ES2319343T3 - Metodo y aparato para analisis automatico. - Google Patents

Abstract

Un método para estimar la concentración de una forma reducida (u oxidada) de una especie redox en un líquido, que comprende las etapas de: poner en contacto una zona (4; 8) de un primer electrodo (1) con una muestra (5) de volumen (V) predeterminado del líquido en el que el primer electrodo está dotado de una enzima y un mediador redox, poner en contacto la muestra (5) con una zona de un segundo electrodo (11) separado del primero, aplicar un potencial entre los electrodos (1, 11) mientras que los electrodos (1, 11) están separados de manera suficientemente cercana como para que los productos de reacción formados en cada electrodo (1 u 11) se difundan hacia el otro electrodo (11 ó 1) mientras que se aplica el potencial, medir o estimar un valor indicativo del cambio en la corriente como función del tiempo (pendiente) y un valor indicativo de la corriente (iss) en estado estacionario, y determinar a partir de dicho volumen (V), dicha corriente como función del tiempo (pendiente) y dicha corriente (i ss) en estado estacionario, la concentración de la forma reducida (u oxidada) de la especie en la muestra (5) de líquido.

Description

Método y aparato para análisis automático.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un método para analizar la concentración de un analito en una muestra y a un aparato de análisis automático. La invención se describirá en el presente documento con referencia particular a un método y a un aparato para medir la concentración de glucosa u otros analitos en la sangre, pero no se limita a ese uso.

Técnica anterior

En los documentos WO-A-97-00441, WO-A-97/18465 y WO-A-97/18464, se ha descrito un método para determinar la concentración de un analito en un soporte. En ese método, se pone en contacto una muestra que va a analizarse con un reactivo que contiene una enzima y un mediador redox en una celda electroquímica. La celda es una celda de capa delgada que comprende un electrodo de trabajo separado de un contraelectrodo por un separador que garantiza que los dos electrodos tengan un área sustancialmente idéntica y una separación predeterminada. La separación entre los electrodos es esencialmente cercana de manera que tras aplicar un potencial entre los electrodos, los productos de reacción del contraelectrodo migran hacia el electrodo de trabajo y viceversa, estableciendo finalmente un perfil de concentración en estado estacionario entre los electrodos, lo que a su vez da como resultado una corriente en estado estacionario.

Se ha encontrado que mediante la comparación de una medida de la corriente en estado estacionario con la tasa de tiempo a la que varía la corriente en el transitorio de corriente antes de que se logre el estado estacionario, puede medirse el coeficiente de difusión del mediador redox, así como su concentración. Puede demostrarse que durante un intervalo de tiempo limitado, una representación gráfica de ln(i/i_{ss}-1) frente al tiempo (medido en segundos) es lineal y tiene una pendiente (indicada mediante S) que es igual a -4p^{2}D/L, en la que "i" es la corriente en el tiempo "t", "i_{ss}" es la corriente en estado estacionario, "D" es el coeficiente de difusión en cm^{2}/sec, "L" es la distancia entre los electrodos en cm y "p" es la constante pi, aproximadamente 3,14159. La concentración del mediador reducido presente cuando se aplica el potencial entre los electrodos viene dado por -2p^{2}i_{ss}/FALS, en la que "F" es la constante de Faraday, A es el área del electrodo de trabajo y los otros símbolos son tal como se facilitaron anteriormente. Dado que está última fórmula utiliza S, incluye el valor medido del coeficiente de difusión.

Dado que L y el área del electrodo son constantes para una celda dada, la medición de i como función del tiempo e i_{ss} permiten que se calcule el valor del coeficiente de difusión del mediador redox y que se determine la concentración del analito. En el documento WO-A-97/18464 se describen métodos adecuados para la producción en serie de celdas que tienen un área A de electrodo y una separación L de electrodos sustancialmente constantes.

