ES2305245T3 - Locus de cadena ligera lambda de raton. - Google Patents
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Abstract
Un ratón en el cual el locus de la cadena ligera lambda del ratón endógeno está funcionalmente silenciada.
Description
Locus de cadena ligera lambda de ratón.
La presente invención se relaciona con los
ratones en los cuales el locus de la cadena ligera (L) endógena de
ratón, \lambda (lambda) y/o el loci de la cadena \lambda y
\kappa (kappa) han sido funcionalmente silenciados, y con los
anticuerpos producidos por tales ratones.
Las células B expresan inmunoglobulinas de
superficie (Ig) tanto con cadena L \kappa (kappa) o \lambda,
una selección la cual determina la exclusión del isotipo. La
proporción de anticuerpos que contienen las cadenas L \kappa o
\lambda varía considerablemente en las diferentes especies pero en
el ratón solamente un pequeño por ciento de anticuerpos expresa
\lambda. Los genes de la cadena L son codificados por dos locis
diferentes, el loci de la cadena L \kappa o \lambda, y el ratón
tiene un extensivo número de genes V (variables) \kappa aguas
arriba del gen 5 J (unión) \kappa y gen \kappa 1 C (región
constante). Aunque el locus \kappa es alrededor de 10 veces mayor
que el locus \lambda, con más de 100 genes V, esta complejidad
extensiva no es considerada como razón de que la mayoría de los
anticuerpos de ratón porten cadena L \kappa. Puede ser que en el
locus de ratón K son simplemente más eficientes los reordenamientos
de ADN lo cual es apoyado por el hallazgo de que en la mayoría de
las células con V \kappa reordenados el locus \lambda está aún
en la configuración de la línea germinal mientras que en la mayoría
de las células que expresan la cadena L \lambda el locus \kappa
es tanto productivamente reordenado o suprimido.
Algunas cepas de ratón con locus de cadena L
\kappa han sido descritos. Ellos fueron generados por integración
homóloga de un gen marcador selectivo en C \kappa o remoción diana
de C \kappa ó J \kappa (ver por ejemplo Zou, X. y otros, 1995,
Eur. J. Immunol 25 (8): 2154-2162). Silenciando la
expresión de la cadena L \kappa se pierde la ligera en la
exclusión del isotipo y la activación de la cadena L y se concluyó
que la expresión de \kappa y \lambda son eventos separados e
independientes. Aunque los ratones homocigotos \kappa^{-/-}
compensan la deficiencia de \kappa con la producción de \lambda
incrementada sus células esplénicas B y células \mu^{+} en la
médula ósea puede ser reducida comparado al ratón normal. Esto puede
sugerir que el reordenamiento y expresión de la cadena L \lambda
es quizás un proceso menos eficiente. Sin embargo, a pesar de la
pérdida de la cadena L \kappa estos ratones son saludables y
pueden mantener una eficiente respuesta inmune.
Durante el desarrollo de las células B los
segmentos de genes que codifican las cadenas Ig H se reordenan
primero por recombinación de D a JH en la etapa de pro células B.
Esto es seguido por recombinación de VH a D-JH en
la etapa de pre B-1 y si una cadena \mu H puede
parearse con la correspondiente cadena L, que consiste en
V_{preB} y proteína \lambda5, esta forma un receptor pre células
B expresado en la superficie (pre BCR) y la etapa de diferenciación
pre B-II. La expresión en la superficie de la célula
del receptor pre BCR induce la proliferación y después algunas
divisiones de las células grandes B II se diferencian en pequeños
restos de células pre B II. La etapa de pre B-II con
una definida relación de células pre B grandes y pequeñas han sido
identificadas por la expresión en la superficie de la cadena
\alpha del receptor IL-2, CD25. En la transición
de pre B II a célula B inmadura el reordenamiento
V-J de la cadena L ocurre donde la correspondiente
cadena L es reemplazada por \kappa ó \lambda. En esta etapa las
células pueden abandonar la médula ósea para diferenciaciones
adicionales en las células del plasma o células de memoria los
órganos linfoides secundarios tales como el bazo o nódulos
linfáticos.
El desarrollo de las células B sin cadenas L no
ha sido completamente dilucidado en el arte anterior. El BCR
consiste en dos cadenas de IgH cada una asociada con una cadena L de
Ig en conjunto con el correceptor Ig\alpha/Ig\beta. Estas 6
cadenas tienen que ensamblarse correctamente en el retículo
endoplasmático (ER) para permitir el transporte y la expresión de
la IgM en la superficie celular para progresar al desarrollo de las
células B. Las células B inmaduras sin cadena L no son mantenidas y
pierden la IgH de la superficie, la expresión de Ig\alpha o
Ig\beta conduce a reducir la señal de una actividad transductora
la cual puede detener la maduración de las células B. La cadena H,
sintetizada antes de la cadena L, es chaperoneada y retenida en el
citoplasma pero si la asociación de la cadena L falla una simple
cadena H, a pesar de las cadenas L, sufre una rápida degradación
intracelular como resultado de un ineficiente transporte desde el ER
a Golgi.
El locus de la cadena ligera lambda \lambda de
ratón tiene alrededor de 200 kb de tamaño y comprende 3 regiones de
genes variables (V) y 4 segmentos de unión (J) aguas arriba de 4
regiones de genes constantes (C), V2 - Vx - J2 - C2 - J4 - C4 - V1
- J3 - C3 - J1 - C1 (Fig. Ia). El silenciamiento de los locus
\lambda es difícil porque la integración homóloga para suprimir o
discapacitar un simple o aún dos genes C \lambda podría no ser
suficiente para prohibir el reordenamiento y expresión de la cadena
ligera \lambda. Para alcanzar esto podría tener que discapacitar
2 regiones C2 y C3-C1 las cuales son de alrededor de
100 kb aparte. C4 es considerada no funcional ya que no ha sido
encontrada proteína. Esto significa que 2 construcciones diana
tienen que ser ensambladas y homólogamente integradas en el mismo
alelo. Una ventaja podría ser el uso de sitios loxP integrados para
permitir la supresión mediada por Cre de los locus completos o la
eliminación de genes funcionales pertinenentes.
