ES2313352T3 - Ensamblaje de liposomas para uso terapeutico y/o diagnostico. - Google Patents
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Abstract
Composición para uso diagnóstico o terapéutico que comprende un ensamblaje que comprende: - un liposoma que lleva una primera carga global neta y que tiene una envolvente límite con superficies interior y exterior respectivas, definiendo dicha envolvente una porción interior del mismo; y - una pluralidad de componentes micelares, que comprenden un compuesto de mejora de imágenes y que llevan una segunda carga global neta de signo opuesto a dicha primera carga neta, estando dichos componentes micelares asociados con la superficie exterior de la envolvente de dicho liposoma por una interacción sustancialmente electrostática.
Description
Ensamblaje de liposomas para uso terapéutico y/o
diagnóstico.
La presente invención se refiere a una nueva
composición de liposomas que contiene un agente activo para uso
terapéutico y/o diagnóstico, a un método de fabricación de la misma
y a un kit farmacéutico que comprende dicha composición. La
invención se refiere adicionalmente a un método para aumentar la
cantidad de un agente activo asociable a un liposoma y a un método
para aumentar el tiempo de residencia de vesículas de liposoma en
la circulación sanguínea. En particular, la presente invención puede
encontrar aplicaciones ventajosas en el campo de la Formación de
Imágenes por Resonancia Magnética (MRI).
Los liposomas son bien conocidos en el campo
terapéutico o diagnóstico como vehículos adecuados para agentes
activos, tales como compuestos terapéuticos y/o diagnósticos. Se han
propuesto diversas composiciones basadas en liposomas que contienen
agentes activos, en particular para aquellos agentes que tienen una
semi-vida corta en el torrente sanguíneo. Por
ejemplo, la Patente US 6.143.321 describe liposomas que contienen
una preparación micelar atrapada en el espacio interior de los
mismos, comprendiendo dicha preparación micelar un agente activo
agregado con un agente tensioactivo lipídico para formar una
micela.
La producción de imágenes diagnósticas con
empleo de agentes capaces de mejorar las imágenes que pueden
obtenerse con técnicas diferentes de formación de imágenes
(conocidos como "agentes de contraste" o "agentes de mejora
de imágenes") ha llegado a ser también una práctica adoptada con
carácter generalizado.
Por ejemplo, productos yodados, tales como
Iopamidol® o Iomeprol® (Bracco Imaging S.p.A.), se emplean de modo
generalizado en el análisis por rayos X con contraste, en particular
rayos X de tomografía computerizada (CT), mientras que compuestos
que contienen iones paramagnéticos talos como ProHance® o
MultiHance® (Bracco Imaging), se emplean en gran escala en el
análisis MRI.
Entre las diversas propiedades de mejora de
imágenes, algunas de las que son probablemente más deseables son
una alta capacidad de mejora de imágenes y un tiempo de residencia
suficientemente largo de las mismas en el sistema, tejido u órgano
relevante a visualizar. Por esta razón, se han dedicado muchos
esfuerzos en el pasado a mejorar estas dos propiedades de los
agentes de contraste.
Por ejemplo, la Patente US 6.217.849 describe
una suspensión acuosa de liposomas para producción de imágenes por
rayos X o NMR que tiene capacidad mejorada de mantenimiento en la
circulación sanguínea.
La Patente US 5.387.410 sugiere la utilización
de un liposoma para llevar un quelato de ion paramagnético dentro o
fuera de la superficie exterior del mismo, con objeto de obtener una
imagen NMR mejorada de un órgano seleccionado.
La Patente US 5.833.948 propone la incorporación
de quelatos de iones paramagnéticos en estructuras micelares que
comprenden un agente tensioactivo no iónico, para mejorar las
propiedades de los mismos en el conjunto de la sangre.
La Patente US 5.827.533 describe liposomas que
contienen agentes activos agregados con agentes tensioactivos
lipídicos.
La Patente US 5.756.069 se refiere al problema
de aumentar la concentración de un agente sensible a MRI en
vehículos, tales como liposomas, para proporcionar una imagen útil.
Se describen compuestos formadores de poliquelatos que son capaces
de fijar una pluralidad de iones paramagnéticos y que comprenden un
anclaje soluble en lípidos para fijar el compuesto a un liposoma o
una micela.
Adicionalmente, pueden utilizarse también
compuestos mejoradores de imágenes en combinación con compuestos de
direccionamiento (que permiten enlazar el compuesto mejorador de la
imagen con un sitio diana específico - v.g. un tejido, un órgano o
células específicas - a fin de mejorar selectivamente la imagen del
mismo) y/o con agentes terapéuticos (v.g. que pueden ser liberados
en un sitio, tejido u órgano correspondiente después de
visualización del mismo).
La Solicitante ha encontrado ahora un nuevo
ensamblaje para uso diagnóstico y/o terapéutico en el cual una
pluralidad de micelas pueden asociarse con la superficie exterior de
un liposoma. La asociación se efectúa por una interacción
sustancialmente electrostática. Con este nuevo ensamblaje, es
posible o bien enlazar una cantidad sustancial de un compuesto
activo a un solo liposoma, aumentar el tiempo de residencia de dicho
liposoma en el torrente sanguíneo o, de acuerdo con un aspecto
preferido de la invención, obtener un agente de contraste con
propiedades mejoradas de formación de imágenes y circulación
prolongada en la sangre.
Un primer aspecto de la invención se refiere por
tanto a una composición para uso diagnóstico o terapéutico que
comprende un ensamblaje que lleva un agente activo, en donde dicho
ensamblaje comprende:
- un liposoma que lleva una primera carga global
neta y que tiene una envolvente límite con superficies interior y
exterior respectivas, definiendo dicha envolvente una porción
interior del mismo; y
- una pluralidad de componentes micelares, que
comprenden un compuesto de mejora de imágenes y que llevan una
segunda carga global neta de signo opuesto a dicha primera carga
neta, estando dichos componentes micelares asociados con la
superficie exterior de la envolvente de dicho liposoma por una
interacción sustancialmente electrostática.
De acuerdo con la presente invención, el término
"agente activo" incluye dentro de sus significados cualquier
agente terapéutico o diagnóstico como se define más adelante en esta
memoria. Dicho agente activo puede estar asociado con el liposoma
(v.g. disuelto o dispersado en la fase acuosa interior y/o
incorporado en la envolvente límite), con las micelas (v.g. como un
compuesto formador de micelas) o con ambos.
Cuando se hace referencia a un ensamblaje de la
invención, el término "interacción sustancialmente
electrostática" significa que la interacción principal capaz de
asociar de manera estable el liposoma y las micelas es la
interacción electrostática (o iónica) determinada por las cargas
opuestas negativa y positiva en los dos componentes
respectivos.
La Solicitante ha observado en particular que la
presencia de compuestos específicos en el componente micelar puede
permitir aumentar sustancialmente el tiempo de residencia de los
liposomas asociados con dichas micelas en el torrente sanguíneo. De
acuerdo con una realización preferida, dicho componente micelar
comprende un compuesto polímero anfifílico. Preferiblemente, dicho
compuesto polímero anfifílico es un agente tensioactivo polímero o
un fosfolípido que lleva un resto polímero hidrófilo.
Alternativamente, o además de lo anterior, dicho componente micelar
puede comprender ácidos biliares o derivados de los mismos, o
lisofosfolípidos.
La Solicitante ha observado adicionalmente que
es posible aumentar sustancialmente la cantidad de un agente activo
cuando el componente micelar que contiene dicho agente activo está
asociado con un liposoma en un ensamblaje de la invención. Esto es
particularmente interesante cuando el ensamblaje está enlazado a un
sitio de direccionamiento, donde el mismo puede incorporar
localmente una cantidad incrementada de agente activo.
Una aplicación ventajosa de este descubrimiento
es la mejora de la respuesta de producción de imágenes de un
compuesto mejorador de imágenes (v.g. un compuesto sensible a MRI,
por ejemplo un quelato con gadolinio), por empleo de un ensamblaje
en el cual las micelas incluyen dicho compuesto mejorador de la
formación de imágenes, en particular cuando el componente mejorador
de las imágenes está asociado con un ligando de direccionamiento,
que está direccionado a un sitio biológico o patológico específico.
Por ejemplo, se ha determinado que micelas que contienen un
complejo lipídico de gadolinio contienen típicamente alrededor de
500 átomos de Gd. Así, una micela que contiene un agente de
direccionamiento puede proporcionar al menos 500 átomos de Gd para
mejora de la imagen cuando se une a un sitio de direccionamiento
respectivo. Por otra parte, la Solicitante ha observado que al
menos aproximadamente 5000 micelas pueden estar asociadas con la
superficie exterior de un liposoma de 1 \mum de diámetro para
formar un ensamblaje; así, cuando dicho ensamblaje se une al mismo
sitio direccionado, asociará algo así como aproximadamente
2.500.000 (500 x 5.000) átomos Gd con un solo sitio diana, lo cual
es claramente una cantidad mucho mayor que el número de átomos Gd
asociables al mismo sitio diana por una sola micela.
Un aspecto preferido de la invención se refiere
por tanto a una composición como se ha definido anteriormente, en
la cual el agente activo está comprendido en el componente
micelar.
Preferiblemente, dicho agente activo es un
compuesto mejorador de imágenes, más preferiblemente un compuesto
sensible a MRI, en particular un ion metálico paramagnético.
En una realización preferida, dicho ensamblaje
comprende adicionalmente un ligando de direccionamiento, incluido
preferiblemente en el componente micelar. En una realización
preferida adicional, está incluido también en el liposoma un agente
activo.
Las Figuras 1, 1a y 1b son representaciones
esquemáticas de un ensamblaje de la invención y de los componentes
respectivos del mismo;
las Figuras 2-4 son gráficos que
ilustran la estabilidad en la circulación sanguínea de los
ensamblajes de la invención;
las Figuras 5-7 son gráficos que
comparan la circulación sanguínea de los ensamblajes de la invención
con respecto a los liposomas;
las Figuras 8a y 8b son imágenes de ensayos
in vitro.
La Figura 1 muestra una representación
esquemática en corte transversal de un ensamblaje de acuerdo con la
invención. Dicho ensamblaje comprende un liposoma (11) de forma
sustancialmente esférica asociado con una pluralidad de micelas
(12), y sumergido en un vehículo líquido fisiológicamente aceptable
adecuado (v.g. solución salina). El liposoma comprende una
envolvente lipídica (13) que define la porción interior llena de
líquidos (14) del mismo, que puede comprender opcionalmente un
agente activo (10). Fig. 1a muestra una porción de la envolvente
liposómica (13), que en esta realización específica está formada por
una bicapa lipídica. En dicha realización, los lípidos que forman
la envolvente son fosfolípidos neutros (15), fosfolípidos cargados
positivamente (16) y colesterol (17). La micela ilustrada en la
realización específica de Fig. 1b comprende un complejo anfifílico
de un ion paramagnético (18), v.g. Gd, y un material anfifílico
cargado negativamente (19), v.g. una fosfatidiletanolamina (19a)
enlazada a un resto polietilenglicol (19b).
El término liposoma incluye dentro de su
significado agregados sustancialmente esféricos de compuestos
anfifílicos, con inclusión de compuestos lipídicos, típicamente en
la forma de una o más capas concéntricas. Como se conoce en la
técnica, los compuestos anfifílicos son aquellas moléculas que
tienen una cabeza polar hidrófila (v.g. un grupo polar o iónico) y
una cola orgánica hidrófoba (v.g. una cadena hidrocarbonada). Estos
compuestos se clasifican también generalmente como agentes
tensioactivos, agentes emulsionantes o agentes dispersantes en la
técnica.
Los liposomas se forman típicamente en
suspensiones acuosas y contienen al menos una bicapa de un compuesto
anfifílico. Las cabezas hidrófilas de los compuestos anfifílicos
que forman la capa exterior de la bicapa están dirigidas hacia el
exterior de la estructura esférica, mientras que las cabezas
hidrófilas de los compuestos anfifílicos que forman la capa
interior de la bicapa están dirigidas hacia el interior de dicha
estructura esférica. El líquido incorporado en el interior de la
estructura esférica de los liposomas es en general el mismo que el
de la suspensión acuosa, conteniendo opcionalmente compuestos
adicionales que no están presentes (o están presentes en menor
proporción) en la suspensión acuosa exterior, tales como un agente
activo. El líquido llena el volumen interior de los liposomas en la
práctica totalidad de dicho volumen, es decir en más de 90%,
preferiblemente más de 95% y de manera típica aproximadamente el
100%.
Materiales preferidos para preparar liposomas
son fosfolípidos, opcionalmente en mezcla con otros compuestos
anfifílicos. Los fosfolípidos son compuestos anfifílicos que
contienen típicamente al menos un grupo fosfato y al menos uno,
preferiblemente dos, grupos hidrocarbonados lipófilos de cadena
larga.
Ejemplos de fosfolípidos adecuados incluyen
ésteres de glicerol con uno o preferiblemente dos (iguales o
diferentes) restos de ácidos grasos y con ácido fosfórico, en donde
el resto de ácido fosfórico está unido a su vez a un grupo
hidrófilo, tal como, por ejemplo, colina (fosfatidilcolinas - PC),
serina (fosfatidilserinas - PS), glicerol (fosfatidilgliceroles -
PG), etanolamina (fosfatidiletanolaminas - PE), inositol
(fosfatidilinositol). Ésteres de fosfolípidos con un solo residuo
de ácido graso se conocen generalmente en la técnica como las
formas "liso" del fosfolípido o "lisofosfolípidos". Los
restos de ácidos grasos presentes en los fosfolípidos son en
general ácidos alifáticos de cadena larga, que contienen típicamente
de 12 a 24 átomos de carbono, preferiblemente de 14 a 22; la cadena
alifática puede contener una o más insaturaciones o,
preferiblemente, está completamente saturada. Ejemplos de ácidos
grasos adecuados incluidos en los fosfolípidos son, por ejemplo,
ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico,
ácido araquídico, ácido behénico, ácido oleico, ácido linoleico, y
ácido linolénico. Preferiblemente, se emplean ácidos grasos
saturados tales como ácido mirístico, ácido palmítico, ácido
esteárico y ácido araquídico.
Ejemplos adicionales de fosfolípidos son los
ácidos fosfatídicos, es decir los diésteres de ácido
glicerol-fosfórico con ácidos grasos;
esfingolípidos tales como esfingomielinas, es decir aquellos
análogos de fosfatidilcolina en los cuales el residuo de un diéster
de glicerol con ácidos grasos está reemplazado por una cadena de
ceramida; cardiolipinas, es decir los ésteres de
1,3-difosfatidilglicerol con un ácido graso;
glicolípidos tales como gangliósidos GM1 (o GM2) o cerebrósidos;
glucolípidos; sulfátidos y glicosfingolípidos.
Como se utiliza en esta memoria, el término
fosfolípidos incluye productos existentes naturalmente,
semi-sintéticos o preparados por síntesis que
pueden emplearse sea aisladamente o en forma de mezclas.
Ejemplos de fosfolípidos existentes naturalmente
son lecitinas naturales (derivados de fosfatidilcolina (PC)), tales
como, típicamente, lecitinas de haba de soja o yema de huevo.
Ejemplos de fosfolípidos semisintéticos son los
derivados parcial o totalmente hidrogenados de las lecitinas
existentes naturalmente. Fosfolípidos preferidos son diésteres de
ácidos grasos de fosfatidilcolina, etilfosfatidilcolina,
fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina,
fosfatidilserina o esfingomielina.
