KR20220008839A - 결합 분자 - Google Patents

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콜레트 존스턴
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Abstract

본 개시내용은 인간 혈청 알부민에 결합하는 단일 도메인 항체, 및 이러한 단일 도메인 항체를 사용하여 치료용 분자의 반감기를 연장하는 방법에 관한 것이다.

Description

결합 분자
단백질 및 펩티드의 약동학은 흡수, 생체분포, 대사 및 제거의 파라미터에 의해 좌우된다. 단백질 및 펩티드에 대한 가장 일반적인 청소 (clearance) 경로는 큰 단백질의 경우 세포내이입 (endocytosis) 및 간 간세포 (liver hepatocytes)에 의한 막-수송 매개 청소 (membrane transport-mediated clearance)를 포함하고, 작은 단백질 및 펩티드의 경우 신장에 의한 사구체 여과 (glomerular filtration)를 포함한다.
치료 및/또는 진단 목적에 유용할 수 있는 활성을 가진 많은 약물은 투여되는 경우 신체로부터 빠르게 제거되기 때문에 제한적인 가치를 갖는다. 예를 들어, 치료적으로 유용한 활성을 가진 많은 폴리펩티드는 신장을 통해 순환계로부터 빠르게 청소된다.
따라서, 원하는 치료 효과를 얻기 위해서는 다량으로 투여되어야 한다. 개선된 약동학적 특성을 가진 개선된 치료제 및 진단제에 대한 필요성이 존재한다.
그러므로 더 작은 단백질 및 펩티드의 약동학을 개선하기 위해, 단백질 또는 펩티드의 크기 및 유체역학적 반경의 증가, 표적 단백질 또는 펩티드의 음전하의 증가, 또는 알부민에의 결합을 통한 펩티드 또는 단백질의 혈청 단백질 결합 수준의 증가를 포함하는 다양한 전략이 사용되었다. 이는 생물학적으로 활성인 단백질 또는 펩티드의 인간 혈청 알부민 (human serum albumin: HSA)에의 융합, 인간 면역글로불린 (Ig) G의 불변 단편 (Fc) 도메인에의 융합, 또는 비-구조화된 폴리펩티드 (non-structured polypeptides) 예컨대 XTEN에의 융합을 포함한다 (Reviewed in Stroh "Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologics as a Strategy to Make Biobetters BioDrugs". 2015; 29(4): 215-239).
적용이 상이하면 다른 반감기를 필요로 하므로, 맞춤형 반감기 연장 분자를 제공해야 할 필요성이 여전히 존재한다. 본 발명은 이러한 필요성을 해결하기 위한 것이다.
본 발명은 HSA에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체, 특히 인간 면역글로불린 단일 가변 중쇄 도메인 항체, 예컨대 구체적으로 재배열되지 않은 인간 V, D, J 유전자 세그먼트를 발현하는 유전자이식 마우스로부터 수득되거나 또는 수득 가능한 인간 면역글로불린 단일 가변 중쇄 도메인 항체에 관한 것이다.
일 양상에서, 본 발명은 서열번호: 1 또는 이에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95%의 상동성을 갖는 서열, 서열번호: 30 또는 이에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95%의 상동성을 갖는 서열, 또는 서열번호: 5 또는 이에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95%의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는, HSA에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호: 1의 변이체이고 서열번호: 1과 비교하여 1 내지 20개의 아미노산 치환을 갖는, HSA에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호: 5의 변이체이고 서열번호: 5와 비교하여 1 내지 20개의 아미노산 치환을 갖는, HSA에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 또한 단백질의 반감기를 연장하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 단백질을 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인에 결합시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체가 융합 단백질에서 치료용 모이어티에 연결되는 경우 상기 치료용 모이어티의 반감기를 연장하는데 있어서 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 용도에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체 또는 본원에 기재된 단백질 또는 구조체를 포함하는 약학적 조성물 (pharmaceutical composition)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열 (nucleic acid sequence)에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 핵산 서열을 포함하는 벡터 (vector)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 핵산 서열 또는 본원에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포 (host cell)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체, 또는 본원에 기재된 단백질 또는 구조체, 또는 본원에 기재된 약학적 조성물을 포함하는 키트 (kit)에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 중쇄 단독 항체, 또는 본원에 기재된 인간 HSA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 인간 면역글로불린 단일 도메인 항체를 포함하는 결합 분자를 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 도메인은 인간 VH 도메인이고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 유전자이식 마우스를 HSA 항원으로 면역화하는 단계로서, 상기 마우스는 인간 중쇄 V 유전자를 포함하는 핵산 구조체를 발현하고, 기능적 내인성 경쇄 또는 중쇄를 생성할 수 없는 것인 단계,
b) 상기 마우스로부터 VH 도메인 서열을 포함하는 서열 라이브러리를 생성하는 단계; 및
c) 상기 라이브러리로부터 VH 도메인 서열을 포함하는 서열을 단리하는 단계.
본 발명은 하기 비-제한적인 도면에서 추가로 예시된다.
도 1. 필리핀 원숭이 (cynomolgus macaque)에서 3 mg/kg의 TPP-1246의 단일 i.v. 투여 후에 혈청 수준.
본 발명의 구체예가 추가적으로 기재될 것이다. 하기에, 다양한 구체예가 기재된다. 정의된 각 양상은 명확하게 반대로 지시하지 않는 한 임의의 다른 양상 또는 양상들과 조합될 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 병리학, 종양학, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법 및 이들의 기술은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 통상적으로 사용되는 것이다. 본 개시내용의 방법 및 기술은 달리 지시하지 않는 한, 일반적으로 당해 분야에 잘 알려져 있는 기존의 방법, 및 본 명세서를 통해 인용되고 토의된 다양한 일반적 및 보다 구체적인 참조문헌들에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들면, Green and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, Zhiqiang An (Editor), Wiley, (2009); 및 Antibody Engineering, 2nd Ed., Vols 1 and 2, Ontermann and Dubel, eds., Springer-Verlag, Heidelberg (2010)를 참조한다.
효소 반응 및 정제 기술은 당해 분야에서 통상적으로 수행되거나 또는 본원에 기재된 바와 같이 제조자의 명세서에 따라 수행된다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 이의 실험 절차 및 기술은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 통상적으로 사용되는 것이다. 화학 합성, 화학 분석, 의약품 제조, 제제화, 및 전달, 및 환자 치료에 대한 표준 기술이 사용된다.
본 발명은 인간 혈청 알부민 (HSA)에 결합하는 아미노산 서열, 및 이러한 아미노산 서열을 포함하는 결합 분자 예컨대 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 본원에 기재된 아미노산을 가지며, 본원에 기재된 치료 방법 및 용도뿐만 아니라 약학적 제제에 활용될 수 있는 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 단일 도메인 항체에 관한 것이다.
본원에 기재된 단일 도메인 항체는 야생형 인간 혈청 알부민 (UniProt 수탁번호 Q56G89)에 특이적으로 결합한다. 야생형 인간 혈청 알부민에 대한 아미노산 서열은 서열번호: 9에 제시되어 있다.
인간 혈청 알부민 (HSA, 2BXN)은 혈장 단백질의 약 60%를 차지한다. HSA는 3개의 상동 도메인 (I, II 및 III)을 포함하는, 585개의 아미노산 길이의 단일 사슬로 구성된다. 도메인 I은 잔기 5-197로 구성되고, 도메인 II는 잔기 198-382를 포함하며, 도메인 III은 잔기 383-569로부터 형성된다. 각 도메인은 A 및 B라고 하는 2개의 서브-도메인 (sub-domains)으로 이루어진다 (IA; 잔기 5-107, IIA; 잔기 108-197, IIA; 잔기 198-296, IIB; 잔기 297-382, IIIA; 잔기 383-494, IIIB; 잔기 495-569).
관심 항원, 예컨대 인간 혈청 알부민에 "결합하거나" 또는 "결합할 수 있는" 본 발명의 단일 도메인 항체 (sdAb), 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 단백질은 상기 항원에 충분한 친화도로 결합하는 것이므로, 상기 단일 도메인 항체는 본원에 기재된 항원인 인간 혈청 알부민을 발현하는 세포 또는 조직을 표적으로 하는 치료제로서 유용할 수 있다.
본원에 기재된 단일 도메인 항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 단백질은 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합한다. 즉, 인간 혈청 알부민 항원에의 결합은 비-특이적 상호작용과는 현저하게 상이하다. 실시예에서 입증된 바와 같이, 상기 단일 도메인 항체는 마우스 인간 혈청 알부민과 교차 반응하지 않는다. 바람직하게는, 상기 단일 도메인 항체는 실시예에 개시된 바와 같이 인간 혈청 알부민에 결합하고, 또한 원숭이 혈청 알부민에 결합한다.
본원에서 사용된 용어 "항체 (antibody)"는, 4개의 폴리펩티드 사슬인, 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)로 이루어진, 임의의 면역글로불린 (Ig) 분자, 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 Ig 분자의 필수 에피토프 결합 특성 (epitope binding features)을 유지하는, 이의 임의의 기능적 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 지칭한다.
전장 항체에서, 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 또는 도메인 (본원에서 HCVR로 약칭) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 상기 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인인, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 또는 도메인 (본원에서 LCVR로 약칭) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 상기 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인 CL로 이루어진다.
상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 프레임워크 영역 (framework regions: FR)으로 불리는, 좀 더 보존되는 영역에 배치된 상보성 결정 영역 (complementarity determining regions: CDR)으로 불리는 초가변 (hypervariability) 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지고, 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 하기 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
면역글로불린 분자는 임의의 타입 (예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2) 또는 서브클래스 (subclass)를 가질 수 있다. 용어 "CDR"은 항체 가변 서열들내 상보성-결정 영역을 지칭한다. 상기 중쇄 및 경쇄의 각 가변 영역에는 3개의 CDR이 있으며, 이는 상기 각 가변 영역에 대해서 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 나타낸다. 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역에서 나타나는 3개의 CDR의 그룹을 지칭한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 당해 분야에 알려져 있는 다양한 시스템에 따라 상이하게 정의될 수 있다.
Kabat 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성에 기반하며, 가장 일반적으로 사용된다 (Kabat et al., (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 and Kabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Chothia refers instead to the location of the structural loops (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901 -917 (1987)). 상기 Kabat 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인에서 잔기 (대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 언급할 때 사용된다. 다른 시스템으로는 ImMunoGeneTics (IMGT) 넘버링 체계이다. 상기 IMGT 넘버링 체계는 Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005)에 기재되어 있다.
Kabat에 의해 개시된 시스템이 본원에서 사용된다. 용어 "Kabat 넘버링 (Kabat numbering)", "Kabat 정의 (Kabat definitions)" 및 "Kabat 라벨링 (Kabat labeling)"이 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 당해 분야에서 인정되는 이들 용어들은 항체 또는 항원 결합 부분의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기들보다 더 많이 가변하는 (즉, 초가변) 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 지칭한다.
용어 "항원 결합 부위 (antigen binding site)"는 항원에 특이적으로 결합하는 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편의 일부를 지칭한다. 항원 결합 부위는 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 항원 결합 부위는 전형적으로 항체 또는 항체 단편의 관련된 VH 및 VL 내에 포함된다.
항체 단편은 항체의 일부, 예를 들어 F(ab')2, Fab, Fv, scFv, 중쇄, 경쇄, 가변 중쇄 (VH), 가변 경쇄 (VL) 도메인 및 유사물이다. 전장 항체의 기능적 단편은 전장 항체의 표적 특이성을 유지한다. 그러므로 재조합 기능적 항체 단편, 예컨대 Fab (단편, 항체), scFv (단쇄 가변 사슬 단편) 및 단일 도메인 항체 (dAb)가 mAb에 기반한 치료제에 대한 대안으로서 치료제를 개발하는데 사용되었다.
scFv 단편 (~25kDa)은 2개의 가변 도메인인, VH 및 VL로 구성된다. 본래, VH 및 VL 도메인은 소수성 상호작용을 통해 비-공유적으로 결합되고, 해리되는 경향이 있다. 그러나 상기 도메인을 친수성 가요성 링커와 연결하여 단쇄 Fv (scFv)를 형성함으로써 안정한 단편이 조작 (engineered)될 수 있다.
최소 항원 결합 단편은 단일 가변 단편, 즉 가변 중쇄 (VH) 또는 가변 경쇄 (VL) 도메인이다. VH 및 VL 도메인은 각각 항원에 결합할 수 있다. 경쇄/중쇄 파트너에의 각 결합 또는 실제로 전장 항체의 다른 부분의 존재는 표적 결합에 요구되지 않는다. 크기가 하나의 단일 도메인 (VH 또는 VL 도메인에 해당함)으로 감소된 항체의 항원-결합 엔티티 (antigen-binding entity)는 일반적으로 "단일 도메인 항체" 또는 "면역글로불린 단일 가변 도메인"으로서 지칭된다. 따라서 단일 도메인 항체 (~12 내지 15 kDa)는 VH 또는 VL 도메인을 가지며, 즉 이는 전장 항체의 다른 부분은 갖지 않는다. 인간 중쇄 도메인을 갖는 단일 도메인 항체뿐만 아니라 본래 경쇄가 없는 카멜리드 (camelid) 중쇄 단독 항체 유래의 단일 도메인 항체가 개시되어 있다. 항원 결합 단일 VH 도메인은 또한 예를 들어 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 게놈 DNA로부터 증폭된 뮤린 (murine) VH 유전자 라이브러리로부터 동정되고, 대장균 (E. coli)에서 발현되었다 (Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546). Ward 등은 "도메인 항체"의 경우 단리된 단일 VH 도메인을 "dAb"라고 명명하였다. 용어 "dAb"는 일반적으로 항원에 특이적으로 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인 (VH, VHH 또는 VL) 폴리펩티드를 지칭한다. 치료에 사용하는 경우, 인간 단일 도메인 항체는 카멜리드 유래의 VHH보다 바람직하며, 이는 환자에게 투여되는 경우 면역 반응을 유발할 가능성이 없기 때문이다.
