JP3691760B2 - 自動分析のための方法および装置 - Google Patents
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Description
(技術分野)
本発明は、試料中の分析物の濃度を分析するための方法および自動分析装置に関する。本発明を、血液中のグルコースまたは他の分析物の濃度を測定するための方法および装置を具体的に参考にして本明細書において説明するが、本発明はこの用途に限定されるものではない。
【0002】
(背景技術)
我々の同時継続出願PCT/AU/00365、PCT/AU/00723およびPCT/AU/00724(これら出願の開示は本明細書の一部を構成する)において、我々は、キャリアー中の分析物の濃度を測定するための方法を記載している。この方法においては、分析すべき試料を、電気化学セルにおいて酵素およびレドックス(酸化還元)媒介物を含む試薬と接触させる。このセルは、2つの電極が実質的に同じ面積および予め決めた間隔を持つことを確実にするスペーサーにより、対の電極から離れて配置された作動電極を含む薄層セルである。これら電極間の間隔は、本質的に近接しており、電極間に電位がかけられた後に、対電極から反応生成物が作動電極におよびその反対に移動し、結果として電極間に定常状態濃度プロフィールが確立され、次いでこれが定常状態電流を与える。
【0003】
定常状態電流の測定値を、定常状態が達成される前の過渡電流において電流が変化する時間速度と比較することによって、レドックス媒介物の拡散係数ならびにその濃度を測定しうることがわかった。限定された時間範囲にわたって、時間(秒で測定)に対するln(i/iSS−1)のプロットは直線状であり、−4p2D/Lに等しい傾き(Sで示す)を持つことを示すことができる[ここで、iは時間tにおける電流であり、iSSは定常状態電流であり、Dは拡散係数(cm2/秒)であり、Lは電極間の距離(cm)であり、pは定数pi、約3.14159である]。電極間に電位がかけられたときに存在する減少した媒介物の濃度は、−2p2iSS/FALS[式中、Fはファラデー定数であり、Aは作動電極の面積であり、他の記号は上記の通りである]で与えられる。この後者の式はSを用いているので、拡散係数の測定値を含んでいる。
【0004】
Lおよび電極面積は所与のセルについては一定であるので、i(時間の関数として)およびiSSの測定によって、レドックス媒介物の拡散係数の値を算出すること、および分析物の濃度を測定することが可能になる。我々の同時継続出願PCT/AU/00724において、実質的に一定の電極距離Lおよび電極面積Aを有するセルの大量生産に適する方法が記載されている。
【0005】
現在、血液試料中のグルコースは、病理研究所などにおいて、YSI血液分析機などの装置により、銀および白金電極が装着された中空円筒状プローブを用いて連続試料を分析することによって測定されている。プローブの表面に3層の膜が取付けられている。中間の層は固定化酵素を含み、これが酢酸セルロースおよびポリカーボネート膜で挟まれている。膜で覆われたプローブの表面が、緩衝液を充填した試料チャンバー中に配置され、これに連続試料が注入される。試料の一部は膜を通って拡散する。この試料が固定化オキシダーゼ酵素と接触したときに、それが迅速に酸化され、過酸化水素が生成し、グルコースがグルコノ-δ-ラクトンを形成する。
【0006】
次いで、過酸化水素が白金陽極で酸化されて電子を生成する。過酸化物の生成および除去の速度が定常状態に到達したときに、動力学的平衡が達成される。電子の流れは、定常状態の過酸化物濃度に、従ってグルコースの濃度に直線的に比例する。
【0007】
白金電極は陽極電位に維持され、過酸化水素以外の多くの物質を酸化することができる。これらの還元剤がセンサー電流に寄与するのを防止するために、膜は、酢酸セルロースの極めて薄い膜からなる内部層を含んでいる。このフィルムは、過酸化水素を容易に通過させるが、約200を越える分子量を有する化合物を排除する。また酢酸セルロースフィルムは、白金表面を汚しうるタンパク質、洗浄剤および他の物質から白金表面を保護する。しかし、この酢酸セルロースフィルムは、硫化水素、低分子量メルカプタン、ヒドロキシアミン、ヒドロジン、フェノールなどの化合物および分析物によって通過されうる。
【0008】
使用時に、試料(または検量標準)はチャンバーに分配され、600μlの緩衝液に希釈され、次いでプローブによって測定が為される。センサーの反応が増加し、次いで定常状態に到達したときにプラトーに達する。数秒後に、緩衝液ポンプがチャンバーを洗い流し、センサーの反応が減少する。
【0009】
