener una estructura principal de PNA-DNA. Estas sondas mixtas podrían ser usadas de forma que la parte de PNA se seleccione para diferenciar entre una secuencia perfectamente complementaria y una secuencia con desadaptaciones. Las secuencias de DNA de los flancos pueden ser seguidamente usadas como cebadores para conducir la reacción de cadena de polimerasa. Estas sondas pueden ser usadas para obtener una amplificación solo de las secuencias que incorporan secuencias perfectamente adaptadas y para facilitar una reducción de la amplificación de cualesquiera secuencias sin desadaptaciones.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invención:

Descripción de las figuras

Figura 1: Experimento de hibridación sobre gel. Columna 1: FdA_{10} + 3d-T_{10}; Columna 2: FdA_{10} + 3c-T_{10}; Columna 3: FdA_{10} + 3a-T_{10}; Columna 4-5: no usada; Columna 6-8: FdA_{10} + 3h-T_{10} 1:1, 1:2, 1:5; Columna 9: no usada; Columna 10: FdA_{10} (testigo negativo): Condiciones: los experimentos de electroforesis se llevaron a cabo sobre gel de poliacrilamida al 15% en tampón TBE 10 mM, pH 8,3, a un voltaje DC constante de 110 V.

Figura 2: Curva de fusión de una mezcla 1:1 entre 3b y poli(rA), poli(rU) y poli(dA). Condiciones como se exponen en el texto.

Figura 3: a: Curva de titulación de CD de PNA (3b) y poli(dA). Condiciones: la concentración de poli(dA) era constante a 8,0 \muM dA, tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 7,0, 20ºC. Para mayor claridad, no se muestra la totalidad de espectros de CD, en particular, los espectros de dA por debajo de 40% en moles son iguales. b: un gráfico entre el porcentaje de moles de A y la elipticidad de híbridos de 3b-poli(dA) y 3b-poli(rA).

Ejemplo 1

El siguiente procedimiento es ilustrativo, siendo 3b-T_{10} un compuesto de esta invención.

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7

Las síntesis de 3a-T_{10}, 3b-T_{10} y 3c-T_{10} requieren bloques de construcción protegidos que incluyen éter (4a) pentafluorofenílico de ácido Fmoc-L-aminopirrolidino-2-carboxílico, éster (4b) pentafluorofenílico de ácido Fmoc-D-aminopirrolidino-2-carboxílico, éter (4c) pentafluorofenílico de ácido (1R,2S)-2-aminociclo-pentacarboxílico y monómero (6) de PNA protegido con Fmoc. Los ácidos tanto D- como L-aminopirrolidino-2-carboxílico se sintetizaron a partir de D- y L-prolina a través de las correspondientes N-nitrosoprolinas, como se describe en Biochemistry, 1967, 6, 170. La protección de D- y L-aminopirrolidino-2-carboxílico con Fmoc-Cl seguida de activación con trifluoroacetato de pentafluorofenilo/DIEA proporcionó ésteres pentafluorofenílicos (4a) y (4b), respectivamente. (-)-Cispentain [ácido (1R,2S)-2-aminociclopentanocarboxílico] (véase J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 1994, 1411-1415) fue análogamente protegido y activado para proporcionar el éster pentafluorofenílico (4c). El monómero de timina protegido con Boc (5) (véase J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 1997, 547-554) se convirtió en el monómero de PNA protegido con Fmoc (6) en cuatro etapas (Esquema 1). Las síntesis de PNA se realizaron en una forma por etapas sin la formación previa de los bloques de construcción de dipéptidos. Para una comparación, se usó también como separador la \beta-alanina flexible. En este caso el bloque de construcción de dipéptidos se sintetizó mediante desprotección selectiva del grupo N-Boc en el monómero de timina (5) por medio de ácido p-toluenosulfónico-acetonitrilo (Biochemistry loc. cit.) seguida de acoplamiento mediado por ECD.HCl con Fmoc-\beta-alanina disponible en el comercio. El dipéptido fue tratado con HCl 4 M en dioxano para desproteger el éster difenilmetílico seguido de tratamiento con trifluoroacetato de pentafluorofenilo/DIEA para proporcionar el dipéptido activado (7) con un rendimiento global del 43%.

