KR20100063078A

KR20100063078A - 폐암 치료

Info

Publication number: KR20100063078A
Application number: KR1020107006244A
Authority: KR
Inventors: 신티아 더블유. 터틸
Original assignee: 사이클론 파아머슈티컬 인코오퍼레이티드
Priority date: 2007-08-23
Filing date: 2008-08-21
Publication date: 2010-06-10
Also published as: US20110189305A1; ZA201001876B; JP2010536854A; CA2697261A1; EP2192835A1; WO2009025830A1; BRPI0815772A2; NZ584065A; CN101842009A; MX2010002046A; UA98508C2; EA201070295A1; AU2008289522A1; EP2192835A4

Abstract

본 발명은 대상체에서 폐암을 치료, 예방, 억제 또는 감소시키기 위하여 면역조절 화합물을 투여하는 방법을 제공한다.

Description

폐암 치료{TREATMENT OF LUNG CANCER}

관련 출원

본 출원은 미국 가출원 일련번호 60/957,530 (2007년 8월 23일 출원) (이의 전체 개시내용이 여기에서 참고문헌으로 포함된다)의 우선권을 청구한다.

본 발명은 폐암의 치료 분야에 관한 것이다.

폐암은 폐 조직의 악성 변형 및 확장이고, 전세계에서 매년 백삼십만 명의 사망의 원인이 되고 있다. 이것은 남성에서 암과 관련된 사망의 가장 흔한 원인이고 여성에서는 두 번째로 가장 흔하다.

현재의 연구는, 폐암 위험에 가장 큰 영향을 미치는 요인이 흡입된 발암물질, 특히 담배 연기로의 장기간 노출임을 나타내고 있다. 기타 경우 (1/10 미만)에서 폐암의 발생은 유전자 요인의 조합에 기인한 것으로 보인다. 또한, 라돈 기체 및 공기 오염이 폐암의 발달의 한 원인이 될 수도 있다.

치료 및 예후는 암의 조직학적 유형, 단계 (확산 정도) 및 환자의 활동도에 의존된다. 현재의 치료는 수술, 화학요법 및 방사선요법을 포함한다. 전체적으로, 5년 생존율은 약 14％이다.

현미경 아래에서 조직병리학자에 의해 관찰된 악성 세포의 크기 및 외관으로 분류되는 폐암의 2가지 주요 유형이 존재한다: 비-소 세포(80％) 및 소-세포 (대략 20％) 폐암. 이러한 분류는, 단순한 조직학적 기준을 근거로 하고 있긴 하지만, 질병의 임상적 관리 및 예후를 위해 매우 중요한 영향을 갖는다.

비-소 세포 폐암(NSCLC)은 그들의 진단 및 관리가 대략 동일하기 때문에 같은 군으로 분류된다. 3개의 주된 하위-유형이 존재한다: 편평 세포 폐 암종, 샘암종 및 대 세포 폐 암종.

폐암의 29％에 달하는 편평 세포 암종은 더욱 큰 기관지에서 시작되지만 천천히 성장한다. 이러한 종양의 크기는 진단에 따라 다양하다.

샘암종은 NSCLC의 가장 흔한 하위유형이고 폐암의 32％에 달한다. 이것은 폐의 기체-교환 표면 근처에서 시작되는 형태이다. 샘암종의 대부분의 경우는 흡연과 관련된다. 그러나, 전혀 흡연을 하지 않은 사람("비-흡연자") 중에서도, 샘암종이 폐암의 가장 흔한 형태이다. 샘암종의 하위유형인 세기관지폐포암종은 여성 비-흡연자에서 더욱 흔하고, 치료에 대해 상이한 반응을 가질 수도 있다.

대 세포 암종은 폐암의 9％에 달하고 폐의 표면 근처에서 성장하는 빠른-성장 형태이다.

소 세포 폐암 (SCLC, 또한 "귀리 세포 암종"이라 불림)은 폐암의 덜 흔한 형태이다. 이것은 더욱 큰 호흡관에서 시작되고 빠르게 성장하여 상당히 커지는 경향이 있다. 가장 일반적으로 관련된 종양유전자는 L-myc이다. "귀리" 세포는 내분비/부신생물 증후군 연관을 제공하는 조밀한 신경분비 과립을 함유한다. 이것은 처음에는 화학요법에 더욱 민감하지만, 궁극적으로 더욱 악화된 예후를 가져오고 종종 전달 시에 전이된다. 이러한 유형의 폐암은 흡연과 강하게 연관된다.

다른 유형의 폐암은 유암종, 선양 낭성 암종 (원주종) 및 점액표피양 암종을 포함한다.

전이 암

폐는 신체의 다른 부분에 있는 종양으로부터 전이되는 일반적인 부위이다. 부신, 간, 뇌 및 뼈는 원발성 폐암 자체로부터 전이되는 가장 일반적인 부위이다.

폐암을 치료, 예방, 억제 또는 감소시키기 위한 처치 방법이 당 기술분야에서 여전히 요구되고 있다.

발명의 요약

본 발명에 따르면, 대상체에서 폐암, 그의 전이 또는 폐 외부의 암으로부터 폐로의 전이를 치료, 억제, 감소 또는 적어도 부분적으로 예방하거나, 또는 폐암 세포의 성장, 그의 전이 또는 폐 외부의 암 세포로부터 폐로의 암 세포 전이를 치료, 억제, 감소 또는 적어도 부분적으로 예방하기 위한 처치 방법은, 대상체에서 상기 폐암, 그의 전이 또는 폐 외부의 암으로부터 폐로의 전이를 치료, 억제, 감소 또는 적어도 부분적으로 예방하거나, 또는 상기 폐암 세포의 성장, 그의 전이 또는 폐 외부의 암 세포로부터 폐로의 암 세포 전이를 치료, 억제, 감소 또는 적어도 부분적으로 예방하기 위해 치료-유효량의 화학식 A의 면역조절제 화합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

<화학식 A>

[상기 식에서,

n은 1 또는 2이고, R은 수소, 아실, 알킬 또는 펩티드 단편이고, X는 방향족 또는 헤테로시클릭 아미노산 또는 그의 유도체이다]

도 1은 하나의 구현양태의 연구에서 상이한 투여량에서의 종양 성장을 그래프로 나타낸다.
도 2는 하나의 구현양태의 연구에서 상이한 투여량에서의 종양 중량을 그래프로 나타낸다.

바람직한 구현양태의 상세한 설명

하나의 구현양태에 따르면, 본 발명은 면역조절제 화합물을 포유동물 대상체, 바람직하게는 인간 환자에게 투여함으로써 폐암을 치료, 적어도 부분적으로 예방, 억제 또는 감소시키기 위한 처치 방법에 관한 것이다.

특정한 구현양태에서, 질병은 폐암, 그의 전이 또는 폐 외부의 암으로부터 폐로의 전이이다. 본 발명은 폐암 세포의 성장, 그의 전이 또는 폐 외부의 암 세포로부터 폐로의 암 세포의 전이를 치료, 적어도 부분적으로 예방, 억제 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현양태에서, 원발성 폐암 종양 또는 그의 대부분은 본 발명의 화합물로의 치료 전, 동안 또는 후에 수술에 의해 제거된다.

본 발명에 따른 면역조절제 화합물은 하기 화학식 A의 면역조절제를 포함한다.

<화학식 A>

화학식 A에서, n은 1 또는 2이고, R은 수소, 아실, 알킬 또는 펩티드 단편이고, X는 방향족 또는 헤테로시클릭 아미노산 또는 그의 유도체이다. 바람직하게는, X는 L-트립토판 또는 D-트립토판, 가장 바람직하게는 L-트립토판이다.

"X"에 대한 방향족 또는 헤테로시클릭 아미노산의 적절한 유도체는 아미드, 모노- 또는 디-(C₁-C₆) 알킬 치환된 아미드, 아릴아미드, 및 (C₁-C₆) 알킬 또는 아릴 에스테르이다. "R"을 위해 적절한 아실 또는 알킬 잔기는 1 내지 약 6개 탄소 원자의 분지 또는 비분지 알킬 기, 2 내지 약 10개 탄소 원자의 아실 기, 및 카르보벤질옥시 및 t-부틸옥시카르보닐과 같은 봉쇄 기이다. 바람직하게는, 화학식 A에 나타낸 CH 기의 탄소는, n이 2일 때 X의 입체배열과 상이한 입체배열을 갖는다.

바람직한 구현양태는 γ-D-글루타밀-L-트립토판, γ-L-글루타밀-L-트립토판, γ-L-글루타밀-N_in-포르밀-L-트립토판, N-메틸-γ-L-글루타밀-L-트립토판, N-아세틸-γ-L-글루타밀-L-트립토판, γ-L-글루타밀-D-트립토판, β-L-아스파르틸-L-트립토판, 및 β-D-아스파르틸-L-트립토판과 같은 화합물을 사용한다. 특히 바람직한 구현양태는 γ-D-글루타밀-L-트립토판 (때로는 SCV-07이라 일컬어짐)을 사용한다. 이러한 화합물, 이 화합물의 제조 방법, 이 화합물의 제약학적으로 허용가능한 염, 및 그의 제약학적 제제는 미국 특허 5,916,878 (여기에서 참고문헌으로 포함됨)에 개시되어 있다.

SCV-07, γ-D-글루타밀-L-트립토판은 γ-글루타밀 또는 β-아스파르틸 잔기를 가진 면역조절 약물 부류의 요소이고, 이것은 러시아 과학자에 의해 발견되었으며 미국에서 사이클론 파마슈티칼스 인코포레이티드 (SciClone Pharmaceuticals Inc.)에 의하여 몇가지 징후에서의 효능을 시험하였다. SCV-07은 생체내 및 시험관내에서 다수의 면역조절 활성을 갖는다. SCV-07은 Con-A-유도된 흉선세포 및 림프구 증식을 증가시키고, Con-A-유도된 인터류킨-2 (IL-2) 생성 및 비장 림프구에 의한 IL-2 수용체 발현을 증가시키며, 뼈 골수 세포에서 Thy-1.2의 발현을 자극한다. 생체내에서, SCV-07은 5-FU-면역-억제된 동물 및 양 적혈구로의 면역화 모델에서 강력한 면역자극 효과를 갖는다.

