RU2256171C2

RU2256171C2 - Электрохимическая тестирующая полоска для применения при определении содержания анализируемого вещества

Info

Publication number: RU2256171C2
Application number: RU2002113054/28A
Authority: RU
Inventors: Йеунг Сиу Ю (US); Йеунг Сиу Ю; Махеш ШАХ (US); Махеш ШАХ
Original assignee: Лайфскен, Инк.
Priority date: 2000-02-02
Filing date: 2001-01-25
Publication date: 2005-07-10
Also published as: CZ20022946A3; DE60140600D1; AR027347A1; MXPA02005796A; CN1394278A; RU2002113054A; WO2001057238A2; JP2003524162A; IL149661A0; ES2334883T3; PL358134A1; AU778966B2; CA2388272A1; KR20020077407A; HK1050047A1; EP1254365B1; AU2005201227B2; EP1254365A2; KR100856342B1; AU2005201227A1

Abstract

Электрохимические тестирующие полоски, являющиеся предметом изобретения, находят применение при определении широкого разнообразия анализируемых веществ, при этом они особенно подходят для применения с целью определения глюкозы. Сущность: предложены электрохимические тестирующая полоска и способ ее применения при определении анализируемого вещества, например глюкозы, в физиологическом образце, например крови. Тестирующие полоски имеют реакционную зону, ограниченную противоположными металлическими электродами, разделенными тонким разделительным слоем. Металлическая поверхность, по меньшей мере, одного из электродов модифицирована однородным модифицирующим поверхность слоем, изготовленным из линейных самособирающихся молекул, имеющих первую сульфгидрильную концевую группу и вторую сульфонатную концевую группу, разделенные короткоцепочечной алкильной соединительной группой, причем в определенных вариантах реализации предпочтительна 2-меркаптоэтансульфоновая кислота или ее соль. Также предложен набор для применения при определении анализируемого вещества в физиологическом образце, который включает описанные выше электрохимические тестирующие полоски. Технический результат изобретения: сохранение прочности и свойств при хранении, снижение степени помех при электрохимических измерениях и снижение времени затекания. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил.

Description

Введение

Область изобретения

Областью данного изобретения является определение содержания анализируемого вещества, в частности электрохимическое определение содержания анализируемого вещества, а более конкретно, электрохимическое определение содержания анализируемых веществ в крови.

Предшествующий уровень техники

Определение содержания анализируемого вещества в физиологических жидкостях, например в крови или в продуктах, полученных из крови, представляет собой все более важную проблему для сегодняшнего общества. Количественные анализы используются во многих сферах, включая лабораторные клинические исследования, исследования в домашних условиях и т.д., где результаты таких исследований играют важную роль в диагностике и лечении множества заболеваний. Интересующие анализируемые вещества включают глюкозу для лечения сахарного диабета, холестерин и им подобные. В ответ на это растущее значение выявления анализируемых веществ было разработано множество методик и устройств для выявления анализируемых веществ для использования и в клинических, и в домашних условиях.

Один вид способов, которые применяются для выявления анализируемых веществ, представляет собой электрохимические способы. В таких способах водный жидкий образец помещают в реакционную зону в электрохимической ячейке, включающей два электрода, т.е. электрод сравнения и рабочий электрод, причем электроды имеют импеданс, который делает их пригодными для амперометрического измерения. Анализируемому компоненту дают возможность вступать в непосредственную реакцию с электродом либо непосредственно или опосредованно с окислительно-восстановительным реагентом с образованием окисленного (или восстановленного) вещества в количестве, соответствующем концентрации анализируемого компонента или анализируемого вещества (аналита). Затем электрохимическим способом оценивают количество окисленного (или восстановленного) вещества и соотносят с количеством анализируемого вещества, присутствующего в исходном образце.

В электрохимических детекторах анализируемых веществ, используемых для осуществления описанных выше способов, часто желательно модифицировать поверхность металлических электродов с тем, чтобы она была гидрофильной. Для модификации поверхностей металлических электродов было разработано множество различных методик. Однако такие электроды с модифицированной поверхностью имеют тенденцию ограниченного срока хранения, ограничивая, таким образом, их возможные сферы применения.

Имеется неослабевающий интерес к выявлению новых способов модификации поверхностей металлических электродов для применения при электрохимическом выявлении анализируемых веществ. Особый интерес представила бы разработка способа, который бы привел к созданию гидрофильной поверхности, устойчивой к хранению, которая бы обеспечила быстроту затекания и не мешала бы электрохимическим измерениям электрода.

Литература, относящаяся к проблеме

Представляющие интерес патентные документы США включают: 5834224; 5942102 и 5972199. Другие представляющие интерес патентные документы включают WO 99/49307; WO 97/18465 и GB 2304628. Другие представляющие интерес ссылки включают: Dalmia et al., J.Electroanalytical Chamistry (1997) 430:205-214; Nakashima et al., J.Chem.Soc. (1990) 12:845-847; и Palacin et al., Chem.Mater. (1996) 8:1316-1325.