En la actualidad la glucosa en muestras de sangre se mide en laboratorios de patología y similares por medio de un aparato tal como el analizador de sangre YSI en el que se analizan muestras sucesivas por medio de una sonda cilíndrica hueca en la que está montado un electrodo de plata y uno de platino. La superficie de la sonda está equipada con una membrana de tres capas. La capa media contiene una enzima inmovilizada que está intercalada entre una membrana de acetato de celulosa y una de policarbonato. La superficie de la sonda, cubierta por la membrana, está situada en una cámara de muestras cargada con tampón en la que se inyectan muestras sucesivas. Parte de la muestra difunde a través de la membrana. Cuando entra en contacto con la enzima oxidasa inmovilizada, se oxida rápidamente produciendo peróxido de hidrógeno, formando la glucosa una glucono-delta-lactona.

El peróxido de hidrógeno a su vez se oxida en el ánodo de platino que produce electrones. Se logra un equilibrio dinámico cuando la tasa de producción y eliminación del peróxido alcanza un estado estacionario. El flujo de electrones es linealmente proporcional a la concentración de peróxido en el estado estacionario y, por tanto, a la concentración de la glucosa.

El electrodo de platino se mantiene a un potencial anódico y puede oxidar muchas sustancias distintas al peróxido de hidrógeno. Para evitar que estos agentes reductores contribuyan a la corriente sensible, la membrana contiene una capa interna que consiste en una película muy fina de acetato de celulosa. Esta película deja pasar fácilmente peróxido de hidrógeno pero excluye compuestos químicos con pesos moleculares superiores a aproximadamente 200. La película de acetato también protege la superficie de platino de proteínas, detergentes y otras sustancias que podrían obstruirla. Sin embargo, la película de acetato de celulosa puede penetrarse por compuestos tales como sulfuro de hidrógeno, mercaptanos de bajo peso molecular, hidroxilaminas, hidrazinas, fenoles y analitos.

En uso, la muestra (o un patrón de calibración) se dispensa en la cámara, se diluye en 600 microlitros de tampón y luego se realiza una medición mediante la sonda. La respuesta sensible aumenta y entonces alcanza una meseta cuando se alcanza un estado estacionario. Tras varios segundos, una bomba de tampón purga la cámara y disminuye la respuesta sensible.

El aparato monitoriza la corriente de línea base. Si es inestable, una bomba de tampón continuará purgando la cámara de muestras con tampón. Cuando se estabiliza una línea de base estable se inicia una calibración automática. El aparato se calibra por sí mismo, por ejemplo, tras cada cinco muestras o 15 minutos. Si se produce una diferencia de más del 2% entre la calibración actual y la anterior, el aparato repite la calibración. También se produce la calibración de nuevo si la temperatura de la cámara de muestras varía en más de 1ºC.

El aparato descrito adolece de varias desventajas. En primer lugar, se invierte una elevada proporción de su tiempo en uso en realizar calibraciones en lugar de en el análisis. Además, el consumo de disoluciones tampón y de calibración supone un coste sustancial. Otra desventaja es que la membrana con enzimas envejece, por lo que un gráfico de la lectura frente a la concentración llega a ser no lineal. Sería sumamente deseable proporcionar un aparato que pueda realizar mediciones del tipo descrito con velocidad y eficacia mejoradas, y a un coste de funcionamiento inferior.

Objeto de la invención

Un objeto de la presente invención es un método y un aparato mejorados para analizar automáticamente muestras que eviten o mejoren al menos algunas de las desventajas de la técnica anterior. Un objeto de la realización preferida de la invención es un aparato automático para estimar la concentración de glucosa en muestras de sangre.

