ES2334883T3 - Tira para prueba electroquimica para usar en la determinacion de analitos. - Google Patents
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Abstract
Una tira para prueba electroquímica (10), que comprende: (a) una zona de reacción definida por electrodos en oposición en funcionamiento (12) y de referencia (14) separados por una capa espaciadora (16); y (b) un sistema de reactivo redox presente en dicha zona de reacción, en la que: dicho sistema de reactivo redox comprende al menos una enzima y un mediador; dicho electrodo de referencia (14) tiene una superficie con la cara hacia la zona de reacción del metal; dicha superficie metálica de dicho electrodo de referencia (14) está modificado con una capa de modificación de superficie homogénea formada por moléculas de auto-ensamblaje que tienen la fórmula HS-(CH2)n-SO3Y; n es un número entero de 1 a 6; Y es H o un catión; y todas las moléculas de auto-ensamblaje mencionadas son idénticas.
Description
Tira para prueba electroquímica para usar en la
determinación de analitos.
El campo de la presente invención es la
determinación de analitos, particularmente la determinación
electroquímica de analitos y, más particularmente, la determinación
electroquímica de analitos en sangre.
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La detección de analitos en fluidos
fisiológicos, por ejemplo sangre o productos derivados de la sangre,
es de una importancia cada vez mayor en la sociedad de hoy. Los
ensayos de detección de analitos son útiles en diversas
aplicaciones, incluidos los análisis clínicos, las pruebas
domiciliarias etc., en las que los resultados de dichas pruebas
desempeñan un papel fundamental en el diagnóstico y tratamiento de
diversos estados patológicos. Entre los analitos de interés se
incluyen la glucosa para el control de la diabetes, el colesterol y
similares. En respuesta a esta creciente importancia de la
detección de analitos se han desarrollado diversos protocolos y
dispositivos de detección de analitos tanto para el uso clínico como
el domiciliario.
Un tipo de procedimiento que se emplea para la
detección de analitos es un procedimiento electroquímico. En dichos
procedimientos, se coloca una muestra de líquido acuoso en una zona
de reacción en una celda electroquímica que comprende dos
electrodos, es decir un electrodo de referencia y un electrodo
activo, en la que los electrodos presentan una impedancia que los
convierte en adecuados para la medición amperiométrica. El
componente que se ha de analizar se deja reaccionar directamente
con un electrodo, o directa o indirectamente con un reactivo redox
para formar una sustancia oxidable (o reducible) en una cantidad
correspondiente a la concentración del componente a analizar, es
decir el analito. A continuación, la cantidad de la sustancia
oxidable (o reducible) presente se estima electroquímicamente y se
relaciona con la cantidad de analito presente en la muestra
inicial.
En los detectores electroquímicos de analitos
usados para la práctica de los procedimientos descritos en lo que
antecede, a menudo es deseable modificar la superficie de los
electrodos metálicos para que sean hidrófilos. Se han desarrollado
diversas técnicas para modificar las superficies de los electrodos
metálicos. No obstante, dichos electrodos modificados tienden a
tener una vida de almacenamiento limitada, lo que limita sus
posibles aplicaciones.
Como tal, existe un continuado interés en la
identificación de nuevos procedimientos para modificar las
superficies de los electrodos metálicos para usar en la detección
electroquímica de analitos. De particular interés sería el
desarrollo de un procedimiento que tenga como resultado una
superficie hidrófila estable al almacenamiento que proporcione un
tiempo de absorción rápido y que no interfiera en las mediciones
electroquímicas del electrodo.
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Entre los documentos de patentes de EE.UU. de
interés se incluyen: Las patentes de EE.UU. nº 5.9425102 y
5.9725199. La patente de EE.UU. nº 5.834.224 desvela un sensor
electroquímico que contiene un material de soporte que tiene una
superficie de metal noble al que está unido una enzima, tal como la
glucosa oxidasa, a través de moléculas de unión. Las moléculas de
unión están unidas a la superficie metálica mediante grupos de
anclaje, tales como grupos tiol, disulfuro o fosfina. Otros
documentos de patentes de interés se incluyen: los documentos WO
97/18465 y GB 2304628. El documento WO 99/49307 desvela un electrodo
metálico estabilizado mediante un revestimiento, en el que el
revestimiento comprende en su estructura molecular un residuo que
contiene azufre. El revestimiento puede también incluir un grupo
hidrófilo y un espaciador entre el residuo que contiene azufre y el
grupo hidrófilo.
Otras referencias de interés incluyen:
Dalmia y col., J. Electroanalytical Chemistry
(1997) 430: 205-214;
Nakashi-ma y col., J. Chem. Soc.
(1990) 12: 845 847; y Palacin y col., Chem.
Mater. (1996) 8:1316-1325.