용어 "단일 도메인 항체, 단일 가변 도메인 또는 면역글로불린 단일 가변 도메인 (ISV)"은 모두 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 표적 항원에 결합하는 항체의 단일 가변 단편을 서술한다. 이들 용어는 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. "단일 중쇄 도메인 항체, 단일 가변 중쇄 도메인, 면역글로불린 단일 중쇄 가변 도메인 (ISV), 인간 VH 단일 도메인"은 경쇄 또는 다른 항체 단편이 부재한 항원에 대해 결합 특이성을 유지하는 항체의 단일 중쇄 가변 단편을 서술한다. 단일 가변 중쇄 도메인 항체는 전장 항체의 임의의 다른 사슬을 포함하지 않으며; 이는 임의의 경쇄 또는 불변 도메인을 갖지 않는다. 따라서, 이는 경쇄가 부재한 항원에 결합할 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 인간 혈청 알부민에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다. 하기에서 설명되는 바와 같이, 본 구체예는 HSA 항원에 결합하는 단일 가변 중쇄 도메인 항체 /면역글로불린 단일 가변 중쇄 도메인에 관한 것이다. 따라서, 상기 단일 가변 중쇄 도메인 항체는 경쇄가 부재한 HSA에 결합할 수 있다. 인간 단일 가변 중쇄 도메인 항체 ("VH 단일 도메인 항체/ 단일 VH 도메인 항체")가 특히 바람직하다. 이러한 결합 분자는 또한 본원에서 Humabody®라고 한다. Humabody®는 Crescendo Biologics Ltd의 등록 상표이다.
따라서, 일부 구체예에서, 상기 단리된 결합제/분자는 적어도 하나의 단일 도메인 항체를 포함하거나 또는 이로 구성되며, 상기 도메인은 인간 면역글로불린 가변 중쇄 도메인이고; 이들은 VL 도메인 또는 다른 항체 단편이 없으며, 표적 항원에 결합한다.
용어 "단리된 (isolated)"은 모이어티가 이의 자연 환경으로부터 단리되는 것을 지칭한다. 예를 들어, 용어 "단리된 (isolated)"은 다른 단일 도메인 항체, 항체 또는 항체 단편이 실질적으로 부재하는 단일 도메인 항체를 지칭한다. 더욱이, 단리된 단일 도메인 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 부재할 수 있다.
각 VH 도메인 항체는 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함하며, 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 하기 순서로 배열된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 따라서, 본 발명의 일 구체예에서, 상기 도메인은 하기 식 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 갖는 인간 가변 중쇄 (VH) 도메인이다.
C 또는 N-말단 VH 프레임워크 서열에 대한 변형이 본 발명의 단일 도메인 항체에 대해 수행되어 이들의 특성을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 VH 도메인은 C- 또는 N-말단 연장부를 포함할 수 있다. C-말단 연장부가 잔기 VTVSS (서열번호: 10)로 종결되는 VH 도메인의 C-말단 단부에 부가될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 단일 도메인 항체는 1 내지 50개의 잔기, 예를 들어 1 내지 10개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 1-20개, 1-30개 또는 1-40개의 추가 아미노산의 C-말단 연장부를 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 단일 도메인 항체는 인간 CH1 도메인의 추가 아미노산을 포함하여, C 말단 단부가 CH1 도메인으로 연장된다. 예를 들어, C-말단 연장부는 중성, 비극성 아미노산, 예컨대 A, L, V, P, M, G, I, F 또는 W, 또는 중성 극성 아미노산 예컨대 S 또는 T를 포함할 수 있다. C-말단 연장부는 또한 펩티드 링커 또는 태그로부터 선택될 수 있다. 또한, C 또는 N-말단 잔기는 예를 들어 본 발명의 단일 도메인 항체를 다른 모이어티에 접합시키는데 사용되는 펩티드 링커, 또는 상기 분자의 검출을 돕는 태그일 수 있다. 이러한 태그는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 링커 His 태그, 예컨대 헥사-His (HHHHHH, 서열번호: 11) 또는 myc 태그를 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "상동성 (homology)" 또는 "동일성 (identity)"은 일반적으로, 서열들을 정렬시킨 후에, 일부 구체예에서, 최대 상동성 퍼센트를 수득하기 위해서 필요하다면 갭 (gap)을 도입한 후에, 아미노산 잔기가 비교되는 참조 폴리펩티드의 잔기와 서열에서 동일한 퍼센트를 나타내며, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환은 고려하지 않았다. 따라서, 2개의 아미노산 서열들 간의 상동성 퍼센트는 2개의 서열들 간의 동일성 퍼센트와 동등하다. N- 또는 C-말단 연장부, 태그 또는 삽입 어느 것도 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되어서는 안된다. 상기 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램이 잘 알려져 있다. 2개의 아미노산 서열들 간의 동일성 퍼센트는 잘 알려져 있는 수학적 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 기재된 단일 도메인 항체의 가변 도메인은 전장 (fully) 인간 또는 실질적으로 전장 (substantially fully) 인간이다. 본원에서 사용된 용어 VH 도메인 항체는 단일 인간 가변 중쇄 도메인 항체를 나타낸다 (카멜리드 중쇄 도메인을 나타내는 VHH와 반대됨). 본원에서 사용된, 인간 VH 도메인은 전장 인간 또는 실질적으로 전장 인간 VH 도메인을 포함한다. 본원에서 사용된, 용어 인간 VH 도메인은 또한 예를 들어 WO2016/062990 및 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 특히 관심 항원 (즉, HSA)으로의 면역화에 반응하여, 전장 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 발현하는 유전자이식 마우스에 의해 생성된 중쇄 단독 항체로부터 단리된 VH 도메인을 포함한다. 일 구체예에서, 인간 VH 도메인은 또한 인간 VH 도메인 아미노산으로부터 유래되거나 또는 이에 기반하거나, 또는 인간 VH 핵산 서열로부터 생성되는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 용어 인간 VH 도메인은 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되거나 또는 이에 의해 코딩되고, 예를 들어 전장 인간 재배열되지 않은 V, D, J 유전자 세그먼트를 발현하는 유전자이식 마우스에서 생성된 중쇄 단독 항체로부터 수득되는 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 실질적으로 인간 VH 도메인, 또는 인간 VH 도메인으로부터 유래되거나 또는 이에 기반한 VH 도메인은 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예: 인 비트로 도입된 돌연변이 예컨대 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이화에 의해 도입되거나, 또는 인 비보 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러므로 용어 "인간 VH 도메인"은 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형되어, 예를 들어 서열 책임 (sequence liabilities)을 제거한 실질적으로 인간 VH 도메인을 포함한다. 예를 들어, 실질적으로 인간 VH 도메인은 생식세포 인간 서열과 비교하여, 최대 10개, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 또는 최대 20개의 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
그러나 본원에서 사용된 용어 "인간 VH 도메인" 또는 "실질적으로 인간 VH 도메인"은 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식세포로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 일 구체예에서, 본원에서 사용된 용어 "인간 VH 도메인"은 또한 카멜화 (camelized) VH 도메인을 포함하는 것으로 의도되지 않으며, 즉 예를 들어 VH 도메인 서열에서 미리결정된 위치를 선택하고, 상기 미리결정된 위치에서 하나 이상의 미리결정된 잔기를 카멜리드 VHH 도메인에서 발견될 수 있는 특정 잔기로 변경시키는 하나 이상의 점 돌연변이를 도입하는 기존의 돌연변이화 방법에 의해 인 비트로에서 특이적으로 변형되어진 인간 VH 도메인이다.
본 발명의 분자는 전장 인간이므로 면역원성이 아니기 때문에 유익하다. 이는 인간화 (humanisation)를 요구하지 않는다.
제1 양상에서, 하기를 포함하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체가 제공된다:
a) 서열번호: 2, 또는 서열번호: 2와 1, 2, 3, 4, 5 또는 5개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
b) 서열번호: 3, 또는 서열번호: 3과 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및/또는
c) 서열번호: 4, 또는 서열번호: 4와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3.
일 구체예에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상기 정의된 CDR들 중 하나, 예컨대 CDR1, CDR2 또는 CDR3을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 CDR은 각각 서열번호: 2, 3 또는 4로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 CDR은 변이체이고, 상기 정의된 바와 같은 치환을 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 CDR 서열들 중 2개의 서열에 대해 하나는 서열번호: 2, 3 또는 4로부터 정의된 바와 같고, 나머지 CDR은 적용 가능한 경우 각각의 CDR 서열 2, 3 또는 4의 변이체이다.
일 구체예에서, 상기 단일 가변 도메인 항체는 서열번호: 1, 또는 이에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95%의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
서열번호: 1은 하기에 제시된다:
EVQLLESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS NYNMNWVRQA PGKRLEWVSS ISSAGTHIYS ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TGVYYCARDP HSTGWYKDFD YWGQGTLVTV SS
(서열번호: 1, 또한 본원에서 Humabody® 1이라고 함)
각 CDR1, CDR2 및 CDR3에 대한 서열은 상기에서 진하게 표시되어 있다. 상기 CDR들은 하기 서열을 갖는다:
NYNMN CDR1: (서열번호: 2)
SISSAGTHIYSADSVKG CDR2: (서열번호: 3)
DPHSTGWYKDFDY CDR3: (서열번호: 4)
일 구체예에서, 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있고, 4개의 프레임워크 영역, 각 FR1 내지 FR4, 및 3개의 상보성 결정 영역, 각 CDR1 내지 CDR3을 갖는 단일 가변 도메인 항체가 제공되며, 상기에서:
(i) CDR1은 서열번호: 2에 제시된 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함하고; CDR2는 서열번호: 3에 제시된 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함하며; CDR3은 서열번호: 4에 제시된 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함하고,
(ii) 상기 아미노산 서열은 서열번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 양상에서, 하기를 포함하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체가 제공된다:
a) 서열번호: 6, 또는 서열번호: 6과 1, 2, 3, 4, 5 또는 5개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
b) 서열번호: 7, 또는 서열번호: 7과 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및/또는
c) 서열번호: 8, 또는 서열번호: 8과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3.
일 구체예에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상기 정의된 CDR들 중 하나, 예컨대 CDR1, CDR2 또는 CDR3을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 CDR은 각각 서열번호: 6, 7 또는 8로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 CDR은 변이체이고, 상기 정의된 바와 같은 치환을 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 CDR 서열들 중 2개의 서열에 대해 하나는 서열번호: 6, 7 또는 8로부터 정의된 바와 같고, 나머지 CDR은 적용 가능한 경우 각각의 CDR 서열 6, 7 또는 8의 변이체이다.
일 구체예에서, 상기 단일 가변 도메인 항체는 서열번호: 5, 또는 이에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95%의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
서열번호: 5는 하기에 제시된다:
EVQLLESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTVS SYTMNWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGRYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARDP RMVGNPHEFD IWGQGTMVTV SS
(서열번호: 5, 또한 본원에서 Humabody® 2라고 함)
각 CDR1, CDR2 및 CDR3에 대한 서열은 상기에서 진하게 표시되어 있다. 상기 CDR들은 하기 서열을 갖는다:
SYTMN CDR1: (서열번호: 6)
SISSSGRYIYYADSVKG CDR2: (서열번호: 7)
DPRMVGNPHEFDI CDR3: (서열번호: 8)
일 구체예에서, 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있고, 4개의 프레임워크 영역, 각 FR1 내지 FR4, 및 3개의 상보성 결정 영역, 각 CDR1 내지 CDR3을 갖는 단일 가변 도메인 항체가 제공되며, 상기에서:
(i) CDR1은 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함하고; CDR2는 서열번호: 7에 제시된 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함하며; CDR3은 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함하고,
(ii) 상기 아미노산 서열은 서열번호: 5의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 갖는다.
상기에서 사용된 서열 상동성/동일성은 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 예를 들어 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 상동성/동일성일 수 있다.
상기 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 기타 변형을 가지며, HSA에 결합하고, 단일 도메인 항체의 생물학적 기능을 유지하는 서열번호: 1 또는 서열번호: 5의 변이체일 수 있다. 따라서, 변이체 VH 단일 도메인 항체는 서열이 조작될 수 있다. 변형은 상기 단일 도메인 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있으며, 이는 네이티브 서열 VH 단일 도메인 항체 또는 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 서열의 변화를 초래한다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체, 예컨대 류신을 세린으로 대체, 즉 보존적 아미노산 대체의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 선택적으로 약 1 내지 25개, 예를 들어 1 내지 5개, 1 내지 10개, 1 내지 15개, 1 내지 20개 범위의 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산일 수 있다. 허용되는 변이는 상기 서열에서 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고, 전장 또는 성숙한 네이티브 서열이 나타내는 활성에 대해 수득된 변이체를 테스트함으로써 결정될 수 있다. 본원에 기재된 VH 단일 도메인 항체의 변이체는 비-변이체 분자에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 상동성/동일성을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 변형은 보존적 서열 변형이다. 본원에서 사용된 용어 "보존적 서열 변형 (conservative sequence modifications)"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의미하게 영향을 미치지 않거나 또는 이를 변경하지 않는 아미노산 변형을 나타내는 것으로 의도된다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 본 발명의 sdAb로 당해 분야에 알려져 있는 표준 기술, 예컨대 부위-지향 돌연변이화 및 PCR-매개 돌연변이화에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리가 당해 분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 가진 아미노산 (예: 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산 (예: 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 가진 아미노산 (예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 가진 아미노산 (예: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 가진 아미노산 (예: 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산 (예: 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 단일 도메인 항체의 CDR 영역들내 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 상기 변경된 항체는 본원에 기재된 기능성 분석법을 사용하여 기능 (즉, HSA 결합)을 유지하는지에 대해 테스트할 수 있다.
따라서, 이들 아미노산의 변경은 전형적으로 폴리펩티드의 생물학적 활성, 기능 또는 다른 원하는 특성, 예컨대 항원에 대한 이의 친화도 또는 이의 특이성을 변경하지 않고 수행될 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드의 비필수 영역에서 단일 아미노산 치환은 실질적으로 생물학적 활성을 변경하지 않는다. 또한, 구조 또는 기능이 유사한 아미노산의 치환은 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성을 방해할 가능성이 적다. 본원에 기재된 폴리펩티드 및 펩티드를 포함하는 아미노산 잔기에 대한 약어, 및 이들 아미노산 잔기의 보존적 치환이 하기 표 1에 기재되어 있다.