Сущность изобретения

Предложены электрохимические тестирующие полоски и способы их применения при определении анализируемого вещества, например глюкозы, в физиологическом образце, например крови. Тестирующие полоски, являющиеся предметом изобретения, имеют реакционную зону, ограниченную противоположными металлическими электродами, разделенными тонким разделительным слоем. Металлическая поверхность, по меньшей мере, одного из электродов модифицирована однородным модифицирующим поверхность слоем, изготовленным из линейных самособирающихся молекул, имеющих первую сульфгидрильную концевую группу и вторую сульфонатную концевую группу, разделенные короткоцепочечной алкильной соединительной группой, причем в определенных вариантах реализации предпочтительна 2-меркаптоэтансульфоновая кислота или ее соль. Обсуждаемые электрохимические тестирующие полоски находят применение при определении широкого разнообразия анализируемых веществ, и они особенно подходят для применения при определении глюкозы.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 и 2 предоставляют изображение электрохимической тестирующей полоски в соответствии с предметом изобретения.

Фиг.3 предоставляет анализ угла контакта различных металлических электродов, обработанных цистином, через различные периоды времени после обработки.

Фиг.4 предоставляет анализ времени затекания различных металлических электродов, обработанных цистином, через различные периоды времени после обработки.

Фиг.5А и 5В предоставляют анализ угла контакта различных металлических электродов, обработанных 2-меркаптоэтансульфоновой кислотой (МЭСК), через различные периоды времени после обработки.

Фиг.6 предоставляет анализ времени затекания различных металлических электродов, обработанных МЭСК, через различные периоды времени после обработки.

Фиг.7 предоставляет сравнение времени затекания различных электродов, покрытых цистином и МЭСК.

Описание определенных вариантов реализации

Предложены электрохимические тестирующие полоски для применения при определении анализируемого вещества в физиологическом образце. В обсуждаемых тестирующих полосках два противоположных металлических электрода, разделенные тонким разделительным слоем, ограничивают реакционную зону. Определяющим признаком обсуждаемых тестирующих полосок является то, что, по меньшей мере, один из металлических электродов имеет поверхность, которая модифицирована модифицирующим поверхность слоем, составленным из линейных молекул, имеющих сульфгидрильную концевую группу и сульфонатную концевую группу, разделенные соединительной группой из низшего алкила. В реакционной зоне присутствуют окислительно-восстановительные реагенты, содержащие фермент и медиатор. Предложены также способы применения обсуждаемых тестирующих полосок при определении анализируемого вещества, например при определении содержания глюкозы. При дальнейшем описании предмета изобретения сначала будут описаны электрохимические тестирующие полоски с последующим более глубоким обзором способов, являющихся предметом изобретения, для применения тестирующих полосок при определении анализируемых веществ.

Перед дальнейшим описанием обсуждаемого изобретения следует понимать, что изобретение не ограничено определенными описанными ниже вариантами реализации изобретения, поскольку могут вноситься изменения в определенные варианты реализации, но они все же подпадают под объем притязаний прилагаемой формулы изобретения. Следует также понимать, что используемая терминология применяется с целью описания определенных вариантов реализации, а не предназначена для ограничения. Вместо этого объем притязаний настоящего изобретения будет установлен прилагаемой формулой изобретения.

До тех пор, пока в контексте ясно не предписывается иное, в данном описании и прилагаемой формуле изобретения ссылки в единственном числе включают множественное число. До тех пор, пока не определено иным образом, все технические и научные

термины, используемые здесь, имеют такое же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области, для которого предназначено данное изобретение.

Электрохимические тестирующие полоски

Как кратко обобщено выше, электрохимические тестирующие полоски обсуждаемого изобретения изготовлены из двух противоположных металлических электродов, разделенных тонким разделительным слоем, причем эти компоненты ограничивают реакционную зону, в которой расположена система окислительно-восстановительного реагента. Изображение электрохимической тестирующей полоски в соответствии с предметом изобретения представлено на фиг.1 и фиг.2. В частности, на фиг.1 представлено перспективное изображение с пространственным разделением деталей электрохимической тестирующей полоски 10, которая составлена из рабочего электрода 12 и электрода сравнения 14, разделенных разделительным слоем 16, имеющим вырез 18, который ограничивает реакционную зону в полоске в сборе. На фиг.2 показана та же тестирующая полоска в собранном виде. Каждый из указанных выше элементов, т.е. рабочий электрод и электрод сравнения, разделительный слой и реакционная зона, теперь описаны более подробно.