Ejemplos de fosfolípidos preferidos son, por
ejemplo, dilauroilfosfatidilcolina (DLPC),
dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC),
dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC),
diaraquidoil-fosfatidilcolina (DAPC),
diestearoil-fosfatidilcolina (DSPC),
dioleoil-fosfatidilcolina (DPC),
1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina
(etil-DSPC),
dipentadecanoil-fosfatidilcolina (DPDPC),
1-miristoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina
(MPPC),
1-palmitoil-2-miristoil-fosfatidilcolina
(PMPC), 1-palmitoil-2-estearoil-fosfatidilcolina (PSPC), 1-estearoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (SPPC), 1-palmitoil-2-oleilfosfatidilcolina (POPC), 1-oleil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (OPPC), dilauroilfosfatidilglicerol (DLPC) y sus sales de metal alcalino, diaraquidoilfosfatidilglicerol (DAPG) y sus sales de metal alcalino, dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) y sus sales de metal alcalino, dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) y sus sales de metal alcalino, diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG) y sus sales de metal alcalino, dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG) y sus sales de metal alcalino, ácido dimiristoil-fosfatídico (DMPA) y sus sales de metal alcalino, ácido dipalmitoil-fosfatídico (DPPA) y sus sales de metal alcalino, ácido diestearoilfosfatídico (DSPA), ácido diaraquidoilfosfatídico (DAPA) y sus sales de metal alcalino, dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), diaraquidoilfosfatidiletanolamina (DAPE), dilinoleilfosfatidiletanolamina (DLPE), dimiristoil fosfatidilserina (DMPS), diaraquidoil-fosfatidilserina (DAPS), dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS), diestearoilfosfatidilserina (DSPS), dioleoilfosfatidilserina (DOPS), dipalmitoil esfingomielina (DPSP), y diestearoilesfingomielina (DSSP), dilauroil-fosfatidil-inositol (DLPI), diaraquidoilfosfatidilinositol (DAPI), dimiristoilfosfatidilinositol (DMPI), dipalmitoilfosfatidilinositol (DPPI), diestearoilfosfatidilinositol (DSPI), dioleoil-fosfatidilinositol (DOPI).
(PMPC), 1-palmitoil-2-estearoil-fosfatidilcolina (PSPC), 1-estearoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (SPPC), 1-palmitoil-2-oleilfosfatidilcolina (POPC), 1-oleil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (OPPC), dilauroilfosfatidilglicerol (DLPC) y sus sales de metal alcalino, diaraquidoilfosfatidilglicerol (DAPG) y sus sales de metal alcalino, dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) y sus sales de metal alcalino, dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) y sus sales de metal alcalino, diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG) y sus sales de metal alcalino, dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG) y sus sales de metal alcalino, ácido dimiristoil-fosfatídico (DMPA) y sus sales de metal alcalino, ácido dipalmitoil-fosfatídico (DPPA) y sus sales de metal alcalino, ácido diestearoilfosfatídico (DSPA), ácido diaraquidoilfosfatídico (DAPA) y sus sales de metal alcalino, dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), diaraquidoilfosfatidiletanolamina (DAPE), dilinoleilfosfatidiletanolamina (DLPE), dimiristoil fosfatidilserina (DMPS), diaraquidoil-fosfatidilserina (DAPS), dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS), diestearoilfosfatidilserina (DSPS), dioleoilfosfatidilserina (DOPS), dipalmitoil esfingomielina (DPSP), y diestearoilesfingomielina (DSSP), dilauroil-fosfatidil-inositol (DLPI), diaraquidoilfosfatidilinositol (DAPI), dimiristoilfosfatidilinositol (DMPI), dipalmitoilfosfatidilinositol (DPPI), diestearoilfosfatidilinositol (DSPI), dioleoil-fosfatidilinositol (DOPI).
El término fosfolípidos incluye adicionalmente
fosfolípido modificado, v.g. fosfolípidos en los cuales el grupo
hidrófilo está unido a su vez a otro grupo hidrófilo. Ejemplos de
fosfolípidos modificados son fosfatidiletanolaminas modificadas con
polietilenglicol (PEG), es decir fosfatidiletanolaminas en las
cuales el resto hidrófilo etanolamina está enlazado a una molécula
de PEG de peso molecular variable (v.g. desde 300 a 5.000 daltons),
tales como DPPE-PEG (o DSPE-PEG),
es decir DPPE (o DSPE) que tiene un polímero de PEG unido al mismo.
Por ejemplo, DPPE-PEG2000 se refiere a una DPPE que
tiene unido a ella un polímero de PEG que tiene un peso molecular
medio de aproximadamente 2.000.
Pueden utilizarse también mezclas de
fosfolípidos, tales como, por ejemplo, mezclas de DPPC, DSPC y/o
DAPC con DSPS, DPPS, DSPA, DPPA, DSPG, DPPG,
etil-DSPC y/o etil-DPPC.
El fosfolípido es típicamente el componente
principal de la envolvente del liposoma, ascendiendo al menos al
50% (p/p) de la cantidad total de componentes que forman dicha
envolvente. En algunas realizaciones preferidas, sustancialmente la
totalidad de la envolvente (es decir al menos 90% y hasta 100% en
peso) puede estar formada por fosfolípidos.
Los fosfolípidos pueden utilizarse
convenientemente en mezcla con otros compuestos anfifílicos tales
como, por ejemplo, ácidos grasos, tales como ácido palmítico, ácido
esteárico, ácido araquidónico o ácido oleico; polímeros portadores
de lípidos, tales como quitina, ácido hialurónico,
polivinilpirrolidona o polietilenglicol (PEG), a los que se hace
referencia también como "compuestos pegilados"; lípidos que
llevan mono-, di-, oligo- o polisacáridos sulfonados; colesterol,
sulfato de colesterol o hemisuccinato de colesterol; hemisuccinato
de tocoferol; lípidos con ácidos grasos con enlaces éter o éster;
lípidos polimerizados; fosfato de diacetilo, fosfato de dicetilo;
ceramidas; ésteres de ácidos grasos con polioxietileno (tales como
estearatos de ácidos grasos con polioxietileno), alcoholes grasos
de polioxietileno, alcoholéteres grasos de polioxietileno, ésteres
de ácidos grasos de sorbitán polioxietilado, ricinoleato de
glicerol-polietilenglicol, esteroles de soja
etoxilados, aceite de ricino etoxilado o copolímeros de bloques de
óxido de etileno (EO) y óxido de propileno (PO); ésteres de ácidos
alifáticos con esterol que incluyen butirato de colesterol,
iso-butirato de colesterol, palmitato de
colesterol, estearato de colesterol, acetato de lanosterol,
palmitato de ergosterol, o n-butirato de fitosterol;
esterol-ésteres de ácidos-azúcar que incluyen
glucurónidos de colesterol, glucurónidos de lanosterol, glucurónido
de 7-deshidrocolesterol, glucurónido de ergosterol,
gluconato de colesterol, gluconato de lanosterol, o gluconato de
ergosterol; ésteres de ácidos-azúcar y alcoholes que
incluyen glucurónido de laurilo, glucurónido de estearoílo,
glucurónido de miristoílo, gluconato de laurilo, gluconato de
miristoílo, o gluconato de estearoílo; ésteres de azúcares con
ácidos alifáticos que incluyen laurato de sacarosa, laurato de
fructosa, palmitato de sacarosa, estearato de sacarosa, ácido
glucurónico, ácido glucónico o ácido poliurónico; saponinas, con
inclusión de sarsasapogenina, esmilagenina, hederagenina, ácido
oleanólico, o digitoxigenina; glicerol o ésteres de glicerol que
incluyen tripalmitato de glicerol, diestearato de glicerol,
triestearato de glicerol, dimiristato de glicerol, trimiristato de
glicerol, dilaurato de glicerol, trilaurato de glicerol, dipalmitato
de glicerol; alcoholes de cadena larga que incluyen alcohol
n-decílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico,
alcohol cetílico, o alcohol n-octadecílico;
6-(5-colesten-3\beta-iloxi)-1-tio-\beta-D-galactopiranósido;
digalactosildiglicérido,
6-(5-colesten-3\beta-iloxi)hexil-6-amino-6-desoxi-1-tio-\beta-D-galactopiranósido;
6-(5-colesten-3\beta-iloxi)hexil-6-amino-6-desoxi-1-tio-\beta-D-manopiranósido;
ácido
12-(((7'-dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metilamino)octadecanoico;
ácido
N-[12-(((7'-dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metilamino)-octadecano-il]-2-aminopalmítico;
N-succinildioleilfosfatidiletanol-amina;
1,2-dioleil-sn-glicerol;
1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerol;
1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol;
1-hexadecil-2-palmitoilglicerofosfoetanolamina
o palmitoilhomocisteína; alquilaminas o sales de alquilamonio, que
comprenden al menos una cadena alquilo (C10-C20),
preferiblemente (C14-C18), tales como, por ejemplo,
N-estearilamina,
N,N'-diestearilamina,
N-hexadecilamina,
N,N'-dihexadecilamina, cloruro de
N-estearilamonio, cloruro de
N,N'-diestearilamonio, cloruro de
N-hexadecilamonio, cloruro de
N,N'-dihexadecilamonio, bromuro de
dimetildioctadecilamonio (DDAB), bromuro de hexadeciltrimetilamonio
(CTAB); sales de amonio terciarias o cuaternarias que comprenden
uno o preferiblemente dos cadenas acilo (C10-C20),
preferiblemente (C14-C18), enlazadas al átomo N a
través de un puente alquileno (C3-C6), tales como,
por ejemplo,
1,2-diestearoil-3-trimetilamonio-propano
(DSTAP),
1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano
(DPTAP),
1,2-oleoil-3-trimetilamonio-propano
(DOTAP),
1,2-diestearoil-3-dimetilamonio-propano
(DSDAP); y mezclas o combinaciones de los mismos.
Compuestos adicionales preferidos son lípidos
que incluyen colesterol, ergosterol, fitosterol, sitosterol,
lanosterol, tocoferol, galato de propilo o palmitato de ascorbilo;
ácidos grasos tales como ácido mirístico, ácido palmítico, ácido
esteárico, ácido araquídico y sales y derivados de los mismos;
hidroxitolueno butilado; o mezclas de los mismos. Es
particularmente preferido el colesterol. Estos compuestos pueden
añadirse a la composición formadora de liposomas en una cantidad de
hasta aproximadamente 60% en moles referida a la composición total,
con preferencia hasta aproximadamente 25%.
Con objeto de conferir la carga neta global
deseada al liposoma, la envolvente respectiva comprende al menos un
componente que lleva una carga neta global, en particular un
material anfifílico cargado, preferiblemente un lípido o un
fosfolípido.
Ejemplos de fosfolípidos que llevan una carga
global negativa son derivados, en particular derivados di-éster de
ácidos grasos, de fosfatidilserina, tales como DMPS, DPPS, DSPS; de
ácido fosfatídico, tales como DMPA, DPPA, DSPA; de
fosfatidilglicerol tales como DMPG, DPPG y DSPG o de
fosfatidilinositol, tales como DMPI, DPPI o DPPI (sic). Asimismo
pueden utilizarse fosfolípidos modificados, en particular
fosfatidiletanolaminas modificadas con PEG, tales como
DMPE-PEG2000, DMPE-PEG3000,
DMPE-PEG4000, DPPE-PEG5000,
DPPE-PEG2000, DPPE-PEG3000,
DPPE-PEG4000, DPPE-PEG5000,
DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000,
DSPE-PEG4000, DSPE-PEG5000,
DAPE-PEG2000, DAPE-PEG3000,
DAPE-PGE4000 o DAPE-PEG5000 como
moléculas con carga negativa. Asimismo, puede utilizarse
ventajosamente la liso-forma de los fosfolípidos
arriba citados, tales como derivados de lisofosfatidilserina (v.g.
liso-DMPS, -DPPS o -DSPS), derivados de ácido
lisofosfatídico (v.g. liso-DMPA, -DPPA, o -DSPA) y
derivados de lisofosfatidilglicerol (v.g.
liso-DMPG, -DPPG o -DSPG), como compuesto con carga
negativa. Ejemplos de lípidos con carga negativa son sales de
ácidos biliares tales como sales de ácido cólico, sales de ácido
desoxicólico o sales de ácido glicocólico; y sales de ácidos grasos
(C12-C24), preferiblemente
(C14-C22), tales como, por ejemplo, sal de ácido
palmítico, sal de ácido esteárico, sal de
1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerol
o sal de
1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol.
Preferiblemente, el compuesto con carga negativa
se selecciona entre DPPA, DPPS, DSPG, DSPE-PEG2000,
DSPE-PEG5000 o mezclas de los mismos.
El componente con carga negativa está asociado
típicamente con un ion de carga opuesta positivo correspondiente,
que puede ser monovalente (v.g. un metal alcalino o amonio),
bivalente (v.g. un metal alcalinotérreo) o trivalente (v.g.
aluminio). Preferiblemente, el ion de carga opuesta se selecciona
entre cationes de metal alcalino, tales como Li+, Na+, o K+, más
preferiblemente Na+.
Ejemplos de fosfolípidos que llevan una carga
global positiva son derivados de etilfosfatidilcolina, en particular
diésteres de etilfosfatidilcolina con ácidos grasos, tales como
1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina
(etil-DSPC o DSEPC),
1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina
(etil-DPPC o DPEPC). El ion de carga opuesta
negativo es preferiblemente un ion halógeno, en particular cloro o
bromo. Ejemplos de lípidos cargados positivamente son sales de
alquilamonio con un ion de carga opuesta halógeno (v.g. cloro o
bromo) que comprenden al menos una cadena alquilo
(C10-C20), preferiblemente
(C14-C18), tales como, por ejemplo, cloruro de mono-
o di-estearilamonio, cloruro de mono- o
di-hexadecilamonio, bromuro de
dimetildioctadecilamonio (DDAB), y bromuro de
hexadeciltrimetilamonio (CTAB). Ejemplos adicionales de lípidos
cargados positivamente son sales terciarias o cuaternarias de amonio
con un ion de carga opuesta halógeno (cloro o bromo) que comprenden
una o preferiblemente dos cadenas acilo (C10-C20),
preferiblemente (C14-C18), enlazadas al átomo N a
través de un puente alquileno (C3-C6), tales como,
por ejemplo,
1,2-diestearoil-3-trimetilamonio-propano
(DSTAP),
1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano
(DPTAP),
1,2-oleoil-3-trimetilamonio-propano
(DOTAP), o
1,2-diestearoil-3-dimetilamonio-propano
(DSDAP).
DSEPC, DPEPC y/o DSTAP se emplean
preferiblemente como compuestos con carga positiva en la envolvente
del liposoma.
El componente con carga positiva está asociado
típicamente con un ion de carga opuesta negativo correspondiente,
que puede ser monovalente (v.g. halógeno), bivalente (v.g. sulfato),
o trivalente (v.g. fosfato). Preferiblemente, el ion de carga
opuesta se selecciona entre iones halógeno, tales como F- (flúor),
Cl- (cloro) o Br- (bromo).
Con objeto de hacer posible una interacción
electrostática eficaz con la micela, la cantidad total de compuestos
cargados en la envolvente del liposoma es de al menos 1% en moles
con respecto a la cantidad total del material que forma dicha
envolvente, preferiblemente al menos 5% y más preferiblemente al
menos 10% en moles. Se ha observado que cantidades inferiores a 80%
en moles de compuestos cargados son suficientes en general para
conseguir una interacción eficaz liposoma-micelas;
preferiblemente dichas cantidades no son mayores que aproximadamente
75% en peso y de modo más preferible no mayores que aproximadamente
60% en moles.
Mezclas de fosfolípidos neutros y cargados y/o
lípidos cargados pueden emplearse satisfactoriamente para formar
los liposomas de un ensamblaje de la presente invención,
opcionalmente en mezcla con otros compuestos anfifílicos.
Preferiblemente, se emplean mezclas de dos o más lípidos o
fosfolípidos, al menos uno con una carga neutra y al menos uno con
una carga global neta. Más preferiblemente, se emplean mezclas de
dos o más lípidos o fosfolípidos, al menos uno con carga neutra y
al menos uno con carga positiva, para obtener liposomas con una
carga global positiva. Se prefieren particularmente mezclas de DSPC
y/o DPPC con etil-DSPC, etil-DPPC
y/o DSTAP.
Otros excipientes o aditivos pueden estar
presentes en la composición formadora de liposomas, sin estar
necesariamente implicados (o estando sólo parcialmente implicados)
en la formación de la envolvente del liposoma. Éstos incluyen
reguladores de pH, ajustadores de la osmolalidad, aumentadores de la
viscosidad, emulsionantes, agentes de aumento de volumen, etc. y
pueden utilizarse en cantidades convencionales. Por ejemplo, pueden
utilizarse compuestos tales como polioxipropilenglicol y
polioxietilenglicol así como copolímeros de los mismos. Ejemplos de
aumentadores de la viscosidad o estabilizadores son compuestos
seleccionados de poli- y oligo-sacáridos lineales y
reticulados, azúcares, y polímeros hidrófilos tales como
polietilenglicol.