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Se proporcionan tiras y procedimientos para
prueba electroquímica para su uso en la detección de un analito,
por ejemplo glucosa, en una muestra fisiológica, por ejemplo sangre.
Las tiras para la prueba objeto de la invención comprenden: (a) una
zona de reacción definida por electrodos en funcionamiento y de
referencia en posiciones opuestas separados por una capa
espaciadora; y (b) un sistema de reactivo redox presente en dicha
zona de reacción, en el que: Dicho sistema de reactivo redox
comprende al menos una enzima y un mediador; dicho electrodo de
referencia tiene una superficie de cara a la zona de reacción del
metal; dicha superficie metálica de dicho electrodo de referencia
se modifica con una capa de modificación de superficie homogénea
hecha de moléculas de auto-ensamblaje que tienen la
fórmula -(CH_{2})_{n}-SO_{3}Y; n es un
número entero de 1 a 6; Y es H o un catión; y todas estas moléculas
de auto-ensamblaje son idénticas. Las tiras para
prueba electroquímicas objeto de este documento encuentran
aplicación en la detección de una amplia variedad de analitos y son
particularmente adecuadas para usar en la detección de glucosa.
Las figuras 1 y 2 proporcionan una
representación de una tira para prueba electroquímica de acuerdo con
la invención sujeto.
La figura 3 proporciona un análisis del ángulo
de contacto de varios electrodos metálicos tratados con cistina a
varios tiempos tras el tratamiento.
La figura 4 proporciona un análisis del tiempo
de absorción de varios electrodos metálicos tratados en cistina a
varios tiempos tras el tratamiento.
Las figuras 5A y 5B proporcionan un análisis del
ángulo de contacto de varios electrodos metálicos tratados con MESA
a varios tiempos tras el tratamiento.
La figura 6 proporciona un análisis del tiempo
de absorción de varios electrodos metálicos tratados con MESA a
varios tiempos tras el tratamiento.
La figura 7 proporciona una comparación del
tiempo de absorción de varios electrodos revestidos con cistina y
MESA.
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Se proporcionan tiras para prueba electroquímica
para usar en la detección de analitos en una muestra fisiológica.
En las tiras para prueba sujeto, dos electrodos opuestos separados
por una fina capa espaciadora definen un área de reacción. Una
característica crítica de las tiras para la prueba sujeto es que al
menos uno de los electrodos tiene una superficie que está
modificada con una capa de modificación de superficie hecha de
moléculas lineales que tienen un grupo terminal sulfhidrilo y un
grupo terminal sulfonato separados por un grupo de unión de alquilo
inferior. En la zona de reacción están presentes reactivos redox que
comprenden una enzima y un mediador. También se proporcionan
procedimientos para usar las tiras para prueba sujeto en la
detección de analitos, por ejemplo la determinación de glucosa. En
una descripción más a fondo de la invención sujeto, primero se
describirá la tira para prueba electroquímica, seguida por una
revisión más profunda de los procedimientos sujeto para usar las
tiras de prueba en la detección de analitos.
Antes de describir más a fondo la invención
sujeto, debe entenderse que la invención no está limitada a las
formas de realización concretas de la invención que se describen a
continuación, dado que se pueden realizar variaciones de las formas
de realización concretas y todavía entrarán dentro del alcance de
las reivindicaciones adjuntas. También debe entenderse que la
terminología empleada es para el fin de describir formas de
realización concretas y no se pretende que sea limitante. En su
lugar, el alcance de la presente invención se establecerá en las
reivindicaciones adjuntas.
En esta especificación y las reivindicaciones
adjuntas, las referencias en singular incluyen el plural, a menos
que el contexto dicte claramente otra cosa. A menos que se defina
otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la
presente memoria descriptiva tienen el mismo significado que un
experto en la técnica a la que la presente invención pertenece
entiende habitualmente.
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Como se ha resumido en lo que antecede, las
tiras para prueba electroquímica de la invención sujeto están
hechas de dos electrodos opuestos separados por una fina capa
espaciadora, en la que estos componentes definen una zona de
reacción en la que se localiza un sistema de reactivo redox. En las
figuras 1 y 2 se proporciona una representación de una tira para
prueba electroquímica 10 que está constituida por un electrodo
activo 12 y un electrodo de referencia 14 separados por una capa
espaciadora 16 que tiene una sección en sección 18 que define la
zona o área de reacción en la tira ensamblada. La figura 2 muestra
la misma tira para prueba en forma ensamblada. A continuación, cada
uno de los elementos anteriores, es decir los electrodos de
funcionamiento y de referencia, la capa espaciadora y el área de
reacción se describen por separado con mayor detalle.