Электроды

Как указано выше, обсуждаемые электрохимические тестирующие полоски включают рабочий электрод и электрод сравнения. В целом, рабочий электрод и электрод сравнения сконфигурированы в форме удлиненных прямоугольных полосок. Типичная длина электродов находится в диапазоне от около 1,9 до 4,5 см, обычно от около 2 до 2,8 см. Ширина электродов находится в диапазоне от около 0,38 до 0,76 см, обычно от около 0,51 до 0,67 см. Электроды сравнения обычно имеют толщину в диапазоне от около 10 до 100 нм, а обычно от около 18 до 22 нм. В определенных вариантах реализации длина одного из электродов короче, чем длина другого электрода, причем в определенных вариантах реализации она короче приблизительно на 0,32 см.

Рабочий электрод и электрод сравнения, кроме того, отличаются тем, что, по меньшей мере, поверхность электродов, которая обращена к реакционной зоне в полоске, представляет собой металл, причем металлы, представляющие интерес, включают палладий, золото, платину, серебро, иридий, углерод, легированный индием оксид олова, нержавеющую сталь и им подобные. Во многих вариантах реализации металл представляет собой золото или палладий. Хотя в принципе весь электрод может быть изготовлен из металла, каждый из электродов обычно изготовлен из инертного опорного материала, на поверхности которого присутствует тонкий слой металлического компонента электрода. В этих более общих вариантах реализации толщина инертного материала подложки обычно находится в диапазоне от около 51 до 356 мкм, обычно от около 10 до 153 мкм, в то время как толщина металлического слоя обычно находится в диапазоне от около 10 до 100 нм, а обычно от около 20 до 40 нм, например, в виде напыленного металлического слоя. В электродах, являющихся предметом изобретения, может использоваться любой удобный инертный материал подложки, причем обычно этот материал представляет собой жесткий материал, который способен обеспечить структурную опору электрода и, в свою очередь, электрохимической тестирующей полоски в целом. Подходящие материалы, которые могут использоваться в качестве подложки, включают пластики, например полиэтилентерефталат, полиэтиленгликоль-терефталат, полиимид, поликарбонат, полистирол, силикон, керамику, стекло и им подобные.

Тестирующие полоски, являющиеся предметом изобретения, кроме того, отличаются тем, что, по меньшей мере, одна из металлических поверхностей электродов, а в некоторых вариантах реализации обе металлические поверхности электродов, которые обращены, т.е. граничат с или ограничивают реакционную зону, имеют присутствующий на них модифицирующий поверхность слой. Модифицирующий поверхность слой представляет собой однородный слой самособирающихся молекул, который делает поверхность устойчиво гидрофильной в плане устойчивости при хранении. Более конкретно, модифицирующий поверхность слой должен придать поверхности низкий угол контакта, типично в диапазоне от около 10 до 30, а обычно от около 15 до 25°, и быстрое затекание, например, от 0,5 до 2, а обычно от около 1 до 2 с, даже после длительного периода времени пребывания при повышенной температуре, например даже после 7-14 дней при температуре от около 4 до 56°С.

Под “однородным” подразумевается, что модифицирующей поверхность слой изготовлен из одного и того же типа молекул. Другими словами, все самособирающиеся молекулы в модифицирующем поверхность слое идентичны. В целом самособирающаяся молекула, которая составляет модифицирующий поверхность слой, представляет собой линейную молекулу, имеющую сульфгидрильную концевую группу и сульфонатную концевую группу, разделенные соединительной группой низшего алкила. Используемый здесь термин “сульфонатная концевая группа” относится и к остатку сульфокислоты, а также к сульфонатной части, которая может быть связана с катионом, например натрием, как обнаруживается в сульфонатной соли. Алкильная соединительная группа в общем имеет длину в диапазоне от около 1 до 8, обычно от 1 до 6 атомов углерода, и может включать, а может не включать один или несколько участков ненасыщения, но в целом представляет собой насыщенную молекулу. В определенных вариантах реализации количество атомов углерода в алкильной соединительной группе находится в диапазоне от около 1 до 4, а часто от около 1 до 3, причем метиленовые и этиленовые соединительные группы являются обычными в этих вариантах реализации.

Во многих вариантах реализации молекула, которая составляет самособирающийся модифицирующий поверхность слой, представляет собой молекулу формулы:

HS-(CH₂)_n-SO₃Y,

в которой: n представляет собой целое число от 1 до 6; a Y представляет собой Н или катион.

Особый интерес во многих вариантах реализации обсуждаемого изобретения представляют модифицирующие поверхность слои, составленные из 2-меркаптоэтансульфоновой кислоты (МЭСК) или ее соли, например из 2-меркаптоэтансульфоната натрия.

