ES2305379T3

ES2305379T3 - Antigeno del cancer humano de la proteina relacionada con la tirosina 1 y genes que lo codifican.

Info

Publication number: ES2305379T3
Application number: ES03022671T
Authority: ES
Inventors: Rong-Fu Wang; Steven A. Rosenberg
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1996-02-09
Filing date: 1997-02-06
Publication date: 2008-11-01
Anticipated expiration: 2017-02-06
Also published as: WO1997029195A3; DE69725428D1; ATE391780T1; ATE251670T1; PT882130E; EP1411124A3; US5840839A; CA2733866C; ES2206685T3; JP2000506380A; DE69738630D1; CY2422B1; EP0882130A2; CA2245702A1; EP1092770A2; US6087110A; EP0882130B1; DE69738630T2; EP1411124A2; DK0882130T3

Abstract

Péptido del cáncer aislado que comprende una variante de un péptido del cáncer que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 6, en el que la variante presenta por lo menos 85% de identidad de secuencia con SEC ID nº: 6, y en el que la variante estimula los linfocitos T específicos para el antígeno del cáncer.

Description

Antígeno del cáncer humano de la proteína relacionada con la tirosinasa 1 y genes que lo codifican.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de los diagnósticos y productos terapeúticos para el cáncer incluyendo una vacuna contra el cáncer. Más específicamente, la invención se refiere al aislamiento y a la purificación de un nuevo péptido del cáncer y a una secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo que codifica el péptido del cáncer. La invención se refiere asimismo al aislamiento y purificación de un nuevo antígeno tumoral capaz de actuar como una herramienta en el tratamiento y prevención del cáncer y a una secuencia de ADN que codifica el antígeno del cáncer. La invención se refiere además al nuevo péptido del cáncer codificado por una secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo procedente del interior del gen de la proteína 1 relacionada con la tirosinasa (TRP 1). La invención se refiere además a procedimientos de detección, diagnóstico y tratamiento del cáncer y precáncer en un individuo.

Antecedentes de la invención

La transferencia adoptiva de linfocitos infiltrantes en el tumor (TIL) puede mediar la remisión tumoral en pacientes con melanoma metastásico, sugiriendo que en estas células tumorales existen antígenos de rechazo tumoral reconocidos por linfocitos T. La disponibilidad de dichos linfocitos T ha hecho posible clonar y secuenciar los genes que codifican los antígenos del melanoma humano. Los antígenos identificados hasta ahora procedentes del melanoma humano se pueden dividir en dos clases basándose en su modelo de expresión. Los antígenos de la primera clase son codificados por los genes que se expresan únicamente en el tumor y en los testículos, pero no en otros tejidos humanos normales. MAGE1, MAGE3, GAGE y BAGE son ejemplos de esta clase. La segunda clase de antígenos representa los antígenos con diferenciación codificados por los genes que se expresan únicamente en melanocitos, melanomas y retina normal. MART-1/Melan-A, gp100 y tirosina son ejemplos de esta clase. Todos estos antígenos son autoproteínas no mutadas. Sin embargo, varios antígenos mutados fueron también identificados al ser reconocidos por los linfocitos T, incluyendo CDK 4, catenina-B y Mum-1. La identificación de los epítopos antigénicos reconocidos por los linfocitos T procedentes de los correspondientes productos del gen es importante no solamente para comprender el mecanismo de la respuesta inmunitaria a los autoantígenos, sino también para desarrollar nuevas estrategias inmunoterapéuticas eficaces con estos antígenos o péptidos sintéticos para el tratamiento de pacientes con cáncer.

Los estudios anteriores demostraron que la infusión de TIL586 más IL-2 en el paciente autólogo con melanoma produjeron la remisión objetiva de la metástasis. Más recientemente, se clonó el gen, de la proteína 1 relacionada con la tirosinasa (TRP-1 o gp75) que codifica el antígeno tumoral reconocido por TIL586 junto con HLA-A31. El producto del gen, gp75, se identificó al principio, de forma ventajosa, como un antígeno reconocido por los anticuerpos de IgG en el suero de un paciente con melanoma metastásico. Se observó que el gen se expresaba solamente en el melanoma, las líneas celulares normales de melanocito y la retina, pero no en otros tejidos normales probados. Por consiguiente, este gen es un elemento de la segunda clase de antígenos que incluyen a MART-1/Melan-A, gp100 y tirosinasa.

En la técnica, ha sido difícil identificar un epítopo en una célula cancerosa que sería útil como inmunógeno o vacuna para proteger a un paciente de desarrollar el cáncer. La presente invención es la identificación de un péptido del cáncer y del epítopo antigénico del cáncer en el péptido codificado a partir de una secuencia con marco de lectura abierto alternativo en el gen de TRP-1 que es reconocido específicamente por los linfocitos T. El péptido del cáncer de la invención es útil como inmunógeno y vacuna para inhibir y prevenir el cáncer en un mamífero.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo péptido y fragmentos del mismo reconocidos como antígenos del cáncer por los linfocitos T.

El péptido del cáncer de la presente invención y el fragmento antigénico del epítopo del cáncer están codificados por una secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo de otro gen aparte de la secuencia del ADN con marco de lectura abierto utilizado para codificar una proteína o péptido normal del mismo gen. Un gen comprendido dentro de este ámbito es el gen de TRP-1. (documento WO 91/14775).

Otro aspecto de la invención es un antígeno tumoral codificado por una secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo de otro gen distinto de la secuencia de ADN con marco de lectura abierto que codifica una proteína o péptido normal del mismo gen. Un gen comprendido dentro de este ámbito es el gen de TRP-1.

TRP-2 es un miembro de la familia del gen relacionado con la tirosinasa. TRP-2 está identificado como un nuevo y potente antígeno tumoral capaz de provocar que los linfocitos T produzcan una respuesta inmunitaria.

Un aspecto de la invención son los péptidos del cáncer codificados por un marco de lectura abierto alternativo del gen de TRP-1 o sus variantes, que son útiles como vacunas contra el cáncer capaces de proteger al receptor del desarrollo del cáncer. La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de administración de la vacuna contra el cáncer en una cantidad eficaz para prevenir cánceres.

Otro aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un péptido del cáncer o un epítopo antigénico del cáncer del mismo, solo o en combinación con una o más moléculas inmunoestimulantes Otro aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende péptidos codificados por un marco de lectura abierto alternativo del gen TRP1, o sus combinaciones que estimulan los linfocitos T para producir una respuesta inmunógena contra los tumores y cánceres. El péptido del cáncer o su epítopo antigénico del cáncer se pueden proporcionar como inmunógeno o como vacuna para la prevención o el tratamiento del cáncer. La composición farmacéutica es útil en los procedimientos de tratamiento o de prevención del cáncer en un mamífero. En el procedimiento de tratamiento, la composición farmacéutica se administra a un mamífero en una cantidad eficaz para prevenir o inhibir el cáncer en un mamífero.

Otro objeto de la presente invención es un procedimiento de generación de péptidos del cáncer y del epítopo antigénico del cáncer en el péptido por traducción de una secuencia de ADN con marco alternativo de lectura abierto a partir de un gen TRP-1.

Todavía otro objeto de la invención es un procedimiento de detección e identificación del producto génico del péptido del cáncer y sus fragmentos traducidos a partir de una secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo procedente de un gen TRP-1.

Un aspecto adicional de la invención es una secuencia de ADN o ARN con marco de lectura abierto alternativo de un gen TRP-1 que codifica un péptido del cáncer o un fragmento del mismo y la utilización de la secuencia de ADN o ARN en los procedimientos de producción del péptido del cáncer o sus fragmentos. La invención proporciona además oligonucleótidos de la secuencia de ADN o ARN alternativa con marco de lectura abierto del gen TRP-1 para su utilización como sondas o cebadores.

La presente invención proporciona además vectores que comprenden una secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo del gen TRP-1 que codifica un péptido del cáncer o sus fragmentos solo o en combinación con una segunda secuencia de ADN que codifica por lo menos una molécula inmunoestimulante. La secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo procede del gen de TRP-1 o de una variante del mismo.

La invención también proporciona células húesped transfectadas o transducidas con un vector que comprende una secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo del gen TRP-1 que codifica un péptido o los fragmentos del mismo solo o en combinación con una segunda secuencia de ADN que codifica por lo menos una molécula inmunoestimulante.

Los vectores y las células húesped pueden servir como vacunas en las que la expresión de un antígeno tumoral o los péptidos del cáncer producen la estimulación de los linfocitos T específicos del antígeno tumoral en un mamífero inmunizado con la vacuna.

Los vectores y las células húesped pueden servir como vacunas en las que la expresión de un péptido del cáncer o de sus fragmentos producen la estimulación de los linfocitos T específicos del péptido del cáncer en un mamífero inmunizado con la vacuna.

Otro objeto de la invención todavía consiste en proporcionar un procedimiento para diagnosticar células y tejidos humanos preneoplásicos y neoplásicos.

La invención proporciona un procedimiento de diagnóstico del cáncer o precáncer en un mamífero mediante detección de un péptido del cáncer o de fragmentos del mismo codificados por una secuencia de ácido nucleico alternativa con marco de lectura de un gen TRP-1 en el que el péptido del cáncer o una porción del mismo es reconocido por los linfocitos T. Una secuencia de ácido nucleico alternativa con marco de lectura abierto procede del gen de TRP-1 o de una variante del mismo.

Todavía otro objeto de la invención consiste en proporcionar un procedimiento para diagnosticar células y tejidos humanos preneoplásicos y neoplásicos. Según la invención, el procedimiento comprende células aislantes, tejidos o extractos de los mismos de un ser humano y que detectan la secuencia alternativa de ADN con marco de lectura abierto, la secuencia de ARN o un fragmento de la misma que codifica un péptido del cáncer o que detectan el péptido del cáncer o los fragmentos del mismo expresados por la secuencia alternativa de ADN con marco de lectura abierto o la secuencia de ARN del gen TRP-1, en el que la detección de/o el aumento de la secuencia alternativa de ADN con marco de lectura abierto, la secuencia de ARN o el producto de expresión es indicador de preneoplasia y
neoplasia.

Todavía otro objeto de la invención consiste en proporcionar un animal transgénico que ha incorporado en su genoma una o más copias de la secuencia de ADN alternativa con marco de lectura abierto del gen TRP-1 que codifica un péptido del cáncer o un fragmento del mismo. Una secuencia ácido nucleico alternativa con marco de lectura procede del gen de TRP-1 o de una variante del mismo. La incorporación de la secuencia de ADN alternativa con marco de lectura abierto produce sobreexpresión o expresión de múltiples formas o variantes del péptido del cáncer. Tales animales transgénicos son útiles para el cribado de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento del
cáncer.

Todavía otro objeto de la invención consiste en proporcionar un animal transgénico que ha incorporado en su genoma una o más copias del antígeno tumoral del mismo de la presente invención. Tales animales transgénicos son útiles para el cribado de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento del cáncer.

La invención abarca asimismo oligonucleótidos con cadena complementaria que direccionan específicamente y se unen a la secuencia ácido nucleico alternativa con marco de lectura abierto del gen TRP-1 e inhiben la expresión del péptido del cáncer o del antígeno tumoral sin afectar desfavorablemente la expresión de la proteína normal del mismo gen.

Todavía otro aspecto de la invención son los anticuerpos monoclonales y policlonales reactivos con el péptido del cáncer y con el epítopo antigénico del cáncer del mismo, incluyendo el péptido del cáncer codificado por un marco de lectura abierto alternativo de este gen TRP-1 para su utilización en las pruebas de diagnóstico y de detección. Los anticuerpos monoclonales y policlonales se pueden proporcionar en forma de un equipo solo, o junto con otros reactivos utilizados frecuentemente en las pruebas de diagnóstico y detección.

Breve descripción de las figuras

Estos y otros objetivos, características y muchas ventajas asociadas de la invención se comprenderán mejor tras una lectura de la siguiente descripción detallada considerada juntamente con los dibujos adjuntos a esta memoria:

Las Fig. 1A y 1B presentan la situación de la secuencia del nucleótido del gp75 que codifica los péptidos antigénicos reconocidos por TIL586.

La Fig. 1A presenta el ADNc completo que comprende el marco de lectura abierto de gp75 de 1584 bp. Los nucleótidos se numeran a partir del codón de iniciación que traduce una proteína constituida por una secuencia principal y la gp75 madura. pADNc776 es una parte del ADNc de gp75 que carece de la zona de codificación de los 246 primeros nucleótidos y se aisló de una biblioteca de ADNc utilizando un análisis basado en la capacidad de TIL586 para estimular la secreción de GM-CSF al transfectar conjuntamente COS-7 junto con el gen HLA-A31. Se preparó una serie de construcciones de deleción y fragmentos de ADN por PCR. pD776A es un derivado de pADNc776 después de la digestión con la enzima de restricción ApaI.

La Fig. 1B presenta la liberación de GM-CSF por TIL586. Se midió la secreción de GM-CSF por TIL586 después de ser cultivado conjuntamente con COS-7 transfectado conjuntamente con fragmentos de ADN mostrados en la Fig. 1A y con el gen de HLA-A31. Las células estimulantes de referencia incluyen 586 mel, 397 mel/A31^{+}, COS-7 solo y COS-7 transfectado bien la HLA-A31 o el ADNc del pADNc776.

La Fig. 2 presenta el nucleótido, la secuencia de aminoácidos y los marcos de lectura abiertos del gen gp75. El nucleótido parcial y las secuencias de aminoácidos de los primeros 157 aminoácidos se presentaron a partir del codón de inicio para la traducción de ORF1 (gp75). El fragmento de ADN que confiere la capacidad para estimular la liberación de GM-CSF de TIL586 está subrayado. Dos supuestos codones de inicio, ATG (254-256) y ATG (294-296), están en negrita y pueden producir la traducción de ORF2 y ORF3, respectivamente. La secuencia del péptido reconocida por TIL586 de ORF3 está en negrita y subrayada.

La Fig. 3A y 3B presenta un péptido antigénico y la traducción de un marco de lectura abierto alternativo.

La Fig. 3A presenta la situación y la longitud de los fragmentos de PCR amplificados por PCR. Se obtuvieron fragmentos de ADN mediante amplificación por PCR y se clonaron a continuación en el vector de expresión pCR3. La sustitución de ATG en las posiciones 294 a 296 por ATC se realizó tal como se describe en Material y procedimientos.

La Fig. 3B presenta la prueba de los fragmentos de ADN y de las construcciones de mutación para estimular la liberación de citosina de TIL586. La prueba de liberación de GM-CSF se realizó como en la Fig. 1.

La Fig. 4A a 4C presenta la caracterización del péptido antigénico reconocido por TIL586.

La Fig. 4A presenta la liberación de GM-CSF por TIL586 restringida por HLA-A31 cuando se incuba conjuntamente con varios estimulantes. Se realizó la transfección y el análisis de citocina como en la Fig. 1A y B. Se incluyeron 586 mel y 397 mel como referencias positiva y negativa para la reactividad de TIL586. Se incubó el péptido ORF3P con 586EBV (A31+) y células T2 (sin A31) a una concentración de 1 \mug/ml durante 90 min. La estimulación de la secrección de GM-CSF por TIL586 aumentó de forma significativa cuando se incubó conjuntamente con células 586EBV autólogas y 1510EBV (A31+) alógenas pulsadas con péptido ORF3P, pero no cuando se incubó conjuntamente con células 586EBV solo o con T2 (sin A31) cargadas con un péptido ORF3P.

La Fig. 4B presenta la lisis citotóxica por TIL586 de las células objetivo. Se utilizaron 586 mel (--\blacksquare--) y 397 mel (--\Box--) como referencias positiva y negativa, respectivamente. Se incubaron linfocitos B de 586EBV con ORF3P (pep) (--\ding{115}--), con un péptido improcedente (ipep) (--\medbullet--) sin péptido (--\Delta--) y células T2 pulsadas con ORF3P (--\medcirc--) como se indica. Después de la incubación, se añadió TIL 586 y se mezcló con las células objetivo. Se midió la actividad citolítica de TIL586 en una prueba de liberación de cromo de 4h.

La Fig. 4C presenta la valoración de la concentración del péptido para sensibilizar las células objetivo para la lisis por TIL586. Se incubaron células 586EBV por separado con diluciones en serie de ORF3P (pep) (--\ding{115}--) o con péptidos improcedentes (ipep) (--\medbullet--) y células T2 con el péptido ORF3P (--\medcirc--) durante 90 min. Se evaluó la actividad citolítica de TIL586 en un ensayo de liberación de ^{51}Cr de 4h en una proporción efector:objetivo (E:T) de 40:1.

Las Figs. 5A y 5B presentan la inhibición de la lisis de las células objetivo marcadas con ^{51}Cr por las células 586EBV no marcadas cargadas con el péptido ORF3P.

La Fig. 5A presenta las células 586 mel marcadas con cromo durante 90 min como un objetivo "caliente". Se utilizaron células EBV586 pulsadas con ORF3P (--\ding{115}--), con péptido improcedente (--\Delta--) y células T2 cargadas con ORF3P (--\Box--) como células objetivo "frías". Después del lavado, se hizó de nuevo un recuento de las células objetivo "calientes" y "frías" y se mezclaron en la proporción "fría"/"caliente" de 1:1, 5:1, 10:1 y 20:1. Se añadió TIL586 en una proporción efector:objetivo "caliente" (E:T) de 20:1. Se midió la liberación de cromo después de 4 h de incubación.