화학식 A 화합물은 어떠한 유효 투여량, 예를 들어 약 0.001 내지 1000 mg, 바람직하게는 약 0.1 내지 100 mg, 가장 바람직하게는 약 10 mg의 투여량으로 투여될 수 있다. 투여량은 1주일 당 1회 이상 투여될 수도 있고, 예를 들어 1일 기준으로 투여량을 1일 당 1회 이상으로 투여한다. 투여는 경구, 비내, 경피, 설하, 주사, 주기적 주입, 연속 주입 등을 포함한 어떠한 적절한 방법에 의해 실행될 수 있다. 다른 형태의 주사 및 주입이 사용될 수도 있긴 하지만 투여량은 근육내 주사에 의해 투여될 수 있으며, 경구 또는 비내 흡입 또는 경구 섭취와 같은 다른 형태의 투여가 사용될 수도 있다. 에어로졸, 용액, 현탁액, 분산액, 정제, 캡슐, 시럽 등이 사용될 수도 있다.

투여량은 체중 킬로그램 당 밀리그램으로 측정될 수 있으며, 투여량은 약 0.00001 내지 1000 mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 100 mg/kg, 더욱더 바람직하게는 약 0.1 내지 50 mg/kg, 더욱 더 바람직하게는 약 1 내지 20 mg/kg의 범위이다.

SCV-07과 실질적으로 유사한 생물활성을 가진 치환, 결실, 연장, 대체 또는 달리 변형된 부분을 갖는 생물학적 활성 유사체, 예를 들어, SCV-07과 실질적으로 동일한 활성을 갖고 실질적으로 동일한 방식으로 기능하도록 SVC-07과 충분한 상동성을 가진 SCV-07 유도 펩티드가 포함된다.

하나의 구현양태에 따르면, 치료 또는 예방 기간 동안에 대상체의 순환계에서 화학식 A 화합물의 유효량을 실질적으로 연속적으로 유지하도록, 화학식 A 화합물을 대상체에게 투여할 수도 있다. 본 발명에 따르면 훨씬 더 긴 치료 기간이 계획되긴 하지만, 본 발명의 구현양태는 적어도 약 6, 10, 12 시간 또는 그 이상의 치료 기간 동안에 환자의 순환 계에서 화학식 A 화합물의 유효량을 실질적으로 연속적으로 유지하는 것을 포함한다. 다른 구현양태에서, 치료 기간은 적어도 약 1일 동안, 및 심지어 여러 날 동안, 예를 들어 1주일 또는 그 이상 동안이다. 그러나, 상기 정의된 바와 같이, 대상체의 순환 계에서 화학식 A 화합물의 유효량이 실질적으로 연속적으로 유지되는 치료는, 유사하거나 상이한 길이의 비-치료 기간에 의해 분리될 수도 있는 것으로 생각된다.

하나의 구현양태에 따르면, 대상체의 순환 계에서 화학식 A 화합물의 유효량을 실질적으로 연속적으로 유지하기 위해, 치료 기간 동안에 화학식 A 화합물을 예를 들어 정맥내 주입에 의하여 대상체에게 연속 주입한다. 주입은 어떠한 적절한 수단, 예컨대 미니펌프에 의하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 대상체의 순환 계에서 화학식 A 화합물의 유효량을 실질적으로 연속적으로 유지하기 위하여 화학식 A 화합물의 주입 요법을 유지할 수 있다. 적절한 주사 요법은 치료 기간 동안에 대상체의 순환 계에서 면역조절제 화합물 펩티드의 유효량을 실질적으로 연속적으로 유지하기 위하여 매 1, 2, 4, 6 등의 시간마다 주사하는 것을 포함할 수도 있다.

화학식 A 화합물의 연속 주입 동안에 실질적으로 더욱 긴 기간 동안 투여를 실행하는 것이 계획되긴 하지만, 하나의 구현양태에 따르면 화학식 A 화합물의 연속 주입은 적어도 약 1 시간의 치료 기간 동안 이루어진다. 더욱 바람직하게는, 연속 주입을 더욱 긴 기간 동안, 예컨대 적어도 약 6, 8, 10, 12 시간 또는 그 이상 동안 수행한다. 다른 구현양태에서, 연속 주입은 적어도 약 1일, 심지어 여러 날, 예컨대 1주일 또는 그 이상 동안 수행된다.

일부 구현양태에서, 화학식 A 화합물은 제약학적으로 허용가능한 액체 담체, 예컨대 주사용 수, 생리 식염수 또는 유사한 담체에 약 0.001 - 1000 ㎍/ml, 더욱 바람직하게는 약 0.1 - 100 ㎍/ml의 범위의 농도로 존재한다.

화학식 A 화합물의 유효량은 일상적인 투여-적정 실험에 의해 결정될 수 있다.

화학식 A 화합물은 다른 약제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 암의 치료에서 이러한 약제는 화학요법제 및/또는 방사선을 포함한다.

방사선은 어떠한 적절한 방법에 의해, 그리고 어떠한 적절한 선량 및 당 기술분야에서 투여되는 투여 요법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 방사선은 대략 1 Gy/분의 투여 속도로 투여될 수 있고, 방사선의 비 투여일에 의해 분리되는 별도의 투여 일에, 예를 들어 약 4 Gy/투여의 1일 당 2회 투여로 투여될 수 있다.

화학식 A 화합물과 함께 치료 요법에서 투여될 수 있는 화학요법제는 어떠한 적절한 화학요법제, 예컨대 제한없이 시스플라틴, 5-플루오로우라실 (5-FU), DTIC 등을 포함한다. 이러한 화학요법제는 하기 실시예에 기재된 것을 포함하여 어떠한 적절한 투여량 및/또는 투여 요법으로 투여될 수도 있다.

실시예 1

약어

CTX 시클로포스파미드

F 여성

g 그램

IR 억제율

Ip 복강내

Kg 킬로그램

L 길이

M 남성

mL 밀리리터

sc 피하

SD 표준 편차

W 폭

요약

이 연구에서, C57/BL6 마우스에서 뮤린 폐 종양의 성장에 미치는 억제 효과에 관하여 SCV-07을 시험하였다. 총 70마리 마우스를 뮤린 루이스 폐 암(LLC) 세포로 피하 이식하고, 이어서 SCV-07 또는 시클로포스파미드(CTX) 단독으로 또는 조합하여 연속 14일 동안 처치하였다. SCV-07을 매일 피하 주사에 의해 투여한 반면, CTX를 격일마다 복강내 주사에 의해 투여하였다. 총 7개 군을 사용하였다: 1 군: 부형제; 2 군: CTX 20 mg/kg; 3 군: CTX 40 mg/kg; 4 군: SCV-07 5 mg/kg; 5 군: SCV-07 10 mg/kg; 6 군: SCV-07 5 mg/kg + CTX 20 mg/kg; 7 군: SCV-07 10 mg/kg + CTX 20 mg/kg. 매 3일마다 종양 부피 및 체중을 측정하고, 연구 마지막에 제16일 (부검 일)에 종양 중량을 측정하였다.

연구 과정에 걸쳐서, 어느 군에서도 동물 사망이 발견되지 않았다. 또한, 체중의 통계적 결과는 SCV-07 단독 군과 부형제 대조군 사이에서 상당한 차이를 나타내지 않았으며, 이는 동물 성장에서 SCV-07의 효과가 없음을 가리키는 것이다. 반대로, 제6일 이후로부터 CTX 처치군은 특히 CTX의 높은 투여량으로 투여된 군에서 체중의 상당한 감소를 나타내었다.

종양 성장에 관하여, 제3일에, 4 군을 제외한 모든 군이 1 군 (부형제 대조)에 비하여 종양 부피의 통계적으로 의미있는 억제를 나타내었다. 제6일에, 단지 2 군 및 3 군만이 억제를 나타내었다. 제9일에, 2 군, 3 군 및 7 군이 억제를 나타내었다. 제12일에, 4 군을 제외한 모든 군이 억제를 나타내었다. 제15일에, 모든 군의 평균 종양 크기는 1 군에 비하여 통계적으로 의미있게 더 작았다. 제16일에, 모든 처치군의 평균 종양 중량은 부형제 대조군보다 낮았다. 2 군, 3 군, 4 군, 5 군, 6 군 및 7 군의 종양 중량 억제 율은 각각 45.54％ (p<0.01), 90.25％ (p<0.01), 18.08％ (p=0.07), 30.60％ (p<0.01), 48.57％ (p<0.01) 및 62.63％ (p<0.01)이었다.

결론적으로, 부형제 군은 상당한 종양 성장을 나타내는 반면 포지티브 대조약물 CTX는 종양 성장을 효과적으로 감소시키기 때문에, 이 연구에서 사용된 종양 모델이 유효하다. 14일 동안 SCV-07 (10 mg/kg)의 매일 투여는 종양 성장을 상당히 억제하였다. 처치된 동물에서 종양 중량은 부형제 대조군에 비하여 상당히 감소되었다. 또한, 최적 이하의 투여량의 CTX (20 mg/kg)와 높은 투여량의 SCV-07 (10 mg/kg)의 조합 처치는 증가된 항-종양 효능을 나타내었다.

도입

이 연구는 폐암에서 항-종양 약물로서 그의 잠재력을 조사하기 위하여 뮤린 폐암 모델을 사용하여 SCV-07의 항-종양 효과를 시험하였다. CTX는 포지티브 대조로서 사용된다. 추가 또는 상승 효과가 존재하는지를 결정하기 위하여 SCV-07과 CTX의 조합 효과를 시험한다.

재료 및 방법

시험 및 대조 물품

네가티브 대조 물품 (부형제)으로서 PBS를 사용하고, 포지티브 대조로서 CTX를 사용하였다. 시그마-알드리치로부터 CTX를 구입하고 10 mg/바이알로 등분하였다. 연구 설계 표에 나타낸 바와 같이 적절한 투여 수준을 달성하기 위하여, PBS를 첨가하였다. 제제를 빙냉시키고, 빛으로부터 보호하고 즉시 사용하였다. 연구 설계 표에 나타낸 것과 같이 적절한 투여 수준을 달성하기 위하여 시험 물품 (SCV-07)을 PBS에 용해시키고, 빙냉시키고, 빛으로부터 보호하고 1주일 이내에 사용하였다.