この装置はベースライン電流をモニターする。これが不安定であるときには、緩衝液ポンプは試料チャンバーを緩衝液で洗い流し続ける。安定なベースラインが確立されたときに、自動検量が開始される。この装置は、例えば、5試料または15分ごとにそれ自体を検量する。2%を越える差異が現在と以前の検量の間に生じたときに、この装置は検量を繰返す。また、試料チャンバー温度が1℃を越えて変動したときに、再検量が為される。
【0010】
この記載された装置は多くの欠点を有している。第1に、使用時に多くの時間が、分析よりむしろ検量を行う際に消費される。さらに、緩衝液および検量溶液の消費が大きなコストになる。別の欠点は、酵素膜が古くなるにつれて、読み値と濃度のグラフが非直線的になることである。改善された速度および効率で、および比較的低い運転コストで、上記種類の測定を行うことができる装置を提供することが非常に望ましいであろう。
【0011】
(発明の目的)
本発明の目的は、従来技術の欠点の少なくとも一部を回避または改善する、試料を自動分析するための改善された方法および装置である。本発明の好ましい態様の目的は、血液試料中のグルコース濃度を評価するための自動装置である。
【0012】
(発明の開示)
第1の態様によれば、本発明は、液体中の還元型(または酸化型)形態のレドックス種の濃度を評価するための方法であって、以下の工程を含んでなる方法にある:
(1)第1電極の領域を、予定した容量の液体試料と接触させ、
(2)この試料を、第1電極から離れて配置された第2電極の領域と接触させ、
(3)電位をかけたときに各電極において生成した反応生成物が他の電極に拡散するように充分に近接して配置したこれら電極の間に電位をかけ、
(4)時間の関数として電流変化の指標となる値および定常状態電流の指標となる値を測定または評価し、そして
(5)該容量、該時間の関数としての電流、および該定常状態電流から、液体試料中の還元型(または酸化型)形態の種の濃度を決定する。
【0013】
第2の態様によれば、本発明は、以下の成分を含んでなる自動分析装置にある:
・第1電極、
・第1電極と接触させる予定した容量の液体試料の小滴を入れるための手段、
・この小滴を、第1電極から離れて配置した第2電極と接触させるための手段、
・これら電極の間に電位をかけるための手段、および
・一方の電極において生成した反応生成物が他方の電極に拡散し、定常状態分布が達成されるように電極を充分に近接させて、時間の関数として電流を測定するための手段。
【0014】
本発明の種々の態様を、添付の図面を参照しながら、例示の目的のみで以下に説明する。
【0015】
(発明を実施するための最良の形態)
例示の目的で、本発明の第1の態様の装置を説明する。
図1を参照すると、血液試料中のグルコースを測定するための自動分析機が模式的に示されている。この装置は、好ましくはスパッター被覆によって例えば100〜1000Åの厚みで、柔軟性キャリアー3(例えば、100ミクロンのPETフィルム)上に形成または付着させたパラジウム層2からなる柔軟性の第1電極1を含んでなる。電極1は、テープの形態でロール(示されていない)によって分析機に供給される。
【0016】
第1電極1には、パラジウム表面2上に、酵素およびレドックス媒介物が供される。これらは、表1に挙げた系から選択することができる(これらに限定されない)。この例においては、GOD酵素およびフェリシアニド媒介物を用いる。これら酵素およびレドックス媒介物は、乾燥した試薬被覆4として第1電極の表面に、予定した間隔で予定した量でプリントすることができる。
【0017】
電極1を、図には示されていない手段によって、試料ステーション「S」を通るように動かし、このステーションにおいて、正確な容量の試料1を、例えば自動ピペットを用いて、電極表面1上の試薬被覆4上の小滴5として供する。好ましさは低いが、予定した量の酵素およびレドックス媒介物を、電極上への小滴の供給前または供給後に試料と混合することもできる。
【0018】
次いで、第2電極11(この例においては、第1電極と同様の構成であり、柔軟性PETキャリアー13上にスパッター被覆されたパラジウム層12を含んでなる)を、電極1と近接して配置された関係で供し、小滴5と接触させる。この小滴はパラジウム表面1および10の両方を濡らし、図2により明瞭に示すように、2つの電極の間で実質的に円筒状の立体配置を取る。この小滴は、電極1,2の中間が、液体/気体界面14を境界としている。
【0019】
次いで、電位を接触を介して2つの電極にかける(図1に示されていない手段による)。
【0020】
