ES2313352T3 - Ensamblaje de liposomas para uso terapeutico y/o diagnostico. - Google Patents

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ES2313352T3 ES05749164T ES05749164T ES2313352T3 ES 2313352 T3 ES2313352 T3 ES 2313352T3 ES 05749164 T ES05749164 T ES 05749164T ES 05749164 T ES05749164 T ES 05749164T ES 2313352 T3 ES2313352 T3 ES 2313352T3
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Abstract

Composición para uso diagnóstico o terapéutico que comprende un ensamblaje que comprende: - un liposoma que lleva una primera carga global neta y que tiene una envolvente límite con superficies interior y exterior respectivas, definiendo dicha envolvente una porción interior del mismo; y - una pluralidad de componentes micelares, que comprenden un compuesto de mejora de imágenes y que llevan una segunda carga global neta de signo opuesto a dicha primera carga neta, estando dichos componentes micelares asociados con la superficie exterior de la envolvente de dicho liposoma por una interacción sustancialmente electrostática.

Description

Ensamblaje de liposomas para uso terapéutico y/o diagnóstico.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una nueva composición de liposomas que contiene un agente activo para uso terapéutico y/o diagnóstico, a un método de fabricación de la misma y a un kit farmacéutico que comprende dicha composición. La invención se refiere adicionalmente a un método para aumentar la cantidad de un agente activo asociable a un liposoma y a un método para aumentar el tiempo de residencia de vesículas de liposoma en la circulación sanguínea. En particular, la presente invención puede encontrar aplicaciones ventajosas en el campo de la Formación de Imágenes por Resonancia Magnética (MRI).
Antecedentes de la invención
Los liposomas son bien conocidos en el campo terapéutico o diagnóstico como vehículos adecuados para agentes activos, tales como compuestos terapéuticos y/o diagnósticos. Se han propuesto diversas composiciones basadas en liposomas que contienen agentes activos, en particular para aquellos agentes que tienen una semi-vida corta en el torrente sanguíneo. Por ejemplo, la Patente US 6.143.321 describe liposomas que contienen una preparación micelar atrapada en el espacio interior de los mismos, comprendiendo dicha preparación micelar un agente activo agregado con un agente tensioactivo lipídico para formar una micela.
La producción de imágenes diagnósticas con empleo de agentes capaces de mejorar las imágenes que pueden obtenerse con técnicas diferentes de formación de imágenes (conocidos como "agentes de contraste" o "agentes de mejora de imágenes") ha llegado a ser también una práctica adoptada con carácter generalizado.
Por ejemplo, productos yodados, tales como Iopamidol® o Iomeprol® (Bracco Imaging S.p.A.), se emplean de modo generalizado en el análisis por rayos X con contraste, en particular rayos X de tomografía computerizada (CT), mientras que compuestos que contienen iones paramagnéticos talos como ProHance® o MultiHance® (Bracco Imaging), se emplean en gran escala en el análisis MRI.
Entre las diversas propiedades de mejora de imágenes, algunas de las que son probablemente más deseables son una alta capacidad de mejora de imágenes y un tiempo de residencia suficientemente largo de las mismas en el sistema, tejido u órgano relevante a visualizar. Por esta razón, se han dedicado muchos esfuerzos en el pasado a mejorar estas dos propiedades de los agentes de contraste.
Por ejemplo, la Patente US 6.217.849 describe una suspensión acuosa de liposomas para producción de imágenes por rayos X o NMR que tiene capacidad mejorada de mantenimiento en la circulación sanguínea.
La Patente US 5.387.410 sugiere la utilización de un liposoma para llevar un quelato de ion paramagnético dentro o fuera de la superficie exterior del mismo, con objeto de obtener una imagen NMR mejorada de un órgano seleccionado.
La Patente US 5.833.948 propone la incorporación de quelatos de iones paramagnéticos en estructuras micelares que comprenden un agente tensioactivo no iónico, para mejorar las propiedades de los mismos en el conjunto de la sangre.
La Patente US 5.827.533 describe liposomas que contienen agentes activos agregados con agentes tensioactivos lipídicos.
La Patente US 5.756.069 se refiere al problema de aumentar la concentración de un agente sensible a MRI en vehículos, tales como liposomas, para proporcionar una imagen útil. Se describen compuestos formadores de poliquelatos que son capaces de fijar una pluralidad de iones paramagnéticos y que comprenden un anclaje soluble en lípidos para fijar el compuesto a un liposoma o una micela.
Adicionalmente, pueden utilizarse también compuestos mejoradores de imágenes en combinación con compuestos de direccionamiento (que permiten enlazar el compuesto mejorador de la imagen con un sitio diana específico - v.g. un tejido, un órgano o células específicas - a fin de mejorar selectivamente la imagen del mismo) y/o con agentes terapéuticos (v.g. que pueden ser liberados en un sitio, tejido u órgano correspondiente después de visualización del mismo).
Sumario de la invención
La Solicitante ha encontrado ahora un nuevo ensamblaje para uso diagnóstico y/o terapéutico en el cual una pluralidad de micelas pueden asociarse con la superficie exterior de un liposoma. La asociación se efectúa por una interacción sustancialmente electrostática. Con este nuevo ensamblaje, es posible o bien enlazar una cantidad sustancial de un compuesto activo a un solo liposoma, aumentar el tiempo de residencia de dicho liposoma en el torrente sanguíneo o, de acuerdo con un aspecto preferido de la invención, obtener un agente de contraste con propiedades mejoradas de formación de imágenes y circulación prolongada en la sangre.
Un primer aspecto de la invención se refiere por tanto a una composición para uso diagnóstico o terapéutico que comprende un ensamblaje que lleva un agente activo, en donde dicho ensamblaje comprende:
- un liposoma que lleva una primera carga global neta y que tiene una envolvente límite con superficies interior y exterior respectivas, definiendo dicha envolvente una porción interior del mismo; y
- una pluralidad de componentes micelares, que comprenden un compuesto de mejora de imágenes y que llevan una segunda carga global neta de signo opuesto a dicha primera carga neta, estando dichos componentes micelares asociados con la superficie exterior de la envolvente de dicho liposoma por una interacción sustancialmente electrostática.
De acuerdo con la presente invención, el término "agente activo" incluye dentro de sus significados cualquier agente terapéutico o diagnóstico como se define más adelante en esta memoria. Dicho agente activo puede estar asociado con el liposoma (v.g. disuelto o dispersado en la fase acuosa interior y/o incorporado en la envolvente límite), con las micelas (v.g. como un compuesto formador de micelas) o con ambos.
Cuando se hace referencia a un ensamblaje de la invención, el término "interacción sustancialmente electrostática" significa que la interacción principal capaz de asociar de manera estable el liposoma y las micelas es la interacción electrostática (o iónica) determinada por las cargas opuestas negativa y positiva en los dos componentes respectivos.
La Solicitante ha observado en particular que la presencia de compuestos específicos en el componente micelar puede permitir aumentar sustancialmente el tiempo de residencia de los liposomas asociados con dichas micelas en el torrente sanguíneo. De acuerdo con una realización preferida, dicho componente micelar comprende un compuesto polímero anfifílico. Preferiblemente, dicho compuesto polímero anfifílico es un agente tensioactivo polímero o un fosfolípido que lleva un resto polímero hidrófilo. Alternativamente, o además de lo anterior, dicho componente micelar puede comprender ácidos biliares o derivados de los mismos, o lisofosfolípidos.
La Solicitante ha observado adicionalmente que es posible aumentar sustancialmente la cantidad de un agente activo cuando el componente micelar que contiene dicho agente activo está asociado con un liposoma en un ensamblaje de la invención. Esto es particularmente interesante cuando el ensamblaje está enlazado a un sitio de direccionamiento, donde el mismo puede incorporar localmente una cantidad incrementada de agente activo.
Una aplicación ventajosa de este descubrimiento es la mejora de la respuesta de producción de imágenes de un compuesto mejorador de imágenes (v.g. un compuesto sensible a MRI, por ejemplo un quelato con gadolinio), por empleo de un ensamblaje en el cual las micelas incluyen dicho compuesto mejorador de la formación de imágenes, en particular cuando el componente mejorador de las imágenes está asociado con un ligando de direccionamiento, que está direccionado a un sitio biológico o patológico específico. Por ejemplo, se ha determinado que micelas que contienen un complejo lipídico de gadolinio contienen típicamente alrededor de 500 átomos de Gd. Así, una micela que contiene un agente de direccionamiento puede proporcionar al menos 500 átomos de Gd para mejora de la imagen cuando se une a un sitio de direccionamiento respectivo. Por otra parte, la Solicitante ha observado que al menos aproximadamente 5000 micelas pueden estar asociadas con la superficie exterior de un liposoma de 1 \mum de diámetro para formar un ensamblaje; así, cuando dicho ensamblaje se une al mismo sitio direccionado, asociará algo así como aproximadamente 2.500.000 (500 x 5.000) átomos Gd con un solo sitio diana, lo cual es claramente una cantidad mucho mayor que el número de átomos Gd asociables al mismo sitio diana por una sola micela.
Un aspecto preferido de la invención se refiere por tanto a una composición como se ha definido anteriormente, en la cual el agente activo está comprendido en el componente micelar.
Preferiblemente, dicho agente activo es un compuesto mejorador de imágenes, más preferiblemente un compuesto sensible a MRI, en particular un ion metálico paramagnético.
En una realización preferida, dicho ensamblaje comprende adicionalmente un ligando de direccionamiento, incluido preferiblemente en el componente micelar. En una realización preferida adicional, está incluido también en el liposoma un agente activo.
Figuras
Las Figuras 1, 1a y 1b son representaciones esquemáticas de un ensamblaje de la invención y de los componentes respectivos del mismo;
las Figuras 2-4 son gráficos que ilustran la estabilidad en la circulación sanguínea de los ensamblajes de la invención;
las Figuras 5-7 son gráficos que comparan la circulación sanguínea de los ensamblajes de la invención con respecto a los liposomas;
las Figuras 8a y 8b son imágenes de ensayos in vitro.
Descripción detallada de la invención
La Figura 1 muestra una representación esquemática en corte transversal de un ensamblaje de acuerdo con la invención. Dicho ensamblaje comprende un liposoma (11) de forma sustancialmente esférica asociado con una pluralidad de micelas (12), y sumergido en un vehículo líquido fisiológicamente aceptable adecuado (v.g. solución salina). El liposoma comprende una envolvente lipídica (13) que define la porción interior llena de líquidos (14) del mismo, que puede comprender opcionalmente un agente activo (10). Fig. 1a muestra una porción de la envolvente liposómica (13), que en esta realización específica está formada por una bicapa lipídica. En dicha realización, los lípidos que forman la envolvente son fosfolípidos neutros (15), fosfolípidos cargados positivamente (16) y colesterol (17). La micela ilustrada en la realización específica de Fig. 1b comprende un complejo anfifílico de un ion paramagnético (18), v.g. Gd, y un material anfifílico cargado negativamente (19), v.g. una fosfatidiletanolamina (19a) enlazada a un resto polietilenglicol (19b).
Liposomas
El término liposoma incluye dentro de su significado agregados sustancialmente esféricos de compuestos anfifílicos, con inclusión de compuestos lipídicos, típicamente en la forma de una o más capas concéntricas. Como se conoce en la técnica, los compuestos anfifílicos son aquellas moléculas que tienen una cabeza polar hidrófila (v.g. un grupo polar o iónico) y una cola orgánica hidrófoba (v.g. una cadena hidrocarbonada). Estos compuestos se clasifican también generalmente como agentes tensioactivos, agentes emulsionantes o agentes dispersantes en la técnica.
Los liposomas se forman típicamente en suspensiones acuosas y contienen al menos una bicapa de un compuesto anfifílico. Las cabezas hidrófilas de los compuestos anfifílicos que forman la capa exterior de la bicapa están dirigidas hacia el exterior de la estructura esférica, mientras que las cabezas hidrófilas de los compuestos anfifílicos que forman la capa interior de la bicapa están dirigidas hacia el interior de dicha estructura esférica. El líquido incorporado en el interior de la estructura esférica de los liposomas es en general el mismo que el de la suspensión acuosa, conteniendo opcionalmente compuestos adicionales que no están presentes (o están presentes en menor proporción) en la suspensión acuosa exterior, tales como un agente activo. El líquido llena el volumen interior de los liposomas en la práctica totalidad de dicho volumen, es decir en más de 90%, preferiblemente más de 95% y de manera típica aproximadamente el 100%.
Materiales preferidos para preparar liposomas son fosfolípidos, opcionalmente en mezcla con otros compuestos anfifílicos. Los fosfolípidos son compuestos anfifílicos que contienen típicamente al menos un grupo fosfato y al menos uno, preferiblemente dos, grupos hidrocarbonados lipófilos de cadena larga.
Ejemplos de fosfolípidos adecuados incluyen ésteres de glicerol con uno o preferiblemente dos (iguales o diferentes) restos de ácidos grasos y con ácido fosfórico, en donde el resto de ácido fosfórico está unido a su vez a un grupo hidrófilo, tal como, por ejemplo, colina (fosfatidilcolinas - PC), serina (fosfatidilserinas - PS), glicerol (fosfatidilgliceroles - PG), etanolamina (fosfatidiletanolaminas - PE), inositol (fosfatidilinositol). Ésteres de fosfolípidos con un solo residuo de ácido graso se conocen generalmente en la técnica como las formas "liso" del fosfolípido o "lisofosfolípidos". Los restos de ácidos grasos presentes en los fosfolípidos son en general ácidos alifáticos de cadena larga, que contienen típicamente de 12 a 24 átomos de carbono, preferiblemente de 14 a 22; la cadena alifática puede contener una o más insaturaciones o, preferiblemente, está completamente saturada. Ejemplos de ácidos grasos adecuados incluidos en los fosfolípidos son, por ejemplo, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido behénico, ácido oleico, ácido linoleico, y ácido linolénico. Preferiblemente, se emplean ácidos grasos saturados tales como ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido araquídico.
Ejemplos adicionales de fosfolípidos son los ácidos fosfatídicos, es decir los diésteres de ácido glicerol-fosfórico con ácidos grasos; esfingolípidos tales como esfingomielinas, es decir aquellos análogos de fosfatidilcolina en los cuales el residuo de un diéster de glicerol con ácidos grasos está reemplazado por una cadena de ceramida; cardiolipinas, es decir los ésteres de 1,3-difosfatidilglicerol con un ácido graso; glicolípidos tales como gangliósidos GM1 (o GM2) o cerebrósidos; glucolípidos; sulfátidos y glicosfingolípidos.
Como se utiliza en esta memoria, el término fosfolípidos incluye productos existentes naturalmente, semi-sintéticos o preparados por síntesis que pueden emplearse sea aisladamente o en forma de mezclas.
Ejemplos de fosfolípidos existentes naturalmente son lecitinas naturales (derivados de fosfatidilcolina (PC)), tales como, típicamente, lecitinas de haba de soja o yema de huevo.
Ejemplos de fosfolípidos semisintéticos son los derivados parcial o totalmente hidrogenados de las lecitinas existentes naturalmente. Fosfolípidos preferidos son diésteres de ácidos grasos de fosfatidilcolina, etilfosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina o esfingomielina.
