ES2337964T3 - Derivados de peptidos o sus sales farmaceuticamente aceptables, su metodo de produccion, uso de dichos derivados y composicion farmaceutica. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que es ciclohexilcarbonilhistamina o N-(imidazolil-4-acetil)-heptilamina o un péptido de fórmula general I: **(Ver fórmula)** o de estructura **(Ver fórmula)** o donde R1 es un radical hidrocarburo C1-C3 sustituido con amino o carboxi, estando el grupo carboxi opcionalmente esterificado y estando el grupo amino opcionalmente sustituido con acilo o el éster de ácido carbónico; o estando el grupo carboxi opcionalmente esterificado y estando el grupo amino opcionalmente sustituido con acilo y el éster de ácido carbónico; o R1 es un radical hidrocarburo C1-C3 sustituido con un residuo indol o un grupo heterocíclico insaturado de 5-6 miembros, comprendiendo el radical hidrocarburo opcionalmente simultáneamente un grupo amino que está sin sustituir o sustituido con acilo, o el éster de ácido carbónico; R2 es hidrógeno o carboxi que está opcionalmente esterificado; R3 es un grupo indol, cuyo grupo está sin sustituir o sustituido con metilo o hidroxi, estando el grupo hidroxi a su vez sin sustituir o sustituido con acilo, alquilo o aralquilo; R3 es un grupo heterocíclico saturado o insaturado de 5-6 miembros que comprende oxígeno, azufre y/o 1-3 átomos de nitrógeno, o un grupo carbocíclico insaturado de 5-6 miembros, o su derivado metilo; o R3 es un radical hidrocarburo C1-C3 sustituido con un amino o carboxi, estando el grupo carboxi opcionalmente esterificado; o R3 es un radical hidrocarburo C1-C3 sustituido simultáneamente con amino, y n es 0-4 y m es 1-5; o su sal farmacéuticamente aceptable, para uso como agente antibacteriano, antitumoral, antiviral o antimetastásico o para aliviar los estados de estrés.
Description
Derivados de péptidos o sus sales
farmacéuticamente aceptables, su método de producción, uso de dichos
derivados y composición farmacéutica.
La presente invención se refiere al campo de la
química bioorgánica y, en particular, se refiere a nuevos
compuestos de dipéptidos y pseudodipeptídos que comprenden un
heterocíclico, por ejemplo, un grupo imidazol o indol, un método
para producir estos y los compuestos conocidos de estructura
similar, así como su uso en medicina como agentes terapéuticos
potenciales.
Se sabe que las sustancias de naturaleza
peptídica poseen una actividad biológica alta. Se describen
diferentes aspectos de acción diferentes de estos compuestos en la
bibliografía: sobre el sistema inmune, sobre la liberación de
histamina a partir de mastocitos peritoneales de rata y basófilos
humanos [Marone G., Columbo N., Soppeisa L. et al., J.
Immunol. (1984), Vol. 133, Nº 3, págs. 1542-1546;
Wise J., Wojtecka-Lukasik E., Maslinski S. Agents
Actions (1986) Vol. 18, Nº 1-2.-págs.
262-265], sobre la producción y el metabolismo de
prostaglandina E_{2} [Duchateau J., Bolla K. Med. Oncol, and
Tumor Pharmacother. (1989), Vol. 6, Nº 6, págs.
19-23] y sobre el desarrollo de una reacción
inmediata [8. Muller E., Sonnenschein B. Naturamed. (1989), Vol. 4,
Nº 4, págs. 34-38].
La hipoxia es vínculo común en la patogénesis de
un gran círculo de afecciones patológicas (estrés, carga física,
radiación, enfermedades alérgicas, ateroesclerosis y las
enfermedades acompañantes, lesiones hepáticas de distinta
etiología, diabetes mellitus y otros). Se sabe que en la hipoxia,
aumenta la peroxidación lípidos (LP) y disminuye el contenido del
citocromo P-450 y la actividad de las enzimas
dependientes de P-450 [Proulx M., Dusouich P. J.
Pharm. Pharmacol. (1995), Vol. 47, Nº 5, págs.
392-397; Barakat M., du Souich P. J. Pharra.
Pharmacol. (1996), Vol 48, págs. 906-910]. Al mismo
tiempo, la actividad de superóxido-desmutasa
aumenta y el contenido de glutatión hepático y la actividad de
glutatión-peroxidasa disminuyen. Estos cambios dan
como resultado un aumento en la cantidad de los radicales de oxígeno
reactivo que pueden causar un daño de las enzimas enlazadas a
membrana, en particular, las enzimas del sistema del citocromo
P-450 [Proulx M., Dusouich P. J. Pharm. Pharmacol.
(1995), Vol. 47, Nº 5, págs. 392-397]. La LP es un
proceso fisiológico importante que se produce continuamente en la
membrana celular y normalmente juega un papel importante en la
actividad vital de las células, por ejemplo, durante la sinstesis de
prostaglandina así como en la fagocitosis [Sokolov E.I. Diabetes
mellitus and atherosclerosis. Moscú, Nauka publishers (1996), 405
pág.]. Sin embargo, como antecedentes al desarrollo de hipoxia
tisular, este proceso se vuelve poco controlable y se forma una
gran cantidad de compuestos de radicales libres, que no tienen
tiempo para la neutralización. El desarrollo de la acidosis va
acompañado de la inducción del citocromo P-450 2E1
que muestra una fuerte actividad cuando se forman peróxidos de
lípidos que promueven el aumento de LP a un grado aún mayor
[Bestervelt L.L., Vaz A.D.N., Coon M.J., Proc. Nat. Acad. Sci. USA.
(1995), Vol. 92, Nº 9, págs. 3764-3768]. La
normalización de LP puede servir como un criterio importante en la
terapia de dichas enfermedades.
Se sabe que el cambio en el estado del sistema
del citocromo P-450 hepático está estrechamente
relacionado con su función antioxidante. El estudio de este
problema tiene un carácter empleado ya en muchas enfermedades
(ateroesclerosis, cirrosis, hepatitis, alcoholismo y otras) altera
el metabolismo de lípidos produciendo un aumento posterior en la
peroxidación de lípidos (LP).
Se ha demostrado que se produce desarrollo de
las reacciones alérgicas experimentales frente al fondo de la
reducción del contenido de oxigenasa terminal y el estado
desestabilizado de los componentes del sistema de monooxidasa
hepático, valorado por la capacidad renovada de los citocromos
B_{5} y P-450 [Krzeczkowska V.V., Máltsev G.Y.,
Marokko I.N. The 4th All-Union Symposium on Medical
Enzymology (1983), p. 137]. El cambio del contenido y en la
relación de los grupos de citocromos P450B y P450L del hígado está
relacionado con el cambio en la duración del sueño del Hexenal, el
status hormonal y la intensidad de las manifestaciones del choque
anafiláctico en los conejillos de Indias [Marokko I.N., Krzeczkowska
V.V., Málikova N.A., Izótov M.V., Benedíktova S.A., Spiridónova
S.M. Boletín de Medicina Experimental- 1991,- Nº 8.- pág.
200-202]. La activación de los fermentos del sistema
de citocromo P-450 por los inductores de tipo de
fenobarbital implica el debilitamiento de la intensidad de las
manifestaciones de reacciones alérgicas experimentales [Marokko
I.N., Krzeczkowska V.V., Málikova N.A., Izótov M.V., Benedíktova
S.A., Spiridónova S.M. Boletín de Medicina Experimental.- 1991,- Nº
8.- pág. 200-202.]. Al mismo tiempo, al introducir
en los animales sensibilizados la metirapona, inhibidor del sistema
de citocromo P-450 y de la síntesis del cortizol se
registra la intensificación del broncoespasmo [Fornhem C, Kumlin
M., Lundberg J.M., Alving K. Eur. Resp. J.- 1995.- vol. 8.- Iss 7.-
págs. 1100-1109; Fornhem C, Lundberg J.M., Alving K.
Eur. Resp. J.-1995.-vol. 8.- Iss 6.- págs.
928-937]. El estado de sensibilización en los
hombres y en los animales experimentales va acompañado de la
disminución del contenido de glucocorticoides en la sangre y la
orina. La normalización de la cantidad de hormonas de la corteza de
la cápsula suprarrenal conlleva la mejora del cuadro clínico de la
enfermedad en los hombres y la reducción de la intensidad de
manifestación de las reacciones alérgicas en los animales [Marokko
I.N., Krzeczkowska V.V., Málikova N.A. Materiales de la Conferencia
de la URSS. "Citocromo P-450 y modificación de
macromoléculas". - Yalta.- 1989.-pág. 339; Macharadze D.S.,
Marokko I.N., Balabolkin I.I., Yujtina N.V., Málikova N.A.
Pediatría.- 1994.- Nº 3.-pág. 9-12], y la reducción
de su cantidad, conlleva su intensificación [Fornhem C., Kumlin M.,
Lundberg J.M., Alving K. Eur. Resp. J. - 1995. - vol. 8. - Iss 7. -
págs. 1100-1109; Fornhem C, Lundberg J.M., Alving K.
Eur. Resp. J.-1995.-vol. 8.- Iss 6.- págs.
928-937].
Los metabolitas del ácido araquidónico (AA),
formados en el sistema de citocromo P-450 poseen
varios efectos biológicos, en particular, el de dilatación de vasos
y bronquios [Knickle L.C, Bend J.R. Mol. Pharmacol.- 1994.- vol.
45.- Iss 6.- págs. 1273-1280; Quiroga J., Prieto J.
Pharmacol. Therap.- 199.3.-35 vol.58.- Iss 1.- págs.
67-91; Ma Y.H., Gebremedhin D., Schwartzman M.L.
et al., Circulation Research.- 1993.- vol.72.- Iss 1,- págs.
126-136], el citoprotector [Quiroga J., Prieto J.
Pharmacol. Therap.- 1993.-vol.58.- Iss 1.- págs.
67-91], potencian la síntesis de prostaglandinas
E_{2} [Carroll M.A., Balazy M., Margiotta P., Falck J.R., Mcgiff
J.C. J. BIOL. CHEM. - 1993. - 5 vol. 268.- Iss 11,- págs.
12260-12266; Sakairi Y., Jacobson H.R., Noland
T.D., Capdevila J.H., Falck J.R., Breyer M.D./7 AMER. J.
PHYSIOL-RENAL. FL. ELECT. - 1995.- Vol. 37.- Iss
5.- págs. F931-F939] y otros. Además, el efecto
vaso-dilatador de la AA se potencia por la
introducción del fenobarbital, conocido inductor del sistema
monoxídico del hígado [Oyekan A.O. Eur J Pharmacol.- 1995.- vol.
277.- Iss 2-3.- págs. 123-132].
Adem's, el metabolita
P-450-dependiente, ácido nuevo
AA-5,6-epoxieicosatrienoico
(5.6-EET), potencia la síntesis y secreción de PGE2
[Sakairi Y., Jacobson H.R., Noland T.D., Capdevila J.H., Falck
J.R., Breyer M.D. Amer. J. Physiol-Renal.Fl. Elect.
- 1995. - Vol. 37.- Iss 5.- págs. F931-F939.]. De
un lado, la PGE2 inhibe la expulsión anafilactogénica de histamina y
otros materiales alérgicos e inflamativos de las células Ehrlich.
Del otro lado, la histamina potencia la síntesis PGE_{2}, lo cual
es considerado uno de los mecanismos de retroacción en las
reacciones alérgicas e inflamativas.
En el desarrollo de las reacciones alérgicas
tiene especial importancia la modificación de la marcha de la fase
patoquímica de las reacciones alérgicas que en gran medida se
determina por el estado de monocélulas-blancos de
la alergia de 1ª orden (basófilos y células ehrlich), cuya
peculiaridad importante es su capacidad de acumular y sintetizar
compuestos biológicamente activos, particularmente, la histamina.
Con la reacción IgE- y/o IgG-mediata al antigén son
esas células las que participan en la secreción de sustancias
activas y determinan la marcha de la fase patoquímica y el grado de
expresividad del cuadro clínico de la alergia [ejemplo
En/Mediadores: liberación y funciones. En el libro.: Inmunología.
Bajo redacción de W. Paul.- Moscú- Ed. Mir- 1989.- vol.3.-
pág.170-247; Chakravarty N.K. In: The mast cell: Its
role in heaelth and disease. ed. J Pepys.- 1979.- p.
38-46]. La importancia de estudiar la secreción de
la histamina por células Ehrlich se determina asimismo por el hecho
de que en las células Ehrich está presente el fermento:
transglutaminasa (EC 2,3,2,13) que realiza la síntesis de la
gamma-glutamil histamina de proteína combinada,
análogo cercano de los compuestos que se ofrecen. Se muestra que el
estímulo de las células Ehrlich producen aumento de la actividad de
la transglutaminasa y del contenido de la
gamma-glutamil histamina de proteína combinada en
las células Ehrlich [Fesus L, Szucs E., Barrett K. et al.,
J. Biol. C. Chem.- 1985.- Nº 25.- págs.
13771-13778].
Se muestra que en las enfermedades del hígado,
por ejemplo la hepatitis y cirrosis, se reduce la actividad
funcional del sistema de citocromo P-450 del hígado
y aumenta la OPL [Imaoka S., Sugiyama T., Taniguchi N., Funae Y.
CARCINOGENESIS.- 1993.- vol. 14.- Iss 1,- págs.
117-121; Debinski H.S., Lee C.S., Danks J.A.,
Mackenzie P.I., Desmond P.V. GASTROENTEROLOGY.- 1995.- vol. 108.-
Iss 5.- págs. 1464-1469]. Los cambios de la
estructura y funciones del hígado, típicos para dichas patologías,
se registran en los animales experimentales al introducir el
carbono 4-cloroso (CCl_{4}). El efecto de esta
sustancia se debe al deterioro de las estructuras membránicas de
las células a causa el aumento de la OPL, lo cual es uno de los
factores de inactivación de los fermentos del sistema de citocromo
P450 del hígado [Kapil A., Koul I.B., Suri O.P. Phytother. Res.-
1995.- vol. 9.- Iss 3.- págs.189-193].
La modificación del metabolismo de lípidos
cuando la ateroesclerosis está relacionada con el cambio del estado
del sistema de citocromo P450 [Wolfgang GHI, Robertson DG, Welty DF,
Metz AL FUND APPL TOXICOL.- 1995.- vol. 26.- Iss 2.- págs.
272-281; Remaley A.T., Schumacher U.K., Amouzadeh
H.R., Brever H.B., Hoeg J.M. J LIPID RES.- 1995.- vol. 36.- Iss 2.-
págs. 308-314; Stegeman J.J., Hahn M.E., Weisbrod
R., Woodin B.R., Joy J.S., Najibi S., Cohen R.A. MOL PHARMACOL.-
vol. 47.- Iss 2.- págs. 296-306]. Se sabe que la
manifestación más frecuente de la ateroesclerosis es la enfermedad
isquémica del corazón que ocupa el primer lugar entre las causas de
la mortalidad de la población adulta del planeta. Una de las
alteraciones más importantes en esta enfermedad es la alteración
del metabolismo lipídico que se expresa en el aumento del contenido
en el plasma sanguíneo de de el colesterol en la composición de
lipoproteínas de baja densidad (LPBD) y de muy baja densidad
(LPMBD) que se llaman "aterogénicas", con la disminución
simultánea de la cantidad de las lipoproteínas
"antiaterogénicas" de alta densidad (LPAD).
Se muestra que la modificación del contenido y
la correlación de lípidos en el plasma refleja sus cambios en las
estructuras membránicas de los órganos parenquimatosos. La
composición de las membranas de la célula, por ejemplo, las
microsomales, depende directamente de la composición de la ración de
los animales experimentales [Wade A., Harred W. Feder.
Proct.-1976.- vol. 55.- págs. 2475-2479]. La
introducción de colesterol en los animales suscita su acumulación
en las membranas de las células disminuyendo su fluidez, lo cual, a
su vez, conduce a la modificación del estado funcional de los
fermentos [Buters J.T.M., Zysset T., Reichen J. Biochem.
Pharmacol.- 1993.- vol. 46.- Iss 6.- págs. 983-991;
Reichen J., Buters J.T.M., Sojcic Z., Roos F.J. Experientia.-
1992.- Vol. 48.- Iss 5.- págs. 482-486; Taton Y.N.
Obesidad,
\hbox{patofisiología, diagnóstico, tratamiento. -
Varsovia. - Editorial médica polaca. - 1981. - 364 pág.].}
Se muestra que con la diabetes dependiente de
insulina, a la par con la alteración del metabolismo de
carbohidratos, se expresa la modificación del metabolismo de
cetonas y ácidos grasos, lo cual causa el desequilibrio del sistema
de monoxigenasas microsomales del hígado y contribuye a una
alteración aún mayor del status hormonal del organismo [Shimojo N.,
Ishizaki T., Imaoka S., Funae Y., Fujii S., Okuda K. BIOCHEM
PHARMACOL.- 1993.- vol. 46.- Iss 4.- págs.
621-627]. Además, se registra una modificación del
metabolismo de lípidos que se expresa en el aumento de el
colesterol en las fracciones de LPBD y LPMBD y la reducción de el
colesterol en la fracción de LPAD, así como la intensificación
considerable de la oxidación perioxídica de lípidos [Sokolov E. I.
Diabetes sacarina y ateroesclerosis.-Moscú- Ed. Naúka.- 1996.- 405
pág.]. Además, los cambios del metabolismo de lípidos con la
diabetes mellitus coinciden prácticamente por completo con la
modificación cuando ateroesclerosis. Uno de los indicadores más
importantes de la estabilización del proceso patológico con diabetes
se refiere al contenido de glucosa en la sangre. Se sabe que
prácticamente todos los preparados antidiabéticos reducen el
contenido de glucosa en la sangre no sólo en los enfermos sino
también en las personas sanas. La fagocitosis es un eslabón
importante en el mantenimiento de la homeostasis del medio interior
del organismo. Las células en fagocitosis están representadas en el
organismo en gran cantidad. En particular pertenecen a ellas los
neutrófilos de la sangre periférica y los macrófagos (MF). La
activación de los MF es uno de los mecanismos adaptivos de la
homeostasis que contribuyen a la eliminación de los patógenos y la
tolerancia contra tumores [Inmunología.- bajo red. de W. Paul-
Moscú- Ed. Mir.- 1989.- vol. 3.- pág.202-228;
Páltsev M. A., Ivanov A.A. Interacciones intercelulares,- Moscú-
Ed. Medicina- 1995.- 224 pág.]. Se sabe que esas células poseen en
la membrana externa receptores de glucocorticoides [Mayanski A.N.,
Pikuza O.I. Aspectos clínicos de la fagocitosis. Kazán.- Ed.
MAGARIF- 1993.-192 pág.]. Uno de los mecanismos de activación de
neutrófilos y MF corresponde al aumento del contenido de las
hormonas glucocorticoides.
La expulsión de hormonas de la corteza de la
cápsula suprarrenal sirve de señal para movilizar los neurófilos de
la médula, lo cual es un mecanismo que relaciona la médula con las
reacciones que limitan estrés [Mayanski A.N., Pikuza O. I. Aspectos
clínicos de la fagocitosis. Kazán. - Ed-. MAGARIF.- 1993. -192
pág.].
Se muestra que las formas activas de neutrófilos
y basófilos sintetizan y liberan en el medio extracelular
sustancias biológicamente activas, tales como el peróxido de
hidrógeno, la peroxidasa y otras, que inactivan leucotrienas, que
condicionan el bronco espasmo con enfermedades alérgicas, desempeñan
un rol importante en la protección contra infecciones y el
mantenimiento de la homeostasis del organismo [Inmunología.- bajo
red. de W.Paul- Moscú.- Ed. Mir.- 1989.- vol. 3.- pág.
202-228; Henderson W.R., Jorg A., Klebanoff S.J. J.
Immunol.- 1982.- vol. 128.- Nº 6. - págs.
2609-2613]. Además, hay quienes consideran [Sokolov
E. I. Diabetes sacarina y ateroesclerosis.-Moscú- Ed. Naúka.-
1996.- 405 pág.] que uno de los eslabones clave en la formación de
la placa de ateroma es la transformación de macrófagos cuando los
animales consumían cantidades elevadas de colesterol y, por
consiguiente, la alteración de la actividad funcional de los
macrófagos, en particular, de las células de Kupfer [Remaley A.T.,
Schumacher U.K., Amouzadeh H.R., Brever H.B., Hoeg J.M. J LIPID RES.
- 1995.- vol. 36.- Iss 2.- págs. 308-314].
Se sabe que el proceso de formación y evolución
de metástasis se determina bastante por el estado de la coagulación
intravascular de la sangre, y a raíz de la evolución de la
enfermedad neoformativa y varios factores acompañantes se activa el
sistema de coagulación de la sangre. Se muestra que el empleo de
anticoagulantes es capaz de recuperar el balance de los sistemas
coagulante y anticoagulante de la sangre [Búrov Y.V., Sirkin A.B.,
Kinzirski A.S, Koroliova A.M. Producción
químico-farmacéutica. - Información de
resumen.-1992.- edición 11, - 42 pág.].
La actividad de los neutrófilos de la sangre con
las infecciones graves se reduce bruscamente, lo cual puede ser
causa de la generalización de la infección, y el aumento del número
de fagocitos activados a los que pertenecen los neutrófilos de la
sangre periférica y los macrófagos peritoneales aumenta la
probabilidad de que la infección bacterial transcurra sin
complicaciones [Mayanski A.N., Pikuza O. I. Aspectos clínicos de la
fagocitosis. Kazán. - Ed- MAGARIF.- 1993.-192 pág.]. La protección
antimicrobiana, antivirus y antioncótica del organismo está
directamente relacionada con los efectos de activación de los
neutrófilos y macrófagos.
Se conocen los compuestos,
\beta-alanilhistamina y
\gamma-aminobutirilhistamina, que corresponden a
la fórmula general (I), poseen la actividad antioxidante in
vitro, así como las actividades cicatrizante y anticataractal
obtenidas por los métodos de química peptídica clásica [Evstignéeva
R. P., Zneltújina G.A., Ogrel S.A., Nebolsin V.E./Síntesis de
pseudopéptidos sobre la base de aminas biogénicas. Informes de la AC
de la URSS.-25 1995.- vol. 345.- Nº 4. - pág.
493-495; Me Caman M. W., Stetzler J.,Clark
B./Synthesis of y-Glutamyldopamine and Other
Peptidoamines in the Nervous System of Aplysia californica./I
J. Neurochem.- 1985.- vol. 45.- Nº 6.- págs.
1828-1835; Evstignéeva R.P., Zheltújina G.A.,
Aguéeva E.A., Vabizháev M.A. Actividad lipopiroxidásica de la
carnosina y carcinina. Informes de la AC de la URSS.- 1993.- vol.
333. - Nº 1,- pág. 104-106], así como por el método
fermentativo: combinando el aminoácido y la histamina en presencia
de una enzima de tipo de hidrolasa [Patente
Fr.-2701947.-02.09.94.].
Los ésteres de derivados de
N-acilo de dipéptidos de
\gamma-glutamilo producidos en el documento US
4.568.489 [del 4 de febrero de 1986] usando un método con DCC, son
los más cercanos por estructura a los compuestos que se reivindican
de naturaleza dipeptídica; sin embargo, se sabe que el método con
DCC que se usa para producir dichos compuestos puede dar como
resultado reacciones adversas que implican los grupos imidazol e
indol [Schroeder E., Lubke K. Peptides, Moscú, MIr publishers
(1967), p. 249]. Se describen compuestos pseudopeptídicos que
tienen un grupo imidazol y que poseen propiedades antioxidantes. Sin
embargo, ninguno de los trabajos indicados anteriormente describe
los derivados de dipéptidos de imidazol novedosos reivindicados, los
procesos para su síntesis ni su amplio espectro de acción.
La presente invención proporciona un compuesto
que es ciclohexilcarbonilhistamina o
N-(imidazolil-4-acetil)-heptilamina
o un péptido de fórmula general I:
o de
estructura
o
donde
- \quad
- R_{1} es un radical hidrocarburo C_{1}-C_{3} sustituido con amino o carboxi, estando el grupo carboxi opcionalmente esterificado y estando el grupo amino opcionalmente sustituido con acilo o el éster de ácido carbónico; o
- \quad
- R_{1} es un radical hidrocarburo C_{1}-C_{3} sustituido simultáneamente con amino y carboxi, estando el grupo carboxi opcionalmente esterificado y estando el grupo amino opcionamlente sustituido con acilo o el éster de ácido carbónico; o
- \quad
- R_{1} es un radical hidrocarburo C_{1}-C_{3} sustituido con un residuo de indol o un grupo heterocíclico insaturado de 5-6 miembros comprendiendo opcionalmente simultáneamente un grupo amino que está sin sustituir o sustituido con acilo o el éster de ácido carbónico;
- \quad
- R_{2} es hidrógeno o carboxi que está opcionalmente esterificado;
- \quad
- R_{3} es un grupo indol, cuyo grupo está sin sustituir o sustituido con metilo o hidroxi, estando el grupo hidroxi a su vez sin sustituir o sustituido con acilo, alquilo o aralquilo; o
- \quad
- R_{3} es un grupo heterocíclico saturado o insaturado de 5-6 miembros que comprende oxígeno, azufre y/o 1-3 átomos de nitrógeno, o un grupo carbocíclico insaturado de 5-6 miembros o su derivado metálico; o
- \quad
- R_{3} es un radical hidrocarburo C_{1}-C_{3} sustituido con un amino o carboxi, estando el grupo carboxi opcionalmente esterificado; o
- \quad
- R_{3} es un radical hidrocarburo C_{1}-C_{3} sustituido simultáneamente con amino y carboxi,
- \quad
- N es 0-4 y m es 1-5;
- \quad
- o su sal farmacéuticamente aceptable, para uso como un agente antibacteriano, antitumoral, antiviral o antimetastásico, o para aliviar las condiciones de estrés.
Preferiblemente, el compuesto de la invención es
para uso junto con un agente citoestático o radioterapia. En otra
realización preferida, cuando un compuesto de la invención es para
uso antiviral, es para uso en el tratamiento de influenza o
VIH.