Como se ha indicado en lo que antecede, las
tiras para prueba electroquímica sujeto incluyen un electrodo de
funcionamiento y un electrodo de referencia. En general, los
electrodos de funcionamiento y de referencia están configurados en
forma de tiras rectangulares alargadas. Normalmente, la longitud de
los electrodos varía de aproximadamente 1,9 a 4,5 cm, habitualmente
de aproximadamente 2 a 2,8 cm. La anchura de los electrodos varía
de aproximadamente 0,38 a 0,76 cm, habitualmente de aproximadamente
0,51 a 0,67 cm. Normalmente, los electrodos de referencia tienen un
espesor que varía de aproximadamente 10 a 100 nm, y habitualmente de
aproximadamente 18 a 22 nm. En ciertas formas de realización, la
longitud de uno de los electrodos es más corta que la longitud del
otro electrodo, mientras que en ciertas formas de realización es de
aproximadamente 0,32 cm.
Los electrodos de funcionamiento y de referencia
se caracterizan además porque al menos la superficie del electrodo
de referencia enfrentada con el área de reacción de la tira es un
metal, en el que los metales de interés incluyen paladio, oro,
platino, plata, iridio, acero inoxidable y similares. En muchas
formas de realización, el metal es oro o paladio. Aunque en
principio todo el electrodo puede estar hecho del metal, cada uno de
los electrodos normalmente está hecho de un material de soporte
inerte sobre cuya superficie está presente una capa fina del
componente metálico del electrodo. En estas formas de realización
más frecuentes, el espesor del material de soporte inerte suele
variar de aproximadamente 51 a 356 \mum, normalmente de
aproximadamente 10 a 153 \mum, mientras que el espesor de la capa
metálica normalmente varía de aproximadamente 10 a 100 nm y
habitualmente de aproximadamente 20 a 40 nm, por ejemplo una capa de
metal bombardeada. Se puede emplear cualquier material de soporte
inerte conveniente en los electrodos sujeto, en los que normalmente
el material es un material rígido que es capaz de proporcionar
soporte estructural al electrodo y, a su vez, la tira para prueba
electroquímica en un todo. Materiales adecuados que pueden emplearse
como el sustrato de soporte incluyen, plásticos, p. ej. PET, PETG,
poliimida, policarbonato, poliestireno, silicio, cerámica, vidrio y
similares.
Las tiras para prueba se caracterizan además
porque al menos una de las superficies metálicas de los electrónicos
y, en algunas formas de realización ambas superficies metálicas de
los electrodos, con la cara hacia el área de reacción, es decir que
limitan o están unidas, tienen una capa de modificación de la
superficie presente en las mismas. La capa de modificación de la
superficie es una capa homogénea de moléculas de
auto-ensamblaje que convierte a la superficie en
hidrófila de forma estable de un modo de almacenamiento estable. Más
específicamente, la capa de modificación de la superficie debería
impartir a la superficie un ángulo de contacto bajo, que
normalmente varía de aproximadamente 10 a 30 y normalmente de
aproximadamente 15 a 25º y un tiempo de absorción rápido, por
ejemplo de 0,5 a 2, y normalmente de aproximadamente 1 a 2 s,
incluso después de un periodo extendido de tiempo a una temperatura
elevada, por ejemplo incluso después de 7 a 14 días a una
temperatura de aproximadamente 4 a 56ºC.
Por homogéneo se quiere decir que la capa de
modificación de la superficie está hecha del mismo tipo de
moléculas. En otras palabras, todas las moléculas de
auto-ensamblaje en la capa de modificación de la
superficie son idénticas. Generalmente, la molécula de
auto-ensamblaje que forma la capa de modificación de
la superficie es una molécula lineal que tiene un grupo terminal
sulfhidrilo y un grupo terminal sulfonato separados por un grupo de
unión de alquilo inferior. En la presente memoria descriptiva, el
término, grupo terminal sulfonato hace referencia tanto a un
residuo de ácido sulfónico como a un residuo de sulfonato, que puede
estar asociado con un catión, por ejemplo sodio, como se encuentra
en una sal de sulfonato. La longitud del grupo de unión alquilo
varía de 1 a 6 átomos de carbono y es una molécula saturada. En
ciertas formas de realización, el número de átomos de carbono en el
grupo de unión alquilo varía de aproximadamente 1 a 4 y a menudo de
aproximadamente 1 a 3.
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De acuerdo con esto, la molécula que forma la
capa de modificación de la superficie de
auto-ensamblaje es una molécula de la fórmula:
HS-(CH_{2})_{n}-SO_{3}Y
en la
que:
n es un número entero de 1 a 6; y
Y es H o un catión.
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De particular interés en muchas formas de
realización de la invención sujeto son las capas de modificación de
la superficie formadas por ácido 2-mercaptoetano
etano sulfónico o una sal del mismo, por ejemplo
2-mercaptoetano sulfonato sódico.