Ejemplos de fosfolípidos preferidos son, por ejemplo, dilauroilfosfatidilcolina (DLPC), dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), diaraquidoil-fosfatidilcolina (DAPC), diestearoil-fosfatidilcolina (DSPC), dioleoil-fosfatidilcolina (DPC), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (etil-DSPC), dipentadecanoil-fosfatidilcolina (DPDPC), 1-miristoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (MPPC), 1-palmitoil-2-miristoil-fosfatidilcolina
(PMPC), 1-palmitoil-2-estearoil-fosfatidilcolina (PSPC), 1-estearoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (SPPC), 1-palmitoil-2-oleilfosfatidilcolina (POPC), 1-oleil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (OPPC), dilauroilfosfatidilglicerol (DLPC) y sus sales de metal alcalino, diaraquidoilfosfatidilglicerol (DAPG) y sus sales de metal alcalino, dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) y sus sales de metal alcalino, dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) y sus sales de metal alcalino, diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG) y sus sales de metal alcalino, dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG) y sus sales de metal alcalino, ácido dimiristoil-fosfatídico (DMPA) y sus sales de metal alcalino, ácido dipalmitoil-fosfatídico (DPPA) y sus sales de metal alcalino, ácido diestearoilfosfatídico (DSPA), ácido diaraquidoilfosfatídico (DAPA) y sus sales de metal alcalino, dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), diaraquidoilfosfatidiletanolamina (DAPE), dilinoleilfosfatidiletanolamina (DLPE), dimiristoil fosfatidilserina (DMPS), diaraquidoil-fosfatidilserina (DAPS), dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS), diestearoilfosfatidilserina (DSPS), dioleoilfosfatidilserina (DOPS), dipalmitoil esfingomielina (DPSP), y diestearoilesfingomielina (DSSP), dilauroil-fosfatidil-inositol (DLPI), diaraquidoilfosfatidilinositol (DAPI), dimiristoilfosfatidilinositol (DMPI), dipalmitoilfosfatidilinositol (DPPI), diestearoilfosfatidilinositol (DSPI), dioleoil-fosfatidilinositol (DOPI).
El término fosfolípidos incluye adicionalmente fosfolípido modificado, v.g. fosfolípidos en los cuales el grupo hidrófilo está unido a su vez a otro grupo hidrófilo. Ejemplos de fosfolípidos modificados son fosfatidiletanolaminas modificadas con polietilenglicol (PEG), es decir fosfatidiletanolaminas en las cuales el resto hidrófilo etanolamina está enlazado a una molécula de PEG de peso molecular variable (v.g. desde 300 a 5.000 daltons), tales como DPPE-PEG (o DSPE-PEG), es decir DPPE (o DSPE) que tiene un polímero de PEG unido al mismo. Por ejemplo, DPPE-PEG2000 se refiere a una DPPE que tiene unido a ella un polímero de PEG que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 2.000.
Pueden utilizarse también mezclas de fosfolípidos, tales como, por ejemplo, mezclas de DPPC, DSPC y/o DAPC con DSPS, DPPS, DSPA, DPPA, DSPG, DPPG, etil-DSPC y/o etil-DPPC.
El fosfolípido es típicamente el componente principal de la envolvente del liposoma, ascendiendo al menos al 50% (p/p) de la cantidad total de componentes que forman dicha envolvente. En algunas realizaciones preferidas, sustancialmente la totalidad de la envolvente (es decir al menos 90% y hasta 100% en peso) puede estar formada por fosfolípidos.
Los fosfolípidos pueden utilizarse convenientemente en mezcla con otros compuestos anfifílicos tales como, por ejemplo, ácidos grasos, tales como ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquidónico o ácido oleico; polímeros portadores de lípidos, tales como quitina, ácido hialurónico, polivinilpirrolidona o polietilenglicol (PEG), a los que se hace referencia también como "compuestos pegilados"; lípidos que llevan mono-, di-, oligo- o polisacáridos sulfonados; colesterol, sulfato de colesterol o hemisuccinato de colesterol; hemisuccinato de tocoferol; lípidos con ácidos grasos con enlaces éter o éster; lípidos polimerizados; fosfato de diacetilo, fosfato de dicetilo; ceramidas; ésteres de ácidos grasos con polioxietileno (tales como estearatos de ácidos grasos con polioxietileno), alcoholes grasos de polioxietileno, alcoholéteres grasos de polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de sorbitán polioxietilado, ricinoleato de glicerol-polietilenglicol, esteroles de soja etoxilados, aceite de ricino etoxilado o copolímeros de bloques de óxido de etileno (EO) y óxido de propileno (PO); ésteres de ácidos alifáticos con esterol que incluyen butirato de colesterol, iso-butirato de colesterol, palmitato de colesterol, estearato de colesterol, acetato de lanosterol, palmitato de ergosterol, o n-butirato de fitosterol; esterol-ésteres de ácidos-azúcar que incluyen glucurónidos de colesterol, glucurónidos de lanosterol, glucurónido de 7-deshidrocolesterol, glucurónido de ergosterol, gluconato de colesterol, gluconato de lanosterol, o gluconato de ergosterol; ésteres de ácidos-azúcar y alcoholes que incluyen glucurónido de laurilo, glucurónido de estearoílo, glucurónido de miristoílo, gluconato de laurilo, gluconato de miristoílo, o gluconato de estearoílo; ésteres de azúcares con ácidos alifáticos que incluyen laurato de sacarosa, laurato de fructosa, palmitato de sacarosa, estearato de sacarosa, ácido glucurónico, ácido glucónico o ácido poliurónico; saponinas, con inclusión de sarsasapogenina, esmilagenina, hederagenina, ácido oleanólico, o digitoxigenina; glicerol o ésteres de glicerol que incluyen tripalmitato de glicerol, diestearato de glicerol, triestearato de glicerol, dimiristato de glicerol, trimiristato de glicerol, dilaurato de glicerol, trilaurato de glicerol, dipalmitato de glicerol; alcoholes de cadena larga que incluyen alcohol n-decílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol cetílico, o alcohol n-octadecílico; 6-(5-colesten-3\beta-iloxi)-1-tio-\beta-D-galactopiranósido; digalactosildiglicérido, 6-(5-colesten-3\beta-iloxi)hexil-6-amino-6-desoxi-1-tio-\beta-D-galactopiranósido; 6-(5-colesten-3\beta-iloxi)hexil-6-amino-6-desoxi-1-tio-\beta-D-manopiranósido; ácido 12-(((7'-dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metilamino)octadecanoico; ácido N-[12-(((7'-dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metilamino)-octadecano-il]-2-aminopalmítico; N-succinildioleilfosfatidiletanol-amina; 1,2-dioleil-sn-glicerol; 1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerol; 1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol; 1-hexadecil-2-palmitoilglicerofosfoetanolamina o palmitoilhomocisteína; alquilaminas o sales de alquilamonio, que comprenden al menos una cadena alquilo (C10-C20), preferiblemente (C14-C18), tales como, por ejemplo, N-estearilamina, N,N'-diestearilamina, N-hexadecilamina, N,N'-dihexadecilamina, cloruro de N-estearilamonio, cloruro de N,N'-diestearilamonio, cloruro de N-hexadecilamonio, cloruro de N,N'-dihexadecilamonio, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB); sales de amonio terciarias o cuaternarias que comprenden uno o preferiblemente dos cadenas acilo (C10-C20), preferiblemente (C14-C18), enlazadas al átomo N a través de un puente alquileno (C3-C6), tales como, por ejemplo, 1,2-diestearoil-3-trimetilamonio-propano (DSTAP), 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano (DPTAP), 1,2-oleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), 1,2-diestearoil-3-dimetilamonio-propano (DSDAP); y mezclas o combinaciones de los mismos.
Compuestos adicionales preferidos son lípidos que incluyen colesterol, ergosterol, fitosterol, sitosterol, lanosterol, tocoferol, galato de propilo o palmitato de ascorbilo; ácidos grasos tales como ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico y sales y derivados de los mismos; hidroxitolueno butilado; o mezclas de los mismos. Es particularmente preferido el colesterol. Estos compuestos pueden añadirse a la composición formadora de liposomas en una cantidad de hasta aproximadamente 60% en moles referida a la composición total, con preferencia hasta aproximadamente 25%.
Con objeto de conferir la carga neta global deseada al liposoma, la envolvente respectiva comprende al menos un componente que lleva una carga neta global, en particular un material anfifílico cargado, preferiblemente un lípido o un fosfolípido.
Ejemplos de fosfolípidos que llevan una carga global negativa son derivados, en particular derivados di-éster de ácidos grasos, de fosfatidilserina, tales como DMPS, DPPS, DSPS; de ácido fosfatídico, tales como DMPA, DPPA, DSPA; de fosfatidilglicerol tales como DMPG, DPPG y DSPG o de fosfatidilinositol, tales como DMPI, DPPI o DPPI (sic). Asimismo pueden utilizarse fosfolípidos modificados, en particular fosfatidiletanolaminas modificadas con PEG, tales como DMPE-PEG2000, DMPE-PEG3000, DMPE-PEG4000, DPPE-PEG5000, DPPE-PEG2000, DPPE-PEG3000, DPPE-PEG4000, DPPE-PEG5000, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000, DSPE-PEG4000, DSPE-PEG5000, DAPE-PEG2000, DAPE-PEG3000, DAPE-PGE4000 o DAPE-PEG5000 como moléculas con carga negativa. Asimismo, puede utilizarse ventajosamente la liso-forma de los fosfolípidos arriba citados, tales como derivados de lisofosfatidilserina (v.g. liso-DMPS, -DPPS o -DSPS), derivados de ácido lisofosfatídico (v.g. liso-DMPA, -DPPA, o -DSPA) y derivados de lisofosfatidilglicerol (v.g. liso-DMPG, -DPPG o -DSPG), como compuesto con carga negativa. Ejemplos de lípidos con carga negativa son sales de ácidos biliares tales como sales de ácido cólico, sales de ácido desoxicólico o sales de ácido glicocólico; y sales de ácidos grasos (C12-C24), preferiblemente (C14-C22), tales como, por ejemplo, sal de ácido palmítico, sal de ácido esteárico, sal de 1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerol o sal de 1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol.
Preferiblemente, el compuesto con carga negativa se selecciona entre DPPA, DPPS, DSPG, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG5000 o mezclas de los mismos.
El componente con carga negativa está asociado típicamente con un ion de carga opuesta positivo correspondiente, que puede ser monovalente (v.g. un metal alcalino o amonio), bivalente (v.g. un metal alcalinotérreo) o trivalente (v.g. aluminio). Preferiblemente, el ion de carga opuesta se selecciona entre cationes de metal alcalino, tales como Li+, Na+, o K+, más preferiblemente Na+.
Ejemplos de fosfolípidos que llevan una carga global positiva son derivados de etilfosfatidilcolina, en particular diésteres de etilfosfatidilcolina con ácidos grasos, tales como 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (etil-DSPC o DSEPC), 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (etil-DPPC o DPEPC). El ion de carga opuesta negativo es preferiblemente un ion halógeno, en particular cloro o bromo. Ejemplos de lípidos cargados positivamente son sales de alquilamonio con un ion de carga opuesta halógeno (v.g. cloro o bromo) que comprenden al menos una cadena alquilo (C10-C20), preferiblemente (C14-C18), tales como, por ejemplo, cloruro de mono- o di-estearilamonio, cloruro de mono- o di-hexadecilamonio, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), y bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB). Ejemplos adicionales de lípidos cargados positivamente son sales terciarias o cuaternarias de amonio con un ion de carga opuesta halógeno (cloro o bromo) que comprenden una o preferiblemente dos cadenas acilo (C10-C20), preferiblemente (C14-C18), enlazadas al átomo N a través de un puente alquileno (C3-C6), tales como, por ejemplo, 1,2-diestearoil-3-trimetilamonio-propano (DSTAP), 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano (DPTAP), 1,2-oleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), o 1,2-diestearoil-3-dimetilamonio-propano (DSDAP).
DSEPC, DPEPC y/o DSTAP se emplean preferiblemente como compuestos con carga positiva en la envolvente del liposoma.
El componente con carga positiva está asociado típicamente con un ion de carga opuesta negativo correspondiente, que puede ser monovalente (v.g. halógeno), bivalente (v.g. sulfato), o trivalente (v.g. fosfato). Preferiblemente, el ion de carga opuesta se selecciona entre iones halógeno, tales como F- (flúor), Cl- (cloro) o Br- (bromo).
Con objeto de hacer posible una interacción electrostática eficaz con la micela, la cantidad total de compuestos cargados en la envolvente del liposoma es de al menos 1% en moles con respecto a la cantidad total del material que forma dicha envolvente, preferiblemente al menos 5% y más preferiblemente al menos 10% en moles. Se ha observado que cantidades inferiores a 80% en moles de compuestos cargados son suficientes en general para conseguir una interacción eficaz liposoma-micelas; preferiblemente dichas cantidades no son mayores que aproximadamente 75% en peso y de modo más preferible no mayores que aproximadamente 60% en moles.
Mezclas de fosfolípidos neutros y cargados y/o lípidos cargados pueden emplearse satisfactoriamente para formar los liposomas de un ensamblaje de la presente invención, opcionalmente en mezcla con otros compuestos anfifílicos. Preferiblemente, se emplean mezclas de dos o más lípidos o fosfolípidos, al menos uno con una carga neutra y al menos uno con una carga global neta. Más preferiblemente, se emplean mezclas de dos o más lípidos o fosfolípidos, al menos uno con carga neutra y al menos uno con carga positiva, para obtener liposomas con una carga global positiva. Se prefieren particularmente mezclas de DSPC y/o DPPC con etil-DSPC, etil-DPPC y/o DSTAP.
Otros excipientes o aditivos pueden estar presentes en la composición formadora de liposomas, sin estar necesariamente implicados (o estando sólo parcialmente implicados) en la formación de la envolvente del liposoma. Éstos incluyen reguladores de pH, ajustadores de la osmolalidad, aumentadores de la viscosidad, emulsionantes, agentes de aumento de volumen, etc. y pueden utilizarse en cantidades convencionales. Por ejemplo, pueden utilizarse compuestos tales como polioxipropilenglicol y polioxietilenglicol así como copolímeros de los mismos. Ejemplos de aumentadores de la viscosidad o estabilizadores son compuestos seleccionados de poli- y oligo-sacáridos lineales y reticulados, azúcares, y polímeros hidrófilos tales como polietilenglicol.
Los liposomas de un ensamblaje de la presente invención pueden contener adicionalmente un agente activo, tal como un agente terapéutico o un agente diagnóstico. Estos compuestos pueden estar asociados con la envolvente lipídica o el liposoma (v.g. incorporados en y/o unidos a la misma) y/o disueltos o dispersados (v.g. como una dispersión micelar) en el volumen acuoso interior del mismo. Aunque puede estar también asociado un ligando de direccionamiento con la envolvente lipídica del liposoma, dichos compuestos están asociados sin embargo más ventajosamente con las micelas del ensamblaje, como se explica en detalle más adelante en esta memoria, a fin de maximizar el efecto de direccionamiento de las mismas.
El término "agente terapéutico" incluye dentro de su significado cualquier sustancia, composición o partícula que pueda utilizarse en cualquier aplicación terapéutica, tal como en métodos para el tratamiento de una enfermedad en un paciente, así como cualquier sustancia que sea capaz de ejercer o susceptible de ejercer un efecto biológico in vitro y/o in vivo. Agentes terapéuticos incluyen así cualquier compuesto o material susceptible de ser utilizado en el tratamiento (con inclusión de diagnosis, prevención, mitigación, alivio del dolor o curación) de cualquier estado patológico en un paciente (con inclusión de enfermedad, aflicción, lesión debida a una enfermedad o herida). Ejemplos de agentes terapéuticos son fármacos, productos farmacéuticos, agentes bioactivos, agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, agentes radioterapéuticos, proteínas, péptidos naturales o sintéticos, con inclusión de oligopéptidos y polipéptidos, vitaminas, esteroides y material genético, con inclusión de nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos y plásmidos. Entre éstos, se prefieren fármacos o productos farmacéuticos.