La Fig. 5B presenta la lisis de 624 mel marcada con ^{51}Cr (objetivo "caliente") por TIL1200 que reconoció gp100 no fue inhibibida por las células 586EBV pulsadas con ORF3P (--\ding{115}--) en comparación con las células 586EBV pulsadas con un péptido improcedente (--\Delta--). Las células objetivo "frías" y "calientes" se mezclaron en las proporciones indicadas. Se añadió TIL1200 en una proporción efector:objetivo "caliente" (E:T) de 30:1. Se evaluó la actividad citolítica de TIL1200 en una prueba de liberación de ^{51}Cr de 4h.

Las Figuras 6A a 6D presentan el reconocimiento de los clones de los linfocitos T del péptido antigénico procedentes de la línea celular TIL586. Se generaron clones de linfocitos T procedentes de la línea celular TIL586. Los linfocitos B de 586EBV se pulsaron con el péptido ORF3P o con un péptido improcedente. Se añadió clon del linfocito T o de células TIL586 y se incubaron conjuntamente. Para tumores con 586 mel, 397 mel/A31^{+} y melanocitos NHEM680, se incubaron 1 \times 10^{5} células por pocillo con 1 \times 10^{5} células para clones de linfocitos T, TIL586-C1 (Fig. 6A), TIL586-C4 (Fig. 6B) y TIL586-C6 (Fig. 6C) o TIL586 (Fig. 6D) durante 18 a 24 h, respectivamente. Se realizó el análisis de GM-CSF tal como se describe en la Fig. 1B.

Fig. 7. Reconocimiento de varias células objetivo y del péptido antigénico por clones de CTL procedentes de TIL586. Se generaron clones de linfocitos T por dilución limitada (1 célula por pocillo) de la línea celular TIL586 y se expandieron además en un medio AIM-V conteniendo 6000 IU/ml de IL-2. Se midió la secreción de GM-CSF por el clon 586TIL-C1 de CTL y por el clon 4 después del cultivo conjunto con la línea celular de melanocitos normales (HLA-A31+), con linfocitos B de 586EBV pulsados con el péptido ORF3P o con un péptido improcedente, células 397 mel o 586 mel.

Figs. 11A a 11C. Caracterización del péptido antigénico reconocido por el clon 4 de CTL. Figura 11 (A). Liberación de GM-CSF por linfocitos T a diferentes concentraciones de péptido. Se pulsaron 586EBV (A31+) con el péptido TRP_{197-205} (--\ding{115}--) y se pulsaron linfocitos T2 (sin A31) con el TRP_{197-205} (--\medbullet--) a varias concentraciones de péptido durante 90 min. Se pulsó ORF3P como péptido de referencia en linfocitos B de 586EBV (--\Delta--). Se determinó la liberación de GM-CSF por el clon 4 de CTL después de incubar conjuntamente con linfocitos B de 586EBV pulsados con TRP_{197-205} y ORF3P y linfocitos T2 pulsados con TRP_{197-205}.

Figura 11 (B). Sensibilización de células objetivo para la lisis por el clon 4 de CTL a diferentes concentraciones de péptido. Se incubaron linfocitos B de 586EBV con TRP_{197-205} (--\ding{115}--), un péptido improcedente ORF3P (--\Delta--) y linfocitos T2 pulsados con TRP_{197-205} (--\medbullet--) a varias concentraciones de péptido. Después de la incubación del péptido, se marcaron las células objetivo durante 30 min. Después de los lavados, se midió la actividad citolítica del clon 4 de CTL a una proporción de E:T de 40:1 después de una incubación de 4 h de los linfocitos T con células
objetivo.

Figura 11 (C). Lisis de células objetivo por el clon 4 de CTL a diferentes proporciones de E:T. Se incubaron por separado células 586EBV con TRP_{197-205} (--\ding{115}--), o con péptidos improcedentes ORF3P (--\Delta--) y se incubaron linfocitos T2 objetivo con péptido TRP_{197-205} (--\medbullet--) durante 90 min. Se utilizaron 586 mel (--\Box--) y 397 mel (--\blacksquare--) como referencias positiva y negativa, respectivamente.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención abarca péptidos del cáncer, antígenos tumorales y fragmentos, derivados o variantes de los mismos que son reconocidos inmunológicamente por los linfocitos T del sistema inmunitario. La presente invención abarca además el/los epítopo(s) antigénico(s) del cáncer que están contenidos en los péptidos del cáncer o en el antígeno tumoral. El epítopo antigénico del cáncer produce específicamente una respuesta inmunitaria celular mediada por interación con los linfocitos T del sistema inmunitario. Esta interación entre el epítopo antigénico del cáncer y los linfocitos T da lugar a que los linfocitos T respondan contra, y previene, elimina o reduce en cáncer en los mamíferos, incluyendo el hombre.

En una forma de realización, los péptidos del cáncer y los epítopos antigénicos del cáncer dentro de los péptidos del cáncer de la presente invención se distinguen de las proteínas o péptidos normales en que los péptidos del cáncer son codificados por un marco de lectura abierto alternativo de un gen TRP-1. El péptido del cáncer y sus fragmentos están ausentes de forma característica de o presentes en concentraciones muy bajas de células normales y en concentraciones altas están presentes células precancerosas y cancerosas. La expresión del péptido del cáncer en grandes concentraciones está correlacionada con la transformación de células normales en células precancerosas o
cancerosas.

Los péptidos del cáncer de la presente invención forman parte de, o proceden de, cánceres que incluyen pero no se limitan a melanoma primario o metastásico, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer pulmonar, cáncer de hígado, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias, cáncer de útero, cáncer cervical, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y adenocarcinomas tales como el cáncer de mama, cáncer de próstota, cáncer de ovario, cáncer pancreático y
similares.

El término melanoma incluye, pero no se limita a, melanomas, melanomas metastásicos, melanomas derivados bien de melanocitos o de melanocitos relacionados con nevocitos, melanocarcinomas, melanoepiteliomas, melanosacomas, melanoma in situ, melanoma que se propaga en superficie, melanoma nodular, melanoma de lentigo maligno, melanoma acrolentiginoso, melanoma invasor o lunar atípico familiar y síndrome de melanoma (FAM-M).

De particular interés son los péptidos, fragmentos o derivados del cáncer de los mismos reconocidos por CTL autólogos en pacientes con cáncer, en particular melanoma. De mayor interés son los péptidos, fragmentos o derivados de los mismos del cáncer reconocidos por los CTL restingidos por MHC, en particular los CTL restringidos por MHC de clase I.

El "antígeno tumoral" de la presente invención abarca la proteína del cáncer o del tumor y cualquier fragmento o péptido de la proteína del cáncer o el tumor capaz de producir una respuesta antitumoral en mamíferos.

Tal como se utiliza en la presente memoria el término "péptidos del cáncer" abarca cualquier epítopo o fragmento de proteína del cáncer o del tumor, que actúa como antígeno tumoral.

Tal como se utiliza en la presente memoria el término "fragmento" significa cualquier segmento de una proteína o gen, que tiene por lo menos 5 ó 6 aminoácidos en el caso de un fragmento de proteína y por lo menos 15 a 18 nucleótidos en el caso de un gen.

En una forma de realización, los péptidos del cáncer de la presente invención proceden de la expresión de una secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo de un gen normal. En lugar del producto del gen normal que se expresa, un péptido del cáncer que es capaz de ser reconocido inmunológicamente por linfocitos T se expresa de un modo restringido por MHC. Los linfocitos T restrigidos por MHC son útiles en la identificación del producto génico del marco de lectura abierto alternativo asociado al cáncer y al precáncer.

En una forma de realización, un péptido, fragmento o su derivado del cáncer de la presente invención comprende el epítopo antigénico del cáncer inmunológicamente reconocido por los linfocitos infiltrantes en el tumor (TIL) procedentes de un tumor del cáncer de un mamífero. De particular interés son los epítopos antigénicos del cáncer reconocidos por los linfocitos T citotóxicos específicos del antígeno del cáncer (CD 8^{+}).

En una forma de realización de la presente invención, el péptido del cáncer comprende aproximadamente 24 aminoácidos y se expresa mediante la secuencia de 3 ADN con marco de lectura abierto alternativo del mismo gen que codifica la proteína 1 relacionada con la tirosinasa como se representa en la Figura 2 o de sus homólogos o
variantes.

En una forma de realización, el péptido del cáncer de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos:

MXaaLQRQFLRTQLWDVPSWLERSCL, (SEC ID nº: 7) y fragmentos o derivados de los mismos, en los que Xaa = Ser o Ala. Están abarcados también en el ámbito de la invención los péptidos del cáncer o los fragmentos de los mismos que comparten la homología de secuencia parcial con SEC ID nº: 6. Homología de secuencia parcial de aminoácidos significa un péptido que tiene por lo menos el 85% de la homología de secuencia con SEC ID nº: 6, preferentemente por lo menos el 95% de la homología de secuencia o más y tiene la función biológica de estimular los linfocitos T específicos del antígeno del cáncer.

En una forma de realización de la presente invención, el péptido del cáncer puede estar representado por la fórmula:

Met Xaa Leu Gln Arg Gln Phe Leu Arg (SEC ID nº: 8) y fragmentos y derivados de la misma en la que Xaa = Ser o Ala.

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En otra forma de realización el péptido del cáncer de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos:

MSLQRQFLR (SEC ID nº: 9) y fragmentos y derivados de la misma.

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El antígeno tumoral de la presente invención está presente en concentraciones significativamente más bajas en la mayoría de las células normales que las concentraciones elevadas halladas en las células precancerosas y cancerosas. La expresión elevada del antígeno tumoral se correlaciona con la transformación de las células normales en una célula precancerosa o cancerosa. TRP-2 está situado en el cromosoma 13 humano y se ha demostrado que es un miembro de la familia del gen relacionado con la tirosinasa y comparte una identidad de la secuencia de aminoácidos del 40 al 45% con la tirosinasa y gp75/TRP-1 (Yokoyama et al., (1994); Bouchard, et al., (1994)). TRP-2 codifica una proteína con 519 aminoácidos y se ha demostrado que presenta una actividad de DOPAcromo tautomerasa implicada en la síntesis de melanina (Bouchard et al. (1994)).

La presente invención se refiere a variantes funcionalmente equivalentes de los péptidos del cáncer codificados por un marco de lectura abierto alternativo del gen TRP-1. Las "variantes funcionalmente equivalentes" incluyen los péptidos con homología parcial de secuencia, los péptidos que presentan uno o más cambios de aminoácidos conservadores y/o no conservadores específicos, conjugados de péptidos, proteínas híbridas, proteínas de fusión y ácidos nucleicos de péptidos.

Los péptidos del cáncer, el antígeno tumoral y sus epítopos antigénicos del cáncer se pueden purificar y aislar de sus fuentes naturales, como por ejemplo de sus cepas clínicas primarias, de las líneas celulares y similares. El péptido del cáncer y sus fragmentos son por lo menos del 90% de pureza, preferentemente del 95% de pureza y tan puros como el 100%. Los péptidos del cáncer y sus epítopos antigénicos se pueden obtener también por síntesis química o por técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Las técnicas para la síntesis química se describen en J.M. Steward y J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1969; M. Bodansky et al. "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, segunda edición, 1976 y J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", vol. 2, pág. 46, Academic Press, Nueva York, 1983 y E. Schroder y K. Kubke, "The Peptides", vol. 1, Academic Press, Nueva York, 1965.

Los péptidos del cáncer y sus epítopos antigénicos del cáncer se pueden formular con excipientes farmacéuticamente aceptables en composiciones farmacéuticas por los procedimientos conocidos en la técnica. La composición es útil como vacuna para prevenir o tratar el cáncer. La composición puede comprender además por lo menos una molécula inmunoestimulante. Las moléculas inmunoestimulantes que se han de utilizar junto con el péptido del cáncer o su fragmento para estimular las respuestas de los linfocitos T específicos del antígeno estimulante incluyen pero no se limitan a uno o más moléculas del complejo de histocompatibilidad principal (MHC), tales como las moléculas de clase I y clase II, preferentemente una molécula de clase I. La composición puede comprender además otras moléculas estimulantes incluyendo B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-3, CD72 y similares y citocinas que incluyen pero no se limitan a IL-1 a IL-15, TNF\alpha, IFN\gamma, RANTES, G-CSF, M-CSF, IFN\alpha, CTAP III, ENA-78, GRO, I-309, PF-4, IP-10, LD-78, MGSA, MIP-1\alpha, MIP-1\beta o sus combinaciones y similares para inmunopotenciación.

La molécula estimulante se puede suministrar como una entidad físicamente independiente o se puede suministrar en la membrana de un antígeno que se presenta en células tales como linfocitos B, macrófagos o células dendríticas, en la membrana de un liposoma o se expresan en la superficie de una célula transducida o transfectada. Las secuencias de ADN de las moléculas inmunoestimulantes de MHC están disponibles en GenBank y similares.

Los péptidos del cáncer, antígenos tumorales y sus epítopos antigénicos del cáncer son útiles en los procedimientos de prevención o tratamiento del cáncer y son útiles en el análisis del diagnóstico para detectar el cáncer o el precáncer en un mamífero, incluyendo el hombre. Los péptidos del cáncer o sus fragmentos pueden estar en forma de derivados a los que se unen otros constituyentes tales como radiomarcadores, biotina y fluoresceína. También se puede unir a los péptidos del cáncer o a sus fragmentos un agente de direccionamiento al antígeno tumoral, permitiendo el direccionamiento específico a un órgano, tumor o a tipos celulares específicos. Dichos agentes de direccionamiento pueden ser hormonas, citocinas, receptores celulares y similares. El péptido del cáncer, antígeno tumoral y sus fragmentos se pueden preparar en forma de botiquín, solo en combinación con otros reactivos.

Otro aspecto de la invención es una vacuna útil para producir inmunidad mediada por células específicas del tumor contra el cáncer.

Los planteamientos para la inmunoterapia del cáncer se pueden dividir en categorias activas o pasivas. La inmunoterapia activa implica la inmunización directa de los pacientes de cáncer con antígenos del cáncer en un intento de reforzar las respuestas inmunitarias contra el tumor. La inmunoterapia pasiva se refiere a la administración de reactivos inmunitarios, tales como células o anticuerpos inmunes con reactividad antitumoral con objeto de mediar directamente en las respuestas antitumorales.

La mayoría de los intentos anteriores en la inmunoterapia activa utilizó células cancerosas íntegras o extractos de células cancerosas con la expectativa de que estos materiales contuvieran antígenos tumorales en cantidad y forma capaces de estimular respuestas inmunitarias. La identificación molecular de los antígenos del cáncer ha abierto, sin embargo, nuevas posibilidades de desarrollo de inmunoterapias para el tratamiento del cáncer humano. Un resumen de algunas de estos planteamientos se presenta en la Tabla 1.

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TABLA 1 Terapias para el cáncer basadas en la identificación molecular de antígenos del cáncer

1.: Inmunoterapia activa con:

a.: Péptidos inmunodominantes

1): solos

2): combinados con adyuvantes

3): unidos a péptidos, lípidos o liposomas cooperadores

4): pulsados en antígenos presentes en células

b.: Péptidos inmunodominantes con sustituciones de aminoácidos para aumentar la unión a moléculas MHC

c.: Proteínas solas o combinadas con adyuvantes

d.: ADN "desnudo" que codifica antígenos del cáncer

1): "cañón génico" para inyección intradérmica

2): inyección intramuscular

3): unido a lípidos

e.: Virus recombinantes tales como vacunas, viruela aviar o adenovirus que codifican

1): antígenos del cáncer solos

2): antígenos del cáncer más genes que codifican citicinas, moléculas coestimulantes u otros genes para potenciar la respuesta inmunitaria

f.: Bacterias recombinantes tales como BCG, Salmonella o Listeria que codifican antígenos del cáncer solos o en combinación con moléculas inmunoestimulantes

2.: Inmunoterapia activa (anterior) seguida de administración de citocinas inmunoestimulantes

1.: IL-2

2.: IL-6

3.: IL-10

4.: IL-12

5.: IL-15 y similares.

3.: Inmunoterapia pasiva con linfocitos antitumorales producidos por sensibilización in vitro de TIL o PBL para

1.: péptidos inmunodominantes pulsados en antígenos presentes en células (producen células CD8)

2.: proteínas antigénicas incubadas conjuntamente con antígenos presentes en células (antígeno exógeno presente en el paso para producir células CD4).

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La inserción del gen que codifica antígenos del cáncer en sistemas de expresión de gran eficacia tales como E. coli, levaduras o baculovirus y similares proporciona la oportunidad de obtener grandes cantidades de antígeno tumoral purificado para su utilización en inmunización. Como alternativa, los péptidos inmunodominantes de estos antígenos tumorales podrían ser sintetizados in vitro fácilmente y purificados en grandes cantidades para la inmunización sola o en una forma deseada para mejorar su inmunogenicidad, tal como en combinación con un adyuvante, unión a lípidos/liposomas o péptidos colaboradores, o pulsados en antígenos presentes en células. La modificación de aminoácidos individuales de los péptidos inmunodominantes para mejorar la eficiencia de la unión a antígenos de MHC puede aumentar potencialmente la inmunogenicidad en comparación con el péptido natural.

