ES2206683T3 - Anticuerpos biotinalados que presentas una carga positiva neta reducida y una toxina, un farmaco o un quelato. - Google Patents
Anticuerpos biotinalados que presentas una carga positiva neta reducida y una toxina, un farmaco o un quelato.Info
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Abstract
SE HAN MODIFICADO ANTICUERPOS MEDIANTE CONJUGACION QUIMICA CON AGENTES REACTIVOS CON GRUPOS AMINO LIBRES. ENTRE LOS AGENTES QUIMICOS UTILIZADOS EN CONEXION CON LA INVENCION SE ENCUENTRAN REACTIVOS HETEROBIFUNCIONALES Y BIOTINA. LOS ANTICUERPOS MODIFICADOS TAMBIEN SE UTILIZAN EN EL DIAGNOSTICO Y LA TERAPIA DEL CANCER Y OTRAS ENFERMEDADES DE MAMIFEROS. EL DIAGNOSTICO UTILIZA INMUNOCENTELLOGRAFIA. LOS ANTICUERPOS MODIFICADOS PUEDEN SER ADEMAS CONJUGADOS CON MARCADORES O CON MOLECULAS BIOLOGICAMENTE ACTIVAS PARA SU USO EN DIAGNOSTICO Y TERAPIA. LOS ANTICUERPOS MODIFICADOS TAMBIEN PUEDEN FORMULARSE EN COMPOSICIONES FARMACEUTICAS PARA ESTOS FINES.
Description
Anticuerpos biotinilados que presentan una carga
positiva neta reducida y una toxina, un fármaco o un quelato.
La presente invención se refiere generalmente al
campo de los anticuerpos modificados. Más específicamente, la
invención se refiere a anticuerpos modificados químicamente con
especificidad de unión aumentada, farmacocinética mejorada y
capacidades de localización. Estos anticuerpos modificados son
particularmente útiles en el diagnóstico y en la terapias de cáncer
y otras enfermedades de mamíferos.
La utilización de anticuerpos, particularmente
anticuerpos monoclonales ("MAb"), posee el potencial de ser un
planteamiento sumamente valioso en el diagnóstico y tratamiento del
cáncer. Una propiedad importante de los MAb es su especificidad para
antígenos sencillos.
Se han producido MAb específicos para los
antígenos de la célula tumoral. También se ha demostrado que los
MAb pueden estar acoplados a elementos adjuntos tales como los
radionucleidos. Dichos MAb radiomarcados sirven para proporcionar
datos clínicos, tales como diagnóstico por imagen del tumor a
partir de inmunogammagrafía, conocida también como diagnóstico por
imagen con cámara g o radioinmunodiagnóstico por imagen. En
inmunogammagrafía, se permite que los MAb se unan al tejido
específico o a los tipos de tumor con antígeno reconocido por los
MAb. Los radionucleidos se observan a continuación mediante la
utilización de tecnología apropiada, tal como mediante la
utilización de una cámara de germanio. La especificidad exclusiva de
los MAb es la que permite su aplicación en inmunogammagrafía de
tumores y de otros tipos de tejidos.
Sin embargo, la utilización de los MAb en
inmunogammagrafía se ha limitado debido a los altos niveles de
fondo y baja capacidad de unión de los MAb a sus antígenos. Los
estudios experimentales sugieren que la biodistribución de los MAb
radiomarcados depende de muchos factores, incluyendo la
especificidad y el tiempo de eliminación del anticuerpo. Para el
diagnóstico eficaz de un tumor por inmunogammagrafía, se debería
seleccionar un anticuerpo que se una a un antígeno que es denso y
homogéneo en la superficie de la célula tumoral. El diagnóstico
eficaz por inmunogammagrafía también requiere que el anticuerpo
seleccionado se una eficazmente al antígeno tumoral. Sin embargo,
con frecuencia los MAb que se unen a antígenos apropiados no
ofrecen la gran afinidad de unión requerida. Además, incluso la
utilización de estos MAb que se unen con gran afinidad en
comparación con otros MAb pueden producir todavía un gran nivel de
unión no específica, que producen grandes niveles de fondo cuando
se utilizan en inmunogammagrafía. Así pues, es necesario un
procedimiento para mejorar la eficacia de unión de los MAb para
mejorar la inmunogammagrafía como herramienta de diagnóstico.
Además, el efecto citotóxico de los MAb se puede
aumentar notablemente por acoplamiento a radionucleidos, fármacos o
toxinas. La especificidad única de los MAb ha levantado
espectativas de desarrollo de la inmunoterapia. En inmunoterapia los
agentes biológicamente activos se administran utilizando los MAb en
determinados tipos de células indeseables, tales como las células
tumorales, afectando de este modo los tipos de células indeseables
sin afectar a otras células del sujeto. Sin embargo, las
inmunoterapias requieren en gran medida anticuerpos con gran
especificidad con el fin de evitar afectar el tejido sano. Por lo
tanto, un procedimiento para aumentar la especificidad de los MAb
sería muy beneficioso para conseguir el objetivo de una
inmunoterapia segura y eficaz.
Muchos MAb permanecen en circulación durante
varios días después de la introducción en un paciente. Esto es
indeseable al menos por dos razones. Una razón es que los MAb
circulantes producen grandes niveles de fondo en inmunogammagrafía.