La presente invención también proporciona nuevos
compuestos (que se han definido anteriormente). Estos nuevos
compuestos poseen (i) efectos antioxidantes, antirradicales,
reguladores de lípidos, hipoglicémicos, antinflamatorios,
inmunomoduladores, antialérgicos, antihipoxídicos y
antiateroescleróticos, (ii) la capacidad para inducir el sistema de
citocromo P-450, modular el metabolismo del ácido
araquidónico, hormonas adrenocorticales, reducir el nivel secreción
de histamina dependiente de antigenos mediante células peritoneales,
modular la actividad de macrófagos y células asesinas naturales y
el sistema de interferon (de citoquinas), (iii) actividad
relacionada con el control de los síntomas de y la prevención del
asma y enfisema pulmonar, (iv) propiedades cicatrizantes, (v)
actividad relacionada con el control de síntomas de lesión de la
piel, por ejemplo, psoriasis, eccema, venas varicosas, (vi)
actividad relacionada con la prevención de trastornos disfuncionales
incluyendo aborto inminente, hemorragias uterinas disfuncionales y
amenorrea, (vii) actividad relacionada con el control de los
síntomas de enfermedad isquémica, obesidad, diabetes mellitus,
(viii) propiedades hepatoprotectoras, (ix) actividad relacionada
con el control de daño por radiación, lesiones hepáticas incluyendo
lesiones tóxicas, hepatitis, cirrosis, alcoholismo, (x) la
capacidad para prevenir el desarrollo de y para los síntomas de
cambios gerontológicos incluyendo cataratas, cambios en tegumentos
cutáneos, psicosis senil, enfermedad de Alzheimer y Parkinson, (xi)
actividad antibacteriana y antivirus incluyendo actividad frente a
la infección por VIH, (xii) actividad antitumoral y antimetastásica
incluyendo cuando se administra junto con agentes citoestáticos y
radioterapia, y (xiii) propiedades adaptogénicas útiles para superar
los estados de estrés incluyendo una carga fisiológica intensa.
En una realización preferida, la presente
invención proporciona un compuesto que es un péptido de fórmula
general (I) de la reivindicación 1, en la que
- \quad
- R_{1} es NH_{2}-CH_{2}-, n es 1-4; o
- \quad
- R_{1} es HOOC-CH_{2}-, n es 0-3; o
- \quad
- R_{1} es R_{2}-OCO-CH_{2}-, n es 0-3; Rz es -H o un radical hidrocarburo C_{1}-C_{3}; o
- \quad
- R_{1} es HOOC-CH_{2}-(CH_{3})C(Rv)-, Rv es H, -CH_{3}; o
- \quad
- R_{1} es C_{6}H_{5}CH_{2}-OCO-NH-CH_{2}-, n es 1-2; o
- \quad
- R_{1} es RX-CONH-CH_{2}-, n es 1-4, Rx es un radical hidrocarburo C_{1}-C_{3}; o
- \quad
- R_{1} es CH_{3}CONH-CH(COOM-, n es 1-2; o
- \quad
- R_{1} es CH_{3}CONH-CH([CH_{2}]_{k}COOH)-, n es 0, k es 1-2; o
- \quad
- R_{1} es NH_{2}-CH([CH_{2}]_{k}COOH)-, n es 0, k es 1-2; o
- \quad
- R_{1} es HOOC-CH(NH_{2})-, n es 0; o
- \quad
- R_{1} es HOOC-CH(NH_{2})-, n es 1-2; o
- \quad
- R_{1} es CH_{3}OOC-CH(NH_{2})-, n es 1-2; o
- \quad
- R_{1} es (CH_{3})_{3}C-OCONH-CH(COOCH_{2}-C_{6}H_{5})-, n es 1-2; o
- \quad
- R_{1} es -CH_{2}-4-imidasolilo, -CH_{2}-3-indolilo, n es 0-1; o
- \quad
- R_{1} es Rb-CH_{2}-CH(NHRy)-, Rb representa -4-imidasolilo, -3-indolilo, R_{y} es terc-butiloxicarbonilo, benciloxicarbonil, H-, n es 0;
- \quad
- R_{2} es -H, -COOH, -COOR_{2}, donde Rz es H o un radical hidrocarburo C_{1}-C_{3}; y
- \quad
- m = 1; o
- \quad
- R_{3} es - CH_{2}-NH_{2}, m = 1-2; o
- \quad
- R_{3} es - CH_{2}-COOH, m = 1-2; o
- \quad
- R_{3} es -CH(NH_{2})-COOH, m = 1-2,
donde R_{4} = -H, -OH, -OCH_{3} o
-OCH_{2}C_{6}H_{5}, para uso como un agente antibacteriano,
antiviral o antimetastásico, o aliviar los estados de estrés.
Los representantes característicos de los nuevos
dipéptidos y pseudopéptidos que corresponden a la fórmula general
(I) son los que se presentan a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, la presente
invención proporciona un compuesto de Fórmula general (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
que se selecciona entre los
siguientes
compuestos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
para uso como un agente
antibacteriano, antiviral o antimetastásico o para aliviar los
estados de
estrés.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización particularmente preferida, la
presente invención proporciona un compuesto de estructura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ó su sal farmacéuticamente
aceptable para uso como un agente antibacteriano, antiviral,
antitumoral o antimetastásico o para aliviar los estados de
estrés.
\newpage
En otra realización preferida de la presente
invención, el compuesto que es para uso como un agente
antibacteriano, antiviral, antitumoral o antimetastásico o para
aliviar los estados de estrés es un compuesto conocido de fórmula
(I) en la que (i)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y (a) R_{1} =
NH_{2}-CH_{2}-, n = 1-2, R_{1
=} CH_{3}CONH = CH(COOH)=, n = 1; R_{1} =
CH_{3}CONH-CH(CH_{2}COOH)-, n = 0, o
R_{1}-CO = piroglotamilo, n = 0, y R_{2} = -H o
(b) R_{1} = NH_{2}-CH(COOH)-, n = 2 y
R_{2} =
COOH,
o (ii) R_{1} = NH_{2}CH_{2}-, n =
1-2, o R_{1} =
NH_{2}-CH(COOH)-, n = 2, y R_{2} = H.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{4} = -H, -OH,
-OCH_{3} o -OCH_{2}C_{6}H_{5} y m =
1.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto más preferido de esta realización
de la presente invención, el compuesto que es para uso como un
agente antibacteriano, antiviral, antitumoral o antimetastásico o
para aliviar los estados de estrés corresponde a la fórmula general
(I), en la que (i)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
m=1
y (a) R_{1} =
NH_{2}-CH_{2}-, n = 1-2, R_{1}
= NH_{2}-CH(COOH)-, n = 2, R_{1} =
CH_{3}CONH-CH(COOH)-, n = 1, R_{1} =
CH_{3}CONH-CH(CH_{2}COOH)-, n = 0, o
R_{1}-CO- = piroglutamilo, n = 0, y R_{2} = -H,
o (b) R_{1} = NH_{2}-CH(COOH)-, n =
1-2, y R_{2} = COOH, o (ii) R_{1} =
NH_{2}CH_{2}-, n = 1-2 ó R_{1} =
NH_{2}-CH(COOH)-, n = 2 y R_{2} = H,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y m = 1, en la que R_{4}= -H o
-OH.
\newpage
Los ejemplos característicos de los
pseudopéptidos preferidos conocidos que corresponden con la fórmula
general (I) se presentan a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona nuevos
compuestos. Los nuevos compuestos son de estructura (II), (III),
(IV), (V), (VI^{a}), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X^{a}), (X),
(XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVIII), (XXII), (XXIII),
(XXIV), (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), (XXXIII),
(XXXIV), (XXXV), (XXXVI), (XXXVII), (XXXVIII), (XXXIX),
(XL^{a,b,c}), (XLI), (XLII), (XLIII) o (Q) que se han definido
anteriormente o sus sales farmacéuticamente aceptables. Se prefiere
glutarilhistamina de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o su sal farmacéuticamente
aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona un
nuevo compuesto de la presente invención para uso en un método del
cuerpo humano o animal mediante terapia.
En una realización los nuevos de la presente
invención son para uso como un agente antibacteriano, antiviral,
antitumoral o antimetastásico o para aliviar los estados de
estrés.
En otra realización, los nuevos compuestos de la
presente invención son para uso como un antihipóxico, un regulador
de lípidos o un agente hipoglicémico, para controlar los síntomas de
o prevenir el asma o enfisema pulmonar, para controlar los síntomas
de lesiones cutáneas, psoriasis o eccema, para prevenir el aborto,
hemorragia uterina disfuncional o amenorrea, para controlar los
síntomas de enfermedad isquémica u obesidad, para uso como un
agente hepatoprotector, o para controlar o prevenir los síntomas de
enfermedad gerontológica.
Preferiblemente, en esta realización el nuevo
compuesto de la invención es para uso en el control de lesiones
hepáticas incluyendo lesiones tóxicas, hepatitis, cirrosis o
alcoholismo.
La presente invención también proporciona un
proceso para producir un nuevo compuesto de la presente invención,
cuyo proceso comprende la acilación del grupo amino de un compuesto
amino de fórmula general
NH_{2}-CH(R_{2})-
(CH_{2})_{m}-R_{3} en la que R_{2}, R_{3} y m son como se han definido anteriormente, con, como agente acilante, un compuesto carboxi activado de fórmula general R_{1}-(CH_{2})_{n}-COX, en la que X es un grupo activador.
(CH_{2})_{m}-R_{3} en la que R_{2}, R_{3} y m son como se han definido anteriormente, con, como agente acilante, un compuesto carboxi activado de fórmula general R_{1}-(CH_{2})_{n}-COX, en la que X es un grupo activador.
En un aspecto preferido de este proceso de la
presente invención, R_{1} es HOOC-CH_{2}-, n =
0-3; o R_{1} =
HOOC-CH_{2}-(CH_{3})C(R_{v})-, n
= 1 y R_{v} = -H o CH_{3}; y R_{2} = -H o -COOCH_{3}, el
compuesto carboxi activado es un anhídrido de un ácido dicarbónico y
el proceso se realiza en un disolvente orgánico.
En otro aspecto preferido de este proceso de la
presente invención, donde R_{1} =
-CH_{2}-NH_{2}, n = 1-2;
R_{2} = -H,
o
donde R_{1} =
HOOC-CH(NH_{2})-, n = 1-2;
Y
\newpage
R_{2} = -COOCH_{3} o H; y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
el agente acilante es un
pentafluorfenil éster del ácido
N-benciloxicarbonil-\gamma-aminobutírico
o
N-benciloxicarbonil-j3-alanina
o un \alpha-bencil éster del ácido
N-terc-butil
oxicarbonil-L-glutamínico o
aspártico y en el que el proceso se realiza en un disolvente
orgánico con la escisión posterior del grupo protector
N-benciloxicarbonilo y el
\alpha-bencil éster o
pentafluoro-fenil éster del derivado protegido de un
dipéptido usando hidrogenolisis catalítica, con la escisión
posterior del grupo N-terc-butil
oxicarbonilo en un medio ácido
anhidro.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto preferido de este proceso de la
presente invención, donde R_{1} =
CH_{3}CONH-CH(COOH)- y n =
1-2; ó R_{1} =
CH_{3}CONH-CH([CH_{2}]_{k}COOH)-, n =
0, k = 1-2; o R_{1} =
CH_{3}CONH-CH_{2}-, n = 2-4; y
R_{2}=H,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y m =
1,
el agente acilante es acetato de
p-nitrofenilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de la presente invención pueden
producirse mediante la acilación de una amina o un grupo aminoácido
amino con un grupo carbónico, un grupo dicarbónico o un derivado
aminoácido N-protegido con un grupo carboxi
activado.
La síntesis de dipéptidos y pseudopéptidos que
comprenden el sustituyente N-amino acílico, puede
realizarse de acuerdo con métodos clásicos de química de péptidos,
usando ventajosamente especies activadas, por ejemplo, ésteres de
N-oxisuccinimida. Las realizaciones preferidas
incluyen el uso de ésteres de pentafluorofenilo, que son los
ésteres más activos conocidos. Por tanto, se usan preferiblemente
los derivados activados de ácidos dicarbónicos, sus anhídridos
cíclicos internos.
El grupo \alpha-amino del
componente carboxílico o amino puede protegerse por diferentes
grupos que se usan de forma convencional, preferiblemente un grupo
protector de terc-butiloxicarbonilo (Boc-) o
benziloxicarbonilo (Z-).
Los grupos \alpha-carboxi de
ácido glutámico o asparagínico están preferiblemente protegidos con
un grupo bencilo (Bzl-) y la ornitina con un grupo
terc-butilo.
En los compuestos de fórmula general (I), el
grupo carboxi de la histidina del componente amino puede estar en
la forma de éster metílico o puede permanecer desprotegido.
\newpage
La síntesis de compuestos que contienen un
sustituyente acilo N-amino se muestra en el
siguiente esquema 1:
Esquema
1
donde R_{y} = Boc-, Z-;
NH_{2}-A-CO- =
\beta-Ala-, \gamma-Abu-,
H-L-Glu-OBzl,
H-L- Asp-Obzl;
H-L-Asp-Obzl-;
NH_{2}-B = HA,
H-His-OH,
H-His-OMe, TrpA,
H-Trp-OMe, 5-(OMe)TrpA,
5-(OBzl)TrpA;
NH_{2}-A''-CO=H-L-Glu-,
H-L-Glu-OMe,
n\cdotR_{x}H = HHal (HCl), CF_{3}COOH, n=1,
2.
La fase 1 se realiza, por regla general, en el
medio de un disolvente aprotónico deshidratado, preferentemente
dimetilformamida (DMF), durante 18-48 horas a
temperatura ambiente, excepto cuando se produzca el dipéptido
Boc-L-Glu(L-His)-OBzl.
Típicamente, ésta última se obtiene por acción de un exceso triple
de
Boc-L-Glu(ONSu)-OBzl
en histidina desprotegida en medio dioxánico acuoso (1:1). La
ventaja de este método está en la simplificación de los procesos
debido al reducido número de fases (ausencia de la necesidad de
introducir y retirar la C-protección de histidina)
y la posibilidad de producir el dipéptido cuando uno o dos grupos
carboxi se protegen selectivamente.
Si es necesario, los grupos protectores del
compuesto intermedio
R_{y}-NH-A-CONH-B
pueden retirarse por escisión de acuerdo con las fases 2 y 3.
La fase 2 puede realizarse por medio de
hidrogenolisis catalítica únicamente en el caso en el que R_{y} =
Z- y NH_{2}-A-CO- =
\beta-Ala-\gamma-Abu-.
La fase 3, si es necesario, puede realizarse en
dos modificaciones diferentes, cuando los grupos -Boc- y Bzl están
presentes en el compuesto intermedio
R_{y}-A-CONH-B,
concretamente para los derivados de ácidos glutámicos y aspárticos.
El método 3.1 consiste en la retirada por escisión acidolítica del
grupo protector N^{\alpha}-Boc, por ejemplo
mediante el efecto de clorhidrato en un disolvente orgánico que es
ventajosamente dioxano, metanol o sus mezclas; o ácido
trifluoracético. La hidrogenolisis catalítica puede usarse para
retirar posteriormente el grupo Bzl (3.2). De acuerdo con el método
3.3, en primer lugar se realiza la hidrogenolisis y después se
retira por escisión acidolítica la
N^{\alpha}-protección (3.4). Como resultado de la
fase 3, se producen productos en la forma de sales respectivas.
Si es necesario producir compuestos diana en
forma de bases libres, se realiza la fase 4.
Si un compuesto no comprende grupos carboxi
desprotegidos, pueden producirse en forma de una base libre
añadiendo base orgánica (Et_{3}N) o inorgánica (NaOH), con el
aislamiento posterior de la sal de bases del producto diana.
Además, puede usarse cromatografía de intercambio iónico para
conseguir este objetivo, de acuerdo la técnica que se describe en
Evstignéeva R.P., Zheltukhina G.A., Ogrel' S.A., Nebol'sin V.E.
Síntesis de pseudopeptides based on biogenic amines., Reports of
the Academy of Sciences of the USSR (1995), Vol. 345, Nº 4, págs.
493-495.
Además, si es necesario necesario, el compuesto
puede producirse en forma de una base, en forma de una sal de
metales de transición con formación de un quelato.
El compuesto conocido
\gamma-L-Glu-HA
[Konishi H., Kakiraoto Y. Formation of
\gamma-Glutamylhistamine from histamine in rat
brain, J. Neurochem. (1976), Vol. 27, págs.
1461-1463], cuyo compuesto de nivel de estructura
(V) puede producirse como se ha definido anteriormente, puede
producirse usando el método que se describe en Mc Caman M.W.,
Stetzler J., Clark B. Synthesis of
\gamma-Glutamyldopamine and Other Peptidoamines
in the Nervous System of Aplysia californica, J. Neurochem.
(1985), Vol. 45, Nº 6, págs. 1828-1835. El derivado
de N-acetil
\gamma-L-Glu-HA-Ac-\gamma-L-Glu-HA
(V), puede producirse de acuerdo con el esquema 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
2
\vskip1.000000\baselineskip
El esquema 2, que introduce un grupo grupo
acetilo en un dipéptido, es ventajoso sobre el uso de un derivado
N-acetilo de ácido glutámico como un producto
inicial para la creación de un enlace de péptido, ya que reduce la
posibilidad de racemización. El uso de acetato de
p-nitrodenilo es preferible en comparación con
anhídrido acético, ya que su uso no va acompañado de reacciones
colaterales del grupo imidazol, que consiste en la formación de un
derivado de acetilo mediante un imidazol y la sal respectiva del
anhídrido acetilo, con la liberación de una molécula de ácido
acético.
La síntesis de compuestos de la presente
invención que comprende un residuo de ácido dicarbónico puede
realizarse usando diferentes métodos, preferiblemente de acuerdo
con el esquema 3, donde se usa un anhídrido cíclico interno como un
compuesto carboxi C-activado.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
3
en la que n = 0-1 y
NH2B = HA,
H-His-OMe,
o
en las que R_{4} = -H, -OH,
-OCH_{3},
-OCH_{2}C_{6}H_{5}.
En caso en el que no esté disponible un
anhídrido apropiado, por ejemplo, para ácido adipínico, la síntesis
del pseudopéptido puede realizarse usando DCC. En este caso, en
primer lugar se realiza una reacción entre ácido dicarbónico y DCC,
siendo la proporción 2:1 M/M y, después, se añade el componente
amino (amina o un derivado aminoácido).
La síntesis de compuestos de la presente
invención que comprenden un residuo N-acilo de un
ácido graso puede realizarse usando anhídrido de cloro.
La presente invención también proporciona una
composición farmacéutica o cosmética que comprende un vehículo o
diluyente farmacéuticamente aceptable y, como un compuesto activo,
un nuevo compuesto de la presente invención como se ha definido
anteriormente. Dichas composiciones poseen efectos antihipóxicos,
antioxidantes, antirradicales, reguladores de lípidos,
hipoglicémicos, antiagregantes, inmunomoduladores, cicatrizantes,
antialérgicos, antiasmáticos, antivirales, antibacterianos,
antitumorales, antimetastásicos y adaptógenos y la capacidad de
inducir el sistema del citocromo P-450 hepático,
para modular el metabolismo del ácido araquidónico y las hormonas
adrenocorticales, reducir el nivel de secreción de histamina
dependiente de antígeno mediante mastocitos, modular la actividad
de macrófagos, células asesinas naturales y el sistema de interferon
(citoquinas) y para prevenir abortos y hemorragias uterinas
disfuncionales, y los síntomas de diabetes mellitus, obesidad,
enfermedad isquémica del corazón, estados de estrés, hepatitis,
cirrosis, lesiones tóxicas de hígado, alcoholismo, daños por
radiación y cambios gerontológicos.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden usarse en forma de preparaciones farmacéuticos
(por ejemplo, en formas solida, semisólida y líquida), que
comprenden un nuevo compuesto de la presente invención como un
ingrediente activo mezclado con un vehículo o excipiente orgánico o
inorgánico, adecuado para administración por vía intramuscular,
intravenosa, intranasal, oral, sublingual, inhalación o
intrarrectal. El ingrediente activo puede incluirse en la
composición farmacéutica junto con vehículos no toxicos
farmacéuticamente aceptables, adecuados para para producir
soluciones, comprimidos, gránulos, cápsulas, supositorios,
emulsiones, suspensiones, pomadas y cualquier otro producto
farmacéutico. Pueden usarse agua como vehículos agua, glucosa,
lactosa, goma arábiga, gelatina, almidón, trixilitol de magnesio,
almidón de maíz, urea y otros vehículos adecuados para preparar
preparaciones sólidas, blandas o líquidas. En este caso, pueden
usarse estabilizadores, espesantes, colorantes y saporíferos como
suplementos.
El compuesto diana activo se introduce en una
composición farmacéutica en una cantidad suficiente para conseguir
el efecto necesario dependiendo de la nosología, el ciclo y la
gravedad de la enfermedad.
En la producción de una forma farmacéutica
unitaria, la cantidad de ingrediente activo que se usa en
combinación con un vehículo, puede variar dependiendo del receptor
sujeto a la terapia y del método de administración particular.
Por lo tanto, por ejemplo, en el uso de un
compuesto de la presente invención en forma de una solución para
inyección, el contenido del ingrediente activo es del
0,01-0,03%. Como un diluyente, puede usarse una
solución de cloruro sódico al 0,9%, agua destilada, una solución de
novocaína para inyecciones, solución de Ringer o una solución de
glucosa. Si se usa un compuesto de la presente invención en forma de
un comprimido en supositorio, la cantidad de ingrediente activo es
de 3,0-30,0 mg por forma farmacéutica unitaria. Para
comprimidos y supositorios, puede usarse cualquier base
farmacéuticamente aceptable como un excipiente farmacéutico.
Para tratar y prevenir enfermedades y afecciones
relacionadas con alergia, inflamación, asma bronquial, enfisema
pulmonar, psoriasis, eccema, venas varicosas, trastornos
disfuncionales, aborto inminente, hemorragias uterinas,
ateroesclerosis, enfermedad isquémica, obesidad, diabetes mellitus,
infecciones (virales y bacterianas), oncología, lesiones hepáticas
(hepatitis, cirrosis), abuso de alcohol y tóxicos, radiación y
lesiones gerontológicas así como, en el caso de que sea necesario,
acelerar la cicatrización de heridas, ejercer un efecto
adaptogénico, inducir el sistema de citocromo P-450
del hígado, modular el metabolismo del ácido araquidónico y las
hormonas adrenocorticales, reducir el nivel de secreción de
histamina dependiente de antígeno por mastocitos y modular la
actividad de macrófagos, células naturales asesinas y los sistemas
de interferón (citoquinas), los compuestos de la presente invención
como se han definido anteriormente pueden administrarse por vía ora,
local, parenteral, por inhalación o por vía rectal en forma de
formas farmacéuticas unitarias que comprenden vehículos no tóxicos
normales farmacéuticamente aceptables. La expresión
"administración parenteral" como se usa en este documento, se
refiere a inyecciones e infusiones subcutáneas, intravenosas,
intramusculares o intratorácicas.
Los compuestos de la presente invención se
pueden administrar una vez al día en dosis de 0,03 a 0,5 mg por 1
kg de peso corporal por día durante 5 a 10 días.
Debe apreciarse que la dosis particular para
cada paciente individual dependerá de muchos factores incluyendo la
actividad del compuesto dado que se va a usar, la edad, el peso del
cuerpo, el género, el estado de salud y el régimen de alimentación
del paciente, la hora y el método de administración del agente
terapéutico, la velocidad de excreción del agente del cuerpo, la
combinación particular de agentes terapéuticos que se va a usar así
como la gravedad de la enfermedad que se va a tratar.
Las formas farmacéuticas de la presente
invención pueden producirse usando técnicas convencionales.
Debe apreciarse que los compuestos de la
presente invención como se han definido anteriormente manifiestan
actividad biológica a dosis que son de dos a tres órdenes más bajos
que los fármacos conocidos que se usan en aplicaciones
comparativas, de prácticamente la misma eficacia. Además, no se
detectaron efectos secundarios para los compuestos de la presente
invención como se ha definido anteriormente y no tienen
contraindicaciones para su uso. Al mismo tiempo, en el ensayo de
toxicidad, no se descubrió LD_{50} ya que tras la administración
a animales (por ejemplo, uno de los compuestos se ensayó en una
dosis oral de 5000 \mug/kg y una dosis parenteral de 10.000
\mug/kg) no se observó la muerte de animales experimentales.
La actividad antihipóxica de los compuestos que
se reivindican permite su uso como agentes antiisquémicos, ya que
se sabe que el abastecimiento de la sangre inferior y por tanto, una
administración del oxígeno mas baja a la región cardíaca
específica, es el factor más importante en el desarrollo del foco de
necrosis.
La capacidad de los compuestos que se
reivindican para modular los sistemas bioquímicos y fisiológicos, es
decir, el sistema del citocromo P-450 hepático, el
fondo hormonal y el sistema de peroxidación de lípidos (LP) y la
actividad antirradical, el metabolismo de ácido arquidónico, de
secreción espontánea de histamina estimulada por antígeno mediante
mastocitos peritoneales, explica su pronunciada actividad
antialérgica y antiinflamatoria.
Además, el aumento endógeno del contenido de
precursores y hormonas glucocorticoides bajo influjo de los
compuestos en estudio puede aprovecharse al tratar las enfermedades
relacionadas con la reducción de la síntesis de esas hormonas en el
organismo. Se sabe que la introducción exógena de preparados
hormonales conlleva, por regla general, complicaciones sistémicas y
es un factor de riesgo del desarrollo de enfermedades oncológicas
[Parker K.L., Schimmer B. P./The Role of Nuclear Receptors in
Steroid-Hormones Production. Sevinars in Cancer
Biology.-1994.- vol. 5. - Iss 5.- págs. 317-325.],
cono también oprime en el organismo la síntesis de las hormonas
pertinentes. En particular, podemos pronosticar un efecto positivo
al utilizar los compuestos de la presente invención en las
patologías que se acompañan de la reducción del contenido
corticoteroides: enfermedades alérgicas e inflamatorias, afecciones
hepáticas de distinta etiología y enfermedades ginecológicas. El
aumento revelado de la cantidad de oxiprogesterona en la sangre
puede ser de suma importancia al curar varias enfermedades
ginecológicas, tales como la esterilidad, la amenaza de malparto, la
amenorrea, hemorragias uterinas disfuncionales, y otras. Ya que se
sabe que los glucocorticoides y loa preparados vasodilatantes se
emplean al curar las enfermedades alérgicas así como varias
enfermedades dermatológicas, incluida la psoriasis, los compuestos
estudiados pueden emplearse asimismo para tratar esas
enfermedades.
Puesto que los compuestos ofrecidos poseen la
capacidad de reducir las manifestaciones de las reacciones alérgicas
e inflamatorias al aplicarlos localmente, como también intensificar
la síntesis de antiagregantes endógenos: prostaglandina E_{2} y
prostaciclina (6-ceto-PGF_{1a}),
se los puede utilizar en forma de ungüento cuando la dilatación
varicosa de las venas, en cuya patogénesis están presentes
componentes, tales como el inflamatorio, el aumento de la
coagulación de la sangre y otros.