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Esquema 1

8

i) 2,5 eq. de p-TsOH.H_{2}O/MeCN, t.a.

ii) Fmoc-\beta-Ala-OH/EDC.HCl, t.a., O/N

iii) Vmoc-Cl/DIEA, t.a., 2 h

iv) HCl/dioxano, t.a., 6 h

v) PfpOTfa/DIEA en DMF, t.a., 15 min.

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Esquema 1

La oligomerización de estos bloques de construcción se realizó sobre resina Novasyn TGR (escala de 2,5 \mumoles para PNA 3a-3c y escala de 5 \mumoles para PNA 3d) como se describe en la publicación J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1997, 555-560. Se incluyó amida de lisina en las terminaciones en N de todos los PNA para una comparación con los PNA previos en esta serie. Cada monómero activado con pentafluorofenilo se unió a la reina usando 4 equivalentes del monómero y 4 equivalentes de OHAc en DMF (60 minutos, acoplamiento único). Se realizó un remate de los grupos terminales (Ac_{2}O/DIEA) después de cada etapa. Después de la separación del grupo N-Fmoc mediante tratamiento con piperidina al 20% en DMF, se repitió el ciclo de síntesis hasta que se obtuvo la secuencia completa de 3a-T_{10}, 3b-T_{10}, 3c-T_{10} y 3d-T_{10}. La verificación cuantitativa del aducto de dibenzofulveno-piperidina liberado durante la desprotección del grupo Fmoc mostró que todas las reacciones de acoplamiento tuvieron lugar de forma bastante eficaz (eficacia media del acoplamiento por ciclo: 3a-T_{10} 98,0, 3b-T_{10} 99,2%, 3c-T_{10} 99,8%, 3d-T_{10} 96,4%). Los PNA en bruto fueron liberados de la resina mediante tratamiento con ácido trifluoroacético sin desprotección previa del grupo Fmoc con el fin de usarlo como medio de purificación (véase la publicación Tetrahedron, 1995, 51, 6179-6194). Después de una purificación mediante HPLC de fase inversa, los PNA de Fmoc-ON fueron tratados con piperidina al 20% en DMF para proporcionar los PNA completamente desprotegidos que fueron caracterizados mediante espectroscopía de masas ESI (Tabla 1).

TABLA 1 Espectros ESI-MS de los PAN 3a-3d

9

Se llevaron a cabo estudios preliminares de cuatro nuevos \beta-PNA respecto a oligodesoxirribonucleótidos mediante la técnica de desplazamiento de unión sobre gel de poliacrilamida usando (dA)_{10} marcado por fluorescencia "(FdA_{10})" como sonda. Después de una breve incubación de mezclas 1:1 del PNA y DNA a 20ºC, las muestras fueron sometidas a electroforesis en gel de poliacrilamida al 15% a la misma temperatura. Solamente PNA 3b-T_{10} que porta un separado de ácido D-aminopirrolidinocarboxílico mostró resultados positivos, como se puso de manifiesto mediante la presencia de una nueva banda fluorescente en movimiento y la desaparición de la banda fluorescente (dA)_{10}, véase la Figura 1. Además de ello, solamente el 3b-T_{10} mostró una fusión observable con poli(dA) con un valor de T_{m} mayor que 80ºC a NaCl 150 mM y pH 7 (Figura 2).

La unión de \beta-PNA a sus oligonucleótidos complementarios es destacable, ya que parece violar el principio de Nielsen "6+3" (Chem. Soc. Rev. 1997, 73-78). Es también de interés apreciar que solamente PNA 3b-T_{10} que porta un separador de ácido D-aminopirrolidino-2-carboxílico proporcionó resultados positivos, mientras que el PNA que porta separador de ácido L-aminopirrolidino-2-carboxílico no los proporcionó. La estereoquímica de los bloques de construcción tiene una gran influencia sobre la conformación de los oligómeros que puede ser tenida en cuenta para los resultados. Eventualmente, el PNA 3c que porta ácido (1R,2S)-2-aminociclopentano-carboxílico con una configuración L en el átomo de carbono \alpha del separador no mostró tampoco evidencia de unión a (dA)_{10}. El PNA 3d que porta un separador de \beta-alanina, en principio, debería ser capaz de adoptar cualquier conformación necesaria para unirse a su NDA complementario. La falta de unión a DNA en este caso puede surgir del hecho de la pérdida de entropía durante el procedimiento de unión fuera elevada.

