ES2302917T3 - Dimeros de avidina eficaces en aumentar la concentracion de biotina radiactiva en radioinmunoterapia predirigida. - Google Patents

Abstract

Dímero de avidina, en el que dos moléculas de avidina están unidas a través de los grupos -NH2 por medio de suberato.

Description

Dímeros de avidina eficaces en aumentar la concentración de biotina radiactiva en radioinmunoterapia predirigida.

La invención descrita aquí se refiere a derivados de avidina que son útiles en el diagnóstico y tratamiento de tumores, y particularmente en el llamado método predirigido en tres pasos.

Campo técnico

La invención descrita aquí se refiere a avidinas modificadas que son útiles para su uso en el diagnóstico y terapia en seres humanos y animales, y particularmente para el diagnóstico y tratamiento de procesos patológicos tales como tumores.

La invención descrita aquí se refiere al campo técnico de la preparación de medicamentos y medios de diagnóstico y proporciona compuestos, métodos para su preparación, métodos para su uso, y composiciones que los contienen que son adecuadas para la aplicación industrial en el campo farmacéutico.

La invención descrita aquí proporciona compuestos, composiciones y métodos que son útiles en medicamentos diagnósticos y terapéuticos, como técnicas de adquisición de imágenes y tratamientos para procesos patológicos de órganos y tejidos.

En particular, pero no exclusivamente, la presente invención se refiere al campo de la terapia de tumores por medio de radiofármacos.

Antecedentes de la invención

La terapia de tumores se realiza principalmente por medio del uso de sustancias cuyo fin es matar las células del tumor. Esto se puede alcanzar con sustancias citotóxicas que tienen que entrar en la célula tumoral para ejercer su efecto completo, o por medio del tratamiento de las células tumorales con radiación con la suficiente energía para matar la célula. En ambos casos, existe el problema de administrar la sustancia tan selectivamente como sea posible a la célula diana, para evitar el posible daño a las células sanas adyacentes. En el caso de los radiofármacos, es decir de sustancias que llevan partes radiactivas, el problema de administrar de forma selectiva la parte activa (es decir, la parte radiactiva) a la diana tumoral, evitando la expansión del radionúclido en el cuerpo o en las células sanas adyacentes al tumor, es de particular importancia.

Un método particularmente eficaz para la detección y terapia de tumores se describe en la patente EP 0 496 074. El protocolo de esta patente se ha aplicado a la llamada Radioinmunoterapia Predirigida Guiada por Anticuerpos (PAGRIT, Pretargeted Antibody-Guided Radioimmunotherapy) de tumores cerebrales. En este método, se inyecta avidina en el sujeto humano, después del anticuerpo monoclonal anti-tenascina biotinilado (Mab-B), para eliminar cualquier Mab-B libre, no unido al tumor, de la corriente sanguínea mediante la formación de complejos que son eliminados de forma eficaz por el hígado (efecto caza). Se administra entonces una infusión de estreptavidina con el fin de obtener mejor avidinación del tumor comparada con la que se puede obtener con avidina, cuya permanencia en la sangre es demasiado corta comparada con la de la estreptavidina.

Aunque el sistema ha mostrado respuestas clínicas positivas (Cremonesi, M. et al., 1999; Paganelli, G. et al., 1999; Paganelli, G. et al., 2001), un factor limitante principal consiste en la fuerte respuesta inmune producida por la estreptavidina (Paganelli et al., 1997). Con el propósito de superar estos dos obstáculos, es decir el alto grado de inmunogenicidad de la estreptavidina y la rápida depuración de la avidina, se han usado avidinas que están modificadas químicamente mediante unión covalente de cadenas de polioxietilenglicol (PEG) a la avidina, con varios niveles de derivación en base al uso de PEGs lineales o ramificados de diferentes pesos moleculares. Los estudios preliminares han revelado que, con el aumento en el grado de funcionalización de la avidina con PEG (de aquí en adelante denominado como pegilación), hay un aumento en la vida media en plasma de la avidina, una disminución en la inmunogenicidad, y una mejora en la biodistribución específica de la sustancia en relación al tumor.