Se sabe que los procesos de envejecimiento
también están relacionados con el estrés de oxidación que se
acompaña del aumento de la OPL y, por consiguiente, de la formación
del MDA que interaccionando con lisina de proteínas forma un
pigmento semejante a lipofuscina. Probablemente ello acelere la
lipofuscinosis, lo cual causa trastornos morfológicos
irreversibles. La reducción del contenido del MDA por los compuestos
de la presente invención disminuye la probabilidad de la formación
de dicho pigmento, lo cual puede llevar a la reducción de la
probabilidad del desarrollo de las enfermedades gerontológicas.
Además, pueden confirmar la posibilidad de aplicar los compuestos
en estudio en las enfermedades gerontológicas los resultados
obtenidos en la publicación de Emanuel y otros [Wmanuel N.M.,
Obujova L.K., Naidich V.I., Murza L.I., Bunto T.V./Deceleración del
envejecimiento mediante la activación del sistema de oxidasas
microsomales por fenobarbital. Informes de la X de la URSS.-1977.-
vpl. 235.- Nº 4.- pág. 957-960] dedicada al aumento
de la esperanza de visa al nacer en los animales experimentales al
administrar dosis pequeñas del fenobarbital. Los compuestos de la
presente invención causan cambios parecidos a los de fenobarbital
del sistema de de citocromo P-450 del hígado, y
puede ser resultado de su influencia sobre el organismo la
reducción de la velocidad del envejecimiento. El complejo de
enfermedades gerontológicas comprende estados patológicos, tales
como las psicosis seniles, la catarata, las alteraciones seniles de
la epidermis. Los compuestos de la presente invención también
pueden aplicarse al curar el parkinsonismo, la catarata y las
alteraciones seniles de la epidermis. Uno de los eslabones de su
patogénesis es el estrés de oxidación en el tejido nervioso
(aumento de la OPL).
Los compuestos de la presente invención poseen
un efecto hepatoprotector expreso. Este efecto de los compuestos se
debe a que al introducirlos en el organismo se produce una
restructuración funcional de muchos sistemas centrales del
organismo que participan en el mantenimiento de la homeostasis, lo
cual permite recomendarlos asimismo para el tratamiento de las
enfermedades relacionadas con el impacto en el organismo de
factores, tales como el estrés, la carga física, la radiación
ionizante, en la profilaxis de fenómenos colaterales de la
radioterapia, para activar los procesos de reparación; al tratar las
enfermedades del hígado (cirrosis, hepatitas de distinta
etiología); estados relacionados con intoxicación con sustancias que
activan la oxidación peroxídica de lípidos, por ejemplo, el
alcoholismo; en calidad de preparados profilácticos en las
reducciones relacionadas con la obtención de reactivos químicos y
en los contactos con las sustancias tóxicas.
Los compuestos de la presente invención pueden
normalizar los indicadores del metabolismo lipídico y tienen
eficacia antihipóxica y antiisquémica. Esto permite ofrecerlos para
la profilaxis y terapia de las enfermedades relacionadas con las
alteraciones del metabolismo lipídico que se caracterizan por el
aumento del contenido de triglicéridos, el colesterol total (CS),
el colesterol de las lipoproteínas de baja y muy baja densidad (LDL
y VLDL) y por la reducción del contenido de colesterol de las
lipoproteínas de alta densidad, tales como la ateroesclerosis, la
obesidad, la enfermedad isquémica del corazón y del cerebro, el
infarto de miocardio e ictus, factor de riesgo de la diabetes
mellitus, manifestación y trombogénesis.
El efecto de los compuestos de la presente
invención que estabiliza la homeostasis del organismo permite
recomendarlos para tratar la diabetes mellitus.
Los compuestos de la presente invención inhiben
significativamente el crecimiento del tumor trasplantable y su
proceso de metástasis, y aumentan la resistencia de los animales a
las infecciones microbianas y virales.
La inhibición de los procesos de crecimiento de
tumores y de metástasis está relacionada con varias acciones
biológicas de los compuestos de la presente invención con la
modificación del estado del sistema de citocromo
P-450, la modificación del status hormonal, las
propiedades antioxidantes y antirradicales del compuesto de la
presente invención, el aumento de la actividad de fagocitos
(neutrófilos y macrófagos peritoneales), células HK y productos de
interferones (citoquinas) bajo un estado de estrés. Esto permite
usar los compuestos de la presente invención en la terapia del
cáncer, ya que se sabe que todos los sistemas indicados
anteriormente participan activamente en el mantenimiento de la
homeostasis del organismo y experimentan cambios significativos con
el cáncer. Otra explicación del efecto antimetastásico de los
compuestos estudiados puede ser la reducción de la formación de
12-HETE ya que se sabe que dicho metabolito del
ácido arquidónico potencia el proceso de metástasis [Honn K.V.,
Tang D.G., Gao X., Butovich I.A., Liu B., Timar J., Hagmann W.
Cancer and Metastasis Reviews. - 1994.- vol. 13.-Iss
3-4.- págs. 365-96.- Ref: 195]. El
aumento de la relación prostaciclina/tromboxan también puede jugar
un papel determinado en el efecto antimetastásico de los
compuestos. Además, los compuestos de la presente invención aumentan
la actividad antitumoral del ciclofosfano que se emplea ampliamente
en la terapia del cáncer. Una característica importante de los
compuestos de la presente invención es que muestran propiedades
terapéuticas después de la administración oral. Al administrar una
forma de dosificación, la actividad terapéutica es comparable con el
empleo de la sustancia. La disminución de la cantidad de metástasis
es de gran importancia práctica puesto que la velocidad de este
proceso es sumamente importante, y su inhibición lleva a un
pronóstico más favorable de la cancerogénesis.
Se ha hecho constar que la normalización de los
indicadores citados anteriormente, sobre todo, el aumento de la
cantidad de macrófagos peritoneales activos en los animales al
introducir el compuesto de la presente invención. El Las células NK
que participan activamente en el mantenimiento del estatus inmune
del organismo y el aumento de la producción de
\gamma-interferón que inhibe in vitro la
proliferación de las células transformadas por el virus pueden
explicar el aumento de la resistencia de los animales a las
infecciones microbianas y virales. Cabe subrayar especialmente el
efecto protector de los compuestos durante la acción citodestructiva
del virus de la inmunodeficiencia humana. El efecto antiviral de
los compuestos también puede deberse a la normalización de la
oxidación peroxídica de lípidos.
La capacidad de los compuestos de la presente
invención de potenciar la transformación blástica inducida por
miógenos de las linfocitos del hombre permite aplicar los compuestos
en estudio cuando la epidermis está afectada, en particular, para
cicatrizar las heridas [Koyama, Masayoshi; Takahashi, Mikiko;
Yanagawa, Masayoshi EP 95-107298 950513; JP
94-115161 940527/Preparation of
L-lysyl-glycyl-L-histidine
and therapeutic agent for wound healing containing the same Eur.
Pat. Appl., 5 págs.].
De esta manera, los compuestos estudiados de la
presente invención pueden ser recomendados para aplicar en el
tratamiento de las citadas enfermedades oncológicas, las infecciones
bacteriales y virales y, sobre todo, para tratar la infección por
VIH.
El amplio espectro de acción de los compuestos
de la presente invención puede explicarse parcialmente por el hecho
de que estos compuestos actúan sobre los sistemas centrales del
cuerpo que estabilizan la homeostasis, por ejemplo, el sistema
citocromo P-450, LP y el sistema de fagocitosis. Se
sabe que un cambio en la actividad de un sistema en un organismo
vivo se sigue de cambios en los otros sistemas, y estos cambios
alcanzan un carácter de cascada. Con la administración de los
compuestos de la presente invención en el cuerpo, se produce la
normalización de muchas funciones corporales. De esta manera, los
compuestos de la presente invención actúan como adaptógenos.
La presente invención se refiere a métodos de
terapia y la prevención de enfermedades de animales de sangre
caliente, comprendiendo los métodos administración de compuestos de
la presente invención como se ha definido anteriormente en una
cantidad eficaz. Las enfermedades y usos para los compuestos de la
presente invención a este respecto incluyen: afecciones de estrés,
enfermedades alérgicas de asma bronquial de tipo inmediato y
retardado, alergia alimentaria, choque anafiláctico, eccemas
alérgicos así como psoriasis, aterosclerosis, enfermedad isquémica
(del corazón y el cerebro), obesidad, diabetes mellitus de tipo 1 y
2, abuso de alcohol, intoxicación alcohólica, venas varicosas,
prevención de trombogénesis; hepatitis, cirrosis hepática; lesiones
hepáticas tóxicas; enfermedades del sistema nervioso, enfermedad de
Parkinson; enfermedades herontológicas, cataratas, alteración senil
en tegumentos cutáneos, lesión de radiación, eliminación de
consecuencias de radioterapia, infecciones virales y bacterianas,
en particular, infección por SHIV, enfermedades cancerosas; carga
física dura; refuerzo de la cicatrización. Los compuestos de la
presente invención que se han definido anteriormente pueden usarse
en la práctica medicinal y veterinaria para la terapia y prevención
de las enfermedades citadas anteriormente.
Las siguientes abreviaturas se usan en los
ejemplos que se presentan a continuación:
En los ejemplos presentados se usan las
siguientes abreviaturas:
AAS - choque anafiláctico activo
AC - ácido araquidónico
ALT - alanina aminotransferasa
NA - neutrófilos activados
AsA - ácido ascórbico
AST - aspartato aminotransferasa
AOF - formas de oxígeno activas
HPLC - cromatografía líquida de alto
rendimiento
DTH - hipersensibilidad de tipo retardado
ITH - hipersensibilidad de tipo inmediato
HS - sueño hexenal
DMF - dimetilformamida
MII - índice de inhibición metastatizante
LD - dosis letal
LA - ácido linólico
LO - ruta lipoxigenasa
HDL - lipoproteínas de alta densidad
LDL - lipoproteínas de baja densidad
VLDL - lipoproteínas de muy baja densidad
LT - leucotrieno
MDA - dialdehido malónico
MP - macrófagos
NR - rojo neutro
NK - células asesinas naturales
NBT - nitroazul tetrazolio (formazán)
OVA - ovalbúmina de pollo
PG - prostaglandinas
PCA - anafilaxia cutánea pasiva
PM - macrófagos peritoneales
LP - peroxidación de lípidos
MLT - vida media
FC - colesterol libre
TBA - ácido tiobarbitúrico
TG - triglicéridos
TGlu - transglutaminasa
MC - mastocitos
TMS - tetrametilsilano
TCA - ácido tricloracético
TX - tromboxano
TLC - cromatografía de capa fina
TCD - dosis citopática de tejido
P - fosfolípidos
PB - fenobarbital
PG - fagocitos
NS - solución salina normal
L - quemioluminiscencia
CS - colesterol
SNC - sistema nervioso central
CO - ruta ciclooxigenasa
EDTA- tetraacetato de etilendiamida
RMN - resonancia magnética nuclear
Bu^{t}OH - terc-butanol
Bu^{t} - terc-butilo
Bzl - bencilo
Boc - terc-butioxicarbonilo
DCC -
N,N'-diciclohexilcarbodiimida
DCU - N,N'-diciclohexilurea
DMF - N,N'-dimetilformamida
Et_{3}N - trietilamina
EtOAc - acetato de etilo
EtOH - etanol
EET - ácido epoxieicosatrienoico
GA - ácido glutárico
Glu - ácido glutámico
F - cortisol
HA - histamina
HETE - ácido
(S)-hidroxi-6.8.11,14-eicosatrienoico
5-HT -
5-hidroxitriptamina (serotonina)
Ind - indol
Im - imidazol
MeCN - acetnitrilo
MeOH -metanol
OBu^{t} - éter
terc-butílico
ONSu - N-oxisuccinimidilo
OPfp - pentafluorfenilo
Py - piridina
P-450B - un grupo de citocromos
P-450 con centro activo, orientado a citosol
P-450L - un grupo de citocromos
P-450 con centro activo, orientado a la membrana de
fosfolípidos
TrpA - triptamina
TFA - ácido trifluoracético
Z – benciloxicarbonilo.
Los derivados de ácido glutámico, ácido
aspártico, histidina, triptófano y ornitina que se usan en la
síntesis son los derivados de la fila L a menos que se indica
especialmente el derivado D. La individualidad de los compuestos
producidos se controla usando el método por TLC en placas Silufol de
la empresa Kavalier, UV-254 (Checoslovaquia) en los
sistemas de disolventes: 9:1 de cloroformo-metanol
(1), 8:2 de cloroformo-metanol (2), 4:1:5 de
n-butanol-ácido acético-agua (3); en
placas Kieselgel de la empresa "Merck" en los sistemas de
disolventes 5:3:1 de
cloroformo-metanol-amoníaco acuoso
al 25% (4); en placas Silufol: 9,3:0,7 de
cloroformo-metanol (5); 5:3:0,5 de
cloroformo-metanol-amoníaco acuoso
al 25% (6), 8,5:1,5 de cloroformo-metanol (7); 6:3:1
de isopropanol-agua-amoníaco acuoso
al 25% (8), cloroformo (9), en placas Kieselgel de la empresa
"Merck" en los sistemas de disolventes 6:1:3 de
isoporpanol-agua-amoníaco acuoso al
25% (10).
Los cromatogramas se desarrollaron con una
solución de clorotolidina, reactivos Pauli y Ehrlich, ninhidrina y
en luz UV.
Las temperaturas de fusión de los compuestos se
determinan usando el instrumento Boetius (Alemania).
Los espectros ^{1}H-RMN se
toman en los aparatos Brucker WM-250 (Alemania) y
Varian XL-400 (Japón) con TMS como patrón
interno.
La espectrometría de masas se realiza en el
instrumento MSBCh (Sumy, Ucrania) usando el método de ionización
por desorción de plasma con fragmentos nucleares de californio
252.
La HPLC analítica de fase inversa se realiza en
las condiciones (1): la columna MPS-270
C-18 (4,0 x 250 mm), 10 \mum, elución con
acetonitrilo al 4% en agua que comprende TFA al 0,1%; (2): la misma
columna, elución con gradiente del -10% al 50% de la fase B en la
fase A durante 20 min; fase A - TFA al 0,1% en agua, fase B - TFA
al 0,09% en la mezcla 60:40 de acetonitrilo y agua; (3): la columna
MPS 300 C18T (4,0 x 250 mm), 10 \mum, elución con gradiente del 0%
al 40% de la fase B en la fase A durante 20 min. Fase A - TFA al
0,1% en agua, fase B - TFA al 0,09% en la mezcla de acetonitrilo y
agua (60:40); (4): la columna MPS 270 C18 (4,0 x 250 mm) 10 \mum,
elución Na_{2}HPO_{4} de 0,1 M, pH 2,3; (5): la misma columna,
elución con Na_{2}HPO_{4} 0,1 M, pH 2,7; (6): la columna
Diasorb 130 C18T (4,0 x 150 mm), 7 \mum, elución con gradiente
del 0% al 42% de acetonitrilo en el TFA al 0,1%; (7): la columna MPS
300 C18T (4,0 x 250 mm), 10 \mum, elución con gradiente del 0% al
18% del acetonitrilo en el TFA al 0,1% durante 20 min; (8): la
columna Lichrosorb RP-18 (4,6 x 250 mm), 5 \mum,
elución con gradiente del 6% al 24% del acetonitrilo en el TFA al
0,1% durante 20 min; (9): la columna Diasorb 130 C16T (4,0 x 150
mm), elución TFA al 0,1%; (10): la columna Diasorb 130 C16T (4,0 x
150 mm), 7 \mum, elución con gradiente del 0% al 24% del
acetonitrilo en el TFA al 0,1% durante 30 min; (11): la misma
columna, elución por el gradiente del 3% al 54% del acetonitrilo en
el TFA al 0,1% durante 30 min; (12): la misma columna, elución con
gradiente del 0% al 30% del acetonitrilo en el TFA al 0,1% durante
30 min; (13): la columna MPS C18T (4,0 x 250 mm), elución con
gradiente del 12% al 60% del acetonitrilo en el TFA al 0,1% durante
20 min; (14): la columna MPS-270, (4,0 x 250 mm), 10
\mum, elución con gradiente del 0% al 60% del acetonitrilo en el
TFA al 0,1% durante 20 min; (15): la columna Diasorb 130 C16T (4,0
x 150 mm), 7 \mum, elución con gradiente del 0% al 60% del
acetonitrilo en TFA al 0,1% durante 30 min; (16): la columna
Diasorb 130 C16T (4,0 x 150 mm), 7 \mum, elución con gradiente
del 60% al 100% del acetonitrilo en el TFA al 0,1% durante 15
min.
En todos los casos, el análisis por HPLC se
realiza a una velocidad de elución de 1 ml/min con detección a 214
nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
A una solución de 0,080 g (0,72 mM) de histamina
en 4 ml de DMF, se le añaden 0,072 g (0,72 mM) de anhídrido
succínico mientras se agitaba. La mezcla de reacción se agita
durante 1 h y se deja durante 20 h a 20ºC. El disolvente se retira
al vacío. El residuo oleoso se disuelve en 1,5 ml de etanol, se
añaden 4 ml de éter seco, se tritura y se mantiene durante 30 min a
4ºC. El residuo se separa y se recristaliza tres veces a partir de
metanol. El rendimiento es 0,075 g (49,2%). R_{f} 0,41(4).
Temperatura de fusión: 153-155ºC. HPLC HPLC en las
condiciones (6): un pico, tiempo de retención 7,77 min. Espectro
^{1}H-RMN, (CD_{3}OD), \delta, ppm.: 2,42 (t,
2H, -CH_{2}CONH), 2,55 (t, 2H, HOOC-CH_{2}),
2,8 (t, 2H, \beta-CH_{2}-HA),
3,4 (t, 2H, \alpha-CH_{2}-HA),
7,0 (s, 1H, CH-5-Im), 8,0 (s, 1H,
CH-2-Im). Espectro de masas, m/z:
[M+1H]^{+} 212,2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
A una solución de 0,366 g (3,3 mM) de histamina
en 5 ml de DMF se le añaden 0,376 g (3,3 mol) de anhídrido
glutárico. La mezcla de reacción se agita durante 3 h y se mantiene
durante 20 h a 20ºC. El sedimento blanco se separa, se seca al
vacío y se recristaliza. El rendimiento es 0,510 g (70,0%). R_{f}
0,36 (6), 0,34 (4). Temperatura de fusión:
187-189ºC. HPLC en las condiciones (7): un pico,
tiempo de retención: 14,36 min. Espectro
^{1}H-RMN (D_{2}O), \delta, ppm: 1,72 (m, 2H,
\beta-CH_{2}), 2.18 (m, 4H,
\alpha,\gamma-CH_{2}), 2,85 (t, 2H,
\beta-CH_{2}-HA), 3,5 (t, 2H,
\alpha-CH_{2}-HA), 7,25 (s, 1H,
CH-5-Im), 8,5 (s, 1H,
CH-2-Im). Espectro de masas, m/z:
[M+1H]^{+} 226,1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
A una solución de 0,197 g (1,35 mM) de ácido
adipínico en 2,5 ml de DMF a 0ºC se le añaden 0,278 g (1,35 mM) de
DCC. La mezcla de reacción se agita a 0ºC durante 30 min y se añade
una solución 0,150 g (1,35 mM) de histamina en 1 ml de DMF y
después se mantiene a 20ºC durante 20 horas. El sedimento de DCU se
separa por filtración. A la mezcla de reacción se le añaden 10 ml
de éter seco y después se mantiene durante 1 hora a 0ºC. El residuo
oleoso se disuelve en etanol y se añaden 0,2 ml de HCl 4 N en
dioxano. El disolvente se retira al vacío. El residuo se lava con
éter, se disuelve en una mezcla 1,5:1 de
cloroformo-etanol y se purifica en una columna
sobre gel de sílice 40/100 (22 x 175 mm). La elución se realiza con
una mezcla de cloroformo-etanol de 7:3 a 2:8,
etanol, metanol y una mezcla 8:1:0,5 de
metanol-AcOH-H_{2}O. Las
fracciones que contienen la sustancia diana con R_{f} 0,25 (6) se
unen y el disolvente se retira al vacío y se seca sobre
P_{2}O_{5}. El rendimiento es 0,129 g (40%). R_{f} 0,25 (6).
HPLC en las condiciones (11): un pico, tiempo de retención: 3,6
min. Espectro ^{1}H-RMN (CD_{3}OD), \delta,
ppm: 1,6 (m, 4H, \beta,\gamma-CH_{2}), 2,3 (m,
4H, \alpha,\delta-CH_{2}), 3,0 (t, 2H,
\beta-CH_{2}-HA), 3,55 (t, 2H,
\alpha-CH_{2}-HA), 7,25 (s, 1H,
CH-5-Im), 8,65 (s, 1H,
CH-2-Im).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
A 0,10 g (0,405 mM) de
\gamma-L-glutamilhistamina se le
añaden 5 ml de agua y se agita hasta que se produjo la disolución
de la masa de la sustancia básica. A la mezcla de reacción se le
añaden 2,5 ml de dioxano y 0,073 g (0,405 mM) de acetato de
p-nitrofenilo, que se agita durante 2 h y se
mantiene durante 18 h a 20ºC. El disolvente se retira al vacío a
40ºC. El residuo se disuelve en la cantidad mínima de metanol y se
purifica usando una cromatografía en columna sobre Kieselgel 60 y
se eluye con metanol. Las fracciones que contienen la sustancia
diana con R_{f} 0,3 (4) se unen y el disolvente se retira al
vacío. Se produce una sustancia vítrea incolora. El rendimiento es
0,046 g (40,0%). R_{f} 0,3 (4). HPLC en las condiciones (3): un
pico, tiempo de retención: 10,77^{1} minutos. Espectro
^{1}H-RMN (CD_{3}OD), \delta, ppm:
2,0-2,3 (m, 2H, \beta-CH_{2}),
2.19 (s, 3H, CH_{3}CO), 2,45 (t, 2H,
\gamma-CH_{2}), 3,07 (t, 2H,
\beta-CH_{2}-HA), 3,64 (t, 1H,
\alpha-CH_{A}H_{B}-HA), 3,65
(t, 1H,
\alpha-CH_{A}H_{B}-HA), 4,42
(t, 1H, \alpha-CH), 7,42 (d, 1H,
CH-5-Im), 8,69 (d, 1H,
CH-2-Im).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
A una solución de 0,30 g (1,16 mM) de
diclorhidrato de éter metílico de L-histidina en 4
ml de metanol anhidro, que se ha producido por calentamiento a 40ºC
con refrigeración posterior a 0ºC, se le añade una solución de
metilato sódico frío producido a partir de 0,053 g de sodio metálico
(2,32 mM) y 1 ml de metanol y después la mezcla de reacción se
mantiene durante 20 min a 0ºC. Después, se añade un volumen igual de
éter seco y se mantiene durante 20 min a 0ºC. El sedimento de
cloruro sódico se separa y el disolvente se retira del filtrado al
vacío. El residuo se disuelve en 3,5 ml de DMF y 0,604 g (1,16 mol)
de
Boc-L-Glu(OPfp)-OBzl.
La mezcla de reacción se agita durante 2 h y se mantiene durante 20
h. La DMF se retira al vacío. El residuo oleoso se purifica en una
columna de 30 x 1,6 cm con gel de sílice 100/160; se eluye con una
mezcla de cloroformo:metanol (9:1). Las fracciones que contienen la
sustancia diana se unen y el disolvente se retira al vacío. La
sustancia diana se seca sobre P_{2}O_{5}. El rendimiento es
0,334 g (55.0%). R_{f} 0,35 (1). Espectro
^{1}H-RMN (CD_{3}OD): 1,45 (s, 9H,
(CH_{3})_{3}C), 2,0 (m, 2H,
\beta-CH_{2}), 2,3 (t, 2H,
\gamma-CH_{2}), 3,0 (d, 2H,
\beta-CH_{2}-His), 3,7 (s, 3H,
CH_{3}O), 4,1 (t, 1H, \alpha-CH), 4,55 (t, 1H,
\alpha-CH-His), 5,15 (m, 2H,
CH_{2}-Bzl), 6,85 (s, 1H,
CH-5-Im), 7,35 (m, 5H,
C_{6}H_{5}-Bzl), 7,6 (s, 1H,
CH-2-Im).
A una solución de 0,30 g de
Boc-L-Glu
(HisOMe)-OBzl (VI^{a}) en 1 ml de MeOH se le
añaden 3 ml de N-clorhidrato 4 N en dioxano. En 30
min, se le añaden 5 ml de éter seco. Los disolventes de retiran al
vacío, después se añade éter seco y también se retira también al
vacío. El residuo se tritura con éter seco y después el éter se
separa por decantación. La sustancia sólida de color blanco se seca
sobre P_{2}O_{5} al vacío. Se producen 0,25 g de
2HCl\cdotL-Glu (HisOMe) OBzl.
A una solución de 0,140 g de la sustancia
producida en 4,5 de metanol anhidro, se le añaden 0,10 g de paladio
al 10% sobre carbono activado y la solución se agita durante 2,5 h
on una corriente de aire pasando a través de forma periódica. El
catalizador se separa usando un filtro y lavando con metanol. El
disolvente se retira del filtrado unido al vacío. Al residuo se le
añade éter seco y también se retira al vacío. La sustancia se seca
al vacío sobre P_{2}O_{5}. El rendimiento es 0,103 g (90,3%).