Una segunda razón es que los MAb circulantes acoplados a
radionucleidos u otros agentes potencialmente citotóxicos pueden
producir efectos secundarios indeseables en el paciente después de
exposición prolongada. Por lo tanto, existe una necesidad de un
procedimiento para disminuir el tiempo de eliminación de MAb. Desde
luego, se produciría una disminución demasiado grande en los MAb
que se eliminan antes de cualquier utilización eficaz que se pueda
hacer de los MAb. Por lo tanto, existe una determinada necesidad de
un procedimiento para disminuir el tiempo de eliminación de los MAb
sin afectar sustancialmente la absorción de los MAb por el tumor u
otros tejidos objetivo.
Un factor que es crítico para determinar tanto la
especificidad como el tiempo de eliminación de un anticuerpo es la
forma del anticuerpo. Tal como se utiliza en la presente memoria,
una molécula de anticuerpo "intacta" se referirá a una molécula
de anticuerpo sin modificar compuesta por dos cadenas pesadas y dos
cadenas ligeras. La molécula intacta del anticuerpo completo se
observa en la parte reactiva de la ecuación química de la Figura 1.
Como se observa en la Figura 1, la molécula intacta se divide en
los campos F_{c} y F_{ab}. F(ab')_{2}, forma bivalente
del fragmento F_{ab}, se puede producir por digestión del campo
F_{c} con una proteasa.
Las dos cadenas pesadas (denominadas "H" en
la Figura 1) se mantienen unidas por uno o más puentes disulfuro.
En las moléculas intactas estos puentes disulfuro se protegen
normalmente de los agentes reductores. Se ha observado sin embargo,
que la eliminación del campo F_{c} permite la reducción fácil de
los puentes disulfuro. De este modo, se puede producir
F(ab'), forma monovalente, a partir de F(ab')_{2}
mediante la acción de un agente reductor suave. Parham, P., On the
Fragmentation of Monoclonal IgG1, IgG2a and IgG2b from BALB/c Mice.
J. Immunol. 131:2895 (1983), cuya exposición se incorpora en
la presente memoria como referencia, describe un procedimiento para
la producción de F(ab') y F(ab')_{2}. La ecuación
química de la Figura 1 presenta una representación esquemática de
los cambios que se cree que tienen lugar en este procedimiento.
Se ha observado que F_{c} es responsable de
muchas de las uniones no específicas de las moléculas de
anticuerpo. Se cree además que el peso molecular de los fragmentos
está por debajo del umbral de filtración glomerular, permitiendo de
este modo la rápida eliminación de los fragmentos. Sin embargo, un
enfoque para aumentar el tiempo de eliminación de los anticuerpos
para su utilización en radiodiagnóstico por imagen ha sido romper el
anticuerpo intacto en varios fragmentos, tal como Fab y su forma
divalente, F(ab')_{2}. Como era de esperar, estos
fragmentos son eliminados del cuerpo tan rápidamente que su
utilidad es reducida. Además, estos fragmentos pueden producir la
absorción reducida por el tumor u otro tejido objetivo en
comparación con el anticuerpo intacto. Por lo tanto, aunque la
utilización de estos fragmentos en inmunogammagrafía puede
proporciona una mejor eliminación y un tejido objetivo mayor a la
proporción de fondo que con los MAb intactos, la concentración
absoluta de los MAb en el tejido objetivo que contiene el antígeno
al que se unirán los MAb se ha observado que es hasta tres veces o
más, tanto con los MAb íntegos como con ambos fragmentos. Además,
ambos tipos de fragmentos se eliminan del torrente sanguíneo muy
rápidamente. Por consiguiente, el periodo de eficacia para el
diagnóstico o para las técnicas terapéuticas que utilizan estos
fragmentos es muy corto.
Los reactivos heterobifuncionales son los
reactivos que tienen dos grupos capaces de participar en reacciones
diferentes. Por ejemplo,
3-(2-piridiniltio)propionato de
siccinimidilo (SPDP) es heterobifuncional porque su grupo éster de
N-hidroxisuccinimida reacciona con grupos amino y
la estructura del disulfuro de 2-piridilo reacciona
con tioles alifáticos.
Orlandi et al., Change in Binding
Reactivity of an Anti-Tumor Monoclonal Antibody
After the Introduction of 2-Piridyl Disulphide
Groups, Hybridoma 5: 1-8 (1986), describió
que se podría obtener un aumento en la unión in vitro los MAb
aumentado frente al carcinoma de ovario humano después de la
conjugación química con el reactivo heterobifuncional, SPDP.
Los MAb utilizados por Orlandi et al.
presentan 11 grupos PDP de media por molécula. Orlandi et
al. observó que los MAb modificados aumentan su actividad de
unión in vitro en un grado que puedan ser detectadas las
moléculas no detectadas por los MAb no modificados. Estos
investigadores no publicaron ningún estudio de utilización de los
MAb conjugados in vivo. Además, estos investigadores creían
que las moléculas que tienen un número muy bajo de sitios
antigénicos eran detectadas por los MAb conjugados. Por
consiguiente, los MAb modificados por PDP presentaban una
especificidad muy reducida de las células objetivo en comparación
con las contrapartidas no modificadas.
Por lo tanto, a pesar de los anteriores avances,
continúa existiendo una necesidad de fragmentos de anticuerpo
modificados que presentan mayor actividad específica a los
antígenos tumorales, permitiendo más concentración absoluta de
anticuerpos para acumularse en el tumor y también con un tiempo de
eliminación relativamente rápido de acumulación de sangre, todavía
no tan rápido como para reducir la eficacia terapéutica o del
diagnóstico.