Existe por lo tanto la necesidad de producir
ratones en los cuales el locus de la cadena ligera \lambda sea
suprimido. Esto podría también ser atractivo para producir ratones
que pierden las cadenas ligeras funcionales para la producción de
ratones que producen solamente anticuerpos de cadena pesada -la
explotación de ratones que producen anticuerpos humanos-, por
ejemplo, es obstaculizada por el problema de que las cadena L lambda
de ratón se asocian con una gran proporción de Ig humana expresada
(o cadena H).
WO 98/24884 está dirigido a animales
transgénicos no humanos (especialmente ratones) capaces de producir
anticuerpos heterólogos.
El ejemplo 28 de WO 98/24884 es un ejemplo
teórico e hipotético que describe dos posibles estrategias para la
inactivación dirigida de los locus de cadena ligera \lambda:
En la primera estrategia, la supresión de un
segmento grande de 120 kb J\lambda2C\lambda2 a
J\lambda1C\lambda1 usando un reemplazamiento tipo vector diana
y dependiendo de la recombinación homóloga para insertar un marcador
selectivo tal como neo podría ser extremadamente difícil sino
imposible de alcanzar. Aunque la misma estrategia fue reportada
usada exitosamente en WO 98/24884 para lograr la supresión diana de
los locus JH, la secuencia del locus JH a ser suprimida y
reemplazada por el gen neo fue solamente de unos pocos kilobases de
tamaño. La propuesta de extrapolación de esta simple supresión para
la supresión dirigida del segmento de 120kb J\lambda2C\lambda2
a J\lambda1C\lambda1 puede no ser técnicamente alcanzable.
Ciertamente, los inventores creen que nadie ha sido capaz de
silenciar el locus de la cadena ligera de ratón A usando esta
estrategia a pesar de que algunos grupos (de personas expertas) han
intentado hacerlo.
En la segunda estrategia, se sugiere que las dos
regiones, viz. J\lambda2C\lambda2/ J\lambda4C\lambda4 y
J\lambda3C\lambda3/ J\lambda1C\lambda1, podrían ser
independientemente suprimidas en las mismas células del sistema
embrionario (ES) usando vectores diana tipo reemplazo. Otra vez, las
regiones propuestas para la supresión son cada una bastante grandes
y es dudoso que cada supresión pueda ser exitosamente ejecutada. La
probabilidad de ir alcanzando independientemente dos de tales
supresiones en la misma célula ES es aún baja. Otra vez, los
presentes inventores creen que nadie ha sido capaz de silenciar el
locus de la cadena ligera \lambda de ratón usando esta estrategia
a pesar de los intentos que han sido hechos.
La WO 98/24884 no proporciona información
suficiente y necesaria para la persona experta para ejecutar la
invención actualmente reivindicada. La presente invención demuestra,
en primer lugar, la producción actual de un ratón con el locus de
la cadena ligera \lambda silenciado.
La WO 94/02602 describe la producción de
anticuerpos xenogénicos en un huésped no humano, el cual
preferiblemente no es capaz de producir cadenas pesadas de
inmunoglobulinas endógenas y es sustancialmente incapaz de
producir cadenas ligeras de inmunoglobulinas endógenas. Así los
anticuerpos de WO 94/02602 podrían retener alguna actividad de
cadena ligera endógena, ya que los métodos usados para producirlos
son solamente "sustancialmente incapaces" de producir cadenas
ligeras de inmunoglobulinas endógenas. En contraste, los anticuerpos
de la presente invención son producidos por un método que no
produce cadenas ligeras de inmunoglobulinas endógenas, más bien
justamente siendo "sustancialmente incapaz" de hacerlo. Es
más, los métodos generales para producir locis inactivados de
inmunoglobulinas endógenas son completamente insuficientes
describiendo los pasos detallados necesarios para producir
anticuerpos de la presente invención. La WO 94/02602 discute en
términos más generales dos amplias estrategias para la producción
de tales anticuerpos. Como se discutió arriba la presente invención
no es susceptible a tales técnicas de rutina y la supresión exitosa
del loci relevante representa un reto técnicamente significativo.
La WO 94/02602 no provee la información suficiente y necesaria para
las personas expertas para producir anticuerpos de acuerdo a la
presente invención.
La WO 96/33735 destaca el uso de un ratón en el
cual las cadenas ligeras y pesadas están alteradas para la
producción de anticuerpos humanos. Este documento se relaciona con
WO 94/02602 para suministrar un ratón incapaz de producir cadenas
ligeras y pesadas de inmunoglobulinas endógenas (los llamados
"Xenoratones"). Por las mismas razones expuestas arriba este
documento no provee la información suficiente y necesaria a las
personas expertas para ejecutar la presente invención
reivindicada.
Según el primer aspecto de la presente
invención, se proporciona un ratón en el cual el locus de la cadena
ligera \lambda está funcionalmente silenciado. El ratón
transgénico de acuerdo a la presente invención ha sido producido
por primera vez por los presentes inventores. Los usos de tales
ratones son descritos abajo.
El locus estricto de la cadena \lambda
endógena de ratón puede ser suprimido en parte o completamente.
Alternativamente, el locus de la cadena ligera \lambda puede ser
funcionalmente silenciado a través de la supresión de segmentos de
genes que codifican para el locus de la cadena ligera \lambda.