R_{f} 0,35 (6). HPLC en las condiciones (9): un pico, tiempo de
retención 6.16 min. Espectro ^{1}H-RMN
(CD_{3}OD), \delta, ppm: 2,15 (m, 2H,
\beta-CH_{2}), 2,55 (t, 2H,
\gamma-CH_{2}), 3,15 (t, 1H,
\alpha-CH), 3,75 (s, 3H, CH_{3}O), 4,0 (t, 1H,
\alpha-CH-His), 4,8 (d, 2H,
\beta-CH2-His), 7,4 (s, 1H,
CH-5-Im), 8,81 (s, 1H,
CH-2-Im). Espectro de masas, m/z:
299,1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
A una solución de 0,30 g (1,16 mol) de
diclorhidrato del éster metílico de L-histidina en 4
ml de metanol anhidro que se han producido por calentamiento a 40ºC
con la refrigeración posterior a 0ºC se le añade una solución de
metilato sódico fría producida a partir de 0,053 g (2,32 mM) de
sodio metálico y 1 ml de metanol. La mezcla de reacción se mantiene
durante 30 min a 0ºC, después se añade un volumen igual de éter seco
y la mezcla de reacción se mantiene durante 20 min a 20ºC. El
sedimento de cloruro sódico se separa al vacío. El residuo se
disuelve en 3,5 ml de DMF y se añaden 0,132 g (1,16 mol) de
glutaraldehído. La mezcla de reacción se agita durante 2 h y se
mantiene durante 20 minutos a 20ºC. El disolvente se retira al
vacío. El residuo oleoso se purifica en una columna (30 x 1,6 cm)
sobre gel de sílice 100/160, eluido con metanol. Las fracciones que
contienen la sustancia diana se unen. El disolvente se retira al
vacío y se seca sobre P_{2}O_{5}. El rendimiento es 0,095 g
(28%). R_{f} 0,43 (10). HPLC en las condiciones (8): un pico,
tiempo de retención: 9,95 min. Espectro ^{1}H-RMN
(CD_{3}OD), \delta, ppm: 1,85 (m, 2H,
\beta-CH_{2}), 2,25 (t, 4H,
\alpha,\gamma-CH_{2}), 3,05 (d, 2H,
\beta-CH_{2}-His), 3,7 (s, 3H,
CH_{3}O), 4,67 (t, 1H,
\alpha-CH-His), 6,92 (s, 1H,
CH-5-Im), 7,72 (s, 1H,
CH-2-Im). Espectro de masas, m/z:
284,4.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
A 0,60 g (2,53 mM) de ácido
N-benciloxicarbonil-\gamma-aminobutírico
se le añaden 9 ml de acetato de etilo anhidro y la mezcla de
reacción se agita y se enfría a 0ºC. Se añaden 0,52 g (2,53 mM) de
DCC y 0,465 g (2,53 mM) de pentafluorofenol. La mezcla de reacción
se agita durante 2 h y después se mantiene durante 20 h a 20ºC. El
residuo de DCU se separa y se lava con acetato de etilo anhidro. Los
filtrados se unen y el disolvente se retira al vacío. Se producen
cristales de color ligeramente amarillento de
Z-\gamma-Abu-OPfp
que se secan al vacío. El rendimiento es 1,05 g (98,0%). R_{f}
0,85 (1).
A 0,30 g (1,16 mol) de diclorhidrato de éster
metílico de L-histidina se le añaden 4 ml de metanol
anhidro y la mezcla de reacción se calienta hasta que se produce la
disolución. La solución se enfría a 0ºC y se añade una solución de
metilato sódico frío, producida a partir de 0,053 g (2,32 mol) de
sodio metálico y 1 ml de metanol anhidro. La mezcla de reacción se
mantiene a 0ºC durante 20 min, se añade un volumen igual de éter
seco y después la mezcla se mantiene durante 20 minutos a 20ºC. El
residuo de cloruro sódico se separa. El disolvente se retira del
filtrado al vacío. Al residuo oleoso se le añaden 5 ml de DMF
anhidra y 0,50 g (1,24 mol) de
Z-\gamma-Abu-OPfp
y la mezcla se mantiene 20 horas a 20ºC. El disolvente se retira al
vacío. El residuo se purifica usando cromatografía en columna sobre
gel de sílice L 40/100, eluida por cloroformo, donde hay un
gradiente de metanol en el cloroformo con la proporción 2:8. Las
fracciones que contienen la sustancia diana con R_{f} 0,46 (2) se
unen y el disolvente se retira al vacío. Al residuo producido se le
añade éter seco en exceso con 1 gota de trietilamina y se tritura.
Una sustancia sólida de color blanco se separa, se lava con éter
seco y se seca al vacío. El rendimiento es 0,243 g (65.0%), R_{f}
0,46(2). Espectro de masas, m/z: 375,5.
A 0,04 g (0,124 mM) de
Z-\gamma-Abu-L-His-OMe
se le añaden 7 ml de metanol anhidro, 0,04 g de paladio al 10%
sobre carbono activo y la mezcla de reacción se hidrata durante 1
hora con agitación. Después de la conversión completa de la
sustancia originaria con R_{f} 0,46 (2) en el producto diana con
R_{f} 0 (2) el catalizador se separa y se lava con metanol. Los
filtrados se unen y el disolvente se retira al vacío. Se produce un
aceite viscoso incoloro. El rendimiento es 0,030 g (90,0%). R_{f}
0,05 (3), R_{f} 0,1 (4). HPLC en las condiciones (1) un pico,
tiempo de retención 4.8 min. Espectro ^{1}H-HMP
(CD_{3}OD), \delta, ppm: 1,85 (m, 2H,
\beta-CH_{2}), 2,23 (t, 2H,
\gamma-CH_{2}), 2,95 (d, 2H,
\beta-CH_{2}-His), 3,1 (t, 2H,
\alpha-CH_{2}), 3,7 (s, 3H, CH_{3}O), 4,65 (t,
1H, \alpha-CH-His), 6,85 (s, 1H,
CH-5-Im), 7,6 (s, 1H,
CH-2-Im).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
A una solución de 0,100 g (0,645 mol) de
L-histidina en 3 ml de agua, se le añaden 0,75 ml de
dioxano con agitación y después se añadieron en porciones 0,560 g
(1,29 mM) de Boc-L-Glu (ONSu) OBzl y
2,25 ml de dioxano durante 2 horas (hasta que la proporción de
dioxano:agua es 1:1). La suspensión resultante se agita durante 2
horas y se mantiene durante 20 horas a 20ºC. Después, la suspensión
se transforma en una solución. El disolvente se retira al vacío. El
residuo oleoso se purifica en una columna de 30 x 1,6 cm sobre gel
de sílice 100/160, se eluye con una mezcla 5:1 de
cloroformo-metanol, aumentando gradualmente el
contenido de MeOH hasta el 50%. Las fracciones que contienen la
sustancia diana se unen. El disolvente se retira al vacío. Se
produce una sustancia sólida de color blanco. El rendimiento es
0,150 g (45,7%). R_{f} 0,48 (3). Espectro
^{1}H-RMN, (CD_{3}OD), \delta, ppm: 1,4 (s,
9H, (CH_{3})_{3}C), 1,98 (m, 2H,
\beta-CH_{2}), 2,3 (t, 2H,
\gamma-CH_{2}-Glu), 3,1 (m, 2H,
\beta-CH_{2}-His), 4,07 (t, 1H,
\alpha-CH), 4,5 (t, 1H,
\alpha-CH-His), 5,18 (m, 2H,
CH_{2}-Bzl), 7,17 (s, 1H,
CH-5-Im), 7,35 (m, 5H,
C_{6}H_{5}), 8,4 (s, 1H,
CH-2-Im).
A una solución de 0,140 g de
Boc-L-Glu(His)-OBzl
(IX^{a}) en 1 ml de metanol anhidro se le añaden 3 ml de
clorhidrato 4 N en dioxano y la mezcla de mantiene a 20ºC durante 40
minutos. A la mezcla de reacción se le añade éter y los disolventes
se retiran al vacío. El sedimento se tritura con éter hasta que se
forma una sustancia sólida de color blanco. El éter se decanta y el
residuo se seca al vacío y se purifica con cromatografía en papel
preparativa en el sistema 4:1:5 de butanol-ácido
acético-agua, fase superior. Se producen 0,12 g
(95.8%) de dipéptido de diclorhidrato, R_{f} 0,26 (3). A una
solución de 0,117 g del producto obtenido en 4,5 ml de metanol
anhidro se le añaden 0,096 g de paladio al 10% sobre carbón
activado. La mezcla de reacción se agita durante 2,5 horas, dejando
pasar periódicamente el flujo de hidrógeno. El catalizador se separa
usando un filtro y se lava con 5 ml de MeOH. Los filtrados se unen
y el disolvente se retira al vacío. El residuo se seca al vacío
sobre P_{2}O_{5}. El rendimiento es 0,091 g (96.1%). R_{f}
0,3 (6). HPLC en las condiciones (10): un pico, tiempo de retención
5.40 minutos. Espectro ^{1}H-RMN (CD_{3}OD),
\delta, ppm: 2.15 (m, 2H, \beta-CH_{2}), 2,55
(t, 2H, \gamma-CH_{2}), 3,16 (t, 1H,
\alpha-CH), 3,75 (s, 3H, CH_{3}O), 3,99 (t, 1H,
\alpha-CH-His), 4,8 (dd, 2H,
\beta-CH_{2}-His), 7,38 (s, H,
CH-5-Im), 8,80 (s, H,
CH-2-Im). Espectro de masas, m/z:
299,2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
A una solución de 0,252 g (0,625 mol) de
Z-\gamma-Abu-OPfp
en 5 ml de DMF se le añaden 0,10 g (0,625 mol) de triptamina y la
mezcla de reacción se agita a 25ºC durante 2 horas. La mezcla de
reacción se mantiene durante 16 horas a la misma temperatura,
después de lo cual se añade un exceso de 7 veces (por volumen) de
agua. Un sedimento coagulado de color blanco se retira por
filtración, se lava en un filtro con agua y se seca. El rendimiento
es 0,22 g (93.0%). R_{f} 0,6 (5), R_{f} 0,54 (3). Espectro de
masas, m/z: 380,6.
A 0,133 g (0,35 ml) de
Z-\gamma-Abu-TrpA
se le añaden 7 ml de metanol anhidro y la mezcla se agita hasta que
se produce la disolución de la masa de la sustancia básica. Al
produce resultante, se le añaden 0,133 g de paladio al 10% sobre
carbón activado y la mezcla de reacción se hidrata durante 1 hora.
Después de la conversión completa de la sustancia inicial con
R_{f} 0,6 (5) en producto diana con R_{f} 0 (5), el catalizador
se separa y el producto se lava con metanol. Los filtrados se unen y
el disolvente se retira al vacío. Se produce un aceite viscoso
incoloro. El rendimiento es 0,086 g (99.0%). R_{f} 0,43 (3). HPLC
en las condiciones (2): un pico, tiempo de retención 18,5 min.
Espectro ^{1}H-RMN (CD_{3}OD), \delta, ppm:
1,65 (m, 2H, \beta-CH_{2}), 2,05 (t, 2H,
\gamma-CH_{2}), 2,85 (t, 2H,
\beta-CH_{2}-TrpA), 3,0 (t, 2H,
\alpha-CH_{2}), 3,45 (m, 2H,
\alpha-CH_{2}-TrpA), 6,95 (s,
1H, CH-2-Ind), 6,99 (m, 1H,
CH-5-Ind), 7,05 (m, 1H,
CH-6-Ind), 7,28 (d, 1H,
CH-7-Ind), 7,48 (d, 1H,
CH-4-Ind).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
A una suspensión de 0,20 g (0,66 mM) de
clorohidrato de O-bencilserotonina en 3 ml de DMF se
le añaden agitando 0,09 ml (0,66 mol) de trietilamina mientras se
agitaba y después 0,075 g (0,66 mM) de anhídrido glutárico. La
mezcla de reacción se agita durante 1 hora y se mantiene durante 20
horas a 20ºC. El sedimento de clorohidrato de trietolamina se
separa y el disolvente se retira al vacío. El residuo oleoso se
purifica en una columna 31 x 1,5 cm sobre gel de sílice 60,
0,063-0,2 mm (Merck). Se produce la elución con una
mezcla 9:1 de cloroformo-metanol. Las fracciones
que contienen el producto diana se unen y el disolvente se retira al
vacío. Se obtiene un producto vítreo incoloro. El rendimiento es 50
mg (20%). R_{f} 0,48 (1). HPLC en las condiciones (14): un pico,
tiempo de retención 23.8 minutos. Espectro
^{1}H-RMN (CD_{3}OD), \delta, ppm: 2,05 (m,
2H, \beta-CH_{2}-GA), 2,45 (m,
4H, \alpha,\gamma-CH_{2}-GA),
3,1 (t, 2H, \beta-CH_{2}), 3,67 (t, 2H,
\alpha-CH_{2}), 5,3 (s, 2H,
CH_{2}-Bzl), 7,0 (dd, 1H,
CH-6-Ind), 7,1-7,7
(m, 8H, CH-7-Ind,
CH-2-Ind,
CH-4-Ind, C_{6}H_{5}).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
A 25 mg (0,065 mol) de
glutaril-O-bencilserotonina se le
añaden 4 ml de metanol anhidro. A una solución resultante se le
añaden 30 mg de catalizador - paladio sobre carbón activado y la
mezcla de reacción se hidrata durante 1 hora mientras se agita. El
catalizador se retira por filtración. El disolvente se retira del
filtrado al vacío. El rendimiento es 17 mg (90%). R_{f} 0,31 (1).
HPLC en las condiciones (14): un pico, tiempo de retención 16,27
min. Espectro ^{1}H-RMN (CD_{3}OD), \delta,
ppm: 2,0 (m, 2H,
\beta-CH_{2}-GA), 2,5 (m, 4H,
\alpha,\gamma-CH_{2}-GA), 3,0
(t, 2H, \beta-CH_{2}), 3,65 (t, 2H,
\alpha-CH_{2}), 6,85 (dd, 1H,
6-CH-Ind), 7,15 (d, 1H,
CH-4-Ind), 7,25 (s, 1H,
CH-2-Ind), 7,4 (d, 1H,
CH-7-Ind).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
A una solución de 0,20 g (1,05 mM) de
O-metilserotonina en 3 ml de DMF se le añaden 0,12 g
(1,05 mM) de anhídrido glutámico mientras se agita. La mezcla de
reacción se agita durante 1 h y se mantienen durante 20 horas a
20ºC. El disolvente se retira al vacío. El residuo oleoso se
purifica en una columna de 31 x 1,5 cm sobre gel de sílice 60,
0,063-0,2 mm (Merck). Se produce la elución con una
mezcla 9:1 de cloroformo-metanol. Las fracciones
que contienen el producto diana se unen y el disolvente se retira al
vacío. Se obtiene una sustancia vítrea incolora. El rendimiento es
0,095 g (29.8%). R_{f} 0,51 (1). HPLC en las condiciones (14): un
pico, tiempo de retención 19,0 min. Espectro
^{1}H-RMN (CDCl_{3}+CD_{3}OD), \delta, ppm:
1,95 (m, 2H, \beta-CH_{2}-GA),
2,37 (m, 4H,
\alpha,\gamma-CH_{2}-GA), 3,0
(t, 2H, \beta-CH_{2}), 3,56 (t, 2H,
\alpha-CH_{2}), 3,92 (s, 3H, CH_{3}O), 6,83
(dd, 1H, CH-6-Ind), 7,1 (d, 2H,
CH-2,4-Ind), 7,31 (d, 1H,
CH-7-Ind).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
A una solución de 0,15 g (0,94 mol) de
triptamina en 3 ml de DMF se le añaden 0,107 g (0,94 mol) de
anhídrido glutámico mientras se agita. La mezcla de reacción de
agita durante 1 h y se mantiene durante 20 horas a 20ºC. El
disolvente se retira al vacío. El residuo oleoso se purifica en una
columna de 31 x 1,5 cm sobre gel de sílice 60,
0,063-0,2 mm (Merck). Se produce la elución con una
mezcla 9:1 de cloroformo-metanol. Las fracciones
que contienen el producto diana se unen y el disolvente se retira al
vacío. Se obtiene una sustancia vítrea incolora. El rendimiento es
0,2 g (78%). R_{f} 0,41 (1). HPLC en las condiciones (14): un
pico, tiempo de retención: 18,95 min. Espectro
^{1}H-RMN (CDCl_{3}+CD_{3}OD), \delta, ppm:
1,90 (m, 2H, \beta-CH_{2}), 2,27 (dt, 4H,
\alpha,\gamma-CH_{2}), 2,95 (t, 2H,
\beta-CH_{2}-TrpA), 3,50 (t, 2H,
\alpha-CH_{2}-TrpA), 7,0 20 (t,
2H, CH-5,6-Ind), 7,1 (s, 1H,
CH-2-Ind), 7,35 (d, 1H,
CH-7-Ind), 7,55 (d, 1H,
CH-4-Ind).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
A una solución de 0,5 g (4.39 mol) de anhídrido
glutárico en 1 ml de DMF se le añaden 0,57 ml (4,39 mol) de
4-(2-aminoetil) morfolina mientras se agitaba y se
enfriaba. La mezcla de reacción se agita durante 30 minutos y se
mantiene durante 20 horas a 20ºC. El disolvente se retira al vacío.
El residuo oleoso se lava con éter, el disolvente se retira al
vacío, después el residuo se seca y se mantiene a +4ºC durante 20
horas. La sustancia cristalina formada se lava y se tritura con
éter (3 x 1,5 ml), después con acetona (4 x 1,5 ml) y después se
separa de los disolventes y se seca al vacío. Se obtienen 0,265 g
(24.8%), de R_{f} 0,41 (6). HPLC en las condiciones (11): un
pico, tiempo de retención 3,93 minutos. Espectro
^{1}H-RMN (CD_{3}OD), \delta, ppm: 0,5 (m,
2H, \beta-CH_{2}-GA), 0,9 (m,
4H, \alpha,\gamma-CH_{2}-GA),
1,3 (m, 8H,
CH_{2}-2,3,5,6-morfilina), 2,0 (
t, 2H, \beta-CH_{2}), 2,38 (t, 2H,
\alpha-CH_{2}).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
A una solución de 0,3 g (2,63 mol) de anhídrido
glutárico en 1 ml de DMF se le añaden 0,315 ml (2,63 mol) de
2-(2-aminoetil) piridina mientras se agita y se
enfría con agua. La mezcla de reacción se agita durante 1 hora y se
mantiene durante 20 horas a 20ºC. El sedimento de color blanco se
retira por filtración, se lava varias veces con éter y con acetona
y se seca. El rendimiento es 0,29 g (46.7%). R_{f} 0,27 (1). HPLC
en las condiciones (12): un pico, tiempo de retención 14,33
minutos. Espectro ^{1}H-RMN (CD_{3}OD),
\delta, ppm: 0,41 (m, 2H,
\beta-CH_{2}-GA), 0,81 (m, 4H,
\alpha,\gamma-CH_{2}-GA), 1,6
(t, 2H, \beta-CH_{2}), 2,15 (t, 2H,
\alpha-CH_{2}), 5,9 (m, 2H,
CH-4,5-piridinil), 6,4 (m, 1H,
CH-3-piridinilo), 7,05 (m, 1H,
CH-6-Py).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
A una solución de 0,5 g (4,39 mM) de anhídrido
glutárico en 1 ml de DMF se le añaden 0,55 ml (4,39 mM) de
feniletilamina mientras se agita y se enfría con agua. La mezcla de
reacción se agita durante 30 min, después se mantiene durante 20
horas a 20ºC. El disolvente se retira al vacío y el residuo se
purifica en una columna de 25 x 230 cm con Kieselgel 40 para la
cromatografía en columna ("Fluka"). Se produce la elución con
una mezcla cloroformo-cloroformo:MeOH (9:1). Las
fracciones que contienen el producto diana con R_{f} 0,57 (1) se
unen y se secan tras la retirada del disolvente al vacío. El
rendimiento es 1,02 g (99%). HPLC en las condiciones (13): un pico,
tiempo de retención 15,12 minutos. Espectro
^{1}H-RMN (CDCl_{3}), \delta, ppm: 1,9 (m,
2H, \beta-CH_{2}-GA), 2,15 (t,
4H, \alpha,\gamma-CH_{2}-GA),
2,8 (t, 4H, \alpha, \beta-CH_{2}), 7,2 (m, 5H,
C_{6}H_{5}).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
17
A 700 mg (3,85 mol) de diclorhidrato de
histamina se le añaden 9 ml de metanol anhidro y la mezcla se
calienta hasta 50ºC, se agita hasta que se produce la disolución y
después se enfría a 0ºC. A la solución resultante se le añaden 1,42
ml (7,7 mM) de una solución de metilato sódico en metanol. La mezcla
se mantiene a 0ºC durante 20 minutos y después se añade un volumen
igual de éter anhidro y la mezcla se mantiene durante 20 minutos a
0ºC. El sedimento de NaCl se separa. El disolvente se retira del
filtrado al vacío. El residuo oleoso se disuelve en 5 ml de DMF y
se enfría hasta +5ºC. A la solución se le añaden 0,537 ml (3,85 mol)
de trietilamina mientras se agita y después se le añaden 0,52 ml
(3,85 mol) de cloroanhídrido del ácido ciclohexano carbónico. La
mezcla de reacción se agita durante 1 hora y después el sedimento de
color blanco se separa. El disolvente se retira del filtrado al
vacío. El producto se cristaliza a partir de 2 ml de acetona
añadiendo la trietilamina. El sedimento se separa y se lava con una
mezcla de 2 ml de éter y acetona (1:1) y 2 ml de metanol con acetona
(1:1) con la adición de trietilamina. R_{f} 0,57 (7). El
rendimiento es 184 mg (52%). HPLC en las condiciones (1): un pico,
tiempo de retención 18,05 minutos. Espectro
^{1}H-RMN (CD_{3}OD), \delta, ppm:
1,36-1,78 (m, 10H,
(CH_{2})_{5}-ciclohexano), 2,18 (m, 1H,
>CH-CO-), 2,8 (t, 2H,
\beta-CH_{2}-HA), 3,41 (t, 2H,
\alpha-CH_{2}-HA), 6,85 (s, 1H,
5-CH-Im), 7,6 (s, 1H,
2-CH-Im).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
18
A una solución de 0,20 g (1,25 mM) de triptamina
en 2,5 ml de dimetilformamida se le añaden 0,17 ml (1,25 mM) de
trietilamina y 0,17 ml (1,25 mM) de cloruro de ciclohexanoílo
mientras se agita vigorosamente. La mezcla de reacción se agita
durante 1,5 horas en la oscuridad y después se añaden 10 ml de una
solución de Na_{2}CO_{3} al 5% y la mezcla se agita durante 30
min más. La emulsión obtenida se extrae con 2 x 15 ml de acetato de
etilo. Los extractos de acetato de etilo se unen, se lavan con 30 ml
de agua y se secan sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. El disolvente se
retira al vacío. El residuo oleoso se purifica en una columna sobre
gel de sílice Kieselgel 60 con un tamaño de partículas de
0,035-0,07 mm (empresa Fluka) con elución por
gradiente de disolventes
cloroformo-cloroformo:metanol (9:1). Las fracciones
que contienen el producto diana se unen y el disolvente se retira
al vacío. El rendimiento es 0,068 g (20,3%). R_{f} 0,63 (1). HPLC
en las condiciones (15): un pico, tiempo de retención: 32,7
minutos. Espectro ^{1}H-RMN (CDCl_{3}),
\delta, ppm: 1,1-1,85 (m, 10H, m,
(CH_{2})_{5}-ciclohexano), 2,0 (m, 1H,
CH-), 2,97 (t, 2H,
\beta-CH_{2}-TA), 3,6 (t, 2H,
\alpha-CH_{2}-TA), 7,0 (s, 1H,
2-CH-Ind), 7,1 (t, 1H,
5-CH-Ind), 7,2 (t, 1H,
6-CH-Ind), 7,4 (d, 1H,
4-CH-Ind), 7,6 (d, 1H,
7-CH-
Ind).
Ind).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
19
A una solución de 0,20 g (1,25 mol) de
triptamina en 2,5 de dimetilformamida se le añaden 0,18 ml (1,25
mol) de trietilamina y 0,17 ml (1,25 mol) de cloruro de hexanoílo
mientras se agita vigorosamente. La mezcla de reacción se agita
durante 1,5 h en la oscuridad y después se añaden 10 ml de una
solución de Ha_{2}CO_{3} al 5% y la agitación continúa durante
30 min más. El sedimento de color blanco se separa y se lava en un
filtro con 2 x 4 ml de agua, 2 x 4 ml de ácido clorhídrico y 3 x 4
ml de agua y después se seca al vacío sobre P_{2}O_{5}. El
producto obtenido se purifica en una columna sobre gel de sílice
Kieselgel 60 con un tamaño de partículas de
0,063-0,2 mm (empresa Merck) con elución por
gradiente de los disolventes
cloroformo-cloroformo/metanol (9:1). Las fracciones
que contienen el producto diana se unen y el disolvente se retira
al vacío. El rendimiento es 0,108 g (33.4%). R_{f} 0,54 (1). HPLC
en las condiciones (15): un pico, tiempo de retención: 33,13
minutos. Espectro ^{1}H-HMP (CDCl_{3}),
\delta, ppm: 1,9 (t, 3H, CH_{3}-), 1,25 (m, 4H,
(CH_{2})_{2}-hexanoílo), 1,6 (m, 2H,
\beta-CH_{2}-hexanoílo), 2,15
(t, 2H,
\alpha-CH_{2}-hexanoílo), 3,0
(t, 2H, \beta-CH_{2}-TA), 3,6
(t, 2H, \alpha-CH_{2}-TA), 7,0
(s, 1H, 2-CH-Ind), 7,1 (t, 1H,
5-CH-Ind), 7,2 (t, 1H,
6-CH-Ind), 7,4 (d, 1H,
7-CH-Ind), 7,6 (d, 1H,
4-CH-Ind).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
20
A una solución de 0,40 g (1,57 mol) de
HCl\cdotH-Trp-OMe en 2,5 ml de
dimetilformamida se le añaden 0,44 ml (3,14 mol) de trietilamina y
0,216 ml (1,57 mol) de cloruro de hexanoílo mientras se agita.
Después de refrigerar la mezcla de reacción con hielo durante 2,5
h, se añaden 20 ml de una solución de Na_{2}CO_{3} al 5% y la
mezcla se agita durante 10 min. El producto se extrae con 2 x 25 ml
de acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo unidos se
lavan con un volumen igual de agua y se secan sobre Na_{2}SO_{4}
anhidro. El disolvente se retira al vacío. El residuo oleoso se
purifica en una columna sobre gel de sílice Kieselgel 60 con un
tamaño de partículas de 0,063-0,2 ml (empresa
Fluka), con elución por un gradiente de disolventes
cloroformo-cloroformo/metanol (9,5:0,5) Las
fracciones que contienen el producto diana se unen y el disolvente
se retira al vacío. El rendimiento es 0,138 g (27,7%). R_{f} 0,79
(1). HPLC en las condiciones (16): un pico, tiempo de retención:
6,92 min. Espectro ^{1}H-RMN (CDCl_{3}),
\delta, ppm: 0,9 (t, 3H, CH_{3}-), 1,24 (m, 4H,
\gamma,\delta, -CH_{2}-hexanoílo), 1,57 (m,
2H, \beta-CH_{2}-), 2,13 (t, 2H,
\alpha-CH_{2}-), 3,31 (d, 2H,
\beta-CH_{2}-Trp), 3,7 (s, 3H,
CH_{3}O-), 4,96 (t, 1H,
\alpha-CH-Trp), 7,0 (s, 1H,
2-CH-Ind), 7,12 (m, 2H,
5-CH, 6-CH-Ind),
7,33-7,53 (dd, 1H,
4,7-CH-Ind).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
21
A una solución de 0,30 g (1,84 mol) de
clorhidrato del ácido imidazol-acético en 2,5 ml de
DMF se le añaden 0,248 g (1,84 mol) de
1-oxibenzotriazol y 0,38 g (1,84 mol) de
ciclohexilcarbodiamida mientras se agita y se enfría con hielo.