Los liposomas de un ensamblaje de la presente
invención pueden contener adicionalmente un agente activo, tal como
un agente terapéutico o un agente diagnóstico. Estos compuestos
pueden estar asociados con la envolvente lipídica o el liposoma
(v.g. incorporados en y/o unidos a la misma) y/o disueltos o
dispersados (v.g. como una dispersión micelar) en el volumen acuoso
interior del mismo. Aunque puede estar también asociado un ligando
de direccionamiento con la envolvente lipídica del liposoma, dichos
compuestos están asociados sin embargo más ventajosamente con las
micelas del ensamblaje, como se explica en detalle más adelante en
esta memoria, a fin de maximizar el efecto de direccionamiento de
las mismas.
El término "agente terapéutico" incluye
dentro de su significado cualquier sustancia, composición o
partícula que pueda utilizarse en cualquier aplicación terapéutica,
tal como en métodos para el tratamiento de una enfermedad en un
paciente, así como cualquier sustancia que sea capaz de ejercer o
susceptible de ejercer un efecto biológico in vitro y/o
in vivo. Agentes terapéuticos incluyen así cualquier
compuesto o material susceptible de ser utilizado en el tratamiento
(con inclusión de diagnosis, prevención, mitigación, alivio del
dolor o curación) de cualquier estado patológico en un paciente
(con inclusión de enfermedad, aflicción, lesión debida a una
enfermedad o herida). Ejemplos de agentes terapéuticos son fármacos,
productos farmacéuticos, agentes bioactivos, agentes citotóxicos,
agentes quimioterapéuticos, agentes radioterapéuticos, proteínas,
péptidos naturales o sintéticos, con inclusión de oligopéptidos y
polipéptidos, vitaminas, esteroides y material genético, con
inclusión de nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos,
polinucleótidos y plásmidos. Entre éstos, se prefieren fármacos o
productos farmacéuticos.
Ejemplos de agentes terapéuticos incluyen
agentes anti-úlcera tales como cimetidina, famotidina, ranitidina,
acetato de roxatidina, pantoprazol, omeprazol, lansoprazol o
sucralfato; relajantes o procinéticos intestinales tales como
bromuro de propantelina, camilofina (acamilofenina), diciclomina,
butilbromuro de hioscina, mebeverina, cisaprida, oxibutinina,
pipenzolato- metil-bromuro, drotaverina,
metoclopramida, bromuro de clidinio, isopropamida o bromuro de
oxifenonio; enzimas o carminativos, tales como pancreatina, papaína,
pepsina, o amilasa; hepatobiliares preparaciones tales como ácido
quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico,
L-ornitina o silimarina; antihipertensivos tales
como clonidina, metildopa, nitroprusiato de sodio, terazosina,
doxazosina, (DI) hidralazina o prazosina;
beta-bloqueantes tales como esmolol, celiprolol,
atenolol, labetolol, propranolol, metoprolol, carvedilol, sotalol,
oxiprenolol o bisoprolol; bloqueantes de los canales de calcio tales
como felodipina, nitrendipina, nifedipina, benidipina, verapamil,
amlodipine o lacidipina; inhibidores de la ACE tales como enalapril,
lisinopril, ramipril, perindopril, benazepril o captopril;
inhibidores de la angiotensina II tales como losartán potásico;
activadores de los canales de potasio, tales como nicorandil;
diuréticos y antidiuréticos tales como hidroclorotiazida, xipamida,
bumetanida, amilorida, espironolactona, indapamida, triamtereno,
clopamida, furosemida o clortalidona; antianginales tales como
isoscorbida dinitrato, oxifedrina, isosorbida
5-mononitrato, diltiazem, tetranitrato de
eritritilo, trimetazidina, lidoflazina, tetranitrato de
pentaeritritol, trinitrato de glicerilo o dilazep; coagulantes
tales como estrógenos conjugados, diosmina, menaftona, menadiona,
hemocoagulasa, etamsilato (cidanamina), flavonoides de rutina o
adrenocromo-monosemicarbazona; anticoagulantes
antitrombóticos o antiplaquetarios tales como ticlopidina,
warfarina, estreptoquinasa, fenindiona, rtpa, uroquinasa,
vasopresina, nicumalona, heparina, heparinas de peso molecular
bajo, mucopolisacáridos polisulfato o dipiridamol; antiarrítmicos
tales como quinidina, disopiramida, procainamida, lignocaína
(lidocaína), mexiletina, amiodarona, adenosina, propafenona;
fármacos en la insuficiencia cardíaca y el choque tales como
mefentermina, digoxina, dopamina, dobutamina o noradrenalina,
vasodilatadores tales como isoxsuprina, xantinol nicotinato,
nilidrina HCl, pentoxifilina (oxpentifilina) o ciclandelato;
glicósidos cardíacos tales como deslanesida, digitoxina, digoxina o
digitalina; penicilinas tales como
bencil-penicilina,
penicilina-procaína (G),
penicilina-benzatina (G), fenoximetil penicilina,
penicilina G/V, bacampicilina, carbenicilina, piperacilina,
ampicilina (opcionalmente en combinación con sulbactam o
probenecid), cloxacilina, o amoxicilina (opcionalmente en
combinación con bromhexina, cloxacilina, carbocisteína o ácido
clavulánico); quinolonas o fluoroquinolonas tales como ácido
nalidíxico, pefloxacina, ofloxacina, esparfloxacina, norfloxacina,
ciprofloxacina, lomefloxacina, cefalosporinas tales como
ceftizoxima, cefuroxima, cefixima, cefotaximo, cefaclor,
ceftriaxona-sodio, cefadroxil, cefalexina,
(opcionalmente en combinación con bromhexina.HCl o probenecid)
cefazolina, cefaloridina, ceftazidimo o ceforperazona; sulfonamidas
tales como sulfonamidas, sulfamoxol, sulfadimetoxina, cotrifamol,
cotrimoxazol, trimetoprima, aminoglicósidos tales como gentamicina,
tobramicina, neomicina, amikacina, sisomicina, kanamicina,
netilmicina, polimixinas tales como polimixina-b,
colistina sulfato; cloramfenicol; tetraciclinas tales como
tetraciclina, doxiciclina, minociclina, demeclociclina,
oxitetraciclina; macrólidos tales como eritromicina, (opcionalmente
en combinación con bromhexina), claritromicina, vancomicina,
lincomicina, azitromicina, espiramicina, roxitromicina,
clindamicina, cefpirona, teicoplanina (teicomicina a2),
antivirales, tales como abacavir, lamivudina, aciclovir, amantadina,
interferón, ribavirina, estavurdina, lamivudina o zidovudina (azt);
antimalariales, tales como quinina, proguanil, cloroquina,
primaquina, amodiaquina, arteméter, artesunato, mefloquina,
pirimetamina, arteéter, mepacrina; agentes antituberculosis tales
como cicloserina, capreomicina, etionamida, protionamida, isoniazida
(inh), rifampicina, rifampicina opcionalmente en combinación con
inh, isoniazida, pirazinamida y/o etambutol; etambutol
(opcionalmente en combinación con isoniazida), estreptomicina o
pirazinamida; antihelmínticos y antiinfestantes tales como
piperazina, niclosamida, pirantel pamoato, levamisol, dietil
carbamazina, tetramisol, albendazol, praziquantel, gluconato de
sodio-antimonio o membendazol; agentes antilepra
tales como dapsona o clofazimina; antianaeróbicos, antiprotozoarios
o antiamébicos tales como tinidazol, metronidazol (opcionalmente en
combinación con furazolidona o norfloxacino),
diloxanida-furoato, secnidazol, hidroxiquinolonas,
deshidroemetina, omidazol o furazolidona; antifúngicos tales como
fluconazol, quetoconazol, hamicina, terbinafina, econazol,
anfotericina-b, nistatina, clotrimazol,
griseofulvina, miconazol o itraconazol; vitaminas; estimulantes
respiratorios tales como doxapram hidrocloruro; antiasmáticos tales
como isoprenalina, salbutamol(albuterol), orciprenalina,
efedrina, terbutalina sulfato, salmeterol, aminofilina, terofilina,
beclometasona dipropionato o fluticasona propionato; antialérgicos
tales como terfenadina, astemizol, loratadina, clemastina,
dimetindeno maleato, hidrocloruro de fexofenadina, hidroxizina,
clorfeniramina, azatadina maleato, metdilazina, feniramina maleato,
difenhidramina o cetrizina; relajantes de la musculatura
esquelética tales como tizanidina metocarbamol, carisoprodol,
valetamato, baclofeno, clormezanona o clorzoxazona; relajantes de
la musculatura lisa tales como bromuro de oxifenonio, bromuro de
propantelina, diclomina, butil-bromuro de hioscina,
mebeverina, drotaverina, bromuro de clidinio, isopropamida o
dihidrocloruro de camilofina; fármacos
anti-inflamatorios no esteroidales tales como
naproxeno, ácido mefenámico, nimesulida, diclofenaco, tenoxicam,
ibuprofeno (opcionalmente en combinación con paracetamol),
meloxicam, aspirina, flurbiprofeno, quetoprofeno, quetoprolac,
fenilbutazona, oxifenbutazona, indometacina o piroxicam; agentes
antineoplásticos, tales como compuestos de mostazas nitrogenadas
(v.g. ciclofosfamida, trofosfamida, iofosfamida, melfalán o
clorambucil), aziridinas (v.g. tioepa), derivados de
N-nitrosourea (v.g. carmustina, lomustina o
nimustina), compuestos de platino (v.g. espiroplatino, cisplatino,
y carboplatino), procarbazina, dacarbazina metotrexato,
adriamicina, mitomicina, ansamitocina, arabinósidos de citosina,
arabinosil adenina, mercaptopolilisina, vincristina, busulfan,
clorambucil, melfalano (v.g. PAM, L-PAM o mostaza de
fenilalanina), mercaptopurina, mitotano, hidrocloruro de
procarbazina, dactinomicina (actinomicina D), hidrocloruro de
daunorrubicina, hidrocloruro de doxorrubicina, epirrubicina,
plicamicina (mitramicina), mitoxantrona, bleomicina, bleomicina
sulfato, aminoglutetimida, estramustina-fosfato de
sodio, flutamida, teuprolida acetato, megestrol acetato, tamoxifen
citrato, testolactona, trilostano, amsacrina
(m-AMSA), asparaginasa
(L-asparaginasa) Erwina asparaginasa, etoposido
(VP-16), interferón a-2a, interferón
a-2b, teniposido (VM-26),
vinblastina sulfato (VLB), vincristina sulfato, vindesina,
paclitaxel (Taxol), metotrexato, adriamicina, arabinosil,
hidroxiurea; antagonistas del ácido fólico (v.g. aminopterina,
metotrexato), antagonistas de bases púricas y pirimidínicas (v.g.
mercaptopurina, tioguanina, fluorouracilo o citarabina); narcóticos,
opiáceos o sedantes tales como paregoric, codeína, morfina, opio,
amobarbital, amobarbital-sodio, aprobarbital,
butobarbital sodio, hidrato de cloral, etclorvinol, etinamato,
hidrocloruro de flurazepam, glutetimida, hidrocloruro de
metotrimeprazina, metiprilón, hidrocloruro de midazolam,
paraldehído, pentobarbital, secobarbital-sodio,
talbutal, temazepam o triazolam; anestésicos locales o generales
tales como bupivacaína, cloroprocaína, etidocaína, lidocaína,
mepivacaína, procaína o tetracaína, droperidol, etomidato,
fentanilo-citrato con droperidol, hidrocloruro de
quetamina, metohexital sodio o tiopental; bloqueantes
neuromusculares tales como atracurium-mesilato,
trietyoduro de galamina, bromuro de hexafluorenio, yoduro de
metocurina, bromuro de pancuronio, cloruro de succinilcolina,
cloruro de tubocurarina o bromuro de vecuronio; o agentes
Terapéuticos para el sistema hormonal, tales como hormona del
crecimiento, hormona estimuladora de los melanocitos, estradiol,
beclometasona dipropionato, betametasona, cortisona acetato,
dexametasona, flunisolida, hidrocortisona, metilprednisolona,
parametasona acetato, prednisolona, prednisona, triamcinolona o
fluorocortisona acetato.
El término "agente diagnóstico" incluye
dentro de su significado cualquier compuesto, composición o
partícula que pueda utilizarse en conexión con métodos de formación
de imágenes de una región interior de un paciente y/o diagnosticar
la presencia o ausencia de una enfermedad en un paciente. Agentes
diagnósticos que pueden incorporarse en el interior del liposoma o
asociarse con el mismo (v.g. a su envolvente, en particular a la
porción lipófila de la misma) en un ensamblaje de la invención son
por consiguiente cualquier compuesto, composición o partícula que
pueda hacer posible la mejora de la imagen en conexión con técnicas
de diagnóstico, con inclusión de imágenes de resonancia magnética,
rayos X, en particular tomografía computerizada, formación óptica de
imágenes, formación de imagen nuclear o formación de imagen
molecular. Ejemplos de agentes de diagnóstico adecuados que pueden
incorporarse en o asociarse a un liposoma son, por ejemplo,
nanopartículas de magnetita; compuestos yodados, tales como
Iomeprol® o Iopapidol® (Bracco Imaging); complejos quelato
hidrófilos o lipófilos de iones paramagnéticos tales como, por
ejemplo, complejos de cromo (III), manganeso (II), manganeso (III),
hierro (II), hierro (III), cobalto (II), níquel (II), cobre (II),
praseodimio (III), neodimio (III), samario (III), gadolinio (III),
terbio (III), disprosio (III), holmio (III), erbio (III), europio
(III) e iterbio (III); compuestos que comprenden un átomo
hiperpolarizado, tales como ^{13}C, ^{15}N, ^{19}F, ^{23}Na,
^{31}P o ^{35,5}Cl, con inclusión, por ejemplo, de
[^{13}C]urea (véase v.g. "Molecular imaging of endogenous
substances", Golman et al., PNAS (Proceedings of the
National Academy of Sciences of the USA), septiembre de 2003, vol.
100, nº. 18, pp. 10435-10439) o
bis-1,1-hidroximetil-1-^{13}C-ciclopropano-D_{8}
(véase v.g. "Cerebral perfussion assessment by bolus tracking
using hyperpolarized ^{13}C", Johansson et al., Magnetic
Resonance in Medicine, 2004, vol. 51, pp. 464-472);
o agentes radiofarmacéuticos, tales como por ejemplo complejos de
tecnecio (^{99m}Tc), galio (^{67}Ga o ^{68}Ga), indio
(^{111}In) o talio (^{201}Tl).
Para la preparación de las presentes
suspensiones de liposomas, pueden utilizarse métodos convencionales
conocidos en la técnica. Dichas técnicas de preparación implican
típicamente disolver los compuestos que forman el liposoma (v.g.
fosfolípidos) en un disolvente orgánico, evaporar el disolvente
orgánico a vacío para obtener una película de los compuestos
formadores del liposoma y finalmente hidratar dicha película.
Típicamente, cuando el compuesto formador del liposoma es un
fosfolípido, la hidratación se realiza a una temperatura superior a
la temperatura de transición de los fosfolípidos. Preferiblemente,
los liposomas así obtenidos se calibran subsiguiente al tamaño
deseado por estrechamiento de la distribución de tamaños de las
vesículas dentro de límites apropiados, v.g. por extrusión a través
de membranas de filtración graduadas convenientemente. Para
encapsulación de un compuesto activo deseado (v.g. un agente
diagnóstico o terapéutico) en la porción interior del liposoma, v.g.
como una solución o suspensión acuosa de dicho compuesto activo, un
método preferido implica utilizar una solución o suspensión de
dicho compuesto activo para hidratar los lípidos a o por encima de
la temperatura de transición del lípido, con lavado subsiguiente
(v.g. por diálisis) de los liposomas obtenidos, a fin de eliminar
el exceso de solución o suspensión no encapsulada. Alternativamente,
los lípidos se hidratan en primer lugar en un vehículo acuoso
desprovisto carga, y a continuación el compuesto activo se introduce
en el interior del liposoma mediante carga de permeación
transmembranal, por incubación de los liposomas obtenidos en
presencia de una solución concentrada del compuesto activo (véase
v.g. WO-A-92/10166 que se incorpora
en esta memoria por referencia), con lavado subsiguiente de los
liposomas.