Técnicas recientes que utilizan ADN "desnudo" inyectado directamente en el músculo o en la piel han demostrado dar lugar tanto a reacciones inmunitarias celulares como humorales con antígenos codificados (Cooney, E.L., A.C. Collier, P.D. Greenberg, R.W. Coombs, J. Zarling, D.E. Arditti, M.C. Hoffman, S.L. Hu y L. Correy, 1991, Lancet 337:567; Wolff, J.A., R.W. Malone, P. Williams, W. Chong, G. Acsadi, A. Jani, y P. L. Felgner, 1990, Science 247:1465; Davis, H.L., R.G. Whalen, y B.A. Demeniex, 1993, Hum. Gene Ther. 4:151; Yang, N.S., J. Burkholder, B. Roberts, B. Martinelli y D. McCabe. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9568; Williams, R.S., S.A. Johnston, M. Riedy, M.J. DeVit, S.G. McElligott y J.C. Sanford, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726; fynan, E.R., Webster, D.H. Fuller, J.R. Haynes, J.C. Santoro y H.L. Robinson, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478; Eisenbraum, M.D., D.H. Fuller y J.R. Haynes, 1993, DNA and Cell Bio. 12:791; Fuller, D.H. y J.R. Haynes, 1994, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10(11):1433; Acsadi, G., G. Dickson, D.R. Love, A. Jani, F.S. Walsh, A. Gurusinghe, J.A. Wolff y K.E. Davies, 1991, Nature 352:815). Las técnicas que utilizan vectores de ADN presentan la ventaja de su facilidad de preparación y seguridad de administración. La secuencia alternativa de ácido nucleico de la presente invención es útil como inmunógeno y como vacuna de ADN contra el cáncer. La secuencia de ácido nucleico con marco de lectura abierto alternativo de la presente invención de TRP-1 o péptidos de la presente invención se puede administrar utilizando un cañón génico en cantidades que producen una respuesta celular contra una célula cancerosa. Cantidades en nanogramos sirven para tales propósitos.

Una forma eficaz de inmunización implica la incorporación de genes que codifican moléculas inmunógenas en bacterias recombinantes tales como BCG, Salmonella o Listeria o en virus recombinantes tales como vacunas, viruela aviar o adenovirus y similares. Los genes que codifican antígenos del cáncer pueden expresarse solos o en combinación con genes que codifican moléculas inmunoestimulantes u otros genes que pueden potenciar la respuesta inmunitaria tras la infección. Estudios con un modelo de antígenos tumorales en modelos murinos han demostrado que la incorporación del gen para interleucina-2 (IL-2) o B7.1 puede aumentar la inmunogenicidad del modelo de antígenos tumorales e incluso mediar la remisión de metástasis pulmonares probadas que producen estos antígenos. La inmunoterapia activa seguida de la administración exógena de citocinas inmunoestimulantes tales como IL-2, IL-6, IL-10,IL-12 o IL-15 puede también utilizarse para mejorar las respuestas inmunitarias.

La inmunoterapia pasiva con células inmunes modificadas genéticamente (denominada generalmente inmunoterapia adoptiva) capaz de reconocer antígenos tumorales humanos es eficaz en la mediación de la remisión del cáncer en pacientes seleccionados con melanoma metastásico. Se han desarrollado técnicas in vitro en las que los linfocitos humanos se sensibilizan in vitro en péptidos inmunodominantes de antígeno tumoral presentados en antígenos presentes en células. Mediante estimulación repititiva in vitro se pueden obtener células con una capacidad mucho mayor para reconocer antígenos tumorales humanos que los TIL que se utilizaron para clonar los genes que codifican estos antígenos. De este modo por sensibilización repetida in vitro con péptidos del cáncer, se podrían obtener linfocitos con 50 a 100 veces más potencia que TIL. La transferencia adoptiva de estas células puede ser más eficaz para mediar la remisión del tumor in vivo que los TIL desarrollados convencionalmente.

En los procedimientos para prevenir o inhibir el cáncer, se pueden administrar péptidos del cáncer o sus fragmentos mediante una de las diversas vías que incluyen pero no se limitan a la intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intratecal, intrapleural, intrauterina, rectal, vaginal, tópica, intratumoral y similares.

La administración puede ser por medios transmucósicos o transdérmicos. Para la administración transmucósica o transdérmica, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para permear la barrera. Dichos penetrantes son conocidos generalmente en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucósica sales biliares y derivados del ácido fusídico. Además, se pueden utilizar detergentes para facilitar la permeación. La administración transmucósica puede realizarse mediante, por ejemplo, atomizadores nasales o supositorios. Para la administración oral, el péptido del cáncer, el antígeno tumoral, sus fragmentos o variantes se formulan en formas para administración oral convencional tales como cápsulas, comprimidos y tóxicos.

En general, es deseable proporcionar al receptor una dosis de péptido del cáncer o de un fragmento del mismo de por lo menos aproximadamente 1 pg por Kg de peso corporal, preferentemente de por lo menos aproximadamente 1 ng por Kg de peso corporal, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 1 \mug o más por Kg de peso corporal del receptor. Se prefiere un intervalo comprendido aproximadamente entre 1 ng por Kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg por Kg de peso corporal aunque se puede administrar una dosis menor o mayor. La dosis es eficaz para cebar, estimular y/o producir la expansión clonal de linfocitos T específicos del antígeno del cáncer, preferentemente linfocitos T citotóxicos, que a su vez son capaces de prevenir o inhibir el cáncer en el
receptor.

La dosis se administra por lo menos una vez y se puede proporcionar en forma de embolada en administración continua. Puede ser preferible la administración múltiple de la dosis durante un periodo de varias semanas a meses. Se pueden administrar dosis posteriores como se indica.

En un procedimiento de tratamiento, se administra una vacuna que comprende el péptido del cáncer o un fragmento del mismo a un mamífero en una cantidad eficaz para prevenir el cáncer en mamíferos. Es de particular interés una vacuna que comprende el péptido del cáncer o un fragmento del mismo codificado por ORF3 del gen TRP-1 para la prevención del melanoma.

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En un procedimiento de reducción de la masa tumoral en animales con tumores el procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de un epítopo antigénico del cáncer en un punto de la masa tumoral, dicha cantidad es eficaz para reducir el tamaño del tumor en el punto.

En otro procedimiento de tratamiento, se pueden obtener linfocitos citotóxicos autólogos o linfocitos de infiltración en el tumor de un paciente con cáncer. Los linfocitos se desarrollan en cultivos y los linfocitos específicos antígenos del cáncer se extienden por cultivo en presencia de péptido del cáncer específicos o epítopo antigénicos del cáncer solos o en combinación por lo menos con una molécula inmunoestimulante con citocinas. Los linfocitos específicos del antígeno se vuelven a infundir a continuación en el paciente en una cantidad eficaz para reducir o eliminar los tumores en el paciente.

Después de la inmunización se puede evaluar la eficacia de la vacuna mediante la producción de células inmunes que reconocen el antígeno del cáncer, según se evalúa por actividad lítica específica, producción de citocina específica, remisión del tumor o una combinación de éstos. Si el mamífero que se ha de inmunizar está ya afectado por el cáncer o por metástasis de cáncer se puede administrar la vacuna conjuntamente con otros tratamientos terapéuticos tales como con inmunodilatadores, por ejemplo, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, interferón, factor de necrosis tumoral y similares, fármacos quimioterapéuticostsc cisplatino, antivíricos tales como ganciclovir, anfotericina B, antibióticos y similares.

Otro aspecto de la invención es una secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo de un gen TRP-1 en la que la secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo codifica péptidos del cáncer y sus fragmentos que reconocen inmunológicamente los linfocitos T del sistema inmunitario.

La secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo incluye las secuencias de ADN del gen TRP-1.

Son de interés las secuencias de ADN con marco de lectura abierto alternativo de un gen melanógeno. Los genes melanógenos incluyen los genes codificadores de gp 75 (TRP-1).

Una forma de realización de la invención es una secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo o un fragmento de la misma que codifica un péptido del cáncer procedente del interior de la secuencia del gen que codifica la proteína relacionada con la tirosinasa. Se ha descrito la secuencia génica para TRP1 mediante el banco de datos de EMBL bajo el número de registro X51455 tal como describe Vijayasaradhi, S. et al. (1990, J. Exp. Med. 171:1375-80) y el número de registro de EMBL X51420 tal como describe Cohen, T. et al. 1990 Nucleic Acids Research, vol. 18:2807.

En una forma de realización, la secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo comprende ORF3 representado en la Figura 2 con la SEC ID nº: 5, los fragmentos de la misma y su variante de la secuencia funcionalmente equivalente que codifica un péptido del cáncer o los fragmentos del mismo reconocidos por linfocitos T específicos del antígeno del cáncer que incluyen los linfocitos de infiltración en el tumor. Asimismo están comprendidos en la presente invención las secuencias de ácido nucleico complementarias, así como anticomplementarias a ORF3 representadas en la Fig. 2.

En otra forma de realización, la secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo comprende:

ATGTCACTGCAACGGCAATTTCTCAGG

(SEC ID nº: 10).

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La secuencia génica para TRP-2 ha sido descrita mediante el banco de genes en el número de registro D17547 como describe Yokoyama et al. (1994) y el número de registro S69231 del banco de genes como describe Bouchard et al. (1994).

Debido a la degeneración en el código genético, variaciones en la secuencia del ADN producirán la traducción de un péptido del cáncer equivalente. Como resultado, las sustituciones están incluidas en el ámbito de la invención mientras la sustitución produce la expresión de un péptido del cáncer que reconocen los linfocitos T restringidos por MHC del antígeno del cáncer. Una sustitución comprendida en la presente invención es la sustitución de Ser codificada por TCA por Ala codificada por GCT, GCC, GCA o GCG. Los homólogos de otras especies de mamíferos están incluidos dentro del ámbito de la invención.

Toda o parte de la secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo como por ejemplo desde el gen TRP-1 y similares se pueden utilizar como sondas para identificar y aislar los homólogos del péptido del cáncer en otra especie de mamífero.

En una forma de realización, se utiliza una secuencia de ADNc murino para cribar un banco de ADNc de mamífero para una secuencia de ácido nucleico homólogo humano. Se seleccionan y secuencian los clones positivos. Ejemplos de fuentes de tejido a partir de los que se puede sintetizar el banco de ADNc incluyen, pero no se limitan a, la dermis, epidermis, tumores sólidos, melanomas, melanocitos y similares. Un experto en la técnica comprenderá las condiciones de hibridación apropiadas que se deben utilizar para detectar los homólogos. Los procedimientos convencionales para la construcción de bancos de hibridación de ácido nucleico y las técnicas de clonación se describen en Sambrook et al., (eds) (1989) en "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Press, Plainview, Nueva York y Ausubel et al. (eds) en "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley and Sons, Nueva York, Nueva York.

Otro aspecto de la invención son las sondas de ácido nucleico para la detección y cuantificación del ARN que transcribe los péptidos del cáncer tales como los codificados por un marco de lectura abierto alternativo del gen TRP-1 en muestras biológicas aisladas de un mamífero con cáncer. Las alteraciones en la concentración de ARN en comparación con una muestra de ARN de referencia son útiles en el diagnóstico y en el pronóstico de la enfermedad en el mamífero.

En una forma de realización, el ARNm procede del tejido de un paciente que se sospecha que padece cáncer o precáncer y se compara con el ARNm procedente de un individuo sano de referencia. Un aumento cuantitativo y/o cualitativo del ARNm con marco de lectura abierto alternativo del gen TRP-1 que codifica un péptido del cáncer en el paciente, en comparación con la referencia, es indicador de cáncer o precáncer en el paciente. Se puede detectar el ARNm utilizando sondas de oligonucleótido hibridables con el ARNm. En una forma de realización la sonda es hibridable con el producto de transcripción de ORF3 de TRP-1.

Las alteraciones en la concentración de ARN en comparación con una muestra de ARN de referencia son útiles en el diagnóstico y en el pronóstico de la enfermedad en el mamífero.

El ARNm puede ser detectado utilizando sondas oligonucleótidas.

Se pueden utilizar combinaciones de oligonucleótidos basadas en la secuencia de codificación del péptido o de fragmentos del mismo como cebadores de PCR para detectar ARNm en muestras biológicas utilizando el procedimiento de reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) para amplificar las secuencias de ARN seleccionadas. La presente invención abarca también la PCR in situ y la RT-PCR in situ para la detección de ADN y ARN que codifican péptidos del cáncer o fragmentos de los mismos. Se prefiere la técnica cuando el número de copias de un ácido nucleico objetivo es muy bajo o cuando se pueden distinguir diferentes formas de ácido nucleico. El procedimiento es especialmente útil en la detección y diferenciación de células precancerosas y cancerosas de las células normales.

La presente invención incluye un procedimiento de identificación de un epítopo antigénico del cáncer reactivo con los linfocitos T específicos del antígeno que comprenden la generación de fragmentos de deleción de ácido nucleico de un gen. Los fragmentos de deleción se sitúan en un vector apropiado que a su vez se transfieren o transducen a la célula huésped para la expresión del producto del ácido nucleico. Opcionalmente, la célula huésped puede expresar también una molécula inmunoestimulante. Las respuestas del linfocito T específico del antígeno del cáncer se determinan en presencia de la célula huésped que expresa el producto de deleción.

En el caso en que la célula huésped exprese solamente el producto de delección, un antígeno presente en la célula, tal como un linfocito B, macrófago, dendrocitos y similares, puede proporcionar una molécula inmunoestimulante o mediante una célula transfectada con una molécula estimulante. En una forma de realización, la molécula inmunoestimulante es una molécula MHC de clase I.

Mediante la cartografía que utiliza este enfoque, se determina la secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo que codifica el péptido del cáncer o el epítopo antigénico del cáncer.

Un procedimiento alternativo de identificación del antígeno del cáncer y del epítopo antigénico del cáncer consiste en la generación de péptidos sintéticos, antígenos pulsantes presentes en células con los péptidos sintéticos y en añadir el antígeno pulsado con el péptido presente en las células con linfocitos T específicos del antígeno y midiendo la respuesta específica del antígeno de los linfocitos T en presencia del antígeno pulsado con el péptido presente en las células. Los péptidos sintéticos que se producen en las respuestas de los linfocitos T específicos del antígeno contienen el epítopo antigénico del cáncer de la presente invención.

La presente invención comprende asimismo el vector que comprende la secuencia de ADN del marco de lectura abierto alternativo que codifica los péptidos del cáncer o el epítopo del cáncer antigénico. Opcionalmente el vector puede comprender asimismo una secuencia de ADN que codifica por lo menos una molécula inmunoestimulante. En una forma de realización el vector comprende ORF-3 del gen TRP-1.

Los vectores de expresión eucarióticos comprenden, pero no se limitan a, vectores retrovíricos, vectores virales de vacunas, vectores de adenovirus, vectores del virus del herpes, vectores del virus de la viruela aviar, vectores de baculovirus, vectores de virus del papiloma humano, vectores de la encefalitis equina, vectores del virus de la gripe y similares.

La presente invención abarca nuevos virus recombinantes que expresan un péptido del cáncer o un fragmento del mismo codificado por una secuencia de ácido nucleico con marco de lectura abierto alternativo de un gen TRP-1. El virus recombinante puede expresar también por lo menos una molécula inmunoestimulante. El virus recombinante es capaz de producir o sobrerregular una respuesta inmunitaria mediada por la célula en un mamífero con objeto de prevenir o tratar el cáncer en el mamífero, particularmente en el hombre.

El virus recombinante ha incorporado en su genoma o en un fragmento del mismo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido del cáncer, un fragmento del mismo o un epítopo antigénico del cáncer, solo o en combinación con uno o más genes que codifican una molécula inmunoestimulante. En una forma de realización, el virus recombinante ha incorporado en su genoma una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido del cáncer codificado por un marco de lectura abierto alternativo de TRP-1 o de un fragmento del mismo. Una célula huésped infectada con el virus recombinante expresa el péptido del cáncer, un fragmento del mismo o un epítopo antigénico del cáncer, solo o en combinación por lo menos con una molécula inmunoestimulante.

Los procedimientos para construir y expresar productos génicos exógenos de vectores de virus de vacunas recombinantes están descritos por Perkus et al., Science 229:981-984, 1985, Kaufman et al., Int. J. Cancer 48:900-907, 1991, Moss Science 252:1662, 1991, Smith y Moss BioTechniques Nov/Dic, págs. 306-312, 1984, y la patente U.S. nº 4.738.846. Sutter y Moss (Proc Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 89:10847-10851, 1992) y Sutter et al. (Virology 1994) describen la construcción y utilización como vector del virus de Ankara recombinante no replicante (MVA, vacuna Ankara modificada) que se puede utilizar como vector vírico en la presente invención. Baxby y Paoletti (Vaccine 10:8-9, 1992) describen la construcción y utilización como vector de un virus de viruela no replicante, incluyendo el virus de la viruela del canario, el virus de viruela aviar y de otras especies de aves para su utilización como vector vírico en la presente invención.

Los vectores de la presente invención pueden estar situados en una célula huésped apropiada para la expresión de un péptido del cáncer o de un epítopo antigénico del cáncer. Las líneas celulares del huésped eucariótico incluyen, pero no se limitan a las células COS, células CHO, células Hela, células NIH/3T3, células de insecto, antígenos presentes en células tales como los dendrocitos y similares. Opcionalmente la célula huésped puede expresar también una molécula estimulante. En el caso en que estas células huésped expresen tanto el péptido del cáncer como el epítopo antigénico del cáncer en combinación, por lo menos, con una molécula de MHC, es preferible que se pueda utilizar un sistema de expresión eucariótico para permitir la propia glucosilación. La expresión tanto del antígeno del cáncer como de la molécula inmunoestimulante por la célula huésped proporciona el péptido restringido por MHC necesario a los linfocitos T específicos y la señal apropiada a los linfocitos T para ayudar al reconocimiento del antígeno y a la proliferación o expansión clónica de los linfocitos T específicos del antígeno. El resultado global es una hiperregulación del sistema inmunitario. La hiperregulación de la respuesta inmunitaria se manifiesta por un aumento de los linfocitos citotóxicos específicos que son capaces de destruir o inhibir el crecimiento de las células cancerosas o precancerosas.