Después, la mezcla de reacción se agita durante 1 hora y se mantiene
durante 20 horas a +4ºC. El sedimento de diciclohexilurea se separa
y el disolvente se retira del filtrado al vacío. Las fracciones que
contienen el producto diana se unen y el disolvente se retira al
vacío. El rendimiento es 0,12 g (29%). R_{f} 0,39 (2). HPLC en
las condiciones (15): tiempo de retención de la sustancia individual
es 28,01 minutos. Espectro ^{1}H-RMN
(CDCl_{3}), \delta, ppm: 0,9 (t, 3H, CH_{3}-), 1,3 (m, 10H,
-(CH_{2})_{5}-), 1,8 (t, 2H,
\alpha-CH_{2}-), 3,0 (s, 2H, -CH_{2}-), 7,6
(s, 1H, 5-CH-Im), 8,2 (s, 1H,
2-CH-Im). Espectro de masas:
[M+1H]^{+}, m/z: 224.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
22
Se añade una solución de 0,8 g (5,29 mol) de
Boc-\beta-Ala en 4 ml de etanol a
una solución de 1,38 g (5,29 mol) de carbonato de cesio en agua. El
disolvente se retira al vacío. El residuo oleoso se seca al vacío
hasta que se forman 1,45 g de un residuo vítreo de la sal de cesio
Boc-\beta-Ala, que después se
disuelve en 10 ml de DMF. A la solución se le añaden 0,538 ml (4,53
mol) de bromuro de bencilo mientras se agita y se enfría y después
la mezcla se agita durante 1,5 horas más. El sedimento de bromuro
de cesio se separa y el disolvente se retira del filtrado al vacío.
El residuo oleoso se purifica por cromatografía en columna sobre
gel de sílice con elución por cloroformo. Se producen 0,70 g (55,0%)
de éster bencílico de
Boc-\beta-Ala. R_{f} 0,27
(9).
\vskip1.000000\baselineskip
A 0,60 g (2,15 mol) de
Boc-\beta-Ala-OBzl
se le añaden 3,5 ml de una solución 4 N de HCl en dioxano y la
mezcla se mantiene durante 40 min. Después, se añaden 3 x 5 ml de
éter anhidro y el disolvente se retira al vacío. El residuo oleoso
se disuelve en 3,5 ml de DMF y se añade trietilamina hasta obtener
un pH 8. Se añaden 0,622 g (2,15 mol) de
Z-L-His y 1,63 g (2,15 mol) de
"complejo F" mientras se enfría con hielo y se agita. Después,
la mezcla de reacción se agita a 0ºC durante 1 hora más y después se
mantiene durante 20 horas a +4ºC. El sedimento de diciclohexilurea
se separa y el disolvente se retira del filtrado al vacío. El
residuo oleoso se disuelve en acetona y se añade trietilamina hasta
obtener un pH 9. El disolvente se retira al vacío y el residuo se
purifica en una columna sobre gel de sílice en un gradiente de
disolventes de cloroformo-cloroformo/metanol
(9,5:0<5). Se producen 0,170 g de una sustancia sólida de color
blanco. R_{f} 0,44 (1).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de 0,14 g de
Z-L-His-\beta-Ala-OBzl
en 3 ml de metanol se le añaden 0,1 g de paladio al 10% sobre
carbón y la mezcla de reacción se agita durante 1,5 horas, dejando
pasar periódicamente la corriente de hidrógeno. El catalizador se
separa, el disolvente se retira al vacío y después el residuo se
seca. El rendimiento es 0,085 g (98%). R_{f} 0,69 (10). HPLC en
las condiciones (15): tiempo de retención de la sustancia
individual: 3,55 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
23
A una solución de 1,7 g (3,48 mM) de
Boc-Asp(pBzl)OPEP se le añaden 5 ml de
DMF mientras se agita. Después, la mezcla se reacción se agita
durante 1,5 horas más y después se mantiene durante 20 h a +4ºC. El
disolvente se retira al vacío. El residuo oleoso se se disuelve en 2
ml de cloroformo y se añade trietilamina hasta obtener un pH 8 y
después el residuo se purifica en una columna de 30 x 1,5 cm sobre
gel de sílice 40/100 en un gradiente de disolventes
cloroformo-cloroformo/metanol (9:1). Las fracciones
que contienen el producto diana se unen y se evaporan. Se produce
una sustancia incolora. El rendimiento es 800 mg (55%), R_{f}
0,29 (1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 85 mg de
Boc-Asp(OBzl)HA se diluyen en 2 ml de
metanol, después se añaden 80 mg de Pd/C y la mezcla de reacción se
agita durante 1,5 horas, dejando pasar periódicamente la corriente
de hidrógeno. El catalizador se retira por filtración y el
disolvente en el filtrado se evapora. Se producen 65 mg (95%) de
aceite transparente. R_{f} 0,35 (3).
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de 65 mg de
Boc-Asp-HA en 2 ml de HCl 4 N en
dioxano se mantuvo durante 40 min. El disolvente se retira al
vacío. El residuo se lava con éter seco y después el disolvente se
retira al vacío. El rendimiento es 50 mg (83%) 2HCl
Asp-HA. R_{f} 0,57 (10). Espectro ^{1}RMN
(CDCl_{3}+CD_{3}OD),\delta, ppm: 2,0 (d, 2H,
\beta-CH_{2}-Asp), 2,9 (t, 2H,
\beta-CH_{2}-HA), 3,5 (t, 2H,
\alpha-CH_{2}-HA), 4,2 (t, 1H,
\alpha-CH-Asp), 7,0 (s, 1H,
5-CH-Im), 8,15(1H, s,
2-CH-Im). Espectro de masas, m/z:
[M+1H] 227.2.
De acuerdo con técnicas típicas, también se
producen nuevos compuestos de fórmula general (I) que se muestran
en la Tabla 2.
\newpage
A continuación, se presentan ejemplos de ensayos
biológicos con compuestos de la presente invención.
Todos los resultados experimentales se
procesaron estadísticamente [Gubler E.V. Computer análisis methods
and recognition of pathological processes, Moscú, Nauta publishers
(1978), 365 págs.].
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
24
Se usaron ensayos para determinar la vida media
de animales en un volumen cerrado y el modelo de hipoxia hipobárica
aguda en la rarefacción mínima atmosférica (170-185
mm Hg) para estudiar la actividad antihipóxica de los compuestos de
fórmula general (I).
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones se colocaron uno por uno en tarros
de vidrio cerrado herméticamente y se registra su vida media.
El experimento se realiza con 90 ratones macho
cruzados que tienen una masa corporal inicial de 20 \pm 0,5 g,
que se mantienen jaulas de 10 animales y se les da una ración de
animalario convencional. La vida media de un ratón en un recipiente
cerrado que tiene un volumen de 250 ml se determinó previamente y
era de 22 a 25 minutos. Todos los grupos tenían 10 animales cada
uno.
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- hipoxia previa durante 12 minutos;
- b)
- primera administración del compuesto inmediatamente después de la hipoxia previa;
- c)
- segunda administración del compuesto 24 horas después de la primera administración, después administración diaria durante tres días;
- d)
- registro de la longevidad de los animales en condiciones hipóxicas en un espacio cerrado herméticamente, 2 horas después de la última administración del compuesto.
Los compuestos de ensayo se disolvieron en agua
destilada y se administraron por vía oral a los animales durante 5
días.
\vskip1.000000\baselineskip
- Grupo 1 -(control)-
- sin hipoxia previa, con administración oral de agua destilada durante 5 días;
- Grupos 2 y 3 -
- administración del compuesto XLIV usando dosis de 50 y 500 \mug, respectivamente,
- Grupo 4 -
- administración por vía oral de oxibutirato sódico a una dosis de 300 mg/kg 2 horas antes de la hipoxia;
- Grupo 5 -(control)-
- con hipoxia previa durante 12 minutos con administración posterior de agua destilada durante 5 días;
- Grupos 6 y 7 -
- administración del compuesto XLIV usando dosis de 50 y 500 \mug, respectivamente;
- Grupos 8 y 9 -
- administración del compuesto III usando dosis de 50 y 500 \mug, respectivamente.
\newpage
Los datos presentados en la Tabla 3 dan
evidencia del hecho de que los compuestos de la presente invención
poseen una fuerte actividad antihipóxica, aumentando
significativamente la longevidad de los Animales experimentales un
20-50 por ciento. Debe apreciarse que los compuestos
ensayados elevan la longevidad de un ratón en un modo comparable
con el efecto del fármaco de referencia (oxibutirato sódico) cuando
se administra a dosis que son inferiores por
tres-cuatro órdenes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La estimulación de AHBH se realizó en una cámara
de flujo continuo a una temperatura de 22ºC. Los experimentos se
realizaron en ratones mestizos con una masa corporal inicial de 20
g, con una rarefacción mínima de 170-185 mm Hg, que
se corresponde a una altitud de 10500-11000 m. La
velocidad de elevación era de 35 m/segundo. Cada grupo incluyó 15
animales. Los compuestos se administraron por vía oral y la
elevación hasta la altitud se realizó 2 horas después de la última
administración.
\vskip1.000000\baselineskip
- Grupo 1 - control intacto -
- administración de solución salina normal cuatro veces.
- Grupos 2 y 3 -
- administración de compuesto III en dosis de 50 y 500 \mug/kg, respectivamente, durante 4 días.
- Grupo 4 -
- administración única de oxibutirato sódico a una dosis de 300 \mug/kg.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se procesan estadísticamente.
\newpage
Los resultados presentados en la tabla 4 prueban
el hecho de que la administración del compuesto a una dosis de 500
\mug/kg aumenta la vida de los animales en condiciones
hipóxicas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
25
La actividad antiisquémica de compuestos se
evaluó mediante un ensayo integral, es decir, el efecto sobre el
tamaño de la zona de necrosis después de la reproducción de infarto
de miocardio en ratas mestizas que pesaban 250-
300 g.
300 g.
El efecto de un compuesto sobre el tamaño de la
zona de necrosis se estudió 4 horas después de la oclusión arterial
en ratas usando un método de indicador diferencia [Sernov L. N.,
Gatsura V. V., A differential indicator method for determinig
ischemic and necrotic zone in experimental myocardial infarction in
rats, Bulletin of Experimental Biology and Medicine (1989), No 5,
págs. 534-535]. Todas las manipulaciones dolorosas
se realizaron en animales con anestesia de etaminal (Etaminal - 40
mg/kg por vía intraperitoneal). Los experimentos se realizaron 15
horas después de la última administración de compuesto. Cada grupo
incluía 8 animales.
\vskip1.000000\baselineskip
- Grupo 1 - control intacto -
- administración de solución salina normal cuatro veces.
- Grupos 2 y 3 -
- administración oral de compuesto III a la dosis de 50 y 500 \mug/kg, respectivamente, durante 4 días.
- Grupo 4 -
- administración intraperitoneal única de Nicorandilo a una dosis de 1 mg/kg inmediatamente después de la oclusión.
\newpage
Los datos presentados en la Tabla 5 proporcionan
evidencia del hecho de que los compuestos poseen actividad
antiisquémica.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
26
Se realizaron ensayos en cobayas mestizas con
una masa corporal inicial de 250-300 g, a los que se
administró una ración de animalario general. La sensibilización de
los animales se realizó de acuerdo con el método publicado
[Shaternikov V. A., Marokko I. N., Pyatnitsky N. N.; Shirina L. I.,
Gorgoshidze L. Sh., Kasyanenko V. V., Sugonyaeva N. P.,Zhminchenko
V. M., Vinokurova N. M., Experimental reproduction of food
anaphylaxis, Voprosy pitaniya (Nutrition problems) (1982) No 2,
págs. 27-31], con ovoalbúmina (OVA) de pollo
recristalizada una vez fabricada por Olajne
Scientific-Productive Amalgamation BIOCHEMREACTIV; a
una dosis de 50 mg por animal diariamente durante 3 días. 14 días
después de la finalización de la sensibilización, se indujo el
choque anafiláctico activo (AAS) en los animales con inyección
intravenosa de una proteína homóloga que provoca anafilaxia a una
dosis de 5 mg en 0,5 ml de solución salina normal. Se evaluó la
gravedad de AAS por el nivel de mortalidad, el número de signos de
ataques y por el valor de índice anafiláctico [Weigle W., Cochrane
C, Dixon F. Anaphylactogenic properties of soluble
antigen-antibody complexes in the guinea pigs and
rabbits. J. Immunology. (1969), Vol. 85, págs. 469-
477].
477].
Los compuestos III y XLV y Claritine (grupos 2,
3 [30 cobayas] y 4 [24 animales], respectivamente) se administraron
por vía oral durante 3 días antes de provocar la anafilaxia a una
dosis de 50 \mug/kg para los compuestos III y XLV y de 1000
\mug/kg para Claritine. A los animales del grupo de control en los
términos respectivos se administró solución salina normal (grupo de
1-30 cobayas).
La significación de las diferencias entre los
grupos se determinó usando el método de Fischer de transformación
angular [Gubler E. V. Computer methods of analysis and recognition
of pathological processes. Moscow, Nauka publishers (1978) 365
pág.].
\newpage
La tabla 6 muestra una disminución significativa
en la gravedad de las manifestaciones de choque anafiláctico en
cobayas a los que se administró los compuestos III y XLV en
comparación tanto con el grupo de control como el grupo de animales
a los que se administró Claritine.
Ejemplo
27
El efecto antiasmático de los compuestos de
ensayo se estudió usando un modelo de broncoespasmo inducido por
antígeno en cobayas sensibilizadas de forma activa de acuerdo con el
método de Andersson [Andersson P. Antigen induced bronchial
anaphylaxis in actively sensitized guinea pig. Allergy (1980), Vol.
35, págs. 65-71].
Se sensibilizaron cobayas macho con una
inyección intramuscular de 0,5 ml de suspensión que comprendía 20
\mug de ovoalbúmina (OVA, fabricada por la compañía Sigma [calidad
III] y 10 mg de Al (OH)_{3} por animal. Se inyectó por vía
intravenosa (vena yugular) una dosis que provoca anafilaxia de
150-200 \mug/kg de OVA en 0,1 ml de solución
salina normal el día 26 después de la sensibilización. La inducción
del broncoespasmo y la medición de los parámetros de la respiración
externa se realizaron de acuerdo con el método descrito en
Yu-Hong L, Barnes P., Rogers D., Inhibition of
neurogenic plasma exudation and bronchoconstriction by a K+ channel
activator, BRL 38227, in guinea pig airways in vivo. Europ.
J. Pharmacol., Vol. 239, págs. 257-259]. La
medición de los parámetros respiratorios se realizó usando un
transductor (Ugo Basel, modelo 7020), conectado con una cánula y un
registrador (Millichrome) para registrar la amplitud de la
respiración. Se observó la dinámica del broncoespasmo durante
30-60 minutos. Se determinó la eficacia de los
compuestos mediante el cambio en el valor del broncoespasmo.
Se ensayaron varios compuestos de la presente
invención (III, VI, XLIV, XLVIII, XLIX). Los compuestos se
disolvieron en solución salina normal y se infundieron por vía
intragástrica a los animales a una dosis de 50 \mug/kg 72, 48 y
18 horas antes de la inducción del broncoespasmo, es decir, se
infundieron tres veces, y el compuesto III, por vía intratraqueal
con la misma dosis 15 minutos antes de la inducción del
broncoespasmo. Se usó Inthal como un fármaco de referencia y se
administró a los animales a una dosis de 5 \mug/kg de acuerdo con
el mismo protocolo de dosificación con el que se administraron las
sustancias de ensayo. El grupo de control de animales recibió una
cantidad equivalente de solución salina normal.
Los compuestos III y XLIV se estudiaron con
mayor detalle.
Grupos de animales: grupo 1 - control; grupo 2 -
animales a los que se administra Inthal; grupo 3 - animales a los
que se administra el compuesto XLIV oral; grupo 4 - animales a los
que se administra compuesto III oral; grupo 5 - animales a los que
se administra el compuesto III intratraqueal; grupo 6 - animales a
los que se les administra el compuesto XLIX, grupo 7 - (ejemplo
comparativo) - animales a los que se administra el compuesto XXXI,
grupo 8 - animales a los que se administra el compuesto XLVI; grupo
9 - animales a los que se les administra el compuesto VII, grupo 10
- animales a los que se les administra el compuesto XLVIII.
Todos los compuestos ensayados disminuyeron el
valor de broncoespasmo el 20-70% en comparación con
los valores de control. El Inthal disminuyó el valor del
broncoespasmo prácticamente el 50%.
La tabla 7 resume los resultados, probando el
hecho de que los compuestos de la presente invención disminuyen el
valor del broncoespasmo más del 50% en comparación con los valores
de control.
Por tanto, los compuestos ensayados de la
presente invención provocaron una disminución similar en el valor
del broncoespasmo que el fármaco de referencia Inthal. El efecto se
puso de manifiesto para la ración de administración tanto oral como
intratraqueal de los compuestos. Sin embargo, la dosis eficaz de las
sustancias ensayadas era dos órdenes menor que la del Inthal.
Ejemplo
28
Se realizaron experimentos en ratones macho
mestizos con una masa corporal inicial de 22-24 g.
Cada grupo incluía 10 animales. Se consiguió la sensibilización de
los animales mediante la inyección por vía intradérmica de
20-30 \mul del suero de ratones obtenido de
animales inmunizados de forma preliminar que comprendía anticuerpos
reactivos contra ovoalbúmina (OVA) de pollo. Los compuestos de
ensayo III y XLIV se administraron por vía oral a los animales
durante 3 días comenzando con el día de la sensibilización dérmica.
Se usaron dosis de 50, 150 y 500 \mug/kg para el compuesto III y
se usó una dosis de 50 \mug/kg para el compuesto XLIV. Los
fármacos de referencia Suprastine a una dosis de 10 mg/kg y
Claritine a una dosis de 2 mg/kg se administraron de un modo
similar. 48 horas después de la sensibilización, se inyectó por vía
intravenosa una dosis de OVA que provoca anafilaxia (1 mg y 0,2 ml
de azul de Evans en 0,2 ml de solución salina normal) en los
ratones. Se determinó la intensidad de la reacción de anafilaxia
cutánea pasiva (PCA) en 30 minutos por el tamaño (área) de un punto
azul sobre la superficie de la piel interna en el sitio de
administración de los anticuerpos reactivos. Se midió el tamaño del
punto en dos direcciones mutuamente perpendiculares y se expresó el
resultado en mm^{2}.
Los resultados presentados en la Tabla 8 prueban
el hecho de que la administración del compuesto en ensayo III a una
dosis de 50 \mug/kg a ratones da como resultado una disminución
significativa en la intensidad de la reacción de PCA del 42% y a
dosis de 150 y 500 \mug/kg, del 34,3% y 30,0%, respectivamente. La
administración del compuesto XLIV da como resultado la disminución
de la intensidad de la reacción de PCA en el 50%. La administración
de Suprastine a animales de experimentación no cambió las
manifestaciones de PCA. Cuando se usó Claritine, se observó una
disminución pronunciada en la reacción de PCA.
Por tanto, los compuestos III y XLIV posen la
capacidad de disminuir la manifestación de PCA en un mayor alcance
que Suprastine. Se inhibió la intensidad de la reacción de PCA en un
mayor alcance con la administración de Claritine que con la
administración de los compuestos III y XLIV, sin embargo, la dosis
eficaz de Claritine era un orden mayor que la de los compuestos III
y XLIV.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
29
Se realizaron estudios en ratones macho blancos
mestizos con una masa corporal inicial de 22-24 g.
Cada grupo incluía 10 animales. Los ratones se sensibilizaron por
inyección intravenosa de la suspensión de 2 x 10^{5} glóbulos
rojos de oveja en 0,05 ml de solución salina normal. El día 5, la
suspensión de 10^{8} glóbulos rojos de oveja en 0,05 ml de
solución salina normal se inyectó en la almohadilla de la pata
trasera. Como un control se inyectó el disolvente, es decir,
solución salina normal en una cantidad equivalente. La intensidad
de la reacción se evaluó después de 24 horas por la diferencia en la
masa de la pata de cada animal.
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\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto de ensayo III se administró por vía
oral durante tres días a dosis de 50 y 500 \mug/k de acuerdo con
el protocolo de dosificación: días 3, 4 y 5. La administración de la
dosis que provoca anafilaxia fue en el día 5.
Los datos presentados en la Tabla 9 muestran que
la administración del compuesto III a dosis de 50 y 500 \mug/kg
disminuye significativamente la intensidad de la hipersensibilidad
retardada.
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El estudio del efecto de los compuestos sobre la
reacción de hipersensibilidad de tipo retardada inducida en ratones
por 2,4,6-triclorobenzol (TCB) se realizó de acuerdo
con el método de Tarayre et al. [Tarayre J. P., Barbara M.,
Aliaga M., Tisne-Versilles, Comparative actions of
immunosuppressants, glucocorticoids and
non-steroidal antiinflammatory drugs on various
models of delayed hypersensitivity and on a
non-immune inflammation in mice. Arzneim.-Forsch.
Drug Res. (1990), Vol. 40, págs. 1125-1131].
Se realizaron estudios en ratones macho mestizos
con una masa corporal inicial de 30-35 g. Cada grupo
incluía 10 animales. Los ratones se sensibilizaron por la
aplicación de 0,1 ml de solución de TCB al 3% en acetona en un área
abdominal rasurada. Después de 7 días se aplicó una dosis de TCB que
provoca anafilaxia (0,025 ml de solución al 3%) sobre ambas
superficies de la oreja derecha. Después de 30 minutos, se aplicaron
0,05 ml de la pomada de ensayo sobre las mismas superficies. 24
horas después de la inducción de edema se sacrificaron los ratones
y se cortaron y pesaron sus orejas. Se evaluó la intensidad de la
reacción alérgica midiendo la diferencia de peso en gramos de la
oreja derecha (la de ensayo) con respecto a la oreja izquierda (la
oreja de control).
La inhibición de la reacción alérgica expresada
en porcentaje se calculó de acuerdo con la fórmula:
donde R = el peso de la oreja
derecha y L = el peso de la oreja
izquierda.
Control = animales intactos, experimento =
animales a los que se administraron los compuestos.
Los compuestos de ensayo se aplicaron sobre la
oreja en forma de pomadas al 1% y 5%, cuya base era una solución de
metilcelulosa al 10% y propilenglicol a una proporción de 1:1.
\vskip1.000000\baselineskip
- Grupo 1 -
- control, se aplicó base de pomada sin sustancia activa sobre la oreja de los animales.
- Grupo 2 -
- se aplicó base de pomada que comprendía compuesto III al 1% sobre la oreja de los animales.
- Grupo 3 -
- se aplicó base de pomada que comprendía compuesto XVII al 1% sobre la oreja de los animales.
- Grupo 4 -
- se aplicó base de pomada que comprendía compuesto XLVII al 5% sobre la oreja de los animales.
Los datos presentados en la Tabla 10 prueban el
hecho de que los compuestos de ensayo poseen la capacidad de
inhibir la hipersensibilidad retardada inducida por TCB.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
30
El experimento se realizó con ratas macho
mestizas blancas que pesaban 280-300 g. Se reprodujo
el modelo de edema de pata inducido por el adyuvante completo de
Freund (FCA) de acuerdo con el método de Ezamuzie y Umezurike
[Ezamuzie Ch., Umezurike C. C., Effect of histamine
H2-receptor antagonists on acute inflammatory of the
rat paw oedema. J. Pharmacol. (1989), Vol. 41, págs.
261-265]. Se realizó la medición del volumen de la
pata usando un pletismógrafo (Ugo Basile). La inhibición de la
reacción inflamatoria, expresada en porcentaje, se calculó de
acuerdo con la fórmula:
donde R = el volumen de la pata
derecha y L = el volumen de la pata
izquierda.
Control - animales intactos, experimento =
animales a los que se administraron los compuestos.
Los compuestos de ensayo se administraron por
vía intragástrica a animales mediante una sonda cuatro veces a una
dosis de 50 \mug/kg en 0,5 ml de solución de almidón al 1%, 72,
48, 24 y 1 hora antes de la administración de FCA. El fármaco de
referencia Naproxeno se administró una vez a una dosis de 50
\mug/kg 1 hora antes de la inducción de edema. Cada grupo incluía
10 animales.
\vskip1.000000\baselineskip
- Grupo 1 -
- control, a los animales se administraron 0,5 ml de solución de almidón al 1%.
- Grupo 2 -
- a los animales se administró el compuesto XLVIII.
- Grupo 3 -
- a los animales se administró el compuesto III.
- Grupo 4 -
- a los animales se administró Naproxeno.
Los datos presentados en la Tabla 11 prueban el
hecho de que los compuestos ensayados poseen la capacidad de
inhibir la reacción inflamatoria inducida por FCA. La intensidad del
efecto antiinflamatorio para el compuesto III es comparable al
efecto de Naproxeno, pero la dosis total de Naproxeno era 25 veces
superior que la del compuesto III.
Este experimento se realizó en ratas macho
mestizas blancas que pesaban 280-300 g. Se provocó
el edema inducido por carragenina de acuerdo con el método de
Winter et al. [Winter, De Rosa M., Giroud J. P., Willoughby
D. A., Studies of the mediators of the acute inflammatory reponse
induced in rats in different sites by carrageenan, and turpentine;
J. Pharmacol. (1971), Vol. 104, págs. 15-29]. Se
midió el volumen de la pata usando un pletismógrafo (Ugo Basile) 1,
3 y 4 horas después de la administración de carragenina. Se calculó
la inhibición de la reacción inflamatoria, expresada en porcentaje,
de acuerdo con la fórmula:
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde R = el volumen de la pata
derecha y L = el volumen de la pata
izquierda.
Control = animales intactos; experimento =
animales a los que se administraron los compuestos.
\vskip1.000000\baselineskip
Serie I de experimento. Los compuestos de ensayo
se administraron por vía intragástrica a animales a través de una
sonda cuatro veces, a una dosis de 50 \mug/kg en 0,5 ml de
solución de almidón al 1%, 72, 48, 24 y 1 hora antes de la
administración de FCA. El fármaco de referencia en Naproxeno se
administró una vez a una dosis de 20 \mug/kg 1 hora antes de la
inducción de edema. Cada grupo incluyó 10 animales.
\vskip1.000000\baselineskip
- Grupo 1 -
- control, a los animales se administraron 0,5 ml de solución de almidón al 1%.
- Grupo 2 -
- a los animales se administró el compuesto III.
- Grupo 3 -
- a los animales se administró el compuesto II.