아미노산 잔기 및 보존적 아미노산 치환의 예
원래의 잔기
3문자 코드, 단문자 코드 		보존적 치환
알라닌, Ala, A Gly, Ser
아르기닌, Arg, R Lys, His
아스파라긴, Asn, N Gln, His
아스파르트산, Asp, D Glu, Asn
시스테인, Cys, C Ser, Ala
글루타민, Gln, Q Asn
글루탐산, Glu, E Asp, Gln
글리신, Gly, G Ala
히스티딘, His, H Asn, Gln
이소류신, Ile, I Leu, Val
류신, Leu, L Ile, Val
리신, lys, K Ar, His
메티오닌, Met, M Leu, Ile, Tyr
페닐알라닌, Phe, F Tyr, Met, Leu
프롤린, Pro, P Ala
세린, Ser, S Thr
트레오닌, Thr, T Ser
트립토판, Trp, W Tyr, Phe
티로신, Tyr, Y Try, Phe
발린, Val, V Ile, Leu
일부 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 1, 서열번호: 30 또는 서열번호: 5와 비교하여 하나 이상의 서열 변형을 포함하는 VH 단일 도메인 항체의 변이체이고, 비변형된 단일 도메인 항체와 비교하여 결합 친화도, 특이성, 열안정성, 발현 수준, 이펙터 기능, 글리코실화, 감소된 면역원성 또는 용해도와 같은 하나 이상의 특성이 향상된 VH 단일 도메인 항체를 제공한다.
당업자는 인 비트로 및 인 비보 발현 라이브러리를 포함하여, 본원에 기재된 항원 결합 분자를 동정, 수득 및 최적화하는 다양한 방법이 있다는 것을 알 것이다. 이는 실시예에 추가로 기재되어 있다. 당해 분야에 알려져 있는 최적화 기술, 예컨대 디스플레이 (예: 리보솜 및/또는 파지 디스플레이) 및/또는 돌연변이화 (예: 오류-유발 돌연변이화 (error-prone mutagenesis))가 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한 본원에 기재된 단일 도메인 항체의 서열 최적화된 변이체를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 단일 도메인 항체의 면역원성을 감소시키기 위한 변형이 수행될 수 있다. 예를 들어, 하나의 접근법으로 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 인간 생식세포 서열로 복귀 (revert)시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 겪은 단일 도메인 항체는 상기 단일 도메인 항체가 유래되는 생식세포 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 상기 단일 도메인 항체 프레임워크 서열을 상기 단일 도메인 항체가 유래되는 생식세포 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 일 구체예에서, 모든 프레임워크 서열은 생식세포 서열이다.
상기 프레임워크 영역 서열에서 아미노산 잔기들 중 하나 이상의 아미노산 잔기를 이의 생식세포 형태로 되돌리기 위해, 체세포 돌연변이는 예를 들어, 부위-지향 돌연변이화 또는 PCR-매개 돌연변이화에 의해 생식세포 서열로 "역돌연변이 (backmutated)"될 수 있다.
다른 타입의 프레임워크 변형으로는 T 세포 에피토프를 제거하여 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해, 프레임워크 영역 내에, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역들내 하나 이상의 잔기를 돌연변이화하는 것을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 아글리코실화 (aglycoslated) 항체가 제조될 수 있다 (즉, 상기 항체는 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어 상기 항체의 항원에 대한 친화도를 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열내 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 해당 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 수행될 수 있다. 이러한 아글리코실화는 항체의 항원에 대한 친화도를 증가시킬 수 있다.
일 구체예에서, 상기 하나 이상의 치환이 CDR1, 2 또는 3 영역에 있다. 예를 들어, 상기 CDR1, 2 또는 3에서 1, 2, 3, 4, 5개 또는 초과의 아미노산 치환이 있을 수 있다. 다른 예에서, 1 또는 2개의 아미노산 결실이 있을 수 있다. 일 구체예에서, 상기 하나 이상의 치환이 프레임워크 영역에 있다. 예를 들어, 프레임워크 영역에 1 내지 10개 또는 초과의 아미노산 치환이 있을 수 있다.
일 구체예에서, 상기 변이체는 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에서의 치환, 서열번호: 1을 참조하여 하기 치환들 중 하나 이상 또는 이들의 조합을 포함한다: E1, V5, G44, Y60, 92A, 28T→A N31, N33, A54, G55, H57, I58 및/또는 Y106. 위치는 Kabat에 따른다.
일 구체예에서, 상기 변이체는 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에서의 치환, 예컨대 위치들에서 서열번호: 1을 참조하여 하기 치환들 중 하나 이상 또는 이들의 조합을 포함한다: E1→Q; 5V-L; G44→R; Y60→S; 92A→G; 28T→A; N31→S; N33→T; A54→G; G55→S; H57→Y; I58→K 및/또는 Y106→F. 위치는 Kabat에 따른다.
일 구체예에서, 상기 변이체는 상기 열거된 변형들 중 1, 2, 3, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 변형을 포함한다. 따라서 상기 변형들의 조합이 특히 계획된다.
일 구체예에서, 상기 변이체는 예컨대 위치들에서 서열번호: 5를 참조하여 하기 치환들 중 하나 이상 또는 이들의 조합을 포함한다: V5, T28, N84, S50, S54, G55, R56, Y60, L103, E108 및/또는 I111. 위치는 Kabat에 따른다.
본 발명에 따른 서열번호: 1의 하나의 변이체가 하기 서열번호:30에 제시된다:
EVQLVESGGG　LVKPGGSLRL　SCAASGFTFS　NYNMNWVRQA　PGKGLEWVSS　ISSAGTHIYY　ADSVKGRFTI　SRDNAKNSLY　LQMNSLRAED　TAVYYCARDP　HSTGWYKDFD　YWGQGTLVTVSS
해당하는 핵산은 하기에 제시된다 (서열번호: 31).
GAGGTGCAGC　TGGTGGAGTC　TGGGGGAGGC　CTGGTCAAGC　CTGGGGGGTC　CCTGAGACTC　TCCTGTGCAG　CCTCTGGATT　CACCTTCAGT　AACTATAACA　TGAACTGGGT　CCGCCAGGCT　CCAGGGAAGG　GGCTGGAGTG　GGTCTCATCG　ATTAGTAGTG　CTGGTACTCA　CATATACTAC　GCAGACTCAG　TGAAGGGCCG　ATTCACCATC　TCCAGAGACA　ACGCCAAGAA　CTCACTGTAT　CTGCAAATGA　ACAGCCTGAG　AGCCGAGGAC　ACAGCTGTTT　ATTACTGTGC　GAGAGATCCT　CATAGCACTG　GCTGGTACAA　GGACTTTGAC　TACTGGGGCC　AGGGAACCCT　GGTCACCGTC　TCCTCA
일 구체예에서, 상기 변이체는 예컨대 위치들에서 서열번호: 5를 참조하여 하기 치환들 중 하나 이상 또는 이들의 조합을 포함한다: V5→L; T28→N 또는 A; N84→H; S50→A; S54→N; G55→S; R56→T; Y60→H; L103→V; E108→A 및/또는 I111→V. 위치는 Kabat에 따른다.
언급된 바와 같이, 본 발명에 의해 제공되는 아미노산 서열은 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있고, 특히 (본원에 기재된 바와 같이) 이에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 따라서, 이들은 예를 들어 치료용 화합물, 모이어티 또는 엔티티에 반감기 (본원에 정의된 바와 같음)의 증가를 부여하기 위해, 인간 혈청 알부민에 결합하기 위한 결합 유닛 또는 결합 도메인으로서 사용될 수 있다.
사용된 용어 "반감기 (half-life)"는 일반적으로 예를 들어 서열 또는 화합물의 분해 및/또는 서열 또는 화합물의 천연 기전에 의한 청소 또는 분리로 인해, 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 혈청 농도가 인 비보에서 50%만큼 감소되는데 걸리는 시간을 지칭할 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 인 비보 반감기는 약동학적 분석과 같이 그 자체로 알려진 임의의 방식으로 결정될 수 있다. 당업자에게는 적합한 기술이 명백할 것이다. 상기 반감기는 파라미터 예컨대 tl/2-알파, tl/2-베타 및 곡선하 면적 (AUC)을 사용하여 표시될 수 있다. 반감기 (t 알파 및 t 베타) 및 AUC는 시간에 대한 접합체 또는 융합체의 혈청 농도 곡선으로부터 결정될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "반감기 (half-life)"는 특히 t1/2-베타 또는 말기 반감기를 지칭한다 (여기서 t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 이들 모두가 고려되지 않을 수 있음).
예를 들어, 제1 단계 (알파 단계)에서 약물 조성물 (예: 약물 접합체, 비공유 약물 접합체, 약물 융합체)은 일부 제거와 함께 환자에서 주로 분포되어 있다. 제2 단계 (베타 단계)는 약물 조성물 (예: 약물 접합체, 비공유 약물 접합체, 약물 융합체)이 분배되고 약물 조성물이 환자로부터 청소됨에 따라 혈청 농도가 감소하는 말기 단계이다. t 알파 반감기는 제1 단계의 반감기이고, t 베타 반감기는 제2 단계의 반감기이다.
본 발명의 HSA 결합 면역글로불린 가변 도메인은:
Figure pct00001
인간 (man)에서 1 내지 72시간, 예를 들어 10시간 이상, 예를 들어 최대 20시간, 또는 12, 24, 36 또는 48시간의 혈청중 반감기 (serum half life) (t1/2로 표시됨)를 가질 수 있으며, 및/또는
Figure pct00002
치료용 모이어티에 연결되는 경우, 인간에서 1 내지 72시간, 예를 들어 10시간 이상, 예를 들어 최대 20시간, 또는 12, 24, 36 또는 48시간의 혈청 중 반감기를 수득된 단백질에 부여한다.
일 구체예에서, 상기 HSA 결합 면역글로불린 가변 도메인은 실시예에 개시된 바와 같이 genOway® HSA/FcRn 마우스 모델에서 분자의 반감기를 약 20 내지 78시간까지 연장시킨다.
일 구체예에서, 상기 HSA 결합 면역글로불린 가변 도메인은 필리핀 원숭이에서 약 84시간의 분자에 대한 반감기를 부여한다. 이는 실시예에서 예를 들어 서열번호: 30의 HSA 결합제에 대해 나타낸 바와 같을 수 있다.
본 발명의 HSA 결합 면역글로불린 가변 도메인은 또한 실시예 9에 개시된 바와 같이 우수한 저장 안정성 (storage stability)을 갖는다. 이들은 VH 단일 도메인 항체의 반감기를 연장하는데 특히 적합하다.
본 발명은 또한 예를 들어 서열번호: 1, 서열번호: 30 또는 서열번호: 5를 포함하거나 또는 이로 구성된 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체 또는 및 제2 모이어티를 포함하는 결합 분자에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 모이어티는 치료용 모이어티이다. 상기 결합 분자는 폴리펩티드, 단백질 또는 구조체일 수 있다. 따라서, 또한 본원에 기재된 단일 가변 도메인 항체를 포함하는 융합 단백질, 다가 및 다중특이적 단백질 또는 구조체가 제공된다. 예를 들어 서열번호: 1, 서열번호: 30 또는 서열번호: 5를 포함하거나 또는 이로 구성된, 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체는 치료 표적과 같은 또 다른 표적에 결합하는 모이어티와 함께 사용하기 위한 것이다.
일 구체예에서, 상기 치료용 모이어티는 예를 들어 항체 또는 항체 단편 (예: Fab, F(ab')2, Fv, 단쇄 Fv 단편 (scFv) 또는 단일 도메인 항체, 예를 들어 VH 또는 VHH 도메인) 또는 항체 모방 단백질로부터 선택되는 결합 분자이다. 일 구체예에서, 본 발명의 단일 도메인 항체는 CH2 및 CH3 도메인 중 하나 또는 둘 다, 및 선택적으로 힌지 영역 (hinge region)을 포함하는, 항체 Fc 영역 또는 이의 단편에 연결될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 적어도 제2 모이어티는 VH 도메인이다.
일 구체예에서, 본원에 기재된 HSA에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 모이어티를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드는 융합 단백질이다. 일 구체예에서, 본원에 기재된 HSA에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 모이어티를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드는 약물 접합체이다.
본원에서 사용된 "접합체 (conjugate)"는 약물에 결합되는 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 지칭한다.
이러한 접합체에는 약물이 공유 결합된 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 "약물 접합체 (drug conjugates)" 및 약물이 비공유 결합된 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 "비-공유 약물 접합체 (non-covalent drug conjugates)"를 포함한다.
본원에서 사용된, "약물 접합체 (drug conjugate)"는 약물이 공유 결합된 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 지칭한다. 상기 약물은 적절한 링커 또는 스페이서 모이어티를 통해 직접 또는 간접적으로 항원-결합 단편에 공유 결합될 수 있다. 상기 약물은 아미노-말단, 카복실-말단과 같은 임의의 적절한 위치에서 또는 적절한 아미노산 측쇄를 통해 항원-결합 단편에 결합될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 제2 모이어티에 상기 2개의 모이어티를 연결하기 위한 펩티드 링커 또는 다른 적절한 링커를 사용하여 연결된다.
용어 "펩티드 링커 (peptide linker)"는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드를 지칭한다. 펩티드 링커는 1 내지 50개의 아미노산, 예를 들어 1 내지 20개의 아미노산을 포함한다. 펩티드 링커는 당해 분야에 알려져 있고, 본원에 비-제한적인 예가 기재되어 있다. 적절한 비-면역원성 링커 펩티드는 예를 들어, G 및/또는 S 잔기를 포함하는 링커, (G4S)n, (SG4)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커이며, 여기서 "n"은 일반적으로 1 내지 10, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 수이다. 일 구체예에서, 상기 펩티드는 예를 들어 GGGGS (서열번호: 12), GGGGSGGGGS (서열번호: 13), SGGGGSGGGG (서열번호: 14), GGGGSGGGGSGGGG (서열번호: 15), GSGSGSGS (서열번호: 16), GGSGSGSG (서열번호: 17), GGSGSG (서열번호: 18) 및 GGSG (서열번호: 19)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
상기 결합제는 다중특이적 (multispecific), 예를 들어 이중특이적 (bispecific)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 본원에 기재된 HSA에 결합하는 제1 VH 단일 도메인 항체 (VH (A)) 및 다른 항원에 결합하는 제2 VH 단일 도메인 항체 (VH (B))를 포함하며, 하기 식을 갖는다: VH (A) - L - VH (B). VH (A)는 예를 들어 펩티드 링커를 사용하여 VH (B)에 접합되며, 즉 VH (B)에 연결된다. L은 링커를 나타낸다.