Описанные выше рабочий электрод и электрод сравнения могут быть изготовлены с использованием любой удобной последовательности операций. Репрезентативная последовательность операций включает изготовление металлических электродов сначала напылением металлического слоя достаточной толщины на поверхность инертного материала подложки. Затем электрод (электроды), поверхность которого предстоит подвергнуть модификации, или, по меньшей мере, металлическая поверхность, которую предстоит подвергнуть модификации, для получения модифицирующего поверхность слоя контактирует с жидкой композицией, например водным органическим раствором самособирающихся молекул. Контакт может быть достигнут любым удобным способом, включая покрытие в погружной ячейке, граверное впечатывание электрода в композицию. Концентрация самособирающихся молекул в жидкой композиции типично находится в диапазоне от около 0,5 до 1%, обычно от около 0,05 до 0,5% и обычнее от около 0,05 до 0,3%. Контакт поддерживается в течение достаточного периода времени для того, чтобы образовался монослой, например в течение периода времени в диапазоне от около 0,5 до 3 мин, обычно от около 0,5 до 2 мин, с последующей сушкой поверхности электрода для использования в обсуждаемых электрохимических тестирующих полосках. Более подробный репрезентативный способ изготовления предоставлен ниже, в экспериментальном разделе.

Разделительный слой

Отличительный признак обсуждаемых электрохимических тестирующих полосок состоит в том, что рабочий электрод и электрод сравнения, как описано выше, обращены друг к другу и разделены только небольшим расстоянием так, что расстояние между рабочим электродом и электродом сравнения в реакционной зоне (области) электрохимической тестирующей полоски крайне маленькое. Этот минимальный промежуток между рабочим электродом и электродом сравнения в обсуждаемых тестирующих полосках является результатом присутствия тонкого разделительного слоя, расположенного или помещенного в виде прослойки между указанными электродами. Толщина этого разделительного слоя в целом находится в диапазоне от около 1 до 500 мкм, обычно от около 102 до 153 мкм. Разделительный слой разрезан таким образом, чтобы обеспечить реакционную зону или область, по меньшей мере, с одним впускным каналом, проникающим в реакционную зону, и также в целом выпускным каналом из реакционной зоны. Репрезентативная конфигурация разделительного слоя изображена на фиг.1 и 2. Хотя на этих чертежах разделительный слой показан как имеющий круговую реакционную область с вырезанными боковыми впускным и выпускным отверстиями или каналами, возможны другие конфигурации, например квадратные, треугольные, прямоугольные, имеющие неправильную форму реакционные зоны и т.д. Разделительный слой может быть изготовлен из любого удобного материала, причем репрезентативные подходящие материалы включают полиэтилентерефталат, полиэтиленгликольтерефталат, полиамид, поликарбонат и им подобные, причем поверхности разделительного слоя могут быть обработаны таким образом, чтобы обладать силой сцепления в отношении соответствующих им электродов и, посредством этого, поддерживать структуру электрохимической тестирующей полоски. Особый интерес представляет применение в качестве разделительного слоя штампованной двухсторонней клеевой полоски.

Реакционная зона

Обсуждаемые электрохимические тестирующие полоски включают реакционную зону, которая ограничена рабочим электродом, электродом сравнения и разделительным слоем, причем эти элементы описаны выше. В частности, рабочий электрод и электрод сравнения ограничивают верх и низ реакционной зоны, в то время как разделительный слой ограничивает стенки реакционной зоны. Объем реакционной зоны составляет, по меньшей мере, 0,1 мкл, обычно, по меньшей мере, 1 мкм, а обычнее, по меньшей мере, 1,5 мкл, причем объем может достигать 10 мкл или более. Как упомянуто выше, реакционная зона в целом включает, по меньшей мере, впускной канал, а во многих вариантах реализации также включает выпускной канал. Площадь поперечного сечения впускного и выпускного каналов может варьировать до тех пор, пока она достаточно велика для обеспечения эффективного входа или выхода жидкости из реакционной зоны, но в целом находится в диапазоне от около 9×10^-5 до 5×10^-3 см², обычно от около 1,3×10^-3 до 2,5×10^-3 см².

В реакционной зоне присутствует система окислительно-восстановительного реагента, причем система реагента обеспечивает наличие вещества, которое определяется электродом, и поэтому используется для получения концентрации анализируемого вещества в физиологическом образце. Система окислительно-восстановительного реагента, присутствующая в реакционной зоне, обычно включает, по меньшей мере, фермент (ферменты) и медиатор. Во многих вариантах реализации ферментный элемент (элементы) системы окислительно-восстановительного реагента представляет собой фермент или множество ферментов, которые работают совместно для окисления представляющего интерес анализируемого вещества. Другими словами, ферментный компонент системы окислительно-восстановительного реагента изготовлен из одного фермента, окисляющего анализируемое вещество, или из комплекта из двух или более ферментов, которые работают совместно для окисления представляющего интерес анализируемого вещества. Представляющие интерес ферменты включают оксидазы, дегидрогеназы, липазы, киназы, диафоразы, хинопротеины и им подобные.