La Figura 1 presenta una representación
esquemática de los cambios que se cree que tienen lugar en un
procedimiento de producción de fragmentos de F(ab') y
F(ab')_{2}.
La Figura 2 presenta la retención en todo el
cuerpo de diferentes preparaciones de Lym-1 de los
MAb radiomarcadas en ratones lampiños atímicos.
La Figura 3 presenta la biodistribución en % de
dosis/gramo inyectadas de Lym-1 y de
Lym-1 modificado de los MAb en ratones lampiños con
linfoma humano, siete días después de la inyección.
La Figura 4 presenta la biodistribución en
relaciones tumor/órgano de Lym-1 y de
Lym-1 modificado de los MAb en ratones lampiños con
linfoma humano siete días después de la inyección.
La Figura 5 presenta la biodistribución en % de
dosis/gramo inyectadas de F(ab')_{2} de
Lym-1 y de Lym-1 modificados de los
MAb en ratones lampiños con linfoma humano cinco días después de la
inyección.
La Figura 6 presenta la biodistribución como
relación tumor/órgano de F(ab')_{2} de
Lym-1 y de Lym-1 modificados de los
MAb en ratones lampiños con linfoma humano cinco días después de la
inyección.
La Figura 7 presenta la imagen obtenida el día 7
después de la inyección de Lym-1 intacto marcado con
I-131.
La Figura 8 presenta la imagen obtenida el día 7
después de la inyección de Lym-1 modificado marcado
con I-131.
La Figura 9 presenta la imagen obtenida el día 7
después de la inyección de Lym-1 modificado marcado
con I-131.
La Figura 10 presenta la imagen obtenida el día 5
después de la inyección de Lym-1 modificado marcado
con I-131.
La Figura 11 presenta la retención total en el
cuerpo de diferentes preparaciones de anticuerpos monoclonales B72.3
en ratones lampiños atímicos.
La Figura 12 presenta la biodistribución en % de
dosis/gramo inyectadas de B72.3 y de B72.3 modificado de los MAb en
ratones lampiños con carcinoma de colon LS174T cuatro días después
de la inyección.
La Figura 13 presenta la biodistribución como
relación tumor/órgano de B72.3 y de B72.3 modificado de los MAb en
ratones lampiños con carcinoma de colon LS174T cuatro días después
de la inyección.
La Figura 14 presenta la imagen obtenida 1 día
después de la inyección de B72.3 modificado, marcado con
I-131.
La Figura 15 presenta la imagen obtenida 4 días
después de la inyección de B72.3 modificado, marcado con
I-131.
La Figura 16 presenta la retención total en el
cuerpo de diferentes preparaciones de TNT-1
radiomarcado de los MAb en ratones lampiños atímicos.
Las Figuras 17A a D presentan una serie de
gráficos de barras. Las Figuras 17A y 17C representan el porcentaje
de TNT-1 intactos inyectados y TNT-1
biotinilados que localizan el tumor y varios tejidos. Las figuras
17B y 17D presentan las relaciones de anticuerpos marcados que
localizan el tumor y varios tejidos.
La figura 18 presenta un gráfico lineal que
representa la eliminación en todo el cuerpo de
TNT-1 intacto, TNT-1 modificado y
fragmentos F(ab')_{2} en ratones Balb/c.
La Figura 19 presenta un gráfico lineal que
representa la eliminación en todo el cuerpo de
Lym-1 intacto, Lym-1 modificado y
fragmentos F(ab')_{2} en ratones Balb/c.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un anticuerpo conjugado con biotina como reactivo químico en al
menos una de las variedades de grupos amino libres dispuestos en el
anticuerpo para producir un anticuerpo modificado. El anticuerpo
tiene una carga neta positiva reducida comparada con el anticuerpo
intacto. El anticuerpo también tiene una velocidad de eliminación
in vivo comprendida entre las velocidades de eliminación de
los fragmentos F(ab')_{2} y de los anticuerpos intactos del
mismo tipo. En los anticuerpos en este aspecto de la invención, el
reactivo químico no es un agente heterobifuncional. Los anticuerpos
incluyen también un grupo químico unido a ellos. El anticuerpo puede
ser un anticuerpo, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo
policlonal. El reactivo químico puede ser biotina, un quelato de
metilo, tal como N_{2}S_{2} o N_{2}S_{4}, otro quelante,
tales como EDTA, DPTA o TETA, o un colorante, tal como FITC. El
grupo químico es con frecuencia un marcador, tal como un
radionucleido. El radionucleido puede ser Tecnecio o radionucleido
de halógeno, tal como ^{125}I o ^{131}I. En determinadas formas
de realización, el marcador es detectable mediante diagnóstico por
imagen por resonancia magnética. El grupo químico puede ser una
molécula biológicamete activa, tal como una toxina, un fármaco y un
quelato. Los fármacos apropiados comprenden metotrexato,
5-fluoro-uracilo,
cis-platino y adriamicina. Una toxina apropiada es
la cadena A de ricino.
Otro aspecto de la presente invención es una
composición farmacéutica para inmunogammagrafía. La composición
comprende un anticuerpo marcado conjugado con biotina como reactivo
químico en los grupos amino libres dispuestos sobre el anticuerpo
marcado, de modo que el anticuerpo tiene una carga neta positiva
reducida comparada con el anticuerpo intacto y un excipiente,
vehículo o base farmacéuticamente aceptable para
inmunogammagrafía.