Ejemplo 2

Como parte de la investigación continuada sobre análogos quirales con restricción conformacional de ácidos nucleicos péptidos (PNA) basada en el estructura del núcleo de pirrolidina, se ha mostrado recientemente que un pirrolidinil-PNA derivado de residuos de ácido 4'R-timin-1-ilpirrolidino-2'R-carboxílico y ácido aminopirrolidino-2R-carboxílico, podría unirse a su oligonucleótido complementario como se muestra mediante electroforesis sobre gel. Se ha investigado adicionalmente que la interacción entre pirrolidinil-PNA y ácidos nucleicos mediante espectroscopía UV y CD y se ha descubierto que el pirrolidinil-PNA exhibe una afinidad preferente considerable por DNA complementario sobre RNA.

Materiales y métodos

El soporte sólido para la síntesis de péptidos, resina Novasyn® TGR (\sim0,20-0,25 mmol de grupos NH_{2} libres/g) y Fmoc-Lys(Boc)-OPfp se obtuvieron de la empresa Calbiochem-Novabiochem Ltd. Se obtuvo ácido trifluoroacéitco (98%) de las empresas Avocado Research Chemicals Ltd y Fiuka AG. Todos los demás reactivos se obtuvieron con la calidad de pureza más elevada disponible de las empresas Aldrich Chemical Company Ltd o Fluka AG y se usaron tal como se recibieron.

DMF era de calidad para la síntesis de péptidos obtenida de la empresa Rathburn Chemicals Ltd, y se usó sin purificación adicional. Todos los demás disolventes usados para la síntesis y purificación fueron disolventes de calidad HPLC obtenidos de la empresa Rathburn. Se obtuvo agua desionizada de un sistema de purificación de agua ultra-pura de la entidad Elga Maxima.

Las muestras para un análisis HPLC de fase inversa se disolvieron en un disolvente acuoso adecuado y se filtraron a través de un filtro de teflon (tamaño de poros 0,47 \mu, Anachem Ltd.). La HPLC se realizó en un sistema Waters 990+ con un detector de red de diodos. Para los análisis y para fines preparativos se usó una columna de HPLC de fase inversa semi-preparativa Waters \muBondapak C-18 (0,78 x 30 cm, P/N 84176) o Hypersil ODS 100 x 4,6 mm, tamaño de partículas 5 \mu. La verificación de los picos y el análisis de los datos se realizaron en un software Waters 990 funcionando en un ordenador compatible NEC IBM-PC/AT con microprocesadores 80286/80287. Las muestras se recuperaron de las fracciones de HPLC mediante liofilización en un liofilizador VirTis Freezemobile 5SL.

Protocolo general para la síntesis en fase sólida de PNA (química de Fmoc)

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La síntesis de PNA se llevó a cabo sobre escalas de 2,5 o 5,0 mmol en resina Novasyn TGR [0,20 mmol/g de sustitución, nuevamente agregadas con Fmoc-Lys(Boc)-OH; 10-25 mg, aprox. 2,5-5 \mumol].