我々の同時継続出願PCT/AU96/00723およびPCT/AU96/00724に記載されているように、電極の間の電位は、還元型形態の種の電気酸化(または、酸化型形態の種の電気還元)の速度が拡散制御されるように設定する。作動電極および対電極が極めて近接して配置(約0.5mmまたはそれ未満の距離)されているので、対電極において生成するフェリシアニドは、作動電極に到達し、作動電極における電流に寄与する時間を有する。即ち、フェリシアニド分子は対電極においてフェロシアニドに還元され、次いで作動電極に拡散することができ、ここでフェリシアニドに再酸化されるであろう。この状況は、短時間の電流の減少と、より長い時間で一定値(定常状態電流)に到達して安定する結果を与える。この電流の安定化は、フェロシアニドの一定の流れが、対電極から作動電極に供給されるために生じる。この機構は、対電極におけるフェリシアニドの還元に起因するフェリシアニドが、観察される電流に影響を及ぼさないように電極が離れているコットレル(Cottrell)デバイスにおける機構とは全く異なっている。
【0021】
本発明に係るセルにおける定常状態電流は、次の式で与えられる:
【数1】
[式中、iSSは定常状態電流であり、Dは拡散係数であり、Fはファラデー定数であり、Aは電極面積であり、C0は分析物(フェリシアニド)の濃度であり、そして、Lは電極の距離である]。
【0022】
時間tにおける電流iは、次の式で与えられる:
【数2】
[式中、pはpiである]。
【0023】
さらに長い時間においては、式(2)中の高等指数項は無視することができる。従って、ある値より大きい時間に対しては、式(2)は、次の式(3)によって近似させることができる:
【数3】
【0024】
式(2)中の第2の指数項が第1の指数項の1%であるときに、式(2)を式(3)によって近似させうると仮定すると、式(3)は、t=0.0389L2/Dより大きい時間に対して有効である。
【0025】
式(3)を次の式に変換しうることは理解されるであろう:
【数4】
【0026】
従って、時間に対して式(4)の左側部分をプロットすると、次の式で示される傾き(slope)を有する直線が得られるであろう:
【数5】
【0027】
式(1)と式(5)を組合せると、次の式が得られる:
【数6】
[式中、V=ALは、テープ上にピペッティングした試料小滴の容量である]。
【0028】
パラメーター「傾き(slope)」および「iSS」は試験において測定され、そしてpおよびFは普遍定数であるので、試験から導かれる分析物の濃度(Co)を測定するためには、ピペッティングした試料の容量を知ることが必要になるのみである。これは極めて正確に行うことができるので、系の他のいずれかの検量を必要とすることなくCoを極めて正確に測定することができる。重要なことは、電極間の間隔および濡れた電極の面積のどちらも知る必要がないことである。
2つの電極と接触した小滴が取る正確な形状は重要ではない。
【0029】
所望により、連続した電極位置の化学が互いに異なるようにして、連続電極位置に分配した連続ピペッティング容量の試料により、複数の異なる試験を行うこともできる。試料ステーションSから上流の図1の部分に対応する図3に示すような第2の態様においては、第1電極に例えば薄いPETフィルムの上層7が供され、これにウエル8を規定するように開口部が開けられ、これに化学試薬4を入れることができ、そして、これが試薬を入れる位置を規定するようにおよび/または使用前に試薬を保護するように働く。この場合、電極1は、ロールの層の間に挟まれることによって使用前に汚染から保護され、そして乾燥した形態でウエル中に予め決めた量の化学試薬を有して、ロールから装置に通常のように供給される。この化学試薬は一度だけ使用されるものであり、従って、従来技術を用いて可能であったよりも品質低下からさらに容易に保護することができる。上記の態様においては、試料小滴5はセルにより「含まれて」いないが、それをウエル8内に入れ、その位置に留めることができる。ウエルを規定する層7を使用するときには、それを電極表面または電極キャリアーに接着させることができ、また、それを単に未接着のスペーサー層とすることができる。
【0030】
上部電極層11を、ウエルを規定する層7の上部表面と接触するようにする必要はない。ピペッティングされる試料の容量は、小滴5の高さが、ウエルを規定する層7の厚みに等しいか、または好ましくはその厚みより高くなるような量である。層7を用いてウエル8を規定するときには、試料容量がウエルの側部に流れるのは望ましくない。試料が既知の容量であり、両電極を濡らして好ましくはこれらの間に実質的に円筒状の形状を形成すれば充分である。
【0031】
また、ウエルを規定する層7を、多孔性の層、例えば多孔性紙、不織メッシュもしくはフェルトまたは多孔性膜で置換しうることも理解されるであろう。この多孔性の層は、試料を電極層に対して空間的に離れて固定化するように、および試薬をその場所に保持するように働く。この場合には、第2電極は、容量を固定化する多孔性層の表面と接触するであろう。