El procedimiento ejemplificado de hacer el locus
de la cadena ligera lambda endógena de ratón no funcional usó dos
estrategias de silenciamiento de todos los genes de las regiones
constantes: 1. integración de un gen marcador selectivo para
discapacitar las regiones de genes constantes individuales y 2.
supresión de genes y locus. Como se describe además en la sección
Experimental abajo, esto produjo dos cepas de ratón KO lambda,
\lambda1.3.2^{-/-}\kappa^{-/-} y
\lambda1-2\Delta^{-/-}\kappa^{-/-}, con
esencialmente las mismas características del locus silente lambda.
El silenciamiento de las cadenas ligeras lambda de ratón verificó
la organización gen/locus y mostró que no participan genes
adicionales parecidos a las cadenas L en el desarrollo de células
B.
En una realización adicional de la invención, el
locus de la cadena ligera \kappa del ratón puede ser
funcionalmente silenciado. Los ratones con eliminación (KO) completa
de la cadena L, por ejemplo locus kappa y lambda silenciados por
genes dianas, mostraron un bloqueo en el desarrollo de las células B
en la etapa cuando la expresión de la cadena L tendría que haber
sido completada. Estos ratones aún producen o expresan cadena \mu
H. Ciertamente, es esperado que estos produzcan repertorios de
cadenas pesadas de anticuerpos. Existe un amplio interés comercial
en tales ratones porque 1) ellos son la primera cepa de ratones con
el locus lambda silenciado y 2) con cruzamientos con las cepas
existentes ellos podrían permitir producir ratones que no expresen
cualquiera de las formas de cadena H o L.
\newpage
En una realización adicional de la invención, el
locus de la cadena pesada del ratón puede ser silenciado por el
método de selección de genes (knock-out).
La \lambda, \kappa y los locis de cadenas
pesadas de ratón pueden ser eliminados o silenciados.
Aún en una realización adicional, los ratones
pueden portar al menos un transgen el cual comprende uno o mas
genes pesados o locis y/o genes de cadena ligera o loci de especies
heterólogas. El ratón puede producir anticuerpos de cadenas pesadas
solamente de especies heterólogas. Las especies heterólogas pueden
ser humanas.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporciona el uso de un ratón como es definido arriba para
producir anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser producidos a través
de procedimientos de inmunización. En una realización preferida,
los anticuerpos son humanos.
También se proporciona un método de producción
de un ratón como se definió arriba en el cual el locus de la cadena
ligera \lambda es funcionalmente silenciado, comprendiendo el paso
de la eliminación de al menos los genes de la región constante C1,
C2 y C3 del locus de la cadena ligera \lambda. El loci de
C2-C4 y el loci C3-C1 pueden ser
eliminados simultáneamente o secuencialmente. En una realización,
son usadas las construcciones diana que se muestran en la
Fig.1.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporciona una construcción diana para producir un ratón en el
cual el locus de la cadena ligera \lambda es funcionalmente
silenciado. La construcción diana es como se mostró en la
fig.1.
También es proporcionado de acuerdo a la
invención el ratón en el cual el locus de la cadena ligera
\lambda es funcionalmente silenciado, con una eliminación de los
genes seleccionados de la cadena \lambda de la siguiente parte de
la región del locus \lambda:
(a) C2 y C3-C1; o
(b) C2-C1 (es decir
C2-C4-C3-C1)
La invención será además descrita en la sección
Experimental abajo con referencias a las figuras acompañantes, en
las cuales:
Figura 1 Muestra la integración diana y la
eliminación de los locus de cadena L \lambda. a, El locus es
\sim200 kb con 2 grupos de genes J-C
(J2-C2 J4-C4 y
J3-C3-J1-C1)
separados \sim110 kb. Dos genes V, V2 y Vx, están localizados
\sim75 kb y \sim56 kb aguas arriba de C2, respectivamente, y V1
está localizado \sim20 kb aguas arriba de C3. La integración
diana de C3-C1 inserta
^{tk}Neo-loxP dentro de C1 y loxP 3'
de J3, esto permite la eliminación de C3, J1 y 5' CI. La
construcción diana C2-C4 inserta
loxP-Neo dentro de C2. Ambas construcciones
diana incapacitan todos los genes C funcionales. Con la eliminación
mediada por Cre la región entre C2-C1 es eliminada.
b, Análisis de la integración diana y eliminación mediada por Cre.
Southern blot del ADN de ratones normales (NM), ADN de células ES
de clones con integración homóloga en C3-C1 (ES3.1)
y C2-C4 (ES2.4), y la eliminación de
C3-C1 (ES3.1\Delta^{+/-} y 3.1\Delta^{-/-})
con digestiones y sondas indicadas (A,B,C,D). El análisis PCR del
ADN de la cola identificó la configuración del locus de la
Ig\lambda antes y después de la eliminación de Cre. Los
oligonucleótidos (1-6, ver debajo) son indicados por
flechas y las bandas resultantes del PCR son el producto de las
combinaciones de oligo usadas indicadas por sombreo. Los sitios de
restricción usados para el análisis son B, BamHI; H, HindIII; R,
EcoRI; S, SacI; X, XhoI; Xb, XbaI;
Figura 2 Muestra el análisis de la citometría de
flujo de a, médula ósea y b, poblaciones de células B esplénicas de
ratones normales (NM),\kappa^{-/-},
\lambda1^{-/-}\kappa^{-/-},
\lambda1.3^{-/-}\kappa^{-/-},
\lambda1.3.2^{-/-}\kappa^{-/-} y
\lambda1-2\Delta^{-/-}\kappa^{-/-.} Los
perfiles son representativos para los resultados obtenidos de al
menos 5 ratones por grupo y muestra teñimiento de los linfocitos de
la médula ósea con c-kit conjugado PE, anti ratón
conjugado con biotina CD43, antiratón conjugado con biotina CD25 o
anti IgM conjugado con biotina en combinación con PE- o anti B220
conjugado APC. Las células del bazo fueron teñidas con anti IgM
conjugado con biotina, anti IgD conjugado con FITC o anti \lambda
conjugado con FITC, y/o anti \kappa conjugado con PE y anti B220
conjugado con APC para el agrupamiento de la puerta de linfocitos
B.