El ciclo de síntesis es como sigue: desprotección: piperidina al 20% en DMF (1,0 ml, 15 minutos), lavado (DMF), acoplamiento [ésteres Pfp S1 o S2/HOAt (1:1) en DMF, 4 eq., 1 h], lavado (DMF), remate de los grupos terminales (10% Ac_{2}O/lutidina en DMF, lavado (DMF)). La reacción de acoplamiento se verificó mediante medición de las cantidades de aducto de dibenzofulveno-piperidina liberado tras una desprotección a 264 y 297 nm. Después de que se completó la adición del residuo final, el grupo Fmoc N-termina se separó por medio de 20% de piperidina en DMF o se retuvo, dependiendo de la eficacia de la síntesis. El PNA fue liberado de la resina mediante tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% (aprox. 1 ml para 10 mg de resina) a temperatura ambiente durante 2-3 h con agitación ocasional. Después del período de tiempo especificado, la solución de escisión se evaporó hasta casi sequedad por medio de una corriente de nitrógeno y seguidamente se diluyó con dietil-éter (diez veces el volumen). Seguidamente la suspensión se centrifugó a 13.000 rpm durante 5 minutos. Después de sedimentar la materia sobrenadante, el PNA en bruto se lavó con éter y el procedimiento de centrifugación-lavado se repitió 2-3 veces. Finalmente el PNA en bruto se secó y se disolvió en acetonitrilo acuoso al 10% que contenía 0,1% de ácido trifluoroacético. La solución en bruto se filtró y se analizó o se purificó mediante HPLC de fase inversa. La elución de la muestra se llevó a cabo usando un gradiente de agua-acetonitrilo que contenía 0,1% de ácido trifluoroacético (verificación mediante absorbancia UV a 270 nm).

Protocolo general para la separación de un grupo Fmoc a partir de Fmoc-ON PAN purificado

A PNA liofilizado (20-50 \mug) se añadió piperidina al 20% en DMF (20-50 \mul) y la solución se mezcló centrifugando. Después de 20 minutos a temperatura ambiente, se añadió seguidamente éter. El péptido precipitado se aisló mediante centrifugación y se lavó unas cuantas veces con éter y finalmente se secó con aire. El residuo se disolvió en acetonitrilo acuoso y se purificó mediante HPLC de fase inversa.

3b: H-[D-Apc-D-Pro(cis-4-T)]_{10}-LysNH_{2}

rendimiento de acoplamiento calculado: 85% (antes de la desprotección de Fmoc final)

t_{R} = 25,5 minutos (Fmoc-OFF); 28,9 minutos (Fmoc-ON)

condiciones de HPLC:

columna - Hypersil ODS 100 x 4,6 mm, tamaño de partículas 5 \mu

disolventes - A = 0,1% TFA en MeCN, B = TFA acuoso al 0,1%, 10:90 A:B durante 5 minutos

seguidamente gradiente lineal hasta 90:10 A:B durante un período de 30 minutos

M_{t} (MALDI-TOF) encontrado 3479,3, calc. para M.H^{+} = 3479,7

Estudios biofísicos - General

Se obtuvieron poli(rA) (sal de potasio; M_{t} \sim 7 x 10^{6}) y poli(rU) (sal de potasio, M_{t} < 9 x 10^{5}) a partir de la empresa Fluka AG. Se obtuvo poli(dA) (sal de sodio, M_{t} \sim 9,19 x 10^{4}) a partir de la empresa Amersham Pharmacia Biotech. Los ácidos nucleicos se usaron tal como se recibieron sin tratamiento adicional. Lo oligonucleótidos cortos se sintetizaron sobre un sintetizador de DNA de Applied Biosystems modelo 380B y se desprotegieron mediante tratamiento con amoníaco acuoso concentrado a 55ºC durante una noche. Los oligonucleótidos se purificaron mediante precipitación en etanol. La concentración de oligonucleótido, ácidos nucleicos y soluciones de PNA se determinó a partir de la absorbancia a 257 o 260 nm. Se usaron los coeficientes de extinción molar a 257 nm (\varepsilon_{257}) de 10,0 y 9.7 ml.\mumol.cm^{-1} por nucleótido para T y A, respectivamente, sin compensación de la hipercromicidad resultante del apilamiento parcial de las bases a temperatura ambiente.