Ejemplos de agentes terapéuticos incluyen agentes anti-úlcera tales como cimetidina, famotidina, ranitidina, acetato de roxatidina, pantoprazol, omeprazol, lansoprazol o sucralfato; relajantes o procinéticos intestinales tales como bromuro de propantelina, camilofina (acamilofenina), diciclomina, butilbromuro de hioscina, mebeverina, cisaprida, oxibutinina, pipenzolato- metil-bromuro, drotaverina, metoclopramida, bromuro de clidinio, isopropamida o bromuro de oxifenonio; enzimas o carminativos, tales como pancreatina, papaína, pepsina, o amilasa; hepatobiliares preparaciones tales como ácido quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico, L-ornitina o silimarina; antihipertensivos tales como clonidina, metildopa, nitroprusiato de sodio, terazosina, doxazosina, (DI) hidralazina o prazosina; beta-bloqueantes tales como esmolol, celiprolol, atenolol, labetolol, propranolol, metoprolol, carvedilol, sotalol, oxiprenolol o bisoprolol; bloqueantes de los canales de calcio tales como felodipina, nitrendipina, nifedipina, benidipina, verapamil, amlodipine o lacidipina; inhibidores de la ACE tales como enalapril, lisinopril, ramipril, perindopril, benazepril o captopril; inhibidores de la angiotensina II tales como losartán potásico; activadores de los canales de potasio, tales como nicorandil; diuréticos y antidiuréticos tales como hidroclorotiazida, xipamida, bumetanida, amilorida, espironolactona, indapamida, triamtereno, clopamida, furosemida o clortalidona; antianginales tales como isoscorbida dinitrato, oxifedrina, isosorbida 5-mononitrato, diltiazem, tetranitrato de eritritilo, trimetazidina, lidoflazina, tetranitrato de pentaeritritol, trinitrato de glicerilo o dilazep; coagulantes tales como estrógenos conjugados, diosmina, menaftona, menadiona, hemocoagulasa, etamsilato (cidanamina), flavonoides de rutina o adrenocromo-monosemicarbazona; anticoagulantes antitrombóticos o antiplaquetarios tales como ticlopidina, warfarina, estreptoquinasa, fenindiona, rtpa, uroquinasa, vasopresina, nicumalona, heparina, heparinas de peso molecular bajo, mucopolisacáridos polisulfato o dipiridamol; antiarrítmicos tales como quinidina, disopiramida, procainamida, lignocaína (lidocaína), mexiletina, amiodarona, adenosina, propafenona; fármacos en la insuficiencia cardíaca y el choque tales como mefentermina, digoxina, dopamina, dobutamina o noradrenalina, vasodilatadores tales como isoxsuprina, xantinol nicotinato, nilidrina HCl, pentoxifilina (oxpentifilina) o ciclandelato; glicósidos cardíacos tales como deslanesida, digitoxina, digoxina o digitalina; penicilinas tales como bencil-penicilina, penicilina-procaína (G), penicilina-benzatina (G), fenoximetil penicilina, penicilina G/V, bacampicilina, carbenicilina, piperacilina, ampicilina (opcionalmente en combinación con sulbactam o probenecid), cloxacilina, o amoxicilina (opcionalmente en combinación con bromhexina, cloxacilina, carbocisteína o ácido clavulánico); quinolonas o fluoroquinolonas tales como ácido nalidíxico, pefloxacina, ofloxacina, esparfloxacina, norfloxacina, ciprofloxacina, lomefloxacina, cefalosporinas tales como ceftizoxima, cefuroxima, cefixima, cefotaximo, cefaclor, ceftriaxona-sodio, cefadroxil, cefalexina, (opcionalmente en combinación con bromhexina.HCl o probenecid) cefazolina, cefaloridina, ceftazidimo o ceforperazona; sulfonamidas tales como sulfonamidas, sulfamoxol, sulfadimetoxina, cotrifamol, cotrimoxazol, trimetoprima, aminoglicósidos tales como gentamicina, tobramicina, neomicina, amikacina, sisomicina, kanamicina, netilmicina, polimixinas tales como polimixina-b, colistina sulfato; cloramfenicol; tetraciclinas tales como tetraciclina, doxiciclina, minociclina, demeclociclina, oxitetraciclina; macrólidos tales como eritromicina, (opcionalmente en combinación con bromhexina), claritromicina, vancomicina, lincomicina, azitromicina, espiramicina, roxitromicina, clindamicina, cefpirona, teicoplanina (teicomicina a2), antivirales, tales como abacavir, lamivudina, aciclovir, amantadina, interferón, ribavirina, estavurdina, lamivudina o zidovudina (azt); antimalariales, tales como quinina, proguanil, cloroquina, primaquina, amodiaquina, arteméter, artesunato, mefloquina, pirimetamina, arteéter, mepacrina; agentes antituberculosis tales como cicloserina, capreomicina, etionamida, protionamida, isoniazida (inh), rifampicina, rifampicina opcionalmente en combinación con inh, isoniazida, pirazinamida y/o etambutol; etambutol (opcionalmente en combinación con isoniazida), estreptomicina o pirazinamida; antihelmínticos y antiinfestantes tales como piperazina, niclosamida, pirantel pamoato, levamisol, dietil carbamazina, tetramisol, albendazol, praziquantel, gluconato de sodio-antimonio o membendazol; agentes antilepra tales como dapsona o clofazimina; antianaeróbicos, antiprotozoarios o antiamébicos tales como tinidazol, metronidazol (opcionalmente en combinación con furazolidona o norfloxacino), diloxanida-furoato, secnidazol, hidroxiquinolonas, deshidroemetina, omidazol o furazolidona; antifúngicos tales como fluconazol, quetoconazol, hamicina, terbinafina, econazol, anfotericina-b, nistatina, clotrimazol, griseofulvina, miconazol o itraconazol; vitaminas; estimulantes respiratorios tales como doxapram hidrocloruro; antiasmáticos tales como isoprenalina, salbutamol(albuterol), orciprenalina, efedrina, terbutalina sulfato, salmeterol, aminofilina, terofilina, beclometasona dipropionato o fluticasona propionato; antialérgicos tales como terfenadina, astemizol, loratadina, clemastina, dimetindeno maleato, hidrocloruro de fexofenadina, hidroxizina, clorfeniramina, azatadina maleato, metdilazina, feniramina maleato, difenhidramina o cetrizina; relajantes de la musculatura esquelética tales como tizanidina metocarbamol, carisoprodol, valetamato, baclofeno, clormezanona o clorzoxazona; relajantes de la musculatura lisa tales como bromuro de oxifenonio, bromuro de propantelina, diclomina, butil-bromuro de hioscina, mebeverina, drotaverina, bromuro de clidinio, isopropamida o dihidrocloruro de camilofina; fármacos anti-inflamatorios no esteroidales tales como naproxeno, ácido mefenámico, nimesulida, diclofenaco, tenoxicam, ibuprofeno (opcionalmente en combinación con paracetamol), meloxicam, aspirina, flurbiprofeno, quetoprofeno, quetoprolac, fenilbutazona, oxifenbutazona, indometacina o piroxicam; agentes antineoplásticos, tales como compuestos de mostazas nitrogenadas (v.g. ciclofosfamida, trofosfamida, iofosfamida, melfalán o clorambucil), aziridinas (v.g. tioepa), derivados de N-nitrosourea (v.g. carmustina, lomustina o nimustina), compuestos de platino (v.g. espiroplatino, cisplatino, y carboplatino), procarbazina, dacarbazina metotrexato, adriamicina, mitomicina, ansamitocina, arabinósidos de citosina, arabinosil adenina, mercaptopolilisina, vincristina, busulfan, clorambucil, melfalano (v.g. PAM, L-PAM o mostaza de fenilalanina), mercaptopurina, mitotano, hidrocloruro de procarbazina, dactinomicina (actinomicina D), hidrocloruro de daunorrubicina, hidrocloruro de doxorrubicina, epirrubicina, plicamicina (mitramicina), mitoxantrona, bleomicina, bleomicina sulfato, aminoglutetimida, estramustina-fosfato de sodio, flutamida, teuprolida acetato, megestrol acetato, tamoxifen citrato, testolactona, trilostano, amsacrina (m-AMSA), asparaginasa (L-asparaginasa) Erwina asparaginasa, etoposido (VP-16), interferón a-2a, interferón a-2b, teniposido (VM-26), vinblastina sulfato (VLB), vincristina sulfato, vindesina, paclitaxel (Taxol), metotrexato, adriamicina, arabinosil, hidroxiurea; antagonistas del ácido fólico (v.g. aminopterina, metotrexato), antagonistas de bases púricas y pirimidínicas (v.g. mercaptopurina, tioguanina, fluorouracilo o citarabina); narcóticos, opiáceos o sedantes tales como paregoric, codeína, morfina, opio, amobarbital, amobarbital-sodio, aprobarbital, butobarbital sodio, hidrato de cloral, etclorvinol, etinamato, hidrocloruro de flurazepam, glutetimida, hidrocloruro de metotrimeprazina, metiprilón, hidrocloruro de midazolam, paraldehído, pentobarbital, secobarbital-sodio, talbutal, temazepam o triazolam; anestésicos locales o generales tales como bupivacaína, cloroprocaína, etidocaína, lidocaína, mepivacaína, procaína o tetracaína, droperidol, etomidato, fentanilo-citrato con droperidol, hidrocloruro de quetamina, metohexital sodio o tiopental; bloqueantes neuromusculares tales como atracurium-mesilato, trietyoduro de galamina, bromuro de hexafluorenio, yoduro de metocurina, bromuro de pancuronio, cloruro de succinilcolina, cloruro de tubocurarina o bromuro de vecuronio; o agentes Terapéuticos para el sistema hormonal, tales como hormona del crecimiento, hormona estimuladora de los melanocitos, estradiol, beclometasona dipropionato, betametasona, cortisona acetato, dexametasona, flunisolida, hidrocortisona, metilprednisolona, parametasona acetato, prednisolona, prednisona, triamcinolona o fluorocortisona acetato.
El término "agente diagnóstico" incluye dentro de su significado cualquier compuesto, composición o partícula que pueda utilizarse en conexión con métodos de formación de imágenes de una región interior de un paciente y/o diagnosticar la presencia o ausencia de una enfermedad en un paciente. Agentes diagnósticos que pueden incorporarse en el interior del liposoma o asociarse con el mismo (v.g. a su envolvente, en particular a la porción lipófila de la misma) en un ensamblaje de la invención son por consiguiente cualquier compuesto, composición o partícula que pueda hacer posible la mejora de la imagen en conexión con técnicas de diagnóstico, con inclusión de imágenes de resonancia magnética, rayos X, en particular tomografía computerizada, formación óptica de imágenes, formación de imagen nuclear o formación de imagen molecular. Ejemplos de agentes de diagnóstico adecuados que pueden incorporarse en o asociarse a un liposoma son, por ejemplo, nanopartículas de magnetita; compuestos yodados, tales como Iomeprol® o Iopapidol® (Bracco Imaging); complejos quelato hidrófilos o lipófilos de iones paramagnéticos tales como, por ejemplo, complejos de cromo (III), manganeso (II), manganeso (III), hierro (II), hierro (III), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), praseodimio (III), neodimio (III), samario (III), gadolinio (III), terbio (III), disprosio (III), holmio (III), erbio (III), europio (III) e iterbio (III); compuestos que comprenden un átomo hiperpolarizado, tales como ^{13}C, ^{15}N, ^{19}F, ^{23}Na, ^{31}P o ^{35,5}Cl, con inclusión, por ejemplo, de [^{13}C]urea (véase v.g. "Molecular imaging of endogenous substances", Golman et al., PNAS (Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA), septiembre de 2003, vol. 100, nº. 18, pp. 10435-10439) o bis-1,1-hidroximetil-1-^{13}C-ciclopropano-D_{8} (véase v.g. "Cerebral perfussion assessment by bolus tracking using hyperpolarized ^{13}C", Johansson et al., Magnetic Resonance in Medicine, 2004, vol. 51, pp. 464-472); o agentes radiofarmacéuticos, tales como por ejemplo complejos de tecnecio (^{99m}Tc), galio (^{67}Ga o ^{68}Ga), indio (^{111}In) o talio (^{201}Tl).
Para la preparación de las presentes suspensiones de liposomas, pueden utilizarse métodos convencionales conocidos en la técnica. Dichas técnicas de preparación implican típicamente disolver los compuestos que forman el liposoma (v.g. fosfolípidos) en un disolvente orgánico, evaporar el disolvente orgánico a vacío para obtener una película de los compuestos formadores del liposoma y finalmente hidratar dicha película. Típicamente, cuando el compuesto formador del liposoma es un fosfolípido, la hidratación se realiza a una temperatura superior a la temperatura de transición de los fosfolípidos. Preferiblemente, los liposomas así obtenidos se calibran subsiguiente al tamaño deseado por estrechamiento de la distribución de tamaños de las vesículas dentro de límites apropiados, v.g. por extrusión a través de membranas de filtración graduadas convenientemente. Para encapsulación de un compuesto activo deseado (v.g. un agente diagnóstico o terapéutico) en la porción interior del liposoma, v.g. como una solución o suspensión acuosa de dicho compuesto activo, un método preferido implica utilizar una solución o suspensión de dicho compuesto activo para hidratar los lípidos a o por encima de la temperatura de transición del lípido, con lavado subsiguiente (v.g. por diálisis) de los liposomas obtenidos, a fin de eliminar el exceso de solución o suspensión no encapsulada. Alternativamente, los lípidos se hidratan en primer lugar en un vehículo acuoso desprovisto carga, y a continuación el compuesto activo se introduce en el interior del liposoma mediante carga de permeación transmembranal, por incubación de los liposomas obtenidos en presencia de una solución concentrada del compuesto activo (véase v.g. WO-A-92/10166 que se incorpora en esta memoria por referencia), con lavado subsiguiente de los liposomas.
La reducción del tamaño deseado de los liposomas se obtiene de acuerdo con técnicas convencionales, que incluyen tratamiento por ultrasonidos, extrusión o microfluidización de la suspensión de liposomas inicial. De acuerdo con ello, los liposomas hidratados obtenidos como se ha descrito arriba pueden exponerse a radiaciones ultrasónicas para reducir convenientemente las dimensiones de los liposomas. Alternativamente, los liposomas hidratados pueden extruirse a través de una pluralidad de membranas (v.g. de policarbonato) con tamaño de poro decreciente (v.g. 2,0, 1,0, 0,8, 0,6, 0,4 y 0,2 \mum), para reducir el tamaño de los liposomas a la dimensión final deseada. Como alternativa adicional, pueden homogeneizarse vesículas grandes bajo alta presión en un microfluidizador (v.g. de Microfluidics Corporation), para reducir progresivamente el tamaño de los liposomas al tamaño deseado, dependiendo de la cantidad de recirculación de los liposomas en el microfluidizador. Estos y otros métodos de preparación se describen, por ejemplo, en el texto de referencia "Liposomes, a practical approach", recopilado por Roger R.C. New, Oxford University Press, 1989.