각 VH는 CDR 및 FR 영역을 포함한다. 따라서, 상기 결합 분자는 하기 식을 가질 수 있다: FR1(A)-CDR1(A)-FR2(A)-CDR2(A)-FR3(A)-CDR3(A)-FR4(A)-L-FR1(B)-CDR1(B)-FR2(B)-CDR2(B)-FR3(B)-CDR3(B)-FR4(B).
상기 단일 VH 도메인들 A 및 B의 순서는 특별히 제한되지 않으며, 본 발명의 폴리펩티드 내에 단일 가변 도메인 A는 N-말단에 위치할 수 있고, 단일 가변 도메인 B는 C-말단에 위치할 수 있으며, 또는 그 반대로 위치할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 결합 분자는 이중특이적이다. 따라서, 일 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 단일 도메인 항체가 상기 단일 도메인 항체와는 상이한 결합 특이성을 가진 제2 기능적 모이어티에 연결된 이중특이적 분자에 관한 것이다.
일 구체예에서, 상기 결합 분자 예컨대 단백질 또는 구조체는 다중특이적이고, 추가의, 즉 제3, 제4, 제5 모이어티 등을 포함한다.
다중특이적 단백질의 일 구체예에서, 상기 HSA 결합 VH 도메인은 상기 단백질의 C 말단에 위치한다. 다중특이적 단백질의 일 구체예에서, 상기 HSA 결합 VH 도메인은 상기 단백질의 N 말단에 위치한다. 다중특이적 단백질의 일 구체예에서, 상기 HSA 결합 VH 도메인은 말단에 위치하지 않는다.
상기 제2 또는 추가의 치료용 모이어티는 예를 들어 종양 항원 또는 면역항암 표적에 결합하는 모이어티로부터 선택될 수 있지만, 당업자라면 본 발명이 이에 제한되지 않음을 알 것이다.
본 발명은 또한 청구항들 중 어느 항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인이 융합 단백질에서 치료용 모이어티에 연결되는 경우 상기 치료용 모이어티의 반감기를 연장하는데 있어서 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 청구항들 중 어느 항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인이 융합 단백질에서 치료용 모이어티에 연결되는 경우 상기 치료용 모이어티의 반감기를 연장하는데 있어서 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 이는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, CD137에 결합하는 sdAb 및 PSMA 또는 PD-1에 결합하는 sdAb를 포함하는 단백질의 반감기를 연장시키는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어 상기 분자는 VH (A)-VH (B)-VH (C), VH (B)-VH (A)-VH (C), VH (C)-VH (A)-VH (B) 또는 VH (C)-VH (B)-VH (A)의 형식으로 존재할 수 있으며, 여기서 A는 CD137에 결합하는 sdAb이고, B는 PSMA 또는 PD-1에 결합하는 sdAb이며, C는 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인 (예: 서열번호: 1, 서열번호: 30 또는 서열번호: 5)이다. 상기 VH의 순서는 유연하며, 본원에서 설명된 바와 같이, 적절한 링커가 VH 분자들을 연결한다. 예시되는 분자는 서열번호: 22, 23, 26, 28, 33, 34 또는 35로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일 구체예에서, 상기 단일 가변 중쇄 도메인 항체는 재배열되지 않은 인간 V, D 및 J 영역을 포함하는 이식유전자를 발현하는 유전자이식 설치류, 특히 인간 중쇄 단독 항체를 생성하는 설치류로부터 수득되거나 또는 수득 가능하다. 일 구체예에서, 상기 설치류는 기능적 내인성 경쇄 및 중쇄를 생성하지 않는다.
일반적으로, 본원에서 달리 지시하지 않는 한, 본원에서 언급된 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 단백질 및 다른 화합물 및 구조체는 인간 (및/또는 선택적으로 또한 온혈 동물, 특히 포유동물)에서 질병 또는 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이다. 따라서, 일반적으로, 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 단백질 및 다른 화합물 및 구조체는 바람직하게는 이들이 (생물학적) 약물 또는 다른 약학적 또는 치료적으로 활성인 화합물 및/또는 의약품 또는 조성물로서 사용될 수 있고 및/또는 적합하게는 이의 일부일 수 있는 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드, 단백질 또는 구조체를 포함하는 약학적 조성물 또는 제제, 예컨대 본원에 기재된 HSA-결합 단일 도메인을 포함하는 결합 분자 또는 융합 단백질에 관한 것이다. 상기 약학적 조성물은 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드, 단백질 또는 구조체, 또는 약학적 조성물은 경구, 국소, 비경구, 설하, 직장, 질, 안구, 비강내, 폐, 피부내, 유리체내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 뇌내, 경피, 경점막, 흡입, 또는 국소, 특히 귀, 코, 눈 또는 피부로의 국소, 또는 흡입을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 편리한 경로로 투여될 수 있다.
비경구 투여는 예를 들어, 정맥내, 근육내, 동맥내, 복강내, 비강내, 직장, 방광내, 피부내, 국소 또는 피하 투여를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 비경구로 투여된다.
상기 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 비히클은 입자상 (particulate)일 수 있으므로, 상기 조성물은 예를 들어 정제 또는 분말 형태이다. 용어 "담체 (carrier)"는 본 발명의 약물 항체 접합체와 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트 또는 부형제를 지칭한다. 이러한 약학적 담체는 액체, 예컨대 물 및 오일일 수 있으며, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참깨유 및 유사물을 포함한다. 상기 담체는 식염수, 아카시아 검, 젤라틴, 전분 페이스트, 탈크, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 우레아 및 유사물일 수 있다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제, 활택제 및 착색제가 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 동물에게 투여되는 경우, 본 발명의 단일 도메인 항체 또는 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균된다. 본 발명의 약물 항체 접합체가 정맥내로 투여되는 경우 물이 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사용 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적절한 약학적 담체는 또한 부형제 예컨대 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 밀가루, 초크 (chalk), 실리카겔, 스테아르산 나트륨, 모노스테아르산 글리세롤, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 및 유사물을 포함한다. 본 발명의 조성물은 요구되는 경우, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 액체 형태, 예컨대 용액, 에멀젼 또는 현탁액일 수 있다. 상기 액체는 주사 (injection), 주입 (infusion) (예: IV 주입) 또는 피하 전달에 유용할 수 있다. 경구 투여를 의도하는 경우, 상기 조성물은 바람직하게는 고체 또는 액체 형태이며, 여기서 반-고체, 반-액체, 현탁액 및 겔 형태가 본원에서 고려된 형태 안에서 고체 또는 액체로서 포함된다.
경구 투여를 위한 고체 조성물로서, 상기 조성물은 분말, 과립, 압축 정제, 환제, 캡슐, 츄잉검, 웨이퍼 (wafer) 또는 유사 형태로 제제화될 수 있다. 이러한 고체 조성물은 전형적으로 하나 이상의 비활성 희석제를 함유한다. 또한, 하나 이상의 하기 성분이 존재할 수 있다: 결합제 예컨대 카복시메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정 셀룰로스 또는 젤라틴; 부형제 예컨대 전분, 락토스 또는 덱스트린, 붕해제 예컨대 알긴산, 알긴산 나트륨, 옥수수 전분 및 유사물; 활택제 예컨대 스테아르산 마그네슘; 윤활제 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제 예컨대 수크로스 또는 사카린; 풍미제 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 풍미제; 및 착색제. 상기 조성물이 캡슐 형태 (예: 젤라틴 캡슐)인 경우, 이는 상기 타입의 물질에 추가하여, 액체 담체 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 사이클로덱스트린 또는 지방 오일을 함유할 수 있다.
상기 조성물은 액체 형태, 예컨대 엘릭시르, 시럽, 용액, 에멀젼 또는 현탁액일 수 있다. 상기 액체는 경구 투여 또는 주사에 의한 전달에 유용할 수 있다. 경구 투여를 의도하는 경우, 조성물은 감미제, 보존제, 염료/착색제 및 풍미 증진제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 주사 투여용 조성물에서, 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산화제, 현탁화제, 버퍼, 안정화제 및 등장제 중 하나 이상이 또한 포함될 수 있다.
조성물은 하나 이상의 투여 단위 (dosage units) 형태를 취할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 조성물을 치료를 필요로 하는 영역에 국소로, 또는 정맥내 주사 또는 주입에 의해 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 HSA-결합 단일 도메인을 포함하는 결합 분자 또는 융합 단백질 또는 본원에 기재된 약학적 조성물 또는 제제의 투여를 포함하는, 암과 같은 질병을 치료하는 방법으로 확장된다. 또한, 질병 치료에 사용하기 위한; 예컨대 암 치료에 사용하기 위한, 본원에 기재된 HSA-결합 단일 도메인을 포함하는 결합 분자 또는 융합 단백질 또는 본원에 기재된 약학적 조성물 또는 제제가 계획된다. 또한, 암 치료용 약제의 제조에 있어서 본원에 기재된 HSA-결합 단일 도메인을 포함하는 결합 분자 또는 융합 단백질 또는 본원에 기재된 약학적 조성물 또는 제제의 용도가 계획된다.
특정 장애 또는 병태 치료에서 유효/활성인 치료제의 양은 상기 장애 또는 병태의 특성에 좌우될 것이며, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 최적의 투여량 범위 확인을 돕기 위한 인 비트로 또는 인 비보 분석법이 선택적으로 사용될 수 있다. 상기 조성물에서 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 질병 또는 장애의 중증도에 좌우될 것이며, 의사의 판단 및 각 환자 상황에 따라 결정되어야 한다. 연령, 체중, 성별, 식단, 투여 시간, 배출 속도, 숙주 상태, 약물 병용, 반응 민감도 및 질병 중증도와 같은 요인이 고려되어야 한다.
전형적으로, 상기 양은 본 발명의 단일 도메인 항체가 조성물의 중량을 기준으로 적어도 약 0.01 중량%이다. 경구 투여를 의도하는 경우, 상기 양은 상기 조성물의 약 0.1 중량% 내지 약 80 중량%의 범위에서 가변될 수 있다. 바람직한 경구 조성물은 본 발명의 단일 도메인 항체를 상기 조성물의 약 4 중량% 내지 약 50중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 조성물은 비경구 투여량 단위가 본 발명의 단일 도메인 항체를 약 0.01 중량% 내지 약 2 중량%로 함유하도록 제조된다.
주사로 투여하는 경우, 상기 조성물은 전형적으로 대상체의 체중 1kg당 약 0.1 mg/kg 내지 약 250 mg/kg, 바람직하게는 동물의 체중 1kg당 약 0.1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 보다 바람직하게는 동물의 체중 1kg당 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 약 1 내지 30 mg/kg, 예컨대 약 5 내지 25 mg/kg, 약 10 내지 20 mg/kg, 약 1 내지 5 mg/kg, 또는 약 3 mg/kg의 용량으로 투여된다. 상기 투약 계획은 예컨대, 1주 1회 내지 2, 3, 또는 4주마다 1회로 가변될 수 있다.
본원에서 사용된, "치료하다 (treat)", "치료하는 (treating)" 또는 "치료 (treatment)"는 질환 또는 장애를 억제 또는 완화시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 치료는 질환 또는 장애와 관련된 증상 발병의 연기, 및/또는 질환으로 발생 또는 발생이 예상되는 이러한 증상의 중증도의 감소를 포함할 수 있다. 상기 용어는 기존 증상의 개선, 추가적인 증상의 예방, 및 이러한 증상의 기초 원인을 개선 또는 예방하는 것을 포함한다. 따라서, 상기 용어는 치료되는 포유동물, 예컨대 인간 환자의 적어도 일부에게 유익한 결과가 부여되고 있음을 나타낸다. 많은 의학적 치료는 치료를 받은 환자의 전부는 아니지만 일부 환자에서 효과적이다.
용어 "대상체 (subject)" 또는 "환자 (patient)"는 치료, 관찰 또는 실험 목적인 동물을 지칭한다. 예로서, 대상체는 인간, 또는 비-인간 포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 뮤린, 소 (bovine), 말 (equine), 개 (canine), 양 (ovine) 또는 고양이 (feline)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 포유동물을 포함한다.
본 발명의 분자 또는 약학적 조성물은 단독 활성 성분으로서 또는 하나 이상의 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 치료제는 질병 치료에 유용한 화합물 또는 분자이다. 치료제의 예로는 항체, 항체 단편, 약물, 독소, 뉴클레아제, 호르몬, 면역조절제, 아폽토시스-유발제 (pro-apoptotic agents), 항-혈관생성제 (anti-angiogenic agent), 붕소 화합물, 광활성제 (photoactive agents) 또는 염료 및 방사성동위원소를 포함한다.
본 발명은 또한 단백질의 반감기를 연장하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인에 상기 단백질을 결합시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 핵산은 서열번호: 20 또는 이에 대해 적어도 90%의 서열 상동성을 갖는 핵산이다. 일 구체예에서, 상기 핵산은 서열번호: 21 또는 이에 대해 적어도 90%의 서열 상동성을 갖는 핵산이다. 일 구체예에서, 상기 핵산 서열은 링커를 사용하여 제2 핵산 서열에 연결된다. 일 구체예에서, 상기 제2 핵산은 치료용 모이어티를 코딩한다. 일 구체예에서, 상기 링커는 핵산 링커이다.