Конкретный фермент, присутствующий в реакционной зоне, зависит от определенного анализируемого вещества, для определения которого предназначена электрохимическая тестирующая полоска, причем репрезентативные ферменты включают: глюкозооксидазу, глюкозодегидрогеназу, холестеринэстеразу, холестериноксидазу, липопротеинлипазу, глицеринкиназу, глицерин-3-фосфатоксидазу, лактатоксидазу, лактатдегидрогеназу, пируватоксидазу, алкогольоксидазу, билирубиноксидазу, уриказу и им подобные. Во многих предпочтительных вариантах реализации, при которых представляющим интерес анализируемым веществом является глюкоза, ферментный компонент системы окислительно-восстановительного реагента представляет собой фермент, окисляющий глюкозу, например глюкозооксидазу или глюкозодегидрогеназу.

Второй компонент системы окислительно-восстановительного реагента представляет собой медиаторный компонент, который изготовлен из одного или нескольких медиаторных агентов. В данной области известны разнообразные медиаторные агенты, которые включают: феррицианид, феназинэтосульфат, феназинметосульфат, фенилендиамин, 1-метокси-феназинметосульфат, 2,6-диметил-1,4-бензохинон, 2,5-дихлоро-1,4-бензохинон, производные ферроцена, осмиево-бипиридиловые комплексы, рутениевые комплексы и им подобные. В тех вариантах реализации, при которых представляющим интерес анализируемым веществом является глюкоза, а ферментные компоненты представляют собой глюкозооксидазу или глюкозодегидрогеназу, медиатором, представляющим особый интерес, является феррицианид. Другие реагенты, которые могут присутствовать в реакционной зоне, включают буферные агенты, например, цитраконат, цитрат, фосфат, “Хорошие” буферы “Good” buffers и им подобные.

Система окислительно-восстановительного реагента в целом присутствует в сухой форме. Количества различных компонентов могут варьироваться, причем количество ферментного компонента обычно находится в диапазоне от около 0,1 до 10% мас.

Способы

Обсуждаемое изобретение также предлагает способы применения обсуждаемых электрохимических тестирующих полосок для определения концентрации анализируемого вещества в физиологическом образце. С использованием обсуждаемых электрохимических тестирующих полосок можно определить множество различных анализируемых веществ, причем репрезентативные анализируемые вещества включают глюкозу, холестерин, лактат, спирт и им подобные. Во многих предпочтительных вариантах реализации обсуждаемые способы используются для определения концентрации глюкозы в физиологическом образце. Хотя в принципе обсуждаемые способы могут применяться для определения концентрации анализируемого вещества во множестве различных физиологических образцов, таких как моча, слезная жидкость, слюна и им подобные, они особенно подходят для применения при определении концентрации анализируемого вещества в крови или фракциях крови, а более конкретно, в цельной крови.

При осуществлении обсуждаемых способов первый этап представляет собой внесение количества физиологического образца в реакционную зону тестирующей полоски, причем электрохимическая тестирующая полоска описана выше. Количество физиологического образца, например крови, которое вносится в реакционную зону тестирующей полоски, может варьироваться, но в целом оно находится в диапазоне от около 0,1 до 10 мкл, обычно от около 1 до 1,6 мкл. Образец может вноситься в реакционную зону с использованием любой удобной последовательности операций, причем образец может вноситься в реакционную зону инжекцией, ему может быть предоставлена возможность затечь в реакционную зону и тому подобное, в зависимости от того, что может быть удобным.

После внесения образца в реакционную зону производят электрохимическое измерение с использованием электрода сравнения и рабочего электрода. Производимое электрохимическое измерение может варьироваться в зависимости от конкретной природы анализа и устройства, с которым применяется электрохимическая тестирующая полоска, например, в зависимости от того, является ли анализ кулонометрическим, амперометрическим или потенциометрическим. В целом, при электрохимическом измерении измеряется заряд (кулонометрическое измерение), ток (амперометрическое измерение) или потенциал (потенциометрическое измерение), обычно в течение данного периода времени после внесения образца в реакционную зону. Способы проведения описанного выше электрохимического измерения, кроме того, описаны в патентах США №№ 4224125; 4545382 и 5266179, а также в WO 97/18465; WO 99/49307, описания которых включены сюда в качестве ссылки.

После определения электрохимического сигнала, генерируемого в реакционной зоне, как описано выше, количество анализируемого вещества, присутствующее в образце, внесенном в реакционную зону, определяется соотнесением электрохимического сигнала с количеством анализируемого вещества в образце. При осуществлении этого вычисления измеренный электрохимический сигнал обычно сравнивают с сигналом, генерируемым рядом ранее полученных контрольных или стандартных величин, и определяют на основании этого сравнения. Во многих вариантах реализации этапы измерения электрохимического сигнала и этапы получения концентрации анализируемого вещества, как описано выше, выполняются автоматически устройствами, предназначенными для работы с тестирующей полоской, с целью получения величины концентрации анализируемого вещества в образце, нанесенном на тестирующую полоску. Репрезентативное устройство считывания для автоматического осуществления этих этапов, в котором пользователю нужно только приложить или внести образец в реакционную зону, а затем считать с устройства окончательный результат определения концентрации анализируемого вещества, дополнительно описано в одновременно рассматриваемой заявке на патент США под № 09/333793, поданной 15 июня 1999, описание которой включено сюда в качестве ссылки.