Experimento de T_{m}

Se realizaron experimento de T_{m} en un espectrofotómetro CARY 100 UV (Varian Ltd.) equipado con un sistema de fusión térmica. La muestra para la medición de T_{m} se preparó mezclando cantidades calculadas de oligonucleótido madre y soluciones de PNA conjuntamente para proporcionar una concentración final de nucleótidos y tampón de fosfato de sodio (pH 7,0) y los volúmenes finales se ajustaron a 3,0 ml mediante la adición de agua desionizada. Las muestras se transfirieron a una celda de cuarzo de 10 mm con tapón de teflon y se equilibraron a la temperatura de partida durante al menos 30 minutos. La OD_{260} se registró por etapas de 25-90ºC (temperatura de bloques) con un aumento de la temperatura de 0,5ºC/minuto. Los resultados se normalizaron dividiendo la absorbancia a cada temperatura por la absorbancia inicial. El análisis de los datos se realizó en un ordenador compatible PC usando Microsoft Excel 97 (Microsoft Corp.).

Cálculo de parámetros termodinámicos^{2-4}

Los valores de la constante de equilibrio, K, se determinaron a cada temperatura usando la ecuación

K = \alpha(C_{T}/n)[(1-\alpha)C_{T}]^{n}

en la que C_{T} es la concentración total de cadenas, \alpha es la fracción de cadena única en el estado dúplex y n es la molecularidad de la reacción (en este caso, n=2). Solamente se usaron los puntos con 0,11 <\alpha<0,91. Suponiendo un modelo de transición de dos estados y que \DeltaH es independiente de la temperatura, el gráfico de ln K frente a 1/% debe ser lineal con una pendiente \approx -\DeltaH/R y una intersección con el eje y = \DeltaS/R. El error se estimó que estaba en el intervalo de \pm 10% debido a la incertidumbre de línea de base en la curva de fusión de UV.

Experimentos de titulación UV

El experimento de titulación de UV se realizó en un espectrofotómetro CARY 100 UV (Varian Ltd.) a 25ºC. A una solución que contenía el PNA 3b (0,39 \muM) y tampón de fosfato de sodio pH 7,0. La absorbancia se leyó frente a un blanco (fosfato de sodio 10 mM) y se añadieron más partes alícuotas de (dA)_{10} hasta un volumen total de
90 \mul (correspondiente a una relación T:A 1:4). La relación de la OD_{260} observada y la OD_{260} calculada se representó gráficamente frente a la relación en moles de nucleótido T:A y se determinó la estequiometría del punto de inflexión^{5}.

Espectroscopía de dicroísmo circular

Todos los experimentos CD se realizaron en un espectropolarímetro JASCO Model J-710/720 (Oxford Centre of Molecular Sciences, Oxford). Las muestras se prepararon mezclando cantidades calculadas de oligonucleótido madre y soluciones de PNA conjuntamente en una celda de cuarzo de 10 mm y los volúmenes vinales se ajustaron a 2,00 ml mediante la adición de agua desionizada que contenía una cantidad apropiada de tampón de fosfato de sodio, pH 7,0 y cloruro de sodio, para proporcionar la concentración apropiada de cada componente, como se describe en el texto. Los espectros se midieron a 20ºC desde 300 hasta 200 nm y se calculó la media 4 veces y seguidamente se sustrajo de un espectro de agua pura bajo las mismas condiciones.

Experimentos de titulación de CD

A una solución que contenía poli(dA) (dA 8,0 \muM) o poli(rA) (A 7,7 \muM) y tampón de fosado de sodio 10 mM, ph 7,0 (2,0 ml) se añadió una parte alícuota de 2,5 \mul de una solución madre concentrada de 3b (concentración = dT 2,0 mM) en tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 7,0. Los espectros se midieron a 20ºC desde 300 hasta 200 nm, se halló la media 4 veces y seguidamente se sustrajo de un espectro de agua pura bajo las mismas condiciones. Se añadieron más soluciones madres 3b hasta que se hubo añadido un volumen total de 20 \mu.

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Referencias

1. Steely, H. Jr.; Gray, D.M.; Ratliff, R.S. Nucleic Acids Res. 1986, 14. 10071.

2. Tomac, S.; Sarckar, M; Ratilainen, T.; Wittung, P.; Nielson, P.E.; Norden, B.; Graslund, A. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 5544.

