JP2006153704A

JP2006153704A - 電気化学測定用電極およびその製造方法ならびに電気化学バイオセンサー

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Publication number: JP2006153704A
Application number: JP2004345994A
Authority: JP
Inventors: Katsuyoshi Hayashi; 勝義林; Tomoko Seyama; 倫子瀬山; Gen Iwasaki; 弦岩崎; Akiyuki Tate; 彰之館
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 2004-11-30
Filing date: 2004-11-30
Publication date: 2006-06-15
Anticipated expiration: 2024-11-30
Also published as: JP4089975B2

Abstract

【課題】測定対象物質の電極上への拡散を阻害せず、夾雑物質のみの拡散を制御することのできる、或いは、測定対象物質の測定電位と夾雑物質の測定電位を分離させることのでき、かつ密着性の良い電極修飾膜を提供する。
【解決手段】電気化学測定用の電極３本体の表面に、有機固体材料をターゲットとして高周波スパッタ法により作製された高分子薄膜４が修飾されていることを特徴とする。電極本体上に、固体の高分子Ａの上に、前記高分子Ａと異なる分子構造を有する高分子Ｂ溶液を展開し乾燥させた複合材料をターゲットとして用い、高周波スパッタで前記電極３本体上に高分子膜４を形成することを特徴とする。
【選択図】図１

Description

本発明は電気化学測定用電極およびその製造方法ならびに電気化学バイオセンサーに関する。

電気化学測定法は、生体分子の濃度を簡便かつ感度良く測定できることから、電気化学式のバイオセンサーの研究が盛んに行われている。電気化学バイオセンサーは、人を含む動物の血液や体液中の電気化学活性を有する測定対象物質をそのまま、あるいは電気化学活性の内物質については生体触媒である酵素などで電気化学活性を持つ物質に変換したのち、電極上で直接酸化あるいは還元することで検出する技術の総称である。

生体試料内には電気化学活性を有する物質が多く存在し、測定対象物質の測定電位で反応する、或いは、酵素−電子移動メディエーター複合電極の電子移動を阻害するものが存在するため、測定対象物質からのみ得られる応答を得ることが困難である。このような測定上妨害となる物質（以下、このような物質を夾雑物質と総称）には、Ｌ−アスコルビン酸、尿酸などがある。

これらの影響を除去するための方法として、電極上を高分子膜で修飾する方法が挙げられる。これまで高分子膜には、ナフィオン膜や過剰に酸化したポリピロール膜（過酸化ポリピロール膜）、ポリアニリン膜、ポリイオンコンプレックス膜などが用いられてきた。

ナフィオン膜ではスルホン酸基を、過酸化ポリピロール膜ではカルボキシル基を有し、静電反発によりＬ−アスコルビン酸や尿酸のようなアニオン性分子が電極上へ拡散するのを抑制することができる（非特許文献１）。ポリイオンコンプレックス膜では、分子サイズの違いを利用して、アニオン性分子が電極上に拡散するのを抑制することができる（非特許文献２）。
Ｍ．Ｎ．ＳｚｅｎｔｉｒｍａｙａｎｄＣ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８４，５６，１８９８−１９０２Ｓ．Ｙａｂｕｋｉ，Ｆ．Ｍｉｚｕｔａｎｉ，Ｙ．Ｈｉｒａｔａ，ＳｅｎｓｏｒｓａｎｄＡｃｔｕａｔｏｒｓＢ７６（２００１）１４２−１４６

拡散制御膜として、ナフィオンを用いた場合では、ナフィオン膜が、高分子溶液を展開し、有機溶媒を乾燥させて形成することから、有機溶媒の揮発後に残る高分子膜内部のポアのサイズが比較的大きく、アニオン性夾雑物も簡単に拡散することから、十分な拡散制御効果を得るために必要な厚さとして、数μｍオーダーの膜厚で形成する必要があった。

その結果、測定対象物質が電極に到達するための拡散距離も大きくなり、測定感度が低下するという問題があった。また、電極本体との密着性が良くないため、長期安定性に欠けるという問題点がある。また過酸化ポリピロール膜においても、非常に薄い状態で形成されることから、測定対象物質の濃度が高い場合には、測定妨害物質存在下でも測定が可能であるが、測定対象物質の濃度が低い場合には、その選択検出は達成されていない。