Puesto que la capacidad de la avidina-PEG de unirse a la biotina de Mab-B se reduce por la pegilación, el resultado es una reducción en la potencia de los derivados (Chinol, M. et al., 1998).

Se ha propuesto una solución a este problema en la solicitud de patente WO 94/23759, presentada en nombre de Immunomedics, donde se describen multipolímeros de avidina en base a la derivación química de moléculas de alto peso molecular, preferiblemente mayor de 5.000 Da, tal como dextrano, proteínas y ácidos policarboxílicos. Pero ninguno de los cinco multímeros descritos realmente en la patente se ha caracterizado en términos de su potencia de acción en el procedimiento predirigido o en otros procedimientos.

La patente de EE.UU. No. 5482698 divulga multímeros de avidina tetramérica para su uso en el método predirigido en tres pasos, las avidinas se conjugan a través de dextrano y contienen 2-3 unidades de avidina por dextrano; divulga además cómo tales multiavidinas se usan en radioinmunoterapia contra el cáncer incluyendo los pasos prediri-
gidos.

Como se demuestra en la invención descrita aquí, el concepto general de multimerización (que incluye también dimerización), dado en la solicitud de patente mencionada anteriormente WO 94/237599, falla en proporcionar instrucciones completas y suficientes para que el técnico medio encuentre un multímero de avidina genérico capaz de cumplir los requerimientos necesarios en la aplicación del método predirigido en tres pasos. De hecho, diferentes diavidinas, obtenidas usando diferentes entrecruzadores bifuncionales, aunque tienen la misma capacidad de unirse a biotina libre, difieren en su potencia cunado se ensayan in vitro en el método predirigido en tres pasos, hasta el punto de que, en algunos casos, demuestran que son completamente ineficaces.

Esta observación indica que la multimerización de la avidina no produce de forma automática productos funcionales útiles, sino que es necesaria la caracterización biológica para la elección de una molécula potenciada adecuada para el predirigimiento.

Compendio de la invención

Se ha encontrado ahora que mediante la unión de dos moléculas de avidina con un enlazador bifuncional, capaz de unir los grupos amino y/o carboxi de la avidina, seleccionado de suberato de disuccinimidilo (dímero de aquí en adelante denominado como diavidina 1) y PEG diamina con peso molecular de 3400 (dímero de aquí en adelante denominado como diavidina 2), se obtienen dos dímeros de avidina que cumplen los requisitos para su uso en el método de tratamiento de tumores conocido como PAGRIT.

De esta manera los objetos de la invención descrita aquí son un dímero de avidina en el que dos moléculas de avidina están unidas a través de los grupos -NH_{2} por medio de un suberato y un dímero de avidina en el que dos moléculas de avidina están unidas a través de los grupos -COOH por medio de polietilenglicol con un peso molecular de 3400.

Objetos adicionales de la invención descrita aquí son composiciones farmacéuticas y/o diagnósticas que contienen las diavidinas mencionadas anteriormente.

Otros objetos de la presente invención son el uso de las diavidinas como medicamentos o agentes de diagnóstico para procesos patológicos de órganos y tejidos, y particularmente para la preparación de medicamentos útiles para la terapia o diagnóstico de tumores.

Estos y otros objetos relacionados de la presente invención se ilustrarán en detalle a continuación, también por medio de ejemplos experimentales.

Descripción detallada de la invención

Según se pretende en la presente invención, avidina significa tanto avidina como estreptavidina, pero el caso en que se usa estreptavidina como forma de realización particular de la presente invención, se especificará este hecho.

Se preparó la diavidina 1 haciendo reaccionar avidina con suberato de disuccinimidilo (DSS), teniendo N-hidroxisuccinimilo (éster de NHS) como el éster activo, siendo DSS un reactivo entrecruzador homobifuncional en la unión del grupo -NH_{2} de la avidina.