Preferiblemente, después de la reducción de tamaño, aproximadamente el 80% de las vesículas están dentro de \pm10% respecto a cualquier valor nominal seleccionado entre 1,2 y 1,0 \mum. No obstante, es admisible cualquier otra distribución más amplia o más estrecha dentro de los límites que anteceden. Después del tratamiento de reducción de tamaños, la suspensión se comprueba preferiblemente para asegurar que la concentración de lípidos en la suspensión de liposomas es adecuada, ajustándose ésta opcionalmente de modo que esté en conformidad con la aplicación deseada. El ajuste puede efectuarse por dilución con un volumen mayor de líquido portador, si la concentración de lípidos excede de los límites deseados; o por el contrario, la concentración puede aumentarse por medios usuales, por ejemplo por micro- o ultra-filtración sobre membranas de porosidades apropiadas que retienen las vesículas pero que son permeables al líquido portador.
Una revisión de liposomas y sus métodos de preparación puede encontrarse también en el texto de referencia "Surfactants and Polymers in Drug Delivery", por M. Malmsten, Cap. 4, pp. 87-131, Marcel Dekker Inc. Ed., 2002.
Micelas
Como se conoce en la técnica, se forman micelas por las moléculas anfifílicas dispersadas en agua cuando la concentración de estas moléculas excede de un umbral predeterminado conocido como CMC (concentración crítica de formación de micelas). A concentraciones inferiores a la CMC, las moléculas están dispersadas en general en la solución acuosa como moléculas simples. Por encima del valor CMC, las moléculas anfifílicas tienden a organizarse en estructuras supermoleculares, en equilibrio con las moléculas libres en la solución, caracterizándose dichas estructuras por el hecho de que la cola hidrófoba (lipídica) de la molécula está dispuesta hacia la parte interior de la estructura, mientras que el grupo de cabeza hidrófilo (polar o iónico) de la molécula está dispuesto hacia la porción exterior de la estructura. La CMC de la molécula anfifílica puede determinarse experimentalmente utilizando métodos estándar en la técnica. Por ejemplo, la CMC de un agente tensioactivo puede determinarse representando gráficamente una propiedad en función de la concentración del agente tensioactivo. La propiedad varía usualmente de modo lineal con el aumento de la concentración de agente tensioactivo hasta que se alcanza el valor CMC, y después de esta concentración, la curva (o la propiedad) se aparta de la linealidad. Propiedades adecuadas que pueden utilizarse para la determinación de la CMC incluyen índice de refracción, dispersión de la luz, tensión superficial, conductividad eléctrica, presión osmótica y análogas. Para el propósito de la invención, los materiales formadores de micelas primarias preferidos son aquéllos que tienen una CMC relativamente baja, v.g. de aproximadamente 10 mM o inferior. Las micelas tienen típicamente una dimensión comprendida entre aproximadamente 0,1 nm y aproximadamente 100 nm, con preferencia desde aproximadamente 1 nm a aproximadamente 50 nm. El diámetro medio numérico (D_{N}) es de aproximadamente 50 nm o menos, con preferencia de aproximadamente 20 nm o menos y de modo mucho más preferible de 10 nm o menos, hasta v.g. 1 nm, con preferencia al menos aproximadamente 2 nm. El término "micela", tal como se utiliza en esta memoria, incluye una estructura micelar formada por una mezcla de dos o más compuestos diferentes ("micelas mixtas"), al menos uno de los cuales es un compuesto anfifílico capaz de formar una estructura micelar. El término micelas mixtas incluye también por tanto dentro de su significado micelas formadas por al menos un compuesto, preferiblemente un compuesto anfifílico, que es por regla general incapaz de formar una estructura micelar cuando se dispersa como tal en un vehículo acuoso, pero que es capaz de formar dicha estructura cuando se utiliza en combinación con cantidades adecuadas de un compuesto anfifílico formador de micelas. Ejemplos de micelas mixtas son, por ejemplo, micelas formadas por fosfolípidos no modificados (los cuales son por regla general incapaces de formar micelas cuando están dispersados como el material único en un vehículo acuoso) y por un compuesto formador de micelas (v.g. un fosfolípido modificado con PEG o una sal de ácido graso).
Una revisión de micelas, sistemas micelares y métodos de preparación de los mismos puede encontrarse, por ejemplo, en el texto de referencia: "Surfactants and Polymers in Drug Delivery", por M. Malmsten, Cap. 4, pp. 19-50, Marcel Dekker Inc. Ed., 2002. De acuerdo con un aspecto de la invención, un compuesto sensible a MRI está asociado con la micela, preferiblemente en la forma de un compuesto anfifílico susceptible de incluirse en la estructura micelar (v.g. un complejo de un ion paramagnético con un agente anfifílico quelante, tal como un poliaminocarboxilato).
Materiales adecuados útiles para formación de micelas a asociar con un liposoma en un ensamblaje de la invención puede seleccionarse entre los materiales lípidos y fosfolípidos enumerados previamente.
Ejemplos de compuestos formadores de micelas son fosfolípidos modificados con PEG, que incluyen en particular fosfatidiletanolaminas modificadas con PEG tales como DMPE-PEG, DPPE-PEG, DSPE-PEG, DAPE-PEG1; sales de ácidos grasos, preferiblemente sales alcalinas, en particular sales de sodio, tales como palmitato de sodio, estearato de sodio, oleato de sodio, linoleato de sodio, dodecanoato de sodio, sal de sodio de 1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerato o sal de sodio de 1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol; derivados de azúcares tales como alquil(C_{6}-C_{10})-\beta-D-glucopiranósido, alquil(C_{8}-C_{12})-\beta-D-maltósido; alquil(C_{8}-C_{16})dimetilamoniopropano-sulfonato; y ácidos biliares derivados de las mismas, tales como colato de sodio o desoxicolato de sodio. Pueden utilizarse también polímeros, con inclusión de porciones hidrófobas e hidrófilas de los mismos (conocidos también como "agentes tensioactivos polímeros") para preparar suspensiones micelares. Ejemplos de agentes tensioactivos polímeros adecuados incluyen, sin limitación, poli(óxidos de etileno) (PEO), tales como n-alquil(C_{8}-C_{16})-PEO-monoéter, n-alquil(C_{8}-C_{10})-fenil-PEO, tetrametilbutilfenil-PEO, polisorbatos de PEO, siendo vendidos estos PEO bajo los nombres comerciales de Brij®, Mirj®, Lubrol®, Triton®, Nonidet® o Tween®; copolímeros de bloques tales como copolímeros de bloques óxido de etileno/óxido de propileno (v.g. Pluronic® o Synperonic®), que tienen preferiblemente un PM de aproximadamente 3.000 a 20.000 Daltons, preferiblemente de 5.000 a 15.000 Daltons. Ventajosamente, pueden utilizarse otros compuestos formadores de micelas, preferiblemente en mezcla con cualquiera de los compuestos formadores de micelas enumerados previamente para formar micelas mixtas. Ejemplos de estos compuestos son sales de alquilamonio que comprenden al menos una cadena alquilo (C_{10}-C_{20}), preferiblemente (C_{14}-C_{18}), tales como, por ejemplo, cloruro de estearilamonio, cloruro de hexadecilamonio, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB); sales de amonio terciarias o cuaternarias que comprenden una o preferiblemente 2 cadenas acilo (C_{10}-C_{20}), preferiblemente (C_{14}-C_{18}) enlazadas al átomo N a través de un puente alquileno(C_{3}-C_{6}), tales como 1,2-diestearoil-3-trimetilamonio-propano (DSTAP), 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano (DPTAP), 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), y 1,2-diestearoil-3-dimetilamonio-propano (DSDAP). Pueden utilizarse también fosfolípidos no modificados para formar micelas, tales como los diésteres de ácidos grasos de fosfatidilcolina, etilfosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina o esfingomielina previamente mencionados. Dado que estos fosfolípidos no modificados son sin embargo incapaces por lo general de formar estructuras micelares cuando están dispersados en un vehículo acuoso (debido a que estos compuestos tienden más bien a asociarse como liposomas cuando están dispersados en una solución acuosa), dichos fosfolípidos no modificados ascenderán con preferencia a menos de aproximadamente 80%, de modo más preferible aproximadamente 70% o menos del peso total de la mezcla de compuestos que forman la estructura micelar. De acuerdo con una realización preferida, el componente micelar se forma a partir de una mezcla que comprende desde aproximadamente 30% a 70%, con preferencia desde aproximadamente 40% a 60% en peso de fosfolípidos no modificados. El resto de la mezcla puede ser cualquiera de los agentes tensioactivos formadores de micelas citados
anteriormente.
La carga neta global puede ser conferida a la micela por cualquiera de los compuestos con carga negativa o positiva citados previamente, en particular lípidos o fosfolípidos, con inclusión de fosfolípidos modificados.
Ejemplos de fosfolípidos adecuados para conferir una carga negativa global a la micela son derivados de fosfatidilserina, tales como DMPS, DPPS, DSPS; derivados de ácido fosfatídico, tales como DMPA, DPPA, DSPA; derivados de fosfatidilglicerol tales como DMPG, DPPG y DSPG. Fosfolípidos modificados, en particular fosfatidiletanolaminas modificadas con PEG, pueden emplearse ventajosamente para conferir la carga negativa global deseada a la micela, tales como, por ejemplo, DMPE-PEG750, -PEG1000, -PEG2000, -PEG3000, -PEG4000 o -PEG5000; DPPE-PEG750, -PEG1000, -PEG2000, PEG3000, -PEG4000 o PEG5000; DSPE-PEG750, -PEG1000, -PEG2000, PEG3000, -PEG4000 o PEG5000; DAPE-PEG750, -PEG1000, -PEG2000, PEG3000, -PEG4000 o PEG5000. Adicionalmente, también la lisoforma respectiva de los fosfolípidos arriba citados, tales como derivados de lisofosfatidilserina, derivados de ácidos lisofosfatídicos (v.g. liso-DMPA, -DPPA o -DSPA) y derivados de lisofosfatidilglicerol (v.g. liso-DMPG, -DPPG o -DSPG). Ejemplos de lípidos cargados negativamente son sales de ácidos biliares tales como sales de ácido cólico, sales de ácido desoxicólico o sales de ácido glicocólico; y sales de ácidos grasos tales como sal de ácido palmítico, sal de ácido esteárico, sal de 1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerol o sal de 1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol.
Preferiblemente, el compuesto con carga negativa se selecciona entre los fosfolípidos modificados con PEG arriba citados. El componente con carga negativa está asociado típicamente con un ion de carga opuesta positivo correspondiente, que puede ser mono- (v.g. un metal alcalino), bi- (v.g. un metal alcalinotérreo) o tri-valente (v.g. aluminio). Preferiblemente, el ion de carga opuesta se selecciona entre cationes de metal alcalino, tales como Li^{+}, Na^{+} o K^{+}, más preferiblemente Na^{+}.
Ejemplos de fosfolípidos adecuados para conferir una carga global positiva a la micela son ésteres de fosfatidilcolinas, tales como 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (etil-DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (etil-DPPC). El ion de carga opuesta negativo es preferiblemente un ion halógeno, en particular cloro o bromo. Ejemplos de lípidos cargados positivamente son sales de alquilamonio, que comprenden al menos una cadena alquilo (C_{10}-C_{20}), preferiblemente (C_{14}-C_{18}), o amonio terciario o cuaternario que comprende una o preferiblemente dos cadenas acilo (C_{10}-C_{20}), preferiblemente (C_{14}-C_{18}), enlazadas al átomo N a través de un puente alquileno (C_{3}-C_{6}), tal como los enumerados previamente.
Como compuestos con carga positiva se emplean preferiblemente etil-DPPC, etil-DSPC, DSTAP o mezclas de los mismos.
El componente con carga positiva está asociado típicamente con un ion de carga opuesta negativo correspondiente, que puede ser mono- (v.g. halógeno), bi- (v.g. sulfonato) o tri-valente (v.g. fosfato). Preferiblemente, el ion de carga opuesta se selecciona entre iones halógeno, tales como F^{-} (flúor), Cl^{-} (cloro) o Br^{-} (bromo).
Como anteriormente, las moléculas cargadas pueden estar mezcladas ventajosamente en algunas realizaciones con un compuesto anfifílico neutro, tales como los enumerados previamente (con inclusión de fosfolípidos neutros), para formar la estructura micelar deseada. Compuestos neutros preferidos a mezclar con los compuestos cargados enumerados anteriormente son agentes tensioactivos polímeros, tales como copolímeros de bloques óxido de etileno-óxido de propileno (v.g. Pluronic F68, Pluronic F108 o Pluronic F127 de la firma Aldrich, Missouri, EE.UU.), alquiléteres polioxietilados (v.g. Brij® 78, Sigma Aldrich), ésteres de ácidos grasos con polioxietileno (v.g. Myrj® 53 o Myrj®59, Sigma Aldrich); ésteres de ácidos grasos con polioxietilen-sorbitán (v.g. Tween® 60, Sigma Aldrich), o glicolalquiléteres de poli-etileno tales como polietilenglicol-terc-octilfeniléter (v.g. Triton® X-100, Sigma Aldrich). De acuerdo con una realización de la invención, las micelas están formadas por mezclas de un compuesto anfifílico cargado con un fosfolípido neutro y uno o más de los compuestos neutros arriba numerados.
Preferiblemente, la cantidad molar de agente tensioactivo cargado que forma la micela es de aproximadamente 5% a 80%, de modo más preferible aproximadamente 10% a aproximadamente 70% de la cantidad molar total de los componentes formadores de micelas.
De acuerdo con un aspecto de la invención, las micelas mixtas comprenden preferiblemente un fosfolípido modificado con PEG, un agente tensioactivo polímero o una mezcla de los mismos, cuya presencia permite mejorar sustancialmente el tiempo de residencia del ensamblaje en el torrente sanguíneo. Alternativamente, o además de ello, pueden emplearse asimismo ácidos biliares, lisofosfolípidos o mezclas de los mismos para aumentar el tiempo de residencia del ensamblaje en la sangre. La cantidad de compuestos capaces de aumentar el tiempo de residencia del ensamblaje en el torrente sanguíneo es con preferencia de aproximadamente 10% a aproximadamente 80% en moles, de modo más preferible aproximadamente 25% a aproximadamente 70% en moles de la cantidad molar total de compuestos formadores de micelas.
Dicho tiempo de residencia mejorado de un ensamblaje de acuerdo con la invención es tal que, después de 30 minutos de la inyección, la cantidad de los ensamblajes en el torrente sanguíneo es al menos 50%, con preferencia al menos 60%, de la cantidad de ensamblajes en la dosis inyectada. Inversamente, la cantidad de una preparación de liposomas correspondiente en el torrente sanguíneo, después de 30 minutos de la inyección, es típicamente menor que 50%, en particular menor que 40%, de la cantidad de liposomas en la dosis inyectada. Análogamente, después de una hora de la inyección, la cantidad de los ensamblajes en el torrente sanguíneo es al menos 50%, y en la mayoría de los casos al menos 60%, de la cantidad de ensamblajes en la dosis inyectada, mientras que la cantidad de una preparación de liposomas correspondiente en el torrente sanguíneo es menor que 40%, en la mayoría de los casos menor que 30%, de la cantidad de liposomas en la dosis inyectada. En particular, para liposomas que tengan un diámetro medio de aproximadamente 1 \mum, la cantidad de liposomas después de 1 hora de la inyección es típicamente menor que 10% de la cantidad de liposomas en la dosis inyectada.
Agentes activos tales como los agentes terapéuticos y diagnósticos citados previamente, están asociados con los componentes micelares, en particular aquellos agentes activos que comprenden una estructura anfipática adecuada que tiene afinidad con los compuestos formadores de micelas o aquéllos que pueden encapsularse en el componente micelar. Un agente activo puede representar desde aproximadamente 10% a aproximadamente 80% del peso total de la micela, con preferencia desde aproximadamente 25% a aproximadamente 70%.