3. Marky, L.A., Breslauer, K.J. Biopolymers 1987, 26, 1601

4. Puglisi, J.D., Tinoco, I. Methods Enzymology, 1989, 180, 304

5. Cassani, C., Bollum, F.J. Biochemistry 1969, 8, 3928.

El decámero de homotimina 3b [H-D-Apc-D-Pro(cis-A-T)]_{10}-LysNH_{2} se sintetizó a partir de los correspondientes monómeros activados con pentafluorofenilo usando una metodología en fase sólida de Fmoc como se describió anteriormente. La identidad del producto se confirmó mediante espectrometría de masas MALDI-TOF (m/z encontrado 3479,3, calc. para M.H^{+} 3479,7).

Una mezcla de 3b y poli(dA) a una relación 1:1 de T:A (3b 2 \muM, NaCl 150 mM, tampón de fosfato de Na 100 mM, 0H 7,0) mostró una dependencia de la temperatura de la absorción UV a 260 mm (Figura 2). Solo se observó una única transición en la zona de 20-90ºC. La T_{m} se estimó que era > 85ºC, aunque el valor exacto no pudo ser obtenido, ya que la fusión no se completó ni siquiera a 95ºC. Bajo las mismas condiciones, la mezcla de 3b y (dA)_{10} proporcionó también una única curva de fusión de transición con un valor de T_{m} ligeramente inferior (76ºC). Por el contrario, una mezcla 1:1 de 3b y poli(rA) mostró una transición con una T_{m} mucho más baja (32ºC). En todos los casos, la fusión fue reversible en un ciclo de enfriamiento-recalentamiento y no se observó histéresis a la velocidad de calentamiento/enfriamiento de 0,5ºC/minutos, que es indicativo de una formación y disociación rápida de complejos. No se observó ninguna unión a poli(rU) bajo las mismas condiciones, sugiriendo que la interacción es específica para el emparejamiento AT. Con el fin de demostrar adicionalmente el reconocimiento específico de adenina en DNA por timina en el PNA 3b, se determinó la T_{m} de híbridos formados entre 3b y (dA)_{10} (adaptación perfecta), d(A_{4}TA_{5}), D(A_{3}TATA_{4}) y (dT)_{10} se determinaron bajo condiciones de bajo contenido de sales (Tabla 2, entradas 1-4). Se mostró claramente que la introducción de una falta de un par de bases con desadaptación dio lugar a una gran disminución de la T_{m} (\DeltaT_{m} > 20ºC por desadaptación). No se observó ninguna unión a (dT_{10}), como era de esperar, mostrando así que la unión es de hecho específica para un emparejamiento de AT. La disminución de T_{m} observada para una única desadaptación es significativamente mayor que el híbrido de 1a-oligodesoxinucleótido de PNA (\DeltaT_{m} \sim 13ºC) y, de hecho, que muchos otros PNA descritos.

Las propiedades de hibridación de 3b fueron estudiadas también mediante espectroscopía CD. El PNA 3b en sí mismo exhibió una señal CD insignificante en la zona de 200-300 nm en comparación con poli(dA) a una concentración similar. Tras la adición de una solución de 3b a poli(dA), se observó un gran cambio de la señal de CD que no era la suma de los espectros de CD de los dos componentes, indicando la formación de un complejo con una conformación quiral bien definida. Siguiendo la señal de CD de la mezcla a diferentes relaciones de los reactantes, se estableció la estequiometría 1:1 del híbrido PNA:DNA (Figura 3). Incluso a una resistencia iónica elevada (NaCl 1 M) no hubo evidencia de formación de triplete, sugiriendo que el complejo 1:3 está estructuralmente excluido. La adición de 3b a poli(rA) indujo también un enorme cambio en el espectro CD, aunque no se observó saturación incluso a una relación 4:1 de PNA:RNA. Esto no es sorprendente considerando que la T_{m} de híbrido PNA RNA no está muy por encima de la temperatura a la que se llevó a cabo el estudio (20ºC). Como consecuencia, no pudo ser determinada la estequiometría del híbrido formado entre 3b y poli(rA). El espectro CD del híbrido 1:1 formado entre 3b y poli(dA) mostró bandas negativas (mínimos de elipticidad) a 205, 248 y 267 nm y bandas positivas con máximos (máximos de elipticidad) a 218, 260 y 284 nm con un punto de cruce de longitudes de onda bajas a 210 nm, que es muy similar a la doble hélice de tipo B formada entre poli(dT) y poli(dA).