Наборы

Обсуждаемое изобретение предоставляет также наборы для применения при осуществлении обсуждаемых способов. Как описано выше, обсуждаемые наборы, по меньшей мере, включают электрохимическую тестирующую полоску с, по меньшей мере, одним металлическим электродом с модифицированной поверхностью. Обсуждаемые наборы могут, кроме того, включать средство для получения физиологического образца. Например, когда физиологическим образцом является кровь, обсуждаемые наборы могут, кроме того, включать средство для получения образца крови, такое как ланцет для прокола пальца, средство для приведения ланцета в действие и им подобные. Кроме того, обсуждаемые наборы могут включать контрольный раствор, например контрольный раствор глюкозы, который содержит стандартизированную концентрацию глюкозы. Как описано выше, в определенных вариантах реализации наборы также включают автоматизированное устройство для определения электрохимического сигнала с использованием электродов после внесения образца и соотнесения определенного сигнала с количеством анализируемого вещества в образце. Наконец, наборы включают инструкции для применения обсуждаемых электрохимических тестирующих полосок при определении концентрации анализируемого вещества в физиологическом образце. Эти инструкции могут присутствовать на одной или нескольких упаковках, на листовках-вкладышах, в контейнерах, присутствующих в наборах, и им подобных.

Следующие примеры приводятся в качестве иллюстрации, а не в виде ограничения.

Экспериментальные примеры

I. Изготовление электрохимических тестирующих полосок

А. Изготовление электрохимических тестирующих полосок, обработанных МЭСК

(0,1)1% раствор 2-меркаптоэтансульфоновой кислоты (МЭСК) получают растворением 1,00 г МЭСК (TCI, Catalog#M0913) в 999 г воды, пропущенной через миллипоровые фильтры Milli-Q. Золотые и палладиевые листы получают напылением на полиэфирную подложку толщиной 7 мкм золота или палладия так, что получают поверхностный металлический слой толщиной от 100 до 500 ангстрем. После получения этих золотых и палладиевых заготовочных рулонов выкраивают листы размером 12×8,5 дюймов (30,48 см ×21,59 см). Листы затем погружают в 1% раствор МЭСК на 1 мин. Затем покрытый лист сушат на воздухе в течение 1 ч и испытывают на угол контакта с использованием гониометра и воды, как описано ниже в процедуре А в приложении А, для того, чтобы удостовериться в том, что угол контакта составляет <20°.

Затем из указанных выше золотых и металлических листов вырезают тестирующие полоски, имеющие размеры 0,2×1,2 дюйма (0,5×3,0 см), и используют их для изготовления электрохимических тестирующих полосок следующим образом. Золотую полоску и палладиевую полоску используют для заключения между ними (“сэндвичевания”) штампованной двухсторонней полоски, покрытой приклеивающимся при надавливании клеем, имеющей толщину 0,005 дюйма (1,27) мм и круговую штампованную область, которая ограничивает реакционную зону, впускной и выпускной каналы при помещении между слоями золотой и металлической полосок, как показано на фиг.1 и 2. Сухой реагент, состоящий из буфера, медиатора, фермента и веществ, придающих объем, наносят струей на палладиевый электрод перед “сэндвичеванием” конструкции с двухсторонним клеевым материалом.

В. Изготовление электрохимических тестирующих полосок, обработанных цистином

Электрохимические тестирующие полоски, обработанные цистином, изготавливают в соответствии со стандартной промышленной последовательностью операций.

II. Характеристика электрохимических тестирующих полосок, обработанных цистином

А. Угол контакта

Угол контакта обработанных цистином золотых и палладиевых тестирующих полосок определяют с помощью воды и гониометра, как описано ниже в процедуре В в Приложении А. Угол контакта определяют через различные периоды времени после обработки поверхности, т.е. 0, 7 и 14 дней после обработки, и при различных температурах хранения, например при комнатной температуре и при 56°С. Результаты представлены на фиг.3.

В. Время затекания

Время затекания обработанных цистином золотых и палладиевых тестирующих полосок определяют, как описано ниже в процедуре С в Приложении А. Время затекания определяют через различные периоды времени после обработки поверхности, т.е. 0, 7 и 14 дней после обработки, и при различных температурах хранения, например при комнатной температуре и при 56°С. Результаты представлены на фиг.4.