Figura 3 Muestra el teñimiento de la superficie
y citoplasmático de células b de la médula ósea CD25 de
\lambda1-2\Delta^{-/-}\kappa^{-/-} y
ratón normal (NM). A, tinción citoplasmática y separadamente de la
superficie con anti-\mu acoplado con FITC. B, la
separación de las células B de acuerdo a su tamaño.
Figura 4 Muestra el análisis de la citometría
de flujo de células B y T en el peritoneo de ratones
\kappa^{-/-} y
\lambda1-2\Delta^{-/-}\kappa^{-/-}. Las
células fueron teñidas con anti CD5 conjugado con PE y anti B220
conjugado con APC: y
Figura 5 Muestra la separación en gel de los
anticuerpos del suero y citoplasma de
\lambda1-2\Delta^{-/-}\kappa^{-/-} (L KO)
y ratones normales (NM) capturados con
anti-\mu.
Aquí se muestra que los ratones con el loci de
la cadena L silenciados son inmunodeficientes. Estos no producen
células B-1 o B-2 en la periferia y
el desarrollo de las células B está comprometido en la etapa
inmadura de células B con un completo bloqueo en la etapa de
diferenciación cuando el reordenamiento de las cadenas L podría
haber sido completado.
Para analizar la importancia de la expresión de
la cadena ligera (L) para el desarrollo de anticuerpos en ratones
mutantes con eliminación dirigida del locus Ig\lambda fueron
generados y cruzados con ratones portadores de un locus no
funcional Ig\kappa. Silenciamientos sucesivos de los genes de
origen C\lambda y \kappa^{-/-} mostraron una reducción de los
niveles de las células B maduras y animales con los genes de la
cadena L silenciados, ejemplo ratones
\lambda^{-/-}\kappa^{-/-}, no expresan polipéptidos de Ig.
Sus bazos están desprovistos de células B y ninguna de las células
B-1 o B-2 están presentes mientras
el número de células T permanece normal. Las células pro y pre B son
solamente ligeramente reducidas y los niveles de CD25^{+} de las
células pre B-II grandes y pequeñas son
principalmente retenidos. En ratones
\lambda^{-/-}\kappa^{-/-} el desarrollo de células B parece
ser esencialmente no comprometido hasta la etapa inmadura. Sin
embargo, un completo bloqueo es evidente cuando debería ser
completado el reordenamiento de la cadena L, resultando en la
expresión de la IgM de superficie. La pérdida de la cadena L evita
la asociación BCR y la función de la cadena L no puede ser
sustituida (ejemplo por cadena ligera correspondiente). Fue
inesperado que la pérdida de la cadena L no tuviera un profundo
efecto en el desarrollo de las células precursoras, tal como la
acumulación de células pre B-II en la etapa de
transición de las células pre B a células B inmaduras.
Construcciones diana. Una librería de
fagos \lambda derivados de ADN de células ES, un amable obsequio
de A. Smith y T. Rabbitts (Laboratorio de Biología Molecular, MRC,
Cambridge, UK) fue hibridizado con una sonda V\lambda y
C\lambda (clon # 505 amablemente proporcionado por M. Neuberger,
MRC, UK) los cuales identificaron algunos clones conteniendo
V\lambda y separadamente, genes C\lambda. Parte de las regiones
C2-C4 y C3-C1 fueron subclonadas en
pUC19 para ensamblar las construcciones y obtener las sondas de
genes. Esto permitió la inserción del extremo de loxP de
pGEM-30 (Gu, H. y otros, 1993, Cell 73:
1155-1164) en el sitio 3' Hind III de J3, inserción
loxP en ^{tk}Neo (Stratagene, La Jolla, CA) y la inserción
final del extremo de ^{tk}Neo- loxP dentro de C\lambda1,
y loxP-^{tk}Neo, derivado de
pGH-1 (Pgem-30 y
pGH-1 fueron amablemente proporcionados por H. Gu,
Instituto de Genética, Universidad de Colonia, Alemania), dentro de
C\lambda2 (ver figura 1a). Las construcciones diana de 14 kb
C3-C1 fueron obtenidas por digestión XhoI y Hind
III y las construcciones diana de 13kb C2-C4 fueron
obtenidas por excisión XhoI en el sitio interno del polilinker.
Sitios de restricción para la integración de ^{tk}Neo (SacI y
BamHI) o loxP (Hind III) en las construcciones diana no
fueron mantenidas.
Análisis de la integración homóloga. Los
métodos usados para la electroporación de la construcciones diana y
la selección de las células ES han sido descritos (Zou, X. y
otros, 1995, supra). La construcción
C3-C1 fue integrada en HM-1
(Selfridge, J. y otros, 1992, Somat. Cell Mol. Genet.
18:325-336) y C2-C4 fue integrado
en células ES \lambdaES3.1\Delta-5. La diana
C3-C1 fue identificada con fragmentos de Hind III
de 0.4 kb (sonda A, las sondas están marcadas en la figura 1a) y
digestiones SacI, Hind III y BamHI las cuales también permitieron
la identificación de la eliminación de C3-C1
Cre-loxP. La integración homóloga en C2-C4
fue identificada con fragmentos de Hind III-Xbal de
0.7 kb (sonda C, el sitio XbaI está inmediatamente 5' de Salc) y
fragmento Hind III-BamHI de 1.2kb (sonda D), y Hind
III y digestiones BamHI de ADN de células ES. Para obtener la
eliminación del locus \lambda el plásmido Cre pBS 185 (GIBCO,
#10347-011) fue transcientemente integrado por
electroporación (Zou, X. y otros, 1995, supra). Los
clones fueron evaluados por PCR usando los siguientes
oligonucléotidos (flechas 1-6 en la fig. 1a):
Oligos 1-2 y por separado
identificaron la integración de la construcción 4-5
mientras la combinación de oligos 1-3 y
1-4 identificaron parcial o completamente la
eliminación de los genes C. Las reacciones de PCR fueron ejecutadas
bajo las siguientes condiciones: dos ciclos iniciales de 45 segundos
a 97ºC, 30 segundos a 60ºC y 60 segundos a 72ºC seguido por 30
ciclos con 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC y 60 segundos a
72ºC, y 10 minutos para completar la reacción.