Todavía otro aspecto de la presente invención
consiste en un procedimiento de preparación de un anticuerpo
modificado, marcado que presenta una especificidad de unión al
antígeno aumentada, una unión no específica disminuida y un tiempo
de eliminación in vivo disminuido. El procedimiento
comprende las etapas siguientes: obtención de un anticuerpo intacto
con especificidad de unión a un antígeno que debe ser detectado,
presentando el anticuerpo natural una variedad de grupos amino
libres dispuestos sobre éste, reacción al menos de uno de los
grupos amino libres con biotina como agente químico para producir
un anticuerpo modificado, tal como el anticuerpo modificado que
tiene un punto isoeléctrico inferior al punto isoeléctrico del
anticuerpo intacto y marcaje del anticuerpo modificado con un
marcador detectable. El procedimiento produce un anticuerpo
modificado, marcado. El marcador en este procedimiento se puede
detectar por inmunogammagrafía, tal como mediante una cámara
gamma.
El objeto de la invención está definido en las
reivindicaciones.
Se ha descubierto que la modificación química de
los anticuerpos, incluyendo los MAb, anticuerpos humanos,
anticuerpos modificados genéticamente, anticuerpos híbridos,
anticuerpos sintetizados y anticuerpos policlonales, por conjugación
con un reactivo que modifica los grupos amino libres puede aumentar
la especificidad de unión al antígeno, disminuir la unión no
específica y disminuir los tiempos de eliminación in vivo.
Los anticuerpos modificados de este modo presentan una carga neta
positiva reducida comparada con un anticuerpo intacto. Ejemplos de
reactivos que se han utilizado para modificar los grupos amino
libres según la presente invención incluyen un reactivo
heterobifuncional tal como SPDP, o un reactivo de biotinilación.
Sin embargo, los expertos en la técnica reconocerán que se puede
utilizar una amplia variedad de reactivos químicos para modificar
los grupos aminos libres y de este modo reducir el punto
isoeléctrico total del anticuerpo. Así pues, por ejemplo, se pueden
utilizar quelatos de metilo, tales como N_{2}S_{2} y
N_{2}S_{4}, otros quelantes, tales como EDTA, DPTA, y TETA y
numerosos colorantes, tal como FITC, para conseguir resultados
eficaces de acuerdo con la presente invención. En Nucl. Med.
Biol., 18:179-185 (1991), se da una
descripción de la unión de N_{2}S_{4} a anticuerpos con otro fin
distinto del descrito en la presente memoria según la presente
invención. Este artículo se incorpora de este modo como
referencia.
Las modificaciones químicas en grupos amino
libres condujeron sorprendentemente al aumento de acumulación de
anticuerpos modificados en las células objetivo que contienen el
antígeno al que se unen los anticuerpos. Otros reactivos
heterobifuncionales aparte de SPDP, incluyendo
2-(p-azido
salicilamido)etil1-1,3'-ditiopropionato
de sulfo-succinimidilo (SASD),
2-(m-azido
o-nitrobenzamido)etil1-1,3'-ditiopropionato
de sulfo-succinimidilo (SAND),
(4-azidofenil-ditio)propionato
de sulfosuccinimidilo (sulfo-SADP) y
2-aminotiolano-HCl (reactivo de
Train), se cree que proporcionan resultados similares cuando se
conjugan con anticuerpos según la presente invención.
Los anticuerpos modificados de la presente
invención se pueden unir de forma ventajosa a otro grupo químico
para proporcionar un diagnóstico específico o un beneficio
terapéutico. Por ejemplo, se puede unir a cualquier variedad de
marcadores bien conocidos, tales como un radionucleido o un enzima.
Se pueden también unir a un grupo terapéutico, tal como a un
compuesto o a una toxina antineoplásica.
Ambos agentes heterobifuncionales y la biotina se
han utilizado anteriormente como aglutinantes para unirse a
marcadores y otros grupos a anticuerpos. La propia biotina puede
funcionar como marcador en determinadas circunstancias. Sin embargo,
ni la biotina ni los agentes heterobifuncionales se han utilizado
con el fin de modificar anticuerpos para conseguir una
especificidad de unión aumentada, una unión no específica
disminuida y tiempos de eliminación in vivo disminuidos. De
este modo, a diferencia de la presente invención, los anticuerpos
anteriores no han tenido unido un agente modificador, tal como un
agente heterobifuncional o biotina, al primer sitio sobre éste ni un
marcador unido a otro grupo químico en un segundo sitio sobre éste.
En la presente invención, el segundo sitio de unión no tiene unido
generalmente un agente modificador del mismo tipo que el agente
modificador unido al primer sitio de unión.
Se cree que el aumento de acumulación de los
anticuerpos modificados se debe al aumento de capacidad de unión
específica. Se ha descubierto que por conjugación, de promedio,
solamente un grupo PDP por molécula de anticuerpo que tiene lugar un
aumento drástico en la especificidad de la molécula para sus
células objetivo en comparación con el anticuerpo no modificado. Se
obtuvieron similares resultados utilizando anticuerpos
biotinilados.