Un agente intensificador de imágenes está asociado con el compuesto micelar, en particular un compuesto sensible a MRI. El compuesto sensible a MRI asociado con la micela se encuentra preferiblemente en la forma de un compuesto anfifílico capaz de incluirse en la estructura micelar, v.g. por interacciones hidrófobas de la porción lipófila de dicho compuesto con las porciones lipófilas de los componentes formadores de las micelas.
De acuerdo con una realización preferida, el compuesto anfifílico sensible a MRI es un ion metálico paramagnético complejado con una molécula quelantes que incluye un resto lipófilo, al que se hace referencia en lo sucesivo como un ion paramagnético quelado. Los iones metálicos paramagnéticos preferidos tienen números atómicos de 21-29, 42, 44, o 57-83. Esto incluye iones de la serie de los metales de transición o lantánidos que tienen al menos uno, y más preferiblemente cinco o más electrones sin aparear y un momento magnético de al menos 1,7 magnetones de Bohr. Metales paramagnéticos preferidos incluyen, pero sin carácter limitante, cromo (III), manganeso (II), manganeso (III), hierro (II), hierro (III), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), praseodimio (III), neodimio (III), samario (III), gadolinio (III), terbio (III), disprosio (III), holmio (III), erbio (III), europio (III) e iterbio (III). Adicionalmente, los heteromultímeros de la presente invención pueden conjugarse también con una o más partículas superparamagnéticas.
Un experto en la técnica seleccionará un material de acuerdo con la dosis requerida para detectar un tejido que contiene la diana y considerar otros factores tales como toxicidad del metal para el paciente. Generalmente, la dosis deseada para un metal individual será proporcional a su relaxividad, modificada por la biodistribución, la farmacocinética y el metabolismo del metal. El catión trivalente Gd^{3+} es particularmente preferido para agentes de contraste MRI, debido a su alta relaxividad y baja toxicidad, con la ventaja adicional de que el mismo existe en un solo estado de oxidación biológicamente accesible, lo que minimiza la metabolización indeseable del metal por un paciente. Otro metal útil es Cr^{3+}, que es relativamente económico.
La molécula quelante es preferiblemente un agente quelante anfipático. En particular, dicha molécula comprende preferiblemente una porción hidrófila quelante, que incluye uno o más grupos polares (que actúan como ligando para y se complejan con, un metal paramagnético) y una porción lipófila capaz de interaccionar con las porciones lipófilas de los otros compuestos formadores de micelas, para integrar el complejo en la estructura micelar. La porción quelante es preferiblemente un residuo de un ácido quelante empleado comúnmente en la técnica, más preferiblemente un ácido quelante policarboxílico o poliaminocarboxílico. Agentes formadores de quelatos conocidos en la técnica incluyen ácidos con grupos de ácido metileno-fosfónico, grupos ácidos de metileno-carbohidroxamina, grupos carboxietilideno, o grupos carboximetileno. Ejemplos de formadores de quelatos incluyen, pero sin carácter limitante, ácido dietileno-triamina-pentaacético (DTPA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético (DO3A), ácido etilenodiamina-tetraacético (EDTA), y ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-1,4,8,11-tetraacético (TETA). Ligandos quelantes adicionales son etilenobis-(2-hidroxi-fenilglicina) (EHPG), y derivados del mismo, con inclusión de 5-Cl-EHPG, 5-Br-EHPG, 5-Me-EHPG, 5-t-Bu-EHPG, y 5-sec-Bu-EHPG; ácido benzodietilenotriamina-pentaacético (benzo-DTPA) y derivados del mismo, con inclusión de dibenzo-DTPA, fenil-DTPA, difenil-DTPA, bencil-DTPA, y dibencil-DTPA; ácido bis-2(hidroxibencil)-etileno-diaminadiacético (HBED) y derivados del mismo; la clase de compuestos macrocíclicos que contienen al menos 3 átomos de carbono, más preferiblemente al menos 6, y al menos 2 heteroátomos (O y/o N), pudiendo estar constituidos dichos compuestos macrocíclicos por un solo anillo, o por dos o tres anillos unidos en los heteroelementos del anillo, v.g. benzo-NOTA, dibenzo-DOTA, benzo-NOTA, donde NOTA es ácido 1,4,7-triazaciclononano N,N',N''-triacético, benzo-TETA, benzo-DOTMA, donde DOTMA es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetra(metil-tetraacético), o benzo-TETMA, donde TETMA es ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-1,4,8,11-(metiltetraacético); derivados de ácido 1,3-propilenodiaminatetraacético (PDTA) y ácido trietilenotetraaminahexaacético (TTHA); derivados de 1,5,10-N,N',N''-tris(2,3-dihidroxibenzoil)tricatecolato (LICAM); derivados de 1,3,5-N,N',N''-tris(2,3-dihidroxibenzoil)-aminometilbenceno (MECAM); o derivados de DO3A, tales como HP-DO3A (ácido 1,4,7,10-tetraazaciclo-dodecan-1-(2-hidroxipropil)-4,7,10-triacético). Ejemplos de formadores de quelatos y grupos quelantes representativos contemplados por la presente invención se describen en los documentos WO 98/18496, WO 86/06605, WO 91/03200, WO 95/28179, WO 96/23526, WO 97/36619, PCT/US98/01473, PCT/US98/20182, y las Patentes U.S. Nos. 4.899.755, 5.474.756, 5.846.519 y 6.143.274. Formadores de quelatos preferidos para uso en la presente invención son DO3A, HP-DO3A, DTPA o DOTA. El uso de los formadores de quelato DO3A o HP-DO3A es particularmente preferido.
El resto lipófilo puede estar enlazado a la porción respectiva formadora de quelato (v.g. cualquiera de los formadores de quelatos ilustrados anteriormente) de la molécula quelantes de acuerdo con técnicas conocidas. Por ejemplo, un resto hidrófobo puede enlazarse a un residuo de ácido carboxílico a través de un enlace éster o un enlace amida. Ejemplos de restos lipófilos adecuados que pueden enlazarse a través de un enlace éster al resto quelante incluyen residuos de alcoholes (C_{1}-C_{24}), preferiblemente (C_{8}-C_{24}), más preferiblemente alcoholes alifáticos lineales (C_{10}-C_{20}), tales como, por ejemplo, alcohol n-decílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol cetílico, o alcohol n-octadecílico; alcoholes aromáticos, tales como, por ejemplo, alcohol bencílico, alcoholes mono-, bi- o tri-(C_{1}-C_{4})alquil-fenílicos; y mezclas de los mismos. Análogamente, aminas preferidas a enlazar a través de un enlace amido al resto carboxílico de un ácido quelante incluyen aminas alifáticas lineales de alquilo(C_{1}-C_{24}), preferiblemente alquilo(C_{8}-C_{24}), más preferiblemente alquilo(C_{10}-C_{20}), tales como, por ejemplo n-decil-amina, n-dodecil-amina, n-tetradecil-amina, n-hexadecil-amina o n-octadecil-amina; aminas aromáticas, tales como, por ejemplo, bencil-amina, mono-, bi- o tri-alquil(C_{1}-C_{4})-fenil-amina; y mezclas de las mismas.
Ejemplos y la preparación de quelatos anfipáticos preferidos y complejos de los mismos con metales paramagnéticos se describen, por ejemplo, en las Patentes US 6.342.598 o 6.652.834.
Alternativamente, un átomo de nitrógeno de cualquiera de los ácidos poliaminocarboxílicos enumerados previamente puede proveerse de un resto alquilo o hidroxialquilo lineal (C_{8}-C_{24}), más preferiblemente (C_{10}-C_{20}), como se describe en la Patente US 6.342.518 citada anteriormente.
Alternativamente, un agente quelante policarboxílico puede proveerse de grupos lipófilo-hidrófobos enlazados a los segmentos alquileno de la cadena molecular principal, o al carbono alfa de las funciones carboxilato o a un grupo hidroxilo cuando está presente en el agente quelante, como se describe en el documento US 6.652.834.
Se prefieren particularmente aquellos derivados de ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético (DO3A) que llevan en la posición N-10 un resto lipófilo adecuado, tales como ácido [10-[2-(dioctadecilamino)-2-oxoetil]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético, que forma el complejo correspondiente [10-[2-(dioctadecilamino)-2-oxoetil]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacetato(3-)]gadolinio.
Preparaciones de ion metálico paramimético quelado pueden realizarse de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como por ejemplo la preparación descrita por G.W. Kabalka et al., Magnetic Resonance in Medicine 8 (1988), 89-95.
De acuerdo con una realización alternativa, el agente sensible a MRI puede ser una nanopartícula de magnetita. Las nanopartículas de magnetita pueden, por ejemplo, mezclarse con un material anfifílico cargado negativamente (y opcionalmente uno neutro), tales como los mencionados previamente, con objeto de estabilizar dichas partículas y mantenerlas dispersadas en una solución acuosa en forma micelar. La Patente U.S. No. 5.545.395 da varios ejemplos de preparación de dichas partículas estabilizadas de magnetita, v.g., por utilización de una mezcla de DPPA y Pluronic® para estabilización de dichas partículas.
Además de los arriba indicados, puede utilizarse cualquier otro agente sensible a MRI asociable de manera estable a la estructura micelar. Por ejemplo, cualquier compuesto anfifílico que comprenda un átomo hiperpolarizado tal como los mencionados previamente, con preferencia ^{13}C, puede incorporarse adecuadamente en una micela asociada con un liposoma en un ensamblaje de acuerdo con la invención. La relación molar del agente sensible a MRI en el componente micelar, en particular del ion metálico paramagnético, debe ser suficientemente alta para permitir la mejora deseada de la imagen de diagnóstico. Preferiblemente, la cantidad molar de agente sensible a MRI es con preferencia al menos 25% del total molar del material formador de micelas, más preferiblemente de al menos 50% y mucho más preferiblemente de al menos 70%. Típicamente, no son deseables en general cantidades mayores que aproximadamente 99%, dado que esto podría rebajar excesivamente la cantidad del componente cargado en la micela. De modo más preferible, la cantidad molar de agente sensible a MRI no es mayor que aproximadamente 95%.
Ligando de direccionamiento
Ventajosamente, las micelas de un ensamblaje de acuerdo con la invención pueden incluir adicionalmente un compuesto que tenga una actividad de direccionamiento, es decir un ligando de direccionamiento, que permita que el ensamblaje se fije a una diana específica.
El ligando de direccionamiento incluido en la micela puede ser sintético, semi-sintético, o existente naturalmente. Materiales o sustancias que pueden servir como ligandos de direccionamiento incluyen, por ejemplo, pero sin carácter limitante, proteínas, con inclusión de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, moléculas receptoras, moléculas de fijación de receptores, glicoproteínas y lectinas; péptidos, con inclusión de oligopéptidos y polipéptidos; peptidomiméticos; sacáridos, con inclusión de mono- y polisacáridos; vitaminas; esteroides; análogos de esteroides, hormonas, cofactores, agentes terapéuticos y material genético, con inclusión de nucleósidos, nucleótidos y polinucleótidos.
El término "diana" o "molécula diana" hace referencia a cualesquiera sustancias a la que puede fijarse a un ligando de direccionamiento, tales como proteínas o polipéptidos, células, receptores, carbohidratos, lípidos, etc.
Ejemplos de dianas y ligandos de direccionamiento adecuados se describen, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 6.139.819.
El ligando de direccionamiento puede ser un compuesto anfifílico per se que está mezclado con los otros componentes de la composición micelar, o puede ser un compuesto que se fija a una molécula anfifílica empleada para la formación de la micela.
En una realización preferida, el ligando de direccionamiento puede estar unido a una molécula anfifílica de la micela a través de un enlace covalente. En tal caso, el resto reactivo específico que precisa estar presente en la molécula anfifílica dependerá del ligando de direccionamiento particular a acoplar a la misma. Como ejemplo, si el ligando de direccionamiento puede enlazarse a la molécula anfifílica a través de un grupo amino, los restos reactivos adecuados para la molécula anfifílica pueden ser grupos isotiocianato (que formarán un enlace tiourea), ácidos carboxílicos o ésteres reactivos (para formar un enlace amida), grupos aldehído (para la formación de un enlace imina que se reducirá a un enlace alquilamina), etc.; si el ligando de direccionamiento puede enlazarse a la molécula anfifílica a través de un grupo tiol, restos reactivos complementarios adecuados para la molécula anfifílica incluyen derivados haloacetilo o maleimidas (para formar un enlace tioéter); y si el ligando de direccionamiento puede enlazarse a la molécula anfifílica a través de un grupo carboxílico, restos reactivos adecuados para la molécula anfifílica podrían ser aminas e hidrazidas (para formar enlaces amida o alquilamida). Con objeto de fijar covalentemente un ligando de direccionamiento deseado, al menos parte del compuesto anfifílico que forma la micela deberá contener por tanto un resto reactivo adecuado y el ligando de direccionamiento que contiene la funcionalidad complementaria se enlazará al mismo de acuerdo con técnicas conocidas, v.g. por adición del mismo a una dispersión acuosa que comprenda los componentes anfifílicos de la micela. El compuesto anfifílico puede combinarse con el ligando de direccionamiento deseado antes de preparar la micela, y la combinación así obtenida puede utilizarse en el proceso de preparación de la micela. Alternativamente, el ligando de direccionamiento puede enlazarse al compuesto anfifílico respectivo durante el proceso de preparación de la micela o puede enlazarse directamente al compuesto anfifílico ya incluido en una estructura micelar.
De acuerdo con una realización alternativa, el ligando de direccionamiento puede asociarse también convenientemente con la micela por la vía de interacción física y/o electrostática. Como ejemplo, un resto funcional que tenga una afinidad y selectividad altas para un resto complementario puede introducirse en la molécula anfifílica, mientras que el resto complementario se enlazará al ligando de direccionamiento. Por ejemplo, un resto avidina (o estreptavidina) (que tiene afinidad alta para biotina) puede enlazarse covalentemente a un fosfolípido, mientras que el resto biotina complementario puede incorporarse en un ligando de direccionamiento adecuado, v.g. un péptido o un anticuerpo. El ligando de direccionamiento marcado con biotina se asociará así con el fosfolípido marcado con avidina de la micela por medio de un sistema de acoplamiento avidina-biotina. Alternativamente, tanto el fosfolípido como el ligando de direccionamiento pueden proveerse de un resto biotina y acoplarse subsiguientemente uno a otro por medio de avidina (que es un componente bifuncional capaz de formar puente entre los dos restos biotina). Ejemplos de acoplamiento biotina/avidina de fosfolípidos y péptidos se describen también en el documento US 6.139.819 citado anteriormente. Como alternativa, interacciones de van der Waal's, interacciones electrostáticas y otros procesos de asociación pueden asociar o fijar el ligando de direccionamiento con las moléculas anfifílicas.