El ADN se puede insertar en la célula huésped por transfección, transducción, liposomas y similares por los procedimientos conocidos en la técnica. (Sambrook et al., (1989), en "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Press, Plainview, Nueva York). Como liposomas, se prefieren los lípidos catiónicos, por ejemplo, el lípido policatiónico, dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil amonio (DMRIE) acomplejado con el fosfolípido neutro dioleil fosfatidil-etanolamina (DOPE) tal como expuso Nabel E.G. et al., 1992, Hum. Gene. Ther. 3:367-275; Nabel G.J. et al., 1992, Hum. Gene. Ther. 3:649-656; Stewart M.J. et al., 1992 Hum. Gene. Ther. 3:399-410; Nabel G.J. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11307-11311; y Harrison, G.S. et al., 1995, BioTechniques 19:816-823.

La proteína recombinante del cáncer, el antígeno tumoral o el epítopo antigénico del cáncer expresados por las células huésped se pueden purificar de los lisados celulares o de los sobrenadantes celulares por los procedimientos habituales de purificación de proteínas conocidos en la técnica. Éstos incluyen, pero no están limitados a cromatografía en tamices moleculares, cromatografía de intercambio iónico, enfocado isoeléctrico, electroforesis en gel, cromatografía por afinidad, HPLC, HPLC en fase inversa y similares. (Ausubel et al., 1987, en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nueva York, NY). Se puede utilizar también la cromatografía de inmunoafinidad para la purificación utilizando, como agente de inmunoafinidad, anticuerpos de proteína anticancerosa o fragmentos de fijación al antígeno de los mismos tal como se describe en la presente memoria.

Se puede utilizar asimismo el virus recombinante como terapéutico o vacuna. En dichas utilizaciones es deseable proporcionar al receptor una dosis de virus recombinante en el intervalo comprendido entre aproximadamente 10^{5} y aproximadamente 10^{10} unidades formadoras de placa/mg de mamífero, aunque se puede administrar una dosis inferior o superior.

El vector vírico recombinante se puede introducir en un mamífero bien antes de cualquier prueba de cáncer tal como melanoma o para mediar la remisión de la enfermedad en un mamífero afectado por un cáncer tal como melanoma. Ejemplos de procedimientos para administrar el vector vírico en mamíferos incluyen, pero no están limitados a, la exposición de las células al virus recombinante ex vivo, o inyección del virus recombinante en el tejido afectado o la administración intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular y similares del virus. Por otra parte, el vector vírico recombinante o la combinación de vectores víricos recombinantes se puede administrar localmente por inyección directa en la lesión cancerosa o por aplicación tópica en un excipiente adecuado farmacéuticamente aceptable. La cantidad de vector vírico recombinante, que lleva la secuencia de ácido nucleico en cuestión se basa en el valor de partículas de virus. Un intervalo preferido para inmunización está comprendido entre aproximadamente 10^{5} y 10^{10} partículas de virus por mamífero, preferentemente el hombre.

El epítopo de antígeno del cáncer de la presente invención que está implicado en el rechazo del tumor no está limitado a lo expuesto específicamente en la presente memoria. Utilizando los procedimientos expuestos en la presente invención se pueden identificar otros epítopos de antígeno del cáncer contenidos en productos con marco de lectura abierto alternativo a partir de otros antígenos asociados al tumor (Van der Bruggen, P. et al., 1991 Science 254:1643-47; Gaugler, B. et al., 1994, J. Exp. Med. 179:921-30; Boel, P. et al. 1995 Immunity. 2:167-75; Brichard, V. et al. 1993, J. Exp. Med. 178:489-95; Robbins, P.F. et al., 1994, Cancer Research 54:3124-26; Kawakami, Y. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3515-19; Coulie, P.G. et al. 1994, J. Exp. Med. 180:35-42; Bakker, A. et al., 1994, J. Exp. Med. 179:1005-09) tales como de MART-1/Melan A (Kawakami et al., J. Exp. Med. 180:347-352, 1994), MAGE-3 (Gaugler et al., J. Exp. Med. 179:921-930, 1994), gp 100 (Kawakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:6458-6462, 1994), tirosinasa (Brichard et al., J. Exp. Med. 178:489, 1993), TRP-2, CEA, CA-19-A, CA-125, PSA, erb-2 (Boon et al., Ann. Rev. Immunol. 12:337, 1994).

Los linfocitos infiltrantes en el tumor (TIL) procedentes de pacientes que padecen de tumor reconocen los antígenos asociados al tumor presentados por las moléculas de clase I (MHC) del complejo de histocompatibilidad principal. La infusión de TIL586 junto con interleucina-2 (IL-2) en el paciente autólogo con melanoma metastásico produjo la remisión objetiva del tumor. Se aisló recientemente un gen que codifica un antígeno tumoral reconocido por TIL586 y demostró que codificaba gp75. La presente invención es la identificación y aislamiento de un péptido antigénico, MSLQRGFLR (SEC ID nº: 9), reconocido por TIL586, que no procede de la proteína gp75 normal. En lugar de este péptido nonámero producido a partir de la traducción de un marco de lectura abierto alternativo o del mismo gen. De este modo, el gen gp75 codifica dos polipéptidos completamente diferentes, gp75 como antígeno reconocido por los anticuerpos de IgG en el suero de un paciente con cáncer y un producto de 24 aminoácidos como antígeno de rechazo tumoral reconocido por los linfocitos T. Esto representa la primera demostración de que el antígeno humano de rechazo tumoral se puede generar a partir de un gen celular normal utilizando otro marco de lectura abierto aparte del utilizado para codificar la proteína normal. Este descubrimiento dio a conocer un nuevo mecanismo para generar antígenos tumorales, que pueden ser útiles como vacunas para producir inmunidad contra el cáncer mediada por las células específicas del tumor.

El procedimiento de análisis por deleción de ExoIII/S1 localizó el epítopo en un pequeño fragmento de ADN del gen gp 75. El epítopo del cáncer estaba ausente en la proteína gp75 normal. El péptido del cáncer de la presente invención reconocido por TIL586 procedía del producto génico traducido procedente de un marco de lectura abierto alternativo del mismo gen que codifica la proteína gp 75 normal. La sustitución de ATG por ATC en los nucleótidos 294 a 296 produjo una pérdida completa de la capacidad para estimular la liberación de citocina procedente de TIL586. Los experimentos de inhibición del objetivo frío indicaron que el epítopo del cáncer identificado era capaz de competir por el reconocimiento de linfocitos T con un péptido procesado de forma natural presente en las células tumorales. Seis clones de linfocitos T generados a partir de la línea celular de TIL586 fueron capaces de reconocer las células tumorales 586 mel, los linfocitos B 586EBV pulsados con este péptido y los melanocitos normales en un modo restringido por HLA-A31, sugiriendo también que el producto génico codificado por el marco de lectura abierto alternativo puede estar presente en las células tumorales así como en los melanocitos normales.

La invención proporciona un animal transgénico que ha incorporado en su genoma una o más copias de la secuencia de ADN con marco de lectura abierto alternativo que codifica un péptido del cáncer o un fragmento del mismo. El procedimiento general de producción de animales transgénicos se describe en Krimpenfort et al., patente U.S. nº 5.175.384, Leder et al., patente U.S. nº 5.175.383, Wagner et al., patente U.S. nº 5.175.385, Evans et al., patente U.S. nº 4.870.009 y Berns patente U.S. nº 5.174.986. La incorporación del gen produce sobreexpresión, expresión alterada o expresión de formas múltiples o variantes de los péptidos del cáncer. El animal transgénico resultante es útil en los estudios de desarrollo del cáncer o del antígeno tumoral de la presente invención. El modelo animal es útil en la identificación de vacunas y fármacos quimioterapéuticos para el tratamiento del cáncer. El animal transgénico es también útil en estudios de desarrollo del cáncer.

Esta invención comprende además un anticuerpo o a un fragmento de fijación al antígeno del mismo, producido por inmunización del péptido del cáncer o del epítopo antigénico del cáncer de la presente invención. En el caso en que el péptido del cáncer o el epítopo del cáncer antigénico esté compuesto por sólo unos pocos aminoácidos, el péptido del cáncer o del epítopo antigénico del cáncer se pueden conjugar con una proteína transportadora para producir una respuesta del anticuerpo. Las proteínas transportadoras tales como KLH, el toxoide antitetánico y similares y los procedimientos de conjugación son conocidos en la técnica. El anticuerpo presenta especificidad para, y reacciona y se une con el péptido del cáncer y con el epítopo antigénico del cáncer de la presente invención.

Ejemplos de moléculas de anticuerpo son las moléculas de inmunoglobulina íntegras, fundamentalmente las moléculas de inmunoglobulina íntegras o aquellos fragmentos de inmunoglobulina que contengan la zona de fijación al antígeno incluyendo aquellas porciones de moléculas de inmunoglobulina conocidas en la técnica como F (ab), F (ab'), F (ab')_{2}, anticuerpo híbrido humanizado y F (v). Se pueden producir anticuerpos policlonales o monoclonales por los procedimientos conocidos en la técnica. (Kohler y Milstein (1975) Nature 256, 495-497; Campbell "Monoclonal Antibody Technology, the Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" en Burdon et al. (eds.) (1985) "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", vol. 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam). Se pueden producir también anticuerpos o los fragmentos de fijación al antígeno por ingeniería genética. La tecnología para la expresión tanto de los genes de cadena ligera como pesada es el asunto de las solicitudes de patente PCT: publicación nº WO 901443, nº WO 9014424, Hus et al. (1989) Science 246:1275-1281 y la patente U.S. nº 4.946.778.

En una forma de realización, se utilizan anticuerpos de la invención en inmunoanálisis para detectar péptidos del cáncer incluyendo los péptidos codificados por un marco de lectura alternativo de TRP-1 o los fragmentos de los mismos en muestras biológicas. Los anticuerpos o los los fragmentos de fijación al antígeno de los mismos se pueden utilizar para detectar péptidos del cáncer en muestras de biopsia de tejidos de un mamífero afectado por el cáncer. La evaluación del antígeno del cáncer en un tejido enfermo se puede utilizar para pronosticar la evolución de la enfermedad en un mamífero o se puede diagnosticar la eficacia del tratamiento. El inmunoanálisis puede ser radioinmunoanálisis, análisis de transferencia de Western, análisis de inmunofluorescencia, inmunoanálisis de enzimas, análisis de quimioluminiscencia, análisis inmunohistoquímico y similares y se puede realizar in vitro, in vivo o in situ. Las técnicas estándar conocidas en la técnica para ELISA se describen en "Methods in Immunodiagnosis", 2ª edición, Rose and Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980; Campbell et al. "Methods and Immunology", W.A. Benjamin, Inc., 1964; y Oellerich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22:895-904. Los procedimientos convencionales para inmunohistoquímica están descritos en Harlow and Lane (ed.) (1988) en "Antibodies A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Ausbel et al. (eds.) (1987) en Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons (Nueva York, NY). Las muestras biológicas apropiadas para dicho análisis de detección incluyen pero no se limitan a células, biopsia de tejidos, sangre completa, plasma, suero, esputos, fluido cerebroespinal, fluido pleural, orina y similares.

Se pueden utilizar también en inmunología los anticuerpos o los fragmentos de fijación al antígeno de la presente invención. Los anticuerpos o los fragmentos de fijación al antígeno de los mismos se suministran a un animal en una cantidad suficiente para impedir, disminuir o atenuar la gravedad, extensión o duración del cáncer. Toda referencia a TRP2 en los ejemplos siguientes se proporciona únicamente a título ilustrativo.

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Ejemplo 1 Materiales y procedimientos Productos químicos y reactivos

Los siguientes productos químicos y reactivos se adquirieron a los proveedores indicados: RPMI 1640, medio AIM-V, Lipofectamina, G418 (GIBCO BRL, Gaithersberg, MD); vector de expresión eucariótica pCR3 (Invitrogen, San Diego, CA); anticuerpo monoclonal anti-HLA-A31 (One lambda, Canoga Park, CA); anticuerpo de anti-inmunoglobulina M conjugado con isotiocianato de fluoresceína (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA).

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Linfocitos T citotóxicos (CTL) y líneas celulares

Se aislaron TIL586 de una muestra del tumor de un paciente con melanoma metastásico y se cultivaron en un medio conteniendo IL-2 (6000 IU/ml) (Chiron) durante 32 a 60 días como se describió anteriormente (Topalian, S., D. Solomon, F. P. Avis, A. E. Chang, D. L. Freeksen, W. M. Linehan, M. T. Lotze, C. N. Robertson, C. A. Seipp, P. Simon, C. G. Simpson y S. A. Rosenberg, 1988, J. Clin. Oncol. 6:839-53). Los TIL586 fueron principalmente linfocitos T CD8^{+}. Los TIL1200 se cultivaron en las mismas condiciones descritas para TIL586. Los clones de linfocitos T se generaron por el procedimiento de dilución limitada a partir de la línea celular TIL586 y a continuación se extendieron en un medio AIM-V conteniendo 6000 IU/ml de IL-2.

Las líneas celulares de melanoma 397 mel, 397 mel/A31, 586 mel, 624 mel y las líneas celulares B transformadas por EBV 586EBV y 1510EBV se crearon en este laboratorio y se cultivaron en medio RPMI 1640 conteniendo 10% de suero de ternero fetal (FCS). Melanocitos normales cultivados procedentes del prepucio de un bebé (NHEM680 adquirido en Clonetics, CA) se cultivaron en medio de cultivo de melanocitos (MGM; Clonetics, CA). La línea celular COS-7 fue suministrada por el Dr. W. Leonard (NIH).

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Análisis de la secreción GM-CSF

La transfección del ADN y el análisis de GM-CSF se realizaron como se describió anteriormente (Wang, R. F.; P. F. Robbins, Y. Kawakami, X. Q. Kang y S. A. Rosenberg, 1995, J. Exp. Med. 181:799-804). En resumen, se mezclaron 200 \mug de ADN que lleva un fragmento diferente y 50 ng de ADN de HLA-A31 con 2 \mul de lipofectamina en 100 \mul de DMEM durante 15 a 45 min. La mezcla ADN/lifofectamina se añadió a continuación a las células COS-7 (5 \times 10^{4} células) y se incubó toda la noche. Al día siguiente, se lavaron las células dos veces con medio DMEM. Se añadió TIL586 a una concentración de 1 \times 10^{5} células/pocillo en medio AIM-V conteniendo120 IU/ml de IL-2. Después de 18 a 24 h de incubación, se recogió 100 \mul de sobrenadante y se midió GM-CSF en un análisis ELISA estándar (R + D Systems, Minneapolis, MN). Para los péptidos, se incubaron células 586EBV, 1510EBV y linfocitos T2 con péptidos a 37ºC durante 90 min, y a continuación se lavó tres veces con medio AIM-V conteniendo 120 IU/ml de IL-2. Se añadió TIL586 y se incubó durante otras 18 a 24 h, se recogió 100 \mul de sobrenadante para análisis
de GM-CSF.

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Construcciones de deleción de Exo III/S1 y fragmentos de PCR

Para realizar una serie de deleciones, se digirió el ADN del plásmido pADNc776 con Xba I y se rellenó con trifosfatos de alfa-fosforotioato desoxirribonucleótido para bloquear la digestión de la Exo III nucleasa. El plásmido pADNc776 es un derivado del vector pADNc3 que contiene un fragmento de ADN de 2,4 kb y un activador CMV para dirigir la transcripción. Se sometió ADN linealizado a la digestión del segundo enzima de restricción Xho I para generar un extremo sensible a Exo III. La deleción de Exo III nucleasa / nucleasa de la alubia de Mung se realizó según las instrucciones del fabricante (Stratagene, CA). El protocolo detallado es el siguiente:

1.: Se digirió 10 \mug de ADN con Xbal y se rellenó con alfa-fosforotioato desoxirribonucleótido.

2.: Se digirió el ADN con el segundo enzima Xhol seguido de extracción con fenol y precipitación con etanol.

3.: Se secó el sedimento de ADN y se puso en suspensión en 125 \mul de tampón 2X Exo, 25 \mul de \beta-mercaptoetanol 100 mM y 100 \mul de agua.

4.: Cuando todas las alícuotas se habían eliminado y colocado en nieve carbónica, se calentaron los tubos a 68ºC durante 15 minutos y a continuación se colocaron en hielo.

5.: Se añadió 15 U de nucleasa de alubia de Mung (diluida previamente con tampón de dilución 1X de alubia de Mung) a cada tubo de punto de tiempo y se incubaron durante 30 minutos a 30ºC.

6.: Se añadió lo siguiente:

: 4 \mul de SDS al 20%

: 10 \mul de Tris-HCl 1 M, pH 9,5

: 20 \mul de LiCl 8 M

: 250 \mul de tampón fenol:cloroformo equilibrado

7.: Se agitaron las muestras, se centrifugaron 1 minuto en microcentrífuga, se eliminó la capa acuosa superior y se extrajo con cloroformo para extraer la proteína de la alubia Mung del ADN.

8.: Se añadió 25 \mul de NaOAc 3 M pH 7,0 a la fase acuosa. Se utilizó ARNt a una concentración final de 10 ng/\mul como vehículo para la precipitación.

9.: Se añadió 650 \mul de etanol frío. Se enfriaron las muestras 10 minutos en nieve carbónica y se centrifugaron en una microcentrífuga durante 20 minutos.

10.: Se drenó el sobrenadante y se lavaron los sedimentos con etanol al 80%.

11.: Se secó el sedimento.