La reducción del tamaño deseado de los liposomas
se obtiene de acuerdo con técnicas convencionales, que incluyen
tratamiento por ultrasonidos, extrusión o microfluidización de la
suspensión de liposomas inicial. De acuerdo con ello, los liposomas
hidratados obtenidos como se ha descrito arriba pueden exponerse a
radiaciones ultrasónicas para reducir convenientemente las
dimensiones de los liposomas. Alternativamente, los liposomas
hidratados pueden extruirse a través de una pluralidad de membranas
(v.g. de policarbonato) con tamaño de poro decreciente (v.g. 2,0,
1,0, 0,8, 0,6, 0,4 y 0,2 \mum), para reducir el tamaño de los
liposomas a la dimensión final deseada. Como alternativa adicional,
pueden homogeneizarse vesículas grandes bajo alta presión en un
microfluidizador (v.g. de Microfluidics Corporation), para reducir
progresivamente el tamaño de los liposomas al tamaño deseado,
dependiendo de la cantidad de recirculación de los liposomas en el
microfluidizador. Estos y otros métodos de preparación se
describen, por ejemplo, en el texto de referencia "Liposomes, a
practical approach", recopilado por Roger R.C. New, Oxford
University Press, 1989.
Preferiblemente, después de la reducción de
tamaño, aproximadamente el 80% de las vesículas están dentro de
\pm10% respecto a cualquier valor nominal seleccionado entre 1,2 y
1,0 \mum. No obstante, es admisible cualquier otra distribución
más amplia o más estrecha dentro de los límites que anteceden.
Después del tratamiento de reducción de tamaños, la suspensión se
comprueba preferiblemente para asegurar que la concentración de
lípidos en la suspensión de liposomas es adecuada, ajustándose ésta
opcionalmente de modo que esté en conformidad con la aplicación
deseada. El ajuste puede efectuarse por dilución con un volumen
mayor de líquido portador, si la concentración de lípidos excede de
los límites deseados; o por el contrario, la concentración puede
aumentarse por medios usuales, por ejemplo por micro- o
ultra-filtración sobre membranas de porosidades
apropiadas que retienen las vesículas pero que son permeables al
líquido portador.
Una revisión de liposomas y sus métodos de
preparación puede encontrarse también en el texto de referencia
"Surfactants and Polymers in Drug Delivery", por M. Malmsten,
Cap. 4, pp. 87-131, Marcel Dekker Inc. Ed.,
2002.
Como se conoce en la técnica, se forman micelas
por las moléculas anfifílicas dispersadas en agua cuando la
concentración de estas moléculas excede de un umbral predeterminado
conocido como CMC (concentración crítica de formación de micelas).
A concentraciones inferiores a la CMC, las moléculas están
dispersadas en general en la solución acuosa como moléculas
simples. Por encima del valor CMC, las moléculas anfifílicas tienden
a organizarse en estructuras supermoleculares, en equilibrio con
las moléculas libres en la solución, caracterizándose dichas
estructuras por el hecho de que la cola hidrófoba (lipídica) de la
molécula está dispuesta hacia la parte interior de la estructura,
mientras que el grupo de cabeza hidrófilo (polar o iónico) de la
molécula está dispuesto hacia la porción exterior de la estructura.
La CMC de la molécula anfifílica puede determinarse
experimentalmente utilizando métodos estándar en la técnica. Por
ejemplo, la CMC de un agente tensioactivo puede determinarse
representando gráficamente una propiedad en función de la
concentración del agente tensioactivo. La propiedad varía
usualmente de modo lineal con el aumento de la concentración de
agente tensioactivo hasta que se alcanza el valor CMC, y después de
esta concentración, la curva (o la propiedad) se aparta de la
linealidad. Propiedades adecuadas que pueden utilizarse para la
determinación de la CMC incluyen índice de refracción, dispersión
de la luz, tensión superficial, conductividad eléctrica, presión
osmótica y análogas. Para el propósito de la invención, los
materiales formadores de micelas primarias preferidos son aquéllos
que tienen una CMC relativamente baja, v.g. de aproximadamente 10
mM o inferior. Las micelas tienen típicamente una dimensión
comprendida entre aproximadamente 0,1 nm y aproximadamente 100 nm,
con preferencia desde aproximadamente 1 nm a aproximadamente 50 nm.
El diámetro medio numérico (D_{N}) es de aproximadamente 50 nm o
menos, con preferencia de aproximadamente 20 nm o menos y de modo
mucho más preferible de 10 nm o menos, hasta v.g. 1 nm, con
preferencia al menos aproximadamente 2 nm. El término "micela",
tal como se utiliza en esta memoria, incluye una estructura micelar
formada por una mezcla de dos o más compuestos diferentes
("micelas mixtas"), al menos uno de los cuales es un compuesto
anfifílico capaz de formar una estructura micelar. El término
micelas mixtas incluye también por tanto dentro de su significado
micelas formadas por al menos un compuesto, preferiblemente un
compuesto anfifílico, que es por regla general incapaz de formar una
estructura micelar cuando se dispersa como tal en un vehículo
acuoso, pero que es capaz de formar dicha estructura cuando se
utiliza en combinación con cantidades adecuadas de un compuesto
anfifílico formador de micelas. Ejemplos de micelas mixtas son, por
ejemplo, micelas formadas por fosfolípidos no modificados (los
cuales son por regla general incapaces de formar micelas cuando
están dispersados como el material único en un vehículo acuoso) y
por un compuesto formador de micelas (v.g. un fosfolípido
modificado con PEG o una sal de ácido graso).
Una revisión de micelas, sistemas micelares y
métodos de preparación de los mismos puede encontrarse, por
ejemplo, en el texto de referencia: "Surfactants and Polymers in
Drug Delivery", por M. Malmsten, Cap. 4, pp.
19-50, Marcel Dekker Inc. Ed., 2002. De acuerdo con
un aspecto de la invención, un compuesto sensible a MRI está
asociado con la micela, preferiblemente en la forma de un compuesto
anfifílico susceptible de incluirse en la estructura micelar (v.g.
un complejo de un ion paramagnético con un agente anfifílico
quelante, tal como un poliaminocarboxilato).
Materiales adecuados útiles para formación de
micelas a asociar con un liposoma en un ensamblaje de la invención
puede seleccionarse entre los materiales lípidos y fosfolípidos
enumerados previamente.
Ejemplos de compuestos formadores de micelas son
fosfolípidos modificados con PEG, que incluyen en particular
fosfatidiletanolaminas modificadas con PEG tales como
DMPE-PEG, DPPE-PEG,
DSPE-PEG, DAPE-PEG1; sales de ácidos
grasos, preferiblemente sales alcalinas, en particular sales de
sodio, tales como palmitato de sodio, estearato de sodio, oleato de
sodio, linoleato de sodio, dodecanoato de sodio, sal de sodio de
1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerato
o sal de sodio de
1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol;
derivados de azúcares tales como
alquil(C_{6}-C_{10})-\beta-D-glucopiranósido,
alquil(C_{8}-C_{12})-\beta-D-maltósido;
alquil(C_{8}-C_{16})dimetilamoniopropano-sulfonato;
y ácidos biliares derivados de las mismas, tales como colato de
sodio o desoxicolato de sodio. Pueden utilizarse también polímeros,
con inclusión de porciones hidrófobas e hidrófilas de los mismos
(conocidos también como "agentes tensioactivos polímeros")
para preparar suspensiones micelares. Ejemplos de agentes
tensioactivos polímeros adecuados incluyen, sin limitación,
poli(óxidos de etileno) (PEO), tales como
n-alquil(C_{8}-C_{16})-PEO-monoéter,
n-alquil(C_{8}-C_{10})-fenil-PEO,
tetrametilbutilfenil-PEO, polisorbatos de PEO,
siendo vendidos estos PEO bajo los nombres comerciales de Brij®,
Mirj®, Lubrol®, Triton®, Nonidet® o Tween®; copolímeros de bloques
tales como copolímeros de bloques óxido de etileno/óxido de
propileno (v.g. Pluronic® o Synperonic®), que tienen
preferiblemente un PM de aproximadamente 3.000 a 20.000 Daltons,
preferiblemente de 5.000 a 15.000 Daltons. Ventajosamente, pueden
utilizarse otros compuestos formadores de micelas, preferiblemente
en mezcla con cualquiera de los compuestos formadores de micelas
enumerados previamente para formar micelas mixtas. Ejemplos de
estos compuestos son sales de alquilamonio que comprenden al menos
una cadena alquilo (C_{10}-C_{20}),
preferiblemente (C_{14}-C_{18}), tales como, por
ejemplo, cloruro de estearilamonio, cloruro de hexadecilamonio,
bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), bromuro de
hexadeciltrimetilamonio (CTAB); sales de amonio terciarias o
cuaternarias que comprenden una o preferiblemente 2 cadenas acilo
(C_{10}-C_{20}), preferiblemente
(C_{14}-C_{18}) enlazadas al átomo N a través
de un puente alquileno(C_{3}-C_{6}),
tales como
1,2-diestearoil-3-trimetilamonio-propano
(DSTAP),
1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano
(DPTAP),
1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano
(DOTAP), y
1,2-diestearoil-3-dimetilamonio-propano
(DSDAP). Pueden utilizarse también fosfolípidos no modificados para
formar micelas, tales como los diésteres de ácidos grasos de
fosfatidilcolina, etilfosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, ácido
fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina o
esfingomielina previamente mencionados. Dado que estos fosfolípidos
no modificados son sin embargo incapaces por lo general de formar
estructuras micelares cuando están dispersados en un vehículo
acuoso (debido a que estos compuestos tienden más bien a asociarse
como liposomas cuando están dispersados en una solución acuosa),
dichos fosfolípidos no modificados ascenderán con preferencia a
menos de aproximadamente 80%, de modo más preferible aproximadamente
70% o menos del peso total de la mezcla de compuestos que forman la
estructura micelar. De acuerdo con una realización preferida, el
componente micelar se forma a partir de una mezcla que comprende
desde aproximadamente 30% a 70%, con preferencia desde
aproximadamente 40% a 60% en peso de fosfolípidos no modificados. El
resto de la mezcla puede ser cualquiera de los agentes
tensioactivos formadores de micelas citados
anteriormente.
anteriormente.
La carga neta global puede ser conferida a la
micela por cualquiera de los compuestos con carga negativa o
positiva citados previamente, en particular lípidos o fosfolípidos,
con inclusión de fosfolípidos modificados.
Ejemplos de fosfolípidos adecuados para conferir
una carga negativa global a la micela son derivados de
fosfatidilserina, tales como DMPS, DPPS, DSPS; derivados de ácido
fosfatídico, tales como DMPA, DPPA, DSPA; derivados de
fosfatidilglicerol tales como DMPG, DPPG y DSPG. Fosfolípidos
modificados, en particular fosfatidiletanolaminas modificadas con
PEG, pueden emplearse ventajosamente para conferir la carga negativa
global deseada a la micela, tales como, por ejemplo,
DMPE-PEG750, -PEG1000, -PEG2000, -PEG3000,
-PEG4000 o -PEG5000; DPPE-PEG750, -PEG1000,
-PEG2000, PEG3000, -PEG4000 o PEG5000; DSPE-PEG750,
-PEG1000, -PEG2000, PEG3000, -PEG4000 o PEG5000;
DAPE-PEG750, -PEG1000, -PEG2000, PEG3000, -PEG4000
o PEG5000. Adicionalmente, también la lisoforma respectiva de los
fosfolípidos arriba citados, tales como derivados de
lisofosfatidilserina, derivados de ácidos lisofosfatídicos (v.g.
liso-DMPA, -DPPA o -DSPA) y derivados de
lisofosfatidilglicerol (v.g. liso-DMPG, -DPPG o
-DSPG). Ejemplos de lípidos cargados negativamente son sales de
ácidos biliares tales como sales de ácido cólico, sales de ácido
desoxicólico o sales de ácido glicocólico; y sales de ácidos grasos
tales como sal de ácido palmítico, sal de ácido esteárico, sal de
1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerol
o sal de
1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol.
Preferiblemente, el compuesto con carga negativa
se selecciona entre los fosfolípidos modificados con PEG arriba
citados. El componente con carga negativa está asociado típicamente
con un ion de carga opuesta positivo correspondiente, que puede ser
mono- (v.g. un metal alcalino), bi- (v.g. un metal alcalinotérreo) o
tri-valente (v.g. aluminio). Preferiblemente, el
ion de carga opuesta se selecciona entre cationes de metal alcalino,
tales como Li^{+}, Na^{+} o K^{+}, más preferiblemente
Na^{+}.
Ejemplos de fosfolípidos adecuados para conferir
una carga global positiva a la micela son ésteres de
fosfatidilcolinas, tales como
1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina
(etil-DSPC),
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina
(etil-DPPC). El ion de carga opuesta negativo es
preferiblemente un ion halógeno, en particular cloro o bromo.
Ejemplos de lípidos cargados positivamente son sales de
alquilamonio, que comprenden al menos una cadena alquilo
(C_{10}-C_{20}), preferiblemente
(C_{14}-C_{18}), o amonio terciario o
cuaternario que comprende una o preferiblemente dos cadenas acilo
(C_{10}-C_{20}), preferiblemente
(C_{14}-C_{18}), enlazadas al átomo N a través
de un puente alquileno (C_{3}-C_{6}), tal como
los enumerados previamente.
Como compuestos con carga positiva se emplean
preferiblemente etil-DPPC,
etil-DSPC, DSTAP o mezclas de los mismos.
El componente con carga positiva está asociado
típicamente con un ion de carga opuesta negativo correspondiente,
que puede ser mono- (v.g. halógeno), bi- (v.g. sulfonato) o
tri-valente (v.g. fosfato). Preferiblemente, el ion
de carga opuesta se selecciona entre iones halógeno, tales como
F^{-} (flúor), Cl^{-} (cloro) o Br^{-} (bromo).
Como anteriormente, las moléculas cargadas
pueden estar mezcladas ventajosamente en algunas realizaciones con
un compuesto anfifílico neutro, tales como los enumerados
previamente (con inclusión de fosfolípidos neutros), para formar la
estructura micelar deseada. Compuestos neutros preferidos a mezclar
con los compuestos cargados enumerados anteriormente son agentes
tensioactivos polímeros, tales como copolímeros de bloques óxido de
etileno-óxido de propileno (v.g. Pluronic F68, Pluronic F108 o
Pluronic F127 de la firma Aldrich, Missouri, EE.UU.), alquiléteres
polioxietilados (v.g. Brij® 78, Sigma Aldrich), ésteres de ácidos
grasos con polioxietileno (v.g. Myrj® 53 o Myrj®59, Sigma Aldrich);
ésteres de ácidos grasos con polioxietilen-sorbitán
(v.g. Tween® 60, Sigma Aldrich), o glicolalquiléteres de
poli-etileno tales como
polietilenglicol-terc-octilfeniléter
(v.g. Triton® X-100, Sigma Aldrich). De acuerdo con
una realización de la invención, las micelas están formadas por
mezclas de un compuesto anfifílico cargado con un fosfolípido
neutro y uno o más de los compuestos neutros arriba numerados.
Preferiblemente, la cantidad molar de agente
tensioactivo cargado que forma la micela es de aproximadamente 5% a
80%, de modo más preferible aproximadamente 10% a aproximadamente
70% de la cantidad molar total de los componentes formadores de
micelas.
De acuerdo con un aspecto de la invención, las
micelas mixtas comprenden preferiblemente un fosfolípido modificado
con PEG, un agente tensioactivo polímero o una mezcla de los mismos,
cuya presencia permite mejorar sustancialmente el tiempo de
residencia del ensamblaje en el torrente sanguíneo.
Alternativamente, o además de ello, pueden emplearse asimismo
ácidos biliares, lisofosfolípidos o mezclas de los mismos para
aumentar el tiempo de residencia del ensamblaje en la sangre. La
cantidad de compuestos capaces de aumentar el tiempo de residencia
del ensamblaje en el torrente sanguíneo es con preferencia de
aproximadamente 10% a aproximadamente 80% en moles, de modo más
preferible aproximadamente 25% a aproximadamente 70% en moles de la
cantidad molar total de compuestos formadores de micelas.