以上のように、生体分子の高感度、あるいは高選択検出には、測定対象物質の電極上への拡散を阻害せず、夾雑物質のみの拡散を制御することのできる、或いは、測定対象物質の測定電位と夾雑物質の測定電位を分離させることのでき、かつ密着性の良い電極修飾膜を必要とする。

上述の課題を解決するため、本発明による電気化学測定用電極は、電気化学測定用の電極本体の表面に、有機固体材料をターゲットとして高周波スパッタ法により作製された高分子薄膜が修飾されていることを特徴とする。

更に本発明による電気化学測定用電極の製造方法は、電極本体上に、固体の高分子Ａの上に、前記高分子Ａと異なる分子構造を有する高分子Ｂ溶液を展開し乾燥させた複合材料をターゲットとして用い、高周波スパッタで前記電極本体上に微細なグレインが高密度に凝縮した構造を有する高分子膜を形成することを特徴とする。

また、本発明による電気化学バイオセンサーは、試料を流通させるための流路とこの流路を流れる試料に接するように設けられた請求項１による電気化学測定用電極と、前記電極の参照電極、対向電極とを備えたことを特徴としている。

本発明による高分子膜修飾電極（電気化学測定用電極）およびそれを用いたバイオセンサーは、カチオン性或いはノニオン性分子を測定対象とする際に妨害となるＬ−アスコルビン酸や尿酸などアニオン性分子を排除できるという特徴を有する。このため、生体内物質、或いは細胞から放出される物質を選択性良く測定することができるという効果を有する。

本発明によれば、生体内レベルの中性溶液中でアニオン性を呈する官能基を密度の高い状態で含み、反応電極との密着性が高く、膜厚制御性に優れた拡散制御膜を提供する。

本発明による電気化学測定用電極は、電極基板上に有機固体材料をターゲットに高周波スパッタ法により作製した高分子薄膜を形成したものである。

前記電極基板は、基板上に電気化学測定用の電極本体を設けた構造になっており、たとえばガラスなどの基板１上にチタン２及び金３の電極本体の薄膜をスパッタにより形成したものを例として挙げることができる（図１参照）。この際、前記電極本体に電極パターンを設けておくこともできる。

このような電極基板の電極本体表面に、有機固体材料をターゲットに高周波スパッタ法により作製した高分子薄膜を設ける。

有機固体材料をターゲット材料とした高周波スパッタ法は、ターゲット材料の基本構造をもつ薄膜を、ターゲット材料に比べて元素密度が高く、基板材への密着良い膜を、優れた膜厚制御性を持って形成できる方法である。

たとえばバルク高分子材料（有機固体材料：Ａ高分子）の上に、高分子溶液（Ｂ高分子）を展開し溶媒を乾燥させて作製したターゲット材料を作製する。次いでこのターゲット材料を用いた高周波スパッタにより、Ａ、Ｂ両高分子に起因するプラズマ中に放出された粒子が、プラズマ環境下の反応により結合し、さらに電極基板上に析出することで、前記電極基板の電極本体表面に高分子薄膜として形成される。また、高エネルギー粒子となったモノマーが前記基板と衝突して膜形成に寄与することから、前記基板との密着性が高い複合高分子の薄膜が形成できる。

このようなＡ高分子としては、たとえば炭化水素高分子を使用することができ、前記高分子Ｂとしては、カチオン交換基を有する高分子、たとえばフッ化物高分子を使用することができる。更に具体的には、炭化水素高分子としてポリエチレン、フッ化物高分子としてナフィオンを使用することができる。

さらに、前記電極本体に修飾される前記高分子膜としては、アミノ酸類、核酸塩基類、生体ゲル類等を例として挙げることができる。しかしながら、これに限定されるものではない。

たとえば、前述のようなアニオン性のナフィオンを高周波スパッタ法のターゲットとして適用することで、アニオン性官能基を有し、密着性の高い、適度な膜厚を持つ薄膜材料を開発し、これを反応電極本体上に形成して、電気化学測定用電極を構成することができる。

このような高分子膜に、酵素を固定し、前記修飾高分子膜の性質を変性させ、前記修飾高分子膜と異なる夾雑物質を拡散させるような高分子膜とすることができる。たとえば、グルコース酸化酵素を前記高分子膜に固定し、グルコースを電気化学活性をもつ物質に変化させ、前記物質を酸化させて測定を行うことができる。この場合他の物質（夾雑物質）の反応は、前記電極で行われない。