Breve divulgación de la invención

Según un primer aspecto, la invención comprende un método para estimar la concentración de una forma reducida (u oxidada) de una especie redox en un líquido, que comprende las etapas de:

poner en contacto una zona de un primer electrodo con una muestra de volumen (V) predeterminado del líquido, en el que el primer electrodo está dotado de una enzima y un mediador redox,

poner en contacto la muestra con una zona de un segundo electrodo separado del primero,

aplicar un potencial entre los electrodos mientras que los electrodos están separados de manera suficientemente cercana como para que los productos de reacción formados en cada electrodo se difundan hacia el otro electrodo mientras que se aplica el potencial,

medir o estimar un valor indicativo del cambio en la corriente como función del tiempo (pendiente) y un valor indicativo de la corriente (i_{ss}) en estado estacionario, y

determinar a partir de dicho volumen (V), dicha corriente como función del tiempo (pendiente) y dicha corriente (i_{ss}) en estado estacionario, la concentración de la forma reducida (u oxidada) de la especie en la muestra de líquido.

Según un segundo aspecto, la invención comprende un aparato de análisis automático, que comprende:

un primer electrodo dotado de una enzima y un mediador redox,

medios para colocar un volumen (V) predeterminado de una muestra de líquido en contacto con el primer electrodo,

medios para poner en contacto la muestra con un segundo electrodo separado del primero,

medios para aplicar un potencial entre los electrodos,

medios para medir la corriente como función del tiempo (pendiente) mientras que los electrodos están en proximidad suficientemente cercana como para que los productos de reacción formados en un electrodo se difundan hacia el otro y logren una distribución de estado estacionario, y

medios para determinar la concentración de la forma reducida (u oxidada) de la especie en la muestra líquida utilizando el volumen, la corriente como función del tiempo y una corriente en estado estacionario.

Breve descripción de los dibujos

Ahora se describirán varias realizaciones de la invención a modo de ejemplo únicamente con referencia a los dibujos adjuntos en los que:

La figura 1 es un diagrama esquemático que muestra en sección transversal una primera realización del aparato según la invención.

La figura 2 es un diagrama esquemático que muestra, en sección transversal ampliada, una gotita de muestra entre dos electrodos.

La figura 3 es un diagrama esquemático que muestra en sección transversal una segunda realización del aparato según la invención.

La figura 4 es un diagrama esquemático de una tercera realización del aparato según la invención en alzado lateral.

La figura 5 muestra la realización de la figura 4 en alzado desde un extremo, vista sobre la línea 5-5 de la figura 4.

Descripción de realizaciones preparadas

A modo de ejemplo, se describirá una primera realización del aparato según la invención.

Con referencia a la figura 1, se muestra esquemáticamente un analizador automático para medir glucosa en muestras de sangre. El aparato comprende un primer electrodo 1 flexible que consiste en una capa 2 de paladio formada o depositada sobre un soporte 3 flexible (por ejemplo una película de PET de 100 micras) preferiblemente mediante recubrimiento por pulverización catódica hasta un espesor de por ejemplo 100-1000 Ángstroms. El electrodo 1 se alimenta en el analizador a partir de un rodillo (no ilustrado) en forma de una cinta.

El primer electrodo 1 está dotado sobre la superficie 2 de paladio de una enzima y un mediador redox. Éstos pueden seleccionarse (sin limitación) de los sistemas de la tabla 1 y en el presente ejemplo, se usan una enzima GOD y un mediador de ferricianuro. La enzima y el mediador redox pueden imprimirse en cantidades predeterminadas a intervalos predeterminados sobre la superficie del primer electrodo como un recubrimiento 4 de reactivo seco.

El electrodo 1 se acciona por medios no mostrados en los dibujos a través de una estación "S" de muestras en la que se coloca un volumen preciso de una muestra 1 como una gotita 5 sobre un recubrimiento 4 de reactivo sobre la superficie 1 del electrodo, por ejemplo, por medio de una pipeta 6 automática. Menos preferiblemente, pueden combinarse cantidades predeterminadas de la enzima y el mediador redox con la muestra antes o después de la deposición de la gotita sobre el electrodo.