Derivación de ratones. La transmisión de
la línea germinal y de ratones quiméricos fue obtenida como se
describe (Hogan, B y otros, 1994a, en Manipulating the mouse embryo,
a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, p253-289. Ratones \lambda1.3, en el
fondo 129/Olax Balb/c, fueron pareados con ratones 129/Ola de 5
generaciones y cruzados con ratones Cre y cada uno para obtener
ratones homocigotos \lambda1.3^{-/-}.A partir de la derivación
de las células ES, los blastocitos fueron colectados y cultivados
en células alimentadoras tratadas con mitomicina C (Hogan, B. y
otros, 1994b, En: Manipulating the mouse embryo, a laboratory
manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
p217-251). Algunas líneas celulares ES fueron
obtenidas y una línea de hembra
\lambdaES3.1\Delta-5, fue usada para la
integración de la construcción diana C2-C4.
Para la derivation de ratones transgénicos que
expresan la proteína Cre de manera ubicua, el plásmido Cre pBS 185
fue linearizado y purificado usando el kit para la purificación de
ADN (Qiagen #28304). El ADN fue microinyectado dentro del pronúcleo
de embriones masculinos F1 (CBAx C57B1/6) de acuerdo a métodos
estándares (Hogan, B. y otros, 1994b, supra) y algunos
fundadores fueron producidos, dos de los cuales mostraron un alto
nivel de eliminación de gen/locus cuando se cruzaron con ratones
loxP.
Análisis de citometría de flujo. Para el
análisis de las poblaciones de células B por citometría de flujo
células de diferentes tejidos fueron preparadas y teñidas con varias
combinaciones de anticuerpos marcados diferentemente contra
marcadores celulares de superficie (ver Fig. 2): estos fueron para
células de la médula ósea antiratón conjugado con PE
c-kit (CD 117) (09995B; PharMingen), Picoeritrina
(PE)- o antiratón CD45R conjugado con aloficocianina (APC) (B220)
(01125A;01129A, PharMingen, San Diego, CA), antiratón CD25
conjugado con Biotina (01092A; PharMingen), monoclonal de rata anti
IgM de ratón conjugado con FITC (cadena \mu específica,
04-6811; Zymed) y/o anti ratón CD43 conjugado con
Biotina (01602D;PharMingen); para células del bazo antiratón CD45R
conjugado con APC (B220) (01125A,01129A; PharMingen), anti IgM de
ratón conjugado con Biotina (cadena \mu específica, 02082D;
PharMingen) anti IgD de ratón conjugado con FITC (02214D;
PharMingen) anti Ig\lambda de ratón (02172D,02174D; PharMingen)
y/o anti Ig\kappa de ratón conjugado con PE (559940, PharMingen):
y para células peritoneales anti CD5 de ratón conjugado con PE
(Ly-1) (01035A; PharMingen) y anti CD45R de ratón
conjugado con APC (B220) (01125A, 01129A; PharMingen).
Para la tinción citoplasmática, células B de la
médula ósea fueron pretratadas usando un kit de permeabilización
celular perm y fix (GSA-004, Caltag) y luego teñidas
con anti IgM de ratón conjugado con FITC (cadena \mu específica,
04-681; Zymed), antiratón CD45R conjugado con PE
(B220) (01125A,01129A; PharMingen) y antiratón CD25 conjugado con
Biotina (01092A; PharMingen) de acuerdo al protocolo del fabricante.
La unión de los anticuerpos biotinilados fue desarrollada con
streptovidina roja cuántica (S2899; Sigma) o streptovidina
tri-color (SA 1006, Caltag, Burlingame).
Análisis de proteínas. Los anticuerpos
del suero fueron identificados por ELISA como se describió (Zou, X.
y otros, 1995, supra). Para la separación en geles de
poliacrilamida los lisados digitoninas de células de la médula ósea
(Bell, S. E. et. al.,1994, EMBO J.13 (4):
816-26) y separadamente, el suero fue incubado por
1 hora a 4ºC con anti IgM de ratón (cadena \mu específica, The
Binding Site, Birmigham,UK) acoplado con Sepharose 4B activada con
CNBr (Pharmacia LKB, Uppsala, Suecia) como se describió (March, S.
C. y otros, 1974, Anal. Biochem. 60: 149-152). Las
muestras fueron fraccionadas en 4-15% de geles
prefundidos (161-1104, Bio-Rad,
Hemel Hempstead, UK) y después transferidos a membranas de
nitrocelulosa, incubados con \mu antiratón bioltinilado
(B-9265,Sigma) durante 1 hora a RT y luego colocadas
en la solución de peróxidasa de rábano con streptovidina
biotiniladas(HRP) (RPN 1051, Amershan) durante 30 minutos en
un zaranda. Las bandas fueron visualizadas con el sustrato
luminiscente SuperSignal West Pico (34080, Pierce, Illinois).