Los electrodos de funcionamiento y de
referencia, como se han descrito en lo que antecede, pueden
fabricarse usando cualquier protocolo conveniente. Un protocolo
representativo incluye la preparación de electrodos metálicos
mediante, en primer lugar, bombardeo de la capa metálica de
suficiente espesor sobre la superficie del material de soporte
inerte. Después, el (los) electrodo(s) cuya superficie se va
a modificar, o al menos la superficie metálica que se ha de
modificar, para que presente la capa de modificación de la
superficie se pone en contacto con una composición de fluidos, por
ejemplo una solución orgánica acuosa, de la molécula de
auto-ensamblaje. El contacto se puede conseguir por
cualquier medio conveniente, incluido el revestimiento de mediante
inmersión a través de ranura, huecograbado del electrodo en la
composición. Normalmente, la concentración de la molécula de
auto-ensamblaje en la composición fluida varía de
aproximadamente 0,05 a 1%, normalmente de aproximadamente 0,05 a
0,5%, y más normalmente de aproximadamente 0,05 a 0,3%. El contacto
se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente para que se
forme la monocapa, por ejemplo durante un periodo de tiempo que
varía de aproximadamente 0,5 a 3 minutos, normalmente de
aproximadamente 0,5 a 2 minutos, seguido por secado de la
superficie del electrodo para usar en las tiras de la prueba
electroquímica sujeto. Un perfil de fabricación representativa más
detallado se proporciona en la sección experimenta, más
adelante.
Una característica de las tiras para prueba
electroquímica sujeto es que los electrodos de funcionamiento y de
referencia, tal y como se han descrito en lo que antecede, están
enfrentados entre sí y están separados sólo pon una distancia
pequeña, de modo que la distancia entre los electrodos de
funcionamiento y de referencia en la zona o área de reacción en las
tiras de prueba es extremadamente pequeña. Este mínimo espacio entre
los electrodos de funcionamiento y de referencia en las tiras para
prueba sujeto es un resultado de la presencia de una fina capa
espaciadora colocada o en sándwich entre los electrodos de
funcionamiento y de referencia. El espesor de esta capa
espaciadora generalmente varía de aproximadamente 1 a 500 \mum,
normalmente de aproximadamente 102 a 153 \mum. La capa
espaciadora se corta de modo que se proporciona una zona o área de
reacción con al menos un puerto de entrada en la zona de reacción y,
generalmente, también un puerto de salida fuera de la zona de
reacción. Una configuración representativa de la capa espaciadora se
puede apreciar en las figuras 1 y 2. Aunque en estas figuras se
muestra que la capa espaciadora tiene un área de reacción circular
cortada con aberturas o puertos laterales de entrada y de salida,
son posibles otras configuraciones, por ejemplo áreas de reacción
de forma cuadrada, triangular, rectangular, irregular etc. La capa
espaciadora se puede fabricar a partir de cualquier material
conveniente, en el que materiales adecuados representativos
incluyen PET, PETG, poliimida, policarbonato y similares, en los que
las superficies de la capa espaciadora pueden estar tratadas de
modo que sean adhesivas con respecto a sus electrodos respectivos y,
de este modo, mantienen la estructura de la tira para prueba
electroquímica. De particular interés es el uso de una tira
adhesiva troquelada de doble cara como capa espaciadora.
Las tiras para prueba electroquímica sujeto
incluyen una zona o área de reacción que está definida por el
electrodo de funcionamiento, el electrodo de referencia y la capa
espaciadora, elementos que se describen en lo que antecede.
Específicamente, los electrodos de funcionamiento y de referencia
definen la parte superior y la parte inferior del área de reacción,
mientras que la capa espaciadora define las paredes del área de
reacción. El volumen del área de reacción es de al menos
aproximadamente 0,1 \mul, normalmente de al menos aproximadamente
1 \mul y más normalmente de al menos aproximadamente 1,5 \mul,
en el que el volumen puede ser de hasta 10 \mul o mayor. Como se
ha mencionado en lo que antecede, generalmente, el área de reacción
incluye al menos un puerto de entrada, y, en muchas formas de
realización, también incluye un puerto de salida. El área
transversal de los puertos de entrada y de salida puede variar
siempre que sea lo suficientemente grande como para proporcionar
una entrada o salida efectiva del fluido desde el área de reacción,
pero generalmente varía desde aproximadamente 9x10^{-5} a
5x10^{-3} cm^{2}, normalmente de aproximadamente 1,3x10^{-3} a
2,5x10^{-3} cm^{2}.
En el área de reacción hay presente un sistema
de reactivo redox, en el que el sistema reactivo proporciona la
especie detectada por el electrodo y, por tanto, se usa para derivar
la concentración del analito en una muestra fisiológica. El sistema
de reactivo redox presente en el área de reacción normalmente
incluye al menos una enzima(s) y un mediador. En muchas
formas de realización el miembro(s) enzimático del sistema de
reactivo redox es una enzima o pluralidad de enzimas que funcionan
conjuntamente para oxidar el analito de interés. En otras palabras,
el componente enzimático del sistema de reactivo redox está formado
por una única enzima oxidante del analito o un grupo de dos o más
enzimas que funcionan de forma conjunta para oxidar el analito de
interés. Las enzimas de interés incluyen oxidasas, deshidrogenasas,
lipasas, quinasas, diaforasas, quinoproteínas y similares.