시험 시스템 및 동물 낙농

뮤린 폐암 세포(LLC)

중국 의료과학 아카데미(CAMS: 중국 베이징)의 세포 배양 센터로부터 뮤린 루이스 폐암 세포를 수득하였다. 실험에서 사용하기 전에 암 세포를 C57BL/6 마우스에 순응시켰다. 세포 순응에 관한 세부사항에 관하여 항목 4.3.1을 참조한다.

시험 시스템

중국 베이징의 CAMS 실험 동물 과학 연구소로부터 35마리 수컷 및 35마리 암컷의 건강하고 실험을 받은 적이 없는 C57BL/6 마우스를 받았다. 동물은 6주령이고 연구 시작 시에 18 내지 22그램의 체중이었다.

동물 낙농

깔짚 재료로서 오토클레이브처리된 목재 조각을 가진 오토클레이브처리된 신발 상자 우리에 동물들을 군별로 수용시켰다. 동물 방의 온도를 22 내지 25 ℃로 유지하고, 상대 습도를 40 내지 60％로 유지하였다. 연구에 관련된 사건에 의해 중단될 때 이외에는 12-시간 빛/12-시간 어둠의 주기를 유지하였다. 동물에게 멸균 수 및 베이징 케아오자이리(KeAoXieLi) 설치류 사료(보증됨)을 무제한 공급하였다. 모든 동물을 종양 접종 전 3일 동안 새 환경에 순응시켰다.

실험 절차

종양 세포 순응

무균 조직 배양 절차에 따라서, 마우스 폐암 세포의 1 바이알을 해동시키고 1000 rpm, 20-25 ℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 세포 펠릿을 0.5 mL 생리식염수(NS)에 현탁시키고, 각각의 마우스의 오른쪽 겨드랑이에 피하 주사하였다 (대략 1× 10⁶ 세포/마우스). 종양 직경이 대략 1 cm에 이르를 때, 동물을 CO₂ 질식으로 안락시시키고, 종양을 절제하였다. 종양 세포를 앞서 기재된 생리 식염수에 현탁시키고, 세포 순응 주기를 한번 이상 반복하였다.

종양 세포 접종

0.1 mL 부피의 생리 식염수 중에 1 × 10⁶ LLC 세포를 마우스의 오른쪽 겨드랑이 부위에 피하 주사하였다. 종양 접종 일을 제0일로 정의하였다.

연구 설계 및 치료 요법

제1일에, 평균 체중이 군들 사이에서 통계적으로 의미있게 다르지 않도록 동물을 그들의 체중을 기준으로 하여 7개의 상이한 군으로 무작위로 추출하였다. 제1일에 투여를 시작하였다. SCV-07을 0.1 mL/20 g 체중의 투여 부피로 피하(sc) 투여를 통해 연속 14일 동안 하루 한번 투여하고, 동일한 투여 부피로 격일마다 복강내 주사에 의해 CTX를 투여하였다. 동일한 투여 부피로 PBS의 sc 투여를 통해 부형제를 연속 14일 동안 하루 한번 투여하였다. 모든 군을 위한 치료 요법을 표 1에 기재한다.

항-종양 효과의 평가

연구 과정에 걸쳐서, 모든 동물의 종양 크기 및 체중을 매 3일마다 측정하였다 - 종양 크기를 캘리퍼스로 측정하고 체중을 실험실 저울로 측정하였다. 동물 사망율 및 이환율을 매일 측정하고 기록하였다. 제16일에, CO₂ 질식에 의해 동물을 안락사시키고 종양을 절제하고 분리하고 무게를 재었다.

하기 식을 사용하여 종양 부피를 계산하였다.

종양 부피 = 길이 × 폭 × 폭/2

하기 식에 따라서 종양 부피 억제율(IR)을 계산하였다:

IR (TV) = (TV_부형제 - TV_{처치된 약물})/TV_부형제 × 100％

여기에서, TV는 측정일에서의 종양 부피이고, "부형제"는 PBS를 받는 군을 나타내고, "처치된 약물"은 SCV-07 및/또는 CTX를 받는 군을 나타낸다.

단독으로 또는 CTX와 조합하여 사용된 SCV-07의 항-종양 효과를 종양 중량에 의해 평가하였다. 각각의 마우스의 종양 중량을 안락사 후에 기록하고, 하기 식에 따라서 종양 중량의 억제율을 계산하였다.

IR (TW) = (종양 중량_부형제 - 종양 중량_{처치된 약물})/종양 중량_부형제 × 100％

엑셀을 사용하여 평균 및 표준 편차를 계산하였다.

통계적 분석

학생의 t 시험을 사용하여, 종양 부피, 종양 중량 및 체중을 고려하여 군-간 비교를 수행하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 의미있는 것으로 간주되었다.

결과 및 논의

사망율

연구에서 동물 사망이 관찰되지 않았다.

종양 크기

종양 크기의 원 측정 데이터를 부록 1-10에 기재한다. 계산된 종양 억제율 및 각 처치군 대 부형제 군의 통계적 비교를 표 2 내지 6에 기재한다. 종양 성장 곡선을 도 1에 나타낸다. 종양 부피 데이터를 기준으로 하여, 4 군 이외의 모든 군이 제3일에 종양 성장의 상당한 억제를 나타내었다. 2 군 및 3 군은 제6일에 억제를 나타내었다. 제9일에, 2 군, 3 군, 7 군의 평균 종양 크기는 1 군 (부형제)에 비하여 통계적으로 의미있게 작았다. 제12일에, 4 군을 제외한 모든 처치군의 평균 종양 크기는 1 군에 비해 통계적으로 의미있게 작았다. 제15일에, 모든 군의 평균 종양 크기는 1 군에 비해 통계적으로 의미있게 작았다. 조합 처치군 중에서, 고 투여량의 SCV-07은 CTX와 함께 추가의 효과를 나타내었다.

종양 중량

종양 중량의 원 데이터를 부록 11에 나타내는 반면, 각각의 처치군과 부형제 대조군 간의 통계적 비교 결과를 표 7에 표로 나타낸다. 표 7에 나타낸 것과 같이, 모든 처치군의 제16일에 측정된 평균 종양 중량은 부형제 대조군에 비해 낮았다. 2 군, 3 군, 4 군, 5 군, 6 군 및 7 군에서의 종양 억제율은 각각 45.54％ (p<0.01), 90.25％ (p<0.01), 18.08％ (p=0.07), 30.60％ (p<0.01), 48.57％ (p<0.01) 및 62.63％ (p<0.01)이었다. 2 군 (CTX 20 mg/kg) 및 6 군 (CTX 20 mg/kg + SCV-07 5 mg/kg) 간의 종양 억제에 통계적으로 의미있는 차이가 존재하지 않았다. 반대로, 7 군 (CTX 20 mg/kg + SCV-07 10 mg/kg)에서의 억제율은 2 군 (CTX 20 mg/kg)에서보다 통계적으로 의미있게 크며, 이것은 CTX를 SCV-07과 조합하여 사용할 때 추가의 효과를 나타낸다.

도 2는 연구 마지막 (제16일)에 모든 군에 대한 종양 중량을 나타낸다.

체중

체중 측정의 원 데이터를 부록 12-17에 기재하였다. 각각의 처치군 대 부형제 군의 통계적 비교 결과를 표 8 내지 13에 기재한다.

표에 나타낸 바와 같이, 제3일에 각각의 처치군 대 부형제 대조군 간에 의미있는 차이가 존재하지 않았다. 제6일에, 3 군 (CTX 40 mg/kg)은 10.82％ (p<0.05)의 체중 억제율을 나타내었다. 다른 군에서 체중의 의미있는 차이가 존재하지 않았다. 제9일에, 2 군 (CTX 20 mg/kg), 3 군 (CTX 40 mg/kg) 및 6 군 (CTX 20 mg/kg + SCV-07 5 mg/kg)의 억제율은 각각 12.35％ (p<0.01), 16.12％ (p<0.01) 및 7.22％ (p<0.01)이었다. 6 군에서 SCV-07의 첨가에 따라 체중 증가의 억제율이 감소되었다. 다른 군에서 체중의 의미있는 차이가 존재하지 않았으며, 이것은 SCV-07이 동물 체중 증가에 효과가 없음을 나타낸다. 제12일에, 2 군 (CTX 20 mg/kg), 3 군 (CTX 40 mg/kg) 및 6 군 (CTX 20 mg/kg + SCV-07 5 mg/kg)에 대한 억제율은 각각 14.83％ (p<0.01), 21.97％ (p<0.01) 및 10.28％ (p<0.01)이었다. 제15일에, 3 군 (CTX 40 mg/kg)에서의 억제율은 25％ (p<0.01)이었다. 다른 군에 대해 체중의 의미있는 차이가 존재하지 않았다. 이 결과는, CTX가 아마도 그의 독성에 기인한 체중 증가를 억제하며 SCV-07이 아마도 CTX 독성의 경감에 기인하여 억제를 부분적으로 유보할 수 있음을 나타내었다.

결론 및 논의

결론적으로, 종양 성장이 포지티브 대조 약물 CTX에 의해 억제될 수 있기 때문에 이 연구에서 사용된 종양 모델은 유효하다. 14일 동안 10 mg/kg으로 시험 물품 SCV-07을 매일 투여하는 것은 종양 성장에 대해 효과적이다. 모든 SCV-07-처치된 동물 군에서 종양 크기는 제12일 이후로부터 부형제 대조군에서의 종양 크기와 비교할 때 상당히 감소되었다. 제16일에 측정된 종양 중량은 10 mg/kg SCV-07 단독을 받은 군 및 조합 요법을 받은 군에서 상당히 감소되지만, 5 mg/kg SCV-07 단독을 받은 군에서는 그렇지 않았다. 또한, 10 mg/kg SCV-07 또는 20 mg/kg CTX를 단독으로 사용할 때 수득되는 30.6％ 및 45.54％ 억제에 비하여, 10 mg/kg SCV-07 및 20 mg/kg SCV-07의 조합 사용은 공동으로 종양 성장의 62.63％ 억제를 일으켰다. 이러한 결과는, SCV-07과 CTX의 조합 사용이 종양 성장 억제에 대해 추가의 효과를 일으킨다는 것을 제시한다.