서열번호: 20
GAGGTGCAGC　TGTTGGAGTC　TGGGGGAGGC　CTGGTCAAGC　CTGGGGGGTC　CCTGAGACTC　TCCTGTGCAG　CCTCTGGATT　CACCTTCAGT　AACTATAACA　TGAACTGGGT　CCGCCAGGCT　CCAGGGAAGA　GGCTGGAGTG　GGTCTCATCG　ATTAGTAGTG　CTGGTACTCA　CATATACTCC　GCAGACTCAG　TGAAGGGCCG　ATTCACCATC　TCCAGAGACAACGCCAAGAA　CTCACTGTAT　CTGCAAATGA　ACAGCCTGAG　AGCCGAGGAC　ACAGGTGTTT　ATTACTGTGC　GAGAGATCCT　CATAGCACTG　GCTGGTACAA　GGACTTTGAC　TACTGGGGCC　AGGGAACCCT　GGTCACCGTC　TCCTCA
서열번호: 21
GAGGTGCAGC　TGTTGGAGTC　TGGGGGAGGC　CTGGTCAAGC　CGGGGGGGTC　CCTGAGACTC　TCCTGTGCAG　CCTCTGGATT　CACCGTCAGT　AGCTATACCA　TGAACTGGGT　CCGCCAGGCT　CCGGGGAAGG　GGCTGGAGTG　GGTCTCATCC　ATTAGTAGTA　GTGGTCGTTA　CATATACTAC　GCAGACTCAG　TGAAGGGCCG　ATTCACCATC　TCCAGAGACA　ACGCCAAGAA　CTCATTATAT　CTGCAAATGA　ACAGCCTGAG　AGCCGAGGAC　ACAGCTGTAT　ATTATTGTGC　GAGAGATCCC　CGTATGGTTG　GGAACCCCCA　TGAATTTGAT　ATCTGGGGCC　AAGGGACAAT　GGTCACCGTC　TCCTCA
본 발명은 또한 본원에 기재된 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 핵산 서열 또는 본원에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 포유동물, 박테리아 또는 효모 세포일 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 약학적 조성물, 본원에 기재된 단백질 또는 구조체, 또는 본원에 기재된 약학적 조성물, 및 선택적으로 사용 지침을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본원에 기재된 단일 도메인 항체는 HSA 항원에 의한 자극 시에 중쇄 단독 항체를 발현하는, 유전자이식 포유동물, 예를 들어 설치류로부터 수득될 수 있다. 상기 유전자이식 설치류, 예를 들어 마우스는 바람직하게는 내인성 항체 유전자를 발현하는 능력이 감소되었다. 따라서, 일 구체예에서, 상기 설치류는 내인성 경쇄 및/또는 중쇄 항체 유전자를 발현하는 능력이 감소되었다. 그러므로 상기 설치류는 내인성 카파 및 람다 경쇄 및/또는 중쇄 항체 유전자의 발현을 방해하는 변형을 포함하여, 예를 들어 하기에서 추가로 설명되는 바와 같이 기능적 경쇄 및/또는 중쇄가 생성되지 않을 수 있다.
일 양상은 또한 HSA에 결합할 수 있는 본원에 기재된 VH 도메인을 갖는 결합 분자 또는 인간 중쇄 단독 항체를 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 유전자이식 설치류, 예컨대 마우스를 HSA 항원으로 면역화하는 단계로서, 상기 설치류는 재배열되지 않은 인간 중쇄 V 유전자를 포함하는 핵산 구조체를 발현하고, 기능적 내인성 경쇄 또는 중쇄를 생성할 수 없는 것인 단계,
b) 인간 중쇄 단독 항체를 단리하는 단계.
예를 들어 상기 설치류, 예컨대 마우스로부터 VH 도메인 서열을 포함하는 서열 라이브러리를 생성하고, 상기 라이브러리로부터 VH 도메인 서열을 포함하는 서열을 단리하는 단계에 의해, 상기 중쇄 단독 항체로부터 VH 도메인을 단리하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
다른 양상은 또한 인간 HSA에 결합할 수 있는 단일 VH 도메인 항체를 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 유전자이식 설치류, 예컨대 마우스를 HSA 항원으로 면역화하는 단계로서, 상기 설치류는 재배열되지 않은 인간 중쇄 V 유전자를 포함하는 핵산 구조체를 발현하고, 기능적 내인성 경쇄 또는 중쇄를 생성할 수 없는 것인 단계,
b) 상기 설치류, 예컨대 마우스로부터 VH 도메인 서열을 포함하는 서열 라이브러리를 생성하는 단계, 및
c) 상기 라이브러리로부터 VH 도메인 서열을 포함하는 서열을 단리하는 단계.
예를 들어 실시예에 기재된 기능성 분석법을 사용하여, HSA에 결합하는 단일 VH 도메인 항체 또는 중쇄 단독 항체를 확인하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
인 비트로 발현 라이브러리를 사용하여 본원에 기재된 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 산물 및 조성물을 제조 또는 생성하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
a) 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 제공하는 단계; 및
b) HSA에 결합할 수 있는/이에 대해 친화도를 가질 수 있는 아미노산 서열에 대해 상기 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 스크리닝하는 단계, 및
c) HSA에 결합할 수 있는/이에 대해 친화도를 가질 수 있는 아미노산 서열(들)을 단리하는 단계.
또한, 본원에 기재된 단일 VH 도메인 항체, 결합 분자 또는 융합 단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 숙주 세포가 본원에 기재된 단일 VH 도메인 항체, 결합 분자 또는 융합 단백질을 생성하거나 또는 발현하는 조건하에 본원에 기재된 숙주 세포를 배양 또는 유지하는 단계를 포함하고, 선택적으로 이와 같이 생성된 본원에 기재된 단일 VH 도메인 항체, 결합 분자 또는 융합 단백질을 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법에서, 아미노산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 예컨대 스크리닝을 용이하게 하기 위해, 파지, 파지미드, 리보솜 또는 적절한 미생물 (예컨대 효모) 상에 디스플레이될 수 있다. 아미노산 서열 (의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리)을 디스플레이 및 스크리닝하는데 적절한 방법, 기술 및 숙주 유기체가 당업자에게 명백할 것이다 (예를 들어, Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press; 1st edition (October 28, 1996) Brian K. Kay, Jill Winter, John McCafferty 참조). 라이브러리, 예를 들어 파지 라이브러리는 항원-특이적, 중쇄-단독 항체를 발현하는 세포 또는 조직을 단리하는 단계, 상기 단리된 세포 또는 조직으로부터 유래된 mRNA로부터 VH 도메인(들)을 코딩하는 서열을 클로닝하는 단계, 및 라이브러리를 사용하여 코딩된 단백질을 디스플레이하는 단계에 의해 생성된다. 상기 VH 도메인(들)은 박테리아, 효모 또는 다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다.
본원에 제시된 다양한 양상 및 구체예에서, 용어 설치류 (rodent)는 마우스 (mouse) 또는 래트 (rat)와 관련될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 설치류는 마우스이다. 상기 마우스는 비-기능적 내인성 람다 경쇄 유전자좌를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 마우스는 기능적 내인성 람다 경쇄를 생성하지 못한다. 일 구체예에서, 상기 람다 경쇄 유전자좌가 일부 또는 전부 결실되거나, 또는 삽입, 역전, 재조합 이벤트, 유전자 에디팅 또는 유전자 사일런싱을 통해 비-기능적이 된다. 예를 들어, 적어도 불변 영역 유전자 C1, C2 및 C3이 결실되거나 또는 상기에 기재된 바와 같이 삽입 또는 다른 변형을 통해 비-기능적이 될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 유전자좌가 기능적으로 침묵되어 상기 마우스는 기능적 람다 경쇄를 생성하지 못한다.
또한, 상기 마우스는 비-기능적 내인성 카파 경쇄 유전자좌를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 마우스는 기능적 내인성 카파 경쇄를 생성하지 못한다. 일 구체예에서, 상기 카파 경쇄 유전자좌가 일부 또는 전부 결실되거나, 또는 삽입, 역전, 재조합 이벤트, 유전자 에디팅 또는 유전자 사일런싱을 통해 비-기능적이 된다. 일 구체예에서, 상기 유전자좌가 기능적으로 침묵되어 상기 마우스는 기능적 카파 경쇄를 생성하지 못한다.
기능적으로 침묵된 내인성 람다 및 카파 L-사슬 유전자좌를 갖는 마우스가 예를 들어 WO 2003/000737에 개시된 바와 같이 제조될 수 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 통합된다.
또한, 상기 마우스는 예를 들어 WO 2004/076618 (본원에 그 전문이 참조로 통합됨)에 기재된 바와 같이, 비-기능적 내인성 중쇄 유전자좌를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 마우스는 기능적 내인성 중쇄를 생성하지 못한다. 일 구체예에서, 상기 중쇄 유전자좌가 일부 또는 전부 결실되거나 또는 삽입, 역전, 재조합 이벤트, 유전자 에디팅 또는 유전자 사일런싱을 통해 비-기능적이 된다. 일 구체예에서, 상기 유전자좌가 기능적으로 침묵되어 상기 마우스는 기능적 중쇄를 생성하지 못한다.
일 구체예에서, 상기 마우스는 비-기능적 내인성 중쇄 유전자좌, 비-기능적 내인성 람다 경쇄 유전자좌 및 비-기능적 내인성 카파 경쇄 유전자좌를 포함한다. 그러므로 상기 마우스는 어떠한 기능적 내인성 경쇄 또는 중쇄도 생성하지 못한다. 따라서, 상기 마우스는 삼중 녹아웃 (triple knockout: TKO) 마우스이다.
상기 유전자이식 마우스는 이종, 바람직하게는 인간, 중쇄 유전자좌를 발현하기 위한 벡터, 예를 들어 효모 인공 염색체 (Yeast Artificial Chromosome: YAC)를 포함할 수 있다. YAC는 효모에서 매우 큰 DNA 삽입물의 클로닝을 위해 사용될 수 있는 벡터이다. 천연의 효모 염색체와 같이 거동하는데 필수적인 모두 3개의 시스-작용 구조적 요소 (cis-acting structural element) (자가 복제 서열 (autonomously replicating sequence: ARS), 센트로미어 (centromere: CEN) 및 2개의 텔로미어 (telomere: TEL))를 포함할 뿐만 아니라, 큰 DNA 삽입물을 수용할 수 있는 능력은 이들이 염색체-유사 안정성 및 효모 세포에서 전달의 정확도에 필요한 최소 크기 (150 kb)에 도달할 수 있도록 한다. YAC의 제작 및 사용은 당해 분야에 잘 알려져 있다 (예: Bruschi, C.V. and Gjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, Encyclopaedia of Life Sciences, 2002 Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group).
예를 들어, 상기 YAC는 다수의 재배열되지 않은 인간 VH, D 및 J 유전자를 CH1 도메인, 마우스 인핸서 (enhancer) 및 조절 영역이 결여된 마우스 면역글로불린 불변 영역 유전자와 조합하여 포함할 수 있다. 상기 인간 VH, D 및 J 유전자는 인간 VH, D 및 J 유전자좌이며, 이들은 전장 인간인 재배열되지 않은 유전자이다. 상기 YAC는 WO2016/062990에 기재된 바와 같을 수 있다.
내인성 마우스 또는 래트의 면역글로불린 유전자의 결실 또는 불활성화 및 CH1 도메인, 마우스 인핸서 및 조절 영역이 결여된 마우스 면역글로불린 불변 영역 유전자와 조합된 인간 V, D 및 J 유전자의 도입을 위해 당해 분야에 알려져 있는 대체 방법이 사용될 수 있다.
유전자이식 마우스는 실시예에 예시된 바와 같이 표준 기술에 따라 형성될 수 있다. 유전자이식 마우스를 형성하기 위한 2개의 가장 특성화된 경로는 유전자 물질을 새롭게 수정된 난모세포로의 전핵 미세주입 (pronuclear microinjection)을 통하거나 또는 안정하게 형질감염된 배아 줄기세포를 상실배 또는 배반포 단계의 배아로의 도입을 통한 것이다. 유전자 물질이 도입되는 방법과 관계없이, 조작된 배아를 가임신한 (pseudo-pregnant) 암컷 수여자에게 전달하여, 임신을 지속시켜서, 후보 유전자이식 새끼 (pups)가 태어났다.
이들 광범위한 방법들 간의 주요 차이점은 ES 클론이 유전자이식 동물을 형성하기 위해 이를 사용하기 전에 광범위하게 스크리닝될 수 있다는 것이다. 반대로, 전핵 미세주입은 이의 도입 이후에 숙주 게놈으로 통합되는 유전자 물질에 의존하며, 일반적으로 이식유전자의 성공적인 혼입은 새끼가 태어날 때까지 확인할 수 없다.
당해 분야에는 이식유전자가 성공적으로 통합되는지 여부를 결정하고 이를 보조하는 많은 방법이 알려져 있다. 유전자이식 동물은 구조체를 게놈으로의 무작위 통합, 부위-특이적 통합, 또는 상동 재조합을 포함하는 다수의 수단에 의해서 생성될 수 있다. 이식유전자의 통합 및 후속하는 변형을 유도 및 선택하기 위해 다양한 수단 및 기술이 사용될 수 있으며, 이는 재조합 효율을 향상시키기 위해 약물 저항성 마커 (양성 선택), 재조합 효소, 재조합-매개 카세트 교환, 음성 선택 기술 및 뉴클레아제의 사용을 포함한다. 이들 방법의 대부분은 통상 ES 세포의 변형에서 사용된다. 그러나 일부 기술은 전핵 주입을 통해 매개되는 유전자이식을 향상시키는데 유용성을 가질 수 있다.
원하는 배경 내에서 유전자이식 계통의 더 효율적인 생성을 위해서 추가적인 개선 (refinements)이 사용될 수 있다. 상기에 기재된 바와 같이, 바람직한 구체예에서, 상기 내인성 마우스 면역글로불린 발현을 침묵시켜서 약물 개발을 위해 이용될 수 있는 중쇄 단독 레퍼토리의 발현을 위해 도입된 이식유전자를 단독으로 사용한다. 유전자 조작된 마우스, 예를 들어 모든 내인성 면역글로불린 유전자좌 (마우스 중쇄, 마우스 카파 사슬 및 마우스 람다 사슬)가 침묵된 TKO 마우스를 상기에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. 임의의 도입된 이식유전자의 이러한 TKO 배경으로의 전달은 통상적으로 또는 공정의 효율적인 스케일링을 제공하기 위해 IVF 단계를 포함하는 육종 (breeding)을 통해 달성될 수 있다. 그러나 유전자이식 과정 중에 TKO 배경을 포함하는 것도 가능하다. 예를 들어, 미세주입의 경우, 난모세포는 TKO 공여체로부터 유래될 수 있다. 유사하게, TKO 배아 유래의 ES 세포가 유전자이식에 사용하기 위해 유도될 수 있다.
면역글로불린 유전자좌를 발현시키기 위해 이식유전자가 도입된 3중 녹아웃 마우스는 본원에서 TKO/Tg로 지칭된다.