La enzima específica presente en el área de
reacción depende del analito concreto para cuya detección está
diseñada la tira para prueba electroquímica en la que entre las
enzimas representativas se incluyen: glucosa oxidasa, glucosa
deshidrogenasa, colesterol esterasa, colesterol oxidasa,
lipoproteína lipasa, glicerol quinasa,
glicerol-3-fosfato oxidasa, lactato
oxidasa, lactato deshidrogenasa, piruvato oxidasa, alcohol oxidasa,
bilirrubina oxidasa, uricasa y similares. En muchas formas de
realización preferidas, cuando el analito de interés es glucosa, el
componente enzimático del sistema de reactivo redox es una enzima
oxidante de la glucosa, por ejemplo una glucosa oxidasa o glucosa
deshidrogenasa.
El segundo componente del sistema de reactivo
redox es un componente mediador, que está formado por uno o más
agentes mediadores. En la técnica se conocen varios agentes
mediadores diferentes e incluyen: Ferricianuro, fenacina
etosulfato, fenacina metosulfato, fenilendiamina,
1-metoxi-fenacina metosulfato,
2,6-dimetil-1,4-benzoquinona,
2,5-dicloro-1,4-benzoquinona,
derivados de ferroceno, complejos de bipiridilo de osmio, complejos
de rutenio y similares. En otras formas de realización en las que
glucosa es el analito de interés y la glucosa oxidasa o la glucosa
deshidrogenasa son los componentes enzimáticos, el mediador de
particular interés es ferricianuro. Otros reactivos que pueden
estar presentes en el área de reacción incluyen agentes tampón, por
ejemplo citraconato, citrato, fosfato, tampones "buenos" y
similares.
Generalmente, el sistema de reactivo redox está
presente en forma seca. Las cantidades de los diversos componentes
pueden variar, normalmente la cantidad del componente enzimático
varía de aproximadamente 0,1 a 10% en peso.
La presente invención también proporciona un
procedimiento de usar las tiras para prueba electroquímica sujeto
para determinar la concentración de un analito en una muestra
fisiológica de acuerdo con la reivindicación 7. Se pueden detectar
diversos analitos diferentes usando las tiras para prueba sujeto,
entre los analitos representativos se incluyen glucosa, colesterol,
lactato, alcohol y similares. En muchas formas de realización
preferidas, los procedimientos sujeto se emplean para determinar la
concentración de glucosa en una muestra fisiológica. Aunque en
principio los procedimientos sujeto pueden usarse para determinar la
concentración de un analito en diversas muestras fisiológicas
diferentes, tales como orina, lágrimas, saliva y similares, son
particularmente adecuados para usar en la determinación de la
concentración de un analito en sangre o fracciones de sangre, y más
particularmente en sangre entera.
Al practicar los procedimientos sujeto, la
primera etapa es introducir una cantidad de la muestra fisiológica
en el área de reacción de la tira para prueba, en la que la tira
para prueba electroquímica se describe en lo que antecede.
La cantidad de muestra fisiológica, por ejemplo sangre, que se
introduce en el área de reacción de la tira para prueba puede
variar, pero generalmente varía de aproximadamente 0,1 a 10 \mul,
normalmente de aproximadamente 1 a 1,6 \mul. La muestra se puede
introducir en el área de reacción usando cualquier protocolo
conveniente, en el que la muestra puede inyectarse en el área de
reacción, dejarse absorber en el área de reacción y similares,
según sea conveniente.
Tras la aplicación de la muestra a la zona de
reacción se realiza una medición electroquímica usando los
electrodos de referencia y de funcionamiento. La medición
electroquímica que se realiza puede variar en función de la
naturaleza concreta del ensayo y del dispositivo con el cual se
emplea la tira para prueba electroquímica, por ejemplo en función
de si el ensayo es coulométrico, amperiométrico o potenciométrico.
Generalmente, la medida electroquímica medirá la carga
(coulométrica), la corriente (amperiométrica) o la potencia
(potenciométrico), normalmente durante un periodo de tiempo dado
tras la introducción de la muestra en el área de reacción. En las
patentes de EE.UU. Nº 4.224.125; 4.545.382 y 5.266.179, así como en
los documentos WO 97//18465; WO 99/49307, se describen los
procedimientos para realizar la medición electroquímica descrita en
lo que antecede.