CTX 처치군에서 평균 동물 체중은 상당히 감소되고, 이것은 독성 효과를 나타낸다. 그러나, 조합 처치군에서 SCV-07의 첨가에 의해서, CTX의 독성 효과가 SCV-07에 의해 적어도 부분적으로 감독될 수 있는 것으로 보인다. 이 현상은 CTX 20 mg/kg 단독이 체중 증가의 통계적으로 의미있는 억제를 일으킬 때인 제9일에 뚜렷하지만, 조합 처치군 (CTX 20 mg/kg + SCV-07 10 mg/kg)에서는 억제가 없어진다. 본 발명자들은 체중 증가의 더욱 현저한 억제를 일으키는 더욱 높은 투여량의 CTX (즉, 40 mg/kg)와 조합된 SCV-07의 예방 효과를 시험하지 않았다. 미래의 연구에 의해 입증된다면, SCV-07 및 CTX 조합 요법을 고려할 때 SCV-07의 예방 효과가 매우 유용할 것이다. 전체적으로, 최적이하 투여량의 CTX (20 mg/kg)와 고 투여량의 SCV-07 (10 mg/kg)의 조합은 증가된 항-종양 효능 및 낮은 독성을 나타내었다.

실시예 2

종양 성장의 감소 효능에 대해 방사선과 조합된 SCV-07의 평가

요약

이 연구에서, 마우스에서 H146 폐암 모델을 사용하여, 방사선 처치와 함께 또는 방사선 치료 없이 종양 성장에 대한 SCV-07의 영향을 시험하였다. 종양을 가진 마우스를 20일 동안 1일 1회 방사선 요법과 함께 또는 방사선 요법없이 식염수 또는 SCV-07로 처치하였다. SCV-07은 생존 및 체중 변화의 관찰을 기준으로 한 연구에서 독성의 증거를 나타내지 않았으며, 방사선에 대한 H146 종양의 반응을 변화시키지 않았다. 단독으로 제공될 때, SCV-07은 투여량 의존적 방식으로 종양 성장을 감소시키는데 효과적이었으며, 20일 동안 1 mg/kg으로 1일 2회 SCV-07을 받은 동물은 9.1％의 종양 성장 억제를 나타내고, 20일 동안 10 mg/kg으로 1일 2회 SCV-07을 받은 동물은 35.9％ 종양 성장 억제를 나타내었다. 방사선 요법의 단일 투여와 조합될 때, 20일 동안 1일 2회 10 mg/kg으로 SCV-07로 처치하면 78.3％ 종양 성장 억제를 가져오거나 또는 방사선 단독으로 처치된 동물에 비해 40.5％의 TGI를 가져온다. 이러한 관찰을 기초로 하여 SCV-07은 단독으로 또는 방사선 요법과 조합하여 주어질 때 폐암 모델에서 종양의 성장을 감소시키는데 효과적인 것으로 보인다.

목적

마우스에서 NCl H146 소 세포 폐암 모델을 사용하여 종양 성장을 억제하는데 있어서 단독-요법으로서 그리고 방사선요법과 함께 SCV-07의 효능을 평가하기 위함.

연구 설계

96마리 암컷 누드 마우스(nu/nu)를 8개 처치군으로 무작위로 지정하였다. 각각의 마우스에 1×10⁵ NCl-H146 (H146) 폐암 세포를 마트리겔(Matrigel)과 함께 0.1 mL의 부피로 왼쪽 아래 옆구리에 접종하였다. 종양이 75-125 mm³의 부피에 이르렀을때 처치를 시작하였다. 군을 표 2.1에 상세히 나타낸 것과 같이 부형제, 방사선, SCV-07 또는 방사선 및 SCV-07로 처치하였다. 약물 처치의 개시를 제1일로 표시하였다. 1 군 및 4 군의 마우스는 20일 동안 피하(sc) 주사에 의해 부형제를 받았다. 2-4 군 및 6-8 군의 마우스는 제1일 내지 제20일에 sc 주사에 의해 1일 1회 부형제 중의 SCV-07을 받았으며, 6-8 군의 마우스는 방사선을 받았다 (제0일 및 제2일에 4 Gy/투여의 2회 투여). 이러한 군에 있는 마우스를 케타민 (120 mg/kg) 및 자일라진 (6 mg/kg)으로 마취시키고 종양을 가진 옆구리 부위가 방사선에 노출되도록 이들을 납 받침대에 놓아둠으로써 방사선처치를 수행하였다. 대략 40 cm의 초점 거리에서 필립스 160 kV 광원을 사용하여 대략 1.0 Gy/분의 선량으로 방사선을 전달하였다. 연구 기간에 걸쳐서 격일로 종양을 측정하였다. 1-8 군의 마우스를 제21일에 희생시키고 나머지 종양을 절제하고 측정하고 무게를 재고 사진을 찍고 이후의 분석을 위해 포르말린에 고정시켰다.

<표 2.1>

중량 및 생존

가능한 독성을 평가하기 위하여, 매일 동물의 무게를 재고 그들의 생존을 기록하였다. 연구 과정 동안에 출발 체중의 20％ 초과의 손실을 나타내는 동물을 안락사시켰다. 종양이 4000 mm³ 초과로 자란 동물도 안락사시켰다.

재료 및 방법

조직 배양

ATCC로부터 H146 인간 폐암 세포를 수득하였다. 이러한 세포를 10％ 태아 소 혈청(FCS), 1％ 페니실린 및 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민으로 보충된 DMEM에서 생육시켰다. 배지를 제거하고 무균 칼슘- 및 마그네슘-비함유 인산염 완충 염수(PBS)로 2회 헹구고 1 내지 2 ml의 0.25％ 트립신/0.03％ EDTA 용액을 첨가함으로써 세포를 계대 배양하였다. 세포가 분리될 때까지 플라스크를 37 ℃에서 배양하였다. 세포를 1:3의 비율로 계대-배양하였다.

연구 수행 장소

미국 매사츄세츠 워터타운에 바이오모델 AAALAC 인가 설비에서 연구를 수행하였다. 이 연구를 위한 동물 사용 승인은 바이오모델스 IACUC로부터 얻었다.

동물

nu 유전자에 대해 동형접합적인 (nu+/nu+) (챨스 리버 랩스), 24 그램의 평균 전-치료 체중을 가진 5 내지 6주령의 암컷 누드 마우스를 사용하였다. 귀 펀치를 사용하여 동물을 개별적으로 번호매기고, 우리 당 6마리의 동물 군으로 수용하고 연구 개시 전에 새 환경에 순응시켰다. 적어도 2일의 순응 기간 동안에 불량한 상태로 제공된 동물을 거부하기 위하여 동물을 매일 관찰하였다.

수용

70℉ ± 5 ℉의 온도 및 50％ ± 20％ 상대 습도에서 여과된 공기가 제공된 동물 실에서 연구를 수행하였다. 동물 실을 1시간 당 최소 12 내지 15회 공기 변화를 유지하도록 설정하였다. 어스름 없이 12시간 켜지고 12시간 꺼지는 명/암 주기를 위하여 자동 타이머를 방에 설치하였다.

살균된 베드-O-콥스(Bed-O-Cobs)® 깔짚을 사용하였다. 깔짚을 1주당 최소 1회 교환하였다.

시판되는 세제로 우리, 지붕, 병 등을 세척하고 통풍 건조시켰다. 사용 전에, 이 항목들을 감싸고 오토클레이브처치하였다. 표면 및 후드에 도입되는 재료를 소독하기 위하여 시판되는 소독제를 사용하였다. 마루를 매일 쓸고 시판되는 세제로 최소 1주 2회 자루걸레로 닦았다. 벽 및 우리 선반을 묽은 표백 용액으로 최소 1달에 한번 스폰지로 닦았다. 연구, 투여량, 동물 수 및 처치군을 확인하기 위하여 필요한 적절한 정보를 가진 우리 카드 또는 라벨을 모든 우리에 표시하였다. 연구 동안에 온도 및 상대 습도를 기록하고 기록을 유지하였다.

식사

무균 랩다이어트(Labdiet)® 5053 (예비-살균) 설치류 음식물을 동물에 공급하고 멸균 수를 무제한으로 제공하였다.

동물 무작위추출 및 배정

치료 개시 전에 마우스를 무작위로 사전에 8개 군으로 나누었다. 각각의 동물을 개별 번호에 상응하는 귀 펀칭으로 확인하였다. 각각의 우리를 확인하기 위해 우리 카드를 사용하고 연구 번호(SCI-05), 처치군 번호 및 동물 번호로 표시하였다.

결과의 평가

학생 t-시험, 만-위트니 U 시험 및 0.05의 임계값을 가진 카이-제곱 분석을 사용하여 처치군 간의 통계적 차이를 결정하였다.

실험 절차

마이크로-캘리퍼스로 2일마다 한번 종양을 측정하고 종양 부피를 4/3 πr³으로 계산하였다 (여기에서 r은 길이와 폭의 합을 4로 나눈 것이다). 수학식 100 - (Vc * 100/Vt)을 사용하여 종양 성장 지수(TGI)를 계산하였다 (여기에서 Vc는 대조군에서 종양의 평균 부피이고 Vt는 시험 군에서 종양의 평균 부피이다).

결과 및 논의

생존

이 연구 과정 동안에 처치의 직접적인 결과로서 동물 사망이 발생하지 않았다.

동물 중량

부형제-처치된 군과 단일 요법으로서 SCV-07을 받은 동물(p=0.7) 또는 방사선 단독 및 방사선요법과 함께 SCV-07을 받은 동물(p=0.68) 사이에 평균 매일 중량 변화에서는 중요한 차이가 없었다. 부형제만을 받은 마우스는 제21일까지 그들의 시작 중량의 평균 13.2％가 증가되었다. 100 ㎍/kg, 1.0 mg/kg 또는 10 mg/kg SCV-07로 처치된 마우스는 제21일까지 그들의 시작 중량의 10.2％ 내지 12.3％가 증가되었다. 부형제로 처치되고 방사선에 노출된 마우스는 제21일까지 그들의 시작 중량의 평균 3.2％가 증가되었다. 100 ㎍/kg, 1.0 mg/kg 또는 10 mg/kg SCV-07로 처치되고 방사선에 노출된 마우스는 제21일까지 그들의 시작 중량의 2.8％ 내지 3.6％가 증가되었다.