【0032】
多孔性またはウエル規定層7の使用が任意的であること、ならびに、本発明の他の態様においては、層7が、試料小滴を金属層2上にピペッティングするのにおよび上部金属層12を予定した容量の試料小滴と接触するようにするのに充分なものである必要がないことが理解されるであろう(上部金属層12は、下部金属層1から予め決めた間隔のところにあるのが望ましいが、必須ではない)。
【0033】
また、金属層のテープまたはバンドを同じ方向に移動させる必要がないことが理解されるであろう。例えば、一方の金属処理した電極層を他の電極層を横断して進行させることができる(各測定の後に、試料充填ステーションのところで新たな下部電極表面および新たな上部電極表面ならびに新たな試薬が出会うように、各テープを前進させる)。それぞれの場合に、電極を予定した容量の試料小滴と接触させながら、得られる電流を時間の関数として測定する。
【0034】
連続バンド電極が好ましい。これらは、使用後に廃棄するか、または、洗浄ステーションを通過させ、次いで所望により試薬を再プリントした後に再使用することができる。
【0035】
本発明の好ましい態様においては、予め決めた量の試薬を、計量デバイスによって、例えば試料ステーション3の上流のインクジェット・プリントヘッドによって、電極の一方または両方に配置し、試料と接触させる前に乾燥することができる(しかし、これは必要ではない)。試薬適用系が装置の一部であってもよく、また、この装置を、別の場所またはプラントにおいて所望の試薬で前処理されたロールまたは他の形態の電極を受入れるように適合させることもできる。
【0036】
一方または両方の電極が連続バンドである必要はなく、例えば、引込み型プローブの形態でありうることが理解されるであろう。第2電極は、第1電極上の小滴と接触するように下がり、次いで電流測定が完了した後に引込む使捨てプローブであることもできる。同様に、第1電極は、テープの形態である必要はない。第1電極は、例えば、回転式コンベヤーに載せるか、または回転式ディスクの形態であることができる。使捨ての電極表面を使用するのが好ましいが、連続使用の間に洗浄される再使用可能な電極を用いて本方法を実施することもできる。例示の目的で、第1水平軸の周りを回転して断続的に動く第1ディスクの形態にある第1電極1を含んでなる自動分析装置を、図4に模式的に示す。第2電極11は、第1軸に平行な水平軸の周りを回転して、第1ディスクと同時かつ断続的に動く。電極1および11は、最も近い接近点のところでその端部が離れて配置されている。正確に予定した容量の試料小滴5は、ディスク回転と同調してピペッティングデバイス6により、間隔をおいて第1電極に供給される。試薬4は、プリントロール16により対応する間隔で第2電極上にプリントされ、例えば送風機(図には示されていない)によりその場で乾燥される。
【0037】
使用時に、電極1が回転すると、小滴5が、第2電極およびその上にプリントされた試薬と接触するような位置に移動する。両方のディスクがそれぞれの電極と接触している小滴と共に静止しているときに、上記のように両電極の間に電位をかけ、電流を測定する。この時間中に、試薬が試料中に溶解し、そして必要な測定が行われた後に、両電極が新たな回転角のところに移動する。分析に使用された表面を、スプレー14によって洗浄し、排水溜め15に流し、再使用の準備を行う。
【0038】
本発明の装置は、YSIデバイスを用いたときに必要とされる量に比べて極めて少ない試料を必要とし、さらに、化学試薬を使用時までより良好に保護することができ、より正確に計量することができるので、本装置はより高い精度および速度を低コストで与える。
【0039】
本発明の別の態様においては、予定した時間または状態に到達するまで、両電極間に電位をかけた後に、電流を時間とともに追跡することができる。次いで、適用電位の符号を逆にし、上記と同様にして分析を行うことができる。ただし、式(3)および(4)を次の式で置換する:
【数7】
【数8】
【0040】
このプロトコールは、試験中に起こる遅い過程を許容することができるという利点を有する。これは、以下の工程によって行うことができる:
(a)電位を逆にする前に、電流が秒あたりの予定量未満に変化するのを待ち、測定に影響を与えるあらゆる遅い過程を実質的に完結させるか、または
(b)電位を逆にする前の時間による電流変化を用いて、遅い過程の生成を相殺する(予め規定した電極距離および面積を有するセルに関する我々の先の特許出願に記載されているように行う)。
【0041】