Tras la detección de la señal electroquímica
generada en la zona de reacción como se ha descrito en lo que
antecede, la cantidad del analito presente en la muestra introducida
en la zona de reacción se determina relacionando la señal
electroquímica con la cantidad de analito en la muestra. Al efectuar
esta derivación, normalmente la señal electroquímica medida se
compara con la señal generada a partir de una serie de valores
estándar o control obtenidos previamente y se determina a partir de
esta comparación. En muchas formas de realización, las etapas de
medición de la señal electroquímica y las etapas de derivación de la
concentración del analito, como se ha descrito en lo que antecede,
se realizan de forma automática mediante un dispositivo diseñado
para funcionar con la tira para prueba con el fin de producir un
valor de la concentración del analito en una muestra aplicada a la
tira para prueba. Un dispositivo de lectura representativo para
practicar de forma automática estas etapas, de modo que el usuario
sólo necesita aplicar la muestra a la zona de reacción y después
leer el resultado de la concentración final del analito en el
dispositivo, se describe con más detalle en la patente de EE.UU. Nº
6.193.873.
Asimismo, la presente invención proporciona un
kit de acuerdo con la reivindicación 9 para usar en la práctica de
los procedimientos sujeto. El kit de la presente invención incluye
al menos una tira para prueba electroquímica de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, tal como se
ha descrito en lo que antecede. El kit sujeto puede además incluir
un medio para obtener una muestra fisiológica. Por ejemplo, cuando
la muestra fisiológica es sangre, el kit sujeto puede además
incluir un medio para obtener una muestra de sangre, tal como una
lanceta para pinchar un dedo, un medio de accionamiento de la
lanceta y similares. Además, el kit sujeto puede incluir una
solución control, por ejemplo una solución control de glucosa que
contiene una concentración estandarizada de glucosa. En ciertas
formas de realización, el kit puede también comprender un
instrumento automático, como se ha descrito en lo que antecede,
para detectar una señal electroquímica usando los electrodos tras
la aplicación de la muestra y relacionando la señal detectada con la
cantidad de analito en la muestra. Por último, el kit puede incluir
instrucciones para usar las tiras para prueba con reactivo sujeto en
la determinación de una concentración de analito en una muestra
fisiológica. Estas instrucciones pueden estar presentes en uno o
más de los envases, una ficha técnica, contenedores presentes en los
kit y similares.
Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de
ilustración y no como limitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara una solución al 1% (0,1) de ácido
2-mercaptoetano sulfónico (MESA) mediante la
disolución de 1,000 g de MESA (TCI, Catálogo nº M0913) en 999 g de
agua Milli Q. Se preparan láminas de oro y paladio mediante
bombardeo de la superficie de un sustrato de poliéster de 0,178 mm
(7 mil) de espesor con oro o paladio de modo que se obtiene una
capa metálica de superficie de 100 a 500 angstrom. Tras la
preparación de estos rollos maestros de oro o paladio se cortan
láminas de 304,8 x 215,9 mm. Después, las láminas se sumergen en la
solución al 1% de MESA durante 1 minuto. A continuación, la lámina
revestida se seca al aire durante 1 hora y se analiza el ángulo de
contacto usando un goniómetro y agua tal y como se describe en el
Procedimiento A que se encuentra en el Anexo 1, más adelante, para
asegurar que el ángulo de contacto es < 20º.
Las tiras de prueba que tienen dimensiones de
5,1 X 30,5 mm se cortan de las láminas de oro y metal anteriores y
se usan para fabricar las tiras para prueba electroquímica del
siguiente modo. Una tira de oro y una tira de paladio se usan para
realizar un sándwich de una tira adhesiva sensible a la presión de
doble cara y troquelada que tiene un espesor de 0,13 mm y un área
de troquelado circular que define la zona de reacción, los puertos
de entrada y de salida cuando se realiza el sándwich entre las tiras
de oro y de metal, como se muestra en las figuras 1 y 2. Antes de
realizar el sándwich del adhesivo de doble cara se roció con tinta
un reactivo seco constituido por tampón, mediador, enzima y agentes
formadores de masa sobre el electrodo de paladio.
Las tiras para prueba electroquímica tratadas
con cistina se prepararon de acuerdo con un protocolo industrial
estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
El ángulo de contacto de las tiras para prueba
de oro y paladio tratadas con cistina se determinó con agua y un
goniómetro, tal como se describe en el Procedimiento B en el Anexo
A, más adelante. El ángulo de contacto se determinó a varios
tiempos tras el tratamiento de superficie, es decir 0, 7 y 14 días
tras el tratamiento, y a varias temperaturas de almacenamiento, por
ejemplo a temperatura ambiente y a 56ºC. Los resultados se
proporcionan en la figura 3.