Dicho tiempo de residencia mejorado de un
ensamblaje de acuerdo con la invención es tal que, después de 30
minutos de la inyección, la cantidad de los ensamblajes en el
torrente sanguíneo es al menos 50%, con preferencia al menos 60%,
de la cantidad de ensamblajes en la dosis inyectada. Inversamente,
la cantidad de una preparación de liposomas correspondiente en el
torrente sanguíneo, después de 30 minutos de la inyección, es
típicamente menor que 50%, en particular menor que 40%, de la
cantidad de liposomas en la dosis inyectada. Análogamente, después
de una hora de la inyección, la cantidad de los ensamblajes en el
torrente sanguíneo es al menos 50%, y en la mayoría de los casos al
menos 60%, de la cantidad de ensamblajes en la dosis inyectada,
mientras que la cantidad de una preparación de liposomas
correspondiente en el torrente sanguíneo es menor que 40%, en la
mayoría de los casos menor que 30%, de la cantidad de liposomas en
la dosis inyectada. En particular, para liposomas que tengan un
diámetro medio de aproximadamente 1 \mum, la cantidad de liposomas
después de 1 hora de la inyección es típicamente menor que 10% de
la cantidad de liposomas en la dosis inyectada.
Agentes activos tales como los agentes
terapéuticos y diagnósticos citados previamente, están asociados con
los componentes micelares, en particular aquellos agentes activos
que comprenden una estructura anfipática adecuada que tiene
afinidad con los compuestos formadores de micelas o aquéllos que
pueden encapsularse en el componente micelar. Un agente activo
puede representar desde aproximadamente 10% a aproximadamente 80%
del peso total de la micela, con preferencia desde aproximadamente
25% a aproximadamente 70%.
Un agente intensificador de imágenes está
asociado con el compuesto micelar, en particular un compuesto
sensible a MRI. El compuesto sensible a MRI asociado con la micela
se encuentra preferiblemente en la forma de un compuesto anfifílico
capaz de incluirse en la estructura micelar, v.g. por interacciones
hidrófobas de la porción lipófila de dicho compuesto con las
porciones lipófilas de los componentes formadores de las
micelas.
De acuerdo con una realización preferida, el
compuesto anfifílico sensible a MRI es un ion metálico paramagnético
complejado con una molécula quelantes que incluye un resto
lipófilo, al que se hace referencia en lo sucesivo como un ion
paramagnético quelado. Los iones metálicos paramagnéticos preferidos
tienen números atómicos de 21-29, 42, 44, o
57-83. Esto incluye iones de la serie de los metales
de transición o lantánidos que tienen al menos uno, y más
preferiblemente cinco o más electrones sin aparear y un momento
magnético de al menos 1,7 magnetones de Bohr. Metales
paramagnéticos preferidos incluyen, pero sin carácter limitante,
cromo (III), manganeso (II), manganeso (III), hierro (II), hierro
(III), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), praseodimio (III),
neodimio (III), samario (III), gadolinio (III), terbio (III),
disprosio (III), holmio (III), erbio (III), europio (III) e iterbio
(III). Adicionalmente, los heteromultímeros de la presente invención
pueden conjugarse también con una o más partículas
superparamagnéticas.
Un experto en la técnica seleccionará un
material de acuerdo con la dosis requerida para detectar un tejido
que contiene la diana y considerar otros factores tales como
toxicidad del metal para el paciente. Generalmente, la dosis
deseada para un metal individual será proporcional a su relaxividad,
modificada por la biodistribución, la farmacocinética y el
metabolismo del metal. El catión trivalente Gd^{3+} es
particularmente preferido para agentes de contraste MRI, debido a
su alta relaxividad y baja toxicidad, con la ventaja adicional de
que el mismo existe en un solo estado de oxidación biológicamente
accesible, lo que minimiza la metabolización indeseable del metal
por un paciente. Otro metal útil es Cr^{3+}, que es relativamente
económico.
La molécula quelante es preferiblemente un
agente quelante anfipático. En particular, dicha molécula comprende
preferiblemente una porción hidrófila quelante, que incluye uno o
más grupos polares (que actúan como ligando para y se complejan
con, un metal paramagnético) y una porción lipófila capaz de
interaccionar con las porciones lipófilas de los otros compuestos
formadores de micelas, para integrar el complejo en la estructura
micelar. La porción quelante es preferiblemente un residuo de un
ácido quelante empleado comúnmente en la técnica, más
preferiblemente un ácido quelante policarboxílico o
poliaminocarboxílico. Agentes formadores de quelatos conocidos en
la técnica incluyen ácidos con grupos de ácido
metileno-fosfónico, grupos ácidos de
metileno-carbohidroxamina, grupos carboxietilideno,
o grupos carboximetileno. Ejemplos de formadores de quelatos
incluyen, pero sin carácter limitante, ácido
dietileno-triamina-pentaacético
(DTPA), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético
(DOTA), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético
(DO3A), ácido etilenodiamina-tetraacético (EDTA), y
ácido
1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-1,4,8,11-tetraacético
(TETA). Ligandos quelantes adicionales son
etilenobis-(2-hidroxi-fenilglicina)
(EHPG), y derivados del mismo, con inclusión de
5-Cl-EHPG,
5-Br-EHPG,
5-Me-EHPG,
5-t-Bu-EHPG, y
5-sec-Bu-EHPG; ácido
benzodietilenotriamina-pentaacético
(benzo-DTPA) y derivados del mismo, con inclusión
de dibenzo-DTPA, fenil-DTPA,
difenil-DTPA, bencil-DTPA, y
dibencil-DTPA; ácido
bis-2(hidroxibencil)-etileno-diaminadiacético
(HBED) y derivados del mismo; la clase de compuestos macrocíclicos
que contienen al menos 3 átomos de carbono, más preferiblemente al
menos 6, y al menos 2 heteroátomos (O y/o N), pudiendo estar
constituidos dichos compuestos macrocíclicos por un solo anillo, o
por dos o tres anillos unidos en los heteroelementos del anillo,
v.g. benzo-NOTA, dibenzo-DOTA,
benzo-NOTA, donde NOTA es ácido
1,4,7-triazaciclononano
N,N',N''-triacético, benzo-TETA,
benzo-DOTMA, donde DOTMA es ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetra(metil-tetraacético),
o benzo-TETMA, donde TETMA es ácido
1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-1,4,8,11-(metiltetraacético);
derivados de ácido 1,3-propilenodiaminatetraacético
(PDTA) y ácido trietilenotetraaminahexaacético (TTHA); derivados de
1,5,10-N,N',N''-tris(2,3-dihidroxibenzoil)tricatecolato
(LICAM); derivados de
1,3,5-N,N',N''-tris(2,3-dihidroxibenzoil)-aminometilbenceno
(MECAM); o derivados de DO3A, tales como HP-DO3A
(ácido
1,4,7,10-tetraazaciclo-dodecan-1-(2-hidroxipropil)-4,7,10-triacético).
Ejemplos de formadores de quelatos y grupos quelantes
representativos contemplados por la presente invención se describen
en los documentos WO 98/18496, WO 86/06605, WO 91/03200, WO
95/28179, WO 96/23526, WO 97/36619, PCT/US98/01473, PCT/US98/20182,
y las Patentes U.S. Nos. 4.899.755, 5.474.756, 5.846.519 y
6.143.274. Formadores de quelatos preferidos para uso en la
presente invención son DO3A, HP-DO3A, DTPA o DOTA.
El uso de los formadores de quelato DO3A o HP-DO3A
es particularmente preferido.
El resto lipófilo puede estar enlazado a la
porción respectiva formadora de quelato (v.g. cualquiera de los
formadores de quelatos ilustrados anteriormente) de la molécula
quelantes de acuerdo con técnicas conocidas. Por ejemplo, un resto
hidrófobo puede enlazarse a un residuo de ácido carboxílico a través
de un enlace éster o un enlace amida. Ejemplos de restos lipófilos
adecuados que pueden enlazarse a través de un enlace éster al resto
quelante incluyen residuos de alcoholes
(C_{1}-C_{24}), preferiblemente
(C_{8}-C_{24}), más preferiblemente alcoholes
alifáticos lineales (C_{10}-C_{20}), tales como,
por ejemplo, alcohol n-decílico, alcohol laurílico,
alcohol miristílico, alcohol cetílico, o alcohol
n-octadecílico; alcoholes aromáticos, tales como,
por ejemplo, alcohol bencílico, alcoholes mono-, bi- o
tri-(C_{1}-C_{4})alquil-fenílicos;
y mezclas de los mismos. Análogamente, aminas preferidas a enlazar
a través de un enlace amido al resto carboxílico de un ácido
quelante incluyen aminas alifáticas lineales de
alquilo(C_{1}-C_{24}), preferiblemente
alquilo(C_{8}-C_{24}), más
preferiblemente alquilo(C_{10}-C_{20}),
tales como, por ejemplo
n-decil-amina,
n-dodecil-amina,
n-tetradecil-amina,
n-hexadecil-amina o
n-octadecil-amina; aminas
aromáticas, tales como, por ejemplo, bencil-amina,
mono-, bi- o
tri-alquil(C_{1}-C_{4})-fenil-amina;
y mezclas de las mismas.
Ejemplos y la preparación de quelatos
anfipáticos preferidos y complejos de los mismos con metales
paramagnéticos se describen, por ejemplo, en las Patentes US
6.342.598 o 6.652.834.
Alternativamente, un átomo de nitrógeno de
cualquiera de los ácidos poliaminocarboxílicos enumerados
previamente puede proveerse de un resto alquilo o hidroxialquilo
lineal (C_{8}-C_{24}), más preferiblemente
(C_{10}-C_{20}), como se describe en la Patente
US 6.342.518 citada anteriormente.
Alternativamente, un agente quelante
policarboxílico puede proveerse de grupos
lipófilo-hidrófobos enlazados a los segmentos
alquileno de la cadena molecular principal, o al carbono alfa de las
funciones carboxilato o a un grupo hidroxilo cuando está presente
en el agente quelante, como se describe en el documento US
6.652.834.
Se prefieren particularmente aquellos derivados
de ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético
(DO3A) que llevan en la posición N-10 un resto
lipófilo adecuado, tales como ácido
[10-[2-(dioctadecilamino)-2-oxoetil]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético,
que forma el complejo correspondiente
[10-[2-(dioctadecilamino)-2-oxoetil]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacetato(3-)]gadolinio.
Preparaciones de ion metálico paramimético
quelado pueden realizarse de acuerdo con procedimientos conocidos,
tales como por ejemplo la preparación descrita por G.W. Kabalka
et al., Magnetic Resonance in Medicine 8 (1988),
89-95.
De acuerdo con una realización alternativa, el
agente sensible a MRI puede ser una nanopartícula de magnetita. Las
nanopartículas de magnetita pueden, por ejemplo, mezclarse con un
material anfifílico cargado negativamente (y opcionalmente uno
neutro), tales como los mencionados previamente, con objeto de
estabilizar dichas partículas y mantenerlas dispersadas en una
solución acuosa en forma micelar. La Patente U.S. No. 5.545.395 da
varios ejemplos de preparación de dichas partículas estabilizadas
de magnetita, v.g., por utilización de una mezcla de DPPA y
Pluronic® para estabilización de dichas partículas.
Además de los arriba indicados, puede utilizarse
cualquier otro agente sensible a MRI asociable de manera estable a
la estructura micelar. Por ejemplo, cualquier compuesto anfifílico
que comprenda un átomo hiperpolarizado tal como los mencionados
previamente, con preferencia ^{13}C, puede incorporarse
adecuadamente en una micela asociada con un liposoma en un
ensamblaje de acuerdo con la invención. La relación molar del agente
sensible a MRI en el componente micelar, en particular del ion
metálico paramagnético, debe ser suficientemente alta para permitir
la mejora deseada de la imagen de diagnóstico. Preferiblemente, la
cantidad molar de agente sensible a MRI es con preferencia al menos
25% del total molar del material formador de micelas, más
preferiblemente de al menos 50% y mucho más preferiblemente de al
menos 70%. Típicamente, no son deseables en general cantidades
mayores que aproximadamente 99%, dado que esto podría rebajar
excesivamente la cantidad del componente cargado en la micela. De
modo más preferible, la cantidad molar de agente sensible a MRI no
es mayor que aproximadamente 95%.
Ventajosamente, las micelas de un ensamblaje de
acuerdo con la invención pueden incluir adicionalmente un compuesto
que tenga una actividad de direccionamiento, es decir un ligando de
direccionamiento, que permita que el ensamblaje se fije a una diana
específica.
El ligando de direccionamiento incluido en la
micela puede ser sintético, semi-sintético, o
existente naturalmente. Materiales o sustancias que pueden servir
como ligandos de direccionamiento incluyen, por ejemplo, pero sin
carácter limitante, proteínas, con inclusión de anticuerpos,
fragmentos de anticuerpos, moléculas receptoras, moléculas de
fijación de receptores, glicoproteínas y lectinas; péptidos, con
inclusión de oligopéptidos y polipéptidos; peptidomiméticos;
sacáridos, con inclusión de mono- y polisacáridos; vitaminas;
esteroides; análogos de esteroides, hormonas, cofactores, agentes
terapéuticos y material genético, con inclusión de nucleósidos,
nucleótidos y polinucleótidos.
El término "diana" o "molécula diana"
hace referencia a cualesquiera sustancias a la que puede fijarse a
un ligando de direccionamiento, tales como proteínas o
polipéptidos, células, receptores, carbohidratos, lípidos, etc.
Ejemplos de dianas y ligandos de
direccionamiento adecuados se describen, por ejemplo, en la Patente
U.S. No. 6.139.819.
El ligando de direccionamiento puede ser un
compuesto anfifílico per se que está mezclado con los otros
componentes de la composición micelar, o puede ser un compuesto que
se fija a una molécula anfifílica empleada para la formación de la
micela.
En una realización preferida, el ligando de
direccionamiento puede estar unido a una molécula anfifílica de la
micela a través de un enlace covalente. En tal caso, el resto
reactivo específico que precisa estar presente en la molécula
anfifílica dependerá del ligando de direccionamiento particular a
acoplar a la misma. Como ejemplo, si el ligando de direccionamiento
puede enlazarse a la molécula anfifílica a través de un grupo amino,
los restos reactivos adecuados para la molécula anfifílica pueden
ser grupos isotiocianato (que formarán un enlace tiourea), ácidos
carboxílicos o ésteres reactivos (para formar un enlace amida),
grupos aldehído (para la formación de un enlace imina que se
reducirá a un enlace alquilamina), etc.; si el ligando de
direccionamiento puede enlazarse a la molécula anfifílica a través
de un grupo tiol, restos reactivos complementarios adecuados para
la molécula anfifílica incluyen derivados haloacetilo o maleimidas
(para formar un enlace tioéter); y si el ligando de
direccionamiento puede enlazarse a la molécula anfifílica a través
de un grupo carboxílico, restos reactivos adecuados para la
molécula anfifílica podrían ser aminas e hidrazidas (para formar
enlaces amida o alquilamida). Con objeto de fijar covalentemente un
ligando de direccionamiento deseado, al menos parte del compuesto
anfifílico que forma la micela deberá contener por tanto un resto
reactivo adecuado y el ligando de direccionamiento que contiene la
funcionalidad complementaria se enlazará al mismo de acuerdo con
técnicas conocidas, v.g. por adición del mismo a una dispersión
acuosa que comprenda los componentes anfifílicos de la micela. El
compuesto anfifílico puede combinarse con el ligando de
direccionamiento deseado antes de preparar la micela, y la
combinación así obtenida puede utilizarse en el proceso de
preparación de la micela. Alternativamente, el ligando de
direccionamiento puede enlazarse al compuesto anfifílico respectivo
durante el proceso de preparación de la micela o puede enlazarse
directamente al compuesto anfifílico ya incluido en una estructura
micelar.
De acuerdo con una realización alternativa, el
ligando de direccionamiento puede asociarse también convenientemente
con la micela por la vía de interacción física y/o electrostática.
Como ejemplo, un resto funcional que tenga una afinidad y
selectividad altas para un resto complementario puede introducirse
en la molécula anfifílica, mientras que el resto complementario se
enlazará al ligando de direccionamiento. Por ejemplo, un resto
avidina (o estreptavidina) (que tiene afinidad alta para biotina)
puede enlazarse covalentemente a un fosfolípido, mientras que el
resto biotina complementario puede incorporarse en un ligando de
direccionamiento adecuado, v.g. un péptido o un anticuerpo. El
ligando de direccionamiento marcado con biotina se asociará así con
el fosfolípido marcado con avidina de la micela por medio de un
sistema de acoplamiento avidina-biotina.