Se ha descubierto también que la modificación
química de los grupos amino libres en IgG por conjugación con un
reactivo heterobifuncional o biotina, de forma ventajosa, mejoró
también la eliminación de los tejidos normales. Aunque no se desea
estar unido por ninguna explicación particular de este efecto, es
concebible que dichas modificaciones conduzcan a la fragmentación
del anticuerpo hasta una forma con un peso molecular por debajo del
umbral para la filtración glomerular, permitiendo de este modo la
rápida eliminación de los fragmentos. Es incluso posible que ocurra
la fragmentación del anticuerpo a la forma monovalente del
anticuerpo. Cualquiera que sea la forma exacta de los fragmentos
resultantes, la eliminación de estos fragmentos es, ventajosamente,
no tan rápida como para abreviar el diagnóstico o la eficacia
terapéutica de los anticuerpos modificados.
Según se expuso anteriormente, los anticuerpos
modificados útiles en la puesta en práctica de la invención se
modifican químicamente en los grupos amino libres y se marcan
además con un marcador detectable. Significativamente, mientras que
el propio anticuerpo o el reactivo químico utilizado para modificar
los grupos amino libres puede estar marcado, se ha demostrado
asimismo que el marcaje del anticuerpo modificado en otro sitio
distinto a los grupos aminos libres puede proporcionar un anticuerpo
útil en la práctica de la invención. Además, cuando un marcador
esté químicamente conjugado con el anticuerpo, bien antes o después
de la modificación química de la invención en los grupos amino
libre, este marcador puede estar unido al anticuerpo y en otro
sitio distinto del grupo amino libre y en otro sitio distinto del
sitio del reactivo modificador del grupo amino cuando este reactivo
es un reactivo heterobifuncional. Según se expuso específicamente en
la presente memoria, los restos de tirosina presentes en la
proteína del anticuerpo se pueden modificar por radioyodación. Sin
embargo los marcadores detectables que pueden estar unidas a los
restos de tirosina del anticuerpo no están limitados al yodo. Otros
marcadores que pueden estar unidos a restos de tirosina del
anticuerpo comprenden los radionucleidos de halógeno, tales como
los isótopos de F, Cl, Br, I y otros. La unión de dichos
radionucleidos de halógeno a los anticuerpos está descrita en
Wilbur, Bioconj. Chem., 3:433470 (1992), cuya exposición se
incorpora en la presente memoria como referencia. Los radionucleidos
de Technicium se unen a otros restos en la molécula del
anticuerpo. Además, otros marcadores y procedimientos de marcaje de
proteínas de anticuerpo son útiles en la puesta en práctica de la
invención, como pondrá de manifiesto fácilmente cualquier experto en
la técnica. Los expertos en la técnica valorarán que los grupos
funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos de una proteína
de anticuerpo puedan servir como sitios de unión al marcador. La
selección de los marcadores, los sitios de unión y los
procedimientos de conjugación del marcador y el anticuerpo serán
apreciados por los expertos en la técnica. El aporte importante con
respecto a la operatividad de la invención es que el anticuerpo
modificado tenga un marcador unido.
Generalmente, se ha descubierto que los
anticuerpos químicamente modificados tienen puntos isoeléctricos
reducidos (pls) en comparación con los anticuerpos no modificados
que presentan una especificidad objetivo mejorada. Más
específicamente, nuestros resultados demostraron que la
modificación química de los grupos amino libres en los anticuerpos
puede comunicar esta especificidad de reconocimiento mejorada. Estas
modificaciones químicas pueden incluir la modificación por agentes
tales como, pero no limitados a los agentes heterobifuncionales
citados anteriormente y a la biotina. Realmente, cualquier
modificación química de los grupos amino libres presente en un
anticuerpo que reduzca eficazmente el pl del anticuerpo proporciona
la especificidad de reconocimiento mejorada.
En tanto que no se desee estar limitado por
ninguna teoria determinada para explicar el origen de esta mejora,
se pretende que la unión no específica del anticuerpo se debe en
parte a interacciones electrostáticas no específicas. Esto es
razonable a la luz de la observación de que los MAb están cargados
positivamente al pH fisiológico, mientras que las células de
mamíferos están cargadas negativamente (Eichmann et al. J. Exp.
Med. 131:207 (1970); Silva Filho et al. J. leukocyte
Biol. 41:143 (1987)). De este modo, la alteración del
caracter de la carga positiva del anticuerpo intacto disminuye
eficazmente la unión no específica debida a interacciones entre
tejidos cargados negativamente y proteínas de anticuerpo cargadas
positivamente. Al minimizar estas interacciones no específicas, la
especificidad del anticuerpo atribuible a los campos del anticuerpo
de unión al antígeno es principalmente responsable de la
determinación de la especificidad de unión. Por lo tanto, cualquier
anticuerpo que tenga una pluralidad de grupos aminosido modificados
de modo que el pl del anticuerpo esté reducido en comparación con
el anticuerpo sin modificar presentará una especificidad de
objetivo mejorado en virtud de tener interacciones no específicas
reducidas con los antígenos no afines. Sin embargo, se ha
descubierto que una segunda propiedad de los anticuerpos
modificados según la invención les hace particularmente útiles para
la localización del antígeno in vivo.
Dos factores que pueden mejorar la relación señal
a ruido, que pueden estar representados por la "relación
tumor/órgano", en los procedimientos de diagnóstico por imagen
del antígeno basado en el anticuerpo son: (1) aumento de la
localización del tumor, y (2) cantidades disminuidas de anticuerpos
marcados unidos específicamente. Se ha descubierto actualmente que
los MAb modificados químicamente que tienen puntos isoelécticos
reducidos en comparación con el MAb intacto no modificado pueden
aumentar de forma ventajosa la especificidad de unión, mientras que
reducen la unión específica y disminuyen el tiempo de eliminación
total del cuerpo en comparación con el anticuerpo sin
modificar.