El tiempo de absorción de las tiras para prueba
de oro y de paladio tratadas con MESA se determinó tal como se
describe en el Procedimiento C que se encuentra en el Anexo A, más
adelante. El tiempo de absorción se determinó a varios tiempos tras
el tratamiento de superficie, es decir 0,7 y 14 días tras el
tratamiento, y a varias temperaturas de almacenamiento, por ejemplo
a temperatura ambiente y a 56ºC. Los resultados se proporcionan en
la figura 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El ángulo de contacto de las tiras para prueba
de oro y paladio tratadas con MESA (tratadas a pH 5,4 y 11,5) se
determinó con agua y un goniómetro, tal como se describe en el
Procedimiento B en el Anexo A, más adelante. El ángulo de contacto
se determinó a varios tiempos tras el tratamiento de superficie, es
decir 0, 7 y 14 días tras el tratamiento, en el que la temperatura
de almacenamiento fue 56ºC. Los resultados se proporcionan en las
figura 5A (pH 5,4) y 5B (pH 11,5).
El tiempo de absorción de las tiras para prueba
de oro y paladio tratadas con MESA (tratadas a pH 5,4 y 11,5) se
determinó como se describe en el Procedimiento B en el Anexo A, más
adelante. El tiempo de absorción se determinó a varios tiempos tras
el tratamiento de superficie, es decir 0, 7 y 15 días tras el
tratamiento, y a varias temperaturas de almacenamiento, por ejemplo
a temperatura ambiente y a 56ºC. Los resultados se proporcionan en
las figura 6.
Se comparó el tiempo de absorción de tres tiras
para prueba electroquímica diferentes preparadas como se ha
descrito en lo que antecede. La primera tira para prueba
electroquímica (Caso A) fue una en la que tanto las superficies de
oro como de paladio se trataron con cistina. La segunda tira para
prueba electroquímica (Caso B) fue una en la que tanto las
superficies de oro como de paladio se trataron con MESA. La tercera
tira para prueba electroquímica (Caso C) fue una en la que tanto la
superficie de paladio se trató con cistina y la superficie de oro
se trató con MESA. Los tiempos de de absorción se determinaron tal
como se describe en el procedimiento C que se encuentra en el Anexo
A, más adelante, con las tiras almacenadas en viales SureStep® a
56ºC durante 7 y 14 días y los resultados se proporcionan en la
figura 7.
Los resultados y la discusión anteriores
demuestran que la presente invención proporciona tiras para prueba
electroquímica significativamente mejoradas para usar en la
determinación de un analito en una muestra de prueba.
Específicamente se proporcionan tiras para prueba electroquímica
estables al almacenamiento que tienen superficies hidrófilas
duraderas que exhiben una baja interferencia a la medición
electroquímica de especies oxidadas y que tienen tiempos de de
absorción rápidos. Además, los reactivos modificadores de superficie
usados para modificar las superficies de las tiras para prueba
sujeto son inodoros. Como tal, la presente invención representa una
contribución significativa a la técnica.
Aunque la invención anterior se ha descrito con
algún detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad
de entendimiento, a la luz de las enseñanzas de la presente
invención es fácilmente evidente para los expertos en la técnica
que se pueden realizar ciertos cambios y modificaciones sin
desviarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Anexo
A
Procedimiento
A
- \quad
- 1. Fuente para horno de vidrio Pirex 4Q de tamaño 26,7 cm x 37,5 cm X 5,72 cm
- \quad
- 2. Agua Mill-Q
- \quad
- 3. Cronómetro
- \quad
- 4. Láminas de oro y paladio de tamaño 30,5 cm x 21,6 cm 8.5'')
- \quad
- Ácido 2-mercaptoetano sulfónico, sal de sodio
- \quad
- Fabricante TCI
- \quad
- Catálogo nº M0913
- \quad
- Pureza: 99%
- \quad
- Peso molecular 164,18
- \quad
- 1. Pesar 1.000 (\pm 0,0005) g de ácido 2-mercaptoetano sulfónico sódico en un papel de pesado.
- \quad
- 2. Pesar 999,0 (\pm 0,1) g de agua Milli Q en un batidor de vidrio.
- \quad
- 3. Añadir polvo de MESA lentamente al batidor. Dejar disolver completamente.
- \quad
- 4. Cortar del rollo. láminas de oro y paladio de tamaño 30,5 cm x 21,6 cm.
- \quad
- 5. Verter lentamente el contenido del batidor en la fuente para horno.
- \quad
- 6. Recubrir las láminas de metal una por una, con la capa de metal hacia el fondo de la fuente. Asegurarse de que la lámina está completamente cubierta con solución. Usar el cronómetro para monitorizar el tiempo de revestimiento (1 min/lámina).
- \quad
- 7. El tiempo de secado es de aproximadamente 1 hora.