일 구체예에서, 상기 마우스는 WO2016/062990에 기재된 바와 같다. 본 발명은 또한 인간 중쇄 유전자좌를 발현하고, HSA 항원으로 면역화된 설치류, 바람직하게는 마우스에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기에 기재된 바와 같은 설치류, 바람직하게는 인간 HSA에 결합하는 인간 VH 도메인을 포함하는 중쇄 단독 항체를 발현하는 마우스에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 설치류는 기능적 내인성 카파 및 람다 경쇄 및/또는 중쇄를 생성할 수 없다. 상기 인간 중쇄 유전자좌는 상기에 기재된 바와 같이 존재할 수 있는 이식유전자 상에 위치한다.
또한, 본 발명은 인간 VH 도메인을 포함하거나 또는 인간 HSA 항원으로 면역화된 설치류, 바람직하게는 마우스로부터 수득되거나 또는 수득 가능하며, 인간 중쇄 유전자좌를 발현하는 항-인간 HSA 단일 VH 도메인 항체 또는 항-인간 HSA 중쇄 단독 항체에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 설치류는 기능적 내인성 카파 및 람다 경쇄 및/또는 중쇄를 생성할 수 없다. 상기 인간 중쇄 유전자좌는 상기에 기재된 바와 같이 존재할 수 있는 이식유전자 상에 위치한다.
본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 상기 개시내용은 본 개시내용을 이루고 사용하는 방법뿐만 아니라 이의 최선의 방식을 포함하는, 본 개시내용의 범위 내에 포함된 주제의 일반적 서술을 제공하며, 하기 실시예는 당업자가 본 개시내용을 실시할 수 있도록 추가로 제공된다. 그러나 당업자는 이들 실시예의 세부사항이 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 이의 범위는 본 개시내용에 첨부된 청구범위 및 이의 등가물로부터 이해되어야 하는 것을 알 것이다. 본 개시내용의 다양한 추가적인 양상 및 구체예는 본 개시내용의 관점에서 당업자에게는 명백할 것이다.
유전자 수탁 번호, 과학 간행물의 언급 및 특허 공보에 대한 언급을 포함하는 본 명세서에 언급된 모든 문헌은 그 전문이 참조로 본원에 통합된다.
"및/또는 (and/or)"이 본원에 사용된 경우, 2개의 명시된 특성 또는 구성요소들 모두 또는 각각을 나타내는 특정 개시내용으로 취급되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 이들이 각각 개별적으로 본원에 제시되는 것과 같이, (ⅰ) A, (ⅱ) B 및 (ⅲ) A 및 B 각각의 특정 개시내용으로 취급되어야 한다. 문맥에서 달리 지시하지 않는 한, 상기에 제시된 특성의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 양상 또는 구체예에 제한되지 않으며, 기재된 모든 양상 및 구체예에 동등하게 적용된다.
본 발명은 하기 비-제한적인 실시예에서 추가로 예시된다.
실시예
실시예 1. Tg/TKO 마우스의 제작
내인성 중쇄 및 경쇄 항체 발현을 침묵시킨 배경 내에서 생식세포 형태로 중쇄 항체 유전자이식 유전자좌를 보유하는 마우스 (3중 녹아웃 또는 TKO)를 이전에 개시된 바와 같이 형성하였다 (WO2004/076618 및 WO2003/000737, Ren et al. Genomics, 84, 686, 2004; Zou et al., J. Immunol., 170, 1354, 2003). 간단히 말해서, 유전자이식 마우스는 CH1 도메인, 마우스 인핸서 및 조절 영역이 결여된 마우스 면역글로불린 불변 영역 유전자와 조합된 다수의 인간 VH, D 및 J 유전자를 포함하는 효모 인공 염색체 (YAC)를 가진 새롭게 수정된 난모세포의 전핵 미세주입 후에 유도되었다. 효모 인공 염색체 (YAC)는 효모에서 매우 큰 DNA 삽입물의 클로닝을 위해 사용될 수 있는 벡터이다. 천연의 효모 염색체와 같이 거동하는데 필수적인 모두 3개의 시스-작용 구조적 요소 (자가 복제 서열 (ARS), 센트로미어 (CEN) 및 2개의 텔로미어 (TEL))를 포함할 뿐만 아니라, 큰 DNA 삽입물을 수용할 수 있는 능력은 이들이 염색체-유사 안정성 및 효모 세포에서 전달의 정확도에 필요한 최소 크기 (150 kb)에 도달할 수 있도록 한다. YAC의 제작 및 사용은 당해 분야에 잘 알려져 있다 (예: Bruschi, C.V. and Gjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES 2002 Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group / www.els.net).
사용된 YAC는 약 340 kb이었고, 이의 천연 입체형상으로 10개의 인간 중쇄 V 유전자, 인간 중쇄 D 및 J 유전자, 뮤린 (murine) Cγ1 유전자 및 뮤린 3' 인핸서 유전자를 포함한다. 이는 CH1 엑손이 결여되어 있다. 구체적으로, 상기 YAC는 (5'에서 3'로) 하기를 포함하였다: 텔로미어-효모 TRP1 마커 유전자-센트로미어-23 인간 V 유전자- 인간 D 유전자- 인간 J 유전자-마우스 μ 인핸서 및 스위치-마우스 Cγ1 (CH1Δ) 유전자-마우스 3' 인핸서-하이그로마이신 내성 유전자-효모 마커 유전자 HIS3-텔로미어.
상기 유전자이식 파운더 마우스 (transgenic founder mice)를 내인성 면역글로불린 발현이 결여된 동물과 역-교배시켜서 기재된 면역화 연구에 사용되는 Tg/TKO 라인을 형성하였다.
실시예 2. 면역화를 위한 항원
면역화에 혈청 정제된 인간 및 cyno 혈청 알부민을 사용하였다. 혈청 정제된 인간 (HSA) 및 cyno (CSA) 혈청 알부민을 Sigma (cat# A4327) 및 Abcam (cat# ab184894)으로부터 구입하였다.
실시예 3. 면역화 프로토콜
3마리의 8-12주령의 Crescendo 마우스에게 완전 Freund 아쥬반트 (Complete Freund's Adjuvant) 중에 유화시킨 CSA 50 μg을 피하로 전달하여 초기 면역화를 제공하고, 그 후에 불완전 Freund 아쥬반트 (Incomplete Freund's Adjuvant) 중에 유화시킨 HSA 10 μg을 피하로 투여하여 초기 프라임 이후에 매주 간격으로 3회 부스트 (boosts)하였다. 아쥬반트 없이 인산염 완충 식염수 중에 HSA의 최종 용량을 복강내 투여하였다. 초기 면역화 후 49일차에, 상기 마우스를 희생시키고, 상완 및 사타구니 림프절 및 비장을 RNAlater (Qiagen cat# 76104)로 수확하였다. 혈청을 수집하고, 반응을 테스트하기 위해 저장하였다.
실시예 4. 혈청 ELISA
Nunc Maxisorp 플레이트를 PBS 용액 중에 1 μg/ml의 HSA로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 그 다음에 상기 플레이트를 0.05% Tween 20이 보충된 PBS를 사용하여 세척한 후에, Tween이 부가되지 않은 PBS로 세척하고, PBS 중 3% 탈지분유 (Marvel) 용액으로 실온에서 적어도 1시간 동안 차단하였다. 혈청의 3% Marvel/PBS에서의 희석물을 폴리프로필렌 튜브 또는 플레이트에서 제조하고, 차단된 ELISA 플레이트로 옮기기 전에 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하고, 여기서 적어도 1시간의 추가 인큐베이션이 수행되었다. PBS/Tween 및 PBS로 세척한 후에, PBS/3% Marvel에서 1:10000으로 희석하여 제조된, 바이오틴-접합된 염소 항 마우스 IgG, Fc감마 서브클래스 1 특이적 항체 (Jackson 115-065-205)의 용액을 부가하고, 플레이트를 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션한 다음에, PBS/Tween 및 PBS를 사용하여 세척하였다. 3% Marvel/PBS에서 1:1000으로 희석된 뉴트라비딘-HRP 용액 (Pierce 31030)을 상기 ELISA 플레이트에 부가하고, 적어도 30분 동안 인큐베이션하였다. 추가 세척 후에, 상기 ELISA를 TMB 기질 (Sigma cat. no. T0440)을 사용하여 전개하고, 10분 후에 0.5M H2SO4 용액을 부가하여 반응을 정지시켰다. 흡광도는 450nm에서 판독하여 결정하였다.
실시예 5. 면역화된 마우스로부터 라이브러리의 생성
a. 조직 처리, RNA 추출 및 cDNA 제조
각 면역화된 동물로부터 비장 및 림프절을 RNAlater로 수집하였다. 각 동물에 대해, 비장의 1/4 및 4개의 림프절을 개별적으로 처리하였다. 처음에, 상기 조직을 균질화하였고; 그 후에 RNA 침전으로 이어진다. RNA 정제는 RNeasy 96 QIAcube 키트 및 QIAcube HT plastics를 사용하여 QIAcube에서 수행하였다. 그 다음에 각 RNA 샘플을 사용하여 Superscript III RT-PCR 고정확도 키트를 사용하여 cDNA를 제조하였다.
b. 파지미드 벡터로의 클로닝
PCR-기반 방법을 사용하여 파지미드 벡터인 pUCG3에서 상기 VH cDNA 라이브러리를 클로닝하였다. 정제된 VH RT-PCR 산물은 선형 벡터 pUCG3-C-태그와 함께 메가프라이머 (megaprimers)로 사용되어 파지 라이브러리 형성을 위한 파지미드 산물을 제공하였다. PCR 산물은 1% 아가로스 겔에서 분석하였다. VH/파지미드 PCR 산물은 원래의 동물 (animal-of-origin)에 의해 풀링되고, 제조자의 지침에 따라 Thermo GeneJet PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 용출된 DNA는 Bio-Rad GenePulser Xcell를 사용한 전기영동에 의해 TG1 대장균 (Lucigen, cat. no. 60502-2)을 형질전환시키는데 사용하였다.
상기 형질전환의 10배 희석 계열을 2% (w/v)의 글루코스 및 100 μg/ml의 암피실린을 갖는 2xTY 아가 패트리 플레이트 (agar petri plates)에 플레이팅하였다. 상기 디쉬에서 수득된 콜로니를 사용하여 라이브러리 크기를 추정하였다. 나머지 형질전환은 2% (w/v)의 글루코스 및 100 μg/ml의 암피실린이 보충된 대형 2xTY 아가 Bioassay 디쉬에 플레이팅하였다. 모든 아가 플레이트를 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 대형 bioassay 디쉬에 2xTY 배양액 10 ml를 부가하여 라이브러리를 수확하였다. 박테리아 콜로니를 부드럽게 긁어 내고, OD600을 기록하였다. 알리코트 (aliquots)는 50% (v/v) 글리세롤 용액의 동일한 부피를 부가한 후 냉동바이알 (cryovials)에서 -80℃에서 저장하거나, 또는 파지 선택 과정에서 직접 사용하였다.
실시예 6. HSA-결합 V H 의 단리를 위한 선택 전략
Humabody® 리드를 생성하기 위해, 마우스로부터의 PEG 침전된 파지 라이브러리를 pH5 또는 pH7에서 면역관 결합 (immuno-tube bound) 재조합 HSA 단백질과 패닝 선택 (panning selections)에 사용하여 공개된 방법 (Antibody Engineering, Edited by Benny Lo, chapter 8, p161-176, 2004)에 따라 인간 혈청 알부민 결합을 증강시켰다.
실시예 7. 표적 결합에 대한 분석법
다양한 선택으로부터의 VH를, HSA 및 CSA에 대한 VH 결합을 확인하기 위해 하기 하나 이상의 분석법으로 스크리닝하였다.
a. 인간 및 cyno 혈청 알부민에 대한 비드 기반 FLISA 결합 분석법
리드 (lead)인 Humabody VH HSA194-D04 및 HSA191E0-2의 경우, 플레이트에서 주변세포질 추출물은 인간 및 필리핀 원숭이 혈청 알부민에 결합하는 특정 클론을 확인하기 위해 형광 미세부피 분석 기술 (fluorescence microvolume assay technology)을 사용하여 균질한 고처리량 분석법 (homogenous high throughput assays)에서 테스트하였다. 균질한 분석 형식으로 분석 플레이트의 웰 바닥에서 정의된 부피내 세포 결합된 형광을 측정하는 형광 미세부피 분석 기술을 사용하여 분석을 수행하였다 (Dietz et al., Cytometry 23:177-186 (1996), Miraglia et al., J. Biomol. Screening 4:193-204 (1999). 상기 분석은 384 웰 분석 형식으로 수행하였고 - 상기 데이터를 분석하기 위해, 후속하여 공급원인 주변세포질 샘플 플레이트의 96웰 레이아웃 (96 well layout)으로 되돌렸다. 소-규모의 박테리아 주변세포질 추출물을 딥 웰 플레이트 (deep well plates)에서 성장시킨, 1 ml의 배양물로부터 제조하였다. 스타터 배양물 (starter cultures)을 사용하여, 0.1% (w/v)의 글루코스+ 100 μg/ml의 암피실린이 보충된 2XTY 브로스 (Melford, M2130)을 함유하는 96-웰 딥 웰 플레이트 (Fisher, cat# MPA-600-030X)에 접종하고, 30℃에서 250 rpm으로 진탕하였다. OD600이 0.5-1에 도달한 경우, IPTG (최종 농도 5 mM) 및 암피실린이 보충된 100 μl의 2XTY를 부가하여 VH 생성을 유도하고, 상기 배양물을 220 rpm으로 진탕하면서 30℃에서 밤새 성장시켰다. 대장균을 3200 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 펠릿화하고, 상등액은 버렸다. 세포 펠릿을 120 μl의 빙냉한 MES 버퍼 (50 mM MOPS, 0.5 mM EDTA, 20% 0.5M 수크로스) 중에 재현탁시킨 다음에, 180 μl의 1:5로 희석된 빙냉한 추출 버퍼를 부가하였다. 세포를 얼음에서 30분 동안 인큐베이션한 다음에, 4℃에서 4500 rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 상등액을 폴리프로필렌 플레이트로 옮기고, 1 x PBST 차단 용액에서 인큐베이션한 후에, ELISA에서 직접 사용하였다.