각각의 동물에 대한 퍼센트 중량 변화 곡선 (AUC) 아래의 평균 면적을 계산하고 1-방식 ANOVA 시험을 사용하여 군을 비교함으로써 이러한 차이의 의미를 평가하였다.

종양 부피

평균 반경(r) (길이 및 폭의 합을 4로 나눈 것)을 계산하고 식 4/3πr³을 사용하여 부피를 계산함으로써, 격일로 측정된 길이 및 폭 측정치로부터 종양 부피를 계산하였다.

100 ㎍/ml로 처치된 동물로부터의 종양은 부형제 대조 동물에 비하여 더욱 빠른 속도로 성장하였다. 비-방사선조사된 동물 중에서, 10 mg/kg의 SCV-07로 처치된 마우스는 종양 성장 억제에서 최선의 개선을 나타내었다. 연구 기간의 마지막에서 평균 종양 부피는 부형제 처치된 동물에 대해 4436.6 mm², 100 ㎍/kg SCV-07 처치된 동물에 대해 4923 mm², 1 mg/kg SCV-07 처치된 동물에 대해 4033.4 mm², 10 mg/kg SCV-07 처치된 동물에 대해 2842.4 mm²이었다.

방사선조사된 동물 중에서, 10 mg/kg의 SCV-07로 처치된 마우스는 종양 성장 억제에서 최선의 개선을 나타내었다. 연구 기간의 마지막에서 평균 종양 부피는 부형제 처치된 동물에 대해 1618.5 mm², 100 ㎍/kg SCV-07 처치된 동물에 대해 1322.3 mm², 1 mg/kg SCV-07 처치된 동물에 대해 1923.9 mm², 10 mg/kg SCV-07 처치된 동물에 대해 962.8 mm²이었다.

각각의 동물에 대한 종양 부피 곡선 (AUC) 아래의 평균 면적을 계산하고 1-방식 ANOVA 시험을 사용하여 군을 비교함으로써 추가의 데이터 분석을 수행하였다. 이 분석은, 처치된 군과 식염수 대조군 사이에 의미있는 차이를 나타내지 않았다 (비-방사선조사 동물에 대해 p=0.13, 및 방사선조사된 동물에 대해 p=0.14). 그러나, 만-위트니 랭크 합계 분석에 의해 부형제 처치된 군과 10 mg/kg SCV-07로 처치된 군의 직접 비교는 상당히 상이하였다 (p=0.026).

식 100 - (Vc * 100/Vt)을 사용하여 종양 성장 억제(TGI)를 계산하였다 (여기에서 Vc는 대조군에서 종양의 평균 부피이고 Vt는 시험 군에서 종양의 평균 부피이다). 표 2.2는 100 ㎍/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg SCV-07 단독으로 또는 방사선과 조합하여 처치된 동물에 대해 종양 성장 억제를 나타낸다. 비-방사선조사 대조군과 비교할 때, 1 mg/kg SCV-07 단독으로 처치된 동물은 9.1％의 종양 성장 억제를 갖고 10 mg/kg SCV-07 단독으로 처치된 동물은 35.9％의 종양 성장 억제를 가졌다. 방사선 단독으로 처치된 동물은 비-방사선조사된 대조군과 비교할 때 63.5％의 TGI를 갖는 반면, SCV-07 + 방사선조사로 처치된 동물은 70.2％ (100 ㎍/kg), 50.3％ (1 mg/kg) 및 78.3％ (10 mg/kg)의 TGI 값을 가졌다. 방사선 + 부형제를 받은 군과 비교할 때, 방사선 + SCV-07로 처치된 군은 100 ㎍/kg에서 18.3％ 및 10 mg/kg에서 40.5％의 TGI를 가졌다.

<표 2.2>

종양 성장 억제(TGI). 식 100 -(Vc*100/Vt)를 사용하여 마지막 종양 측정으로부터 TGI를 계산하였으며, 식에서 Vc는 대조군에서 종양의 평균 부피이고, Vt는 시험 군에서 종양의 평균 부피이다. **2 군 및 7 군에서 평균 종양 부피는 부형제 대조 동물을 초과하였다 (각각 9.8％ 및 15.87％).

결론

SCV-07은 생존 및 체중 변화의 관찰을 기초로 하는 이 연구에서 독성의 증거를 나타내지 않았다.

10 mg/kg SCV-07 단독으로 처치된 동물은 부형제 대조 동물 (P=0.026)에 비하여 종양 성장 억제(TGI=68％)에서 상당한 감소를 나타내었다.

통계적으로 의미있지는 않지만, 100 ㎍/kg SCV-07 단독으로 또는 1 mg/kg SCV-07 단독으로 처치된 동물은 부형제 만을 받은 동물에 비하여 종양 성장에서의 감소를 나타내었다.

통계적으로 의미있지는 않지만, 100 ㎍/kg 또는 10 mg/kg으로 SCV-07로 처치된 방사선조사된 동물은 방사선조사된 부형제 대조 동물에 비하여 종양 성장에서의 감소를 나타내었다.

실시예 3

피하 LLC 종양을 가진 마우스에서 SCV-07 및 시스플라틴의 조합된 처치의 항-종양 효능 연구

약어

BW 체중

CO₂ 이산화탄소

CDDP 시스-디아민 디클로로플라티눔 (시스플라틴)

g 그램

kg 킬로그램

L 길이

LLC 루이스 폐 암종

mg 밀리그램

mL 밀리리터

PBS 인산염 완충 염수

PI 퍼센트 억제율

SD 표준 편차

TV 종양 부피

TW 종양 중량

VBI 바이탈 브릿지 (차이나) 인코포레이티드

W 폭

요약

이 연구에서, C57/BL6 마우스에 접종된 마우스 루이스 폐 암종(LLC) 세포로부터 증식된 피하 암의 성장에 대하여 시스플라틴(CDDP)과 함께 SCV-07의 억제 효과를 평가하였다. 총 70마리 마우스를 마우스 LLC 세포로 피하 이식한 다음 연속 14일 동안 SCV-07 또는 CDDP 단독 또는 조합으로 처치하였다. SCV-07을 매일 sc 주사에 의해 투여한 반면, CDDP를 1, 6 및 12일에 ip 주사에 의해 투여하였다. 전체적으로, 7개 군을 사용하였다: 1 군: 부형제; 2 군: CDDP 2 mg/kg; 3 군: CDDP 6 mg/kg; 4 군: SCV-07 10 mg/kg; 5 군: SCV-07 20 mg/kg; 6 군: SCV-07 10 mg/kg + CDDP 2 mg/kg; 7 군: SCV-07 20 mg/kg + CDDP 2 mg/kg. 체중을 매 3일마다 한번 기록하고, 격일마다 한번 종양 크기를 측정하고, 연구 마지막에 제16일 (부검 일)에 종양 중량을 측정하였다.

연구 과정에 걸쳐서 동물이 사망하지 않았다. 체중의 통계적 결과는 SCV-07 단독 처치군 (4 군 및 5 군)과 부형제 대조군 (1 군) 사이에 의미있는 차이를 나타내지 않았으며 이는 동물 성장에서 SCV-07의 효과가 없음을 가리킨다. 반대로, 제3일 이후로부터, 6 mg/kg CDDP 처치를 받은 군 (3 군)은 통계적으로 의미있는 체중 감소를 지속적으로 나타내었다. 2 mg/kg CDDP 처치를 받은 군인 2 군은 단지 제15일에 통계적으로 의미있는 체중 감소를 나타낸 반면, 20 mg/kg SCV-07과 조합하여 2 mg/kg CDDP를 받은 7 군은 제3일 이후로부터 1 군에 비해 통계적으로 의미있는 체중 감소를 나타내었다.

종양 측정 데이터는 2 군 및 3 군의 평균 종양 부피가 제6일에 1 군의 부피보다 통계적으로 의미있게 더 적다는 것을 나타내었다. 제8일, 제10일, 제12일 및 제14일에 모든 군의 평균 종양 부피가 제1군에 비해 통계적으로 의미있게 더 적었다. 제16일에, 모든 처치군의 평균 종양 중량은 1 군에 비해 낮았다. 종양 중량을 기준으로 하여 계산된 종양 억제는, 2 군, 3 군, 4 군, 5 군, 6 군 및 7 군에 대하여 각각 58.90 ％ (p<0.01), 77.35％ (p<0.01), 16.84％ (p<0.05), 37.45％ (p<0.01), 40.81％ (p<0.01) 및 56.13％ (p<0.01)이었다.

요약하면, 포지티브 대조 약물 CDDP가 종양 성장을 효율적으로 감소시키기 때문에 이 연구에서 사용된 종양 모델은 유효하였다. SCV-07 (10 mg/kg 또는 20 mg/kg)으로의 처치는, 부형제 대조군에 비하여 이러한 군에서 더 작은 종양 부피 및 더 낮은 종양 중량에 의해 반영되는 바와 같이, 종양 성장을 억제시켰다. CDDP (2 mg/kg)와 조합하여 SCV-07 (10 또는 20 mg/kg)의 치료 요법은 SCV-07 치료 단독에 비하여 더욱 높은 종양 성장 억제를 유도하지만, CDDP 단독에 비하여 항-종양 효능은 증가하지 않았다 (추가 효과 없음).

도입

이 연구는, 폐암의 치료를 위한 치료 잠재력을 조사하기 위하여, 마우스 루이스 폐암(LLC) 모델에서 단독으로 또는 CDDP와 조합하여 사용된 SCV-07의 항-종양 효과를 평가하기 위해 설계되었다. 또한, CDDP는 암 모델을 입증하기 위한 포지티브 대조 약물로서 사용되었다.