- Grupo 4 -
- a los animales se administró Naproxeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos presentados en la Tabla 12 prueban el
hecho de que los compuestos, con administración oral, poseen la
capacidad de inhibir la reacción inflamatoria inducida por
carragenina. La intensidad del efecto antiinflamatorio del
compuesto III es comparable al efecto de Naproxeno, cuando la dosis
total de Naproxeno era 10 veces mayor que la del compuesto III.
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Serie 2 del experimento. Se inyectó una solución
de carragenina al 2% por vía sublateral en las patas de las ratas.
Después de 1 minuto se aplicó 0,1 ml de un gel que comprende los
compuestos de ensayo a la pata derecha. La base de gel consistía en
propilenglicol disuelto en una mezcla de agua y etanol. La
concentración de los compuestos en el gel fue del 1%. El volumen de
las patas se midió 4 horas después de la administración de
carragenina.
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- Grupo 1 - control-
- 1, se aplicó gel sin compuesto sobre la pata.
- Grupo 2 -
- el gel aplicado comprendía el compuesto XL.
- Grupo 3 -
- el gel aplicado comprendía el compuesto III.
- Grupo 4 -
- el gel aplicado comprendía el compuesto XXXVI.
- Grupo 5 -
- el gel aplicado comprendía el compuesto XIII.
- Grupo 6 -
- control - 2, se aplicó gel sin compuesto sobre la pata.
- Grupo 7 -
- gel comprendía Voltaren al 1%.
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Los datos presentados en la Tabla 13 prueban el
hecho de que los compuestos ensayados en aplicación cutánea poseen
la capacidad de inhibir la reacción inflamatoria inducida por
carragenina. La intensidad del efecto antiinflamatorio de los
compuestos es comparable con el efecto del fármaco de referencia
Voltaren.
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\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
31
Se estudió el efecto antiinflamatorio e
inmunomodulador del compuesto III después de la administración
intragástrica usando el modelo de granulomatosis pulmonar no
infecciosa.
Se usaron 20 ratas Wistar hembra de cuatro meses
de edad que pesaban 200-220 g en el experimento. Las
ratas Wistar se seleccionaron debido a que con la administración en
aerosol de Sephadex A-25 se desarrolla un proceso
inflamatorio granulomatoso en los pulmones [Makarova O. V., Kovaleva
V. L., Sladkopevtsev A. S., Mikhailova L. P., Noseikina E. M.,
Experimental model of non-infectious pulmonary
granulomatosis (1996), No 1, págs. 76-79]. Los
datos sobre el número de animales en los grupos se presentan en la
Tabla 14.
Se administró Sephadex A-25, a
una dosis de 5 mg por 1 kg de masa corporal, a ratas con anestesia
con éter usando un dispositivo de dosificación original para la
administración en inhalación de polvos secos fabricados por el
Scientific-Research Institute for Medical
Instrument-Making. Las ratas Wistar se recuperaron
rápidamente de la anestesia después de la administración de
Sephadex A-25 y no mostraron ninguna peculiaridad en
su comportamiento y carácter de respiración. Se administró el
compuesto III por vía intragástrica usando una sonda gástrica a una
dosis de 50 mg por 1 kg de masa corporal e, inmediatamente después
de esto, se realizó la administración en aerosol única de Sephadex
A-25 de acuerdo con la técnica que ya se ha
descrito. Después, el compuesto III se administró por vía
intragástrica una vez al día durante 6 días a una dosis de 50 mg/kg
de masa corporal, en forma de una solución de agua. Las ratas se
examinaron el 7º día después del comienzo de la administración del
compuesto III y Sephadex A-25.
Se obtuvo un lavado broncoalveolar con anestesia
con Hexenal. Se determinó la citosis, es decir, el número absoluto
de células en 1 ml, en el fluido de lavado broncoalveolar. Se
calculó el histograma endopulmonar (en porcentaje) en los frotis
teñidos de acuerdo con Romanovsky-Gimza. Después del
procedimiento de lavado broncoalveolar, los pulmones con tráquea se
extirparon de la cavidad torácica y la macropreparación se puso en
una solución de ácido acético al 2%. Después de
18-24 horas, la tráquea, los bronquios principal y
lobares se diseccionaron bajo una lupa. La densidad en volumen de
los folículos linfoides se estimó bajo la lupa usando el método de
recuento por puntos. Se realizó un examen histológico de pulmones
teñidos con hematoxilina y eosina. Se determinó la densidad en
volumen de alveolitis y enfisema usando el método de recuento por
puntos.
El examen histológico de los pulmones de las
ratas del grupo de control (animales intactos) no puso de manifiesto
ningún cambio patológico. El examen histológico de los pulmones de
ratas Wistar el día 7 después del efecto en aerosol de Sephadex
A-025 encontró una imagen morfológica de un proceso
inflamatorio granulomatoso de granulomas de macrófagos maduros,
bronquitis aguda y alveolitis con componente neutrófilo, enfisema
focal. Los granulomas se dispusieron a lo largo del tejido
conectivo pulmonar y la mayoría de los mismos se encontraron en el
tejido conectivo a lo largo de vasos sanguíneos, ramas de arteria
pulmonar y venas pulmonares así como en la pared de los bronquios.
Se encontró una pequeña porción de pequeños granulomas de macrófagos
en el intersticio de los "ángulos" de septos interalveoloares,
pasos alveolares y bronquiolos respiratorios y terminales. La
composición celular de los granulomas estaba representada de forma
predominante por macrófagos así como por ocasionales neutrófilos y
linfocitos. En el examen morfométrico de los pulmones de ratas
Wistar, los parámetros densidad de volumen de alveolitis y de
enfisema eran 7,0 \pm 3,0 y 15,1 \pm 5,1%, respectivamente
(Tabla 15).
De acuerdo con los datos del examen citológico
de fluido de lavado broncoalveolar en ratas Wistar el día 7 después
del efecto de aerosol de Sephadex A-25, el índice de
citosis aumentó en comparación con el control (Tabla 16). Se
observó el aumento en el porcentaje de contenido de neutrófilos y
linfocitos en el histograma endopulmonar, pero las diferencias no
eran estadísticamente significativas.
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En el grupo de ratas tratadas con compuesto III,
el examen histológico de los pulmones también puso de manifiesto la
imagen de la inflamación granulomatosa. De acuerdo con los datos del
examen morfométrico, la prevalencia de alveolitis y enfisema
disminuyó y era 38 \pm 1,0 y 11,2 \pm 3,2%, respectivamente,
pero las diferencias no eran estadísticamente significativas (véase
la Tabla 15). De acuerdo con los datos del examen citológico, el
índice de citosis en el grupo de ratas tratadas con compuesto III se
normalizó (véase la tabla 16). Se encontró una disminución
significativa en el porcentaje de contenido de neutrófilos y
linfocitos en el citograma endopulmonar, sin embargo, no se observó
la normalización de los parámetros.
El efecto del compuesto III sobre el sistema
inmune pulmonar se evaluó por su efecto sobre el tejido linfoide
asociado con bronquios. Los parámetros morfométricos de densidad de
volumen del tejido linfoide asociado con bronquios se representa en
la Tabla 17.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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El índice de densidad de volumen de folículos
linfoides en ratas Wistar normalmente era hasta del 15,0 \pm
3,9%. Se observó una hiperplasia del aparato linfoide pulmonar
pronunciada el día 7 después de la exposición a aerosol de Sephadex
A-25, siendo el índice de densidad de volumen de
folículos linfoides del 44,8 \pm 3,7%. En el grupo de ratas
tratadas con el compuesto III, la densidad de volumen de folículos
linfoides disminuyó hasta el 34,7 \pm
10,3%.
10,3%.
Por tanto, se observó que el compuesto III tenía
actividad antiinflamatoria sobre la granulomatosis no infecciosa
pulmonar inducida por Sephadex -A-25. De acuerdo con
los datos de exámenes patológicos, morfométricos y citológicos, el
compuesto III induce una disminución en la intensidad del componente
exudativo inflamatorio y la prevalencia de alveolitis, así como la
inhibición de hiperplasia de tejido linfoide.
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Ejemplo
32
Se estudió la actividad antioxidante en un
experimento in vivo, usando el modelo de lesión hepática
tóxica aguda con cuadricloruro de carbono (CCl_{4}).
El experimento se realizó en 40 ratas macho
mestizas con una masa corporal inicial de 190-200 g
y alimentadas con una ración de animalario convencional. Cada grupo
incluyó 10 animales. La lesión hepática (hepatitis experimental) se
indujo en los animales por administración intragástrica de 0,25 ml
por 100 g de masa corporal de CCl_{4} en forma de una solución al
50% en aceite de vaselina durante 3 días [Vengerovsky A. I.,
Chuchalin V. S., Pauls O. V., Saratikov A. S., Effect of
hepatoprotectors on lipid metabolism in hepatitis induced by CCI4,
Bulletin of Experimental Biology (1987), Nº 4, págs.
430-432]. El compuesto de ensayo III se administró
por vía intragástrica a animales a dosis de 50 y 500 \mug/kg
durante 3 días cuando se administró CCl_{4} (grupos 3 y 4). A los
animales del grupo de control se administró CCl_{4} como se ha
descrito anteriormente (grupo 2). A los animales intactos se
administró por vía oral solución salina normal en una cantidad
equivalente (grupo 1).
Se tomaron muestras de sangre y de hígado para
el análisis 18 horas después de la última administración de
CCl_{4}.
CCl_{4}.
El contenido de los productos de peroxidación de
lípido primario (LP) - conjugados de dieno, cetonas de dieno y
trienos - se determinó usando el método publicado [Volchegorsky I.
A., Nalimov A. G., Yarovinsky B. G., Lifshits R. I., Comparison of
different approaches to determining lipid peroxidation products in
heptane-isopropanolic blood extracts, Voprosy
Meditsinskoy Chimii (Problems of Medical Chemistry) (1989), Nº 1,
págs. 127-131]. El contenido de productos LP se
calculó correlacionando los valores de las respectivas extinciones
con 1 ml de muestra de
ensayo.
ensayo.
La cantidad de productos LP - dialdheído
malónico (MDA) - se determinó por el ensayo con ácido tiobarbitúrico
(TBA) [Korobeinikova E. N., Modification of lipid peroxidation
products in the reaction with thiobarbituric acid., Laboratornoye
delo (Laboratory Matter) (1989), Nº 7, págs. 8-10].
La concentración de producto activo de TBA se calculó usando una
ecuación de regresión. El contenido de MDA en el hígado de animales
de experimentación se evaluó usando el método modificado [Stalnaya
I. D., Garishvili T. G., The method of determining malonic
dialdehyde using thiobarbituric acid., En: Modern methods in
biochemistry, Moscow, Meditsina publishers. (1977), págs.
66-69], realizando la extracción preliminar de
lípidos de acuerdo con Folch [Cates M. Technology of Lipidology,
Moscow, Mir publishers (1975), págs. 74-76].
Los resultados presentados en la Tabla 18
prueban el hecho de que la administración de CCl_{4} a ratas dio
como resultado la acumulación de productos de PL en suero sanguíneo
e hígado y que en animales de grupos de experimentación a los que
se administró el compuesto de ensayo se observó una disminución
significativa en el contenido hepático de productos de LP primario
y contenido de MDA en suero y hepático.
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Los números en superíndice 1 y 2 muestran los
números de grupo en relación con los cuales las diferencias son
significativas.
Los resultados mostraron que el compuesto III de
la presente invención posee un efecto antioxidante pronunciado en
el modelo de lesión hepática tóxica aguda.
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Ejemplo
33
El cambio en la duración del sueño por Hexenal
(HS) es el índice medible in vivo de la condición del sistema
de citocromo P-450 hepático.
Se realizaron estudios en ratones macho de las
líneas BALB/c*h75, C57B1/6, CBA, DBA/2 e híbridos de primera
generación CBF1 y BDF1, con una masa inicial de
18-20 g, incluyendo cada grupo 10 ratones; y sobre
cobayas macho mestizos con una masa inicial de
250-300 g, incluyendo cada grupo 24 animales. Todos
los compuestos de ensayo (de II a LII) se administraron por vía
oral en el agua de la bebida, durante tres días a dosis de 50 y 500
\mug/kg. Se administró clorhidrato de Hexenal a una dosis 36
\mug/kg de masa de animales 24 horas después de la última
administración del fármaco, excepto por la línea de ratón
BALB/c*h75, a la que se administró Hexenal a una dosis de 60
\mug/kg al mismo tiempo y cobayas, para las que la dosis de
Hexenal fue 30 \mug/kg. La duración de HS se determinó en
minutos.
minutos.
La Tabla 19 resume los datos sobre el cambio en
la duración del sueño por Hexenal (HS) en ratones de diferentes
líneas, híbridos CBF1 y BDF1, así como en cobayas influidos por los
compuestos de la presente invención. Se demostró que los compuestos
disminuyen la duración de HS en animales de experimentación a dosis
tanto de 50 como de 500 \mug/kg.
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Al examinar los cambios en la duración de HS
influidos por el resto de los compuestos de la presente invención
en ratones CBF1, se mostró que los compuestos disminuyen la duración
de HS del 13% al 54% en comparación con el control.
Por tanto, todos los compuestos ensayados
disminuyen la duración del sueño por Hexenal, lo que prueba que
inducen el sistema de citocromo P-450 hepático.
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Se estudió el cambio en el sistema de
monooxigenasa hepática usando cobayas macho mestizos con una masa
inicial de 250-300 g, cada grupo incluía 12
animales. El compuesto de ensayo III y Fenobarbital (PB) se
administraron tres veces 72, 48 y 24 horas antes del examen del
sistema de monooxigenasa. Se midió el contenido de citocromos
P-450 y B_{6}, de acuerdo con el método publicado
[Omura T., Scato R., The monooxide binding pigment of liver
microsomes., 11. Solubilization, purification and properties. J.
Chem. (1964), Vol. 239, págs. 2379-2385], en la
fracción hepática microsomal y se aislaron usando el método de
centrifugación diferencial [Ahokas J., Pelkonen O., Karkin N.
Characterisation of BP-hydroxylase of
Trout-liver. Cancer Res. (1977), Vol. 37, págs.
3737-3743]. El método de prioridad [Izotov M. V.,
Scherbakov V. M., Devichensky V. M. et al., The method of
determining the content of P-450 cytochrome
isoenzymes in liver microsomes. The inventor's certificate Nº
1,488,738. B. I. (1989), Nº 3.-6.06.09, ICI, 01.- Nº 33/15, Nº
33/48]. Se determinó el contenido de proteína microsomal usando el
método de Lowry modificado [Hartree E. Determination of protein: a
modification of the Lowry method, that gives a linear photometric
responses., Ann. Biochem. (1972), Vol. 48, págs.
422-427].
Los resultados presentados en la tabla 20
prueban el hecho de que en cobayas pretratados con el compuesto de
ensayo y PB, el contenido hepático total de citocromos
P-450 y B_{5} aumenta significativamente. Al mismo
tiempo, los animales de los grupos 2 y 3 mostraron un aumento
significativo en citocromos P-450B y los animales a
los que se administró el compuesto de ensayo de la presente
invención también mostraron un aumento significativo en la
proporción de citocromos P-450B a
P-450L y en la proporción de citocromos B_{5} a
P-450.
Se observó que el compuesto de ensayo III cambia
el sistema de citocromo P-450 hepático de un modo
similar a PB, sin embargo, tiene sus propias peculiaridades, tales
como elevar la proporción de citocromos P-450B a
P-450L y la proporción de citocromos B_{5} a
P-450.
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Ejemplo
34
Se realizaron estudios en cobayas macho mestizos
con una masa corporal inicial de 250-300 g. Cada
grupo incluía 12 animales. La sensibilización de los animales se
realizó como se ha descrito en el ejemplo 27. Se muestreó sangre
(para la determinación del nivel hormonal) en animales antes de
comenzar el experimento y 18 horas después de la última
administración de fármaco durante 10 a 11 horas. La sustancia se
administró por vía oral tres veces a los animales sensibilizados e
intactos, a una dosis de 50 \mug/kg, 72, 48 y 18 horas antes del
segundo muestreo de sangre. Se realizó un análisis de estado
hormonal comparando los cambios individuales en cada animal en un
grupo. Los valores paramétricos medios expresados en nM/l se
presentan en la Tabla 21. Se determinaron los niveles en suero
sanguíneo de las hormonas progesterona,
17-oxiprogesterona,
11-desoxicortisol y cortisol por radioinmunoensayo
usando los kits de la compañía Beloris. La concentración de hormona
en las muestras se determinó a partir del gráfico de relación entre
la actividad de una hormona marcada unida precipitada y la
concentración de hormona en muestras de calibración.
Los resultados experimentales se presentan en la
Tabla 21. La administración del compuesto XLIV a animales intactos
dio como resultado un aumento significativo en los niveles de
Cortisol (F) y de sus precursores oxiprogesterona
(17-OH-P) y desoxicortisol, así como
una tendencia a aumentar el nivel de progesterona (P). En cobayas
sensibilizadas se observó una disminución significativa en los
niveles de F y 17-OH-P de suero
sanguíneo y una tendencia a la disminución en el nivel de P. En
animales sensibilizados a los que se administró el compuesto de
ensayo, se observó una normalización de los niveles de F y
desoxicortisol en suero sanguíneo y un aumento significativo en los
niveles de P y 17-OH-P.
Con la administración del compuesto III a
animales de experimentación tanto intactos como sensibilizados, se
observaron los mismos cambios de estado hormonal.
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Ejemplo
35
Se realizaron estudios en ratones macho CBA
alimentados con una ración de animalario convencional. A los
animales se administró el compuesto a una dosis de 50 \mug/kg y
fenobarbital a una dosis de 80 \mug/kg durante tres días.
Después, los animales se sacrificaron, se extrajeron sus pulmones,
se congelaron en nitrógeno líquido, se homogeneizaron en un
homogeneizador de vidrio fabricado por la compañía Wheaton (EE.UU.)
a +4ºC en 10 volúmenes de tampón Tris-HCl 0,05 M.
Se incubaron alícuotas (0,5 ml) de sobrenadante en 0,5 \muC
[C^{14}]-ácido araquidónico ([C^{14}]-AA,
Amersham, Gran Bretaña; actividad específica 50-60
\muCi/mM) a +37ºC durante 30 minutos. El
[C^{14}]-AA no metabolizado y sus productos de
metabolismo se extrajeron en 20 volúmenes de una mezcla de
cloroformo y metanol (1:1) a una eficacia de extracción no menor del
90%, evaluados usando [C^{14}]-PGF_{2\alpha}.
La separación e identificación de [C^{14}]-AA y
sus metabolitos se realizó mediante cromatografía en capa fina
(placas de gel de sílice 60 de la compañía Merck, Alemania) usando
una fase orgánica de un sistema de disolventes (acetato de
etilo:isooctano:ácido acético:agua - 110:50:20:100) y patrones
marcados. Se realizó la densitometría de los autorradiocromatogramas
obtenidos en películas de rayos X X-Omat AR (Kodak,
EE.UU.) y HS 11 (ORWO, Alemania) en el densiscan KS3 (Kipp y Zonnen,
Holanda). El análisis cuantitativo de eicosanoides individuales se
realizó usando radiometría de las fracciones obtenidas con
cromatografía líquida de alto rendimiento (el sistema de HPLC de la
empresa Gilson Francia; la columna C8 ZORBAX de la compañía Du
Pont, EE.UU.) y con elución de puntos en placas de
TLC.
TLC.
Los resultados experimentales se representan en
la Tabla 22. Se observó que el compuesto de ensayo estimula la
producción de metabolitos de AA de ciclooxigenasa, como se ha
especificado, concretamente, aumentó la síntesis de prostaglandina
E_{2} (PGE_{2}) y
6-ceto-PGF_{1\alpha},
PGF_{2\alpha} y la ruta del metabolismo de AA de lipoxigenasa, es
decir, aumenta la producción de 5-HETE y HHT. Al
mismo tiempo, se observa una disminución en el metabolismo de AA en
el sistema de citocromo P-450
-12-HETE y 15-HETE. Se debe observar
que el cambio en el perfil de metabolitos de AA en animales
pretratados con uno de los compuestos de la presente invención era
similar al observado en animales que reciben Fenobarbital - un
inductor del sistema de citocromo P-450
conocido.
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Ejemplo
36
Se realizó la sensibilización de ratas macho
Wistar con una masa corporal inicial de 200-250 g de
acuerdo con el método publicado de Guschin et al [Guschin
et al Guschin LS., Voitenko V. G., Sviridov B. D. et
al., A polyfunctional molecule produced by the conjugation of
synthetic polyionimmunostimulant with specific antigen and an
inhibitor of mast cell activation. Effects on histamine release.
Agents and Actions (1989), Vol. 27, págs. 75-78].
Después de 14 días de sensibilización de acuerdo con el método
convencional de Fredholm et al [Fredholm B. B., Gyschin I.
S., Elwin K. et al., Cyclic AMP-independent
inhibition by papaverine of histamine release induced by compound
48/80, - Biochem. Pharmacol. (1976), Vol. 25, págs.
1583-1588], se aisló una suspensión celular de la
cavidad peritoneal y se determinaron las secreciones de histamina
espontáneas y estimuladas con ovoalbúmina (OVA) de pollo por
mastocitos (MC). También se determinó el nivel de histamina en los
mastocitos de animales de control y de experimentación. 2 ml de una
suspensión celular que contenía 0,1-0,2 x 10^{6}
MC/ml se incubó en presencia de 200 \mug/kg de OVA. La secreción
de histamina se expresó como un porcentaje de su nivel total. La
cantidad de histamina en las muestras se determinó usando un método
espectrofluorométrico [Short P. A., Burkhalter A., Cohn V. N., A
method for fluorimetric assay of histamine in tissues, J. Pharmacol.
Exper. Ther. (1959), Vol. 127, págs. 182-
186].
186].
El compuesto de ensayo se administró a los
animales por vía intraperitoneal, de acuerdo con el siguiente
protocolo de dosificación: durante 3 días antes del examen de MC,
se administró un compuesto de ensayo a una dosis de 50 \mug/kg
(grupo 2) o Suprastine a una dosis de 1000 \mug/kg (grupo 3). A
los animales del grupo de control se inyectó por vía
intraperitoneal solución salina normal (grupo 1). Cada grupo incluyó
10 animales.
Los resultados experimentales se presentan en la
Tabla 23. Se demostró que la administración del compuesto XLV
disminuye significativamente la secreción de histamina dependiente
de antígenos por MC. Al mismo tiempo, se observó un aumento
significativo en la secreción espontánea de histamina por MC. Estos
cambios tienen lugar frente al fondo de una disminución en el nivel
de histamina en los MC de animales sensibilizados a los que se
administra uno de los compuestos de ensayo.
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Ejemplo
37
Se estudió el efecto de los compuestos de la
presente invención sobre cambios en la quimioluminiscencia (CL)
determinada por el radical hidroxilo (OH) y el radical de anión
superóxido (O_{2}-) usando sistemas químicos y enzimáticos de
modelo.
Se generaron formas de oxígeno activo (AOF) de
diferente naturaleza en los siguientes sistemas:
- A.
- Radical hidroxilo - en una mezcla de FeSO_{4} con H_{2}O_{2} (el reactivo Fenton) [Halliwell B. Superoxide-dependent formation of hydroxyl radicals in the presence of iron salts. FEBS Lett. (1978), Vol. 96, págs. 238-241]. El medio de incubación comprendía KH_{2}PO_{4} 5 mM (pH 7,4); FeSO_{4} 5 mM y luminol 2 mM. Se introdujo H_{2}O_{2} a concentración final de 5 mM por un dispensador en una cubeta después de un registro de luminiscencia de fondo de la mezcla de reactivos. De 5 a 10 ml de los compuestos de ensayo (disueltos en agua a la concentración necesaria) se introdujeron en una cubeta. El volumen total de la muestra fue 0,5 ml.
- B.
- Radical de anión superóxido en una mezcla de xantina y xantina oxidasa [Afanas'ev I., Suslova T., Cheremisina Z. et al., Study of antioxidant properties of metal aspartates, Analyst (1995), Vol. 120, págs. 859-862].
\newpage
El medio de incubación comprendía
KH_{2}PO_{4} 5 mM y 0,2 UI/ml de xantina oxidasa. Se introdujo
xantina a una concentración de 1 mM en una muestra por un
dispensador. Se usó luceginina (0,2 mM) en el sistema como un
sensibilizador de luminiscencia. Los compuestos de ensayo se
introdujeron de un modo similar a cómo se introdujeron en el
estudio de radical.
Los estudios preliminares mostraron que los
compuestos de la presente invención no tienen efectos sobre la
actividad de xantina oxidasa.
La CL de los sistemas que se han descrito
anteriormente se midió a 25ºC con agitación pulsada (en el momento
de la introducción de los reactivos por el dispensador). Se realizó
la indicación de la señal de CL por su integración cada 10 segundos
durante 5 minutos. La duración del registro instantáneo de CL
después de mezclar los ingredientes dependía de una cinética de
proceso particular. Para cada sistema, se determinó la suma de luz
de CL (mV) en las muestras de control sin preparaciones (I-) y en
muestras que comprendían concentraciones respectivas de las
preparaciones (I+). Para estimar el grado de inhibición de CL
(activación), se observó la proporción I+/I- (en unidades
relativas) en los sistemas estudiados.
Se registró la formación de AOF y el efecto de
los compuestos de ensayo sobre este proceso en el instrumento
Luminometer-1251 (LKB, Suecia).
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Cuando se introdujo H_{2}O_{2} en tampón
fosfato que comprendía sulfato de hierro, tuvo lugar una reacción
instantánea de CL, que estaba provocada por la formación de
radicales (predominantemente) hidroxilo en la mezcla de reacción.
La reacción instantánea tenía un carácter a corto plazo -
consiguiéndose su máxima intensidad en el 10º segundo y durante los
siguientes 10-20 segundos, la luminiscencia
disminuyó y los parámetros de CL disminuyeron, hasta valores de
fondo.
La Tabla 24 resume los datos que muestran el
efecto de los compuestos sobre la generación de radical hidroxilo
en el reactivo de Fenton. Los resultados muestran que los compuestos
de ensayo inhiben la formación de radical hidroxilo en el sistema
estudiado.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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La introducción de xantina en el medio que
contenía xantina oxidasa y lucegenina dio como resultado la
aparición de una reacción instantánea de CL, reacción instantánea
que estaba a un máximo durante 3-5 minutos y después
comenzó una reducción muy lenta de la intensidad de la
quimioluminiscencia. La adición de los compuestos de ensayo a la
mezcla de xantina-xantina oxidasa no cambió de forma
importante la forma de la curva de respuesta de CL y solamente
variaron los valores de intensidad de CL máxima. Debido a la
"distensión" de la curva cinética, se registró la suma de luz
de quimioluminiscencia durante los primeros 3-5
minutos. Esto reflejó la cantidad total de cuantos de luz
producidos en el sistema hasta que se consiguieron los valores de
intensidad de CL máxima. Como se puede observar a partir de los
datos presentados (Tabla 25), los compuestos de ensayo poseen la
capacidad de inhibir significativamente la formación del radical
anión superóxido.