De acuerdo con una realización alternativa, el ligando de direccionamiento puede ser un compuesto que se mezcla con los componentes que forman la micela tales como, por ejemplo, un lipopéptido como se describe, v.g. en las Solicitudes de Patente Internacional WO 98/18501 o 99/55383. Alternativamente, puede fabricarse en primer lugar una micela, que comprende un compuesto que tiene un resto adecuado capaz de interaccionar con un resto complementario correspondiente de un ligando de direccionamiento; después de ello, el ligando de direccionamiento deseado se añade a la suspensión de micelas, para fijarse al resto complementario correspondiente en la micela. Como una alternativa adicional, puede prepararse un ensamblaje, que comprende una micela que incluye un compuesto que tiene un resto adecuado capaz de interaccionar con un resto correspondiente complementario de un ligando de direccionamiento; después de ello, el ligando de direccionamiento deseado se añade a la suspensión del ensamblaje, para fijarse al resto correspondiente en la micela. Ejemplos de dianas específicas adecuadas a las cuales puede estar dirigido el ensamblaje son, por ejemplo, fibrina y el receptor de fijación GPIIbIIIa en las plaquetas activadas. La fibrina y las plaquetas están presentes de hecho generalmente en los "trombos", es decir coágulos que pueden formarse en el torrente sanguíneo y causar una obstrucción vascular. Péptidos de fijación adecuados se describen, por ejemplo, en el documento US 6.139.419 citado anteriormente. Péptidos de fijación adicionales específicos para direccionamiento a fibrina se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Internacional WO 02/055544. Otros ejemplos de dianas importantes incluyen receptores en placas vulnerables y receptores específicos de tumores, tales como la región del dominio de quinasa (KDR) y el complejo VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular)/KDR. Péptidos de fijación adecuados para KDR o complejo VEGF/KDR se describen, por ejemplo, en las Solicitudes de Patente Internacional WO 03/74005 y WO 03/084574.
Micelas mixtas que contienen los componentes anfifílicos deseados, el ion metálico paramagnético quelado y, opcionalmente, un agente de direccionamiento, pueden prepararse como se conoce en la técnica, v.g. de acuerdo con el método de preparación descrito en la Patente Europea EP 804.251.
Por ejemplo, los componentes pueden dispersarse en un vehículo líquido acuoso por agitación. Ejemplos de vehículos líquidos adecuados son agua, solución salina (cloruro de sodio al 0,9%), solución salina tamponada con fosfato (10 mM, pH 7,4), tampón HEPES (20 mM, pH 7,4), y glucosa al 5% p/p en agua. Por ejemplo, los compuestos anteriores pueden dispersarse en una concentración de aproximadamente 1 a 100 mg/ml en un líquido acuoso y disolverse por medio de agitación mecánica suave o tratamiento por ultrasonidos.
Las micelas pueden guardarse luego como una dispersión acuosa (v.g. en el vehículo acuoso utilizado para su preparación) antes de mezclarse con una suspensión que contiene liposomas. Alternativamente, la suspensión de micelas puede liofilizarse de acuerdo con técnicas convencionales, para eliminar el líquido y guardar el producto seco final para los usos subsiguientes.
Ensamblaje
La preparación de un ensamblaje de acuerdo con la invención puede realizarse de acuerdo con métodos convencionales, v.g. por mezcla de una suspensión acuosa que comprende los liposomas (obtenida de acuerdo con cualquiera de los métodos de fabricación citados anteriormente) con un suspensión acuosa que comprende micelas obtenida como se ha descrito arriba.
Opcionalmente, la mezcla así obtenida puede someterse a uno o más pasos de lavado, con objeto de eliminar el exceso de componentes no asociados. Para los propósitos de la presente invención, el término "paso de lavado" incluye en su significado cualquier método o proceso dirigido a separar y/o al menos eliminar parcialmente el exceso de materiales no asociados, componentes, partículas y análogos de una suspensión de un compuesto deseado. Métodos de separación adecuados incluyen, por ejemplo, diálisis, decantación, centrifugación, ultrafiltración o microfiltración, siendo preferida generalmente la centrifugación. En el paso de lavado pueden emplearse soluciones de lavado convencionales adecuadas, tales como agua destilada, solución salina tamponada con fosfato, tampón Tris/glicerol, solución salina o solución de glucosa al 5%. La fase de la mezcla lavada que comprende el ensamblaje de la invención se separa luego y se recoge; opcionalmente, la suspensión recuperada que contiene el ensamblaje se diluye finalmente antes de su utilización, v.g. con cualquiera de los vehículos fisiológicamente aceptables citados anteriormente.
La suspensión que comprende el ensamblaje de la invención puede guardarse para una administración subsiguiente o puede administrarse directamente a un paciente. Si se desea, el vehículo líquido de la suspensión puede eliminarse (v.g. por liofilización) a fin de obtener un polvo seco del ensamblaje que puede guardarse luego durante periodos de tiempo relativamente largos antes de su reconstitución.
Alternativamente, los dos componentes del ensamblaje pueden guardarse como composiciones separadas en forma seca (v.g. liofilizada) y reconstituirse como una suspensión antes de la administración. La reconstitución con un vehículo líquido acuoso puede tener lugar por separado en las dos composiciones secas que comprenden los componentes respectivos del ensamblaje, obteniendo así dos suspensiones separadas que se mezclan subsiguientemente para obtener la suspensión de ensamblaje deseada. Alternativamente, las dos composiciones secas pueden mezclarse una con otra y reconstituirse luego como una sola suspensión con un vehículo líquido acuoso. De acuerdo con una realización preferida, la composición micelar seca se reconstituye primeramente con un vehículo acuoso fisiológicamente aceptable, y la suspensión obtenida se utiliza luego para reconstitución de la composición de liposomas seca, a fin de obtener finalmente una suspensión del ensamblaje.
Para la preparación del ensamblaje puede ser ventajoso añadir una cantidad en exceso de micelas con respecto a la cantidad de micelas que se desea tener en el ensamblaje final, debido en particular a que cierta cantidad de dichas micelas puede eliminarse durante los pasos de lavado opcionales de la suspensión de ensamblaje. El exceso de micelas se expresa por conveniencia como el exceso de cargas negativas (o positivas) en la preparación micelar con respecto a la cantidad de cargas positivas (o negativas) en la suspensión de liposomas, indicándose las cargas como "equivalente de cargas". El término "equivalente de carga" (EC) hace referencia al número de cargas por mol de un compuesto; así, un mol de un compuesto mono-iónico contiene un EC, un mol de un compuesto di-iónico contiene dos EC, y así sucesivamente. En general, se prefiere que la cantidad de EC en la composición micelar sea sustancialmente igual al EC en la composición de los liposomas (es decir relación EC de aproximadamente 1:1). La relación entre EC en la preparación micelar con respecto al EC en la preparación de liposomas puede variar así, por ejemplo, desde aproximadamente 1:2 a aproximadamente 3:1, preferiblemente desde 2:3 a 3:2. Con objeto de tener una indicación práctica de la eficacia del ensamblaje, la Solicitante ha encontrado útil hacer referencia al potencial \zeta (potencial zeta) de la suspensión de liposomas y la suspensión de ensamblaje. El potencial \zeta, denominado también potencial electrocinético, es el potencial eléctrico en la superficie de una partícula coloidal con relación al potencial en el medio a granel a una distancia larga. El mismo puede medirse de acuerdo con métodos analíticos convencionales de micro-electroforesis, v.g. por la determinación de la velocidad de las partículas en un campo eléctrico impulsor por Anemometría Láser-Doppler. Por ejemplo, puede utilizarse ventajosamente el instrumento ZetaSizer 3000 Has (Malvern Instrument GmbH). En la práctica, se determina primeramente el potencial \zeta de la suspensión inicial de liposomas, el cual puede tener un valor positivo o negativo, dependiendo de si los liposomas contienen compuestos con carga positiva o negativa, respectivamente. A continuación, se mida el potencial \zeta en la suspensión final que contiene el ensamblaje (es decir después de los pasos de lavado necesarios para eliminar micelas posiblemente no fijadas). En general, la adición de micelas de signo opuesto con respecto a los liposomas determina una disminución más o menos pronunciada en valor absoluto del potencial \zeta de la suspensión. En particular, las suspensiones que comprenden liposomas cargados positivamente exhibirán una disminución del potencial \zeta después de la adición de una suspensión de micelas cargadas negativamente, mientras que las suspensiones que comprenden liposomas cargados negativamente exhibirán un aumento relativo del potencial \zeta (es decir, una disminución en valor absoluto) después de la adición de una suspensión de micelas cargadas positivamente. Como ha sido observado por la Solicitante, los ensamblajes preferidos son aquellas suspensiones que exhiben una disminución sustancial en valor absoluto respecto al potencial \zeta de la suspensión inicial de liposomas, es decir una disminución de al menos 50%, preferiblemente al menos 75% y más preferiblemente al menos 90% de dicho valor inicial. Suspensiones de ensamblajes particularmente preferidas son aquéllas que exhiben un potencial \zeta sustancialmente neutro (es decir 0 \pm 15 mV, correspondiente a una disminución absoluta de aproximadamente 100% con respecto al potencial inicial de la suspensión de liposomas) o un potencial \zeta opuesto en signo con respecto al potencial \zeta de la suspensión inicial de liposomas. Como ha sido observado por la Solicitante, cuando el potencial \zeta de la suspensión de ensamblaje se mantiene igual en signo con una disminución absoluta inferior al 50% con respecto al potencial \zeta de las suspensiones iniciales de liposomas, esto puede ser una indicación de que un número insuficiente de micelas están asociadas con los liposomas.
De acuerdo con una realización preferida, la cantidad de micelas cargadas en el ensamblaje es tal que confiere un potencial \zeta sustancialmente neutro a dicho ensamblaje o un potencial \zeta que es opuesto en signo respecto al potencial \zeta de la suspensión de liposomas. Como ha sido observado por la Solicitante, para obtener dicho potencial \zeta neutro o de signo opuesto del ensamblaje, no es necesario sin embargo que el ensamblaje contenga un exceso de equivalentes de carga de las micelas. De hecho, se ha observado que ensamblajes compuestos de liposomas positivos y micelas negativas y que tienen una relación entre EC en las micelas y equivalentes de carga opuesta en los liposomas de aproximadamente 1:5 (es decir, un exceso de aproximadamente 5 veces de cargas positivas en los liposomas) puede exhibir sin embargo un potencial \zeta sustancialmente neutro o negativo. Aunque no se desea quedar ligados por ninguna teoría particular, puede suponerse que las cargas (negativas) comprendidas en las micelas están dispuestas en la superficie exterior del ensamblaje; si el número de micelas asociadas con el liposoma es suficientemente alto, el exceso de cargas opuestas (positivas) en el liposoma puede resultar, al menos parcialmente, apantallado por dichas micelas. Así, dado que el potencial \zeta medido en una partícula se ve influenciado fuertemente por las cargas presentes en el límite exterior de dicha partícula, incluso un ensamblaje que tenga un exceso de equivalentes (positivos) de carga derivados de un liposoma puede exhibir un potencial \zeta negativo, si la cantidad de micelas cargadas (negativamente) es suficiente para apantallar parcialmente las cargas (positivas) del liposoma. Todo lo anterior es por supuesto aplicable también a ensamblajes formados por liposomas cargados negativamente y micelas cargadas positivamente.
Las composiciones inyectables después de la reconstitución del agente de contraste liofilizado deben ser, en la medida de lo posible, isotónicas con la sangre. Por tanto, antes de la inyección, pueden añadirse también pequeñas cantidades de agentes isotónicos a las suspensiones que comprenden el ensamblaje de la invención. Los agentes isotónicos son soluciones fisiológicas utilizadas comúnmente en medicina tales como, solución salina acuosa (NaCl al 0,9%), solución de glicerol al 2,6% o solución de dextrosa al 5%. La reconstitución de las suspensiones acuosas se obtiene generalmente por simple disolución de los componentes secos y agitación moderada.
El volumen y las concentraciones del líquido de reconstitución pueden estar deseablemente equilibrados para hacer sustancialmente isotónicas las formulaciones resultantes listas para ser utilizadas. Por tanto, el volumen y la concentración del fluido de reconstitución seleccionado dependerán del tipo y cantidad de estabilizador (y otros agentes de aumento de volumen) presente en el producto liofilizado.
El ensamblaje de la invención puede incluirse en kits de diagnóstico que comprenden el ensamblaje de la invención o sus componentes separados respectivos, comprendiendo opcionalmente además el vehículo líquido acuoso.
De acuerdo con una primera realización, dicho kit es un kit de dos componentes que comprende el ensamblaje de la invención junto con un vehículo líquido acuoso. Dicho kit de dos componentes puede incluir dos envases separados o un envasa de dos cámaras.
En el primer caso, el primer envasa es preferiblemente un vial convencional sellado con una membrana, en donde el vial que contiene el ensamblaje como un residuo liofilizado (obtenido de acuerdo con cualquiera de los métodos ilustrados anteriormente) está sellado con una membrana a través de la cual puede inyectarse el líquido vehículo para reconstituir la suspensión de ensamblajes. El líquido vehículo está contenido en un segundo envasa que tiene preferiblemente la forma de una jeringuilla. La jeringuilla se llena previamente de modo preferible con la suspensión reconstituida y se utiliza subsiguientemente para administrar el agente de contraste por inyección. En lugar del ensamblaje formado, el primer envasa puede contener alternativamente mezclas de micelas liofilizadas por separado y composiciones de liposomas, que formarán el ensamblaje deseado después de su reconstitución con el vehículo acuoso. Aunque por regla general la agitación a mano del envasa proporciona la energía deseada para reconstitución de la suspensión, pueden proporcionarse medios para dirigir o permitir la aplicación de energía suficiente al envasa (v.g. un mezclador Vortex), a fin de asegurar la reconstitución adecuada de la suspensión de ensamblajes. El envasa de dos cámaras es preferiblemente una jeringuilla de dos cámaras, en la cual los componentes se mantienen separados v.g. por medio de una membrana desechable, y una vez que el liofilizado se ha reconstituido por agitación suave mediante sacudidas, puede utilizarse directamente el envasa para inyectar el agente de contraste. Como anteriormente, pueden proporcionarse medios para dirigir o permitir la aplicación de energía suficiente al envase.
Puede ser apreciado por una persona con experiencia ordinaria en la técnica que otros sistemas de reconstitución de dos cámaras capaces de combinar el polvo seco con la solución acuosa de una manera estéril están también dentro del alcance de la presente invención. De acuerdo con una realización alternativa, un kit de acuerdo con la invención es un kit de al menos dos componentes que comprende una composición de micelas, una composición de liposomas y, opcionalmente, un vehículo acuoso. El kit se presenta preferiblemente como al menos dos envases separados, conteniendo el primero de ellos la composición de liposomas liofilizada y conteniendo el segundo la composición de micelas liofilizadas deseada (v.g. donde las micelas comprenden un ligando de direccionamiento adecuado). Un tercer envasa opcional, que contiene el vehículo acuoso para reconstitución, puede incluirse ventajosamente en el kit. Si se desea, pueden incluirse en el kit envases adicionales que contienen micelas liofilizadas adicionales (v.g. que comprenden un segundo ligando de direccionamiento) o composiciones de liposomas. Para la administración, la suspensión micelar se reconstituye primeramente en el vehículo acuoso y la suspensión obtenida se utiliza luego para reconstituir la composición de liposomas, formando así la suspensión de ensamblaje deseada.
No se requieren envases, viales o sistemas de conexión específicos de ningún tipo; la presente invención puede utilizar envases, viales y adaptadores convencionales. El único requerimiento es un sellado satisfactorio entre el tapón y el envase. La calidad del sellado, por consiguiente, es una cuestión de importancia primaria; cualquier degradación de la integridad del sellado podría permitir la entrada de sustancias indeseables en el vial. Además de asegurar la esterilidad, es esencial el mantenimiento de vacío para los productos tapados a las presiones del ambiente o presiones reducidas a fin de garantizar una reconstitución segura y adecuada. El material del tapón que forma el sello estanco a los gases del envasa es preferiblemente un compuesto elastómero o una formulación multicomponente basada en un elastómero, tal como poli(isobutileno) o caucho de butilo. Convenientemente, puede utilizarse un tapón de caucho de butilo de Daiko Seiko Ltd.