- \quad
- 8. Comprobar el ángulo de contacto de la película metalizada con agua con un goniómetro. El ángulo de contacto usado debería ser < 20º para las superficies de Au y de Pd.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento
B
- \quad
- 1. Lámina de oro y paladio recubierta con MESA
- \quad
- 2. Goniómetro Rame-Hart Modelo -100-00-115
- \quad
- 3. Sistema de pipeteado automático
- \quad
- 4. Software RHI 2001
Procedimiento: Usando agua, llenar el
sistema de pipeteado automático. Colocar la muestra (Au/Pd) sobre la
plataforma de la muestra y sujetar con pinzas. Abrir el programa
RHI y establecer el valor basal. Introducir de 3 a 5 \mul de agua
desde una pipeta automática. El sistema RHI 2001 captura la imagen y
mide el ángulo de contacto desde ambos lados y realiza el promedio.
Esto se puede repetir varias veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento
C
- \quad
- 1. Tiras para prueba tratadas con MESA
- \quad
- 2. Sangre fresca ajustada al 70% del hematocrito
- \quad
- 3. Pipeta- 20 \mul
- \quad
- 4. Piezas de parafilm para la aplicación de la sangre
- \quad
- 5. Cámara Panasonic modelo GP KP222
- \quad
- 6. Software Adobe Premiere 4,2 para captura de vídeo
- \quad
- 7. Sistema informático y un monitor
- \quad
- 8. Cinta adhesiva de doble cara y una plataforma para tiras
- \quad
- 1. Colocar una tira sobre una plataforma y sujetarlo con cinta.
- \quad
- 2. Colocar la tira bajo la lente de la cámara y ajustar el enfoque y el aumento.
- \quad
- 3. Lanzar el software Premiere y abrir el programa de capturas de película. Seleccionar el sistema 30fps NTSC para capturar una película viva.
- \quad
- 4. Colocar 5 \mul de sangre 70% de hct en la superficie de parafilm.
- \quad
- 5. Encender en modo grabar y aplicar la sangre desde cualquier lado de la tira para prueba en el capilar.
- \quad
- 6. Apagar el modo grabación cuando la sangre alcance el otro extremo de la tira para prueba.
- \quad
- 7. Ir a la ventana de imágenes y analizarla. Usar la marca DENTRO cuando la sangre toca la tira y la marca FUERA cuando la sangre alcanza el otro extremo.
- \quad
- El software realiza el recuento de marcos (30 marcos/segundo) y lo muestra en la ventana inferior.
- \quad
- 8. Calcular el tiempo absorción, dividir el número de marcos por 30.
- \quad
- 9. Repetir el procedimiento para el nº 1 de las tiras.
Claims (9)
1. Una tira para prueba electroquímica (10), que
comprende:
(a) una zona de reacción definida por electrodos
en oposición en funcionamiento (12) y de referencia (14) separados
por una capa espaciadora (16); y
(b) un sistema de reactivo redox presente en
dicha zona de reacción,
en la que:
dicho sistema de reactivo redox comprende al
menos una enzima y un mediador;
dicho electrodo de referencia (14) tiene una
superficie con la cara hacia la zona de reacción del metal;
dicha superficie metálica de dicho electrodo de
referencia (14) está modificado con una capa de modificación de
superficie homogénea formada por moléculas de
auto-ensamblaje que tienen la fórmula
HS-(CH_{2})_{n}-SO_{3}Y;
n es un número entero de 1 a
6;
Y es H o un catión; y
todas las moléculas de
auto-ensamblaje mencionadas son idénticas.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La tira para prueba electroquímica (10) de
acuerdo con la reivindicación 1, en la que la superficie de al
menos dicho electrodo de referencia (14) comprende un metal
seleccionado del grupo constituido por oro, paladio, plata, iridio
y acero inoxidable.
3. La tira para prueba electroquímica (10) de
acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que
dicha al menos una enzima incluye una enzima oxidante.
4. La tira para prueba electroquímica (10) de
acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicha enzima oxidante es
una enzima oxidante de glucosa.
5. La tira para prueba electroquímica (10) de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la
que dicha molécula de auto-ensamblaje es ácido
2-mercaptoetano sulfónico o una sal del mismo.
6. La tira para prueba electroquímica (10) de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la
que dicha zona de reacción tiene un volumen que varía de 0,1 a 10
\mul.
7. Un procedimiento para determinar la
concentración de un analito en una muestra fisiológica, en el que
dicho procedimiento comprende:
(a) aplicar dicha muestra fisiológica a una tira
para prueba electroquímica (10) de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes;
(b) detectar una señal eléctrica en dicha zona
de reacción usando dichos electrodos; y
(c) relacionar dicha señal eléctrica detectada
con la cantidad de dicho analito en dicha muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
8. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que dicho analito es glucosa.
9. Un kit para usar en la determinación de la
concentración de un analito en una muestra fisiológica, en el que
dicho kit comprende:
(a) una tira para prueba electroquímica (10) de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y
(b) al menos una de:
- (i)
- un medio para obtener dicha muestra fisiológica; y
- (ii)
- un analito estándar.
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