本発明による電気化学バイオセンサーは、上述のような電気化学測定用電極を使用するものである。本発明による電気化学バイオセンサーは、図２に示すように、試料２１を流通させるための流路１６とこの流路１６に接するように設けられた本発明による電気化学測定用電極１３と、前記電極の対向電極１２と参照電極（銀ペースト）１５とを備えたことを特徴としている。

このような電気化学バイオセンサは、前記流路１６に試料２１を導入するに先立って（したがって、試料の流れに対し、流路１６の上流に）、試料２１をマイクロダイアリシスプローブ２０あるいはガラスキャピラリーを通過させた構造の電気化学バイオセンサーを製造することが可能である。このようなマイクロダイアリシスプローブ２０あるいはガラスキャピラリーを流路の上流に設けることによって応答の劣化を防止することができる。

以下、図面を参照して本発明の実施例を詳細に説明する。尚、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

本発明による電気化学測定用修飾電極の模式図および測定システムを図１に示す。本電気化学用修飾電極に用いる電極本体として、金を用いた。ガラス基板１上に、チタン２および電極本体である金３をスパッタし、電極基板とした。この電極基板上に高周波スパッタ装置を用いて有機プラズマ薄膜４を作製した。

この際、高周波スパッタのターゲットは下記のように製造した。まずターゲット材料の基板となる円盤状バルク高分子材料の表面に、前処理として希ガスを用いたエッチング処理を実施した。次に、ポリエチレン円盤（円盤状バルク高分子材料）（直径１３．５ｍｍφ、厚さ１５ｍｍ）の中央部、直径５０ｍｍの範囲にナフィオンのイソプロピルアルコール溶液を展開し、大気環境下で溶媒成分を揮発させた。円盤状高分子であるポリエチレンの基本骨格は、ＣＨ_３−（ＣＨ＝ＣＨ）_ｘ−ＣＨ_３であり、一方、円盤上に展開された高分子であるナフィオンの基本構造は、−［（ＣＦ_２ＣＦ_２）_ｎ−Ｃ＝ＣＦ−（ＯＣＦ_２ＣＦ（ＣＦ_３））_ｍＯＣＦ_２ＣＦ_２ＳＯ_３Ｈ］_ｘ−である。

作製された高分子薄膜の膜厚を測定したところ、約１００ｎｍであった。またＳＥＭによる観察からは、１００ｎｍ以下のグレインが高密度に凝集した構造が認められた。

これをダイシングソー（ディスコＤＡＤ５２１）を用いて切断し、縦４０ｍｍ、幅１０ｍｍに加工した。作用電極として用いるために、切断した粘着シート５を用いて、直径３ｍｍの円形電極６とした。また、粘着シートで覆われていない部分を端子接続用のパッド７とした。本電気化学測定用修飾電極は、銀／塩化銀参照電極８、対向電極９（白金）とともに、溶液１０中に浸漬させた。本実施例において用いた試料は、リン酸緩衝溶液を用いて調製した。これらの電極は、ポテンシオスタット１１（ＡＬＳＭｏｄｅｌ１０００）に接続した。

はじめに、リン酸緩衝液中に浸漬させ、自然電位を測定し、高分子膜により電極と溶液との間が絶縁されていないことを確認した。次に、１０μＭのドーパミン溶液を用いて、サイクリックボルタンメトリーを行った。電位掃引範囲を−０．２〜０．８Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌに、電位掃引速度を１０ｍＶ／ｓに設定した。その結果、０．３Ｖ付近に酸化電流のピークが観測され、そのときの電流値は約２５０ｎＡだった。その後電位が大きくなるに従い、徐々に電流値は低下した。続いて、１０μＭのアスコルビン酸溶液を用いて同様な実験を行ったところ、電位が増加しても電流値は増加しなかった。この結果は、カチオン性分子であるドーパミンなどのカテコールアミン類は検出でき、アニオン性分子であるＬ−アスコルビン酸は検出できないことを示している。