재료 및 방법

시험 및 대조 물품

네가티브 대조 물품(부형제)로서 PBS를 사용하고 포지티브 대조로서 CDDP를 사용하였다. CDDP는 PUMC 병원으로부터 구입되었다. 퀼루 파마슈티칼 컴퍼니 리미티드에 의해 제조되는 각각의 약물 바이알은 10 mg CDDP 분말을 함유한다. 사용 이전에 PBS를 CDDP의 하나의 바이알에 첨가하여 투여 제제 표 (표 3.1)에 나타낸 바와 같이 적절한 투여량 수준을 달성하였다. 제제를 빙냉시키고 빛으로부터 보호하고 즉시 사용하였다. 시험 물품 (SCV-07)을 PBS에 용해시켜 표 1에 나타낸 바와 같이 적절한 투여량 수준을 달성하고; 빙냉시키고 빛으로부터 보호하고 1주일 이내에 사용하였다.

<표 3.1>

시험 시스템 및 동물 낙농

뮤린 폐암 세포(LLC)

중국 의료과학 아카데미(CAMS: 중국 베이징)의 세포 배양 센터로부터 뮤린 루이스 폐암 세포를 수득하였다. 실험에서 사용하기 전에 암 세포를 C57BL/6 마우스에 순응시켰다. 세포 순응에 관한 세부사항에 대하여 항목 4.3.1을 참조한다.

시험 시스템

동물 낙농

실험 절차

종양 세포 순응

액체 질소 저장으로부터 LLC 세포의 1개 바이알을 꺼내고 37 ℃ 수 욕조에 넣었다. 바이알의 내용물이 해동될 때까지 서서히 와류를 일으켰다. 무균 조직 배양 기술을 사용하여, TD5A-WS 원심분리로 1000 rpm, 20-25 ℃에서 5분 동안 세포를 즉시 원심분리하였다. 원심분리 후에 세포를 0.1 내지 0.5 mL 생리식염수(NS)에 현탁시키고, 10마리 마우스에 피하 주사하였다 (0.1 ml/마우스, 대략 1× 10⁶ 세포). 1 또는 2주 후에, 종양 직경이 대략 1 cm에 이르를 때, 동물을 CO₂ 질식으로 안락사시키고, 종양을 절제하였다. 다른 20마리 마우스로 절차를 반복하여 적절한 이식가능성을 가진 LLC 세포의 충분한 수를 생성하였다.

종양 세포 접종

종양 이식 일에 대략 0.1 mL 부피 중의 1.2 × 10⁶ 세포를 각각의 마우스의 오른쪽 겨드랑이 부위에 피하 주사하였다. 종양 이식 일을 제0일로 정의하였다.

연구 설계 및 치료 요법

제1일에, 동물들을 상이한 중량-조화 군으로 무작위로 지정하고, 표 3.2에 따른 요법을 사용하여 투여를 시작하였다. 간략하게, SCV-07을 종양 세포 이식과 상이한 부위에서 연속 14일 동안 피하 주사를 통해 하루 한번 투여한 반면, CDDP를 제1일, 제6일 및 제12일에 복강내 투여하였다.

항-종양 효과의 평가

제1일 내지 제14일에, 사망율 및 이환율을 하루 2회 점검하고, 체중을 매 3일마다 한번 기록하고, 매 2일마다 한번 캘리퍼스를 사용하여 종양을 측정하였다. 연구 마지막 (제16일)에, CO₂ 질식에 의해 동물을 안락사시키고 종양을 절제하고 무게를 재었다.

하기 식을 사용하여 종양 부피를 계산하였다.

종양 부피 = 길이 × 폭 × 폭/2

하기 식에 따라서 종양 부피 억제율(PI)을 계산하였다:

PI (TV) = (TV_부형제 - TV_{처치된 약물})/TV_부형제 × 100％

여기에서, TV는 측정일에서의 종양 부피이고, "부형제"는 PBS를 받는 군을 나타내고, "처치된 약물"은 SCV-07 및/또는 CDDP를 받는 군을 나타낸다.

단독으로 또는 CDDP와 조합하여 사용된 SCV-07의 항-종양 효과는 종양 중량에 의해 평가하였다. 각각의 마우스의 종양 중량을 안락사 후에 기록하고, 하기 식에 따라서 종양 중량의 억제율을 계산하였다.

PI (TW) = (TW_부형제 - TW_{처치된 약물})/TW_부형제 × 100％

엑셀을 사용하여 평균 및 표준 편차를 계산하였다.

<표 3.2>

통계적 분석

결과 및 논의

사망율

연구 과정에 걸쳐서 동물이 사망하지 않았다.

종양 크기

종양 크기의 원 측정 데이터를 부록 3.1-3.14에 표로 나타내었다. 계산된 평균 종양 부피 및 각각의 처치군 대 부형제 군의 통계적 비교를 표 3 내지 9에 기재하였다. 제2일에 어느 군에서도 종양을 측정할 수 없었다. 제4일에, 4 군 이외의 모든 군에서 평균 종양 부피는 1 군 (부형제 대조)의 부피보다 통계적으로 의미있게 작았다. 제6일에, 2 군 및 3 군 만이 더욱 작은 평균 종양 부피를 나타내었다. 제8일, 제10일, 제12일 및 제14일에 모든 군의 평균 종양 부피는 1 군보다 통계적으로 의미있게 작았다.

종양 중량

제16일에 측정된 종양 중량의 원 데이터를 부록 3.15에 표로 나타내었다. 종량 중량을 기준으로 하여 계산된 평균 억제(PI) 값 및 각각의 처치군 대 부형제 군의 통계적 비교 결과를 표 3.10에 기재하였다. 표 3.10에 나타낸 바와 같이 모든 처치군의 평균 종양 중량은 부형제 군의 중량보다 낮았다. 2 군, 3 군, 4 군, 5 군, 6 군 및 7 군에서의 PI 값은 각각 58.90％ (p<0.01), 77.35％ (p<0.01), 16.84％ (p=0.05), 37.45％ (p<0.01), 40.81％ (p<0.01) 및 56.13％ (p<0.01)이었다. 조합 처치군 (즉, 6 군 및 7 군)이 SCV-07 단독 처치를 받은 상응하는 군 (즉, 4 군 및 5 군)에 비해 더 높은 PI 값을 갖긴 하지만, 이러한 PI 값은 CDDP 단독 처치를 받은 2 군에 비해 높지 않았다. 조합 처치군과 CDDP 단독 처치군 (2 군) 사이에 PI의 통계적으로 의미있는 차이가 존재하지 않았으며, 이는 SCV-07과 조합하여 CDDP를 사용할 때 추가 효과가 없음을 나타낸다.

체중

체중 측정의 원 데이터를 부록 3.16-3.21에 기재하였다. 각각의 처치군 대 부형제 군의 통계적 비교 결과를 표 3.11-3.16에 기재하였다.

표 3.11-3.16에 나타낸 바와 같이, 제0일에 각각의 처치군 대 부형제 대조군 간에 의미있는 차이가 존재하지 않았다. 제3일에, 3 군 (CDDP 6 mg/kg) 및 7 군 (CDDP 2 mg/kg + SCV-07 20 mg/kg)은 각각 부형제 군에 비해 9.33％ (P<0.01) 및8.31％ (P<0.01)의 체중 감소를 나타내었다. 부형제 군에 비하여 다른 군에서 체중의 의미있는 차이가 존재하지 않았다. 제6일에, 3 군 및 7 군의 체중은 부형제 군보다 10.45％ (p<0.01) 및 6.58％ (p<0.01) 더 낮았다. 제9일에, 3 군, 6 군 및 7 군의 체중은 부형제 군보다 각각 14.51％ (p<0.01), 8.70％ (p<0.05) 및 11.41％ (p<0.01) 더 낮았다. 제12일에, 3 군 및 7 군의 체중은 부형제 군에 비해 각각 13.62％ (P<0.01) 및 6.65％ (P<0.05) 더 낮았다. 제15일에, 2 군, 3 군, 6 군 및 7 군의 체중은 각각 부형제 군보다 12.51％ (p<0.01), 24.38％ (p<0.01), 10.42％ (p<0.05) 및 14.56％ (p<0.01) 더 낮았다. 연구 과정에 걸쳐서, SCV-07 단독 처치를 받은 4 군 및 5 군의 체중의 통계적으로 의미있는 차이가 존재하지 않았으며, 이것은 SCV-07은 단독으로 사용될 때 동물 체중에 대해 의미있는 효과를 갖지 않음을 나타낸다. 반대로, CDDP 처치는 체중 감소와 연관되었으며, 이 관찰은 높은 투여량 (6 mg/kg)의 CDDP를 받은 군인 3 군에서 특히 현저하였다. SCV-07과 CDDP의 조합 사용은 체중 감소를 경감시키지 않았으나, 사실상 CDDP-관련 체중 감소를 더욱 현저하게 만들 수도 있다. CDDP 단독을 받은 2 군에 비하여, 높은 투여량의 SCV-07과 조합하여 CDDP를 받은 군인 7 군에서 더욱 높은 체중 감소가 나타났다.

결론 및 논의

결론적으로, 종양 성장이 포지티브 대조 약물 CDDP에 의해 억제되기 때문에 이 연구에서 사용된 종양 모델은 유효하였다. 10 mg/kg 및 20 mg/kg으로 시험 물품 SCV-07을 매일 투여하는 것은 종양 성장에 대해 효과적이었다. 모든 SCV-07-처치된 동물 군에서 평균 종양 부피는 제8일 이후로부터 부형제 대조군에서의 종양 부피와 비교할 때 상당히 감소되었다. 제16일에 측정된 종양 중량은 10 mg/kg 또는 20 mg/kg SCV-07 단독을 받은 군 및 조합 요법을 받은 군에서 상당히 감소되었다. 2 mg/kg CDDP와 함께 10 mg/kg 또는 20 mg/kg SCV-07의 조합 사용은, 10 mg/kg 또는 20 mg/kg SCV-07 단독을 사용할 때 수득되는 16.84％ 및 37.45％ 억제, 및 2 mg/kg 또는 6 mg/kg CDDP 단독을 사용할 때 수득되는 58.90％ 및 77.35％ 억제에 비하여 40.81％ 및 56.13％ 종양 성장 억제를 일으켰다. 이러한 결과는, SCV-07과 CDDP의 조합 사용이 종양 성장 억제에 대해 추가의 효과를 일으키지 않는다는 것을 제시하였다.