12.: Se redisolvió el sedimento de ADN en 15 \mul de Tris-Cl 10 mM pH 7,5, EDTA 0,1 mM.

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B. Ligadura

13.: Las deleciones de ADN se ligaron utilizando las siguientes condiciones:

: ADN tratado con 1,0 \mul de Exo/Mung

: 10X 2,0 \mul de tampón de ligadura

: Tris-HCl 500 mM, pH 7,5

: MgCl_{2} 70 mM

: DTT 10 mM

: 2,0 \mul de ATP 5 mM, pH 7,0-7,5

: 2,0 \mul de T4 ADN ligasa (Cat. nº 600011; suministrado en maletín)

: 13,0 \mul de H_{2}O

: 20.0 \mul volumen de reacción total

: Incubados a temperatura ambiente

: Stratagene suministra un maletín de ligadura de ADN (Cat. nº 203003) para ligaduras, inserciones o vectores.

14.: Se utilizó 7 \mul del ADN restante tratado con 14 \mul de Exo/Mung para el análisis de electroforesis en gel.

15.: Se utilizó 1 \mul de la reacción de ligadura para transformar 100 \mul de células RecA-JM109 de Epicurian coli o de XL1-Blue y se colocaron en placas con LB/AMP.

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C. Técnica de agarosa con bajo punto de fusión

: Para minimizar la identificación de las deleciones, se introdujo un fragmento de deleción en agarosa de bajo punto de fusión, se escindió la banda de interés y se continuó la ligadura. Se mantuvo la concentración de agarosa por debajo del 0,5% en la reacción de ligadura.

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La amplificación por PCR se realizó a 94ºC durante 2 min seguido de 25 ciclos de 94ºC durante 1 min, 55ºC durante 45 seg y 72ºC durante 1 min. Se utilizaron cebadores gpN (5'AGAATGAGTGCTCCTAAACTCCTCTCTCTGGG) (SEC ID nº: 42) y gp11B (5'CATGTGAGA AAAGCTGGTCCCTCA) (SEC ID nº: 43) para generar el fragmento de ADN (1-667) y a continuación se clonó en el vector de expresión pCR3 para producir pPCR110. Los plásmidos pPCR210 y pPCR220 eran vectores pCR3 que contienen fragmentos de inserción de ADN amplificados utilizando cebadores gp-1 (5'TGGATATGGCAAAGCGCACAACTC) (SEC ID nº: 44) y gp11B, gp-1 y gp22 (5'TAAATG
GAAATGTTCTCAAATTGTGGCGTG) (SEC ID nº: 45), respectivamente.

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Ensayos de lisis citotóxica

El ensayo citolítico se realizó como se describió anteriormente (Kawakami, Y. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6458-62). En resumen, las células objetivo se marcaron con cromo durante 90 min. Después de lavar tres veces, se incubaron las células con péptidos a una concentración de 1 \mug/ml durante 90 min. Se lavaron de nuevo las células, se hizo el recuento y a continuación se mezclaron con TIL586 a la proporción indicada de efector:objetivos (E:T). Se midió la liberación de cromo después de 4 h de incubación. Los péptidos se sintetizaron por un procedimiento en fase sólida utilizando un sintetizador de péptidos (modelo AMS 422, Gilson Co., Inc., Worthington, OH). Se purificaron algunos péptidos por HPLC y presentaron una pureza mayor del 98%. Para la valoración del péptido ORF3P reconocido por TIL586, se incubaron linfocitos B de 586EBV con varias concentraciones de péptido ORF3P purificado. Se determinó el porcentaje de lisis específica mediante la ecuación (A-B)/(C-B) \times 100, en la que A es la lisis de los linfocitos B de 586EBV por TIL586 en presencia de un péptido, B es la liberación espontánea de los linfocitos B de 586EBV en presencia del mismo péptido pero en ausencia de las células del efector y C es la liberación máxima de cromo. Se realizó la inhibición de la citólisis por el objetivo frío utilizando células 586 mel o 624 mel marcadas
con ^{51}Cr como objetivos "calientes" y linfocitos B de 586EBV y T2 pulsados con péptidos como objetivos "fríos".

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Mutagénesis direccionada al punto

Para la construcción de la mutagénesis direccionada al sitio, se utilizaron cebadores mutados GPMUT1 (5'GCCATGGGCAGAGATGATCGGGAGGTCTGGCCCTTGCGCTTCTTCAATAGGACATCTCACTGCAAC) (SEC ID nº: 11) y GPA1 para generar un fragmento por PCR que contiene una mutación (G a C) en el nucleótido 296. Se amplificaron los fragmentos de ADN natural utilizando cebadores GPF1 (5'GAAGATCTGCCATGGGCAGAGATGATCGG
GAGGTCTG) (SEC ID nº: 12), GPE1 (5'GAATTCGTTGTGTCCTGAGAAATTGCCGTTG) (SEC ID nº: 13), GPE2 (5'GAATTCGACTATGAGAACCCTCTGGTCACAGGC) (SEC ID nº: 14) y GPA1 (5'AAGATCTGGGCCCGGA
CAAAGTGGTTCTTTTC) (SEC ID nº: 15) como se indicó mediante puntas de flecha en la Fig. 3A. Los productos de PCR purificados se clonaron a continuación en el vector de expresión pCR3. Se secuenciaron todos los plásmidos que contienen fragmentos de PCR para confirmar la orientación y secuencia del nucleótido.

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Ejemplo 2 Localización de el/los péptido(s) antigénico(s) reconocidos por TIL586

Con el fin de identificar el epítopo antigénico procedente de gp75, se generó una serie de deleciones anidadas del gen gp75 desde el extremo 3' utilizando Exo III/S1 nucleasa así como fragmentos de ADN adicionales procedentes de gp75 mediante amplificación por PCR (Fig. 1A). La razón por la que se seleccionó pADNc776 como material de partida para los estudios de delección es que este clon se purificó inicialmente por cribado de una biblioteca y confirió la capacidad para estimular la liberación de citocina de TIL586. El plásmido pADNc776 se depositó en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD en los términos del tratado de Budapest del 19 de enero de 1996 y se asignó el número de registro, ATCC 97423. ya que el objetivo de este estudio era identificar el epítopo reconocido por TIL586, se utilizaron fragmentos lo más cortos posibles (la forma truncada de gp75, en lugar del ADNc completo) de modo que el epítopo se pudiera localizar rápidamente en un fragmento de ADN relativamente pequeño. Ae transfirieron a continuación estas construcciones de deleciones a células COS-7 junto con el plásmido pBK-CMV que contiene el gen HLA-A31. (Wang, R.F. et al., 1995, J. Exp. Med. 181:799-804). Después de 24 horas, se examinaron las células COS-7 transfectadas para determinar qué construcción podría estimular la liberación de citocina por TIL586. Un fragmento pequeño de ADN truncado que oscila entre el nucleótido 247 a 771, que carece del codón de iniciación gp75 normal, conserva la capacidad para estimular la liberación de GM-CSF por TIL586, lo que sugiere que el epítopo reconocido por TIL586 estaba situado en el fragmento de ADN que contiene los nucleótidos desde 247 a 771. Ya que existe un codón de inicio ATG en un contexto relativamente bueno de la secuencia Kozak (GATATGG) (SEC ID nº: 16) situada en los nucleótidos 445 a 447 y está en el mismo marco que el marco de lectura abierto de gp75, se pensó que el epítopo reconocido por TIL586 podría estar localizado en la zona de nucleótidos 445 a 771. Por consiguiente, se construyeron pPCR210 y pPCR220, que eran derivados del vector de expresión pCR3 y contenían un codón ATG interno en el marco con gp75 (GATATGG) (SEC ID nº: 16) situado a 445 bp como codón de inicio para la traducción de la proteína gp75 normal truncada. Sin embargo, ni pPCR210 ni pPCR220 confieren la capacidad para estimular la secreción de citocina del TIL586 después de la transfección conjunta de COS-7 con el gen HLA-A31 (Fig. 1B), lo que sugiere que el epítopo estaba situado corriente arriba de estos fragmentos. Por consiguiente, se construyó un plásmido pD776A adicional, que contenía la secuencia de nucleótidos desde 247 a 442 y no tenía ningún codón ATG en el mismo marco que gp75, sino que contenía 2 codones ATG en diferentes marcos de lectura abiertos en comparación con gp75. Este plásmido estimuló intensamente la liberación de citocina por TIL586 cuando se transfectaba junto con ADNc de A31 en las células COS-7. El plásmido pPCR110 que contiene el codón de inicio auténtico de gp75 estimuló varias veces menos la liberación de citocina que lo hizo pDel 5 o pD776A cuando se transfectaba junto con el gen HLA-A31 (Fig. 1B). Estos resultados sigirieron que el/los epítopo(s) reconocido(s) por TIL586 estaban situados en la zona de los nucleótidos 247 a 442.

Aunque esta zona (nucleótidos 247 a 442) no tienen ningún codón de inicio ATG en el marco de lectura abierto gp75 normal, el inicio de la traducción desde los codones sin ATG tales como ACG, CTG y GTG se ha descrito en algunos casos (Hann, S.R. 1994, Biochimie 76:880-86; Muralidhar, S. et al., J. Virol. 1994, 68:170-76). Para identificar el péptido en esta zona, se preparon péptidos sintéticos basándose en el motivo de unión al péptido de HLA-A31 (resto hidrófobo en la posición 2 y el resto cargado positivamente en el terminal C) (Fig. 2) (Falk, K. et al., Immunogenetics 1994, 40:238-41). La mayoría de los péptidos seleccionados para este estudio eran nonámeros, aunque algunos eran decámeros y undecámeros. Estos péptidos se pulsaron en linfocitos B de 586EBV y la capacidad de estas células para estimular la liberación de citocina por TIL586 (Tabla 1). Un péptido, AACDQRVLIVRR (SEC ID nº: 25), produjo muy débilmente liberación de GM-CSF de TIL586. Sin embargo, este péptido no pudo sensibilizar los linfocitos B de 586EBV cargados con el péptido durante la lisis por TIL586 (Tabla 1).

TABLA 1 Identificación de péptidos sintéticos con reactividad a TIL586

1

Debido a que este péptido estimulaba débilmente la liberación de citocina de TIL586 únicamente cuando se incubaba con linfocitos B de 586EBV en grandes concentraciones (>1 \mug/ml) y no sensibilizaba las células objetivos para la lisis por TIL586 incluso a una concentración de 10 \mug/ml de péptido (datos no mostrados), puede no representar el epítopo del linfocito T predominante reconocido por TIL586.

Para definir además a zona que contiene el epítopo del linfocito T predominante, se construyeron dos plásmidos adicionales que contienen fragmentos de PCR amplificados por cebadores GPF1, GPE1 y GPE2, respectivamente (Fig. 3A). Tal como se muestra en la Fig. 3B, ambos plásmidos que contienen un codón de inicio ATG en al principio del fragmento de PCR más pequeño confirió la capacidad de estimular la liberación de citocina por TIL586 junto con HLA-A31, lo que sugiere que el epítopo reconocido por los linfocitos T estaba codificado dentro de una secuencia de 82 nucleótidos entre las bases 247 y 329 del ADNc de gp75. Se sintetizaron treinta y ocho péptidos solapantes (nonámeros o decámeros) en ORF1 basados en la secuencia de aminoácidos de gp75 en esta zona, pero no se observó que ninguno estimulase la liberación de GM-CSF o a los linfocitos B de 586EBV sensibles a la lisis por TIL586 (datos no mostrados).

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Ejemplo 3 Péptidos antigénicos procedentes de la traducción de un marco de lectura abierto alternativo del gen gp75

La ineficacia para identificar un epítopo reconocido por TIL586 en esta pequeña zona sugirió que los marcos de lectura abiertos alternativos pueden ser traducidos. Dos codones ATG en el contexto relativamente bueno estaban presentes en esta zona (nucleótidos 247 a 442) en diferentes marcos de lectura abiertos en comparación con el marco de lectura abierto de gp75 (ORF1) (Fig. 2). La traducción del primer ATG (251 GAGATGA257) (SEC ID nº: 29) produjo un marco de lectura abierto que codifica 45 aminoácidos (ORF2) mientras que el inicio de la traducción desde el ATG situado entre los nucleótidos 294 a 296 (GACATGT) (SEC ID nº: 30) generó un producto génico de 24 aminoácidos (ORF3) (Fig. 2). Se seleccionaron y sintetizaron tres péptidos procedentes de ORF2 y dos péptidos de ORF3 sobre la base del motivo de unión a HLA-A31 (Tabla 2 y Fig. 2). Sorprendentemente, un péptido MSLQRQFLR (SEC ID nº: 9) (denominado ORF3P) que procede de ORF3 fue reconocido intensamente por TIL586 cuando se pulsó en los linfocitos B de 586EBV (Tabla 2). El reconocimiento del péptido ORF3P (MSLQRQFLR) (SEC ID nº: 9) por TIL586 se observó solamente cuando el péptido se pulsó en linfocitos de B 586EBV autólogos y linfocitos B (A31+) de 1510EBV, pero no cuando el péptido era cargado en linfocitos T2 (sin HLA-A31) (Fig. 4A), lo que sugiere que el reconocimiento de este péptido por TIL586 estaba restringido por HLA-A31. La masa de péptido de ORF3P se confirmó por análisis espectrométrico de masas. Como se muestra en la Fig. 4B, TIL586 lisó linfocitos B de 586EBV pulsados con el péptido ORF3P, pero no pudo lisar los linfocitos B de 586EBV pulsados con péptido improcedente que cumplen el criterio del motivo de unión al péptido de HLA-A31, pero no son reconocidos por TIL586 o por los linfocitos T2 pulsados con el péptido ORF3P. La sensibilización para la lisis por el péptido mostró el efecto máximo a 100 nM, mediante actividad lítica se detectó incluso a una concentración de péptido de 1 nM (Fig. 4C). TIL586 no reconoció los péptidos MSLQRQFLR T (SEC ID nº: 33) ni SLQRQFLRT (SEC ID nº: 34), o los péptidos modificados (sustitución de restos anclados en las posiciones 2, 6 y 9) M L LQRQFLR (SEC ID nº: 36), M R LQRQFLR (SEC ID nº: 37), MSLQRLFLR (SEC ID nº: 38), MSLQRQFL E (SEC ID nº: 39), MSLQRQFL K (SEC ID nº: 40), procedentes de MSLQRQFLR (SEC ID nº: 9) (Tabla 2). TIL586 solo reconoció el péptido M A LQRQFLR (SEC ID nº: 35) con una sustitución Ser por Ala en la posición 2 comparado con el péptido MSLQRQFLR (SEC ID nº: 9) (Tabla 2).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Identificación de péptidos antigénicos con reactividad a TIL586

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Ejemplo 3 La traducción es necesaria para generar el péptido antigénico procesado naturalmente

Ya que existía un codón de terminación TAG (288-290) situado en los seis nucleótidos corriente arriba del codón de inicio ATG de ORF3 (294-296) (fig. 2), era poco probable que el péptido ORF3P procediese de un desplazamiento del marco de lectura. El análisis de la secuencia de ADN también confirmó que no existía ninguna deleción o inserción en la zona corriente arriba. Para investigar si el ATG situado en los nucleótidos 294-296 jugaban un papel importante en la traducción del producto de 24 aminoácidos, ATGT (294-297) se mutó en ATCT (294-297) para eliminar la traducción de ORF3, que produciría un cambio de Cys (UGU) a Ser (UCU) en ORF1 (gp75) (Fig. 3A). Se analizó la capacidad para conferir reconocimiento por TIL586 de un plásmido que contiene el gen mutado (pGFMUT1) cuando se transfectaba conjuntamente con COS-7 junto con el ADNc de HLA-A31. La Fig. 3B demostró que el gen mutado perdía completamente la capacidad de que TIL586 estimulara la liberación de GM-CSF en comparación con la construcción que contiene el gen natural. Esta observación indicaba que se necesitaba ATG en ORF3 en las posiciones 294 a 296 del nucleótido para la traducción del producto de 24 aminoácidos y por consiguiente era esencial para generar el epítopo del linfocito T reconocido por TIL586.

Ya que el Met (ATG) está en la posición 1 del epítopo del péptido y la mutación de ATG en ATC en los nucleótidos 294 a 296 produjo un cambio de Met a Ile en la posición 1 del péptido, se investigó la posibilidad de que la pérdida de reconocimiento del gen mutado por TIL586 pudiera ser debida a la pérdida de capacidad del péptido mutado para unirse a las moléculas MHC de clase I. Se preparó un péptido sintético (ISLQRQPLR) (SEC ID nº: 41) con la misma secuencia de aminoácidos que la codificada por el gen mutado y se probó el reconocimiento por TIL586. Se observó que el péptido mutado sintético era reconocido todavía por TIL586 en concentraciones comparables a las del péptido natural. Además, cuando se introducía la misma mutación en el ADNc completo, no se observó ninguna reactividad con TIL586, mientras que el ADNc natural era capaz de estimular la liberación por citocina de TIL586 a una concentración similar a la del pPCR110. Esto está de acuerdo con los datos de la delección, que indican que TIL586 no reconocía el/los péptido(s) en otras zonas del gen. Estos resultados sugieren que la pérdida de reconocimiento del gen mutado (ATG en ATC en los nucleótidos 294 a 296) por los linfocitos T era debida a la inactivación del inicio de la traducción de ORF3.