Silenciamiento del locus de las cadena L
\lambda de ratón. Para investigar el desarrollo de las
células B sin la cadena L se produjeron ratones con el locus Ig
\lambda eliminado. Los ratones \lambda^{-/-} fueron cruzados
con animales portando el locus Ig\kappa no funcional, también
obtenidos por genes dianas (Zou, X. y otros, 1995,
supra). El locus de la cadena L \lambda de ratón contiene 3
regiones de genes V (variables), 4 segmentos J (unión) y 4 regiones
de genes C (constantes) los cuales pueden independientemente
reordenarse y expresar 3 cadenas L \lambda diferentes. No se
encontró que C4 fuera expresada. El silenciamiento del locus
\lambda fue llevado a cabo en 4 etapas sucesivas por introducción
de secuencias de 3 loxP y dianas de C1 y C2 (Fig. Ia). La
introducción de construcciones dianas C3-C1
silenciaron C1 y ratones de transmisión a la línea germinal fueron
producidos los cuales, al aparearse con expresores Cre ubiquitios,
tuvieron C3-C1 eliminados en ambos alelos. Tales
ratones, reproducidos dentro del fondo 129/Ola, fueron usados para
la derivación de células embrionarias germinales (ES) con
integración homóloga permitida y silenciamiento de C2. Ratones con
transmisión de la línea germinal fueron obtenidos y se reprodujeron
con expresores Cre y cada uno resultó en animales homocigóticos con
una eliminación de C2 a C1 de \sim120 kb. Análisis de células ES
y ratones por Southern Blot y PCR, con ejemplos representativos
mostraron en la Fig. 1b, la integración homóloga identificada y la
eliminación del locus y resultó en animales separados con los
siguientes genes silenciados a) \lambdaC1^{-/-} (ratón 130 =
ES1.3), b) \lambdaC1^{-/-} y \lambdaC3^{-/-} (ratón 1.3 =
ES1.3\Delta), c) \lambdaC2 ^{-/-} y \lambdaC3^{-/-} (ratón
50 = ES2.4) y c) eliminación de \lambdaC1^{-/-},
\lambdaC2^{-/-}, \lambdaC3^{-/-} y \lambdaC4^{-/-}
(ratón 1.3-2.4\Delta). Estas cepas de ratones
fueron cruzadas dentro del fondo de \kappa^{-/-} y denominadas
de acuerdo a su genes C silenciados o eliminados (\Delta):
\lambda1^{-/-}\kappa^{-/-},
\lambda1.3^{-/-}\kappa^{-/-},
\lambda1.3.2^{-/-}\kappa^{-/-} y
\lambda1-2\Delta^{-/-}\kappa^{-/-}. La
eliminación del locus \lambda fue verificado por secuenciación de
fragmentos de PCR de 686 pb mostrado en la fig. 1b el cual contiene
la región 3'J2 y 3' C1 separadas por loxP.
Reducción de las células B en la eliminación
del gen C \lambda. Los ratones con genes C \lambda
silenciados individualmente en el fondo \kappa^{-/-} mostraron
significativamente números reducidos de células B maduras IgM^{+}
comparadas con los ratones normales mantenidos en las mismas
condiciones libres de patógenos (Tabla 1). Los anticuerpos de suero
en \lambda1^{-/-}\kappa^{-/-}y
\lambda1.3^{-/-}\kappa^{-/-} fueron también reducidos pero
comparables con aquellos en ratones \kappa^{-/-} (Zou, X. y
otros, 1995, supra). Inesperadamente ratones
\lambda1.3.2^{-/-}\kappa^{-/-} y
\lambda1-2\Delta^{-/-}\kappa^{-/-}
derivados de hembras heterocigóticas o madres adoptadas tuvieron
títulos de anticuerpos significativos en el suero aún detectables
por ELISA 6 semanas después del destete. Sin embargo, los análisis
de suero de tales ratones después de 3 meses no mostraron
anticuerpos remanentes (datos no mostrados). La pérdida de Ig de
suero en ratones \lambda1.3.2^{-/-}\kappa^{-/-} confirmó
que C\lambda4 tiene que ser seudogen que los genes V\lambda
remanentes no pueden ser expresados usando un gen C todavía
desconocido. La reducción del nivel de células B en la médula ósea
y el bazo a cada etapa de silenciamiento sucesiva es mostrado en la
Fig. 2 y la Tabla 1. En la médula ósea el desarrollo de las células
pro y pre-B parece estar un poco afectado por la
pérdida de la expresión de la cadena L y los niveles de
c-kit^{+}, las células B CD43^{+}, y CD25^{+} son
bastante similares en las cepas KO y comparadas con los ratones
normales (Fig. 2a). Sin embargo, en la etapa cuando el
reordemaniento de la cadena L debería haber sido completado el
desarrollo normal es bloqueado y las células B inmaduras fallan
para expresar la IgM de superficie. De manera interesante, es
claramente visible una reducción en el número de células que
expresan la IgM de superficie y, comparado al 12% de IgM de
linfocitos B220^{+} en la médula ósea de ratones normales, 4 % son
encontrados en ratones \kappa^{-/-}, 2% en ratones
\lambda1^{-/-}\kappa^{-/-}, 1% en
\lambda1.3^{-/-}\kappa^{-/-} y esencialmente ninguno en
ratones \lambda1.3.2^{-/-}\kappa^{-/-} y
\lambda1-2\Delta^{-/-}\kappa^{-/-}. En el
bazo los niveles de células B Ig^{+} en ratones
\lambda1^{-/-}\kappa^{-/-} y
\lambda1.3^{-/-}\kappa^{-/-} son similares a aquellos en
ratones \kappa^{-/-} mientras que en ratones
\lambda1.3.2^{-/-}\kappa^{-/-} y
\lambda1-2 \Delta\kappa^{-/-} solo una
tinción de fondo es remanente (Fig. 2b).