Entonces se lleva un segundo electrodo 11, que en el presente ejemplo es de construcción similar al primer electrodo, y que comprende una capa 12 de paladio recubierta mediante pulverización catódica sobre un soporte 13 de PET flexible, en relación separada de manera cercana con el electrodo 1 y se pone en contacto con una gotita 5. La gotita humedece ambas superficies 1 y 10 de paladio y adopta una configuración sustancialmente cilíndrica entre los dos electrodos tal como se ilustra más claramente en la figura 2. La gotita está limitada entre los electrodos 1, 2 mediante una interfase 14 líquido/gas.

Entonces se aplica un potencial eléctrico de los dos electrodos (mediante medios no ilustrados en la figura 1) a través de contactos.

Tal como se describe en los documentos WO-A-97/18465 y WO-A-97/18464, se establece el potencial entre los electrodos de manera que la tasa de electrooxidación de la forma reducida de la especie (o de electrorreducción de la forma oxidada) se controla por difusión. Dado que el electrodo de trabajo y el contraelectrodo están situados en proximidad muy cercana (separados en aproximadamente 0,5 mm o menos) el ferricianuro que se genera en el contraelectrodo tiene tiempo para alcanzar el electrodo de trabajo y contribuir a la corriente en el electrodo de trabajo. Es decir, una molécula de ferricianuro puede reducirse en el contraelectrodo a ferrocianuro y luego puede difundir hacia el electrodo de trabajo, en el que se volverá a oxidar a ferricianuro. Esta situación da como resultado una corriente decreciente en tiempos cortos que se estabiliza hasta alcanzar un valor constante en tiempos mayores (la corriente en estado estacionario). Esta estabilización de la corriente se produce porque se está suministrando una corriente constante de ferrocianuro al electrodo de trabajo desde el contraelectrodo. Este mecanismo es bastante distinto del que se produce en un dispositivo Cottrell en el que los electrodos están separados de manera que el ferricianuro que resulta de la reducción del ferricianuro en el contraelectrodo no influye en la corriente observada.

En la presente celda, la corriente en estado estacionario viene dada por

\vskip1.000000\baselineskip

1

en la que i_{ss} es la corriente en estado estacionario, D es el coeficiente de difusión, F es la constante de Faraday, A es el área del electrodo, C_{0} es la concentración del analito (ferricianuro) y L es la separación de los electrodos.

La corriente i en el tiempo t viene dada por la ecuación:

\vskip1.000000\baselineskip

2

en la que p es pi.

A tiempos mayores, pueden ignorarse los términos exponenciales superiores en la ecuación 2. Por tanto, la ecuación 2 puede aproximarse a la ecuación 3 para tiempos superiores a un cierto valor

3

Si se supone que la ecuación 2 puede aproximarse a la ecuación 3 cuando el segundo término exponencial en la ecuación 2 es el 1% del primer término exponencial, la ecuación 3 es válida para tiempos superiores a t = \frac{0,0389L^{2}}{D}.

Se entenderá que la ecuación 3 puede transformarse para dar:

4

Por tanto, una representación gráfica del lado izquierdo de la ecuación (4') frente al tiempo dará una línea recta con nueva

5

\vskip1.000000\baselineskip

Combinar las ecuaciones (1) y (5') da

6

en la que V = AL es el volumen de la gota de muestra pipeteada sobre la cinta. Dado que los parámetros "pendiente" e "i_{ss}" se miden en la prueba y p y F son constantes universales, para medir la concentración del analito derivado de la prueba (Co) sólo se requiere conocer el volumen de la muestra pipeteada. Dado que esto puede realizarse de manera muy precisa, es posible tener una medición muy precisa de Co sin necesidad de ninguna otra calibración del sistema. De manera significativa, no es necesario conocer ni la separación entre los electrodos ni el área humedecida del electrodo.

La forma exacta adoptada por la gotita en contacto con los dos electrodos no es importante.