La diavidina 2 y la diavidina 3 (control negativo) se generaron usando PEG diamina (PEG(NH_{2})_{2}) con un peso molecular de 3400 y ácido polietilenglicol-disuccinimidilpropiónico [PEG(SPA)_{2}] con un peso molecular de 3400, respectivamente, como entrecruzadores homobifuncionales.

Debido a la eliminación más lenta de la estreptavidina comparada con la avidina de la circulación, la diestreptavina es una forma de realización particular de la presente invención. La vida media más larga es crucial para alcanzar el máximo aumento en la eficacia de las avidinas. El protocolo para el entrecruzamiento de la estreptavidina fue similar al usado para la producción de diavidina 1.

Las composiciones farmacéuticas o diagnósticas según la invención descrita aquí contienen al menos una de las diavidinas descritas aquí. La diavidina estará en una mezcla con los vehículos y/o excipientes adecuados usados comúnmente en farmacia, tal como aquellos descritos en "Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook", última edición. Las composiciones según la presente invención contendrán una cantidad eficaz de diavidina.

Los ejemplos preferidos de composiciones farmacéuticas son los que permiten administración parenteral y locorregional. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el fin son soluciones, suspensiones, o formas liofilizadas a ser reconstituidas al tiempo de uso.

Con respecto al uso de las diavidinas según la presente invención, estas son particularmente adecuadas para la preparación de medicamentos o medios de diagnóstico para el diagnóstico o terapia de procesos patológicos de tejidos, tales como, por ejemplo, tumores, por medio de la técnica conocida como predirigimiento con anticuerpos, y por esta razón también son adecuados para técnicas predirigidas in vitro. En una realización a modo de ejemplo, la técnica predirigida se realiza con un anticuerpo anti-tenascina biotinilado, preferiblemente un anticuerpo monoclonal.

Formas adecuadas para la aplicación industrial de la presente invención son también kits para diagnóstico o terapia, particularmente la radioterapia de tumores, tal como, por ejemplo, se describe en EP 0 496 074, en el estudio de Paganelli, Chinol et al., publicado en el European Journal of Nuclear Medicament Vol. 26, No. 4; Abril de 1999, 348-357, US5968405 y bibliografía relacionada.

Un objeto más de la invención descrita aquí es un kit para la terapia o diagnóstico de tumores, particularmente por medio de radiactividad, por ejemplo, con el método predirigido, preferiblemente en tres pasos, caracterizado en que al menos uno de los componentes de dicho kit contiene una diavidina. En dicho kit, un anticuerpo biotinilado preferido es un anticuerpo anti-tenascina, e incluso más preferiblemente un anticuerpo monoclonal.

Los siguientes ejemplos ilustran más la invención.

Ejemplo 1 Diavidina 1

Se mezcló 1 ml de solución de avidina, 300 \muM en PBS, pH 7,4, con 25 \mul de DSS (de Pierce) 25 mM en DMSO (razón avidina:DSS 1:2). La mezcla se incubó durante 2 horas a 0ºC antes de bloquear la reacción con 50 \mul de Tris 1M, pH 8,0. La elección de la razón de reacción antes mencionada se basó en ensayos preliminares usando proporciones desde 1:1 hasta 1:10.

El esquema de reacción es como sigue:

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Ejemplo 2 Diavidina 2

Se mezcló 1 ml de avidina, 450 \muM en PBS, pH 7,4, con 120 \mul de PEG(NH_{2})_{2} (de Shearwater Corp.) 9 mM en H_{2}O y 50 \mul de 1-83-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida-HCl (EDAC) 260 mM en DMSO (razón avidina:PEG aproximadamente 1:2,5) y se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Al final de este período se añadieron 50 \mul de Tris 1 M, pH 8,0, y la mezcla se sometió a filtración en gel. La razón avidina:PEG se investigó sobre un intervalo desde 1:1 hasta 1:10 a un pH de reacción desde 4,0 hasta 8,0. El valor de la razón avidina:PEG en el producto final diavidina 2 purificada era de 0,9, usando el método descrito por Sims et al., 1980. Brevemente, la diavidina 2 se diluyó hasta 300 \muM en agua, se añadieron 250 \mul de BaCl_{2} al 5% en HCl 1 N a un volumen de 1 ml, y después 250 \mul de una solución preparada mezclando 1,27 g de I_{2} en 100 ml de KI al 2%. La mezcla se incubó durante 15 minutos y después se tomó la lectura de la absorbancia a 535 nm. La curva patrón se obtuvo con PEG(NH_{2})_{2}.

El esquema de reacción para la diavidina 2 es como sigue:

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Ejemplo 3 Diavidina 3

Se mezcló 1 ml de avidina 150 \muM en PBS, pH 7,4, con 20 \mul de disuccinimidil-propionato de PEG (SPA-PEG-SPA) 20 mM en H_{2}O (razón avidina:PEG 1:3,5) y se dejó reaccionar durante 2 horas a 0ºC. La razón de la reacción se seleccionó en base a ensayos preliminares realizados con razones que variaban desde 1:2 hasta 1:10. El valor de la razón avidina:PEG en el dímero purificado, determinado usando el método desarrollado por Sims et al., como anteriormente, fue de 3:1. El esquema de reacción es como sigue:

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El rendimiento de diavidina en las tres reacciones descritas en los ejemplos 1, 2 y 3 fue aproximadamente del 20-30%. Al aumentar la cantidad de los tres enlazadores en las reacciones, se obtuvieron mayores cantidades finales de oligómeros de avidina (trímeros, etc., no mostrado), con dificultades en la separación cromatográfica como resultado. Las mezclas de reacción se analizaron en una columna de filtración en gel Superdex 200-10/30, mientras que la purificación de los productos se hizo en una columna Superdex 200-16/60. Los perfiles de cromatografía de las mezclas de reacción para diavidina 1, 2 y 3 se muestran en las Figuras 1 a, b y c, respectivamente. Se indican los pesos moleculares de una serie de proteínas patrón (calibración) en los tiempos de elución respectivos. La calibración de la columna se muestra en la figura 1 d: se usaron azul de dextrano (Vo), ferritina (444 kDa), aldolasa (158 kDa), albúmina (67 kDa), y ribonucleasa (14 kDa).

Los dímeros de avidina purificados se presentan en las figuras 1 e, f y g. Las muestras se separaron en Superdex 200-10/15 a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min (a-d) y 1 ml/min (e-g) en PBS en el sistema de HPLC de Jasco conectado a un espectrofotómetro a 280 nm.

Ejemplo 4 Diestreptavidina

Se mezcló 1 ml de estreptavidina (300 \muM en PBS, pH 7,4) con 25 \mul de DSS (25 mM en DMSO) a una razón de estreptavidina:DSS de 1:2 y se incubó durante 2 horas a 0ºC antes de que la reacción fuese extinguida con 50 \mul de Tris 1 M, pH 8,0. Se ensayaron un total de 4 condiciones de reacción con una razón estreptavidina:DSS que variaba desde 1:1 hasta 1:10. Se seleccionó la razón descrita antes de 1:2.

El esquema de reacción es análogo a los descritos en los ejemplos anteriores.

El perfil cromatográfico de la mezcla de entrecruzamiento al final de la reacción para diestreptavidina se muestra en la figura 5a. La diestreptavidina purificada se muestra en la figura 5b y la estreptavidina en la 5c. Las muestras se analizaron en una columna Superdex 200 10/15 a un flujo de 1 ml/min en PBS en un sistema de HPLC de Jasco conectado a un espectrofotómetro que medía la absorbancia 280 nm.