CDDP 처치군에서 평균 체중은 상당히 감소되고, 이것은 독성 효과를 나타낸다. 그러나, 단독으로 사용될 때 SCV-07은 모든 SCV-07-처치군에서 체중의 통계적으로 의미있는 감소를 일으키지 않았으며, 이것은 SCV-07이 동물 체중에 효과를 갖지 않음을 나타낸다. 그러나, SCV-07이 CDDP와 조합하여 사용될 때, 연구 과정에 걸쳐서 높은 투여량의 SCV-07과 조합하여 CDDP를 받은 군인 7 군에서 더욱 높은 체중 감소가 주목되었기 때문에, 이것은 CDDP-관련 체중 감소를 악화시킬 수도 있다.

<표 3.3>

<표 3.4>

<표 3.5>

<표 3.6>

<표 3.7>

<표 3.8>

<표 3.9>

<표 3.10>

<표 3.11>

<표 3.12>

<표 3.13>

<표 3.14>

<표 3.15>

<표 3.16>

실시예 4

B16, LLC 및 RenCa 세포주의 증식에 관한 SCV-07의 시험관내 효과

약어

5-Fu 5-플루오로우라실

CV 변동 계수

DMEM 둘베코의 변형 이글 배지

DMF N,N-디메틸 포름아미드

DTIC 5-(3,3-디메틸-1-트리아제닐)이미다졸-4-카르복사미드

FBS 태아 소 혈청

LLC 루이스 폐 암종

MTT 메틸티아졸릴디페닐-테트라졸륨 브로마이드

NA 적용불가능

OD 광학 밀도

PBS 인산염 완충 염수

RPMI 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트

SD 표준 편차

SDS 소듐 도데실 설페이트

SOP 표준 작동 절차

VBI 바이탈 브릿지(차이나), 인코포레이티드

Vs 대(versus)

요약

B16, LLC 및 RenCa 세포에 대한 SCV-07의 시험관내 세포독성 효과를 평가하기 위하여 연구를 수행하였다.

블랭크 대조를 포함한 12개 상이한 농도에서 SCV-07 또는 포지티브 대조 약물 (즉, DTIC, 5-Fu 및 시스플라틴)의 존재 하에서 96-웰 플레이트에서 B16, LLC 또는 RenCa 세포를 배양하였다. 이전의 생체내 연구의 유효 투여량으로부터 어림잡은 혈장 농도를 기초로 하여 SCV-07의 농도를 선택하였다. 문헌에 보고된 각각의 IC₅₀ 값에 따라서 5-Fu 및 시스플라틴의 농도를 선택하였다. SCV-07 및 포지티브 대조 약물의 배양 시간은 24 내지 72시간으로 다양하였다. 세포 증식에 대한 약물의 억제 효과를 MTT 방법에 의해 결정하였다.

5-Fu 및 시스플라틴의 처치에 의하여 상응하는 세포 주에서 의미있는 세포독성 효과가 얻어졌다. B16 세포 증식을 억제하기 위한 5-Fu의 IC₅₀ 값은 3개 분석에서 0.26, 0.38 및 0.26 ㎍/mL로 추정되었다. RenCa 세포에서, 5-Fu의 IC₅₀ 값은 3개 분석에서 0.03, 0.04 및 0.04 ㎍/mL로 추정되었다. LLC 세포 증식을 억제하기 위하여 시스플라틴의 IC₅₀ 값은 3개 분석에서 3.26, 3.07 및 3.10 ㎍/ml로 추정되었다. 모든 시험 농도 (0.05 내지 100 ㎍/mL)에서 SCV-07은 배양된 B16, LLC 및 RenCa 세포에서 세포 증식을 억제하지 않았다. SCV-07의 IC₅₀ 값은 그의 농도-억제 곡선의 적합성 결여로 인하여 수득되지 않았다.

결론적으로, 이 연구는 SCV-07이 배양된 B16, LLC 및 RenCa 종양 세포에서 시험관내 세포독성 효과를 갖지 않음을 증명하였다.

도입

이 연구의 목적은 B16, LLC 및 RenCa 세포에 대한 SCV-07의 시험관내 세포독성 효과를 평가하는 것이다.

SCV-07은 면역조절제이다. 이전의 생체내 연구에서, 마우스에 피하 이식된 종양 세포 (B16, LLC 또는 RenCa)의 성장을 억제하는 것이 증명되었다 ^(1-3). 이 연구에서, 이러한 종양 세포주에 미치는 SCV-07의 시험관내 세포독성 효과를 평가하였다.

SCV-07 또는 포지티브 대조 약물 (DTIC, 5-Fu 또는 시스플라틴)의 존재 하에서 96-웰 플레이트에서 B16, LLC 및 RenCa 세포를 배양하였다. 상이한 세포주에서 약물의 배양 시간은 24 내지 72시간으로 다양하였다. 세포 증식의 억제를 평가하기 위하여 MTT 분석을 사용하였다.

재료 및 방법

재료

SCV-07

SCV-07 (로트 # RR002101)이 스폰서에 의해 공급되었다. 8.4 ml의 무균 둘베코 PBS (인비트로겐, 목록번호 14190-144)에 4.2 mg SCV-07을 용해시킴으로써 0.5 mg/mL 농도의 SCV-07 원액을 제조하였다. 이어서 원액을 무균 여과하고, 2-8 ℃에서 저장하고 호일로 빛으로부터 보호하였다. 사용 전에, 배양 배지로 원액을 다양한 농도로 더욱 희석하였다.

DTIC

시그마로부터 DTIC를 구입하였다 (목록번호 # D2390, 로트번호 # 026K1363). 500 ㎕의 0.1N HCl에 8.8 mg의 DTIC를 용해시킨 다음 380 ㎕의 밀리-Q 물을 첨가함으로써 10 mg/mL의 원액을 제조하였다. 일단 제조되면, 원액을 무균 여과하고 2-8 ℃에서 저장하고 호일로 빛으로부터 보호하였다. 사용 전에, 배양 배지로 원액을 다양한 농도로 더욱 희석하였다.

5-FU

시그마로부터 5-Fu를 구입하였다 (목록번호 # F6627, 로트번호 # 125K1499). 9.6 mL의 무균 둘베코 PBS (인비트로겐, 목록번호 #14190-144)에 4.8 mg의 5-Fu를 용해시킴으로써 0.5 mg/mL의 원액을 제조하였다. 일단 제조되면, 원액을 무균 여과하고 2-8 ℃에서 저장하고 호일로 빛으로부터 보호하였다. 사용 전에, 배양 배지로 원액을 다양한 농도로 더욱 희석하였다.

시스플라틴

퀼루 파마슈티칼 컴퍼니 리미티드 (Qilu Pharmaceutical Co.Ltd.)로부터 시스플라틴을 구입하였다. 10 mL의 무균 둘베코 PBS (인비트로겐, 목록번호 #14190-144)에 10 mg의 시스플라틴을 용해시킴으로써 1 mg/mL의 원액을 제조하였다. 일단 제조되면, 원액을 무균 여과하고 2-8 ℃에서 저장하였다. 사용 전에, 배양 배지로 원액을 다양한 농도로 더욱 희석하였다.

기타 재료

시그마로부터 MTT를 구입하였다 (목록번호 # M2128). 인비트로겐으로부터 FBS, 페니실린-스트렙토마이신, DMEM 및 RPMI-1640 배지를 구입하였다. 피셔 사이언티픽으로부터 팔콘® 96-웰 편평바닥 플레이트 (BD, 목록번호 #353072)를 구입하였다.

시험 시스템

B16 세포 배양액

상하이 세포 은행, 차이니즈 아카데미 오브 사이언스로부터 B16 흑색종 세포주를 얻었다. 10％ FBS, 100 단위/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI-1640 배지에서 세포를 배양하였다.

LLC 세포 배양액

상하이 세포 은행, 차이니즈 아카데미 오브 사이언스로부터 LLC 세포주를 얻었다. 10％ FBS, 100 단위/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM에서 세포를 배양하였다.

RenCa 세포 배양액

차이니즈 밀리터리 아카데미 오브 사이언스로부터 RenCa 세포주를 얻었다. 10％ FBS, 100 단위/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI-1640 배지에서 세포를 배양하였다.

MTT 분석

VBI SOP 65.026에 따라서 MTT 분석을 수행하였다. 간략하게, 상기 기재된 상응하는 배양 배지와 함께 B16, LLC 또는 RenCa 세포의 현탁액을 제조하였다. 100 ㎕의 세포 현탁액을 팔콘® 96-웰 편평바닥 플레이트의 각각의 웰에 접종하였다. 접종 밀도는 웰 당 10000개 세포 (B16 및 LLC 세포 주) 또는 웰 당 7000개 세포 (RenCa 세포 주)였다. 플레이트에 25 ㎕의 약물을 첨가한 다음, 플레이트를 미리 한정된 시간 동안 5％ CO₂와 함께 37 ℃에서 배양함으로써 약물 처치를 수행하였다 (약물 처치에 관한 세부사항에 관해 표 4.1 참조). 약물을 블랭크 대조를 포함한 12개 농도로 처치하였으며, 각각의 농도를 4회씩 시험하였다. 이전의 생체내 연구의 효능있는 투여량으로부터 어림잡은 혈장 농도를 기초로 하여 SCV-07의 농도를 선택하였다. 상응하는 세포 주에 대해 문헌에 기록된 각각의 IC₅₀ 값에 따라 5-Fu 및 시스플라틴의 농도를 선택하였다. 약물 치료 후에 MTT를 1 mg/ml의 최종 농도로 각각의 웰에 첨가하였으며, 세포 배양을 4시간동안 계속하였다. MTT 배양의 마지막에, SDS 및 DMF로 구성된 추출 완충액을 플레이트에 첨가하여, 생균에 의해 MTT로부터 전환된 포르마잔을 용해시켰다. 570 nm에서 테칸 인피티트 M200 플레이트 판독기로 각각의 웰의 OD를 측정하였다.

<표 4.1>

데이타 분석

평균 및 SD의 계산

평균 및 SD의 계산을 위하여 원 OD 데이터를 마이크로소프트 엑셀로 가져왔다.