Alternativamente, tanto el fosfolípido como el ligando de
direccionamiento pueden proveerse de un resto biotina y acoplarse
subsiguientemente uno a otro por medio de avidina (que es un
componente bifuncional capaz de formar puente entre los dos restos
biotina). Ejemplos de acoplamiento biotina/avidina de fosfolípidos y
péptidos se describen también en el documento US 6.139.819 citado
anteriormente. Como alternativa, interacciones de van der Waal's,
interacciones electrostáticas y otros procesos de asociación pueden
asociar o fijar el ligando de direccionamiento con las moléculas
anfifílicas.
De acuerdo con una realización alternativa, el
ligando de direccionamiento puede ser un compuesto que se mezcla
con los componentes que forman la micela tales como, por ejemplo, un
lipopéptido como se describe, v.g. en las Solicitudes de Patente
Internacional WO 98/18501 o 99/55383. Alternativamente, puede
fabricarse en primer lugar una micela, que comprende un compuesto
que tiene un resto adecuado capaz de interaccionar con un resto
complementario correspondiente de un ligando de direccionamiento;
después de ello, el ligando de direccionamiento deseado se añade a
la suspensión de micelas, para fijarse al resto complementario
correspondiente en la micela. Como una alternativa adicional, puede
prepararse un ensamblaje, que comprende una micela que incluye un
compuesto que tiene un resto adecuado capaz de interaccionar con un
resto correspondiente complementario de un ligando de
direccionamiento; después de ello, el ligando de direccionamiento
deseado se añade a la suspensión del ensamblaje, para fijarse al
resto correspondiente en la micela. Ejemplos de dianas específicas
adecuadas a las cuales puede estar dirigido el ensamblaje son, por
ejemplo, fibrina y el receptor de fijación GPIIbIIIa en las
plaquetas activadas. La fibrina y las plaquetas están presentes de
hecho generalmente en los "trombos", es decir coágulos que
pueden formarse en el torrente sanguíneo y causar una obstrucción
vascular. Péptidos de fijación adecuados se describen, por ejemplo,
en el documento US 6.139.419 citado anteriormente. Péptidos de
fijación adicionales específicos para direccionamiento a fibrina se
describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Internacional WO
02/055544. Otros ejemplos de dianas importantes incluyen receptores
en placas vulnerables y receptores específicos de tumores, tales
como la región del dominio de quinasa (KDR) y el complejo VEGF
(factor de crecimiento endotelial vascular)/KDR. Péptidos de
fijación adecuados para KDR o complejo VEGF/KDR se describen, por
ejemplo, en las Solicitudes de Patente Internacional WO 03/74005 y
WO 03/084574.
Micelas mixtas que contienen los componentes
anfifílicos deseados, el ion metálico paramagnético quelado y,
opcionalmente, un agente de direccionamiento, pueden prepararse como
se conoce en la técnica, v.g. de acuerdo con el método de
preparación descrito en la Patente Europea EP 804.251.
Por ejemplo, los componentes pueden dispersarse
en un vehículo líquido acuoso por agitación. Ejemplos de vehículos
líquidos adecuados son agua, solución salina (cloruro de sodio al
0,9%), solución salina tamponada con fosfato (10 mM, pH 7,4),
tampón HEPES (20 mM, pH 7,4), y glucosa al 5% p/p en agua. Por
ejemplo, los compuestos anteriores pueden dispersarse en una
concentración de aproximadamente 1 a 100 mg/ml en un líquido acuoso
y disolverse por medio de agitación mecánica suave o tratamiento
por ultrasonidos.
Las micelas pueden guardarse luego como una
dispersión acuosa (v.g. en el vehículo acuoso utilizado para su
preparación) antes de mezclarse con una suspensión que contiene
liposomas. Alternativamente, la suspensión de micelas puede
liofilizarse de acuerdo con técnicas convencionales, para eliminar
el líquido y guardar el producto seco final para los usos
subsiguientes.
La preparación de un ensamblaje de acuerdo con
la invención puede realizarse de acuerdo con métodos convencionales,
v.g. por mezcla de una suspensión acuosa que comprende los
liposomas (obtenida de acuerdo con cualquiera de los métodos de
fabricación citados anteriormente) con un suspensión acuosa que
comprende micelas obtenida como se ha descrito arriba.
Opcionalmente, la mezcla así obtenida puede
someterse a uno o más pasos de lavado, con objeto de eliminar el
exceso de componentes no asociados. Para los propósitos de la
presente invención, el término "paso de lavado" incluye en su
significado cualquier método o proceso dirigido a separar y/o al
menos eliminar parcialmente el exceso de materiales no asociados,
componentes, partículas y análogos de una suspensión de un compuesto
deseado. Métodos de separación adecuados incluyen, por ejemplo,
diálisis, decantación, centrifugación, ultrafiltración o
microfiltración, siendo preferida generalmente la centrifugación. En
el paso de lavado pueden emplearse soluciones de lavado
convencionales adecuadas, tales como agua destilada, solución salina
tamponada con fosfato, tampón Tris/glicerol, solución salina o
solución de glucosa al 5%. La fase de la mezcla lavada que comprende
el ensamblaje de la invención se separa luego y se recoge;
opcionalmente, la suspensión recuperada que contiene el ensamblaje
se diluye finalmente antes de su utilización, v.g. con cualquiera de
los vehículos fisiológicamente aceptables citados
anteriormente.
La suspensión que comprende el ensamblaje de la
invención puede guardarse para una administración subsiguiente o
puede administrarse directamente a un paciente. Si se desea, el
vehículo líquido de la suspensión puede eliminarse (v.g. por
liofilización) a fin de obtener un polvo seco del ensamblaje que
puede guardarse luego durante periodos de tiempo relativamente
largos antes de su reconstitución.
Alternativamente, los dos componentes del
ensamblaje pueden guardarse como composiciones separadas en forma
seca (v.g. liofilizada) y reconstituirse como una suspensión antes
de la administración. La reconstitución con un vehículo líquido
acuoso puede tener lugar por separado en las dos composiciones secas
que comprenden los componentes respectivos del ensamblaje,
obteniendo así dos suspensiones separadas que se mezclan
subsiguientemente para obtener la suspensión de ensamblaje deseada.
Alternativamente, las dos composiciones secas pueden mezclarse una
con otra y reconstituirse luego como una sola suspensión con un
vehículo líquido acuoso. De acuerdo con una realización preferida,
la composición micelar seca se reconstituye primeramente con un
vehículo acuoso fisiológicamente aceptable, y la suspensión
obtenida se utiliza luego para reconstitución de la composición de
liposomas seca, a fin de obtener finalmente una suspensión del
ensamblaje.
Para la preparación del ensamblaje puede ser
ventajoso añadir una cantidad en exceso de micelas con respecto a
la cantidad de micelas que se desea tener en el ensamblaje final,
debido en particular a que cierta cantidad de dichas micelas puede
eliminarse durante los pasos de lavado opcionales de la suspensión
de ensamblaje. El exceso de micelas se expresa por conveniencia
como el exceso de cargas negativas (o positivas) en la preparación
micelar con respecto a la cantidad de cargas positivas (o negativas)
en la suspensión de liposomas, indicándose las cargas como
"equivalente de cargas". El término "equivalente de carga"
(EC) hace referencia al número de cargas por mol de un compuesto;
así, un mol de un compuesto mono-iónico contiene un
EC, un mol de un compuesto di-iónico contiene dos
EC, y así sucesivamente. En general, se prefiere que la cantidad de
EC en la composición micelar sea sustancialmente igual al EC en la
composición de los liposomas (es decir relación EC de
aproximadamente 1:1). La relación entre EC en la preparación
micelar con respecto al EC en la preparación de liposomas puede
variar así, por ejemplo, desde aproximadamente 1:2 a aproximadamente
3:1, preferiblemente desde 2:3 a 3:2. Con objeto de tener una
indicación práctica de la eficacia del ensamblaje, la Solicitante ha
encontrado útil hacer referencia al potencial \zeta (potencial
zeta) de la suspensión de liposomas y la suspensión de ensamblaje.
El potencial \zeta, denominado también potencial electrocinético,
es el potencial eléctrico en la superficie de una partícula
coloidal con relación al potencial en el medio a granel a una
distancia larga. El mismo puede medirse de acuerdo con métodos
analíticos convencionales de micro-electroforesis,
v.g. por la determinación de la velocidad de las partículas en un
campo eléctrico impulsor por Anemometría
Láser-Doppler. Por ejemplo, puede utilizarse
ventajosamente el instrumento ZetaSizer 3000 Has (Malvern Instrument
GmbH). En la práctica, se determina primeramente el potencial
\zeta de la suspensión inicial de liposomas, el cual puede tener
un valor positivo o negativo, dependiendo de si los liposomas
contienen compuestos con carga positiva o negativa,
respectivamente. A continuación, se mida el potencial \zeta en la
suspensión final que contiene el ensamblaje (es decir después de
los pasos de lavado necesarios para eliminar micelas posiblemente no
fijadas). En general, la adición de micelas de signo opuesto con
respecto a los liposomas determina una disminución más o menos
pronunciada en valor absoluto del potencial \zeta de la
suspensión. En particular, las suspensiones que comprenden
liposomas cargados positivamente exhibirán una disminución del
potencial \zeta después de la adición de una suspensión de
micelas cargadas negativamente, mientras que las suspensiones que
comprenden liposomas cargados negativamente exhibirán un aumento
relativo del potencial \zeta (es decir, una disminución en valor
absoluto) después de la adición de una suspensión de micelas
cargadas positivamente. Como ha sido observado por la Solicitante,
los ensamblajes preferidos son aquellas suspensiones que exhiben una
disminución sustancial en valor absoluto respecto al potencial
\zeta de la suspensión inicial de liposomas, es decir una
disminución de al menos 50%, preferiblemente al menos 75% y más
preferiblemente al menos 90% de dicho valor inicial. Suspensiones de
ensamblajes particularmente preferidas son aquéllas que exhiben un
potencial \zeta sustancialmente neutro (es decir 0 \pm 15 mV,
correspondiente a una disminución absoluta de aproximadamente 100%
con respecto al potencial inicial de la suspensión de liposomas) o
un potencial \zeta opuesto en signo con respecto al potencial
\zeta de la suspensión inicial de liposomas. Como ha sido
observado por la Solicitante, cuando el potencial \zeta de la
suspensión de ensamblaje se mantiene igual en signo con una
disminución absoluta inferior al 50% con respecto al potencial
\zeta de las suspensiones iniciales de liposomas, esto puede ser
una indicación de que un número insuficiente de micelas están
asociadas con los liposomas.
De acuerdo con una realización preferida, la
cantidad de micelas cargadas en el ensamblaje es tal que confiere
un potencial \zeta sustancialmente neutro a dicho ensamblaje o un
potencial \zeta que es opuesto en signo respecto al potencial
\zeta de la suspensión de liposomas. Como ha sido observado por la
Solicitante, para obtener dicho potencial \zeta neutro o de signo
opuesto del ensamblaje, no es necesario sin embargo que el
ensamblaje contenga un exceso de equivalentes de carga de las
micelas. De hecho, se ha observado que ensamblajes compuestos de
liposomas positivos y micelas negativas y que tienen una relación
entre EC en las micelas y equivalentes de carga opuesta en los
liposomas de aproximadamente 1:5 (es decir, un exceso de
aproximadamente 5 veces de cargas positivas en los liposomas) puede
exhibir sin embargo un potencial \zeta sustancialmente neutro o
negativo. Aunque no se desea quedar ligados por ninguna teoría
particular, puede suponerse que las cargas (negativas) comprendidas
en las micelas están dispuestas en la superficie exterior del
ensamblaje; si el número de micelas asociadas con el liposoma es
suficientemente alto, el exceso de cargas opuestas (positivas) en
el liposoma puede resultar, al menos parcialmente, apantallado por
dichas micelas. Así, dado que el potencial \zeta medido en una
partícula se ve influenciado fuertemente por las cargas presentes en
el límite exterior de dicha partícula, incluso un ensamblaje que
tenga un exceso de equivalentes (positivos) de carga derivados de
un liposoma puede exhibir un potencial \zeta negativo, si la
cantidad de micelas cargadas (negativamente) es suficiente para
apantallar parcialmente las cargas (positivas) del liposoma. Todo lo
anterior es por supuesto aplicable también a ensamblajes formados
por liposomas cargados negativamente y micelas cargadas
positivamente.
Las composiciones inyectables después de la
reconstitución del agente de contraste liofilizado deben ser, en la
medida de lo posible, isotónicas con la sangre. Por tanto, antes de
la inyección, pueden añadirse también pequeñas cantidades de
agentes isotónicos a las suspensiones que comprenden el ensamblaje
de la invención. Los agentes isotónicos son soluciones fisiológicas
utilizadas comúnmente en medicina tales como, solución salina
acuosa (NaCl al 0,9%), solución de glicerol al 2,6% o solución de
dextrosa al 5%. La reconstitución de las suspensiones acuosas se
obtiene generalmente por simple disolución de los componentes secos
y agitación moderada.
El volumen y las concentraciones del líquido de
reconstitución pueden estar deseablemente equilibrados para hacer
sustancialmente isotónicas las formulaciones resultantes listas para
ser utilizadas. Por tanto, el volumen y la concentración del fluido
de reconstitución seleccionado dependerán del tipo y cantidad de
estabilizador (y otros agentes de aumento de volumen) presente en
el producto liofilizado.
El ensamblaje de la invención puede incluirse en
kits de diagnóstico que comprenden el ensamblaje de la invención o
sus componentes separados respectivos, comprendiendo opcionalmente
además el vehículo líquido acuoso.
De acuerdo con una primera realización, dicho
kit es un kit de dos componentes que comprende el ensamblaje de la
invención junto con un vehículo líquido acuoso. Dicho kit de dos
componentes puede incluir dos envases separados o un envasa de dos
cámaras.
En el primer caso, el primer envasa es
preferiblemente un vial convencional sellado con una membrana, en
donde el vial que contiene el ensamblaje como un residuo
liofilizado (obtenido de acuerdo con cualquiera de los métodos
ilustrados anteriormente) está sellado con una membrana a través de
la cual puede inyectarse el líquido vehículo para reconstituir la
suspensión de ensamblajes. El líquido vehículo está contenido en un
segundo envasa que tiene preferiblemente la forma de una
jeringuilla. La jeringuilla se llena previamente de modo preferible
con la suspensión reconstituida y se utiliza subsiguientemente para
administrar el agente de contraste por inyección. En lugar del
ensamblaje formado, el primer envasa puede contener alternativamente
mezclas de micelas liofilizadas por separado y composiciones de
liposomas, que formarán el ensamblaje deseado después de su
reconstitución con el vehículo acuoso. Aunque por regla general la
agitación a mano del envasa proporciona la energía deseada para
reconstitución de la suspensión, pueden proporcionarse medios para
dirigir o permitir la aplicación de energía suficiente al envasa
(v.g. un mezclador Vortex), a fin de asegurar la reconstitución
adecuada de la suspensión de ensamblajes. El envasa de dos cámaras
es preferiblemente una jeringuilla de dos cámaras, en la cual los
componentes se mantienen separados v.g. por medio de una membrana
desechable, y una vez que el liofilizado se ha reconstituido por
agitación suave mediante sacudidas, puede utilizarse directamente
el envasa para inyectar el agente de contraste. Como anteriormente,
pueden proporcionarse medios para dirigir o permitir la aplicación
de energía suficiente al envase.