Determinación de la capacidad de las diavidinas de unirse a biotina

Para comparar la capacidad de la avidina y diavidina de unirse a biotina se usó el método HABA (ácido 4-hidroxi-azobenceno-2'-carboxílico). La avidina y las diavidinas estaban todas a una concentración correspondiente a 3 \muM del monómero de avidina de 67 kDa, en fosfato 0,1 M, HABA 0,4 mM a pH 7,0. Se añadió entonces la biotina disuelta en fosfato a una concentración final que variaba desde 0 hasta 20 \muM y se midió la absorbancia a 500 nm.

Se evaluó la capacidad de unir biotina como la concentración de biotina necesaria para desplazar el 50% del HABA unido.

La biotina 5 \muM aproximadamente fue capaz de desplazar el 50% del HABA tanto con avidina como con las tres diavidinas (Figura 2), de lo que se puede deducir que las diavidinas conservan el número total de sitios de unión después del entrecruzamiento. Las propiedades de unión a biotina de las diavidinas son comparables a las de la avidina.

Ensayos predirigidos in vitro

Para ensayar la capacidad de las diavidinas de aumentar la cantidad de unión de biotina radiomarcada a tenascina a través del anticuerpo monoclonal anti-tenascina biotinilado (Mab-B), se usó en un ensayo predirigido in vitro esquemáticamente ilustrado en la figura 3.

Brevemente, se adsorbió a una placa de 96 pocillos tenascina humana (Tn-C) 0,5 \mug/pocillo de durante 16 horas a 4ºC. Después de tres lavados con PBS y Tween 20 al 0,1%, se bloquearon los sitios de adsorción residuales en los pocillos con PBS, BSA al 2% y Tween 20 al 0,1%, durante 1 hora a temperatura ambiente. Se incubaron entonces dos anticuerpos monoclonales anti-tenascina biotinilados (ST2146 y ST2077) durante 2 horas en los pocillos, a la concentración saturante de 10 \mug/ml. Después de lavar como antes, se incubaron la avidina o diavidina por duplicado en los pocillos a concentraciones crecientes. Por último, se incubó una cantidad saturante de 5 pmol de biotina-^{3}H (1,6 TBq/mmol) durante 1 hora en cada pocillo. Después de los lavados, se tomó la lectura de la placa en un contador \beta. Como se muestra en la Figura 4, para los dos MAbs usados, diavidina 1 y diavidina 2 producen un aumento en la biotina unida comparada con avidina; la diavidina 3 no muestra aumento con el MAb ST2146 o muestra una reducción de la capacidad de unión con el MAb ST2077.

Comparada con la avidina, la diavidina 2 a una concentración de 2,5 \mug/ml muestra un aumento en la cantidad de biotina-^{3}H unida por un factor de 2,1 (media de 3 experimentos) con el MAb ST2077. Para la diavidina 1 el aumento fue por un factor de 1,6 (media de 6 experimentos), mientras que para la diavidina 3 la capacidad de unión fue menor (90%) comparada con el monómero de avidina.

A partir de estos experimentos se puede concluir que tanto la longitud del enlazador como los sitios de unión implicados en el dímero de diavidina afectan la actividad del dímero en el predirigimiento mediado por anticuerpos biotinilados.

La diestreptavidina demostró ser más potente que la estreptavidina in vitro como se muestra en la figura 6.

Se recubrieron placas de 96 pocillos de microtitulación con 0,5 \mug/pocillo de Tn-C humana durante 16 horas a 4ºC, se lavaron 3 veces con PBS, Tween 20 al 0,1% y después se bloquearon para la unión inespecífica con PBS/BSA al 2%/Tween-20 al 0,1%. Se añadió el anticuerpo anti-TnC biotinilado ST2146 a una concentración de 10 \mug/ml durante 2 horas. Los pocillos se lavaron 3 veces con PBS/Tween-20 y después de esto se añadieron la estreptavidina o diestreptavidina a las concentraciones indicadas. Finalmente, se añadieron 5 pmol de biotina-^{3}H (1,6 TBq/mmol), se incubaron los pocillos durante 2 horas, se lavaron y se contaron en un contador \beta.