La composición de la invención puede utilizarse de la misma manera que las composiciones terapéuticas o diagnósticas convencionales. Por ejemplo, cuando la composición comprende un agente sensible a MRI, pueden preferirse ciertas técnicas MR y secuencias de pulsos cuando se trata de obtener la imagen de un tejido que contiene la diana tal como, por ejemplo, un sitio de angiogénesis, a fin de mejorar el contraste del sitio respecto a la sangre y los tejidos sustrato. Estas técnicas incluyen (pero sin carácter limitante), por ejemplo, secuencias en negro de angiografía de sangre que procuran oscurecer la sangre, tales como eco-secuencias de espín rápidas (véase v.g. Alexander et al., Magnetic Resonance in a Medicina, 40(2): 298-310 (1998)) y eco-secuencias en gradiente de flujo deteriorado ("flow-spoiled") (véase v.g. Edelman et al., Radiology, 177(1): 45-50 (1990)). Estos métodos incluyen también técnicas de flujo independiente que mejoran la diferencia de contraste, tales como secuencias preparadas por inversión-recuperación o preparadas por saturación-recuperación, que aumentarán el contraste entre el tejido que contiene la diana, tal como un tumor angiogénico, y los tejidos sustrato. Finalmente, preparaciones de transferencia por magnetización pueden aumentar también el contraste con estos agentes (véase v.g. Goodrich et al., Investigative Radiology, 31(6): 323-32 (1996)).
El ensamblaje de la invención se administra preferiblemente al paciente en la forma de una composición inyectable. El método de administración es preferiblemente parenteral, es decir intravenoso, intraarterial, intratecal, intersticial, intradérmico o intracavitario. Para obtención de imágenes de angiogénesis activa, se prefiere la administración intravenosa o intraarterial.
Cuando el ensamblaje contiene un compuesto sensible a MRI y un ligando de direccionamiento, se contempla que el paciente recibirá una dosis de agente de contraste suficiente para mejorar la señal MR en la diana (v.g. un sitio de angiogénesis) al menos un 10%. Después de la inyección del ensamblaje que incluye el reactivo MRI, el paciente se somete a escaneo en la máquina MRI para determinar la localización de cualesquiera sitios que contengan la diana. En los escenarios terapéuticos, después de localización de la diana, puede administrarse inmediatamente un agente terapéutico, en caso necesario, y el paciente puede escanearse subsiguientemente para visualizar el efecto terapéutico.
Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar la invención con mayor detalle.
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Ejemplos
Se emplean en los ejemplos los materiales siguientes:
1
Los potenciales \zeta del liposoma y las suspensiones de ensamblaje se determinan utilizando un instrumento Malvern ZetaSizer 3000Hsa en glucosa 0,4M.
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Ejemplo 1
Preparación de liposomas cargados positivamente de 1,0 \mum de diámetro
Se disuelven 1037,7 mg (1,332 mmol) de SPC3, 74,9 mg (0,089 mmol) de etil-SPC3, y 137,4 mg (0,355 mmol) de colesterol (Fluka) en una mezcla de 17 ml de metanol y 33 ml de cloroformo. La solución se filtra sobre un filtro estéril de 0,2 \mum (Macherey Nagel) y se añade como marcador una cantidad de trazador 14C-tripalmitina (10 \mul en CHCl3; actividad específica 50 \muCi/ml). Se eliminan los disolventes orgánicos por evaporación en un evaporador rotativo (Rotavapor) a 40ºC a presión reducida y el residuo se seca durante una noche a la misma temperatura bajo una presión de 1 torr.
Se añaden a los lípidos secos 50 ml de una solución de Iomeprol (Bracco Imaging), correspondientes a 280 mg de yodo por ml, de tal manera que la solución obtenida contiene aproximadamente 25,3 mg de lípidos/ml (CLip). La solución se calienta luego durante aproximadamente media hora a 80ºC con agitación suave para efectuar la hidratación de los lípidos con la formación subsiguiente de vesículas de liposoma. La suspensión de liposomas se extruye luego en sucesión 5 veces a través de un filtro de policarbonato de tamaño de poro 2,0 \mum (Nucleopore^{(TM}).
Con objeto de determinar la cantidad de yodo encapsulada eficazmente en las vesículas de liposoma, se dializa una parte alícuota de 1 ml de la preparación filtrada (bolsa de diálisis de Serva; punto de corte por peso molecular \approx 10.000-15.000) durante aproximadamente 10-12 horas contra 1 l de tampón PBS. La operación de diálisis se repite una vez para asegurarse de que se ha eliminado totalmente el yodo libre no encapsulado. Se añade una solución de dodecil-sulfato de sodio al 10% (0,1 ml) a la solución dializada (0,9 ml) y la mezcla se calienta a 40ºC durante 5 minutos para destruir los liposomas y liberar el yodo atrapado. El contenido de yodo en la preparación final se determina por medida de la densidad óptica de esta solución a 230 nm. En el específico (sic), la proporción final contenía 230 mg/ml de Iomeprol (correspondientes a 113 mg de yodo atrapado en liposomas por ml de suspensión).
La cantidad de lípidos efectivamente presente en la preparación se determina por medida de la radiactividad de la muestra utilizando un analizador de centelleo de líquidos (Packard 2200-CA, TRI-CARB®). En el específico (sic), se determinó una concentración de lípidos (CLip) de 25 mg/ml.
El volumen total de la suspensión filtrada de liposomas se somete a diálisis (bolsa de diálisis de Serva; punto de corte por peso molecular \approx 10.000-15.000, PBS) para eliminar el yodo libre no encapsulado de la suspensión y se concentra luego por ultrafiltración (membrana de células Amicon) para aumentar aproximadamente dos veces la concentración de lípidos (aproximadamente 30 mg/ml).
El tamaño medio de las vesículas de liposoma y la distribución de tamaños de las vesículas se determinan por un método de Dispersión Dinámica de la Luz (DLS) (conocido también como "Photon Correlation Spectroscopy - PCS") utilizando un Malvern Mastersizer MS20 (Malvern Instruments). La determinación específica indicó que el tamaño medio de las vesículas en la presente preparación era aproximadamente 1,05 \mum.
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Ejemplo 1a
Se aplica el mismo procedimiento del Ejemplo 1, pero los lípidos secos obtenidos después de la evaporación del disolvente orgánico se hidratan con 50 ml de una solución de glucosa 0,4M (en lugar de los 50 ml de solución de Iomeprol®). Después de la extrusión como en el Ejemplo 1, se obtienen liposomas con un diámetro medio de aproximadamente 1 \mum.
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Ejemplo 2
Preparación de liposomas cargados positivamente de 0,4 \mum de diámetro
Se sigue el mismo procedimiento del Ejemplo 1, con el paso adicional de que después de las 5 extrusiones a través del filtro de policarbonato de 2,0 \mum, la suspensión de liposomas se filtra ulteriormente cinco veces a través de un filtro de policarbonato de tamaño de poro 1,0 \mum y ulteriormente 5 veces a través de un filtro de policarbonato de tamaño de poro 0,6 \mum.
Yodo encapsulado: 67,7 mg/ml; diámetro medio de los liposomas: 0,42 \mum.
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Ejemplo 3
Preparación de liposomas cargados positivamente de 0,2 \mum de diámetro
Se sigue el mismo procedimiento del Ejemplo 2, con el paso adicional de que después de las 5 extrusiones a través del filtro de policarbonato de 0,6 \mum, la suspensión de liposomas se filtra ulteriormente cinco veces a través de un filtro de policarbonato de 0,4 \mum y 5 veces a través de un filtro de policarbonato de 0,2 \mum.
Yodo encapsulado: 33,6 mg/ml; diámetro medio de los liposomas: 0,22 \mum.
Todas las preparaciones de liposomas de los Ejemplos 1-3 exhiben un potencial \zeta de aproximadamente +45 mV \pm2.
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Ejemplo 4
Preparación de micelas cargadas negativamente con complejo de Gd
Se disuelven 200 mg de complejo de Gd y 200 mg de DSPE-PEG2000 en 10 ml de agua destilada y la mezcla se homogeneiza por tratamiento con ultrasonidos durante aproximadamente 30 min a 70ºC (Sonificador Branson, potencia 40).
Se miden las relaxividades del espín protónico de la suspensión de micelas utilizando un aparato Minispec PC-120 (Brucker), que opera por debajo de 0,47 Tesla (20 MHz). Se utiliza EDM510A (EDM = Módulo de Definición del Experimento) para medir el tiempo de relajación espín-red T1 por el método de "recuperación de inversión". Se utilizó EDM610A para medir el tiempo de relajación espín-espín T2 por la técnica de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (GPMG). Las medidas de las relaxividades longitudinal (r_{1}) y transversal (r_{2}) (expresadas en s^{-1}mM^{-1} = 1/T) en una suspensión 1 mM preparada como anteriormente eran como sigue:
(r_{1}) = 22.6; 
\hskip0,5cm
(r_{2}) = 26.3
Ejemplo 5
Preparación de ensamblaje con liposomas cargados positivamente y micelas cargadas negativamente con complejo de Gd
Se llevan a cabo tres preparaciones de ensamblaje, por mezcla de 4 ml de una suspensión de micelas preparadas de acuerdo con el Ejemplo 4 con 16 ml de cada una de las tres suspensiones de liposomas preparadas de acuerdo con los Ejemplos 1 a 3, con objeto de obtener suspensiones respectivas de ensamblajes A1, A2, y A3. La mezcla se agita suavemente durante 4 horas y se deja luego en reposo a 4ºC durante una noche. Después de ello, se lleva la suspensión a la temperatura ambiente y se centrifuga durante 1 hora a 30.000 g (Heraeus Supratech 22). Se recuperan luego los ensamblajes liposoma-micela del pelet del sedimento de la suspensión centrifugada (desechando el sobrenadante) y se suspenden en glucosa 0,4M, hasta un volumen total de 16 ml, y se agitan suavemente durante una
noche.
Para cada preparación, se determinan el contenido de yodo y los tiempos de relajación T1 y T2 como se ilustra en los Ejemplos 1 y 4, respectivamente, por mezcla de 0,4 ml de cada preparación con 3 ml de sangre (rata). Se calculan luego las relaxividades r1 y r2 a partir de los valores T1 y T2 respectivos. Los valores de relaxividad r1 y r2 (en s^{-1}mM^{-1}) medidos sobre las preparaciones de los ensamblajes A1, A2 y A3 eran como sigue:
A1: r1= 21,1,
r2= 25,2;
A2: r1= 19,6,
r2= 23,5;
A3: r1= 22,7,
r2= 25,6.
Para las tres preparaciones de ensamblaje, el potencial \zeta medido era aproximadamente +5 mV \pm1.
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Ejemplo 5a
Se sigue el mismo procedimiento del Ejemplo 5, pero los 4 ml de la suspensión de micelas del Ejemplo 4 se mezclan con 16 ml de una suspensión de liposomas del Ejemplo 1a. La mezcla se agita suavemente durante 4 horas y se deja luego en reposo durante una noche a 4ºC. Después de ello se lleva la suspensión a la temperatura ambiente y los ensamblajes formados se separan del exceso de micelas no fijadas por medio de cromatografía de exclusión de tamaños, eluyendo con una solución de glucosa 0,4M.
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Ejemplo 6
Preparación de ensamblaje con liposomas cargados negativamente y micelas cargadas positivamente con complejo de Gd
Se prepara una suspensión de liposomas cargados negativamente que comprendían 840,5 mg (1,079 mmoles) de SPC3, 58,1 mg (0,073 mmoles) de DSPG\cdotNa y 113,7 mg (0,294 mmoles) de colesterol disuelta en 20 ml de solución de Iomeprol de acuerdo con el procedimiento reseñado en el Ejemplo 1. El tamaño medio de las vesículas era aproximadamente 0,95 \mum.
Se prepara una suspensión de micelas cargadas positivamente que comprendía 200 mg de complejo de Gd, 300 mg de Pluronic F108 y 61,6 mg de Etil-SPC3 disuelta en 20 ml de agua destilada de acuerdo con el procedimiento reseñado en el Ejemplo 4. El tamaño medio de las micelas era aproximadamente 0,80 nm.
Se mezcla 1 ml de la suspensión de liposomas con 1 ml de la suspensión de micelas de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 5. El ensamblaje recuperado resultante exhibía los valores de relaxividad siguientes: r1 = 21,6 s^{-1}mM^{-1}, r2 = 24,2 s^{-1}mM^{-1}.
El potencial \zeta medido sobre la preparación inicial de liposomas es de aproximadamente 32 mV, mientras que el potencial \zeta de la preparación final de ensamblaje es de aproximadamente -3 mV.
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Ejemplo 7
Preparación de ensamblaje con liposomas cargados positivamente y micelas cargadas negativamente con partículas de magnetita
Se prepara una suspensión de liposomas cargados positivamente de acuerdo con el procedimiento reseñado en el Ejemplo 1.
Se preparan partículas de magnetita recubiertas con DPPA/Pluronic F108 (relación FE/DPPA/Pluronic F108 3/15/
15 en mg/ml) de acuerdo con la Patente US 5.545.395. La solución se diluye con 10 ml de glucosa al 5%.
Se mezclan 5 ml de la suspensión de liposomas con 4,5 ml de suspensión de micelas de magnetita, se mantienen durante 3 horas bajo agitación rotativa, y se centrifugan luego a 3500 g durante 30 minutos. Se desecha el sobrenadante y se diluye la solución que contiene las micelas con 50 ml de glucosa al 5%. El valor de relaxividad r2 medido sobre la suspensión de ensamblaje obtenida era 366,6 s^{-1}mM^{-1}.
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Ejemplo 8
Preparación de ensamblaje con liposomas cargados positivamente que contienen complejo de Gd y micelas cargadas negativamente con complejo de Gd
1156,5 mg de SPC3, 163,5 mg de colesterol, 178,5 mg de Etil-SPC3 y 375,0 mg de complejo de Gd se disuelven en 100 ml de CHCl_{3}. Se evapora el disolvente en el evaporador rotativo a 50ºC y se seca el residuo durante una noche en un horno de vacío. La película de lípido seca se rehidrata por adición de 150 ml de Iomeprol (280 mg yodo/ml) durante 45 min a 65ºC con agitación moderada. La suspensión de liposomas obtenida se pasa luego 5 veces a través de un filtro de policarbonato de 2 \mum (Nucleopore) y se dializa finalmente contra glucosa 0,4M, para eliminar el Iomeprol no atrapado.
Los valores de relaxividad determinados en los liposomas eran como sigue:
r1 = 9.3\ s^{-1}mM^{-1}
r2 = 12.6\ s^{-1}mM^{-1}
5 ml de una suspensión micelar que contiene 26,02 mg/ml de complejo de Gd y 20,04 mg/ml de PE-PEG2000 en agua se añaden a 20 ml de la suspensión de liposomas anterior. La mezcla se deja a la temperatura ambiente durante aproximadamente 3 horas y se centrifuga luego a 35.000 g durante 45 minutos. Se desecha el sobrenadante y los ensamblajes recuperados se resuspenden en glucosa 0,4M.