III. Характеристика электрохимических тестирующих полосок, обработанных МЭСК

А. Угол контакта

Угол контакта обработанных МЭСК золотых и палладиевых тестирующих полосок (обработанных при рН 5,4 и 11,5) определяют с помощью воды и гониометра, как описано ниже в процедуре В в Приложении А. Угол контакта определяют через различные периоды времени после обработки поверхности, т.е. 0, 7 и 14 дней после обработки, и при различных температурах хранения, например при комнатной температуре и при 56°С. Результаты представлены на фиг.5А (рН 5,4) и 5В (рН 11,5).

В. Время затекания

Время затекания обработанных МЭСК золотых и палладиевых тестирующих полосок (обработанных при рН 5,4 и 11,5) определяют, как описано ниже в процедуре В в Приложении А. Время затекания определяют через различные периоды времени после обработки поверхности, т.е. 0, 7 и 14 дней после обработки, и при различных температурах хранения, например при комнатной температуре и при 56°С. Результаты представлены на фиг.6.

IV. Сравнительное исследование времени затекания

Сравнивают время затекания трех различных электрохимических тестирующих полосок, изготовленных, как описано выше. Первая электрохимическая тестирующая полоска (наблюдение А) была полоской, в которой и золотая, и палладиевая поверхности были обработаны цистином. Вторая электрохимическая тестирующая полоска (наблюдение В) была полоской, в которой и золотая, и палладиевая поверхности были обработаны МЭСК. Третья электрохимическая тестирующая полоска (наблюдение С) была полоской, в которой палладиевая поверхность была обработана цистином, а золотая поверхность была обработана МЭСК. Величины времени затекания определяли, как описано ниже в процедуре С в Приложении А, на полосках, хранившихся во флаконах SureStep® при 56°С в течение 7 и 14 дней, и результаты представлены на фиг.7.

Представленные выше результаты демонстрируют, что обсуждаемое изобретение предоставляет значительно усовершенствованные электрохимические тестирующие полоски для применения при определении содержания анализируемого вещества в исследуемом образце. В частности, предоставлены устойчивые при хранении электрохимические тестирующие полоски, имеющие прочные и длительно сохраняющие свои свойства гидрофильные поверхности, которые проявляют низкую степень помех электрохимическому измерению окисленных веществ и имеют короткое время затекания. Кроме того, модифицирующие поверхность реагенты, используемые для модификации поверхности обсуждаемых тестирующих полосок, не имеют запаха. Обсуждаемое изобретение как таковое представляет собой значительный вклад в данную область.

Все публикации и патенты, приведенные в данном описании, включены в него в качестве ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или патент были конкретно и отдельно указаны как включенные в качестве ссылки. Каждая публикация приводится для ее раскрытия перед датой подачи, и она не должна рассматриваться как допущение того, что настоящее изобретение не дает право на предвосхищение такой публикации на основании предшествующего изобретения.

Хотя раскрытое выше изобретение было описано с определенной подробностью в виде иллюстрации и примера в целях ясности и понимания, для средних специалистов в данной области совершенно очевидно в свете положений данного изобретения, что в него могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности или объема притязаний прилагаемой формулы изобретения.

Приложение А

Процедура А

Процедура обработки поверхности для пластиков, металлизированных золотом и палладием

Материалы:

1. Стекло “Пирекс” размером с противень 4Q (26,67 см ×37,465 см ×5,715 см)

2. Вода, пропущенная через фильтр Milli-Q

3. Секундомер

4. Золотые и палладиевые листы размером 30,48 см ×21,59 см

Химические вещества:

2-меркаптоэтансульфоновая кислота, натриевая соль.

Производитель TCI

Каталог #MO0913

Степень очистки: 99%

Молекулярная масса 164,18

Процедура:

0,1% (масс./масс.) МЭСК

1. Отвесить 1,000 (±0,0005) г 2-меркаптоэтансульфоновокислого натрия в бумаге для взвешивания.

2. Отвесить 999,0 ((±0,1) г воды, пропущенной через фильтр Milli-Q, в стеклянный лабораторный стакан.

3. Медленно добавить в лабораторный стакан порошок МЭСК. Дать ему полностью раствориться.

Обработка поверхности:

4. Отрезать от рулона листы золота и палладия (размером 30,48 см ×21,59 см).

5. Медленно вылить содержимое лабораторного стакана на противень.

6. Покрыть один за другим металлические листы с металлическим слоем, обращенным к днищу противня. Удостовериться в том, что лист полностью покрыт раствором. Использовать секундомер для контроля времени покрытия (1 мин/лист).

7. Время сушки около 1 ч.

8. Гониометром проверить угол контакта металлизированной пленки с водой. Угол контакта для золотой и палладиевой поверхности должен быть <20°.