IC₅₀의 계산

프리즘 5.01 (그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드)로 세포 증식을 억제하기 위한 IC₅₀을 계산하였다. 세포 사멸을 가져오는 약물의 농도를 IC₅₀의 결정으로부터 배제하였다. 하기 식을 사용하여 IC₅₀을 추정하였다:

상기 식에서,

X는 약물의 농도를 나타내고, Y는 상응하는 OD를 나타낸다. 최저는 이론적으로 가장 낮은 OD를 나타내는 반면 (세포 성장의 최대 억제에 상응함), 최고는 이론적으로 가장 높은 OD를 나타낸다. IC₅₀는 50％ 반응을 일으키는 약물의 농도를 나타낸다. 모든 X 및 Y 값을 넣을 때, 내장된 억제 모델에 조화시키는 프로그램을 통하여 최저, 최고 및 IC₅₀의 값들이 자동적으로 결정되었다 (즉, 로그[억제제] 대 반응 모델).

결과

B16 세포에 대한 SCV-07의 효과

B16 세포 증식에 대한 SCV-07 및 포지티브 대조 약물의 효과를 측정하였다. 계산된 IC₅₀ 값을 표 4.2에 기재한다. 원 데이터 및 계산된 평균 및 SD를 부록 4.1-4.4에 표로 나타낸다. SCV-07의 농도-억제 곡선은 필수적으로 편평하고, 이것은 B16 세포에 대한 SCV-07의 세포독성 효과 (즉, 세포 증식의 억제)의 부재를 나타낸다. DTIC는 포지티브 대조로서 처음에 사용되었다. 그러나, 세포독성 효과가 높은 농도 (즉, 250 및 500 ㎍/ml)에서만 나타났고 IC₅₀은 곡선 수렴의 실패로 인하여 확립되지 못하였다. 이것은 아마도 DTIC의 간세포-의존적 활성화의 부족에 기인한 것으로 생각된다. 0.2 내지 20 ㎍/mL의 농도 범위에서 5-Fu에 대해 세포 성장의 억제가 관찰되었다. 세포 사멸은 50 및 100 ㎍/mL에서 유도되었다. 이에 의해 IC₅₀ 분석으로부터 2개 농도가 배제되었다. IC₅₀ 값은 3개 분석에서 5-Fu에 대해 0.26, 0.38 및 0.26 ㎍/mL인 것으로 결정되었다. 반대로, IC₅₀ 값은 그의 농도-억제 곡선의 적합성 결여로 인하여 SCV-07에 대해 수득되지 않았다.

<표 4.2>

LLC 세포에 대한 SCV-07의 효과

LLC 세포 증식에 대한 SCV-07 및 시스플라틴 (포지티브 대조 약물)의 효과를 측정하였다. IC₅₀의 계산된 값을 표 4.3에 기재한다. 원 데이터 및 계산된 평균 및 SD를 부록 4.5-4.7에 표로 나타낸다. SCV-07의 농도-억제 곡선은 필수적으로 편평하고 이것은 LLC 세포에서 세포독성의 부재를 나타낸다. 반대로, 1.0 ㎍/ml 이상의 농도에서 시스플라틴에 대해 세포독성 효과가 관찰되었다. 시스플라틴에 대한 IC₅₀ 값은 3개 분석에서 3.26, 3.07 및 3.10 ㎍/mL인 반면, 그의 농도-억제 곡선의 적합성 결여로 인하여 SCV-07에 대해 IC₅₀ 값은 확립될 수 없었다.

<표 4.3>

RenCa 세포에 대한 SCV-07의 효과

RenCa 세포 증식에 대한 SCV-07 및 5-Fu (포지티브 대조 약물)의 효과를 측정하였다. 계산된 IC₅₀ 값을 표 4.4에 기재한다. 원 데이터 및 계산된 평균 및 SD를 부록 4.8-4.10에 표로 나타낸다. SCV-07의 농도-억제 곡선은 필수적으로 편평하고 이것은 RenCa 세포에서 세포독성의 부재를 나타낸다. 반대로, 0.05 내지 10 ㎍/ml의 농도 범위에서 5-Fu에 대해 세포독성이 관찰되었다. 20, 50 및 100 ㎍/mL에서 세포 사멸이 유도되었다. 이에 의해 IC₅₀ 분석으로부터 3개 농도를 배제하였다. 5-Fu에 대한 IC₅₀ 값은 3개 분석에서 0.03, 0.04 및 0.04 ㎍/mL이었다. 반대로, 그의 농도-억제 곡선의 적합성 결여에 기인하여 SCV-07에 대해 IC₅₀ 값이 수득되지 않았다.

<표 4.4>

결론 및 논의

5-Fu 및 시스플라틴의 처치에 의해 상응하는 세포 주에서 세포 증식의 의미있는 억제가 얻어졌으며, 이는 시험 화합물의 잠재적인 세포독성을 결정하는데 있어서 이 분석을 사용할 수 있음을 확인한다. B16 세포 증식을 억제하기 위한 5-Fu의 IC₅₀ 값은 3개 분석에서 0.26, 0.38 및 0.26 ㎍/mL인 것으로 추정되었다. RenCa 세포에서, 5-Fu의 IC₅₀ 값은 3개 분석에서 0.03, 0.04 및 0.04 ㎍/mL인 것으로 추정되었다. LLC 세포 증식을 억제하기 위한 시스플라틴의 IC₅₀ 값은 3개 분석에서 3.26, 3.07 및 3.10 ㎍/mL인 것으로 추정되었다. 더욱 높은 농도 (즉, 250 및 500 ㎍/mL)에서 DTIC에 대해 세포독성이 주목되었다. DTIC의 낮은 농도에서 인지가능한 세포독성의 부족은 간세포에 의해 DTIC가 더욱 독성의 대사물로 대사 전환되는 요건과 일치하고, 이것은 분석에 포함되지 않았다.

포지티브 대조 약물에 의한 의미있는 세포독성과는 반대로, SCV-07은 배양된 B16, LLC 또는 RenCa 세포에서 세포 증식을 억제하지 않았다. 농도-억제 곡선의 적합성 결여에 기인하여 SCV-07의 IC₅₀ 값이 수득되지 않았다.

SCV-07의 세포독성 효과의 부재는 면역 체계의 활성화를 통해 그의 효과를 발휘하는 전형적인 면역조절제의 작용 메카니즘과 일치한다. 그러나, SCV-07로부터 유래된 대사물의 세포독성 효과가 결정되어야 한다는 것을 주목해야 한다. DTIC와 유사하게, SCV-07의 간세포-매개 대사 활성화는 세포독성 효과를 위해 필수적일 수도 있다. SCV-07 대사물(들) 또는 간세포 및 종양 세포로 구성된 세포 배양 시스템으로의 연구는, 종양 요법을 위한 SCV-07의 작용 메카니즘에서 세포독성의 역할을 더욱 정의하는데 도움이 될 수도 있다.

결론적으로, 이 연구는 현재의 실험 조건 하에서 SCV-07이 배양된 B16, LLC 및 RenCa 종양 세포에 대해 시험관내 세포독성 효과를 갖지 않음을 증명하였다.

Claims

대상체에서 폐암, 그의 전이 또는 폐 외부의 암으로부터 폐로의 전이를 치료, 적어도 부분적으로 예방, 억제 또는 감소시키거나, 또는 대상체에서 폐암 세포의 성장, 그의 전이 또는 폐 외부의 암 세포로부터 폐로의 암 세포 전이를 치료, 적어도 부분적으로 예방, 억제 또는 감소시키기 위해 유효량의 화학식 A의 면역조절제 화합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 폐암, 그의 전이 또는 폐 외부의 암으로부터 폐로의 전이를 치료, 적어도 부분적으로 예방, 억제 또는 감소시키거나, 또는 폐암 세포의 성장, 그의 전이 또는 폐 외부의 암 세포로부터 폐로의 암 세포 전이를 치료, 적어도 부분적으로 예방, 억제 또는 감소시키기 위한 처치 방법.
<화학식 A>

상기 식에서,
n은 1 또는 2이고, R은 수소, 아실, 알킬 또는 펩티드 단편이고, X는 방향족 또는 헤테로시클릭 아미노산 또는 그의 유도체이다.
제1항에 있어서, X가 L-트립토판 또는 D-트립토판인 방법.
제1항에 있어서, 상기 화합물이 SCV-07인 방법.
제1항에 있어서, 상기 화합물을 약 0.001-1000 mg 범위의 투여량으로 투여하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 화합물을 약 0.01-100 mg 범위의 투여량으로 투여하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 화합물을 대상체 체중 1 kg 당 약 0.00001-1000 mg 범위의 투여량으로 투여하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 화합물을 대상체 체중 1 kg 당 약 0.01-100 mg 범위의 투여량으로 투여하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 화합물이 SCV-07이고, 이를 약 0.001-1000 mg 범위의 투여량으로 투여하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 화합물이 SCV-07이고, 이를 대상체 체중 1 kg 당 약 0.00001-1000 mg 범위의 투여량으로 투여하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 처치가 원발성 폐암에 관한 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 화합물을 약 0.001-1000 mg 범위의 투여량으로 투여하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 화합물을 약 0.1-100 mg 범위의 투여량으로 투여하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 화합물을 대상체 체중 1 kg 당 약 0.00001-1000 mg 범위의 투여량으로 투여하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 화합물을 대상체 체중 1 kg 당 약 0.01-100 mg 범위의 투여량으로 투여하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 처치가 폐암 전이에 관한 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 화합물을 약 0.001-1000 mg 범위의 투여량으로 투여하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 화합물을 약 0.1-100 mg 범위의 투여량으로 투여하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 화합물을 대상체 체중 1 kg 당 약 0.00001-1000 mg 범위의 투여량으로 투여하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 화합물을 대상체 체중 1 kg 당 약 0.01-100 mg 범위의 투여량으로 투여하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 투여량이 약 10 mg인 방법.
제17항에 있어서, 상기 투여량이 약 10 mg인 방법.
제1항에 있어서, 화학식 A의 상기 화합물을 방사선 또는 화학요법제 중 하나 이상의 투여를 추가로 포함하는 처치 요법으로 투여하는 방법.
제22항에 있어서, 상기 화학요법제가 시스플라틴, 5-Fu 또는 DTIC 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.