Se ha descubierto además que se pueden conseguir
el aumento de la especificidad del anticuerpo y las capacidades de
localización utilizando anticuerpos modificados químicamente que
tienen dispuestos sobre ellos un marcador detectable. Dicho marcador
puede ser, por ejemplo, un radionucleido. Más específicamente, se
ha descubierto actualmente que los anticuerpos modificados que
contienen grupos de biotina presentan una capacidad sustancialmente
mejorada para unirse al antígeno. Como se describe más adelante, se
ha utilizado anticuerpos biotinilados marcados en un procedimiento
para localizar las células tumorales in vivo. En la puesta
en práctica del procedimiento inventado, es esencial para el
anticuerpo modificado químicamente que esté marcado directamente.
Esto contrasta con los procedimientos que emplean anticuerpos
marcados indirectamente como describe Khawli et al. en
Antibody, Immunoconjugates, and Radiopharmaceuticals,
6:13 (1993), cuya exposición se incorpora en la presente
memoria como referencia.
Por lo tanto, se pueden producir reactivos útiles
en los procedimientos para mejorar la localización del tumor
obteniendo un anticuerpo con especificidad de unión para un
antígeno objetivo deseado, grupos amino libres que se modifican
químicamente en el anticuerpo utilizando un reactivo tal como un
reactivo heterobifuncional o biotina y marcando a continuación el
anticuerpo con un marcador detectable tal como un radionucleido. En
la práctica, el orden de las etapas de modificación química y de
radiomarcaje es óptima. Además, se puede eliminar una etapa para
radiomarcar sustancialmente los anticuerpos purificados si los
anticuerpos empleados en el procedimiento son los MAb y si el
hibridoma que produce estos MAb se propaga en un medio de cultivo
que contiene precursores marcados que se incorporan en los productos
MAb del hibridoma. De este modo, por ejemplo, se pueden producir
los MAb radiomarcados y biotinilados útiles en relación con la
invención propagando la línea celular que produce MAb en el medio de
cultivo que contiene aminoácidos radiomarcados, recogiendo los MAb
radiomarcados y biotinilidando los MAb radiomarcados. Los
procedimientos alternativos para los anticuerpos de marcaje, ya sea
antes o después de una etapa de biotinilación, se podrán de
manifiesto por los expertos en la técnica.
El procedimiento descrito en la presente memoria,
aunque se refiere al expuesto por Khawli et al. en
Antibody, Immunoconjugates, and Radiopharmaceuticals, supra,
implica ventajosamente pocas etapas para diagnósticar por imagen los
antígenos de la célula tumoral in vivo y sorprendentemente
proporciona mejores resultados que utilizando simplemente
anticuerpos radiomarcados que carecen de grupos biotina. De este
modo, en la presente memoria se da a conocer que los anticuerpos
biotinilados presentan reconocimiento mejorado cuando se comparan
con los anticuerpos no biotinilados. Ya que se puede detectar un
anticuerpo útil conjuntamente con la invención en virtud de una
marca realizada en el anticuerpo, la presencia de grupos biotina en
el anticuerpo marcado proporciona ventajas obvias con respecto al
reconocimiento y a la detección. Por lo tanto, las propiedades
esenciales de los anticuerpos útiles en relación con la invención y
de las de los anticuerpos: (1) tiene grupos aminosido químicamente
modificados de modo que el pl del anticuerpo modificado se reduce
en comparación con el anticuerpo no modificado y (2) proteger un
marcador que se puede detectar por medios de detección.
Los anticuerpos modificados de la presente
invención, de forma ventajosa, han mejorado sorprendentemente el
diagnóstico y la eficacia terapéutica en comparación con los
fragmentos de anticuerpos, tales como F(ab') o
F(ab')_{2}.
Los ejemplos siguientes presentan un
procedimiento ejemplar para la introducción por término medio, de
un grupo PDP a un anticuerpo monoclonal.
Lym-1 (IgG_{2a}), anticuerpo
monoclonal contra el linfoma del linfocito B, se obtuvo según
Epstein, A.L. et al., Two New Monoclonal antibodies,
Lym-1 and Lym-2, Reactive with
Human B-lymphocytes and Derived Tumors, with
Immunodiagnostic and Immunoreactive Potential, Cancer Res.
47: 830-840 (1987), cuya descripción se
incorpora a la presente memoria como referencia. Se introdujeron
grupos funcionales en los MAb de Lym-1 utilizando
SPDP, reactivo heterobifuncional que reacciona con grupos amino
libres en anticuerpos tal como en Carlson J. et al., Protein
Thiolation and Reversible Protein-Protein
Conjugation: N-succinimidyl
3-(2-piridyldithio)propionate, A New
Heterobifunctional Reagent, Biochem. J. 173:
723-737 (1978), cuya descripción se incorpora a la
presente memoria como referencia. A un tubo de ensayo de 5 ml que
contenía 1 ml de Lym-1 (10 mg/ml) en PBS, pH 7,2, se
añadió 20 \muL de 3 mg de SPDP en 1 ml de etanol y 40 \muL de
N,N-dimetilformamida. Se incubó esta mezcla durante
15 minutos a temperatura ambiente con mezclado continuo utilizando
un aparato agitador orbital puesto a velocidad normal. Después de
la incubación, se purificó la solución de Lym-1
funcionalizada mediante el paso a través de una columna
PD-10 equilibrada con PBS.