비드 집단: 재조합 HSA 도메인 I-II (cat#9905), 재조합 HSA 도메인 II (cat. #9902) 및 CSA에 결합된 SOL-R4, SOL-R5 Tm 카복실 비드. 상기 비드를 필요한 농도로 희석하였다.
b. 정제된 V H 의 제조
VH는 pJExpress 벡터를 가진 W3110 대장균의 상등액으로부터 정제되었다. 이러한 절차를 위해, 최대 1L의 배양물을, 0.1% (w/v) 글루코스+ 50 μg/ml 카나마이신이 보충된 2xTY 브로스 (Melford, M2130)에서 250 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 성장시켰다. OD600이 0.5-1에 도달한 경우, IPTG 및 카나마이신을 부가하여 VH 생성을 유도하였고, 상기 배양물을 250 rpm으로 진탕하면서 30℃에서 밤새 성장시켰다. 대장균을 3200 rpm으로 원심분리하여 펠렛화하고, 수득된 상등액을 수확하고, Capture Select C-tag XL 친화성 매트릭스 (Thermo Fisher Cat# 2943072010)를 사용하여 VH를 정제한 후에, AKTA Pure 시스템에서 HiLoad 26/600 Superdrex 75 pg 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다.
정제된 VH의 수율은 분광광도계로 추정하였고, 순도는 SDS PAGE를 사용하여 평가하였다.
c. 결합 동역학
pH 7.4 및 pH 6.0에서 인간, cyno 및 마우스 혈청 알부민을 사용한 결합 연구는 Biacore T200에서 단일 주기 동역학 (single cycle kinetics)을 사용하여 수행하였다. 혈청 알부민 (HSA, CSA, MSA)을 아민 시약 커플링 키트 GE Healthcare BR-1000-50을 사용하여 아민 커플링에 의해 CM5 칩에 커플링하였다. 제조자의 지침에 따라 칩 표면을 활성화하였다. 혈청 알부민 (HSA, CSA, MSA)을 포착하고, 10 mM 아세트산 나트륨, pH 5.0 중 혈청 알부민 (HSA, CSA, MSA)을 주입하여 센서 칩 표면에 가교시켰다. 그 후에 1M 에탄올아민을 주입하여 상기 표면 상에 혈청 알부민을 안정화시켰다. 이러한 절차로, 약 300 RU가 고정되었다.
동역학 측정을 위해, PBST pH 7.4 또는 PBST pH 6.0에서 VH 단일 도메인 항체 (194D04-2 또는 191E02-2)의 4배 계열 희석물을 25℃에서 45 μl/분의 유속으로 120초 회합 및 300초 해리로 주입하였다. 블랭크 유세포 및 동일한 유세포에서 수행된 버퍼를 모두 차감하여 결합 반응을 수정하였다. 트레이스 (traces)는 1:1 모델을 사용하여 피팅하였다.
인간 혈청 알부민 (HSA) Cyno 혈청 알부민 (CSA) MSA
K D ka (1/Ms) kd (1/s) K D ka (1/Ms) kd (1/s) K D
서열번호: 30 pH 7.4 5.9E-07 3.3E+05 1.9E-01 1.0E-07 2.9E+05 4.1E-02 결합 없음
서열번호: 30 pH 6.0 6.0E-07 5.3E+05 3.2E-01 9.9E-08 6.4E+05 6.44E-02 결합 없음
서열번호: 5 pH 7.4 3.0E-08 6.2E+05 1.9E-02 1.1E-08 5.7E+05 6.5E-03 결합 없음
서열번호: 5 pH 6.0 3.7E-08 8.4E+05 3.1E-02 4.9E-09 6.4E+05 3.2E-03 결합 없음
표 2: 혈청 알부민에 대한 Humabody VH에 대한 계산된 동역학 상수 및 KD.
실시예 9 - V H 단일 도메인 항체는 우수한 안정성을 나타냄.
정제된 VH를 크기 배제 크로마토그래피로 처리하였다. 간단히 말해서, 정제된 VH를 4℃ 또는 25℃에서 0-7일 동안 선택된 버퍼 중에 10 mg/ml로 저장한 다음에, Waters ACQUITY BEH 125Å SEC 컬럼에서 분리와 함께 PDA 검출기 (280 nm에서 검출)를 포함하는 Waters H-Class Bio UPLC를 사용하여 다양한 시점에서 분석하였다. 샘플을 10μl 부피로 주입하고, 200 mM NaCl, 100 mM 인산나트륨, pH 7.4 + 5% 프로판-1-올을 함유하는 이동상에서 0.4 ml/분의 유속으로 수행하였다. 데이터를 6분 동안 수집하고, 저장 후에 샘플 중에 단량체 단백질의 퍼센트를 계산하였다.
4℃ 및 40℃에서 7일 동안 인큐베이션한 후에, 유의미한 변화는 보이지 않았다.
SEC에 의한 순도 % SEC에 의한 순도 %, 4℃ SEC에 의한 순도 %, 40℃
　 1 7 0 1 7
TPP-712 99.48 99.35 99.48 99.15 96.66
TPP-814 99.23 98.80 99.23 98.28 93.29
표 3: TPP-712 및 814의 안정성. 이는 0, 1 및 7일 후에 존재하는 단량체의 퍼센트를 나타낸다.
실시예 10 이중 유전자이식 인간화 FcRn/HSA 마우스에서 반감기가 연장된 구조체의 단일 정맥내 투여의 약동학적 분석
간단히 말해서, 수컷 또는 암컷 GenOway 인간 HSA/FcRn Tg 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 하기 표 4에 열거된 화합물 (n = 3)을 1 또는 2 mg/kg으로 단일 정맥내 주사로 투여하였다. 일부 구조체는 정제/검출 태그 예컨대 폴리히스티딘 또는 FLAG 태그를 함유하였다. 혈액 샘플은 복재 정맥 (saphenous vein)을 통해, 약물 투여 전 및 약물 투여 후 0.083시간, 1시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 수집하였다. 투여 후 168시간에, 모든 동물을 안락사시키고, 혈액을 수집하였다. 혈장을 분리하고, 분석을 수행할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 혈장 샘플은 캡쳐로서 바이오틴화 인간 PSMA 또는 인간 CD137, 및 검출로서 인간 CD137Dylight650, 인간 PD-1 Dylight650 또는 항-Flag-AF647 토끼 mAb (NEB, cat# 15009S)를 사용하여, Gyrolab 면역분석 플랫폼에서 분석하였다. 혈장 중 화합물 농도를 수득하기 위해 Gyros를 사용하여 데이터를 분석하였다. 데이터의 약동학적 분석은 엑셀의 추가 기능인 PK Solver 2.0을 사용하여 수행하였다. 연구 결과로부터 화합물들은 인간 HSA/FcRn Tg 마우스에서 1 또는 2 mg/kg으로 정맥내 투여하는 경우 반감기를 19.9 내지 78.7시간을 갖는 것을 보여주었다.
번호 형식 (특정 표적에 VH의 결합) 용량 (mg/kg) Cmax
[μg/ml] 		반감기 [h]
814 단백질 서열 서열번호: 22, 핵산 서열 서열번호: 23 PSMA-6GS-CD137-6GS-HSA 상기 HSA 결합제는 서열번호: 5에 제시된 것임 1 17.5 40.7
712 단백질 서열 서열번호: 24, 핵산 서열 서열번호: 25 PSMA-6GS-CD137-6GS-HSA 상기 HSA 결합제는 서열번호: 30에 제시된 것임 1 23.8 22.5
446 단백질 서열 서열번호: 26, 핵산 서열, 서열번호: 27 PSMA-6GS-HSA 상기 HSA 결합제는 서열번호: 1에 제시된 것임 2 43.9 26
708 단백질 서열 서열번호: 28, 핵산 서열, 서열번호: 29 PSMA-6GS-HSA 상기 HSA 결합제는 서열번호: 5에 제시된 것임 1 20.9 78.7
1010 단백질 서열 서열번호: 34, 핵산 서열 서열번호: 37 PD-1-6GS-HSA-6GS-CD137 상기 HSA 결합제는 서열번호: 30에 제시된 것임 2 53.7 20.3
1027 단백질 서열 서열번호: 32, 핵산 서열 서열번호: 38 CD137-6GS-HSA-6GS-PD-1 상기 HSA 결합제는 서열번호:30에 제시된 것임 2 54.5 19.9
1028 단백질 서열 서열번호: 33, 핵산 서열 서열번호: 39 CD137-6GS-HSA-6GS-PD-1 상기 HSA 결합제는 서열번호: 5에 제시된 것임 2 61.3 51.6
표 4: pK 파라미터에 대한 요약표.
실시예 8 필리핀 원숭이에서 PK 연구
필리핀 원숭이의 PK 연구를 시작하기 전에, Crescendo Biologics 및 계약 연구 기관 모두에서 대체, 감소 및 개선 고려 사항뿐만 아니라 윤리적 및 과학적 정당성 (예: 표적 발현/인간에 대한 상동성, 용량 수준 등), 및 위험에 대한 검토를 수행하였다. 이러한 필리핀 원숭이의 PK 연구에서 동물 연구는 영국에 근거를 둔 계약 연구 기관에서 UK Home Office Project 라이선스에 따라 수행하였다. 본 연구를 관장하는 Home Office 라이선스는 동물에 대한 영향의 심각성의 한계를 엄격하게 명시하였다. 상기 프로토콜의 절차는 절차의 심각성 한계를 초과하는 어떠한 영향도 유발하지 않았다.
간단히 말해서, 3마리의 수컷 필리핀 원숭이에게 표에 열거된 4 mg/kg의 Humabody 구조체 (TPP-1246)를 투여하였고, 본 연구는 Charles River Study에서 수행하였다. 혈청 샘플은 모든 테스트 대상체로부터 투여 전 (-24시간), 투여 후 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 120시간, 168시간, 216시간, 264시간, 312시간, 360시간, 408시간 및 504시간에 채취하고, 테스트 전에 동결하였다. PK 분석은 Crescendo에서 개발된 분석법을 사용하여 혈청 샘플에 대해 수행하였다.
상기 PK 분석법은 샌드위치 면역분석 형식 (sandwich immunoassay format)을 사용하는 Gyrolab Xplore 면역분석 플랫폼을 활용하였다; 분석물 (하기 표에 열거됨)은 바이오틴화된 CD137 항원에 의해 고정되고, dyLight650 표지된 PD-1로 검출하였다. 상기 분석법은 범위 및 재현성을 확인하기 위해 최적화 및 수립되었고, 샘플 분석은 수립된 분석에 따라 완료하였다. 상기 PK 분석은 하기 시점으로부터 PK 데이터에서 수행하였다: 동물 01: 1 내지 168시간, 동물 02: 1 내지 120시간 및 동물 03: 1 내지 168시간. 보고된 PK 파라미터는 각 결과에 대해 3마리의 개체들로부터의 평균이다. Cyno 혈청 중 TPP-1246의 T1/2은 84.5시간 ± 7.58시간인 것으로 나타났다. 데이터는 도 1에 도시되어 있다.