比較実験として、金電極を用いて同様な測定を行ったところ、１μＭのドーパミンから得られた電流値は、約２５０ｎＡであり、本発明による電極と同じ電流値を示した。一方、同濃度のＬ−アスコルビン酸から得られた電流値は約２００ｎＡであった。さらに、カーボン電極にナフィオン膜を塗布し、同様の測定を行ったところ、１μＭのＬ−アスコルビン酸からは応答が得られなかったものの、１μＭのドーパミンから得られた電流値は約２２０ｎＡであった。

また、金電極上に微小電極パターンを形成した後に、有機プラズマ薄膜を形成したものを用いて同様な測定を行った場合では、電極を微小アレイ化したことにより、電流密度を約２０倍に向上し、電極を高分子膜で修飾しない場合と比べて同等のＳ／Ｎが得られた。これは、高分子薄膜の膜厚が１００ｎｍと薄く、測定対象物質であるドーパミンの拡散を阻害しないためである。

以上より、本発明による電気化学測定用電極は、測定対象物質であるカテコールアミン類に対する感度を阻害せず、Ｌ−アスコルビン酸の共存下において選択的に検出することができる。

実施例１と同様な修飾電極（電気化学測定用電極）を作製し、以下の実験を行った。本実施例では、測定用試料としてリン酸緩衝液に代えて塩化ナトリウム溶液を用いた。はじめに、塩化ナトリウム溶液中に浸漬させ、自然電位を測定し、高分子膜により電極と溶液との間が絶縁されていないことを確認した。次に、１０μＭのドーパミン溶液を用いて、サイクリックボルタンメトリーを行った。電位掃引範囲を−０．２〜０．８Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌに、電位掃引速度を１０ｍＶ／ｓに設定した。その結果、０．１Ｖ付近に酸化電流のピークが観測され、そのときの電流値は約２５０ｎＡだった。その後電位が大きくなるに従い、徐々に電流値は低下した。

続いて、１０μＭのアスコルビン酸溶液を用いて同様な実験を行ったところ、電位が増加するのに従い電流値は増加し、０．３Ｖ付近に酸化電流のピークが観測された。そのときの電流値は、約１００ｎＡであった。この結果より、塩化ナトリウム溶液を試料調製用の溶液として用いることにより、ドーパミンとＬ−アスコルビン酸の酸化電位を分けることが可能であることが分かった。

以上より、本発明による電気化学測定用電極は、カテコールアミン類、Ｌ−アスコルビン酸の酸化電位を分離することができ、Ｌ−アスコルビン酸の影響を受けずにカテコールアミン類を選択的に検出することができる。

実施例１と同様な有機プラズマ薄膜修飾電極を作製し、有機プラズマ薄膜上にグルコース酸化酵素を固定した電気化学測定用電極を作製した。１ｍＭのグルコース、Ｌ−アスコルビン酸の混合溶液をリン酸緩衝溶液を用いて調製し、その溶液中に電極を挿入して電気化学測定を行った。印加電位は、６００ｍＶとした。グルコース濃度は、グルコース酸化酵素により、過酸化水素が生成されるため、この過酸化水素を酸化することにより観測された電流値より定量される。測定の結果、約１００ｎＡの応答電流値が得られた。また、グルコースのみを測定した場合でも約１００ｎＡの応答電流が得られた。

一方、比較として、有機プラズマ薄膜未修飾電極では、約２００ｎＡの電流値が得られた。有機プラズマ薄膜を持たない電極の方が、応答電流が高かったのは、Ｌ−アスコルビン酸も電極上で反応してしまったためであると考えられ、酵素反応を介して測定することができる物質に対しても、本発明の高分子薄膜修飾電極は有効である。

図２にマイクロダイアリシスプローブが接続され、高分子薄膜修飾電極が搭載されたチップ型センサーの見取り図を示す。本センサーは、二枚のガラス基板からなっており、一方のガラス基板には、三つの金薄膜電極本体１２、１３、１４が形成されている。電極１３を検出用電極として用いることとし、高分子薄膜をスパッタ法により形成する際には、本発明の実施例１の電極１３以外の電極本体１２、１４を被覆した。電極１４には、銀ぺースト１５（藤倉化成）を塗布し、参照電極として用いた。もう一方の基板には、幅１ｍｍ、深さ５０μｍの流路１６が両面テープ１７により形成されており、かつ試料導入用チューブ１８、排出用チューブ１９が接続されている。これら二つの基板は、両面テープ１７により接着されている。