Ejemplo 4 Reconocimiento del péptido antigénico en células tumorales así como en melanocitos

Para estudiar la cuestión de si TIL586 reconocía un péptido procesado naturalmente que es similar o idéntico al péptido ORF3P en las células tumorales, se examinó la capacidad de los linfocitos B de 586EBV pulsados con el péptido ORF3P para inhibir la lisis de 586 mel marcado con ^{51}Cr en una prueba de inhalación del objetivo frío. Se observó inhibición significativa de la lisis de 586 mel marcado por ^{51}Cr por los linfocitos B de 586EBV pulsados con el péptido ORF3P pero no con los linfocitos B de 586EBV pulsados con péptido improcedente o con los linfocitos T2 pulsados con el péptido ORF3P (Fig. 5A), lo que indica que este epítopo era capaz de competir con un péptido procesado naturalmente en las células tumorales para reconocimiento de linfocitos T. Como estaba previsto, los linfocitos B de 586EBV cargados con ORF3P no inhibieron la lisis de 624 mel objetivo por TIL1200, que reconoce el antígeno de gp100 en el contexto de HLA-A2, comparado con B de 586EBV solo (Fig. 5B). Para probar además si los clones de linfocitos T pueden reconocer tanto los linfocitos B de 586EBV pulsados por el péptido ORF3P como las líneas celulares tumorales, se generaron clones de linfocitos T a partir de la línea celular de TIL586 por dilución limitante (1 célula/pocillo en una microplaca de fondo redondo de 96 pocillos) y se extendieron además en el cultivo. Se generaron clones de linfocitos T por dilución limitante (1 célula por pocillo) a partir de la línea celular de TIL586. Los clones de linfocitos T se extendieron además en un medio AIM-V conteniendo 6000 IU/ml de IL-2. Los linfocitos B de 586EBV se pulsaron con el péptido ORF3P o con el péptido improcedente durante 90 min a 37ºC. Después de lavar tres veces, se añadieron clones de linfocitos T o células TIL586 y se incubaron conjuntamente durante 18 a 24 h más. Para los tumores de células 586 mel, 397 mel/A31^{+} y NHEM680 de melanocitos, se incubaron 1 \times 10^{5} células por pocillo con 1 \times 10^{5} células para los clones de linfocitos T, TIL586-C1 (Fig. 6A), TIL586-C4 (Fig. 6B) y TIL586-C6 (Fig. 6C) o TIL586 (Fig. 6D) durante 18 a 24 h, respectivamente. Se realizó el ensayo de GM-CSF como se describe en la Fig. 1B. Seis clones de linfocitos T fueron capaces de reconocer células tumorales 586 mel, linfocitos B de 586EBV pulsados con el péptido ORF3P y melanocitos positivos HLA-A31, pero no 397 mel/A31 o linfocitos B de 586EBV solos. Los datos representativos se muestran en las Figuras 6A a 6D. Estos resultados sugirieron que los clones de linfocitos T probablemente reconocieron un péptido procesado naturalmente bien similar o idéntico al péptido ORF3P en células tumorales y melanocitos normales.

Ya que existe una identidad en la secuencia de aminoácidos del 40 al 45% de gp75 con tirosinasa, gp100 y TRP-2, se probó la posibilidad de que el péptido reconocido por los clones de linfocitos T no provenga de gp75, sino de una de estas otras proteínas. Se transfectaron células COS-7 con HLA-A31 más tirosinasa, gp100 o ADNc de TRP-2, respectivamente, y se observó que ninguna podía ser reconocida por los seis clones T mientras que las HLA-A31 y ADNc de gp75 transfectados por COS-7 estimularon la liberación de GM-CSF procedente de estos clones (datos no mostrados). Una búsqueda en la base de datos de ordenador indicó que ninguna de las proteínas conocidas incluyendo la tirosinasa, gp100 y TRP-2 en la base de datos contenía secuencias de aminoácidos con el motivo de fijación al péptido de HLA-A31 y una similitud importante con el epítopo del péptido reconocido por TIL586.

Ejemplo 5 Ensayo de protección in vivo

Para los estudios de protección in vivo, se inmunizaron ratones transgénicos MHL-A31^{+} con 0, 1 pg, 1 ng, 1 \mug, 1 mg ó 100 mg del péptido del cáncer (SEC ID nº: 9), por vía intravenosa el día cero y el día 14 antes de una prueba de provocación subcutánea con 10^{4} células de melanoma de ratón Trp-1^{+} B16 o una prueba de provocación intravenosa con 5 \times 10^{5} células de melanoma de ratón Trp-2^{+} B16. Los ratones que recibieron células tumorales por vía subcutánea se les observó dos veces a la semana el desarrollo del tumor y se determinó su tamaño. Los ratones que recibieron células tumorales por vía intravenosa se les practicó la eutanasia el día 12 y se determinó el número de metástasis pulmonares según describió Houghton, A.N. 1994 J. Exp. Med. 180:1-40.

Ejemplo 6 Ensayo de tratamiento in vivo

Para el tratamiento in vivo se hizo una prueba de provocación en ratones transgénicos MHL-A31^{+} bien con 1 \times 10^{5} ó 5 \times 10^{5} células de melanoma de ratón Trp-1^{+} B16 por vía intravenosa para establecer la metástasis pulmonar. Se vacunaron posteriormente los ratones con un virus recombinante que expresa el péptido del cáncer (SEC ID nº: 9) en 10^{5} PFU/mg de peso corporal. Se practicó la eutanasia a los ratones el día 12 y se determinó el número de metástasis pulmonares en los ratones vacunados frente a los no vacunados.

Ejemplo 7 Linfocitos T específicos del antígeno del cáncer Inmunoterapia

Linfocitos T sensibilizados previamente con un antígeno de melanoma pueden ser eficaces para tratar terapeúticamente mamíferos afectados de melanoma. Se aislan linfocitos T de la sagre periférica o de suspensiones tumorales de melanoma y se cultivan in vitro (Kawakami, Y. et al, 1988, J.Exp. Med. 168:2183-2191).

Los linfocitos T están expuestos al péptido del cáncer (SEC ID nº: 6) en una concentración de 1 \mug/ml solos o en presencia de IL-2, resensibilizados y sembrados en el cultivo. Los linfocitos T expuestos al péptido del cáncer se administran a un mamífero a razón de aproximadamente 10^{9} a 10^{12} linfocitos por mamífero. Los linfocitos se administran bien por vía intravenosa, por vía intraperitoneal o por vía intralesional. El tratamiento se puede administrar simultáneamente con otros tratamientos terapeúticos tales como citocinas, excisión quirúrgica o lesiones de melanoma y fármacos quimioterapéuticos.

Ejemplo 8 Tratamiento de pacientes con melanoma metastásico

En este protocolo, se inmuniza a los pacientes con melanoma avanzado con un epítopo antigénico del cáncer.

Los pacientes seleccionables para la prueba deben presentar pruebas de melanoma metastásico mensurables o evaluables en las que haya fracasado la terapia eficaz habitual. Los pacientes deben tener tumores que expresen el antígeno de TPI-1 probado por PCR o por análisis de transferencia de Northern o ARN de células tumorales.

Los pacientes reciben 1 ng, 1 \mug, 1 mg ó 500 mg/kg de peso corporal de un péptido del cáncer (SEC ID nº: 6) por vía intravenosa el día cero, el día 7 y el día 14 solo o en combinación con IL2 y/o una molécula inmunoestimulante. Se evalúa la toxicidad, efectos inmunológicos y la eficacia terapeútica en los pacientes.

En los linfocitos extraídos de los pacientes tratados se prueba la respuesta específica al antígeno del cáncer que comprende la secuencia de aminoácidos MSLQRQFLR (SEC ID nº: 6).

Se define una respuesta completa como la desaparición de toda prueba clínica de enfermedad que termina al menos en cuatro semanas. Una respuesta parcial es una disminución del 50% o mayor en la suma de los productos del diámetro perpendicular de todas las lesiones mensurables durante al menos cuatro semanas sin aparición de nuevas lesiones o aumento en alguna de las lesiones. Las respuestas menores se definen como la disminución del 25 al 49% en la suma de los productos del diámetro perpendicular de todas las lesiones mensurables durante al menos cuatro semanas sin aparición de nuevas lesiones o aumento en alguna de las lesiones. Cualquier paciente con menos de una respuesta parcial se considera que no responde al tratamiento. La aparición de nuevas lesiones o mayores del 25% de aumento en el producto de los diámetros perpendiculares de las lesiones anteriores después de una respuesta parcial o completa se considera una recaída.

Ejemplo 9 Materiales y procedimientos para TRP-2 Productos químicos y reactivos

Los siguientes productos químicos y reactivos se adquirieron a los proveedores indicados: RPMI1640, medio AIM-V, Lipofectamina, G418 (GIBCO BRL, Gaithersberg, MD); vector de expresión eucariótica pCR3 (Invitrogen, San Diego, CA); anticuerpo monoclonal anti-HLA-A31 (One lambda, Canoga Park, CA); anticuerpo de anti-inmunoglobulina M conjugado con isotiocianato de fluoresceína (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA).

Clones y líneas celulares de linfocitos T

Se generaron clones de linfocitos T por procedimientos de dilución limitante (a razón de 1 célula/pocillo) procedentes de la línea celular TIL586 y se utilizaron PBL alógenos (1 \times 10^{3} células/pocillo) como células nutridoras en RPMI1640 conteniendo suero AB humano al 10% y 500 IU de IL-2. Después de 12 días, se sembraron a continuación clones de linfocitos T en un medio AIM-V conteniendo 6000 IU/ml de IL-2. Para obtener una expansión óptima, se utilizó el procedimiento de expansión de OKT3 descrito por S. Riddell (Walter et al. 1995 N. Engl. J. Med. 333:1038-1044). En resumen, el día 0, se cultivaron 5 \times 10^{4} a 5 \times 10^{5} linfocitos T junto con HLA-A31 PBL (relación PBL:linfocitos, T500:1) y linfocitos B de 586EBV (relación EBV:linfocitos T, 100:1) en 25 ml de RPMI 1640 conteniendo suero humano al 11%, 30 ng/ml de anticuerpo OKT3 y antibióticos. El día 1, se añadió IL-2 a una concentración final de 180 IU/ml. Se cambió el medio por medio reciente conteniendo suero humano al 11%, 180 IU/ml de IL-2 el día 5. Se cambiaron a continuación los medios cada tres días. Los días 12 a 14, se recogieron los linfocitos T, se hizo el recuento y se conservaron en el congelador. Se aislaron TIL586 de la muestra tumoral de un paciente con melanoma metastásico y se cultivaron en un medio conteniendo IL-2 (6000 IU/ml) (Chiron) durante 32 a 60 días como se describió anteriormente (Topalian et al. 1988, J. Clin. Oncol. 6:839-853). TIL586 eran principalmente linfocitos T de CD8^{+}.

Las líneas celulares de melanoma 397 mel, 397 mel/A31, 586 mel, 624 mel, 624 mel/A31 y las líneas celulares de linfocitos B transformadas por EBV 586EBV y 1510EBV fueron creadas en nuestro laboratorio y cultivadas en medio RPMI 1640 conteniendo suero de ternero fetal al 10% (FCS). Melanocitos normales cultivados procedentes del propucio de un bebé (NHEM680 adquiridos en Clonetics, CA) se cultivaron en medio de cultivo de melanocitos (MOM; Clonetics, CA). La línea celular de COS-7 fue proporcionada por el Dr. W. Leonard (NIH).

Ensayo de secreción de GM-CSF

Se realizaron ensayos de transfección de ADN y de GM-CSF como se indicó anteriormente (Wang et al. 1995, J. Exp. Med. 181:799-804). En resumen, se mezclaron 200 ng de ADN que codifica antígenos y 50 ng del ADN de HLA-A31 con 2 \mul de lipofectamina en 100 ml de DMEM durante 15 a 45 min. La mezcla de ADN/lipofectamina se añadió a continuación a las células de COS-7 (5 \times 10^{4}) y se incubaron toda la noche. Al día siguiente, se lavaron las células dos veces con medio DMEM. Se añadió TIL586 a una concentración de 1 \times 10^{5} células/pocillo en un medio de AIM-V conteniendo 120 IU/ml de IL-2 para los clones de los linfocitos T, se añadieron únicamente 1-2 \times 10^{4} células/pocillo. Después de 18 a 24 h de incubación, se recogieron 100 \mul de sobrenadante y se midió GM-CSF en un análisis ELISA estándar (R + D Systems, Minneapolis, MN). Para el reconocimiento de los péptidos de la prueba, se incubaron células 586EBV o linfocitos T2 con péptidos a 37ºC durante 90 min y a continuación se lavaron tres veces con medio AIM-V conteniendo 120 IU/ml de IL-2. Se añadieron linfocitos T y se incubaron durante 18 a 24 h más, se recogió 10 \mul de sobrenadante para el ensayo de GM-CSF.

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Construcciones de deleción de Exo III/SI y subclonación

El ADNc de TRP-2 fue una donación del Dr. Shibahara (Yokoyama et al. 1994, Biochim. Biophys. Acta 1217:317-321) y se subclonó en el vector de pCR3 con un activador para la expresión de CMV. Para preparar una serie de deleciones, se dirigió el plásmido pCR3 que contiene ADNc de TRP-2 con Xba I y se rellenó con trifosfatos de alfa-fosforotioato desoxirribonucleótido para bloquear la digestión de la Exo III nucleasa. El ADN linealizado se sometió a la digestión del segundo enzima de restricción para generar un extremo sensible a Exo III. La deleción de Exo III nucleasa/nucleasa de la alubia de Mung se realizó según las instrucciones del fabricante (Stratagene, CA). Se secuenciaron todas las construcciones de delección para determinar la situación de la secuencia de ADN que se elimina. El plásmido pTA fue un derivado de pCR3-TRP2, en el que se eliminó un fragmento de ADN de Apa I procedente del extremo 3' del gen TRP-2. pTK fue creado después de la eliminación de un fragmento de ADN de KpnI procedente del extremo 3' del gen TRP-2. Se generó pTP eliminando un fragmento Pst I interno y religadura.

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Análisis de transferencia de Northern

Se aisló ARN completo por el procedimiento de centrifugación de isocianato de guanidina/cloruro de cesio. El ARN completo del tejido normal humano se adquirió en Clontech, CA. Se sometieron a electroforesis veinte \mug de ARN completo en 1,2% gel de agarosa folmaldehído y se transfirieron a una membrana de nilón. Se marcó un fragmento de ADN de 2,0 kb del gen TRP-2 con ^{32}P-\alpha-CTP por el procedimiento de cebado al azar. Se realizó la prehibridación y la hibridación según el protocolo QuickHyb (Stratagene). Se lavaron dos veces las membranas con 2 X SSC/SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 min y dos veces con 0,1 X SSC/SDS al 0,1% a 60ºC durante 30 min. Se realizó la autorradiografía a -70ºC.

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Pruebas de citotoxicidad

Se determinó la citolisis utilizando Calcein AM (Molecular Probes, Eugene, OR). En resumen, se pulsaron linfocitos T2 o B 586EBV con péptidos en RPMI1640/FCS al 5% durante 90 min. Las células tumorales y los linfocitos B EBV pulsados por el péptido se marcaron con Calcein AM (15 \mul de 1 mg/ml de Calcein AM por cada 1 \times 10^{6} células) durante 30 min a 37ºC. Después de la incubación, las células se lavaron tres veces con AIMV/120 IU de IL-2. Se mezclaron 1 \times 10^{3} células objetivo con linfocitos T en varias proporcones E:T. Después de 4 h de incubación a 37ºC, se añadió 5 \mul de solución de hemoglobina bovina enfriada bruscamente conteniendo bromuro de etidio. Se leyó la placa por ecografía Lambda. Se calculó el porcentaje de lisis a partir de la siguiente ecuación: [1-(A-B)/(C-B)] \times 100, en la que A es la lectura de las células no lisadas en presencia de linfocitos T, B es el valor de la señal de fondo y C es el valor de la señal máxima de las células objetivo.

Se sintetizaron los péptidos por un procedimiento en fase sólida utilizando un sintetizador de péptidos (modelo AMS 422, Gilson Co., Inc., Worthington, OH). Se purificaron algunos péptidos por HPLC y presentaron una pureza mayor del 98%. Se confirmó la masa de péptidos de algunos péptidos por análisis de espectrometría de masas.

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Ejemplo 10 Reconocimiento de nuevos antígenos en células tumorales por clones de CTL

En los estudios anteriores, se ha aislado un número de clones de linfocitos T a partir de la línea celular de TIL586 por el procedimiento de dilución limitante (Wang et al. antes de 1996, J. Exp. Med. 183:1131-1140). Entre ellos, seis clones reconocieron los linfocitos B de 586EBV pulsados con el péptido ORF3P procedente de un producto génico traducido a partir de un marco de lectura abierto alternativo del gen TRP-1/gp75 y de las células tumorales de 586 mel autólogo, pero no reconocieron los linfocitos B de 586EBV pulsados con un péptido improcedente. Se seleccionó TIL586-C1 como un representante para estos clones de linfocitos T como se muestra en la Fig. 7. Sin embargo, varios clones de linfocitos T aislados de la misma línea celular de TIL586 no reconocieron ni los linfocitos B de 586EBV con el péptido ORF3P de TRP-1 ni con las células COS transfectadas con TRP-1 y los ADNc de HLA-A31, pero fueron capaces de reconocer 586 mel así como HLA-A31 + melanocitos (Fig. 7). Estos resultados sugirieron que estos clones de linfocitos T reconocieron los antígenos tumorales adicionales en las células tumorales 586 mel. Se sembraron a continuación estos clones de linfocitos T para obtener suficientes células para la identificación de bibliotecas de ADNc o análisis de otros ADNc para reconocimiento por los procedimientos descritos en el apartado Materiales y Procedimientos (Ejemplo 9). Uno de los clones, el clon 4 de CTL, se extendió con éxito y se utilizó para estudios posteriores como se describe más adelante.