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Los resultados presentados en los ejemplos
24-37 muestran que los compuestos de la presente
invención poseen una actividad antihipóxica, antialérgica y
antiinflamatoria pronunciada.
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Ejemplo
38
Se estudiaron las propiedades hepatoprotectoras
de los compuestos usando un modelo de lesión hepática subcrónica
(hepatitis) con tetracloruro de carbono.
Se usaron en el experimento 70 ratas hembra
mestizas con una masa corporal inicial de 190-200 g
y alimentadas con una ración de animalario convencional. Los
animales se dividieron en 7 grupos (10 ratas cada uno):
- Grupo 1 -
- de control; durante los cuatro primeros días del experimento se inyectó por vía subcutánea a los animales 0,2 ml de aceite de vaselina;
- Grupo 2 -
- durante los cuatro primeros días se inyectó por vía subcutánea a los animales una solución de CCl_{4} al 50% en aceite de vaselina a una velocidad de 0,1 ml por 100 g de masa corporal;
- Grupo 3 -
- se administró Legalon en un gel de almidón por vía oral durante 8 días a una dosis de 30 mg/kg frente a los antecedentes de administración de CCl_{4};
- Grupos 4 y 5 -
- se administró compuesto III a dosis de 50 y 500 \mug/kg, respectivamente, de un modo similar al grupo 3;
\newpage
- Grupos 6 y 7 -
- se administró compuesto XLIV a dosis de 50 y 500 \mug/kg, respectivamente, de un modo similar al grupo 3.
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Los compuestos de ensayo y el Legalon se
administraron a los animales 1 hora antes de la administración de
CCl_{4}. 24 horas después de la última administración de los
fármacos, los animales se decapitaron.
Se estimó la actividad hepatoprotectora de los
compuestos de ensayo basándose en los siguientes parámetros:
- 1)
- en suero sanguíneo:
- -
- actividad de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST);
- -
- colesterol total (CS total);
- -
- colesterol en lipoproteínas de alta densidad (HDL-CS);
- -
- colesterol en lipoproteínas de baja densidad y colesterol en lipoproteínas de muy baja densidad (LDL-CS y VLDL-CS, respectivamente);
- -
- triglicéridos (TG);
- -
- dialdehído malónico (MDA);
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- 2)
- en el hígado:
- -
- composición de lípidos: fosfolípidos (PL), colesterol libre (FCS), triglicéridos (TG);
- -
- MDA.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de las transaminasas ALT y AST en
suero sanguíneo se evaluó usando el método de
Frenkel-Rightman convencional [Laboratory
examination methods in the clinic, Ed. por Menshikov V. V. Moscú,
Meditsina publishers (1969), 302 págs.].
El nivel de CS total en suero sanguíneo se
determinó de acuerdo con el método Ilk [Biochemical examination in
the clinic. Ed. por Pokrovsky A. A. Moscú, Meditsina publishers
(1969), págs. 300-302]. El nivel de
HDL-CS se midió en el sobrenadante después de la
precipitación con heparina-manganeso [Titov V. N.,
Brener E. D., Khaltaiev N. G., Zadoya A. A., Tvorogova M. G., A
method and diagnostic significance of cholesterol level study in
\alpha-lipoproteins, Laboratornoye delo
(Laboratory Matter) (1979), Nº 1, págs. 36-41]
usando el método Ilk [Biochemical examination in the clinic. Ed.
por Pokrovsky A. A. Moscú, Meditsina publishers (1969), págs.
300-302]. Se calcularon los niveles de
LDL-CS y VLDL-CS de acuerdo con las
fórmulas [Friedwald W. T., Levy R. I., Fredrickson D. S.,
Estimation of the concentration of low-density
lipoprotein cholesterol in plasma, without use of preparative
ultracentrifuge, Clin. Chem. (1972), Vol. 18, págs.
499-502]:
LDL - CS = CS\
total - (HDL - CS +
TG/5),
donde TG/5 corresponde al nivel de
VLDL-CS en suero
sanguíneo.
\vskip1.000000\baselineskip
El método publicado por Rodionova et al
[Rodionova L. P. Modification of blood serum triglyceride level
determination method. Laboratornoye delo (Laboratory Matter)
(1980), Nº 5, págs. 297-299] se usó para determinar
el nivel de TG en suero sanguíneo.
El MDA producto final de la LP en suero
sanguíneo se determina usando el método publicado por Korobeinikova
[Ko-robeinikova E. N., Modification of lipid
peroxydation product determination in reaction with thiobarbituric
acid, Laboratornoye delo (Laboratory Matter) (1989), Nº 7, págs.
8-10]. La concentración de productos activos en TBA
se calculó usando esta ecuación de regresión:
C = 0.21 +
0.26D,
donde C = concentración de
productos activos en TBA (en nM de MDA por 1 ml de suero) y D =
índice D_{535} - D_{580} (en unidades de densidad
óptica).
\newpage
Se extrajeron los lípidos hepáticos totales
usando el método de Folch modificado [Cates M. Technology of
Lipidology, Moscú, Mir publishers (1975), págs.
74-76]. El contenido cuantitativo de las fracciones
lipídicas se evaluó mediante un método de cromatografía en capa
fina (TLC) usando el sistema de disolventes de hexano:éter
dietílico:ácido acético en la proporción 80:20:2. Se determinaron
zonas de fracciones de lípidos individuales usando una solución
alcohólica al 10% de ácido fosforomolibdénico y después de la
elución se analizaron espectrofométricamente a 60 nm.
El nivel de MDA hepático se determinó usando el
método publicado por Stalnaya et al [Stalnaya I. D.,
Garishvili T. G., Malonic dialdehyde determination method using
thiobarbituric acid. En: Modern methods in biochemistry, Moscú,
Meditsina publishers (1977), págs. 66-69]. La
cantidad de MDA se calculó usando el valor del coeficiente de
extinción molar de un complejo de trimetilo teñido formado por MDA
con dos moléculas de TBA:
E = 1.56\ x\
10^{5}\ cm^{-1}\ x\
M^{-1}
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Los resultados experimentales (Tabla 26)
proporcionan pruebas del hecho de que en animales tratados con
CCl_{4} se observaba una hiperenzinemia significativa. La
administración de los compuestos de la presente invención se
acompañaba de la normalización de la actividad de ALT y AST en suero
sanguíneo, pronunciándose el máximo efecto hepatoprotector en la
administración de la segunda sustancia.
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\newpage
Los datos obtenidos del análisis de la
composición de lípidos del suero sanguíneo en animales
experimentales mostraban (Tabla 27) que la lesión hepática tóxica
se acompaña de hipertrigliceridemia. Se observaron algunas
peculiaridades de la distribución del colesterol entre las
fracciones lipoproteínas bajo el efecto del CCl_{4}, en concreto,
(junto con un aumento en los niveles de colesterol total y
VLDL-CS) el nivel de HDL-CS aumentó
y el nivel de LDL-CS cayó. Frente a los antecedentes
de la administración de Legalon y los compuestos de ensayo, se
observó una tendencia a una disminución del nivel de colesterol
total y a la normalización de los niveles de
LDL-CS, VLDL-CS y
HDL-CS.
HDL-CS.
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Los resultados que se presentan en la tabla 28
muestran que la administración de CCl_{4} daba como resultado una
disminución del nivel de colesterol. Los compuestos de ensayo
normalizaban el nivel de FCS y disminuían el nivel de TG. Al mismo
tiempo, se observó un aumento en la fracción de fosfolípidos cuando
se administraron las sustancias de ensayo.
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La Tabla 29 resume los datos sobre los cambios
en el nivel de MDA producto final de la LP hepático y en suero
sanguíneo en lesiones causadas por CCl_{4} y el efecto de la
administración de los compuestos de ensayo. La lesión hepática
tóxica se acompañaba de un aumento en los niveles de MDA tanto en
suero como en hígado. El tratamiento de los animales con Legalon y
los compuestos de la presente invención dio como resultado la
normalización del nivel de MDA en los tejidos examinados.
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Por lo tanto, los compuestos de ensayo de la
presente invención poseen un efecto antioxidante y regulador de
lípidos pronunciado que es comparable al efecto del fármaco de
referencia Legalon y por varios parámetros los compuestos de ensayo
superaban al Legalon. Al mismo tiempo debería señalarse que los
compuestos de ensayo se administraron a dosis de dos a tres veces
inferiores a las dosis de Legalon.
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Ejemplo
39
La actividad hipolipidémcia de los compuestos de
la presente invención se estudió usando el modelo de hiperlipidemia
experimental descrito por Arichi et al, [Arichi H., Kumura H.
O., Effects of stibens compounds of roots of polygonum
cuspidatium on the lipid metabolism, Chem Pharm. Bull. (1982),
Vol. 30, Nº 5, págs. 1766-1767], con ratas macho
mestizas con una masa corporal inicial de 220-250 g.
Después de una ración convencional durante 10 días las ratas
recibieron por administración intragástrica una suspensión oleosa
que comprende colesterol al 10% y ácido cólico al 1% (a razón de
una suspensión de 1 ml por 100 g de masa corporal). Cada grupo de
animales incluía 10 ratas. Los compuestos de ensayo III, V, VI, VII,
VIII, IX, X, XIII, XXVIII, XLIV, XLVII, L y LI se administraron por
vía oral a animales a dosis de 50 y 500 \mug/kg durante los
últimos cuatro días del experimento. Como fármaco de referencia se
usó ácido nicotínico, se administró a una dosis de 10 \mug/kg a
animales durante 10 días al nivel de fondo de carga aterogénica. Se
tomaron muestras de sangre para análisis 18 horas después de la
última administración de las sustancias de ensayo, periodo durante
el cual se les retiró la comida a las ratas.
Se determinaron los siguientes parámetros:
colesterol total (CS total); colesterol en lipoproteínas de alta
densidad (HDL-CS); colesterol en lipoproteínas de
baja densidad y colesterol en lipoproteínas de muy baja densidad
(LDL-CS y VLDL-CS); y triglicéridos
(TG). El nivel de CS en suero sanguíneo se determinó de acuerdo con
el método IIk [Biochemical examination in the clinic. Ed. por
Pokrovsky A. A. Moscú, Meditsina publishers (1969), págs.
300-302]. El nivel de HDL-CS se
midió en el sobrenadante después de la precipitación con
heparina-manganeso de LDL + VLDL [Titov V. N.,
Brener E. D., Khaltaiev N. G., Zadoya A. A., Tvorogova M. G., A
method and diagnostic significance of cholesterol level study in
\alpha-lipoproteins. Laboratomoye delo (Laboratory
Matter) (1979), Nº 1, págs. 36-41]. La
determinación del nivel de LDL-CS se realizó por
cálculo de acuerdo con la fórmula descrita por Friedwald et
al [Friedwald W. T., Levy K. J., Leus R. Fat transport in
lipoproteins: an integrated approach to mechanism and disorders,
New Engl. J. Med. (1967), Vol. 276, pág. 32].
Para evaluar el efecto de los compuestos de
ensayo sobre el índice de lipoproteínas aterogénicas y
antiaterogénicas en suero sanguíneo, se calculó el índice de
colesterol (K_{cs}) de acuerdo con la fórmula descrita por Klimov
et al [Klimov A. N., Nikulcheva N. G., Lipoproteins,
dylipoproteinemias and atherosclerosis. Moscú, Meditsina publishers
(1984), 165 págs.].
Se determinó el nivel de TG en suero sanguíneo
usando un método convencional [Friedwald W. T., Levy R. I.,
Fredrickson D. S. Estimation of concentration of
low-density lipoprotein cholesterol in plasma,
without use of preparative ultracentrifuge. Clin. Chem. (1972),
Vol. 18, págs. 499-502].
La administración de una suspensión de grasa a
animales se acompañó de un aumento significativo en el nivel de CS
en suero sanguíneo a costa de las fracciones de lipoproteínas
aterogénicas (LDL y VLDL) con un fondo de disminución en el nivel
de la fracción antiaterogénica (HDL). Se observó un aumento de tres
veces en el índice de aterogenicidad. También se observó un aumento
significativo en los TG en suero sanguíneo (Tabla 30). Cuando los
compuestos de ensayo se administraron a animales (Tabla 31) a ambas
dosis se observó una caída del 10-26 por ciento en
el nivel de colesterol total en comparación con los animales con
carga aterogénica a costa de la disminución de
LDL-CS y VLDL-CS y típicamente se
observaba un aumento del 20-100 por cien en
HDL-CS. La caída en el índice de aterogenicidad del
colesterol K_{cs} era prácticamente hasta los valores de control
y se observó con la administración de todos los compuestos de
ensayo. El nivel de TG en sangre en animales caía hasta los valores
de control tras la administración de los compuestos de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Como ejemplo del efecto de los compuestos de
ensayo sobre el cambio en la composición de lípidos sanguíneos, la
Tabla 31 resume los resultados del efecto de algunos de los
compuestos de la presente invención sobre la composición de lípidos
en sangre en animales a los que se les administró una carga
aterogénica. Se demostró que la administración de estos compuestos
normalizaba todos los parámetros examinados, prácticamente hasta
los valores de control.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, los cambios en la composición de
lípidos en suero sanguíneo tras la administración de los compuestos
de ensayo a animales experimentales son comparables con el efecto
lipolipidémico del ácido nicotínico del fármaco de referencia
(tabla 30).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
40
Los experimentos se realizaron en ratas macho
Wistar que pesaban 250-300 g. Se indujo diabetes
experimental con una sola inyección intravenosa de estreptozotocina
(la empresa cooperativa Synthez en el IMBG de la Academia de las
Ciencias de Ucrania), a una dosis de 42 mg/kg a ratas que estuvieron
previamente en ayunas durante 24 horas, proporcionándose acceso al
alimento inmediatamente después de la inyección. Las ratas se
seleccionaron para experimentos 2 semanas después de la inducción
de diabetes con glucemia de 120-180 mg/dl. Cada
grupo incluía 12
animales.
animales.
Los compuestos se administraron por vía
intragástrica a animales intactos y a ratas con diabetes por
estreptozotocina durante cuatro días a dosis diarias de 50
\mug/kg y 500 \mug/kg en una solución de agua a razón de 1 ml
por 200 g de masa corporal. A los animales intactos se les
administraron los compuestos III y XLIV y a las ratas con diabetes
inducida se les administró el compuesto XLIV. La determinación del
nivel de glucosa en sangre se realizó el día del experimento,
después a los animales se les administraron los compuestos de ensayo
y se les privó de alimento. Los animales de control recibieron un
volumen correspondiente de agua. Se estimó el efecto basándose en
el cambio en el nivel de glucosa en sangre a las 2 y 5 horas.
Después, los animales recibieron forraje y 24 horas después de la
última administración de fármaco se tomaron de nuevo muestras de
sangre para examen -0,1 ml de sangre se recogieron de la vena de la
cola. El nivel de glucosa se determinó usando el método de
o-tolui-
dina.
dina.
El nivel de glucosa se calculó en mg/dl usando
soluciones de glucosa convencionales. Después se determinó el grado
de cambio en el nivel de glucosa en relación con el nivel inicial
para cada animal, con su expresión en porcentaje desde el nivel
inicial. Se realizó un cálculo final para cada grupo de animales.
Cada grupo incluía 10 anima-
les.
les.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados presentados en la Tabla 32
proporcionan pruebas del hecho de que el compuesto XLIV no tenía
efectos sobre la curva de cambios del nivel de glucosa en sangre en
animales intactos después de un periodo de ayuno a corto plazo
mientras que el compuesto III administrado a una dosis de 500
\mug/kg evitaba una caída en el nivel de glucosa en sangre en
ratas intactas dos horas después de la privación de alimento.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los datos presentados en la Tabla 33 muestran
que la administración intragástrica de compuesto III durante cuatro
días a dosis diarias de 50 y 500 \mug/kg da como resultado una
caída significativa en el nivel de glucosa en sangre dos horas
después de la última administración de fármaco a los animales. Se
mantuvo un efecto antidiabético hipoglucémico 5 horas después de la
administración, sin embargo, este efecto era menos pronunciado.
Por lo tanto, los compuestos de la presente
invención no tienen efecto ni estabilizan el nivel de glucosa en
sangre en animales intactos y poseen una actividad de disminución
del nivel de glucosa en ratas con diabetes por estreptozotocina que
es igualmente pronunciada con la administración a dosis de tanto 50
\mug/kg como 500 \mug/kg.
Los resultados presentados en los ejemplos
38-40 proporcionan pruebas del hecho de que los
compuestos de la presente invención poseen un efecto
hepatoprotector pronunciado. Estos compuestos de efecto se explican
por el hecho de que cuando se administran en el cuerpo se produce
una reorganización funcional de muchos sistemas corporales
centrales que participan en el mantenimiento de la homeostasis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
41
Se realizaron experimentos en ratones macho con
una masa corporal inicial de 18-20 g. Cada grupo
incluía 10 animales. Se realizó un trasplante de tumor de acuerdo
con la técnica convencional [Experimental estrimation of antitumor
drugs in the U. S. S. R. and the U. S. A. editado por E. P. Sof'ina,
A. B. Syrkin, A. Goldin, A. Kline. Moscú, Meditsina publishers
(1980), 296, págs.]. La administración de los compuestos II, III,
IX, X, XH, XIV, XV, XVI, XVII (ejemplo comparativo) XIX, XX, XXI,
XXII y XLVII en el agua de bebida comenzó 24 horas después del
trasplante y continuó hasta el final del experimento. El efecto de
los compuestos sobre el carcinoma pulmonar de rata Lewis (LLC) se
estimó el día 12 del experimento basándose en el cambio en el
volumen tumoral expresado en
mm^{3}.
mm^{3}.
\newpage
Los datos presentados en la Tabla 34 muestran
que todos los compuestos ensayados inhibían el desarrollo de LLC
aunque en diferente medida.
Ejemplo
42
El estudio se llevó a cabo en ratones hembra
BDF_{1} con una masa corporal inicial de 25-30 g.
Cada grupo incluía 15 animales. Se inyectaron por vía intramuscular
0,3 ml de suspensión tisular de tumor LLC a los ratones. Se usó
solución de Henks como disolvente. Los compuestos de ensayo II, III,
VI, IX, X, XII, XXIII y XLIV se disolvieron en agua y se
administraron por vía oral a los animales durante 24 días a una
dosis de 50 y 500 \mug/kg en 0,2 ml de disolvente, comenzando el
día dos después del trasplante de tumor. El día 25 del experimento
los animales se sacrificaron y sus pulmones se resecaron y se
fijaron en solución de Bouen usando el microscopio
MBS-9 con aumentos 8 x 2. 24 horas después de la
fijación, se calcularon las colonias metastásicas pulmonares. Se
llevó a cabo el cálculo del índice de metastatización de acuerdo con
las recomendaciones metodológicas [Methodological recommendations
on preclinical study of agents possessing ability to inhibit
metastasizing process and to enhance efficacy of cytostatic therapy
of malignant tumors. Moscú (1992) 13 págs.].
Se descubrió que los compuestos de ensayo
inhibían el proceso de metastatización espontánea del tumor LLC
trasplantable en presencia de un nudo tumoral primario de diferente
grado (del 20 al 70 por ciento) La Tabla 35 resumen los resultados
que demuestran la alta actividad antimestastásica de los compuestos
de ensayo.
El criterio de actividad para fármacos
antimetastásicos es su capacidad para inhibir la metastatización en
el 35 por ciento.
\newpage
\global\parskip0.850000\baselineskip
Una propiedad importante de los compuestos de la
presente invención es su capacidad para manifestar actividad
farmacológica en el modelo con resección del nudo tumoral primario y
no disminuir la eficacia terapéutica de los fármacos antitumorales
respectivos. Esta propiedad se demostró mediante experimentos usando
un modelo en el que se trasplantaba un tumor LLC de metastatización
espontánea en las almohadillas plantares de ratones hembra C57BL/6
que pesaban 20-25 g. La resección quirúrgica del
nudo tumoral primario se realizó 13 días después del trasplante del
tumor. Los compuestos antitumorales de ensayo se administraron de
acuerdo con dos regímenes de dosificación:
- \quad
- Régimen de dosificación 1 - se administró a los animales compuesto III desde el día 1 hasta el día 13 del experimento a una dosis de 500 \mug/kg (grupo 1); se administró ciclofosfano por vía intraperitoneal dos veces antes de la operación con un intervalo de 96 horas a una dosis de 100 \mug/kg (grupo 2); se administró una administración combinada del compuesto III y ciclofosfano de una forma similar a las sustancias en los grupos 1 y 2 (grupo 3). El número de metástasis se calculó el día 29 del experimento.
- \quad
- Régimen de dosificación 2 - se administró a los animales compuesto III desde el día 14 del experimento (comienzo de la administración 24 horas post-operación) hasta el día 28 (grupo 4); se administró ciclofosfano dos veces después de la operación con un intervalo de 96 horas a una dosis de 100 \mug/kg (grupo 5); se administró una administración combinada del compuesto III y ciclofosfano de una forma similar a las sustancias de los grupos 4 y 5 (grupo 6). La eficacia antimetastásica de los fármacos se consideró el día 29 del experimento.
Los resultados experimentales se presentan en la
Tabla 36. Como se observa a partir de estos resultados, el
compuesto III manifestaba actividad antimetastásica en el modelo con
resección quirúrgica del nudo tumoral primario y en la
administración combinada con ciclofosfano después de la resección
tumoral, se observó potenciación del efecto farmacológico así como
suma de los fenómenos ensayados en la administración de ambos
fármacos antes de la resección quirúrgica del tumor.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para estimar la eficacia terapéutica del
compuesto III en una forma de dosificación en comprimidos
(comprimidos de 0,2 g de 6 mm de diámetro que comprenden 17 mg de
sustancia) se llevaron a cabo estudios en el modelo de
metastatización espontánea de carcinoma LLC.
Se llevaron a cabo experimentos en ratones
hembra C57BL/6 que pesaban 20-25 g. Los grupos
experimentales incluían 8 animales y los grupos de control tenían
11 ratones. La forma fundamental y la forma de dosificación en
comprimidos de compuesto III se administraron por vía oral a una
dosis de 500 \mug/kg (donde 500 \mug es la cantidad del agente
activo) diariamente desde el día 1 hasta el día 10 del experimento.
El experimento duraba 24 días.
Los resultados experimentales se presentan en la
Tabla 37. Proporcionan pruebas del hecho de que los parámetros de
la actividad antimetastásica de las formas fundamental y de
dosificación en comprimidos son prácticamente similares.
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Ejemplo
43
El efecto de los compuestos de la presente
invención sobre el cambio en la vida media de animales de
experimentación infectados con Salmonella spp.
Los experimentos se llevaron a cabo en ratones
blancos mestizos de ambos sexos que pesaban 18-22 g.
Se administraron por vía oral los Compuestos III, XLIV y el fármaco
de referencia nucleinato sódico durante 3 días antes y después de
la infección (es decir, un total de 6 veces con un régimen de
dosificación de -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3, donde 0 es el día de la
infección). Se usó para la infección un cultivo de Salmonella
spp. de 24 horas cultivado en agar Hottinger. Se usó solución
salina normal para preparar una suspensión celular. La suspensión
de células de Salmonella spp. se administró por vía subcutánea a una
dosis de 5 x 10^{8} células por ratón a 0,5 ml.
Los compuestos de ensayo se administraron a una
dosis de 500 \mug/kg y el fármaco de referencia nucleinato sódico
a una dosis de 50 \mug/kg en 0,5 ml de solución salina normal.
A una dosis de 500 \mug/kg los compuestos de
ensayo aumentaban significativamente la vida media de ratones
infectados con Salmonella spp. (Tabla 38), ejerciendo un efecto
protector en condiciones experimentales estrictas (letalidad del
cien por cien en el grupo de control). Se observó un aumento
significativo en el índice de supervivencia de ratones a los que se
administró compuesto III el día 2 del experimento en comparación con
el grupo de control y el día 1 del experimento para animales a los
que se administró el compuesto XLIV. Al mismo tiempo se estableció
que el carácter de la distribución del desenlace letal en animales
del grupo de control era anormal, mientras que al verse afectada
por los compuestos III y XLIV la distribución se hacía normal. Esto
confirma la eficacia de los compuestos ensayados.
El efecto protector de los compuestos de ensayo
en relación con la infección bacteriana era comparable al efecto
del nucleinato sódico que es un promotor conocido de respuestas
inmunes, incluyendo la fagocitosis [Lazareva D. L., Alekhin E. K.
Immunity stimulants (1985), 286 págs.]. Una dosis eficaz de los
compuestos de ensayo era dos órdenes inferior a la dosis
correspondiente para el fármaco de referencia.
Por lo tanto los compuestos de la presente
invención poseen un efecto protector frente a la infección
microbiana.
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Los números en superíndice significan los grupos
de control en relación con los que las diferencias eran
significativas.
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Ejemplo
44
Se llevaron a cabo estudios en ratones mestizos
de ambos sexos con una masa corporal inicial de
10-11 g. Los grupos de control y experimentales
incluían 30 animales cada uno. El compuesto XLIV y el fármaco de
referencia inductor de interferón Ridostina se administraron una
vez por vía intraperitoneal 24 horas después de infectar a los
ratones con el virus de la encefalomiocarditis a dosis de 30
\mug/kg y 5,0 mg/kg, respectivamente. El virus de la
encefalomiocarditis se administró a una dosis de 100 DL_{50}. Se
determinó la actividad antiviral por cambio en la vida media (MLT)
de ratones y el grado de protección proporcionado frente a la
infección vírica letal.
Los resultados obtenidos se presentan en la
Tabla 39. Se muestra que el compuesto XLIV posee una actividad
antiviral pronunciada a una dosis que, en comparación con la dosis
del fármaco de referencia, es dos órdenes
inferior.
inferior.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo estudios en ratones mestizos
de ambos sexos que pesaban 8-10 g. Se administró por
vía intranasal a los ratones la cepa Aichi (líquido alantoideo) de
virus de la gripe humana tipo A a una dosis DL_{50}. Los
compuestos de ensayo III, VI, VIII, XXXIII, XLVIII y XLVIII se
administraron por vía oral a los animales durante tres días antes
de la infección y durante diez días después de la infección. Se usó
Arbidol (un fármaco específico) como fármaco de referencia a una
dosis de 100 mg/kg y se administró 24 y 2 horas antes y 3 días
post-infección, y se administró Tymogen (fármaco
inespecífico) a los animales a una dosis de 10 \mug/kg de acuerdo
con el mismo régimen de dosificación que el compuesto de ensayo. Se
determinó la actividad antiviral basándose en el MLT de los ratones
y la protección proporcionada frente a la infección vírica
letal.