Los valores de relaxividad medidos sobre la suspensión de ensamblaje fueron como sigue:
r1 = 16.9\ s^{-1}mM^{-1}
r2 = 21.6\ s^{-1}mM^{-1}
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Ejemplo 9
Evaluación de la circulación en la sangre de las preparaciones de ensamblaje
Las preparaciones de ensamblaje obtenidas de acuerdo con el Ejemplo 5 se evalúan en cuanto a sus propiedades respectivas de circulación en la sangre y se comparan con preparaciones de liposomas correspondientes obtenidas de acuerdo con los Ejemplos 1 a 3.
En lo que sigue, las preparaciones de liposomas de los Ejemplos 1, 2 y 3 se identifican como L1 (tamaño medio de 1,05 \mum), L2 (tamaño medio de 0,42 \mum) y L3 (tamaño medio de 0,22 \mum), respectivamente, mientras que las preparaciones de ensamblaje correspondientes obtenidas como se describe en el Ejemplo 5 (es decir, por mezcla de cada una de dichas preparaciones de liposoma con la preparación de micelas obtenida de acuerdo con el Ejemplo 4), se identifican como A1, A2, y A3, respectivamente. Las preparaciones de liposomas y de ensamblaje se inyectan luego por vía intravenosa en 6 grupos (3 para las preparaciones de liposoma y 3 para las preparaciones de ensamblaje) de 7 ratas cada uno (8 ml de suspensión por kg de rata en la vena del rabo) y se determina la concentración de yodo y de gadolinio (eliminación de la sangre) para cada preparación inyectada en diferentes momentos por sacrificio de una de las 7 ratas de cada grupo a intervalos de 5, 10, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos. La concentración de gadolinio en cada momento se determina como se describe en el Ejemplo 4, y se expresa como el porcentaje de los valores iniciales T1 y T2 de la dosis inyectada. La concentración de yodo se determina por HPLC después del tratamiento de partes alícuotas de 500 \mul de sangre extraída con 100 \mul de SDS (10 mina, 65ºC bajo agitación) y 100 \mul de HClO_{4} al 35% (10 min bajo centrifugación); el sobrenadante se pasa luego a través de una columna HPLC (LiChrosfer 10RP-18, Merck; fase A: tampón de fosfato de potasio 10 mM, pH 6,0; fase B: 30% MeOH, 70% fase A; 1 ml/min; detección UV: 240 nm); la concentración de yodo se expresa como el porcentaje de la concentración inicial de yodo en la dosis inyectada. Las Figuras 2-4 muestran los gráficos de eliminación de yodo (líneas con rombos) y de gadolinio (T1, líneas con cuadrados; T2, líneas con triángulos) de la sangre, para las preparaciones de ensamblaje A1, A2, y A3, respectivamente.
Como puede deducirse de dichas figuras, las preparaciones de ensamblaje A1, A2, y A3 tienen una variación sustancialmente similar de la concentración de yodo y gadolinio en función del tiempo, lo que demuestra que las preparaciones siguen una cinética de eliminación de la sangre sustancialmente similar y que el ensamblaje es estable cuando se inyecta en la circulación sanguínea (ausencia de separación entre los liposomas que contienen yodo y las micelas que contienen gadolinio). Por el contrario, como se muestra en las Figuras 5-7 (que ilustran la variación de yodo en el tiempo para las preparaciones A1-L2, A2-L2 y A3-L3, respectivamente), las preparaciones de liposomas L1, L2 y L3 (líneas inferiores con cuadrados) muestran una cinética bastante rápida de eliminación de la sangre, en comparación con los ensamblajes A1, A2 y A3 respectivos (líneas superiores con triángulos), indicando así que la capa micelar que rodea los liposomas actúa como una clase de barrera "invisible" para los liposomas, permitiendo aumentar sus tiempos de residencia respectivos en la circulación sanguínea.
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Ejemplo 10
Formación de imágenes MR in vitro de ensamblajes direccionados a. Preparación del ensamblaje con micelas biotiniladas
Se prepara una suspensión de liposomas de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 1.
Se prepara una suspensión micelar de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 4, dispersando 200 mg de complejo de Gd, 150 mg de DSPE-PEG2000 y 50 mg de DSPE-PEG2000 biotinilado en 10 ml de agua destilada.
Se añaden 40 ml de la preparación de liposomas a 5,25 ml de la suspensión micelar con agitación (agitador magnético) y se mantienen en agitación durante 3 horas. Después de ello, se centrifuga la suspensión durante 30 minutos a 25.000 g, se recuperan los ensamblajes liposoma-micela de los pelets de la suspensión centrifugada (desechando el sobrenadante), y se suspenden luego en un volumen de PBS para un volumen total de 35 ml.
Los valores relativamente altos de los tiempos de relajación T1 (1800 ms) y T2 (2000 ms) medidos en la fase de sobrenadante desechada permiten la estimación de que el gadolinio está sustancialmente ausente de esta fase y que la totalidad sustancial de las micelas están ligadas por tanto a los liposomas.
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b. Preparación del sustrato Neutravidin®
Para la evaluación de la eficacia de formación de imágenes del ensamblaje de la invención, se emplean dos cartuchos de fibras huecas (Minikros M11 260 01 P, membrana polisulfónica, de Spectrum Laboratories Inc.), para simular la estructura vascularizada de un tumor. Los detalles del cartucho son como sigue:
longitud de fibras: 12,2 cm; longitud total: 18,5 cm; diámetro del tubo del cartucho: 1,88 cm; superficie útil total: 615 cm^{2}; diámetro de fibra: 0,05 cm; volumen interior de la fibra: 0,024 cm^{3}; superficie interior de la fibra: 1,92 cm^{2}.
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Ensayo de formación de imágenes
Se llena un primer cartucho (A, control) con 25 ml de tampón de carbonato (pH 9,8).
Se llena un segundo cartucho (B) con una mezcla de 4 ml de una solución de Neutravidin® de concentración 1 mg/ml y 20 ml de un tampón de carbonato (pH 9,8). El cartucho se deja durante una noche a 4ºC y se lava luego tres veces con tampón PBS al 0,1% (p/p) de Tween® 20. Después del lavado, se llena el cartucho con 22 ml de la suspensión de ensamblaje anterior, se incuba durante 24 horas a la temperatura ambiente y se lava luego 10 veces con 25 ml de PBS, hasta que resulta del lavado un líquido claro.
Se analizan los dos cartuchos por medio de un aparato Philips Intera 1.5T, con dos secuencias de eco diferentes, como se detalla en las Tablas 1 y 2 siguientes. En las mismas tablas, se da la intensidad relativa de la señal detectada para ambos cartuchos (expresada en unidades relativas arbitrarias).
TABLA 1 Intensidad de señal relativa Secuencia eco de espín: TR = 400 ms; TE = 20 ms
3 
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TABLA 2 Intensidad de señal relativa Secuencia eco de gradiente: TR = 116 ms; TE = 29 ms; ángulo de salto: 80º
4
Las Figuras 8a y 8b muestran las imágenes respectivas correspondientes a los valores presentados en la Tabla 2. Por estas figuras, puede apreciarse la mejora sustancial de la formación de imagen proporcionada por una suspensión que contiene un ensamblaje direccionado de acuerdo con la invención en el cartucho B, mientras que se consigue una formación de imagen más bien pobre del cartucho A.
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Ejemplo 11
Formación de imágenes MR in vivo de los ensamblajes direccionados
Se prepara una suspensión de liposomas que comprende complejo de Gd, SPC3, colesterol y etil-SPC3 en una relación molar de 12,5/60/17,5/10, de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 8.
Se prepara una suspensión micelar de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 4, dispersando 200 mg de complejo de Gd, 150 mg de DSPE-PEG2000 y 50 mg de DSPE-PEG2000 biotinilado en 10 ml de agua.
Se añaden 40 ml de la preparación de liposomas a 5,25 ml de la suspensión micelar con agitación (agitador magnético) y se deja en agitación durante tres horas. Después de ello, se centrifuga la suspensión durante 30 minutos a 25.000 g, se recuperan los ensamblajes liposoma-micela del fondo de la suspensión centrifugada (desechando el sobrenadante), y se suspenden luego en glucosa 0,4M hasta una concentración final de lípidos de 25 g/l. La suspensión de ensamblaje se incuba luego durante una noche con neutravidina a la temperatura ambiente (relación biotina/neutravidina: 20/1).
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Ensayo de formación de imagen
Se implantan dos tumores VX2 yuxtapuestos (derecha e izquierda) en el lomo de un conejo. Quince días después de la implantación, se inyectan por vía intravenosa 150 \mug de anticuerpo humano Biot-\beta3 que reconoce el receptor \alphaV\beta3 expresado en células endoteliales (Chemicon International Inc.). 24 horas después, se inyectan las preparaciones de ensamblaje (3 ml/kg de conejo) y 8 horas más tarde se somete el conejo a MRI. Se observa una visualización clara de los dos tumores.

Claims (23)

1. Composición para uso diagnóstico o terapéutico que comprende un ensamblaje que comprende:
- un liposoma que lleva una primera carga global neta y que tiene una envolvente límite con superficies interior y exterior respectivas, definiendo dicha envolvente una porción interior del mismo; y
- una pluralidad de componentes micelares, que comprenden un compuesto de mejora de imágenes y que llevan una segunda carga global neta de signo opuesto a dicha primera carga neta, estando dichos componentes micelares asociados con la superficie exterior de la envolvente de dicho liposoma por una interacción sustancialmente electrostática.
2. Composición de acuerdo con la reivindicación 1 en la cual dicho componente micelar comprende un compuesto polímero anfifílico.
3. Composición de acuerdo con la reivindicación 1 en la cual dicho compuesto mejorador de imágenes es un compuesto sensible a MRI.
4. Composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la cual dicho compuesto sensible a MRI es un ion metálico paramagnético complejado por una molécula quelante que incluye un resto lipófilo.
5. Composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la cual dicho ion paramagnético se selecciona entre cromo (III), manganeso (II), manganeso (III), hierro (II), hierro (III), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), praseodimio (III), neodimio (III), samario (III), gadolinio (III), terbio (III), disprosio (III), holmio (III), erbio (III), europio (III) e iterbio (III).
6. Composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la cual dicha molécula quelante es un agente anfipático quelante que comprende una porción hidrófila quelante y una porción lipófila.
7. Composición de acuerdo con la reivindicación 6, en la cual dicha porción hidrófila quelante es un residuo de un ácido quelante seleccionado de ácido dietilenotriamina-pentaacético (DTPA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), benzo-DOTA, dibenzo-DOTA, ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético (DO3A), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclo-dodecan-1-(2-hidroxipropil)-4,7,10-triacético (HP-DO3A), ácido etilenodiamina-tetraacético (EDTA), ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-(1,4,8,11-tetraacético (TETA), benzo-TETA, etilenobis-(2-hidroxi-fenilglicina) (EHPG), 5-Cl-EHPG, 5-Br-EHPG, 5-Me-EHPG, 5-t-Bu-EHPG, y 5-sec-Bu-EHPG, ácido benzodietilenotriamina-pentaacético (benzo-DTPA), dibenzo-DTPA, fenil-DTPA, difenil-DTPA, bencil-DTPA, dibencil-DTPA, ácido bis-2-(hidroxibencil)-etileno-diaminadiacético (HBED), ácido 1,4,7-triazaciclononano-N,N',N''-triacético (NOTA), benzo-NOTA, ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetra(metiltetraacético) (DOTMA), benzo-DOTMA, ácido 1,4,8,11-tetraazaciclo-tetradecano-1,4,8,11-(metil-tetraacético) (TETMA), benzo-TETMA, derivados de ácido 1,3-propilenodiamina-tetraacético (PDTA), derivados de ácido trietilenotetraaminahexaacético (TTHA), derivados de 1,5,10-N,N',N''-tris(2,3-dihidroxibenzoil)tricatecolato (LICAM), y derivados de 1,3,5-N,N',N''-tris(2,3-dihidroxibenzoil)-amino-metilbenceno (MECAM).
8. Composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la cual dicho compuesto sensible a MRI es [10-[2-(dioctade-
cilamino)-2-oxoetil]-1,4,7,10-tetraazaciclo-dodecano-1,4,7-triacetato(3-)]gadolinio.
9. Composición de acuerdo con la reivindicación 6, en la cual dicha porción lipófila es un residuo de un alcohol (C_{1}-C_{24}), un alcohol aromático, una alquilamina (C_{1}-C_{24}) alifática lineal, una amina aromática, o mezclas de las
mismas.
10. Composición de acuerdo con la reivindicación 9, en la cual dicha porción lipófila es un residuo de alcohol n-decílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol cetílico, alcohol n-octadecílico, alcohol bencílico, alcoholes mono-, di- o tri-(alquil(C_{1}-C_{4})-fenílicos), n-decil-amina, n-dodecil-amina, n-tetradecil-amina, n-hexadecil-amina, n-octadecil-amina, bencil-amina, mono-, di- o tri-alquil(C_{1}-C_{4})-fenil-amina, o mezclas de las mismas.
11. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la cual dicho ensamblaje comprende adicionalmente un ligando de direccionamiento incluido en el componente micelar.
12. Composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la cual dicho ensamblaje comprende un agente terapéutico en el liposoma.
13. Composición de acuerdo con la reivindicación 2, en la cual dicho compuesto polímero es un agente tensioactivo polímero o un fosfolípido que lleva un resto polímero hidrófilo.
14. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la cual dicho liposoma o dicho componente micelar comprenden un compuesto anfifílico cargado positivamente.
15. Composición de acuerdo con la reivindicación 14, en la cual dicho compuesto anfifílico cargado positivamente se selecciona de mono- o di-ésteres de etilfosfatidilcolina con uno o dos ácidos grasos; sales de alquilamonio que comprenden al menos una cadena alquilo (C_{10}-C_{20}); sales de amonio terciario o cuaternario que comprenden una o dos cadenas acilo (C_{10}-C_{20}) enlazadas al átomo N a través de un puente alquileno (C_{3}-C_{6}); o mezclas de las mismas.
16. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la cual dicho liposoma o dicho componente micelar comprenden un compuesto anfifílico cargado negativamente.
17. Composición de acuerdo con la reivindicación 16, en la cual dicho compuesto cargado negativamente se selecciona de di-ésteres de ácidos grasos con fosfatidilserina, diésteres de ácidos grasos con ácido fosfatídico, diésteres de ácidos grasos con fosfatidilglicerol, diésteres de ácidos grasos con fosfatidilinositol, diésteres de ácidos grasos con fosfatidiletanolamina modificados con polietilenglicol, sales de ácidos biliares, sales de ácidos grasos (C_{12}-C_{24}), o mezclas de los mismos.
18. Un kit diagnóstico y/o terapéutico que comprende:
a) un liposoma, o un precursor del mismo, que lleva una primera carga neta global como primer componente;
b) un componente micelar, o un precursor del mismo, asociable o asociado con dicho liposoma, que comprende un compuesto mejorador de imágenes y que llevan una segunda carga neta global opuesta en signo a dicha primera carga neta, estando asociado o siendo asociable dicho componente micelar con la superficie exterior de dicho liposoma por una interacción electrostática.
19. Un kit de acuerdo con la reivindicación 18 que comprende un liposoma en forma liofilizada.
20. Un kit de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19 que comprende por separado un componente micelar en forma liofilizada.
21. Un kit de acuerdo con la reivindicación 18 que comprende un ensamblaje que comprende un liposoma liofilizado asociado con un componente micelar liofilizado.
22. Un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 que comprende adicionalmente un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable.
23. Método para preparar un ensamblaje de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 17, que comprende mezclar una preparación que comprende un liposoma o un precursor del mismo con una preparación que comprende un componente micelar o un precursor del mismo que se asocia con dicho liposoma.
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