Puede ser apreciado por una persona con
experiencia ordinaria en la técnica que otros sistemas de
reconstitución de dos cámaras capaces de combinar el polvo seco con
la solución acuosa de una manera estéril están también dentro del
alcance de la presente invención. De acuerdo con una realización
alternativa, un kit de acuerdo con la invención es un kit de al
menos dos componentes que comprende una composición de micelas, una
composición de liposomas y, opcionalmente, un vehículo acuoso. El
kit se presenta preferiblemente como al menos dos envases
separados, conteniendo el primero de ellos la composición de
liposomas liofilizada y conteniendo el segundo la composición de
micelas liofilizadas deseada (v.g. donde las micelas comprenden un
ligando de direccionamiento adecuado). Un tercer envasa opcional,
que contiene el vehículo acuoso para reconstitución, puede incluirse
ventajosamente en el kit. Si se desea, pueden incluirse en el kit
envases adicionales que contienen micelas liofilizadas adicionales
(v.g. que comprenden un segundo ligando de direccionamiento) o
composiciones de liposomas. Para la administración, la suspensión
micelar se reconstituye primeramente en el vehículo acuoso y la
suspensión obtenida se utiliza luego para reconstituir la
composición de liposomas, formando así la suspensión de ensamblaje
deseada.
No se requieren envases, viales o sistemas de
conexión específicos de ningún tipo; la presente invención puede
utilizar envases, viales y adaptadores convencionales. El único
requerimiento es un sellado satisfactorio entre el tapón y el
envase. La calidad del sellado, por consiguiente, es una cuestión de
importancia primaria; cualquier degradación de la integridad del
sellado podría permitir la entrada de sustancias indeseables en el
vial. Además de asegurar la esterilidad, es esencial el
mantenimiento de vacío para los productos tapados a las presiones
del ambiente o presiones reducidas a fin de garantizar una
reconstitución segura y adecuada. El material del tapón que forma
el sello estanco a los gases del envasa es preferiblemente un
compuesto elastómero o una formulación multicomponente basada en un
elastómero, tal como poli(isobutileno) o caucho de butilo.
Convenientemente, puede utilizarse un tapón de caucho de butilo de
Daiko Seiko Ltd.
La composición de la invención puede utilizarse
de la misma manera que las composiciones terapéuticas o diagnósticas
convencionales. Por ejemplo, cuando la composición comprende un
agente sensible a MRI, pueden preferirse ciertas técnicas MR y
secuencias de pulsos cuando se trata de obtener la imagen de un
tejido que contiene la diana tal como, por ejemplo, un sitio de
angiogénesis, a fin de mejorar el contraste del sitio respecto a la
sangre y los tejidos sustrato. Estas técnicas incluyen (pero sin
carácter limitante), por ejemplo, secuencias en negro de
angiografía de sangre que procuran oscurecer la sangre, tales como
eco-secuencias de espín rápidas (véase v.g.
Alexander et al., Magnetic Resonance in a Medicina,
40(2): 298-310 (1998)) y
eco-secuencias en gradiente de flujo deteriorado
("flow-spoiled") (véase v.g. Edelman et
al., Radiology, 177(1): 45-50 (1990)).
Estos métodos incluyen también técnicas de flujo independiente que
mejoran la diferencia de contraste, tales como secuencias
preparadas por inversión-recuperación o preparadas
por saturación-recuperación, que aumentarán el
contraste entre el tejido que contiene la diana, tal como un tumor
angiogénico, y los tejidos sustrato. Finalmente, preparaciones de
transferencia por magnetización pueden aumentar también el contraste
con estos agentes (véase v.g. Goodrich et al., Investigative
Radiology, 31(6): 323-32 (1996)).
El ensamblaje de la invención se administra
preferiblemente al paciente en la forma de una composición
inyectable. El método de administración es preferiblemente
parenteral, es decir intravenoso, intraarterial, intratecal,
intersticial, intradérmico o intracavitario. Para obtención de
imágenes de angiogénesis activa, se prefiere la administración
intravenosa o intraarterial.
Cuando el ensamblaje contiene un compuesto
sensible a MRI y un ligando de direccionamiento, se contempla que
el paciente recibirá una dosis de agente de contraste suficiente
para mejorar la señal MR en la diana (v.g. un sitio de
angiogénesis) al menos un 10%. Después de la inyección del
ensamblaje que incluye el reactivo MRI, el paciente se somete a
escaneo en la máquina MRI para determinar la localización de
cualesquiera sitios que contengan la diana. En los escenarios
terapéuticos, después de localización de la diana, puede
administrarse inmediatamente un agente terapéutico, en caso
necesario, y el paciente puede escanearse subsiguientemente para
visualizar el efecto terapéutico.
Los ejemplos siguientes se proporcionan para
ilustrar la invención con mayor detalle.
\vskip1.000000\baselineskip
Se emplean en los ejemplos los materiales
siguientes:
Los potenciales \zeta del liposoma y las
suspensiones de ensamblaje se determinan utilizando un instrumento
Malvern ZetaSizer 3000Hsa en glucosa 0,4M.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se disuelven 1037,7 mg (1,332 mmol) de SPC3,
74,9 mg (0,089 mmol) de etil-SPC3, y 137,4 mg (0,355
mmol) de colesterol (Fluka) en una mezcla de 17 ml de metanol y 33
ml de cloroformo. La solución se filtra sobre un filtro estéril de
0,2 \mum (Macherey Nagel) y se añade como marcador una cantidad de
trazador 14C-tripalmitina (10 \mul en CHCl3;
actividad específica 50 \muCi/ml). Se eliminan los disolventes
orgánicos por evaporación en un evaporador rotativo (Rotavapor) a
40ºC a presión reducida y el residuo se seca durante una noche a la
misma temperatura bajo una presión de 1 torr.
Se añaden a los lípidos secos 50 ml de una
solución de Iomeprol (Bracco Imaging), correspondientes a 280 mg de
yodo por ml, de tal manera que la solución obtenida contiene
aproximadamente 25,3 mg de lípidos/ml (CLip). La solución se
calienta luego durante aproximadamente media hora a 80ºC con
agitación suave para efectuar la hidratación de los lípidos con la
formación subsiguiente de vesículas de liposoma. La suspensión de
liposomas se extruye luego en sucesión 5 veces a través de un
filtro de policarbonato de tamaño de poro 2,0 \mum
(Nucleopore^{(TM}).
Con objeto de determinar la cantidad de yodo
encapsulada eficazmente en las vesículas de liposoma, se dializa
una parte alícuota de 1 ml de la preparación filtrada (bolsa de
diálisis de Serva; punto de corte por peso molecular \approx
10.000-15.000) durante aproximadamente
10-12 horas contra 1 l de tampón PBS. La operación
de diálisis se repite una vez para asegurarse de que se ha eliminado
totalmente el yodo libre no encapsulado. Se añade una solución de
dodecil-sulfato de sodio al 10% (0,1 ml) a la
solución dializada (0,9 ml) y la mezcla se calienta a 40ºC durante
5 minutos para destruir los liposomas y liberar el yodo atrapado. El
contenido de yodo en la preparación final se determina por medida
de la densidad óptica de esta solución a 230 nm. En el específico
(sic), la proporción final contenía 230 mg/ml de Iomeprol
(correspondientes a 113 mg de yodo atrapado en liposomas por ml de
suspensión).
La cantidad de lípidos efectivamente presente en
la preparación se determina por medida de la radiactividad de la
muestra utilizando un analizador de centelleo de líquidos (Packard
2200-CA, TRI-CARB®). En el
específico (sic), se determinó una concentración de lípidos (CLip)
de 25 mg/ml.
El volumen total de la suspensión filtrada de
liposomas se somete a diálisis (bolsa de diálisis de Serva; punto
de corte por peso molecular \approx 10.000-15.000,
PBS) para eliminar el yodo libre no encapsulado de la suspensión y
se concentra luego por ultrafiltración (membrana de células Amicon)
para aumentar aproximadamente dos veces la concentración de lípidos
(aproximadamente 30 mg/ml).
El tamaño medio de las vesículas de liposoma y
la distribución de tamaños de las vesículas se determinan por un
método de Dispersión Dinámica de la Luz (DLS) (conocido también como
"Photon Correlation Spectroscopy - PCS") utilizando un Malvern
Mastersizer MS20 (Malvern Instruments). La determinación específica
indicó que el tamaño medio de las vesículas en la presente
preparación era aproximadamente 1,05 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1a
Se aplica el mismo procedimiento del Ejemplo 1,
pero los lípidos secos obtenidos después de la evaporación del
disolvente orgánico se hidratan con 50 ml de una solución de glucosa
0,4M (en lugar de los 50 ml de solución de Iomeprol®). Después de
la extrusión como en el Ejemplo 1, se obtienen liposomas con un
diámetro medio de aproximadamente 1 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se sigue el mismo procedimiento del Ejemplo 1,
con el paso adicional de que después de las 5 extrusiones a través
del filtro de policarbonato de 2,0 \mum, la suspensión de
liposomas se filtra ulteriormente cinco veces a través de un filtro
de policarbonato de tamaño de poro 1,0 \mum y ulteriormente 5
veces a través de un filtro de policarbonato de tamaño de poro 0,6
\mum.
Yodo encapsulado: 67,7 mg/ml; diámetro medio de
los liposomas: 0,42 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se sigue el mismo procedimiento del Ejemplo 2,
con el paso adicional de que después de las 5 extrusiones a través
del filtro de policarbonato de 0,6 \mum, la suspensión de
liposomas se filtra ulteriormente cinco veces a través de un filtro
de policarbonato de 0,4 \mum y 5 veces a través de un filtro de
policarbonato de 0,2 \mum.
Yodo encapsulado: 33,6 mg/ml; diámetro medio de
los liposomas: 0,22 \mum.
Todas las preparaciones de liposomas de los
Ejemplos 1-3 exhiben un potencial \zeta de
aproximadamente +45 mV \pm2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se disuelven 200 mg de complejo de Gd y 200 mg
de DSPE-PEG2000 en 10 ml de agua destilada y la
mezcla se homogeneiza por tratamiento con ultrasonidos durante
aproximadamente 30 min a 70ºC (Sonificador Branson, potencia
40).
Se miden las relaxividades del espín protónico
de la suspensión de micelas utilizando un aparato Minispec
PC-120 (Brucker), que opera por debajo de 0,47 Tesla
(20 MHz). Se utiliza EDM510A (EDM = Módulo de Definición del
Experimento) para medir el tiempo de relajación
espín-red T1 por el método de "recuperación de
inversión". Se utilizó EDM610A para medir el tiempo de
relajación espín-espín T2 por la técnica de
Carr-Purcell-Meiboom-Gill
(GPMG). Las medidas de las relaxividades longitudinal (r_{1}) y
transversal (r_{2}) (expresadas en s^{-1}mM^{-1} = 1/T) en
una suspensión 1 mM preparada como anteriormente eran como
sigue:
(r_{1})
= 22.6;
\hskip0,5cm(r_{2}) = 26.3
Ejemplo
5
Se llevan a cabo tres preparaciones de
ensamblaje, por mezcla de 4 ml de una suspensión de micelas
preparadas de acuerdo con el Ejemplo 4 con 16 ml de cada una de las
tres suspensiones de liposomas preparadas de acuerdo con los
Ejemplos 1 a 3, con objeto de obtener suspensiones respectivas de
ensamblajes A1, A2, y A3. La mezcla se agita suavemente durante 4
horas y se deja luego en reposo a 4ºC durante una noche. Después de
ello, se lleva la suspensión a la temperatura ambiente y se
centrifuga durante 1 hora a 30.000 g (Heraeus Supratech 22). Se
recuperan luego los ensamblajes liposoma-micela del
pelet del sedimento de la suspensión centrifugada (desechando el
sobrenadante) y se suspenden en glucosa 0,4M, hasta un volumen total
de 16 ml, y se agitan suavemente durante una
noche.
noche.
Para cada preparación, se determinan el
contenido de yodo y los tiempos de relajación T1 y T2 como se
ilustra en los Ejemplos 1 y 4, respectivamente, por mezcla de 0,4
ml de cada preparación con 3 ml de sangre (rata). Se calculan luego
las relaxividades r1 y r2 a partir de los valores T1 y T2
respectivos. Los valores de relaxividad r1 y r2 (en
s^{-1}mM^{-1}) medidos sobre las preparaciones de los
ensamblajes A1, A2 y A3 eran como sigue:
- A1: r1= 21,1,
- r2= 25,2;
- A2: r1= 19,6,
- r2= 23,5;
- A3: r1= 22,7,
- r2= 25,6.
Para las tres preparaciones de ensamblaje, el
potencial \zeta medido era aproximadamente +5 mV \pm1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5a
Se sigue el mismo procedimiento del Ejemplo 5,
pero los 4 ml de la suspensión de micelas del Ejemplo 4 se mezclan
con 16 ml de una suspensión de liposomas del Ejemplo 1a. La mezcla
se agita suavemente durante 4 horas y se deja luego en reposo
durante una noche a 4ºC. Después de ello se lleva la suspensión a la
temperatura ambiente y los ensamblajes formados se separan del
exceso de micelas no fijadas por medio de cromatografía de
exclusión de tamaños, eluyendo con una solución de glucosa 0,4M.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se prepara una suspensión de liposomas cargados
negativamente que comprendían 840,5 mg (1,079 mmoles) de SPC3, 58,1
mg (0,073 mmoles) de DSPG\cdotNa y 113,7 mg (0,294 mmoles) de
colesterol disuelta en 20 ml de solución de Iomeprol de acuerdo con
el procedimiento reseñado en el Ejemplo 1. El tamaño medio de las
vesículas era aproximadamente 0,95 \mum.
Se prepara una suspensión de micelas cargadas
positivamente que comprendía 200 mg de complejo de Gd, 300 mg de
Pluronic F108 y 61,6 mg de Etil-SPC3 disuelta en 20
ml de agua destilada de acuerdo con el procedimiento reseñado en el
Ejemplo 4. El tamaño medio de las micelas era aproximadamente 0,80
nm.
Se mezcla 1 ml de la suspensión de liposomas con
1 ml de la suspensión de micelas de acuerdo con el procedimiento
del Ejemplo 5. El ensamblaje recuperado resultante exhibía los
valores de relaxividad siguientes: r1 = 21,6 s^{-1}mM^{-1}, r2
= 24,2 s^{-1}mM^{-1}.
El potencial \zeta medido sobre la preparación
inicial de liposomas es de aproximadamente 32 mV, mientras que el
potencial \zeta de la preparación final de ensamblaje es de
aproximadamente -3 mV.
\newpage
Ejemplo
7
Se prepara una suspensión de liposomas cargados
positivamente de acuerdo con el procedimiento reseñado en el
Ejemplo 1.
Se preparan partículas de magnetita recubiertas
con DPPA/Pluronic F108 (relación FE/DPPA/Pluronic F108 3/15/
15 en mg/ml) de acuerdo con la Patente US 5.545.395. La solución se diluye con 10 ml de glucosa al 5%.
15 en mg/ml) de acuerdo con la Patente US 5.545.395. La solución se diluye con 10 ml de glucosa al 5%.
Se mezclan 5 ml de la suspensión de liposomas
con 4,5 ml de suspensión de micelas de magnetita, se mantienen
durante 3 horas bajo agitación rotativa, y se centrifugan luego a
3500 g durante 30 minutos. Se desecha el sobrenadante y se diluye
la solución que contiene las micelas con 50 ml de glucosa al 5%. El
valor de relaxividad r2 medido sobre la suspensión de ensamblaje
obtenida era 366,6 s^{-1}mM^{-1}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
1156,5 mg de SPC3, 163,5 mg de colesterol, 178,5
mg de Etil-SPC3 y 375,0 mg de complejo de Gd se
disuelven en 100 ml de CHCl_{3}. Se evapora el disolvente en el
evaporador rotativo a 50ºC y se seca el residuo durante una noche
en un horno de vacío. La película de lípido seca se rehidrata por
adición de 150 ml de Iomeprol (280 mg yodo/ml) durante 45 min a
65ºC con agitación moderada. La suspensión de liposomas obtenida se
pasa luego 5 veces a través de un filtro de policarbonato de 2
\mum (Nucleopore) y se dializa finalmente contra glucosa 0,4M,
para eliminar el Iomeprol no atrapado.
Los valores de relaxividad determinados en los
liposomas eran como sigue:
r1 = 9.3\
s^{-1}mM^{-1}
r2 = 12.6\
s^{-1}mM^{-1}
5 ml de una suspensión micelar que contiene
26,02 mg/ml de complejo de Gd y 20,04 mg/ml de
PE-PEG2000 en agua se añaden a 20 ml de la
suspensión de liposomas anterior. La mezcla se deja a la temperatura
ambiente durante aproximadamente 3 horas y se centrifuga luego a
35.000 g durante 45 minutos. Se desecha el sobrenadante y los
ensamblajes recuperados se resuspenden en glucosa 0,4M.