Los resultados del estudio se presentan en la
Tabla 40. Se demostró que el mayor aumento en la MLT, el índice de
supervivencia y el grado de protección se observaban cuando se
administraba compuesto VII a una dosis de 500 \mug/kg. La
administración de los otros compuestos ensayados a dosis de 50 y 500
\mug/kg y de Arbidol se acompañaba de un cambio igual en los
parámetros. El efecto de Tymogen como fármaco antiviral se expresaba
menos.
Por lo tanto, los datos presentados proporcionan
pruebas de un efecto antiviral pronunciado para compuestos de la
presente invención en la infección vírica experimental en ratones
causada por virus de la gripe humana tipo A.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El estudio se llevó a cabo usando un cultivo de
células linfoblastoides humanas, en concreto, se usaron en el
experimento células MT-4 VIH-1/IV17
del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 aislado de la
colección del D. l. lvanovsky Institute for Virology. Los
compuestos de ensayo III, VI y VII se introdujeron en el cultivo
celular a concentraciones de 1,0, 0,1 y 0,01 \mug/ml. El fármaco
de referencia Azidotimidina se introdujo a una dosis de 0,05
\muM/ml. Los compuestos se introdujeron en el cultivo de células
MT-4 a una dosis de 1000 DCT_{50} una hora antes
de la introducción del virus. La viabilidad de las células
MT-4 se estimó el día 7 del experimento.
La viabilidad de las células eran los parámetros
de eficacia principales de los compuestos de ensayo.
Los experimentos preliminares mostraban que los
compuestos de ensayo no son tóxicos para células linfoblastoides a
concentraciones de 1,0 \mug/ml e inferiores.
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Los resultados presentados en la Tabla 41
muestran que los compuestos de ensayo a concentraciones de 1,0 y
0,1 \mug/ml presentan un efecto protector frente al efecto
citodestructor del VIH-1. El efecto de los
compuestos es pronunciado en un grado diferente para cada
compuesto, siendo el efecto del compuesto III comparable con el
efecto del fármaco de referencia Azidotimidina.
\newpage
Ejemplo
45
Se llevaron a cabo experimentos en ratones
hembra C57BL/6 con carcinoma LLC trasplantado por vía intramuscular.
Se midió la actividad de los neutrófilos los días 11 y 14 del
experimento.
Los animales de experimentación se dividieron en
cuatro grupos:
control - animales con tumor LLC, 10
animales;
animales con tumor LLC + compuesto III a una
dosis de 500,0 \mug/kg durante 10 días, 8 animales;
animales con tumor LCC + ciclofosfano 5 veces a
una dosis de 20,0 \mug/kg (en 48 horas) durante 10 días, 8
ani-
males;
males;
compuesto III y Ciclofosfano de acuerdo con el
régimen de dosificación anterior, 8 animales.
\vskip1.000000\baselineskip
La duración del experimento era de 14 días. La
Tabla 42 resume los resultados del estudio de la actividad de
neutrófilos en los animales de los grupos experimentales.
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Se demostró que el desarrollo de carcinomas LCC
se acompañaba de una disminución en el número de formas activas de
neutrófilos en la sangre periférica de animales de experimentación.
Los animales a los que se administró una combinación de compuesto
III y Ciclofosfano se caracterizaban por un nivel de actividad
significativamente superior de los neutrófilos en comparación con
los animales de control.
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Ejemplo
46
Se estudiaron los cambios en la actividad de
macrófagos peritoneales (PM), según se efectuaban por los compuestos
de ensayo.
Los experimentos se llevaron a cabo en ratones
macho blancos mestizos con una masa corporal inicial de
20-22 g. Cada grupo incluía 10 animales. Los
compuestos III, VI, XLIV se disolvieron en solución salina normal
(NS). Los compuestos de ensayo se administraron a los animales por
vía oral durante tres días a dosis de 50 y 500 \mug/kg. A los
animales del grupo de control se les administró un volumen
equivalente de NS. Los ratones se sacrificaron 20 horas después de
la última administración de compuesto y la cavidad peritoneal se
lavó con 1,5 ml de solución de Henks que comprendía heparina 5
U/ml. Se incubaron 0,1 ml de la solución de lavado durante 30
minutos a 37ºC con 0,1 ml de solución de nitroazul de tetrazolio
(NBT) al 0,2%, después se prepararon frotis. Los núcleos se tiñeron
adicionalmente con solución rojo neutro al 0,1%. Los resultados se
expresaron como porcentaje de células activas [Klimov V. V.,
Kolovkina T. V. Nitroblue tetrasolium reduction test stimulated
with pyrogenal. Laborotornoye delo (Laboratory matter) (1982), Nº
10, págs. 624-625]. Se estimó el grado de actividad
de PM basándose en la cantidad de inclusiones de NBT reducidas
(formazano) de acuerdo con las siguientes puntuaciones:
- 0 -
- sin inclusiones de formazano, PM inactivos;
- 1 -
- inclusiones de formazano individuales;
- 2 -
- las inclusiones llenan hasta 1/3 del citoplasma de PM;
- 3 -
- las inclusiones llenan hasta 1/2 del citoplasma de PM;
- 4 -
- las inclusiones llenan todo el citoplasma.
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Los datos presentados en la Tabla 43 muestran
que los compuestos ensayados aumentan la porción de macrófagos
activos a expensas de una disminución en la cantidad de formas
inactivas, siendo el efecto del compuesto III en estudio
pronunciado a ambas dosis de sustancia mientras que el efecto del
compuesto XLIV es más pronunciado a una dosis de 500 \mug/kg y el
del compuesto VI es más pronunciado a una dosis de 50 \mug/kg.
Por lo tanto, los compuestos ensayados poseen la
capacidad de aumentar la porción de formas activas de macrófagos
pero a dosis diferentes.
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Ejemplo
47
Se llevan a cabo experimentos en ratones macho
C57B1 que pesaban 18-20 g. Se realizó un trasplante
de carcinoma pulmonar de Lewis (generación 3) de acuerdo con una
técnica convencional [Experimental estrimation of antitumor drugs
in the U. S. S. R. and the U. S. A. editado por E. P. Sof'ina, A. B.
Syrkin, A. Goldin A. Kline. Moscú, Meditsina publishers (1980), 296
págs.]. Cada grupo incluía 8 animales. La administración de
compuesto III a una dosis de 500 \mug/kg por día en el agua de
bebida comenzó 24 horas después del trasplante de tumor.
\newpage
La relación de tromboxano A_{2} respecto a
prostaciclina se determinó de acuerdo con la técnica descrita en el
ejemplo 35. El día 24 del experimento los animales se sacrificaron y
se determinaron los parámetros de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
- Grupo 1 -
- control intacto.
- Grupo 2 -
- ratones con carcinoma de Lewis trasplantado.
- Grupo 3 -
- ratones con carcinoma de Lewis trasplantado + compuesto III.
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Los datos presentados en la Tabla 44
proporcionan pruebas del hecho de que en ratones con carcinoma de
Lewis trasplantado se descubrió que el nivel de tromboxano A_{2}
aumentaba 1,4 veces y se detectó una caída de dos veces en la
formación de prostaciclina y en la relación de prostaciclina
respecto a tromboxano A_{2}. La administración de compuesto III a
animales da como resultado un aumento en la formación de
prostaciclina y en la relación de prostaciclina respecto a
tromboxano A_{2} así como una caída en la síntesis de tromboxano
A_{2}.
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Ejemplo
48
Se llevaron a cabo experimentos en ratones macho
Balb endogámicos con una masa corporal inicial de
16-18 g. Cada grupo incluía 12 animales. El modelo
de nado en agua templada durante 20 minutos se usó para desarrollar
estrés locomotor emocional en los animales. Se estimó el desarrollo
de estrés basándose en la actividad de los linfocitos asesinos
naturales (células NK) y el funcionamiento del sistema de interferón
[Sukhikh T. G., Nossik N. N., Parshina O. V., Van'ko L. V., Meerson
F. Z., Yershov F. I., Relationship between the natural cellular
cytotoxicity system and the interferon system in immobilization
stress, Bulletin of Experimental Biology (1984), Nº, págs.
593-
595].
595].
La actividad de células NK se determinó usando
el ensayo de liberación de H^{3}-uridina de
células diana marcadas YAC-1 (linfoma celular de
ratón mantenido por pases in vitro en suspensión en el medio
RPMI-1640 con suero fetal al 10%). Se introdujo la
H^{3}-uridina (3-5
\muC/células/ml) en la suspensión celular a una concentración de
1 millón de células/ml en el minuto 60 mientras se agitaba con un
intervalo de 15 minutos y posterior lavado con el
medio.
medio.
La fuente de células NK eran esplenocitos de
ratones obtenidos usando el método publicado por Nossik et al
[Nossik N. N., Bopegamage S. A., Yershov F. I., Properties of
interferons produced by different cell populations. Acta
microbiologica Hungarica (1988), Vol. 35, Iss. 4, págs.
397-403].
En el estudio de la reacción a interferón de
esplenocitos de ratón, se colocaron células de bazo en un medio de
incubación (el medio RPMI-1640 + suero fetal de
ternera al 10%), se llevó su concentración a 1-3 x
10^{3} células/ml y se incubaron a 37ºC durante 24 horas. Se usó
virus de la enfermedad de Newcastle (inducción de interferón
\alpha) y mitógeno FGA (inducción de interferón \gamma) como
inductores de interferón [Nossik N. N., Bopegamage S. A., Yershov
F. I. Properties of interferons produced by different cell
populations. Acta microbiologica Hungarica (1988), Vol. 35, Iss. 4,
págs. 397-403].
Los animales se dividieron en cuatro grupos,
incluyendo cada uno 36 ratones.
- Grupo 1 -
- animales intactos no sometidos a estrés y a los que se administró solución salina normal (NS).
- Grupo 2 -
- animales que se sometieron a efecto de estrés y a los que se administró NS.
- Grupo 3 -
- animales que se sometieron a efecto de estrés y a los que se administró compuesto III.
- Grupo 4 -
- animales que se sometieron a efecto de estrés y a los que se administró compuesto XLIV.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de ensayo (a una dosis de 50
\mug/kg) y el NS se administraron por vía oral a los animales
cuatro veces de acuerdo con el siguiente régimen de dosificación:
durante dos días antes de la exposición a estrés (administraciones
primera y segunda), dos horas antes del estrés (tercera
administración) y 24 horas después de la tercera administración
(cuarta administración).
La actividad de células NK y el estado de
interferón se determinaron dinámicamente 4 horas después del estrés,
24 horas después y después en los días 5, 7 y 10.
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\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados presentados en la Tabla 45
muestran que la administración de los compuestos de ensayo evita la
caída en la actividad de células NK causada por estrés. Además, la
administración de los compuestos de ensayo a animales da como
resultado la normalización de la producción de interferón \alpha y
aumentos en la producción de interferón \gamma (Tabla 46).
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, en animales a los que se
administraron los compuestos de ensayo, las consecuencias de la
reacción de estrés eran menos pronunciadas que en ratones a los que
no se les administró.
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Ejemplo
49
Se usaron linfocitos humanos para la reacción de
transformación blástica [Kiseleva E. P., Tsveibakh A. S., Goldman
E. I., Pigareva N. V., Application of a micromethod to study
blasttransformation of lymphocytes in humans and animals,
Immunology (1985), Nº 1, págs. 76-78]. Se recogieron
10 ml de sangre en una jeringa estéril que contenía heparina (a una
concentración final de 25 U/ml) y se incubó para sedimentar los
glóbulos rojos (60-90 minutos a 37ºC). Se
seleccionó la fase de suspensión leucocitaria y se calculó el número
de células nucleadas. Las células obtenidas se incubaron durante 72
horas en una atmósfera húmeda con CO_{2} al 5% a 37ºC en las
células de placas para reacciones inmunes en medio
RPMI-1640 que comprende suero fetal de ternera al
15% y neomicina 50 \mug/kg (volumen de mezcla de incubación 0,15
ml). Se introdujeron 5 x 10^{5} células en cada celda de placa.
La incubación se llevó a cabo en presencia o ausencia de mitógeno
fitohemaglutinina (PHA) (Sigma) (13,3 \mug/kg) o concanavalina A
(ConA) (Sigma) (13,3 \mug/kg) con o sin adición de los compuestos
de ensayo a diferentes concentraciones. Se introdujo
H^{3}-timidina 2 mCi en el medio
RPMI-1640 en cada celda 16 horas antes de la
finalización de la incubación. Después de la finalización del
periodo de cultivo, se transfirieron 0,15 ml de suspensión celular
de cada celda de placa sobre filtros de papel FN-8.
Los filtros se secaron, se lavaron dos veces con solución salina
normal durante 5 minutos y después se lavaron con TCA durante 60
minutos. Después de secar se calculó la radiactividad de las
muestras en un contador de centelleo ZhS-8. El
índice de estimulación se calculó como la relación de la
radiactividad de muestra con mitógeno respecto a la radiactividad
de muestra sin
mitógeno.
mitógeno.
Los resultados presentados en las Tablas
47-49 proporcionan pruebas de un efecto estimulante
de los compuestos XLIV y III sobre la reacción de transformación
blástica de linfocitos humanos. También se observó la potenciación
de la reacción inducida tanto por PHA como por ConA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos presentados en los ejemplos
41-49 proporcionan pruebas del hecho de que los
compuestos de ensayo poseen actividad inmunomoduladora que inhibe
significativamente el desarrollo de un tumor trasplantable, el
proceso de metastatización y el aumento de la resistencia de
animales a infecciones microbianas y víricas.
Todos los estudios mencionados anteriormente
también muestran que los compuestos de la presente invención poseen
la eficacia biológica mencionada anteriormente a dosis que son de 2
a 3 órdenes inferiores a las dosis de fármacos conocidos que se
usan para una eficacia prácticamente similar.
Además, se presentan a continuación ejemplos de
formas de dosificación en los que pueden usarse los compuestos de
la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
50
La composición del polvo introducido en una
cápsula es
- Un compuesto de la presente invención
- 1-35 mg
- Óxido de magnesio
- 50 mg
- Almidón
- 100-200 mg.
Los ingredientes indicados anteriormente se
mezclan y la mezcla se introduce en cápsulas de gelatina sólidas en
una cantidad de 151-285 mg.
\vskip1.000000\baselineskip
La forma de dosificación en comprimidos se
prepara usando los ingredientes mencionados anteriormente:
- Compuesto de la presente invención
- 1-35 mg
- Almidón de patata
- 100 mg
- Polivinilpirrolidona
- 10 mg
- Estearato de magnesio
- 2 mg
- Lactosa
- 48-82 mg
- Aerosyl
- 5 mg.
Los ingredientes se agitan y se presionan para
producir comprimidos que pesan 200 mg cada uno.
\vskip1.000000\baselineskip
La composición de mezcla en aerosol se calcula
por 10 administraciones:
- Compuesto de la presente invención
- 10-40 mg
- Sulfato de magnesio
- 150 mg
- Lactosa
- 110-140 mg.
El compuesto se mezcla con excipientes y se
coloca en un dispositivo especial para pulverización.
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes bases pueden usarse como bases de
supositorios: bases insolubles en agua - aceite de cacao, bases
solubles en agua o bases mezclables con agua - bases de
gelatina-glicerínicas o de óxido de polietileno;
bases combinadas - jabonosas-glicerínicas.
\vskip1.000000\baselineskip
- Compuesto de la presente invención
- 1-35 mg
- Aceite de cacao
- cantidad necesaria para preparar un supositorio.
Si es necesario pueden producirse supositorios
rectales, vaginales y uretrales con los excipientes respectivos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes compuestos pueden usarse como
base de pomada:
- bases de pomada de carbohidratos -
- vaselina blanca y amarilla (Vaselinum album, Vaselinum flavum), aceite de vaselina (Oleum vaselini) y pomada blanca y amarilla (Unguentum album, Unguentum flavum) y como complementos para conferir una consistencia más firme, pueden usarse parafina dura y cera;
- bases de pomadas absorbentes -
- vaselina hidrófila (Vaselinum hydrophylicum), lanolina (Lanolinum) y crema fría (Unguentum leniens);
- bases de pomada lavables con agua -
- pomada hidrófila (Unguentum hydrophylum);
- bases de pomada solubles en agua -
- pomada de polietilenglicol (Unguentum glycolis polyaethyleni), bases de bentonita y otras.
\newpage
- Un compuesto de la presente invención
- 0,1-0,5 mg
- Vaselina
- 10 mg.
Las pomadas se producen de acuerdo con la
tecnología respectiva.
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes sustancias pueden usarse como
disolventes para preparar una solución para inyección en solución
de cloruro sódico al 0,9%, agua destilada, solución de novocaína.
Formas de dosificación: ampollas, viales,
jeringas-tubos, insertos.
\vskip1.000000\baselineskip
- Un compuesto de la presente invención
- 1-5 mg
- Agua destilada
- 1-2 mg.
Es posible la producción de diferentes formas de
dosificación para inyecciones: soluciones estériles, polvos
estériles y comprimidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
51
- Compuesto de la presente invención:
- 0,1-1 g,
- Odorante:
- 0,5-1,5 g,
- Alcohol etílico 60º-70º:
- 100-150 ml.
Las lociones se fabrican según la tecnología
común con el indicador pH= 5,5-6,0.
\vskip1.000000\baselineskip
- Compuesto de la presente invención:
- 0,1-1 g.
- Aceite de oliva:
- 8-10 g,
- Trietanolamina:
- 1 g,
- Glicerina:
- 3-5 g,
- Benzoato de sodio:
- 1-2 g,
- Odorante:
- 1-1,5 g,
- Lanolina:
- 20-25 g,
- Agua:
- hasta 100 g.
Las cremas se fabrican según la tecnología
pertinente.
Claims (17)
1. Un compuesto que es
ciclohexilcarbonilhistamina o
N-(imidazolil-4-acetil)-heptilamina
o un péptido de fórmula general I:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o de
estructura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o
donde
- \quad
- R_{1} es un radical hidrocarburo C_{1}-C_{3} sustituido con amino o carboxi, estando el grupo carboxi opcionalmente esterificado y estando el grupo amino opcionalmente sustituido con acilo o el éster de ácido carbónico; o
- \quad
- estando el grupo carboxi opcionalmente esterificado y estando el grupo amino opcionalmente sustituido con acilo y el éster de ácido carbónico; o
- \quad
- R_{1} es un radical hidrocarburo C_{1}-C_{3} sustituido con un residuo indol o un grupo heterocíclico insaturado de 5-6 miembros, comprendiendo el radical hidrocarburo opcionalmente simultáneamente un grupo amino que está sin sustituir o sustituido con acilo, o el éster de ácido carbónico;
- \quad
- R_{2} es hidrógeno o carboxi que está opcionalmente esterificado;
- \quad
- R_{3} es un grupo indol, cuyo grupo está sin sustituir o sustituido con metilo o hidroxi, estando el grupo hidroxi a su vez sin sustituir o sustituido con acilo, alquilo o aralquilo;
- \quad
- R_{3} es un grupo heterocíclico saturado o insaturado de 5-6 miembros que comprende oxígeno, azufre y/o 1-3 átomos de nitrógeno, o un grupo carbocíclico insaturado de 5-6 miembros, o su derivado metilo; o
- \quad
- R_{3} es un radical hidrocarburo C_{1}-C_{3} sustituido con un amino o carboxi, estando el grupo carboxi opcionalmente esterificado; o
- \quad
- R_{3} es un radical hidrocarburo C_{1}-C_{3} sustituido simultáneamente con amino, y
- \quad
- n es 0-4 y m es 1-5;
- \quad
- o su sal farmacéuticamente aceptable,
- \quad
- para uso como agente antibacteriano, antitumoral, antiviral o antimetastásico o para aliviar los estados de estrés.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1, que es para uso junto con un agente citostático o
radioterapia.
3. Un compuesto que es un péptido de fórmula
general (I) de la reivindicación 1, en el que:
- \quad
- R_{1} es NH_{2}-CH_{2}-, n es 1-4; o
- \quad
- R_{1} es HOOC-CH_{2}-, n es 0-3; o
- \quad
- R_{1} es Rz-OCO-CH_{2}-, n es 0-3; Rz es -H o un radical hidrocarburo C_{1}-C_{3}; o
- \quad
- R_{1} es HOOC-CH_{2}-(CH_{3})C(Rv)-, Rv es H, -CH_{3}; o
- \quad
- R_{1} es C_{6}H_{5}CH_{2}-OCO-NH-CH_{2}-, n es 1-2; o
- \quad
- R_{1} es RX-CONH-CH_{2}-, n es 1-4, Rx es un radical hidrocarburo C_{1}-C_{3}; o
- \quad
- R_{1} es CH_{3}CONH-CH(COOH)-, n es 1-2; o
- \quad
- R_{1} es CH_{3}CONH-CH([CH_{2}]_{k}COOH)-, n es 0, k es 1-2; o
- \quad
- R_{1} es NH_{2}-CH([CH_{2}]_{k}COOH)-, n es 0, k es 1-2; o
- \quad
- R_{1} es HOOC-CH(NH_{2})-, n es 0; o
- \quad
- R_{1} es HOOC-CH(NH_{2})-, n es 1-2; o
- \quad
- R_{1} es CH_{3}OOC-CH(NH_{2})-, n es 1-2; o
- \quad
- R_{1} es (CH_{3})_{3}C-OCONH-CH(COOCH_{2}-C_{6}H_{5})-, n es 1-2; o
- \quad
- R_{1} es -CH_{2}-4-imidazolilo, -CH_{2}-3-indolilo, n es 0-1; o
- \quad
- R_{1} es Rb-CH_{2}-CH(NHRy)-, Rb es -4-imidazolilo, -3-indolilo, R_{y} es terc-butiloxicarbonilo, benciloxicarbonilo, H-, n es 0;
- \quad
- R_{2} es -H, -COOH, -COORz, donde Rz es H o un radical hidrocarburo C_{1}-C_{3}; y
- \quad
- m = 1; ó
- \quad
- R_{3} es- CH_{2}-NH_{2}, m = 1-2; o
- \quad
- R_{3} es - CH_{2}-COOH, m = 1-2; o
- \quad
- R_{3} es -CH(NH_{2})-COOH, m = 1-2, donde R_{4} = -H, -OH, -OCH_{3}. -OCOCH_{3} o -OCH_{2}C_{6}H_{5}
- \quad
- para un uso tal como se ha definido en la reivindicación 1.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un compuesto que es un péptido de fórmula
general (I) de la reivindicación 1 y se selecciona entre los
siguientes compuestos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
5. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1, que es una estructura de glutarilhistamina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o su sal farmacéuticamente
aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, en el que, cuando el compuesto
es para uso como antiviral, es para uso en el tratamiento de
influenza o VIH.
7. Un compuesto estructura (II), (III), (IV),
(V), (VI^{a}), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X^{a}), (XXV),
(XXI),(XXVII), (XXVIII), (XXIX), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV),
(XXXVII), (XXXVIII), (XXXIX), (XL^{a,b,c}), (XLI), (XLII),
(XLIII) o (Q) o su sal farmacéuticamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
8. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 7, que es glutarilhistamina de fórmula
o su sal farmacéuticamente
aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Un proceso para producir un compuesto de
acuerdo con la reivindicación 7, o su sal farmacéuticamente
aceptable, cuyo proceso comprende la acilación del grupo amino de
un compuesto amino de fórmula general
NH_{2}-CH(R_{2})-(CH_{2})_{m}-R_{3},
en la que R_{2}, R_{3} y m son como se han definido en la
reivindicación 7, con un compuesto carboxi activado de fórmula
general R_{1}-(CH_{2})_{n}-COX como
agente acilante, en la que X es un grupo activador.
10. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
9, en la que cuando R_{1} es HOOC-CH_{2}-, n es
0-3; o R_{1} =
HOOC-CH_{2}-(CH_{3})C(R_{v})-, n
= 1 y R_{v} = H o CH_{3}; y R_{2} es -H o -COOCH_{3},_{
}el compuesto carboxi activado es un anhídrido de un ácido
dicarbónico y el proceso se realiza en un disolvente orgánico.
11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
9, en el que, cuando
R_{1}-CH_{2}-NH_{2}, n =
1-2, R_{2}=H,
- \quad
- m = 1 o
- \quad
- cuando R_{1} = HOOC-CH(NH_{2})-, n = 1-2; y
- \quad
- R_{2} = -COOCH_{3} o H, y
- \quad
- m = 1
el agente de acilación es un pentafluorofenil
éster de ácido
N-benciloxicarbonil-\gamma-aminobutírico
o
N-benciloxicarbonil-\beta-alanina
o un \alpha-bencil éster de de ácido
N-terc-butil
oxicarbonilo-L-glutámico o
aspártico y donde el proceso se realiza en un disolvente orgánico
con la escisión posterior del grupo protector de
N-benciloxicarbonilo y
\alpha-bencil éster o pentafluorofenil éster a
partir del derivado protegido de un dipéptido usando hidrogenolisis
catalítica, con la escisión posterior del grupo
N-terc-butil oxicarbonilo en un
medio ácido anhidro.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
9, en el que R_{1} = CH_{3}CONH-CH(COOH)-
y n = 1-2; o R_{1} =
CH_{3}CONH-CH([CH_{2}]_{k}COOH)-, n =
0, k = 1-2; o R_{1} =
CH_{3}CONH-CH_{2}-, n = 2-4; y
R_{2} = H,
- \quad
- y m = 1,
- \quad
- el agente de acilación es acetato de p-nitrofenilo.
13. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 7 u 8, para uso en un método de tratamiento del
cuerpo humano o animal mediante terapia.
14. Una composición farmacéutica que comprende
un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y, como un
agente activo, un compuesto de acuerdo con la reivindicación 7 u
8.
15. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 7 u 8, para uso como un agente antibacteriano,
antitumoral, antiviral o antimetastásico o para aliviar los estados
de estrés.
16. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 7 u 8 como un antihipóxico, un regulador de lípidos o
un agente hipoglicémico, para controlar los síntomas o prevenir el
asma o el enfisema pulmonar, para controlar los síntomas de
lesiones cutáneas, soriasis o eccema, para prevenir el aborto, la
hemorragia uterina disfuncional o la amenorrea, para controlar los
síntomas de enfermedad isquémica u obesidad, para uso como un agente
hepatoprotector, o para controlar o prevenir los síntomas de una
enfermedad gerontológico.
17. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 16, que es para uso en el control de lesiones
hepáticas incluyendo lesión tóxica, hepatitis, cirrosis o
alcoholismo.
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