次にマイクロダイアリシスプローブ２０を試料導入用チューブ１８と接続した。試料２１には、馬の血清中に０．１ｍＭのドーパミン、およびドーパミンとＬ−アスコルビン酸をそれぞれ０．１ｍＭになるように混合した試料を用いた。また、リン酸緩衝液をシリンジ２２に入れ、シリンジポンプ２３を用いて、流速２μｌ／ｍｉｎ．で送液した。測定電位は参照電極に対して０．２Ｖとした。

はじめに血清にドーパミンのみを混合した試料を測定したところ、応答電流は２００ｎＡであった。次に血清にドーパミンとＬ−アスコルビン酸を混合した試料を測定したところ、血清にドーパミンのみを混合した試料から得られた応答とほぼ同じ電流値が得られた。これは、Ｌ−アスコルビン酸の酸化電位が貴な電位にシフトし、０．２Ｖでは酸化されにくいためであると考えられる。また、長時間測定した場合でも、応答の劣化が認められなかった。これは、マイクロダイアリシスプローブを接続したことにより、タンパク質が電気化学バイオセンサーに導入されず、その電極上への吸着が抑制されたためであると考えられる。

以上により、本発明による高分子薄膜修飾電極をマイクロダイアリシスプローブと接続したオンラインセンサーに応用することにより、血液試料に存在する分子をＬ−アスコルビン酸やタンパク質の影響を受けずに測定することができる。

本願は、電気化学バイオセンサーの測定対象物以外の物質を除去するための電極修飾膜を、アニオン性のナフィオンをターゲットとした高周波スパッタ法によって製造することで、生体内レベルの中性溶液中でアニオン性を呈する官能基を密度の高い状態で含み、反応電極との密着性が高く、膜厚制御性に優れた、膜を得ることを特徴とする。

本発明による電気化学測定用修飾電極の模式図および測定システムを示す図。マイクロダイアリシスプローブが接続され、高分子薄膜修飾の本発明による電気化学測定用電極が搭載されたチップ型の電気化学バイオセンサーの見取り図。

符号の説明

１ガラス基板
２チタン
３金
４有機プラズマ薄膜
５粘着シート
６円形電極
７パッド
８参照電極
９対向電極
１１ポテンシオスタット
１２金薄膜電極
１３金薄膜電極
１４金薄膜電極
１５銀ぺースト
１６流路
１７両面テープ
１８試料導入用チューブ
１９排出用チューブ
２０マイクロダイアリシスプローブ
２１試料
２２シリンジ
２３シリンジポンプ

Claims

電気化学測定用の電極本体の表面に、有機固体材料をターゲットとして高周波スパッタ法により作製された高分子薄膜が修飾されていることを特徴とする電気化学測定用電極。
前記電極本体表面に、電極パターンが形成されていることを特徴とする請求項１記載の電気化学測定用電極。
前記ターゲットは、固体の高分子Ａの上に、前記高分子Ａと異なる分子構造を有する高分子Ｂ溶液を展開し乾燥させたものであることを特徴とする請求項１または２記載の電気化学測定用電極。
前記高分子Ａは高分子炭化水素であり、前記高分子Ｂはカチオン交換基を有する高分子であることを特徴とする請求項３記載の電気化学測定用電極。
前記高分子Ｂはナフィオンであり、前記高分子Ａはポリエチレンである請求項３または４記載の電気化学測定用電極。
前記電極本体上に修飾された高分子薄膜が、アミノ酸類、核酸塩基類、生体ゲル類のいずれかであることを特徴とする請求項１または２記載の電気化学測定用電極。
前記電極本体に酵素が固定化された高分子薄膜が積層されていることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の電気化学測定用電極。
固体の高分子Ａの上に、前記高分子Ａと異なる分子構造を有する高分子Ｂ溶液を展開し乾燥させたターゲットとして用い、高周波スパッタで電極本体上に微細なグレインが高密度に凝縮した構造を有する高分子膜を形成することを特徴とする電気化学測定用電極の製造方法。
試料を流通させるための流路とこの流路を流れる試料に接するように設けられた請求項１による電気化学測定用電極と、前記電極の参照電極、対向電極とを備えたことを特徴とする電気化学バイオセンサー。
前記流路に試料を導入するに先立ってマイクロダイアリシスプローブあるいはガラスキャピラリーを通過するようにしたことを特徴とする請求項９記載の電気化学バイオセンサー。