Ejemplo 11 Identificación de un ADNc que codifica un antígeno tumoral reconocido por clones de linfocitos T

Para determinar la molécula de HLA responsable de presentar el antígeno al clon 4 de CTL, se transfirió ADNc de HLA-A31 a líneas tumorales negativas para A31 tales como 397 mel y 624 mel y se examinaron para reconocimiento por el clon de CTL. Los transfectantes de 397 mel y 624 mel que expresan HLA-A31 fueron significativamente reconocidos por el clon 4 de CTL (Tabla 3). Además, estos linfocitos T fueron también capaces de reconocer a 1353 mel de la línea tumoral alógena positiva a HLA-A31, indicando que el reconocimiento del antígeno tumoral por el clon 4 de CTL estaba restringido por HLA-A31.

TABLA 3 La secreción específica de GM-CSF por el clon 4 de CTL está restringida por HLA-A31

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Ya que solamente estaban disponibles un número limitado de linfocitos T, se probó en primer lugar si estos linfocitos T reconocidos previamente identificaban o no antígenos tumorales o proteínas de diferenciación del linaje de melanocitos. Se probó el reconocimiento de las células COS-7 transfectadas con ADNc de HLA-A31 y los genes que codifican los antígenos tumorales conocidos o antígenos supuestos incluyendo MART 1 (Kawakami, et al., después de 1994, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 91:3515-3519), gp75 (Wang et al., 1995, J. Exp. Med., 181:799-804), gp100 (Kawakami et al., antes de 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:6458-6462), tirosinasa (Brichard et al. 1993, J. Exp. Med. 178:489-495), plS (Robbins et al., 1995, J. Immunol. 154:5944-5950) y TRP2 (Yokoyama et al. 1994, Biochim. Biophys. Acta 1217:317-321; Bouchard et al. 1994, Eur. J. Biochem. 219:127-134) por el clon 4 de CTL. Las células COS transfectadas con HLA-A31 solas o TRP-2 solas no confieren reconocimiento por los clones de linfocitos T. Sin embargo, las células COS transfectadas con HLA-A31 y ADNc de TRP-2 estimularon la liberación de GM-CSF de los linfocitos T, mientras que las células COS transfectadas con HLA-A31 y otros genes que no indican que el clon 4 de los linfocitos T reconocieron TRP-2 como antígeno tumoral de un modo restringido por HLA-A31.

El análisis de similitudes estructurales en HLA-A3, A11, A31, A33 y A68 y su motivo de fijación al péptido ha sugerido la existencia del supermotivo de tipo A3 (Sidney et al. 1996, Human Immunol., 45:79-93). Un solo péptido del epítopo podría interreaccionar con las moléculas HLA-A3, A11, A31, A33 y A68 que se expresan acumuladamente en aproximadamente el 40 al 50% de la población general. Se ha publicado que el mismo epítopo del péptido procedente de la proteína nucleocápsida del virus de la Hepatitis B podría ser presentado por HLA-A31 y por moléculas -A68 y ser reconocido por el correspondiente CTL restringido por HLA-A31 o -A68 (Missale et al., 1993, J. Exp. Med., 177:751-762). Se probó si los linfocitos T restringidos por HLA-A31 reconocían los epítopos de TRP-1 y TRP-2 cuando se pulsaban sobre linfocitos B de EBV positivos a HLA-A3. Convenientemente, se detectó un reconocimiente débil basado en la liberación de GM-CSF procedente de los linfocitos T. Sin embargo, no se detectó ningún reconocimiento de células tumorales positivas a HLA-A3.

Ejemplo 12 Expresión del gen de TRP-2

Se realizaron análisis de transferencia de Northern utilizando ADNc de TRP-2 como sonda para evaluar el modelo de expresión de TRP-2 en diferentes tejidos. El tejido retiniano normal demostró ser el único positivo para la expresión de TRP-2 entre los tejidos humanos normales probados. El modelo de expresión de TRP-2 en las líneas celulares de melanoma y de otras líneas celulares se relaciona a continuación en la Tabla 4. Se observó que veinticinco de treinta líneas celulares de melanoma expresan TRP-2. La línea Daudi del linfocito B de Burkitt y la línea celular MDA23 1 del cáncer de mama fueron negativas, de acuerdo con los resultados anteriores (Bouchard et al. 1994, Eur. J. Biochem. 219:127-134). De este modo, igual que tirosinasa, TRP-1, gp100 y MART-1, el modelo de expresión de este gen parecía que estaba restringido a los melanomas, líneas celulares de melanocitos normales y a la retina.

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TABLA 4 Expresión de TRP-2 en diferentes líneas celulares y tejidos humanos probados

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Ejemplo 13 Epítopos del péptido reconocidos por linfocitos T

Para determinar los epítopos antigénicos de TRP-2, se generaron una serie de deleciones anidadas del gen TRP-2 a partir del extremo 3' utilizando nucleasa Exo III/S1 así como fragmentos de ADN que codifican la forma truncada de TRP-2. Estas deleciones y construcciones subclonadas se transfirieron a las células COS-7 junto con el plásmido pBK-CMV que contiene el ADNc de HLA-A31. El reconocimiento de las células COS transfectadas se probó con el clon de CTL midiendo la liberación de citocina de GM-CSF procedente del clon CTL. La Fig. 9 indicaba que las construcciones pTD1, 2 y 3 conservaban la capacidad para estimular la liberación de citocina en el clon 4 de CTL, pero pTD4 y pDT5 perdieron la actividad estimulante para el clon 4 de CTL, lo que indica que el/los epítopo(s) reconocido()s por el clon 4 de CTL estaba(n) situado(s) en la zona de los nucleótidos 836 a 1045. Esto era coherente con los resultados obtenidos en los experimentos de subclonación. Aunque pTA y pTP perdieron la capacidad para estimular la liberación de citocina en el clon 4 de CTL, pTK se mantiene todavía positivo en el ensayo de liberación de citocina. Por consiguiente, los epítopos residían en un fragmento de ADN flanqueados por las zonas PstI y KpnI como se muestra en la Fig. 10.

Para identificar los epítopos de la zona de codificación de este pequeño fragmento de ADN, cinco péptidos sintéticos se basaron en el motivo de fijación al péptido sintetizado para HLA-A31 (restos hidrófobos en la posición 2 y restos cargados positivamente en la posición 9) (Rammensee et al. 1995, Immunogenetics 41:178-228). estos péptidos fueron pulsados en linfocitos B de 586EBV y se probó la capacidad del clon 4 de CTL para estimular la liberación de citocina. Tal como se muestra en la Tabla 5, el péptido TRP_{197-205} fue firmemente reconocido por el clon 4 de CTL cuando se pulsó en los linfocitos B de 586EBV. El reconocimiento de este péptido por el clon 4 de CTL se observó solamente cuando se pulsó el péptido en los linfocitos B de HLA-A31 + EBV tal como 586EBV y 1510 EBV, pero no en los linfocitos T2 negativos para HLA-A31. El clon 4 de CTL no era el péptido ORF3P procedente del marco de lectura abierto alternativo del gen TRP-1. Estos resultados demostraron que TIL586-C1 reconocía específicamente el péptido ORF3P procedente de TRP-1 y el clon 4 de CTL reconocía específicamente el péptido procedente de de TRP2. No se observó reactividad cruzada mientras que tanto ORF3P como TRP2-p197 eran presentados a los linfocitos T por las moléculas HLA-A31.

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TABLA 5 Identificación de péptidos sintéticos con reactividad para los clones de linfocitos T

5

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Ejemplo 14 Caracterización del péptido TRP_{197-205}

Los experimentos de valoración demostraron que 1 nM de péptido era suficiente para estimular la liberación de GM-CSF del clon 4 de los linfocitos T y la estimulación alcanzó una meseta a 500 nM (Fig. 10A). La lisis de los linfocitos B de 586EBV pulsada con TRP_{197-205} por el clon 4 de CTL se determinó también a varias concentraciones de péptido (Fig. 10B) y como en los ensayos de liberación de citocina, la lisis de las células objetivo por el clon 4 de CTL se detectó a una concentración de péptido de 1 nM. La lisis máxima se observó a 100 nM de concentración de péptido. El clon 4 de CTL fue capaz de lisar a 586EBV pulsadas con células tumorales TRP2-p197 y 586 mel incluso a una proporción E:T baja, pero no pudo lisar los linfocitos B de 586EBV solos o pulsados con el péptido de control ORF3P ni con la línea 397 mel negativa a HLA-A31 (Fig. 10).

La mayoría de los antígenos de melanoma humano identificados hasta la fecha son autoantígenos no mutados y el reconocimiento de los linfocitos T y la afinidad de unión de estos autopéptidos para las correspondientes moléculas MHC ha sido en algunos casos mejorada por sustitución de aminoácidos y restos de anclaje. Se prepararon numerosos péptidos sintéticos incluyendo octámeros o decámeros y péptidos modificados como se indica en la Tabla 6 y se probó su reconocimiento por el clon 4 de CTL cuando se pulsaron en los linfocitos B de 586EBV. El decámero TLLGPGRPYR, en el que un aminoácido se extendió al terminal N de TRP_{197-205}, fue reconocido todavía por el clon 4 de CTL cuando se pulsó en los linfocitos B de 586EBV, pero la reactividad fue aproximadamente el 60% de la del nonámero LLGPGRPYR solapante. Basándose en el motivo de unión de HLA-A31, se generaron unos péptidos poco modificados con sustitución de aminoácidos en las posiciones 2 y 9 de los restos de anclaje así como en otras posiciones. El resto Arg en la posición 9 y el terminal C podrían ser sustituidos por el resto Lys y el péptido modificado conservó por lo menos el 60% de la actividad del péptido precursor. La sustitución de un resto de Leu en la posición 2 por restos de Ser, Ile o Val conservó la misma actividad o redujo la actividad al 60% del péptido parental mientras que la sustitución por Ala o Phe en esta posición redujo la capacidad de estimular la liberación de citocina en los linfocitos T (Tabla 6). Otras modificaciones proporcionaron actividad variable del péptido del cáncer en el reconocimiento de los linfocitos T.

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TABLA 6 Comparación de reactividad de linfocitos T de péptidos modificados

6

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La proteína TRP-2 contiene dos supuestos sitios de fijación al cobre, zonas ricas en cisteína y un dominio de transmembrana. Se ha cartografiado el cromosoma 13 de la TRP-2 humana mientras que en la contrapartida del ratón se ha cartografiado el cromosoma 14 en la zona de mutación del color pizarroso del pelo. Existe aproximadamente una identidad de secuencia de aminoácidos del 40% entre TRP-2 y tirosinasa o TRP-1/gp75, pero no se observó ninguna línea ni clon de CTL que reconociera en alto grado un epítopo del péptido común entre la familia de proteínas de la tirosinasa.

El péptido nonámero TRP_{197-205} reconocido por el clon 4 de CTL está situado en una de las zonas de fijación al cobre en la zona de codificación de la TRP-2. Este péptido estimuló muy eficazmente la liberación de citocina de los linfocitos T en comparación con otros péptidos incluyendo los péptidos modificados probados en este estudio. Esto estaba de acuerdo con el motivo de unión a HLA-A31 previsto, lo que indica que Leu en la posición 2 y Arg en la posición 9 son los restos favorables. Aunque Leu en la posición 2 y Arg en la posición 9 podrían ser sustituidos con Ile y Ser en la posición 2 y Lys en la posición 9, respectivamente, con una pérdida pequeña o mínima de reactividad para el reconocimiento de linfocitos T, las sustituciones de aminoácidos en las posiciones 1, 3 ó 6 condujeron a alguna pérdida de reactividad.

Ejemplo 15 Ensayo de tratamiento in vivo

Para el tratamiento in vivo, se expusieron ratones transgénicos MHL-A31^{+} a 1 \times 10^{5} ó 5 \times 10^{5} células de melanoma de ratón Trp-1^{+} B16 por vía intravenosa para crear metástasis pulmonar. Se vacunaron los ratones posteriormente con un péptido del cáncer con expresión de virus recombinante, LLGPGRPYR a 10^{5} PFU/mg de peso corporal. Se practicó la eutanasia a los ratones el día 12 y se determinó el número de metástasis pulmonares en los ratones vacunados frente a ratones los no vacunados.

Ejemplo 16 Inmunoterapia de linfocitos T específicos para el antígeno del cáncer

Los linfocitos T sensibilizados previamente con un antígeno de melanoma puede ser eficaces en el tratamiento terapeútico de mamíferos afectados de melanoma. Los linfocitos T se aislan de la sangre periférica o de suspensiones tumorales de melanoma y se cultivan in vitro (Kawakami et al., 1988, J. Exp. Med. 168:2183-2191).

Los linfocitos T se exponen al péptido del cáncer, LLGPGRPYR a una concentración de 1 \mug/ml solos o en presencia de IL-2, se vuelven a sensibilizar y se extienden en el cultivo. Los linfocitos T expuestos al péptido del cáncer se administran a un mamífero a razón de aproximadamente 10^{9} a 10^{12} linfocitos por mamífero. Los linfocitos se administran ya sea por vía intravenosa, intraperitoneal o intralesional. El tratamiento se puede administrar simultáneamente con otros tratamientos terapeúticos tales como citocinas, excisión quirúrgica de lesiones de melanoma y fármacos quimioterapeúticos.

Ejemplo 17 Tratamiento de pacientes con melanoma metastásico

En este protocolo, se inmunizaron pacientes con melanoma avanzado con el epítopo antigénico del cáncer. Los pacientes seleccionados para la prueba deben presentar pruebas de melanoma mensurable o metastásico evaluable en los que ha fracasado la terapia eficaz estándar. Los pacientes deben presentar tumores que expresen el antígeno de TPI-2 probados por PCR o mediante análisis de transferencia de Northern del ARN de la célula tumoral.

Los pacientes reciben bien 1 ng, 1 \mug, 1 mg o 500 mg/kg de peso corporal de un péptido del cáncer LLGPGRPYR por vía intravenosa el día cero, el día 7 y el día 14 solo o en combinación con IL-2 y/o una molécula co-inmunoestimulante. Se evalúa la toxicidad, los efectos inmunológicos y la eficacia terapeútica en los pacientes.

En los linfocitos extraídos de los pacientes tratados se analiza la respuesta específica al antígeno del cáncer que comprende la secuencia de aminoácidos LLGPGRPYR.

Se define una respuesta completa como la desaparición de toda prueba clínica de enfermedad que dure al menos cuatro semanas. Una respuesta parcial es una disminución del 50% o mayor en la suma de los productos del diámetro perpendicular de todas las lesiones mensurables durante al menos cuatro semanas sin aparición de nuevas lesiones o aumento en alguna de las lesiones. Las respuestas menores se definen como la disminución del 25 al 49% en la suma de los productos de los diámetros perpendiculares de todas las lesiones mensurables sin aparición de nuevas lesiones y sin aumento en alguna de las lesiones. Cualquier paciente con menos de una respuesta parcial se considera que no responde al tratamiento. La aparición de nuevas lesiones o mayores del 25% de aumento en el producto de los diámetros perpendiculares de las lesiones anteriores después de una respuesta parcial o completa se considera una recaída.

Exposición

Se han identificado varios epítopos de linfocitos T antigénicos procedentes del marco de lectura abierto normal de los correspondientes antígenos de melanoma compartidos no mutados, tales como tirosinasa, MART-1/Melan-A y gp100. En este estudio se demostró que el péptido antigénico reconocido por TIL586 procedía de un segundo producto génico del gen gp75. En nuestra opinión, éste es el primer ejemplo en que los linfocitos T reconocen un péptido antigénico procedente de la traducción de un marco de lectura abierto solapante del mismo gen y el único ejemplo en células eucarióticas en el que se pueden traducir dos proteínas y/o péptidos completamente diferentes procedentes de los marcos de lectura abiertos solapantes de un único gen celular. El ORF3 de gen gp75 codifica una proteína corta de 24 aminoácidos. El péptido antigénico reconocido por TIL586 está codificado por la secuencia situada inmediatamente detrás del codón de inicio ATG (294-296) del marco de lectura abierto alternativo.

Aunque gp75 comparte una homología de secuencia del 40 al 45% con la tirosinasa, gp100 y TRP-2, la transfección conjunta de HLA-A31 y tirosinasa, gp100 o los ADNc de TRP-2, respectivamente, en las células COS-7 fue ineficaz para estimular la liberación de GM-CSF en los clones de linfocitos T procedentes de TIL586. Una búsqueda en la base de datos no puso de manifiesto ninguna proteína que tuviera un motivo de unión al péptido HLA-A31 y la homología de secuencia importante en el epítopo del péptido reconocido por TIL586 y sus clones de los linfocitos T derivados. Además, los estudios anteriores demostraron que los transfectantes del melanoma (gp75^{+}/A31^{+}) confirieron la capacidad de estimular la liberación de GM-CSF procedente de TIL586, pero los transfectantes del melanoma de gp75 (gp75^{-}/A31^{+}) no lo hicieron (Wang R.F. et al., J. Exp. Med. 1995, vol. 181:799-804). Similares resultados se obtuvieron con otras líneas celulares (gp75^{-}/A31^{+}). Ya que el péptido ORF3P fue el único epítopo identificado del gen gp75 y fue reconocido por seis clones de linfocito T procedentes de TIL586, este péptido puede ser idéntico o similar al péptido natural procesado en las células tumorales y en los melanocitos. Esto se apoyaba además en los experimentos de inhibición del objetivo frío ya que este péptido fue capaz de competir por el reconocimiento de los linfocitos T con un péptido natural o con células tumorales.