La titulación UV así como los experimentos de electroforesis sobre gel proporcionan una evidencia de soporte adicional de que 3b y (dA)_{10} forman un híbrido 1:1. A partir de la especifidad observada y los datos de estequiometría, es muy probable que el complejo esté formado por un emparejamiento de bases de Watson-Crick (A.T). Basándose en la estequiometría 1A1 y suponiendo un modelo de hibridación de "todo o ninguno", la entalpía y la entropía de unión a partir del gráfico de Van't Hoff se calculó que eran de -10,0 kcal y -27,2 cal.K^{-1} por mol de nucleótido, respectivamente.

\newpage

Con el fin de determinar si la unión correcta del pirrolidinil-PNA estaba restringida a homopolímeros complementarios de DNA, se sintetizaron dos secuencias mixtas de PNA (3), H-T_{5}AT_{4}LysNH_{2} (3e MALDI-TOF m/z encontrada 2485,0, calc. para M 3485,5) y H-T_{3}ATAT_{4}LysNH_{2} (3f, MALDI-TOF m/z encontrada 3493,6, calc. para M 3494,6) y su T_{m} determinada con oligodesoxirribonucleótidos suponiendo una unión antiparalela. Los datos se muestran en la Tabla 3. Las entradas 4 y 7 muestran que el PNA de secuencia mixta se une a oligonucleótidos complementarios con T_{m} = 70\pm1ºC similar y solamente 10ºC por debajo del PNA homopolímero (3b) con dA_{10}. Sin embargo, una única desadaptación puede provocar un fallo en la T_{m} de 20-35ºC (entradas 1-4) y una doble desadaptación (entrada 5) evita una unión medible a 20ºC. Por tanto, esta nueva clase de pirrolidinil-PNA muestra una poderosa discriminación para DNA y para secuencias adaptadas, incluso si una única desadaptación provoca una gran caída de la T_{m}.

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TABLA 3 T_{m} de PNA H-T_{5}AT_{4}-LysNH_{2} (3e) y H-T_{3}ATAT_{4}-LysNH_{2} (3f) con oligonucleótidos

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^{a}Si no se indica otra cosa, la T_{m} fue medida a una relación de PNA:DAN = 1:1, concentración de cadena de
PNA = 1 \muM, tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 7,0, velocidad de calentamiento 0,5ºC/minuto; ^{b}T_{m} fue determinada a partir del gráfico de la derivada primera.

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La estabilidad inusual del híbrido formado entre pirrolidinil-PNA y oligodesoxirribonucleótidos podría ser atribuida al menos parcialmente a la atracción electrostática entre el átomo de nitrógeno de hidrazina con carga positiva en el PNA respecto al grupo fosfato con carga negativa del DNA. La proposición anterior está apoyada por el hecho de que la T_{m} del híbrido es sensible al pH, siendo mayor a un pH más bajo (Tabla 2, entradas 5, 6). Además de ello, la T_{m} es también dependiente de la resistencia iónica (Tabla 2, entradas 7, 8), siendo disminuida a una resistencia iónica superior similar a otros análogos de oligonucleótidos con carga positiva. La presencia del conector de la aminoprolina estructuralmente rígido con una geometría apropiada es probablemente otro factor que contribuye a las propiedades de fuerte unión del PNA (3b). Es interesante apreciar que aunque el PNA (3b) que porta el separador de D-aminoprolina se une fuertemente a DNA, el correspondiente PNA (3a) que porta el separador de L-aminoprolina no mostró ninguna unión observable según el ensayo de desplazamiento de unión sobre gel y los experimentos de la T_{m}.