Se determinó que el grado de funcionalización de
Lym-1 con SPDP era una promedio de un grupo PDP por
molécula mediante medición de la liberación de
piridina-2-tiona a 343 nm después
de la reducción de una alícuota de la solución de
Lym-1 con exceso molar de 7 mg de ditioeritritol en
solución salina con tampón fosfato (PBS), pH 7,2, tal como en
Grassetti, D.R. y Murray, J.F. Determination of Sulfhydryl Groups
with 2,2'- or 4,4'-dithiopyridine. Arch.
Biochem. Biophys. 119: 41-49 (1967), cuya
descripción se incorpora a la presente memoria como referencia.
Se analizó el anticuerpo modificado del Ejemplo 1
por cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) para demostrar
que los anticuerpos permanecían sustancialmente intactos. Este
análisis se presenta en el Ejemplo 2.
El análisis del anticuerpo modificado, del
Ejemplo 1, se consiguió por cromatografía líquida rápida de
proteínas (FPLC) equipada con un espectrofotómetro UV de longitud de
onda fija fijada en 280 nm. Se realizó la cromatografía por
exclusión de tamaño en una columna con superosa-12
(Pharmacia) con PBS, pH 7,2, como sistema disolvente, eluyendo a un
caudal de 1 ml/min. El Lym-1 modificado apareció en
un tiempo de retención de 690 segundos, idéntico al tiempo de
retención de Lym-1 intacto, no marcado.
Así pues, el Ejemplo 2 demuestra que los
anticuerpos modificados por SPDP se comportan en la práctica
idénticamente a los anticuerpos no modificados en FPLC. Estos datos
demuestran que la modificación probablemente no condujo a la
destrucción de las moléculas intactas in vitro.
Para estudiar además los MAb modificados para la
prueba in vivo, se realizó el radiomarcaje de los MAb
modificados. El radiomarcaje se presenta en el Ejemplo 3.
Un lote de Lym-1 modificado con
PDP y Lym-1 se yodó con ^{125}I, y se marcó otro
lote con ^{131}I utilizando el procedimiento de cloramina T
modificado de Mills S.L. et al., ^{125}I Radiolabelling of
Monoclonal antibodies for In Vivo Procedures,
Hybridoma 5: 265-275 (1986), cuya
descripción se incorpora a la presente memoria como referencia. En
resumen, a un tubo de ensayo de 5 ml que contenía 100 \mug de
anticuerpo monoclonal en 100 \muL de PBS, se añadió el isótopo de
yodo apropiado, ^{125}I o ^{131}I, dependiendo del lote y 10
\muL de solución acuosa de cloramina T 43 mM. Se enfrió
bruscamente la reacción después de 3 minutos con 20 \muL de
solución de metabisulfito de sodio 120 mM. Se purificaron los
anticuerpos radiomarcados utilizando una columna Sephadex
G-25. Esta columna constaba de una pipeta
serológica de plástico (8 mm x 200 mm) tapada en el extremo con
algodón (V_{0} = 4,5 ml, V_{t} = 12 ml). Se cargó cada mezcla
de reacción en una columna y se eluyó con PBS, pH 7,2. Se hizo el
recuento en los tubos individuales que contenían alícuotas de 1 ml y
se recuperaron los anticuerpos radiomarcados en el tubo 6 en 85 a
90% de rendimiento. Estos anticuerpos marcados se almacenaron en el
frigorífico y se administraron a ratones durante 4 horas de
marcaje.
Los MAb radiomarcados del Ejemplo 3 se sometieron
a cromatografía en capa fina instantánea (ITLC) con el fin de
determinar la pureza de los MAb marcados. Este análisis se presenta
en el Ejemplo 4.
Se analizaron Lym-1 modificado,
radiomarcado con ^{131}I y Lym-1 modificado,
radiomarcado con ^{125}I por el procedimiento de cloramina T del
Ejemplo 3 utilizando un sistema analítico ITCL que consta de fibra
de vidrio impregnada de gel de sílice. Se activaron las tiras (2 x
20 cm) calentando a 110-1/2ºC durante 15 minutos
antes de utilizar; se manchó con 1 \muL de muestra; se secó con
aire y se eluyó con MeOH/H_{2}O (80:20) durante aproximadamente
12 cm; se secó otra vez con aire, se cortó por la mitad y se hizo
el recuento para determinar la radioactividad ligada a la proteína y
no ligada a la proteína. Ambas formas de anticuerpos de
Lym-1 radiomarcados tenían un valor R_{f} de 0 y
presentaron una pureza radioquímica de \geq 99%. El análisis de
Lym-1 intacto marcado de la misma forma que en el
Ejemplo 3 puso de manifiesto la misma pureza.
De este modo, el Ejemplo 4 demuestra que podrían
obtenerse anticuerpos de gran pureza radiomarcados. Se determinaron
las inmunorreactividades de los MAb radiomarcados mediante su
capacidad para unirse a las células de Raji. Este análisis se
presenta en el Ejemplo 5.