Los valores de relaxividad medidos sobre la
suspensión de ensamblaje fueron como sigue:
r1 = 16.9\
s^{-1}mM^{-1}
r2 = 21.6\
s^{-1}mM^{-1}
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Las preparaciones de ensamblaje obtenidas de
acuerdo con el Ejemplo 5 se evalúan en cuanto a sus propiedades
respectivas de circulación en la sangre y se comparan con
preparaciones de liposomas correspondientes obtenidas de acuerdo
con los Ejemplos 1 a 3.
En lo que sigue, las preparaciones de liposomas
de los Ejemplos 1, 2 y 3 se identifican como L1 (tamaño medio de
1,05 \mum), L2 (tamaño medio de 0,42 \mum) y L3 (tamaño medio de
0,22 \mum), respectivamente, mientras que las preparaciones de
ensamblaje correspondientes obtenidas como se describe en el Ejemplo
5 (es decir, por mezcla de cada una de dichas preparaciones de
liposoma con la preparación de micelas obtenida de acuerdo con el
Ejemplo 4), se identifican como A1, A2, y A3, respectivamente. Las
preparaciones de liposomas y de ensamblaje se inyectan luego por
vía intravenosa en 6 grupos (3 para las preparaciones de liposoma y
3 para las preparaciones de ensamblaje) de 7 ratas cada uno (8 ml
de suspensión por kg de rata en la vena del rabo) y se determina la
concentración de yodo y de gadolinio (eliminación de la sangre) para
cada preparación inyectada en diferentes momentos por sacrificio de
una de las 7 ratas de cada grupo a intervalos de 5, 10, 15, 30, 60,
90 y 120 minutos. La concentración de gadolinio en cada momento se
determina como se describe en el Ejemplo 4, y se expresa como el
porcentaje de los valores iniciales T1 y T2 de la dosis inyectada.
La concentración de yodo se determina por HPLC después del
tratamiento de partes alícuotas de 500 \mul de sangre extraída
con 100 \mul de SDS (10 mina, 65ºC bajo agitación) y 100 \mul de
HClO_{4} al 35% (10 min bajo centrifugación); el sobrenadante se
pasa luego a través de una columna HPLC (LiChrosfer
10RP-18, Merck; fase A: tampón de fosfato de
potasio 10 mM, pH 6,0; fase B: 30% MeOH, 70% fase A; 1 ml/min;
detección UV: 240 nm); la concentración de yodo se expresa como el
porcentaje de la concentración inicial de yodo en la dosis
inyectada. Las Figuras 2-4 muestran los gráficos de
eliminación de yodo (líneas con rombos) y de gadolinio (T1, líneas
con cuadrados; T2, líneas con triángulos) de la sangre, para las
preparaciones de ensamblaje A1, A2, y A3, respectivamente.
Como puede deducirse de dichas figuras, las
preparaciones de ensamblaje A1, A2, y A3 tienen una variación
sustancialmente similar de la concentración de yodo y gadolinio en
función del tiempo, lo que demuestra que las preparaciones siguen
una cinética de eliminación de la sangre sustancialmente similar y
que el ensamblaje es estable cuando se inyecta en la circulación
sanguínea (ausencia de separación entre los liposomas que contienen
yodo y las micelas que contienen gadolinio). Por el contrario, como
se muestra en las Figuras 5-7 (que ilustran la
variación de yodo en el tiempo para las preparaciones
A1-L2, A2-L2 y
A3-L3, respectivamente), las preparaciones de
liposomas L1, L2 y L3 (líneas inferiores con cuadrados) muestran una
cinética bastante rápida de eliminación de la sangre, en
comparación con los ensamblajes A1, A2 y A3 respectivos (líneas
superiores con triángulos), indicando así que la capa micelar que
rodea los liposomas actúa como una clase de barrera "invisible"
para los liposomas, permitiendo aumentar sus tiempos de residencia
respectivos en la circulación sanguínea.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se prepara una suspensión de liposomas de
acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 1.
Se prepara una suspensión micelar de acuerdo con
el procedimiento del Ejemplo 4, dispersando 200 mg de complejo de
Gd, 150 mg de DSPE-PEG2000 y 50 mg de
DSPE-PEG2000 biotinilado en 10 ml de agua
destilada.
Se añaden 40 ml de la preparación de liposomas a
5,25 ml de la suspensión micelar con agitación (agitador magnético)
y se mantienen en agitación durante 3 horas. Después de ello, se
centrifuga la suspensión durante 30 minutos a 25.000 g, se
recuperan los ensamblajes liposoma-micela de los
pelets de la suspensión centrifugada (desechando el sobrenadante),
y se suspenden luego en un volumen de PBS para un volumen total de
35 ml.
Los valores relativamente altos de los tiempos
de relajación T1 (1800 ms) y T2 (2000 ms) medidos en la fase de
sobrenadante desechada permiten la estimación de que el gadolinio
está sustancialmente ausente de esta fase y que la totalidad
sustancial de las micelas están ligadas por tanto a los
liposomas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la evaluación de la eficacia de formación
de imágenes del ensamblaje de la invención, se emplean dos
cartuchos de fibras huecas (Minikros M11 260 01 P, membrana
polisulfónica, de Spectrum Laboratories Inc.), para simular la
estructura vascularizada de un tumor. Los detalles del cartucho son
como sigue:
longitud de fibras: 12,2 cm; longitud total:
18,5 cm; diámetro del tubo del cartucho: 1,88 cm; superficie útil
total: 615 cm^{2}; diámetro de fibra: 0,05 cm; volumen interior de
la fibra: 0,024 cm^{3}; superficie interior de la fibra: 1,92
cm^{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llena un primer cartucho (A, control) con 25
ml de tampón de carbonato (pH 9,8).
Se llena un segundo cartucho (B) con una mezcla
de 4 ml de una solución de Neutravidin® de concentración 1 mg/ml y
20 ml de un tampón de carbonato (pH 9,8). El cartucho se deja
durante una noche a 4ºC y se lava luego tres veces con tampón PBS
al 0,1% (p/p) de Tween® 20. Después del lavado, se llena el cartucho
con 22 ml de la suspensión de ensamblaje anterior, se incuba
durante 24 horas a la temperatura ambiente y se lava luego 10 veces
con 25 ml de PBS, hasta que resulta del lavado un líquido claro.
Se analizan los dos cartuchos por medio de un
aparato Philips Intera 1.5T, con dos secuencias de eco diferentes,
como se detalla en las Tablas 1 y 2 siguientes. En las mismas
tablas, se da la intensidad relativa de la señal detectada para
ambos cartuchos (expresada en unidades relativas arbitrarias).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras 8a y 8b muestran las imágenes
respectivas correspondientes a los valores presentados en la Tabla
2. Por estas figuras, puede apreciarse la mejora sustancial de la
formación de imagen proporcionada por una suspensión que contiene
un ensamblaje direccionado de acuerdo con la invención en el
cartucho B, mientras que se consigue una formación de imagen más
bien pobre del cartucho A.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Se prepara una suspensión de liposomas que
comprende complejo de Gd, SPC3, colesterol y
etil-SPC3 en una relación molar de 12,5/60/17,5/10,
de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 8.
Se prepara una suspensión micelar de acuerdo con
el procedimiento del Ejemplo 4, dispersando 200 mg de complejo de
Gd, 150 mg de DSPE-PEG2000 y 50 mg de
DSPE-PEG2000 biotinilado en 10 ml de agua.
Se añaden 40 ml de la preparación de liposomas a
5,25 ml de la suspensión micelar con agitación (agitador magnético)
y se deja en agitación durante tres horas. Después de ello, se
centrifuga la suspensión durante 30 minutos a 25.000 g, se
recuperan los ensamblajes liposoma-micela del fondo
de la suspensión centrifugada (desechando el sobrenadante), y se
suspenden luego en glucosa 0,4M hasta una concentración final de
lípidos de 25 g/l. La suspensión de ensamblaje se incuba luego
durante una noche con neutravidina a la temperatura ambiente
(relación biotina/neutravidina: 20/1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se implantan dos tumores VX2 yuxtapuestos
(derecha e izquierda) en el lomo de un conejo. Quince días después
de la implantación, se inyectan por vía intravenosa 150 \mug de
anticuerpo humano Biot-\beta3 que reconoce el
receptor \alphaV\beta3 expresado en células endoteliales
(Chemicon International Inc.). 24 horas después, se inyectan las
preparaciones de ensamblaje (3 ml/kg de conejo) y 8 horas más tarde
se somete el conejo a MRI. Se observa una visualización clara de
los dos tumores.
Claims (23)
1. Composición para uso diagnóstico o
terapéutico que comprende un ensamblaje que comprende:
- un liposoma que lleva una primera carga global
neta y que tiene una envolvente límite con superficies interior y
exterior respectivas, definiendo dicha envolvente una porción
interior del mismo; y
- una pluralidad de componentes micelares, que
comprenden un compuesto de mejora de imágenes y que llevan una
segunda carga global neta de signo opuesto a dicha primera carga
neta, estando dichos componentes micelares asociados con la
superficie exterior de la envolvente de dicho liposoma por una
interacción sustancialmente electrostática.
2. Composición de acuerdo con la reivindicación
1 en la cual dicho componente micelar comprende un compuesto
polímero anfifílico.
3. Composición de acuerdo con la reivindicación
1 en la cual dicho compuesto mejorador de imágenes es un compuesto
sensible a MRI.
4. Composición de acuerdo con la reivindicación
3, en la cual dicho compuesto sensible a MRI es un ion metálico
paramagnético complejado por una molécula quelante que incluye un
resto lipófilo.
5. Composición de acuerdo con la reivindicación
4, en la cual dicho ion paramagnético se selecciona entre cromo
(III), manganeso (II), manganeso (III), hierro (II), hierro (III),
cobalto (II), níquel (II), cobre (II), praseodimio (III), neodimio
(III), samario (III), gadolinio (III), terbio (III), disprosio
(III), holmio (III), erbio (III), europio (III) e iterbio
(III).
6. Composición de acuerdo con la reivindicación
4, en la cual dicha molécula quelante es un agente anfipático
quelante que comprende una porción hidrófila quelante y una porción
lipófila.
7. Composición de acuerdo con la reivindicación
6, en la cual dicha porción hidrófila quelante es un residuo de un
ácido quelante seleccionado de ácido
dietilenotriamina-pentaacético (DTPA), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético
(DOTA), benzo-DOTA, dibenzo-DOTA,
ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético
(DO3A), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclo-dodecan-1-(2-hidroxipropil)-4,7,10-triacético
(HP-DO3A), ácido
etilenodiamina-tetraacético (EDTA), ácido
1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-(1,4,8,11-tetraacético
(TETA), benzo-TETA,
etilenobis-(2-hidroxi-fenilglicina)
(EHPG), 5-Cl-EHPG,
5-Br-EHPG,
5-Me-EHPG,
5-t-Bu-EHPG, y
5-sec-Bu-EHPG, ácido
benzodietilenotriamina-pentaacético
(benzo-DTPA), dibenzo-DTPA,
fenil-DTPA, difenil-DTPA,
bencil-DTPA, dibencil-DTPA, ácido
bis-2-(hidroxibencil)-etileno-diaminadiacético
(HBED), ácido
1,4,7-triazaciclononano-N,N',N''-triacético
(NOTA), benzo-NOTA, ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetra(metiltetraacético)
(DOTMA), benzo-DOTMA, ácido
1,4,8,11-tetraazaciclo-tetradecano-1,4,8,11-(metil-tetraacético)
(TETMA), benzo-TETMA, derivados de ácido
1,3-propilenodiamina-tetraacético
(PDTA), derivados de ácido trietilenotetraaminahexaacético (TTHA),
derivados de
1,5,10-N,N',N''-tris(2,3-dihidroxibenzoil)tricatecolato
(LICAM), y derivados de
1,3,5-N,N',N''-tris(2,3-dihidroxibenzoil)-amino-metilbenceno
(MECAM).
8. Composición de acuerdo con la reivindicación
4, en la cual dicho compuesto sensible a MRI es
[10-[2-(dioctade-
cilamino)-2-oxoetil]-1,4,7,10-tetraazaciclo-dodecano-1,4,7-triacetato(3-)]gadolinio.
cilamino)-2-oxoetil]-1,4,7,10-tetraazaciclo-dodecano-1,4,7-triacetato(3-)]gadolinio.
9. Composición de acuerdo con la reivindicación
6, en la cual dicha porción lipófila es un residuo de un alcohol
(C_{1}-C_{24}), un alcohol aromático, una
alquilamina (C_{1}-C_{24}) alifática lineal, una
amina aromática, o mezclas de las
mismas.
mismas.
10. Composición de acuerdo con la reivindicación
9, en la cual dicha porción lipófila es un residuo de alcohol
n-decílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico,
alcohol cetílico, alcohol n-octadecílico, alcohol
bencílico, alcoholes mono-, di- o
tri-(alquil(C_{1}-C_{4})-fenílicos),
n-decil-amina,
n-dodecil-amina,
n-tetradecil-amina,
n-hexadecil-amina,
n-octadecil-amina,
bencil-amina, mono-, di- o
tri-alquil(C_{1}-C_{4})-fenil-amina,
o mezclas de las mismas.
11. Composición de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la cual dicho ensamblaje comprende
adicionalmente un ligando de direccionamiento incluido en el
componente micelar.
12. Composición de acuerdo con la reivindicación
1, en la cual dicho ensamblaje comprende un agente terapéutico en
el liposoma.
13. Composición de acuerdo con la reivindicación
2, en la cual dicho compuesto polímero es un agente tensioactivo
polímero o un fosfolípido que lleva un resto polímero hidrófilo.
14. Composición de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la cual dicho liposoma o dicho
componente micelar comprenden un compuesto anfifílico cargado
positivamente.
15. Composición de acuerdo con la reivindicación
14, en la cual dicho compuesto anfifílico cargado positivamente se
selecciona de mono- o di-ésteres de etilfosfatidilcolina con uno o
dos ácidos grasos; sales de alquilamonio que comprenden al menos
una cadena alquilo (C_{10}-C_{20}); sales de
amonio terciario o cuaternario que comprenden una o dos cadenas
acilo (C_{10}-C_{20}) enlazadas al átomo N a
través de un puente alquileno (C_{3}-C_{6}); o
mezclas de las mismas.
16. Composición de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la cual dicho liposoma o dicho
componente micelar comprenden un compuesto anfifílico cargado
negativamente.
17. Composición de acuerdo con la reivindicación
16, en la cual dicho compuesto cargado negativamente se selecciona
de di-ésteres de ácidos grasos con fosfatidilserina, diésteres de
ácidos grasos con ácido fosfatídico, diésteres de ácidos grasos con
fosfatidilglicerol, diésteres de ácidos grasos con
fosfatidilinositol, diésteres de ácidos grasos con
fosfatidiletanolamina modificados con polietilenglicol, sales de
ácidos biliares, sales de ácidos grasos
(C_{12}-C_{24}), o mezclas de los mismos.
18. Un kit diagnóstico y/o terapéutico que
comprende:
a) un liposoma, o un precursor del mismo, que
lleva una primera carga neta global como primer componente;
b) un componente micelar, o un precursor del
mismo, asociable o asociado con dicho liposoma, que comprende un
compuesto mejorador de imágenes y que llevan una segunda carga neta
global opuesta en signo a dicha primera carga neta, estando
asociado o siendo asociable dicho componente micelar con la
superficie exterior de dicho liposoma por una interacción
electrostática.
19. Un kit de acuerdo con la reivindicación 18
que comprende un liposoma en forma liofilizada.
20. Un kit de acuerdo con la reivindicación 18 ó
19 que comprende por separado un componente micelar en forma
liofilizada.
21. Un kit de acuerdo con la reivindicación 18
que comprende un ensamblaje que comprende un liposoma liofilizado
asociado con un componente micelar liofilizado.
22. Un kit de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 21 que comprende adicionalmente un vehículo
líquido farmacéuticamente aceptable.
23. Método para preparar un ensamblaje de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 17,
que comprende mezclar una preparación que comprende un liposoma o un
precursor del mismo con una preparación que comprende un componente
micelar o un precursor del mismo que se asocia con dicho
liposoma.
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