Para evaluar si las células B B220^{+} en la
médula ósea acumulan cadena H \mu en el citoplasma y si esas
células migran a órganos linfoides secundarios se tiñó para el IsM
citoplasmático. Como se muestra en la figura 3a las células B de la
médula ósea CD25^{+} provenientes de ratones
\lambda1-2\Delta^{-/-}\kappa^{-/-}
ciertamente se tiñen para la cadena H \mu citoplasmática pero no
muestran teñimiento para la IgM de superficie. Ciertamente los
niveles de células B CD25^{+} y su distribución de tamaños es muy
similar en ratones normales y L KO (Fig. 3b). Sin embargo, la
migración de estas células a, por ejemplo, el peritoneo no tiene
lugar y la Fig 4 muestra que esencialmente ninguna células B
existe en los órganos linfoides secundarios. Hubo sorpresa porque
la cadena H \mu identificada en el citoplasma de las células B de
los ratones
\lambda1-2\Delta^{-/-}\kappa^{-/-} es del
mismo tamaño o peso molecular que la cadena H \mu convencional. La
lisis celular usando digitonina y capturando las cadenas H \mu
enlazadas y no enlazadas, analizadas en geles de poliacrilamida
(Fig.5), no mostró diferencias de tamaño de la cadena H \mu
producida en el citoplasma de ratones silenciada de cadena L o
normal. Sin embrago, como se mostró también en la Fig. 5 la Ig de
suero no es producida por esos ratones. Esto
re-enfatiza que el desarrollo de las células B y la
expresión de la cadena H \mu hasta la etapa cuando las cadenas L
son expresadas parece no ser ampliamente afectada en ratones KO de
cadena L. Además, la pérdida de la cadena L evita la liberación de
la cadena H \mu desde la célula lo cual evita la secreción de
Ig.
Bloqueo en el desarrollo en la etapa de
células B inmaduras. El silenciamiento de los genes de la
cadena L \lambda en el fondo de \kappa^{-/-} mostró que no es
producida Ig secretada ni de superficie y que el bloqueo resultante
en el desarrollo de las células B está establecido en la fase de
transición de preB II a inmadura. En esta etapa la expresión de
CD25 es revocada, el pre BCR es reemplazado por el BCR, la cadena L
no es expresada y el reordenamiento de la cadena L \kappa o
\lambda es completado con la expresión exitosa que permite la
asociación de la cadena H \mu. Después de algunas divisiones las
células pre B-II de CD25^{+} grandes se
diferencian en células pre B-II que mantienen
CD25^{+} pequeños las cuales están en el proceso de
reordenamiento de sus genes de cadena L. Como puede ser observado en
la Fig. 2a el número de células CD25^{+}B220^{+} en la etapa
inmediatamente antes del bloqueo desarrollado es muy similar. Como
el reordenamiento exitoso de la cadena L es evitado o impedido en
los ratones mutantes hubo sorpresa porque este bloqueo altera la
relación de células CD25^{+} pequeñas y grandes. En la Fig.3b el
número de células de la médula ósea CD25* de ratones
\kappa^{-/-} y
\lambda1-2\Delta^{-/-}\kappa^{-/-},
normales de edad similares trazado contra el tamaño celular. La
comparación muestra ligeras variaciones como se esperaba pero no
diferencias importantes en las poblaciones de células pre
B-II grandes y pequeñas. Esto concluye que la falla
para expresar cadenas L inicia un completo bloqueo en el desarrollo
de la etapa de células B inmaduras cuando la IgM de superficie
debería ser expresada. Además no se acumulan células B inmaduras
antes del evento.
Este bloqueo en el desarrollo con recobrados no
evidentes impide la expresión IgM de superficie superficie y la
subsecuente migración celular. Como se muestra en la Tabla 1 el
número de células del bazo en ratones
\lambda1.3.2^{-/-}\kappa^{-/-} y
\lambda1-2\Delta^{-/-}\kappa^{-/-} es
significativamente reducida. Una pérdida completa de las células B
maduras es también encontrada en la cavidad del peritoneo con
células no B 220^{+} y B 220^{+}CD5^{+}. (Fig.4). Esta pérdida
de células B-1 y B-2 parece no tener
efecto en los niveles de células T las cuales son mantenidos.
Los experimentos mostraron que el desarrollo de
las células B es abortado en los ratones con la eliminación de la
cadena L en la etapa de transición de células B pre BII a inmaduras
cuando la expresión del receptor de superficie debería haber sido
lograda. Este completo bloqueo en el desarrollo evita la maduración
de las células B y el ratón es inmunodeficiente con respecto a las
células B que expresan anticuerpos. La cadena L correspondiente
codificada por VpreB y \lambda5 no sostiene el desarrollo de
células B y con la falla para expresar polipéptidos de la cadena L
la diferenciación de células B cesa exactamente en la etapa cuando
el reordenamiento de la cadena L debería haber sido completado. Esto
reenfatiza la importancia de la cadena L para el desarrollo inmune
y que, al menos en el ratón, no hay gen o eventos de rescate que
puedan compensar la deficiencia de la cadena L.