Se publicó que los péptidos del epítopo de los linfocitos T procedentes del desplazamiento del marco de lectura del gen mutado de poliposis coli de la adenomatosis (APC) en el cáncer de colon fueron reconocidos por los CTL generados en ratones BALB/c vacunados (Townsend, A. et al. 1994 Nature 371:662). Los resultados de la Fig. 3 indicaron que se necesitaba ATG en los nucleótidos 294 a 296 para la traducción del producto de 24 aminoácidos que, a su vez, dio lugar al péptido antigénico reconocido por TIL586. TIL586 reconoció todavía el péptido sintético mutado pulsado en los linfocitos B de 586EBV, pero no el gen mutado cuando se transfectó en las células COS-7 junto con el ADNc de HLA-A31, indicando que la pérdida de reconocimiento del gen mutado (ATG en ATC) por TIL586 procedía de la eliminación de la traducción del producto ORF3. Estos resultados más el análisis de la secuencia del ADN regularon la posibilidad de que el péptido antigénico reconocido por TIL586 procediera del producto del desplazamiento del marco de lectura de gp75. Es posible, por lo tanto, que multiples péptidos o proteínas sean traducidos a menudo desde marcos de lectura abiertos solapantes de un único gen eucariótico, pero esto significa que detectar estos productos alternativos no ha estado disponible. La sensibilidad exquisita de los linfocitos T para detectar los péptidos naturales puede poner de manifiesto muchos otros ejemplos de este fenómeno.

El mecanismo por el cual el marco de lectura abierto solapante 3 (ORF3) es traducido in vivo no está actualmente claro. Aunque se han publicado ejemplos de los ARNm celulares que se inician en más de un codón AUG, y que, en algunos casos raros, se inician tanto en el codón AUG como en uno distinto de AUG, tal como CUG, para generar secuencias idénticas extendidas con terminal N, la utilización de marcos de lectura abiertos solapantes (es decir que traducen dos péptidos completamente diferentes) de un solo ARNm celular eucariótico no se han descrito nunca a nuestro entender. Se han descrito varios ejemplos de traducción de marcos de lectura solapantes de un solo ARNm, pero limitados exclusivamente a genes víricos. La detección de los productos de los marcos de lectura solapantes en genes víricos ha sido posible debido a la existencia de anticuerpos reactivos en el suero de huéspedes infectados por virus. En la presente invención se utilizó un análisis de linfocitos T para identificar el péptido del epítopo reconocido por los linfocitos T. Este planteamiento es muy diferente y más sensible que los análisis de inmunoprecipitación o de transferencia de Western convencionales. Aunque existen cinco codones ATG entre el auténtico codón de inicio y el codón de inicio de ORF3, la construcción pPCR110 que abarca la parte N-terminal de ORF1 (gp75), los ORF2 y ORF3 completos (nucleótidos 1 a 667) conservaban todavía la capacidad de estimular la liberación de citocina de TIL586. El nivel de estimulación, sin embargo, fue varias veces inferior que el estimulado por la fórmula 5' truncada (que le falta los primeros 246 nucleótidos) de gp75 (Fig. 1A y 1B), lo que sugiere que los codones ATG corriente arriba pueden tener parcialmente inhibida la expresión de ORF3. Varios factores han hecho posible detectar la expresión del producto ORF3 en este sistema. En primer lugar, los codones ATG corriente arriba que proceden del codón de inicio ATG de ORF3 no parecían estar en el contexto óptimo, que puede permitir utilizar el ATG corriente abajo como codones de inicio por el modelo de identificación averiado. En segundo lugar, la expresión relativamente elevada de los genes transfectados en las células COS-7 y la disponibilidad del ensayo con linfocitos T como medio sumamente sensible puede permitir la detección de muy bajas concentraciones de los productos traducidos.

De forma conveniente, el producto ORF3 fue detectado por los linfocitos T en las células tumorales así como en melanocitos normales (Figuras 6A a 6D), sugiriendo intensamente que la proteína del ORF3 no era un producto génico procedente de alteraciones genéticas en las células tumorales. En los estudios anteriores se demostró que TIL586 reconocía las líneas celulares del tumor múltiple (gp75^{+}/A31^{+}) probadas, lo que sugiere que TIL586 reconoce un antígeno tumoral compartido, no mutado (Wang R.F. et al., ibid). Ya que el gen gp75 está sumamente expresado en melanomas basados en la transferencia de Northern y en análisis de PCR (Wang R.F. et al., Ibid) y su proteína gp 75 del producto génico es la glucoproteína intracelular más abundante expresada en células del melanoma y en melanocitos (Tai, T., Eisinger, M., Ogata, S. y Lloyd, K. O, 1983, Cancer Res. 43:2773-2779; Thomson, T. N., Mattes, J. M.., Roux, L., Old, L. J. y Lloyd, K. O. 1985, J. Invest. Dermat. 85, 169-174; Thomson, T. N., real, F. X., Mutakami, S., Cordon-cardo, C., Old, L.J. y Houghton, A. N. 1988, J. Invest. Dermat. 90, 459-466), no es sorprendente que los clones de los linfocitos T reconocieran el péptido ORF3P cuando se pulsan en linfocitos B de 586EBV (A31^{+}), melanoma (gp75^{+}/A31^{+}) así como melanocitos A31^{+}, pero no células de melanoma gp75/A31^{+} o linfocitos T2 pulsados en células distintas de A31 de ORF3P. Otra posibilidad para explicar la expresión del péptido en células tumorales y en melanocitos es que el ORF3 pueda ser traducido a partir de una(s) transcripción(es) de ARNm independiente(s) generada(s) mediante corte y empalme alternativo del ARNm del gp75 o de un activador diferente. En nuestra opinión, las transcripciones de ARNm generadas por corte y empalme alternativo son traducidas en proteínas isomorfas mediante la utilización de los mismos marcos de lectura abiertos. En nuestro caso, sin embargo, si se generaba una transcripción independiente y se utilizaba como plantilla para la traducción, pero se utilizaba un marco de lectura abierto completamente diferente en comparación con gp75 para traducir el producto ORF3. Se necesitan experimentos adicionales para aclarar los mecanismos de traducción de la proteína ORF3 in vivo. No obstante, estas posibilidades mencionadas anteriormente no son mutuamente exclusivas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTES: EL GOBIERNO DE LOS ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA REPRESENTADO POR EL SECRETARIO DE SANIDAD Y SERVICIOS HUMANOS

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTÍGENO DEL CÁNCER HUMANO DE LAS PROTEÍNAS 1 Y 2 RELACIONADAS CON LA TIROSINASA Y GEN CODIFICADOR DEL MISMO

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 60

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DIRECCIÓN: MORGAN & FINNEGAN, L.L.P.

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(B): CALLE: 345 PARK AVENUE

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(C): CIUDAD: NEW YORK

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(D): ESTADO: NEW YORK

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(E): PAÍS: USA

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(F): CP:10154

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(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: 3,5 PULGADAS, 1,44 MB DE ALMACENAMIENTO

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(B): ORDENADOR: IBM PC COMPATIBLE

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA INFORMÁTICO: WORDPERFECT 5.1

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(vi): DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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(A): FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-FEB-1997

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(vii): DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/599.602

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-FEB-1996

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(vii): DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/725.736

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 04-OCT-1996

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(viii): DATOS DE ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:

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(A): NOMBRE: KATHRYN M. BROWN

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 34,556

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(C): REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO: 2026-4209PC

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(ix): INFORMACIÓN DE CONTACTO:

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(A): TELÉFONO: (212) 758-4800

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(B): FAX: (212) 751-6849

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(C): TÉLEX: 421792

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 471 PARES DE BASES

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(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

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(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

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(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

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(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

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(x): INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:

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(A): AUTORES: COHEN, T.; MULLER, R.M.; TOMITA, Y.; SHIBAHARA, S.

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(B): TÍTULO: SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL ADNc QUE CODIFICA LA PROTEÍNA RELACIONADA CON LA TIROSINASA HUMANA

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(C): REVISTA: NUCLEIC ACIDS RESEARCH

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(D): VOLUMEN: 18

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(E): EDICIÓN: 9

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(F): PÁGINAS: 2807-2808

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(G): FECHA: 11 MAYO 1990

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(H): RESTOS APLICABLES EN LA SEC ID nº:1: DEL 1 AL 471

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:

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7

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 157 AMINOÁCIDOS

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(B): TIPO: AMINOÁCIDO

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(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:

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8

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 129 PARES DE BASES

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(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

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(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

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(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

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(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:

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9

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 43 AMINOÁCIDOS

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(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

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(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:

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10

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 72 PARES DE BASES

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(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

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(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

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(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

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(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:

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11

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 24 AMINOÁCIDOS

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(B): TIPO: AMINOÁCIDO

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(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:

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12

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 24 AMINOÁCIDOS

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(B): TIPO: AMINOÁCIDO

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(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

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(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DENOMINACIÓN/CLAVE: XAA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1 A 2

\vskip0.500000\baselineskip

(C): PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: EXPERIMENTAL

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: XAA = SER O ALA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DENOMINACIÓN/CLAVE: XAA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1 A 2

\vskip0.500000\baselineskip

(C): PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: EXPERIMENTAL

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: XAA = SER O ALA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:

\hskip1cm

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

101

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

102

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 66 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 37 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

105

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

106

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

107

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

108

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

109

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

110

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

111

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

112

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

113

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

114

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

115

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 24

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

116

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 25

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

117

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 26

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 26:

118

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 27

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

119

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

120

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

121

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

122

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

123

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

124

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

125

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

126

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

127

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

128

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

129

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 38

\vskip1.000000\baselineskip

130

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

131

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

132

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

133

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 42

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

134

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

135

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

136

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

137

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2291

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA:DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(x): INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): AUTORES: YOKAYAMA, ET AL.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TÍTULO: CLONACIÓN MOLECULAR Y ANÁLISIS FUNCIONAL DE UN ADNc QUE CODIFICA PARA LA PROTEÍNA RELACIONADA CON LA TIROSINASA 2/DOPACROMO TAUTOMERASA HUMANA

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REVISTA: BIOCHIM. BIOPHSY. ACTA.

\vskip0.500000\baselineskip

(D): VOLUMEN: 1217

\vskip0.500000\baselineskip

(E): EDICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(F): PÁGINAS: 317-321

\vskip0.500000\baselineskip

(G): FECHA: 1994

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

138

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 519

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA:DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(x): INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): AUTORES: YOKAYAMA, ET AL.

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REVISTA: BIOCHIM. BIOPHSY. ACTA.

\vskip0.500000\baselineskip

(D): VOLUMEN: 1217

\vskip0.500000\baselineskip

(E): EDICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(F): PÁGINAS: 317-321

\vskip0.500000\baselineskip

(G): FECHA: 1994

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: PÉPTIDO TRP-2

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1 a 11

\vskip0.500000\baselineskip

(C): PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: POR EXPERIMENTO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: EN EL QUE Xaa PUEDE SER IGUAL O DIFERENTE Y PUEDE SER UNO O MÁS AMINOÁCIDOS

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

139

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA:DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

140

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA:DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 50:

\hskip1cm

141

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA:DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 51:

\hskip1cm

142

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA:DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

143

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA:DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

144

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA:DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

145

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA:DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 55:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

146

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA:DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

147

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA:DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 57:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

148

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA:DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 58:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

149

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: UNA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA:DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: PÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 59:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

150

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: DESCONOCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA:DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: OLIGONUCLEÓTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

151

Claims

1. Péptido del cáncer aislado que comprende una variante de un péptido del cáncer que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 6, en el que la variante presenta por lo menos 85% de identidad de secuencia con SEC ID nº: 6, y en el que la variante estimula los linfocitos T específicos para el antígeno del cáncer.

2. Péptido del cáncer aislado según la reivindicación 1, en el que la variante comprende la SEC ID nº: 6 con una alanina sustituida por una serina en la posición 2 de SEC ID nº: 6.

3. Péptido del cáncer aislado según la reivindicación 1, en el que la variante comprende la SEC ID nº: 9 con una alanina sustituida por una serina en la posición 2 de SEC ID nº: 9.

4. Péptido del cáncer aislado constituido por una secuencia de aminoácidos presentada en SEC ID nº: 9 con una isoleucina sustituida por una metionina en la posición 1 de SEC ID nº: 9 y en el que el péptido del cáncer aislado estimula los linfocitos T específicos para el antígeno del cáncer.

5. Ácido nucleico aislado constituido por una secuencia de nucleótidos que codifica (i) una variante del péptido del cáncer aislado, en el que la variante presenta por lo menos 85% de identidad de secuencia con SEC ID nº: 6, y en el que la variante estimula los linfocitos T específicos para el antígeno del cáncer o (ii) un péptido del cáncer aislado constituido por una secuencia de aminoácidos presentada en SEC ID nº: 9 con una isoleucina sustituida por una metionina en la posición 1 de SEC ID nº: 9 y en el que el péptido del cáncer aislado estimula los linfocitos T específicos para el antígeno del cáncer.

6. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 5, en el que el ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 7, en el que Xaa de SEC ID nº: 7 es Ala.

7. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 5, en el que el ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 8, en el que Xaa de SEC ID nº: 8 es Ala.

8. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico según las reivindicaciones 5 a 7.

9. Vector recombinante que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

10. Virus recombinante que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

11. Virus recombinante según la reivindicación 10, en el que el virus es seleccionado de entre el grupo constituido por retrovirus, baculovirus, virus de Ankara, virus de viruela aviar, adenovirus y virus de vacuna.

12. Virus recombinante según la reivindicación 10 u 11, en el que el péptido del antígeno del cáncer procede de melanocitos.

13. Virus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el ácido nucleico codifica el péptido del antígeno del cáncer que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 7 en el que Xaa de SEC ID nº: 7 es Ala.

14. Virus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el ácido nucleico codifica el péptido del antígeno del cáncer que comprende el amino ácido de SEC ID nº: 8, en el que Xaa de SEC ID nº: 8 es Ala.

15. Célula aislada transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante según la reivindicación 9 o un virus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14.

16. Anticuerpo aislado, o parte de unión al antígeno del mismo, que se une a una variante de un péptido del cáncer constituido por SEC ID nº: 6, en el que la variante presenta por lo menos 85% de identidad de secuencia con SEC ID nº: 6.

17. Anticuerpo aislado o parte de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 16, que une un péptido del cáncer de SEC ID nº: 7.

18. Anticuerpo aislado o parte de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 16, que une un péptido del cáncer de SEC ID nº:9.

19. Anticuerpo aislado o parte de unión al antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

\newpage

20. Anticuerpo aislado o parte de unión al antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

21. Kit que comprende el anticuerpo aislado o la parte de unión al antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20.

22. Kit según la reivindicación 21, comprendiendo además dicho kit reactivos de inmunoensayo estándar.

23. Procedimiento de detección de un péptido del cáncer en una muestra biológica que comprende:

a. poner en contacto la muestra con un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20 en condiciones que formen un complejo inmunitario, y

b. detectar la presencia del complejo inmunitario.

24. Inmunógeno que comprende un péptido del cáncer según las reivindicaciones 1 a 4, solo o en combinación con por lo menos una molécula inmunoestimulante.

25. Inmunógeno según la reivindicación 24, en el que la molécula inmunoestimulante es una molécula MHC.

26. Composición farmacéutica que comprende un péptido del cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, un vector recombinante según la reivindicación 9, un virus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, una célula aislada según la reivindicación 15 o un anticuerpo o una parte de unión al antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, un inmunógeno según la reivindicación 24 ó 25, o una combinación de los mismos, y un portador farmacéuticamente aceptable.

27. Composición farmacéutica según la reivindicación 26, que comprende además una molécula inmunoestimulante seleccionada de entre el grupo constituido por una molécula MHC de clase I, una molécula MHC de clase II, B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-3, CD72, IL-1 a IL-15, TNF\alpha, IFN\gamma, RANTES, G-CSF, M-CSF, IFN\alpha, CTAP III, ENA-78, GRO, I-309, PF-4, IP-10, LD-78, MGSA, MIP-1\alpha, MIP-1\beta y combinaciones de las mismas.

28. Animal transgénico no humano que expresa un péptido del cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

29. Utilización de un péptido del cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, un vector recombinante según la reivindicación 9, un virus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, una célula según la reivindicación 15, un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, solo o en combinación con una molécula inmunoestimulante, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la inhibición o prevención del cáncer en un mamífero.

30. Procedimiento de preparación de un péptido del cáncer recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende:

a. transferir un vector según la reivindicación 9 en una célula húesped, y

b. cultivar la célula húesped en condiciones apropiadas para la expresión del péptido del cáncer, y

c. recoger el péptido del cáncer recombinante.

31. Procedimiento según la reivindicación 30, en el que el vector comprende una secuencia de nucleótido que codifica una molécula MHC de clase I o una parte funcional de la misma.

32. Procedimiento para detectar la presencia de cáncer o precáncer en un mamífero que comprende:

a. poner en contacto un ácido nucleico según las reivindicaciones 5 a 8 con una muestra biológica de prueba de ARNm del mamífero, permitiendo así la formación de un complejo entre el ácido nucleico y el ARNm,

b. comparar la cantidad del producto de transcripción de ORF3 de TRP-1 en la muestra de prueba con una cantidad del producto de transcripción de ORF3 de TRP-1 de una muestra biológica normal conocida, en el que una cantidad incrementada del producto de transcripción de ORF3 de TRP-1 de la muestra de prueba es un indicio de cáncer o precáncer.

33. Procedimiento según la reivindicación 32, en el que el cáncer es un melanoma.