Como se muestra en la Figura 6 la diestreptavidina media un aumento en la unión de biotina radiomarcada comparada con la estreptavidina.

Referencias

Chinol M., Casalini P., Maggiolo M., Canevari S., Omodeo E.S., Caliceti P., Veronese F.M., Cremonesi M., Chiolerio F., Nardone E., Siccardi A.G., Paganelli G. Biochemical modifications of avidin improve pharmacokinetics and biodistribution, and reduce immunogenicity. British Journal of Cancer 78(2): 189-197, 1998.

Cremonesi M., Ferrari M., Chinol M., Stabin M.G., Grana C., Prisco G., Robertson C., Tosi G., Paganelli G. Three-step radioimmunotherapy with yttrium-90 biotin: dosimetry and pharmacokinetics in cancer patients. Eur J Nucl Med 26(2): 110-120, 1999.

Paganelli G., Chinol M., Maggiolo M., Sidoli A., Corti A., Baroni S., Siccardi A.G. The three-step pretargeting approach reduces the human anti-mouse antibody response in patients submitted to radioimmunoscintigraphy and radioimmunotherapy. Eur J Nucl Med 24: 350-351, 1997.

Paganelli G., Grana C., Chinol M., Cremonesi M., De Cicco C., De Braud F., Robertson C., Zurrida S., Casadio C., Zoboli S., Siccardi A.G., Veronesi U. Antibody-guided three step therapy for high grade glioma with yttrium-90 biotin. Eur J Nucl Med 26(4): 348-357, 1999.

Paganelli G., Bartolomei M., Ferrari M., Cremonesi M., Broggi G., Maira G., Sturiale C., Grana C., Prisco G., Gatti M., Caliceti P., Chinol M. Pre-targeted locoregional radioimmunotherapy with ^{90}Y-biotin in glioma patients: Phase I study and preliminary therapeutic results. Cancer Biother & Radiopharm 16(3): 227-235, 2001.

Sims G.E.S. y Snape T.J. A method for estimation of polyethylene glycol in plasma protein fractions. Anal Biochem 107: 60-63, 1980.

Claims (18)

1. Dímero de avidina, en el que dos moléculas de avidina están unidas a través de los grupos -NH_{2} por medio de suberato.

2. Dímero de avidina, en el que dos moléculas de avidina están unidas a través de los grupos -COOH por medio de polietilenglicol con un peso molecular de 3400.

3. Dímero según la reivindicación 1 ó 2, en donde la avidina es estreptavidina.

4. Composición farmacéutica y/o diagnóstica que contiene el dímero de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Composición según la reivindicación 4, que se puede administrar de forma parenteral o locorregional.

6. Uso del dímero de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para la preparación de medicamentos.

7. Uso del dímero de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de tumores.

8. Uso del dímero de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en métodos predirigidos in vitro usando anticuerpos.

9. Uso del dímero de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de tumores usando métodos predirigidos con anticuerpos.

10. Uso según la reivindicación 9, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo anti-tenascina.

11. Uso según la reivindicación 10, donde dicho anticuerpo anti-tenascina es monoclonal.

12. Uso según la reivindicación 9, donde dicho medicamento es parte de un kit que es útil en el diagnóstico y tratamiento de tumores por medio de la técnica predirigida en tres pasos.

13. Uso según la reivindicación 12, donde dicho kit contiene un radiofármaco.

14. Kit para la radioterapia o diagnóstico de tumores, caracterizado en que al menos uno de los componentes de dicho kit contiene un dímero según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

15. Kit según la reivindicación 14, para su uso en la técnica predirigida.

16. Kit según la reivindicación 15, donde dicha técnica predirigida es en tres pasos.

17. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 14, 15 ó 16 que contiene un anti-tenascina biotinilado.

18. Kit según la reivindicación 17, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.