Si se desea, la química de ubicaciones de electrodo sucesivas podría ser diferente una de otra de manera que podría realizarse una multiplicidad de pruebas diferentes en volúmenes pipeteados sucesivos de muestra situada en ubicaciones de electrodo sucesivas. En una segunda realización tal como se muestra en la figura 3 que corresponde a la parte de la figura 1 aguas arriba de la estación S de muestras, el primer electrodo está dotado de una capa 7 solapante, por ejemplo, de una película de PET delgada a partir de la cual se han perforado aberturas para definir pocillos 8 en los que pueden colocarse reactivos 4 químicos y que servían para definir las ubicaciones en las que se han colocado los reactivos y/o para proteger los reactivos antes de su uso. En este caso, el electrodo 1 se suministra convenientemente al aparato a partir de un rodillo que tiene cantidades predeterminadas de reactivos químicos en los pocillos en forma seca y se protege de la contaminación antes de su uso intercalándolo entre las capas del rodillo. Los reactivos químicos sólo se usan una vez y, por tanto, pueden protegerse más fácilmente frente al deterioro de lo que es posible con la técnica anterior. En la realización descrita anteriormente, la gotita 5 de muestra no está "contenida" por una celda, aunque puede depositarse y situarse dentro de un pocillo 8. Cuando se emplea una capa 7 que define pocillos, puede adherirse a la superficie del electrodo o al soporte del electrodo o puede ser simplemente una capa separadora no adherente.

No es necesario que la capa 11 de electrodo superior entre en contacto con la superficie superior de la capa 7 que define pocillos. El volumen de muestra pipeteado es de manera que la altura de la gota 5 es igual a o preferiblemente superior que el espesor de la capa 7 que define pocillos. Si se usa una capa 7 para definir un pocillo 8, resulta indeseable que el volumen de muestra fluya por los lados del pocillo. Es suficiente con que la muestra tenga un volumen conocido y humedezca ambos electrodos formando preferiblemente una forma sustancialmente cilíndrica entre ellos.

También se entenderá que la capa 7 que define pocillos puede sustituirse por una capa porosa, por ejemplo un papel poroso, fieltro o malla no tejida, o una membrana porosa, que actúa para inmovilizar la muestra en el espacio con respecto a las capas del electrodo y para mantener los reactivos en su sitio y, en este caso, el segundo electrodo entrará en contacto con la superficie de la capa porosa que inmoviliza el volumen.

Se entenderá que el uso de una capa 7 porosa o que define pocillos es opcional y que en otras realizaciones de la invención, es innecesaria una capa 7, siendo suficiente que se pipetee una gota de muestra sobre una capa 2 metálica y que se ponga una capa 12 metálica superior en contacto con una gota de muestra de volumen predeterminado, estando la capa 12 metálica superior de manera deseable pero no esencial a una separación predeterminada de la capa 1 metálica inferior.

También se entenderá que no es necesario que las cintas o bandas de capa metálica se desplacen en la misma dirección. Por ejemplo, una capa de electrodo metalizada puede hacerse avanzar transversalmente con respecto a la otra, haciéndose avanzar cada cinta tras cada medición para exponer una superficie del electrodo nueva inferior y una nueva superior y reactivo nuevo en la estación de carga de muestra.

En cada caso, se mide la corriente resultante como función del tiempo mientras que los electrodos están en contacto con una gota de muestra de volumen predeterminado.

Se prefieren electrodos de banda continua. Éstos o bien pueden desecharse tras su uso o bien pueden hacerse pasar a través de una estación de lavado y luego reutilizarse, si se desea, tras la impresión de nuevo con reactivos.

En las realizaciones preferidas de la invención, cantidades predeterminadas del reactivo se sitúan sobre uno o ambos electrodos mediante dispositivos de dosificación, por ejemplo, un cabezal de impresión por chorro de tinta aguas arriba de la estación 3 de muestra, y puede secarse, pero no es necesario, antes del contacto con la muestra. Un sistema de aplicación de reactivo puede ser una parte del aparato, o el aparato puede estar adaptado para alojar electrodos en rodillo o en otra forma pretratada con los reactivos deseados en otra ubicación o planta.