El desarrollo de las células B en el ratón ha
sido ampliamente estudiado por la selección de genes y uno de los
primeros experimentos una exon transmembrana \mu fue declarada no
funcional lo cual evita la expresión de IgM de superficie. Esta
\muMT KO causó un bloqueo en el desarrollo conduciendo a la
acumulación de células pre B-I y la desaparición de
células pre B-II. Con la pérdida de la expresión de
la IgM de superficie no fue obtenida proliferación o diferenciación
en las células B inmaduras o maduras, sin embargo, el reordenamiento
de ADN fue mantenido. Ciertamente los ratones \muMT reordenan los
genes de cadenas H y L mientras que los ratones KO de cadena H sin
segmentos J mantienen el reordenamiento de la cadena L. Esto está de
acuerdo con los resultados de los ratones
\lambda^{-/-}\kappa^{-/-} los cuales muestran reordenamiento
de la cadena H y la expresión citoplasmática de Ig\mu lo que
reitera que la expresión y el reordenamiento de las cadenas H y L
son eventos independientes. La importancia crítica del BCR en la
progresión normal y señalización del desarrollo a través de las
señalización etapas de maduración de las células B fue además
analizado por la selección de genes de componentes individuales
BCR. Los resultados mostraron que el silenciamiento de algunos
genes, tal como el locus de la cadena L Ig\kappa, tuvo un efecto
moderado en el desarrollo de las células B y es bien tolerado
mientras que la función de otros genes, tales como C\mu o
Ig\beta, es esencial y bloquea cualquier progreso en el
desarrollo. El bloqueo en el desarrollo de las células B fue
frecuentemente acompañado por la acumulación de células antes de la
etapa de diferenciación cuando el gen silenciado debería estar
activo. Sorprendentemente esto no fue observado en ninguna etapa de
células B pre o pro en ratones \lambda^{-/-}\kappa^{-/-} y
los números de células B grandes y pequeñas CD25^{+}
inmediatamente antes del bloqueo en el desarrollo son similares a
aquellos encontrados en ratones normales. Una razón para esto puede
ser que las células que entran a la etapa de pre
B-II y aquellas apoptóticas, quizás la mitad de las
células CD25^{+} generadas en la médula ósea mueren sin madurar
en células B IgM^{+}, permitiendo mantener los niveles de células
bastante constantes.
La importancia de la expresión de la cadena L ha
sido estudiada en ratones KO RAG-1 y
RAG-2 donde el desarrollo de células B es detenido
en la etapa de células pro B B220^{+}CD43^{+}. Con la
introducción de un reordenamiento de la cadena H Ig\mu fue
expresado en el citoplasma lo cual está de acuerdo con la
observación de que la cadena L facilita la disociación de la
proteína de unión de la cadena H y el transporte a la superficie
celular. Sin embargo, para dirigir el desarrollo de la población
celular de la línea B en ratones RAG^{-/-} ambos reordenamioentos
de los genes de las cadenas H y L tuvieron que ser introducidos. En
la médula ósea de ratones
RAG-1^{-/-}\lambda5^{-/-}que portan una
transmisión de cadena H reordenada de células pro B a apre B y la
expresión de la IgM de superficie fue solamente observado cuando
ambos \lambda5 o una cadena L reordenada fueron introducidos.
Nussenzweig y colaboradores argumentaron que cuando ninguna cadena
L convencional ni \lambda5 son expresadas el desarrollo de las
células B no puede proceder pasada la etapa de células pro B. Esto
no ha sido observado en los ratones con el locus de la cadena ligera
\lambda y \kappa silenciados donde el desarrollo de las células
B permite la expresión de la cadena pesada y el progreso
desarrollado a la etapa de células pre B-II.
Las células fueron teñidas con anticuerpos
pertinentes de para las características listadas (ver Materiales y
Métodos) y analizadas
Los números de células totales fueron
determinados por tinción con Tripán Blue * Las células fueron
provenientes de un fémur.
Claims (17)
1. Un ratón en el cual el locus de la cadena
ligera \lambda del ratón endógeno está funcionalmente
silenciada.
2. El ratón de acuerdo a la reivindicación 1 en
el cual el locus de la cadena ligera \lambda está eliminado en
parte o completamente.
3. El ratón de acuerdo a la reivindicación 1 o
la reivindicación 2 en el cual el locus de la cadena ligera
\lambda es funcionalmente silenciado a través de la eliminación de
segmentos de genes que codifican para el el locus de la cadena
ligera \lambda.
4. El ratón de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el cual el locus de la cadena ligera
\kappa está funcionalmente silenciado.
5. El ratón de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el cual el locus de la cadena pesada
es silenciado por un método de selección de genes
(Knout-out).
6. El ratón de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el cual el loci de la cadena pesada
y \lambda, \kappa ha sido eliminados o silenciados.
7. El ratón de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que porta al menos un transgen el cual
comprende uno o mas genes pesados o loci y/o genes de cadenas
ligeras o loci de especies heterólogas.
8. El ratón de acuerdo a la reivindicación 7,
donde el ratón produce anticuerpos solamente de cadena pesada de
especies heterólogas.
9. El ratón de acuerdo a la reivindicación 7 o a
la reivindicación 8 donde la especie heteróloga es el humano.
10. Uso de un ratón como es definido en
cualquiera de las reivindicaciones precedentes para producir
anticuerpos.
11. El uso de acuerdo a la reivindicación 10
donde los anticuerpos son producidos a través de procedimientos de
inmunización.
12. El uso de acuerdo a la reivindicación 10 o
la reivindicación 11 donde los anticuerpos son humanos.
13. La combinación de dos construcciones diana
capaces de producir un ratón en el cual el locus de la cadena
ligera \lambda está funcionalmente silenciado, la primera
construcción diana siendo de alrededor de 14kb y en la cual un
sitio loxP está insertado en el sitio 3' Hind III de la región J3 y
en el cual el ^{tk}Neo-loxP está insertado en
C\lambda1, y la segunda construcción diana siendo de alrededor de
13kb y en la cual el loxP-^{tk}Neo está insertado
en la región C\lambda2.
14. Un método para producir un ratón como se
definió en la reivindicación 1 en el cual el locus de la cadena
ligera \lambda está funcionalmente silenciado, comprendiendo el
paso de eliminación de al menos los genes de las regiones
constantes C1, C2 y C3 del locus de la cadena ligera \lambda.
15. El método de la reivindicación 14 donde el
loci C2-C4 y C3-C1 son eliminados
simultáneamente o secuencialmente.
16. El método de acuerdo a la reivindicación 14
o la reivindicación 15, dicho método usa las construcciones diana
de la reivindicación 13.
17. El ratón de acuerdo a la reivindicación 1,
el cual tiene una eliminación de los genes de la cadena ligera
\lambda seleccionados de las siguientes parte de la región del
locus \lambda.
(a) C2 y C3-C1; o
(b) C2-C1 (es decir
C2-C4-C3-C1).
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