Процедура В

Измерение угла контакта с использованием гониометра Rame-Hart

Материалы:

1. Золотые и палладиевые листы, покрытые МЭСК

2. Гониометр Rame-Hart Модель - 1000-00-115

3. Автоматизированное пипеточное устройство

4. Программное обеспечение RHI 2001

Процедура:

Используя воду, заполнить Автоматизированное пипеточное устройство. Поместить образец (Au/Pd) на платформу для образца и зафиксировать зажимом. Открыть программу RHI 2001 и установить исходный уровень. Накапать от 3 до 5 мкл воды из Автоматизированного пипеточного устройства. Система RHI 2001 захватывает изображение и измеряет угол контакта с обеих сторон и усредняет их. Это можно повторить несколько раз.

Процедура С

Измерение времени затекания

Материал:

1. Тестирующие полоски, обработанные МЭСК

2. Свежая кровь с гематокритом, доведенным до 70%

3. Пипетка 20 мкл

4. Кусочки парафилма для нанесения крови

5. Камера “Panasonic” модель GP KP222

6. Программное обеспечение Adobe Premiere 4,2 для фиксации видеоизображения

7. Компьютерное устройство и монитор

8. Двухсторонняя клеющаяся лента и платформа для полоски

Процедура:

1. Поместить полоску на платформу и фиксировать ее лентой.

2. Поместить полоску под линзы камеры и настроить фокус и увеличение.

3. Запустить программу Premiere и открыть программу фиксации кинокадров. Выбрать для фиксации динамической киносъемки систему 30fps NTSC.

4. Поместить 5 мкл крови с 70% гематокритом на поверхность парафилма.

5. Включить режим записи и внести кровь с каждой стороны тестирующей полоски в капилляр.

6. Выключить режим записи, когда кровь достигнет другого конца тестирующей полоски.

7. Перейти к окну изображения и проанализировать его. Использовать отметку “включено”, когда кровь соприкоснется с полоской, и отметку “выключено”, когда кровь соприкоснется с другим концом. Программа производит рамочный подсчет (30 рамок/сек) и представляет на дисплее в нижнем окне.

8. Для расчета времени затекания нужно разделить количество рамок на 30.

9. Повторить процедуру для N полосок.

Claims

1. Электрохимическая тестирующая полоска, включающая в себя

(a) реакционную зону, ограниченную противоположными рабочим электродом и электродом сравнения, разделенными с помощью разделительного слоя, причем, по меньшей мере, один из указанных первого и второго электродов имеет поверхность, модифицированную однородным модифицирующим поверхность слоем, выполненным из самособирающихся молекул, имеющих первую сульфгидрильную концевую группу и вторую сульфонатную концевую группу, причем указанные сульфгидрильная и сульфонатная концевые группы разделены соединительной группой низшего алкила; и

(b) систему окислительно-восстановительного реагента, присутствующую в указанной реакционной зоне, причем указанная система окислительно-восстановительного реагента включает в себя, по меньшей мере, один фермент и медиатор.

2. Электрохимическая тестирующая полоска по п.1, отличающаяся тем, что, по меньшей мере, один из указанных электродов включает в себя металл, выбранный из группы, состоящей из золота, палладия, платины, серебра, иридия, углерода, легированного индием оксида олова и нержавеющей стали.

3. Электрохимическая тестирующая полоска по п.1 или 2, отличающаяся тем, что самособирающиеся молекулы имеют формулу

HS-(CH₂)_n-SO₃Y,

в которой n представляет собой целое число от 1 до 6; a Y представляет собой Н или катион.

4. Электрохимическая тестирующая полоска по любому из пп.1, 2 или 3, отличающаяся тем, что указанный, по меньшей мере, один фермент включает в себя окисляющий фермент.

5. Электрохимическая тестирующая полоска по п.4, отличающаяся тем, что указанный окисляющий фермент представляет собой фермент, окисляющий глюкозу.

6. Электрохимическая тестирующая полоска по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что указанная самособирающаяся молекула представляет собой 2-меркаптоэтансульфоновую кислоту или ее соль.

7. Электрохимическая тестирующая полоска по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что указанная реакционная зона имеет объем от около 0,1 до 10 мкл.

8. Способ определения концентрации анализируемого вещества в физиологическом образце, причем указанный способ включает в себя этапы, на которых

(a) прикладывают указанный физиологический образец к электрохимической тестирующей полоске по любому из пп.1-7;

(b) определяют электрический сигнал в указанной реакционной зоне с использованием указанных металлических электродов и

(c) соотносят указанный электрический сигнал с количеством указанного анализируемого вещества в указанном образце.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанное анализируемое вещество представляет собой глюкозу.

10. Набор для применения при определении концентрации анализируемого вещества в физиологическом образце, причем указанный набор включает

(a) электрохимическую тестирующую полоску по любому из пп.1-7; и

(b) по меньшей мере, одно из:

(i) средство для получения указанного физиологического образца и

(ii) стандарт анализируемого вещества.