Se entenderá que no es necesario que uno o ambos electrodos sean una banda continua sino que pueden estar, por ejemplo, en forma de una sonda retráctil. El segundo electrodo podría ser una sonda desechable que se baja en contacto con una gotita en un primer electrodo y entonces se retira tras completarse las mediciones de corriente. Asimismo, no es necesario que el primer electrodo esté en forma de una cinta. El primer electrodo podría estar montado, por ejemplo, en un carrusel o estar en forma de un disco giratorio. Aunque se prefiere usar superficies de electrodo desechables, el método puede aplicarse con electrodos reutilizables lavados entre usos sucesivos. A modo de ejemplo, se muestra esquemáticamente en la figura 4 un aparato de análisis automático que comprende un primer electrodo 1 en forma de un primer disco accionado de manera intermitente en rotación alrededor de un primer eje horizontal. Un segundo electrodo 11 se acciona de manera intermitente y síncrona con el primer disco en rotación alrededor de un eje horizontal paralelo al primer eje. Los electrodos 1 y 11 están separados en su borde en el punto de aproximación más cercano. Se depositan gotas 5 de muestra de un volumen predeterminado con precisión sobre el primer electrodo a intervalos mediante un dispositivo 6 de pipeteo en sincronización con la rotación del disco. Se imprimen los reactivos 4 sobre el segundo electrodo a intervalos correspondientes por medio de un rodillo 16 de impresión y se secan in situ, por ejemplo mediante un ventilador de aire (no mostrado en los dibujos).

En uso, cuando el electrodo 1 gira, una gota 5 se desplaza hasta una posición en la que entra en contacto con el segundo electrodo y con los reactivos impresos sobre el mismo. Mientras que ambos discos son estacionarios con la gotita en contacto con cada electrodo, se aplica un potencial entre los electrodos y se mide la corriente tal como se trató anteriormente. Durante este tiempo, el/los reactivo(s) se disuelve(n) en la muestra y tras realizar las mediciones necesarias, ambos electrodos se gradúan en un nuevo ángulo de rotación. Las superficies usadas para el análisis se lavan mediante pulverizaciones 14a, en sumideros 15 de drenaje y quedan listas para un nuevo uso.

El aparato según la invención requiere muestras mucho más pequeñas a las requeridas con el dispositivo YSI y dado que los reactivos químicos pueden protegerse mejor hasta su uso y pueden dosificarse con más precisión, el aparato proporciona una precisión y velocidad superiores a un coste reducido.

En otra realización de la invención, la corriente puede seguirse con el tiempo tras haberse aplicado un potencial entre los electrodos hasta que se ha alcanzado un tiempo o estado predeterminados. El signo del potencial aplicado se invertiría entonces y se realizaría el análisis de manera similar al facilitado anteriormente, excepto en que las ecuaciones (3) y (4) se sustituyen por

7

8

Este protocolo tiene la ventaja de poder permitir que se produzcan en la prueba procesos lentos. Esto puede realizarse:

a) esperando a que la corriente cambie en menos de una cantidad predeterminada por segundo antes de invertir el potencial, de manera que cualquier proceso lento que afecte a la medición sea sustancialmente completo, o

b) usando el cambio en la corriente con el tiempo antes de que se invierta el potencial para compensar los procesos lentos que se producen (tal como se ha descrito en las solicitudes de patentes anteriores en relación con celdas que tienen un área y una separación de electrodos predefinidas).

Aunque la invención se ha descrito con referencia a electrodos de paladio, los electrodos pueden ser de otros metales adecuados, tal como se describe por ejemplo en las solicitudes anteriores a las que se hace referencia en el presente documento. Un electrodo puede ser diferente de otro. Los electrodos pueden estar soportados por PET tal como se mencionó a modo de ejemplo anteriormente, o mediante otro material aislante adecuado, o pueden ser autoestables. Si están soportados sobre una película aislante, se prefiere, pero no es esencial, que los metales estén depositados sobre la película mediante recubrimiento por pulverización catódica. El contacto eléctrico para la aplicación de un potencial y/o para la medición de la corriente puede ser mediante cualquier medio adecuado incluyendo acoplamiento de fijación con un extremo del electrodo si está en forma de una cinta, o por medio de contactos rodantes adecuados, o contactos accionados por resorte, o similares. La aplicación del potencial eléctrico; la medición de la corriente; el cálculo de la concentración de analito; el control síncrono del movimiento de un electrodo con respecto al otro y con la deposición de las gotitas de muestra y, si se requiere, con la deposición de reactivos, pueden controlarse mediante un microprocesador o similar y los resultados pueden imprimirse, visualizarse y/o registrarse de otro modo por medios que son bien conocidos por los expertos en técnicas de control.