필리핀 원숭이에서 TPP-1246의 단일 정맥내 투여 후에 PK 파라미터 추정치
TPP 화합물 명칭 용량 (mg/kg) Cmax [μg/ml] 반감기 [h]
1246
단백질 서열 서열번호: 35, 핵산 서열 서열번호: 36		 CD137-6GS-HSA-6GS-PD-1
상기 HSA 결합제는 서열번호:30에 제시된 것임		 4 100.6939 84.51278
상기 모든 실험에 사용된 분자는 상기 언급한 분자를 기반으로 하였다. 테스트된 분자에는 적절한 경우, 정제 태그와 같은 C-말단 서열을 포함하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Crescendo Biologics Limited <120> Binding Molecules <130> P36323WO1 <150> GB1906870.9 <151> 2019-05-15 <150> GB1906872.5 <151> 2019-05-15 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ala Gly Thr His Ile Tyr Ser Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro His Ser Thr Gly Trp Tyr Lys Asp Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Tyr Asn Met Asn 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Ile Ser Ser Ala Gly Thr His Ile Tyr Ser Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Pro His Ser Thr Gly Trp Tyr Lys Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Arg Met Val Gly Asn Pro His Glu Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Tyr Thr Met Asn 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ser Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Pro Arg Met Val Gly Asn Pro His Glu Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 9 <211> 609 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 20 25 30 His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 35 40 45 Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 50 55 60 Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 65 70 75 80 Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95 Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 100 105 110 Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 115 120 125 His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 130 135 140 Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 145 150 155 160 Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175 Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190 Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 195 200 205 Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Gly Leu Lys Cys 210 215 220 Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 225 230 235 240 Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255 Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly 260 265 270 Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile 275 280 285 Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 290 295 300 Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp 305 310 315 320 Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly 340 345 350 Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365 Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 385 390 395 400 Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 405 410 415 Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu 420 425 430 Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445 Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 455 460 Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Cys Leu Ser Val Phe 465 470 475 480 Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 485 490 495 Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Gly Arg Pro Cys Phe 500 505 510 Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525 Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540 Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 545 550 555 560 Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 565 570 575 Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 580 585 590 Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 595 600 605 Leu <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal extension <400> 10 Val Thr Val Ser Ser 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-tag <400> 11 His His His His His His 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly Ser linker <400> 12 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly Ser linker <400> 13 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly Ser linker <400> 14 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly Ser linker <400> 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly Ser linker <400> 16 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly Ser linker <400> 17 Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly Ser linker <400> 18 Gly Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly Ser linker <400> 19 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 20 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactataaca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaaga ggctggagtg ggtctcatcg attagtagtg ctggtactca catatactcc 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acaggtgttt attactgtgc gagagatcct 300 catagcactg gctggtacaa ggactttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 21 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ctggtcaagc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt agctatacca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtggtcgtta catatactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcattatat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acagctgtat attattgtgc gagagatccc 300 cgtatggttg ggaaccccca tgaatttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 22 <211> 422 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TPP-814 construct <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Pro Ala Trp Gly Leu Arg Leu Gly Glu Ser Ser Ser Tyr 100 105 110 Asp Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 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gaggtggtag tgaggtgcag 480 ttagttgaga gcggaggtgg tttagttcag ccggggggct cgcttcgcct gtcgtgcgcc 540 gcctcgggat tcacattatc aaactactgg atgaattggg tccgccaggc tccgggcaaa 600 ggtcttgagt gggtggcgaa cattaatcag gacgggagcg agcgttatta cgttgattcg 660 gtaaaaggac gtttcactat cagtcgtgac aacgctaaaa attccttgta cttacagatg 720 aactcacttc gtgctgagga caccgcagtg tactactgtg ctcgcggtgg tgaaggatac 780 ggcgtcgatc actacggcct tgatgtatca ggacagggga ctacagttac cgtctcttcc 840 ggaggtggag gttcaggagg tggtggttct ggtggtggcg gttcaggtgg aggtggtagt 900 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ctggtcaagc cgggggggtc cctgagactc 960 tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt agctatacca tgaactgggt ccgccaggct 1020 ccggggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtggtcgtta catatactac 1080 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcattatat 1140 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acagctgtat attattgtgc gagagatccc 1200 cgtatggttg ggaaccccca tgaatttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 1260 tcctca 1266 <210> 24 <211> 432 <212> PRT <213> Artificial 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Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Arg Met Val 245 250 255 Gly Asn Pro His Glu Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 260 265 270 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 275 280 285 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly 305 310 315 320 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp 325 330 335 Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 340 345 350 Val Ser Gly Ile Thr Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser 355 360 365 Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu 370 375 380 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 385 390 395 400 Cys Val Arg Asp Lys Tyr Ser Tyr Ala Trp Ser Tyr Asp Asp Phe Asp 405 410 415 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His 420 425 430 His His His His His 435 <210> 34 <211> 437 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg 600 gtctcatcga ttagtagtgc tggtactcac atatactacg cagactcagt gaagggccga 660 ttcaccatct ccagagacaa cgccaagaac tcactgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga 720 gccgaggaca cagctgttta ttactgtgcg agagatcctc atagcactgg ctggtacaag 780 gactttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcaggtgg tggcggttca 840 ggcggaggtg gctctggagg tggaggttca ggaggtggtg gttctggcgg cggtggatcg 900 ggtggaggtg gtagtgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggtgtggt acggcctggg 960 gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct ttgatgatta tgccatgagt 1020 tgggtccgcc aagctccagg gaaggggctg gagtgggtct ctggtattac ttggaatggt 1080 ggtagcacag gttatgcaga ctctgtgaag gaccgattca ccatctccag agacaacgcc 1140 aagaactccc tgtatctgca aatgaacagt ctgagagccg aggacacggc cttgtattac 1200 tgtgtgagag acaagtatag ctatgcctgg tcttatgatg attttgatat ctggggccaa 1260 gggacaatgg tcaccgtctc ctca 1284 <210> 37 <211> 1311 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPP-1010 construct <400> 37 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggt gtggtacggc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgagttgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctctggt attacttgga atggtggtag cacaggttat 180 gcagactctg tgaaggaccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccttgt attactgtgt gagagacaag 300 tatagctatg cctggtctta tgatgatttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360 gtctcctcag gtggtggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gaggtggagg ttcaggaggt 420 ggtggttctg gcggcggtgg atcgggtgga ggtggtagtg aggtgcagct ggtggagtct 480 gggggaggcc tggtcaagcc tggggggtcc ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc 540 accttcagta actataacat gaactgggtc cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg 600 gtctcatcga ttagtagtgc tggtactcac atatactacg cagactcagt gaagggccga 660 ttcaccatct ccagagacaa cgccaagaac tcactgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga 720 gccgaggaca cagctgttta ttactgtgcg agagatcctc atagcactgg ctggtacaag 780 gactttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcaggcgg aggtggctct 840 ggaggaggag gttcaggagg tggtggatct ggaggaggcg gatcgggggg tggaggaagt 900 ggcggcggtg gtagtgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggcgttgt ccagcctggg 960 gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagtaatta tggcatgcac 1020 tgggtccgcc aggctccagg caagggcctg gagtgggtgg cagtcatatc aaatgatgga 1080 aatactaaaa cctatgcaga ttccgtgaag ggccgattca ccatctccag agacaattcc 1140 aagaacacgt tatatctgca aatgaacagc ctgagagctg aggacacggc tgtgtattac 1200 tgtgcgcaag atgagacgac tacagtaact gcgtcgtatt actttgacta ctggggccag 1260 ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcggcc gcacaccacc atcatcacca c 1311 <210> 38 <211> 1311 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPP-1027 construct <400> 38 gaggtgcagt tagttgagag cggaggtggt ttagttcagc cggggggctc gcttcgcctg 60 tcgtgcgccg cctcgggatt cacattatca aactactgga tgaattgggt ccgccaggct 120 ccgggcaaag gtcttgagtg ggtggcgaac attaatcagg acgggagcga gcgttattac 180 gttgattcgg taaaaggacg tttcactatc agtcgtgaca acgctaaaaa ttccttgtac 240 ttacagatga actcacttcg tgctgaggac accgcagtgt actactgtgc tcgcggtggt 300 gaaggatacg gcgtcgatca ctacggcctt gatgtatcag gacaggggac tacagttacc 360 gtctcttccg gtggtggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gaggtggagg ttcaggaggt 420 ggtggttctg gcggcggtgg atcgggtgga ggtggtagtg aggtgcagct ggtggagtct 480 gggggaggcc tggtcaagcc tggggggtcc ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc 540 accttcagta actataacat gaactgggtc cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg 600 gtctcatcga ttagtagtgc tggtactcac atatactacg cagactcagt gaagggccga 660 ttcaccatct ccagagacaa cgccaagaac tcactgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga 720 gccgaggaca cagctgttta ttactgtgcg agagatcctc atagcactgg ctggtacaag 780 gactttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcaggtgg tggcggttca 840 ggcggaggtg gctctggagg tggaggttca ggaggtggtg gttctggcgg cggtggatcg 900 ggtggaggtg gtagtgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggtgtggt acggcctggg 960 gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct ttgatgatta tgccatgagt 1020 tgggtccgcc aagctccagg gaaggggctg gagtgggtct ctggtattac ttggaatggt 1080 ggtagcacag gttatgcaga ctctgtgaag gaccgattca ccatctccag agacaacgcc 1140 aagaactccc tgtatctgca aatgaacagt ctgagagccg aggacacggc cttgtattac 1200 tgtgtgagag acaagtatag ctatgcctgg tcttatgatg attttgatat ctggggccaa 1260 gggacaatgg tcaccgtctc ctcagcggcc gcacaccacc atcatcacca c 1311 <210> 39 <211> 1311 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPP-1028 construct <400> 39 gaggtgcagt tagttgagag cggaggtggt ttagttcagc cggggggctc gcttcgcctg 60 tcgtgcgccg cctcgggatt cacattatca aactactgga tgaattgggt ccgccaggct 120 ccgggcaaag gtcttgagtg ggtggcgaac attaatcagg acgggagcga gcgttattac 180 gttgattcgg taaaaggacg tttcactatc agtcgtgaca acgctaaaaa ttccttgtac 240 ttacagatga actcacttcg tgctgaggac accgcagtgt actactgtgc tcgcggtggt 300 gaaggatacg gcgtcgatca ctacggcctt gatgtatcag gacaggggac tacagttacc 360 gtctcttccg gtggtggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gaggtggagg ttcaggaggt 420 ggtggttctg gcggcggtgg atcgggtgga ggtggtagtg aggtgcagct gttggagtct 480 gggggaggcc tggtcaagcc gggggggtcc ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc 540 accgtcagta gctataccat gaactgggtc cgccaggctc cggggaaggg gctggagtgg 600 gtctcatcca ttagtagtag tggtcgttac atatactacg cagactcagt gaagggccga 660 ttcaccatct ccagagacaa cgccaagaac tcattatatc tgcaaatgaa cagcctgaga 720 gccgaggaca cagctgtata ttattgtgcg agagatcccc gtatggttgg gaacccccat 780 gaatttgata tctggggcca agggacaatg gtcaccgtct cctcaggtgg tggcggttca 840 ggcggaggtg gctctggagg tggaggttca ggaggtggtg gttctggcgg cggtggatcg 900 ggtggaggtg gtagtgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggtgtggt acggcctggg 960 gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct ttgatgatta tgccatgagt 1020 tgggtccgcc aagctccagg gaaggggctg gagtgggtct ctggtattac ttggaatggt 1080 ggtagcacag gttatgcaga ctctgtgaag gaccgattca ccatctccag agacaacgcc 1140 aagaactccc tgtatctgca aatgaacagt ctgagagccg aggacacggc cttgtattac 1200 tgtgtgagag acaagtatag ctatgcctgg tcttatgatg attttgatat ctggggccaa 1260 gggacaatgg tcaccgtctc ctcagcggcc gcacaccacc atcatcacca c 1311

Claims (26)

  1. 인간 (human) HSA에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체로서,
    a) 서열번호: 2, 또는 서열번호: 2와 1 또는 2개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
    b) 서열번호: 3, 또는 서열번호: 3과 1, 2, 3, 4, 5, 6개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및
    c) 서열번호: 4, 또는 서열번호: 4와 1, 2, 3 또는 4개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호: 1, 또는 이에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95%의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체.
  3. 청구항 2에 있어서, 서열번호: 30, 또는 이에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95%의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체.
  4. 인간 HSA에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체로서,
    d) 서열번호: 6, 또는 서열번호: 6과 1 또는 2개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
    e) 서열번호: 7, 또는 서열번호: 7과 1, 2, 3, 4, 5, 6개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및
    f) 서열번호: 8, 또는 서열번호: 8과 1, 2, 3 또는 4개의 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체.
  5. 청구항 4에 있어서, 서열번호: 5, 또는 이에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95%의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체.
  6. 청구항 1 내지 5에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 단백질 또는 구조체.
  7. 청구항 6에 있어서, 치료용 모이어티 (therapeutic moiety)를 포함하는 단백질 또는 구조체.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 치료용 모이어티는 항체 또는 이의 단편인 것인 단백질 또는 구조체.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 단편은 scFv, Fv, 중쇄 또는 단일 도메인 항체인 것인 단백질 또는 구조체.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 단일 도메인 항체는 단일 가변 중쇄 도메인 항체인 것인 단백질 또는 구조체.
  11. 청구항 6 내지 10 중 어느 항에 있어서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체가 상기 치료용 모이어티에 펩티드 링커를 사용하여 연결되는 것인 단백질 또는 구조체.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 펩티드 링커는 (G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 15인 것인 단백질 또는 구조체.
  13. 청구항 6 내지 12 중 어느 항에 있어서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체는 상기 단백질의 N 또는 C 말단 단부에 위치하는 것인 단백질 또는 구조체.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체는 상기 단백질의 C 말단 단부에 위치하고, 1 내지 50개의 아미노산의 C 말단 연장부를 포함하는 것인 단백질 또는 구조체.
  15. 단백질의 반감기를 연장하는 방법으로서, 청구항 1 내지 5 중 어느 항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체에 상기 단백질을 결합시키는 단계를 포함하는 방법.
  16. 청구항 1 내지 5 중 어느 항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인이 융합 단백질에서 치료용 모이어티에 연결되는 경우 상기 치료용 모이어티의 반감기를 연장하는데 있어서, 청구항 1 내지 5 중 어느 항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체의 용도.
  17. 청구항 1 내지 5 중 어느 항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 청구항 6 내지 14 중 어느 항에 따른 단백질 또는 구조체를 포함하는 약학적 조성물.
  18. 청구항 1 내지 5 중 어느 항에 따른 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열.
  19. 청구항 18에 있어서, 서열번호: 16을 포함하는 핵산 서열.
  20. 청구항 18 또는 19에 있어서, 상기 핵산 서열이 링커를 사용하여 제2 핵산 서열에 연결되는 것인 핵산 서열.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 제2 핵산은 치료용 모이어티를 코딩하는 것인 핵산 서열.
  22. 청구항 20 또는 21에 있어서, 상기 링커는 핵산 링커인 것인 핵산 서열.
  23. 청구항 18 내지 22 중 어느 항에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  24. 청구항 18 내지 22 중 어느 항에 따른 핵산 서열 또는 청구항 23의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  25. 청구항 1 내지 5 중 어느 항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체, 또는 청구항 6 내지 14 중 어느 항에 따른 단백질 또는 구조체, 또는 청구항 16에 따른 약학적 조성물을 포함하는 키트.
  26. 인간 HSA에 결합할 수 있는 청구항 6 내지 14 중 어느 항에 따른 적어도 하나의 인간 면역글로불린 단일 도메인 항체를 포함하는 결합 분자를 제조하는 방법으로서,
    상기 도메인은 인간 VH 도메인이고,
    상기 방법은:
    a) 유전자이식 마우스를 HSA 항원으로 면역화하는 단계로서, 상기 마우스는 인간 중쇄 V 유전자를 포함하는 핵산 구조체를 발현하고, 기능적 내인성 경쇄 또는 중쇄를 생성할 수 없는 것인 단계,
    b) 상기 마우스로부터 VH 도메인 서열을 포함하는 서열 라이브러리를 생성하는 단계; 및
    c) 상기 라이브러리로부터 VH 도메인 서열을 포함하는 서열을 단리하는 단계를 포함하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0115256D0 (en) 2001-06-21 2001-08-15 Babraham Inst Mouse light chain locus
GB2398784B (en) 2003-02-26 2005-07-27 Babraham Inst Removal and modification of the immunoglobulin constant region gene cluster of a non-human mammal
WO2012072731A2 (en) * 2010-12-01 2012-06-07 Glaxo Group Limited Improved anti-serum albumin binding single variable domains
AU2013257848A1 (en) * 2012-05-07 2014-11-27 The University Court Of The University Of Aberdeen Single domain binding molecule
AU2014409276A1 (en) 2014-10-22 2017-04-06 Crescendo Biologics Limited Transgenic mice
JP7101621B2 (ja) * 2016-05-20 2022-07-15 ハープーン セラピューティクス，インク． 単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質
AU2017373746A1 (en) * 2016-12-07 2019-05-30 Ablynx Nv Improved serum albumin binding immunoglobulin single variable domains
WO2018127710A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Crescendo Biologics Limited Single domain antibodies to programmed cell death (pd-1)
GB201711068D0 (en) * 2017-07-10 2017-08-23 Crescendo Biologics Ltd Therapeutic molecules binding PSMA
EP3470426A1 (en) * 2017-10-10 2019-04-17 Numab Therapeutics AG Multispecific antibody
WO2019092452A1 (en) * 2017-11-13 2019-05-16 Crescendo Biologics Limited Molecules that bind to cd137 and psma

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