TABLA 2 T_{m} de híbridos de PNA-ácidos nucleicos

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^{a}Si no se indica otra cosa, la T_{m} se midió a una relación de PNA:DNA = 1:1, concentración de cadena de
PNA = 2 \muM, tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 7,0, velocidad de calentamiento 0,5ºC/minuto, ^{b}T_{m} se determinó a partir del gráfico de la derivada primera; ^{c}Se observó una fusión parcial a la temperatura más baja usada para la determinación de la curva de fusión (25ºC) ^{d}Datos tomados de Haaina et al., New J. Chem 1999 23, 833-839. No se describió en % de hipercromicidad.

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El diferente comportamiento hacia poli(dA) y poli(rA) de PNA 3b es quizás la características más llamativa de este PNA que contiene \beta-aminoácidos. La preferencia de unión a DNA sobre RNA no ha sido previamente observada en otros análogos de PNA. De hecho, la mayoría de PNA interaccionan más fuertemente con RNA que con DNA.

Claims (15)

1. Un método de analizar una secuencia de polinucleótidos, que comprende incubar la secuencia con dos sondas bajo condiciones de hibridación adecuadas, en el que cada sonda comprende un compuesto de fórmula:

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en la que n es 20 a 200, en cuyo caso cada unidad recurrente puede ser igual o diferente,

B es una base protegida o sin proteger capaz de un emparejamiento de Watson-Crick o Hoogsteen,

C es OH o OR''' en el que R''' es un grupo protector o un grupo activante o un grupo lipófilo o un aminoácido o amino-amida o nucleósido,

D es H o un grupo protector o un grupo lipófilo o un grupo amino-acilo o nucleósido,

cada uno de R' y R'', que pueden ser iguales o diferentes, es un grupo alquilo o arilo o R' y R'' conjuntamente representan 2 o más átomos de la cadena necesarios para completar un anillo insaturado o saturado con X e Y, estando opcionalmente sustituido dicho anillo y estando opcionalmente condensado al menos a otro anillo,

X representa 14 e Y representa 15 en el que Y' representa hidrógeno o adicionalmente, cuando R' y R'' no completan conjuntamente un anillo, un grupo alquilo o arilo, y X', cuando R' y R'' conjuntamente completan un anillo, representan hidrógeno o forman un puente con otro átomo del anillo, o cuando R' y R'' no completan conjuntamente un anillo, representan hidrógeno o un grupo alquilo o arilo;

y detectar la presencia o ausencia de cualquier híbrido formado,

en el que las bases B de una de las sondas se seleccionan para que sean complementarias respecto a una secuencia diana y las bases B de la otra sonda se seleccionan para que tengan una o más desadaptaciones con respecto a dicha secuencia diana

y en el que los estudios de hibridación se llevan a cabo bajo condiciones que permitan que una secuencia complementaria a la sonda se distinga de una secuencia que contiene una desadaptación con respecto a la sonda.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que el método comprende las etapas de:

incubar la secuencia de polinucleótidos con la sonda que comprende un compuesto de la invención; y

opcionalmente, lavar las sondas no unidas de la secuencia de polinucleótidos;

en que el método se lleva a cabo bajo condiciones que permitan que una secuencia complementaria para la sonda se distinga de una secuencia que contiene una secuencia desadaptada con respecto a la sonda;

y detectar cualquier híbrido así formado.

3. Un método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la secuencia de polinucleótidos está unida a un soporte sólido.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la sonda está marcada.

5. Un método según la reivindicación 4, en el que cada sonda está marcada con un marcador diferente.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R' y R'' representan conjuntamente 2 a 5 átomos de la cadena.

7. Un método según la reivindicación 6, en el que R' y R'' completan conjuntamente un anillo que contiene nitrógeno de 4, 5 ó 6 miembros.

8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R' y R'' completan conjuntamente un anillo saturado.

9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que Y representa 16.

10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R' y R'' completan conjuntamente un anillo de pirrolidina.

11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R' y R'' completan un anillo con X e Y que está condensado a un anillo de 5 ó 6 miembros que es saturado o aromático.

12. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X' forma un puente de -CH_{2}- o -CH_{2}-CH_{2}- con otro átomo de carbono del anillo.

13. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada B es una nucleobase que se produce de forma natural que es adenina, citosina, guanina, timina o uracilo.

14. Un método según la reivindicación 13, en el que C es OH y B es timina.

15. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que n es 5-30.