Tal como se apreciará por los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas del presente documento pueden combinarse las características de una realización con las de otra y la invención puede realizarse de otras formas sin apartarse de los conceptos descritos en el presente documento.

TABLA 1

9

Claims (13)

1. Un método para estimar la concentración de una forma reducida (u oxidada) de una especie redox en un líquido, que comprende las etapas de:

poner en contacto una zona (4; 8) de un primer electrodo (1) con una muestra (5) de volumen (V) predeterminado del líquido en el que el primer electrodo está dotado de una enzima y un mediador redox,

poner en contacto la muestra (5) con una zona de un segundo electrodo (11) separado del primero,

aplicar un potencial entre los electrodos (1, 11) mientras que los electrodos (1, 11) están separados de manera suficientemente cercana como para que los productos de reacción formados en cada electrodo (1 u 11) se difundan hacia el otro electrodo (11 ó 1) mientras que se aplica el potencial,

medir o estimar un valor indicativo del cambio en la corriente como función del tiempo (pendiente) y un valor indicativo de la corriente (i_{ss}) en estado estacionario, y

determinar a partir de dicho volumen (V), dicha corriente como función del tiempo (pendiente) y dicha corriente (i_{ss}) en estado estacionario, la concentración de la forma reducida (u oxidada) de la especie en la muestra (5) de líquido.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra de volumen (V) predeterminado es una gotita (5) depositada sobre uno de dichos electrodos (1, 11).

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la gotita (5) se mantiene entre los dos electrodos (1, 11) mediante tensión superficial.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos uno de los electrodos (1, 11) está en forma de una tira continua.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos uno de los electrodos (1, 11) está preimpreso con al menos un reactivo (4).

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos un electrodo (1) está cubierto con una capa (7) que sirve para definir pocillos (8) sobre la superficie del electrodo.

7. Un aparato de análisis automático, que comprende:

un primer electrodo (1), dotado de una enzima y un mediador redox,

medios (6) para colocar un volumen (V) predeterminado de una muestra de líquido en contacto con el primer electrodo (1),

medios para poner en contacto la muestra con un segundo electrodo (11) separado del primero (1),

medios para aplicar un potencial entre los electrodos (1, 11),

medios para medir la corriente como función del tiempo (pendiente) mientras que los electrodos (1, 11) están en proximidad suficientemente cercana como para que los productos de reacción formados en un electrodo (1 u 11) se difundan hacia el otro (11 ó 1) y logren una distribución de estado estacionario, y

medios para determinar la concentración de la forma reducida (u oxidada) de la especie en la muestra de líquido usando el volumen (V), la corriente como función del tiempo (pendiente) y una corriente (i_{ss}) en estado estacionario.

8. Aparato de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende además un medio poroso para inmovilizar el volumen (V) predeterminado.

9. Aparato de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que al menos uno de los electrodos (1, 11) es una capa de paladio.

10. Aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que al menos un electrodo (1, 11) está en forma de una tira continua.

11. Aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que al menos un electrodo (1, 11) está sobre un soporte (3) flexible.

12. Aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, que comprende además una pipeta (6) para depositar un volumen (V) predeterminado de muestra (5) en contacto con el primer electrodo (1).

13. Aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, que comprende además medios (16) para depositar uno o más reactivos (4) sobre uno de los electrodos (1, 11) antes de colocar la muestra (5) sobre el electrodo (1, 11).