本発明をパラジウム電極を参考にして説明したが、これら電極は、他の適当な金属、例えば本明細書中に挙げた我々の先の出願に記載されている金属の電極であることができる。一方の電極は他方の電極とは異なることもできる。これら電極は、上で例示したようにPETによって、または他の適当な絶縁材料によって支持されていてよく、また、自己支持性であってもよい。絶縁フィルム上で支持するときには、金属をスパッター被覆によってフィルム上に付着させるのが好ましいが、これは必須ではない。電位適用および/または電流測定のための電気接点は、あらゆる適当な手段によることができる。これら手段には、電極の一方の末端とのクランプかみ合い(テープの形態にあるとき)が含まれ、適当な回転接触またはバネ押し接触などによることもできる。電位の適用;電流の測定;分析物濃度の算出;他方の電極、試料小滴の供給、および所望による試薬の供給に対する一方の電極の移動の同調制御は、マイクロプロセッサーなどによって行うことができ、これらの結果を、制御分野における当業者には周知である手段によって、プリント、表示、および/またはそれ以外の方法で記録することができる。
【0042】
本明細書中の教示から当業者には理解されるように、ある態様の特徴を他の態様と組合せることができ、本発明を、本明細書中に開示した概念から逸脱することなく他の形態に組立てことができる。
【0043】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明の第1態様の装置の断面を示す模式図である。
【図2】 2つの電極の間の試料小滴を拡大した断面で示す模式図である。
【図3】 本発明の第2態様の装置の断面を示す模式図である。
【図4】 本発明の第3態様の装置の側部立面を示す模式図である。
【図5】 図4の線5−5から見た、図4の態様の末端部立面を示す模式図である。
Claims (15)
- 液体中の還元型または酸化型形態のレドックス種の濃度を評価するための方法であって、以下の工程を含んでなる方法:
(1)第1電極の領域を、予定した容量の液体試料と接触させ、
(2)この試料を、第1電極から離れて配置された第2電極の領域と接触させ、
(3)電位をかけたときに各電極において生成した反応生成物が他の電極に拡散するように充分に近接して配置したこれら電極の間に電位をかけ、
(4)時間の関数として電流変化の指標となる値および定常状態電流の指標となる値を測定または評価し、そして
(5)該容量、該時間の関数としての電流、および該定常状態電流から、液体試料中の還元型または酸化型形態の種の濃度を決定する。 - 予定した容量の試料が、一方の電極に供給される小滴である請求項1に記載の方法。
- 小滴が、表面張力によって2つの電極の間に維持される請求項1または2に記載の方法。
- 少なくとも一方の電極が連続ストリップの形態にある請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも一方の電極に、少なくとも1つの試薬が予めプリントされる請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも一方の電極に、電極表面にウエルを規定するように働く層が被覆される請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 以下の成分を含んでなる自動分析装置:
・第1電極、
・第1電極と接触させる予定した容量の液体試料を入れるための手段、
・この試料を、第1電極から離れて配置した第2電極と接触させるための手段、
・これら電極の間に電位をかけるための手段、および
・一方の電極において生成した反応生成物が他方の電極に拡散し、定常状態分布が達成されるように電極を充分に近接させて、時間の関数として電流を測定するための手段。 - 容量が小滴である請求項7に記載の装置。
- 小滴が、電流測定時に電極表面の中間で気体/液体界面を境界としている請求項7に記載の装置。
- 予定した容量が、多孔性媒体に固定される請求項7または8に記載の装置。
- 少なくとも一方の電極がパラジウム層である請求項7〜10のいずれかに記載の装置。
- 少なくとも一方の電極が連続ストリップの形態にある請求項7〜10のいずれかに記載の装置。
- 少なくとも一方の電極が柔軟性基材上にある請求項7〜10のいずれかに記載の装置。
- 第1電極と接触させる予定した容量の試料を供給するためのピペットをさらに含んでなる請求項7〜13のいずれかに記載の装置。
- 一方の電極に試料を供給する前にこの電極に1またはそれ以上の試薬を供給するための手段をさらに含んでなる請求項7〜14のいずれかに記載の装置。
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