Se evaluaron las inmunorreactividades in
vitro de Lym-1 modificado, radiomarcado y
Lym-1 intacto mediante la prueba en vivo
convencional de 10^{6} células de Raji/tubo por el procedimiento
de Epstein, A.L. et al., supra. En resumen, se
pipetearon células de Raji resuspendidas en 100 \muL de albúmina
de suero bovino al 1% en PBS en una serie por triplicado de tubos
de ensayo. Se añadió cien \muL de Lym-1 marcado a
cada tubo de ensayo 100.100 cpm/tubo) y se incubaron durante 30
minutos a temperatura ambiente con mezclado continuo utilizando un
agitador orbital. Después de la incubación, se lavaron las células
tres veces con suero bovino al 1% en BPS centrifugando los tubos a
1000 rpm durante 5 minutos, decantando el sobrenadante y volviendo
a poner en suspensión las células en 200 ml de PBS. Después de la
finalización de los lavados, se detectó Lym-1 ligado
al medir la radioactividad ligada a las células utilizando un
contador gamma. Los resultados demostraron que la actividad ligada
de Lym-1 modificado era del 87%, mientras que el
Lym-1 intacto, que servía como referencia patrón,
tenía una actividad ligada del 80%.
Así pues, el Ejemplo 5 demuestra que el
Lym-1 modificado fue más inmunorreactivo in
vitro que el Lym-1 no modificado. Con el fin de
obtener una evaluación preliminar de la estabilidad de la actividad
de los anticuerpos modificados in vivo, se analizó la
estabilidad en el suero de los anticuerpos modificados in
vivo, de los MAb modificados, como se presenta en el Ejemplo
6.
Se añadieron anticuerpos monoclonales de
Lym-1 modificado y Lym-1 intacto que
habían sido marcados directamente con ^{125}I a cada uno de los
diversos conjuntos por triplicado de suero de ratón reciente hasta
una concentración final de 100 \mug/ml. Se incubaron los tubos a
37-1/2ºC en un incubador humidificado mantenido en
CO_{2} al 5% en aire. En tiempos entre 0 y 8 días se determinó la
actividad ligada a la proteína añadiendo 900 \muL de ácido
tricloroacético al 100% (TCA) a alícuotas de 100 \muL. Después de
cinco minutos de incubación a temperatura ambiente, se sedimentaron
por centrifugación los precipitados de proteína y se extrajeron 500
\muL de sobrenadante de cada tubo y se hizo el recuento de
radioactividad en un contador gamma. Los datos se expresaron como
recuentos en porcentaje medio precipitados menos los de los tubos de
referencia. Los resultados demostraron que en cada punto de tiempo
después de la incubación, Lym-1 con ^{125}I
modificado fue tan estable como Lym-1 intacto
marcado con ^{125}I que sirvió como referencia patrón. Los
resultados demostraron además que \geq 92% de la actividad
presente en el Lym-1 modificado después de 8 días
de incubación a 37-1/2ºC era precipitable en
TCA.
Así pues, el Ejemplo 6 demostró que la
estabilidad de la actividad de los anticuerpos modificados se
mantenía en el suero durante al menos 8 días. Con el fin de evaluar
si los MAb modificados permanecían intactos después de la incubación
en suero, se realizó el análisis por HPLC de los
Lym-1 modificados después de la incubación, como se
muestra en el Ejemplo 7.
Se realizaron análisis de HPLC en un sistema
Waters equipado con columnas de exclusión de tamaño (SW 300) con
tampón de fosfato neutro 0,1 M como disolvente eluyente y un caudal
de 1 ml/min. El eluido se detectó con un detector de radioisótopo.
La mezcla del producto Lym-1 modificado, marcado del
Ejemplo 6 presentó un pico principal de una especie de peso
molecular bajo con un tiempo de elución de 750 segundos, más una
pequeña cantidad a 690 segundos. El Lym-1 intacto
dio un solo pico con un tiempo de retención de 690 segundos.
Así pues, el Ejemplo 7 demuestra que las muestras
de Lym-1 modificado, incubado en suero tenían un
peso molecular aparente en el análisis por HPLC inferior al del
Lym-1 intacto. En cambio, el Ejemplo 2 demostró que
el Lym-1 modificado, no incubado tenía un tiempo de
retención idéntico que el Lym-1 intacto. Así pues,
el Lym-1 modificado demostró una pérdida aparente
de peso molecular en el análisis de FPLC en incubación en suero.
Para verificar además la pérdida aparente del
peso molecular del Lym-1 modificado en incubación
en el suero se realizó la electroforesis en gel de poliacrilamida de
las muestras, como se presenta en el Ejemplo 8.
Se comprobaron en serie las mismas alícuotas de
cada mezcla de suero incubada del Ejemplo 6 por
SDS-PAGE no reducido. Para este estudio, se
introdujeron muestras en geles de poliacrilamida al 10%, se secaron
con cuidado y se expusieron de la forma habitual a una película
fotográfica como en Laemmli, U.K., Cleavage of Structural Proteins
During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4, Nature
227: 680-685 (1970), cuya descripción se
incorpora a la presente memoria como referencia. Este análisis puso
de manifiesto que ^{125}I-Lym-1
intacto era evidente a M_{r}, 200.000, mientras que
^{125}I-Lym-1 se observó a una
banda distinta correspondiente a un peso molecular más pequeño, a
aproximadamente M_{r} 116.000. De este modo, el presente ejemplo
demuestra que la incubación de los anticuerpos modificados en el
suero produce un peso molecular aparente modificado en geles de
acrilamida, verificando los resultados del análisis de HPLC.
Se examinaron también las mismas muestras que en
el Ejemplo 6 durante un estudio de 8 días para ver si había alguna
pérdida de radiactividad del Lym-1 radiomarcado;
dicha pérdida se puede interpretar como prueba de desyodación en el
suero. Los datos no demostraron prácticamente ninguna pérdida de
radioactividad durante este periodo, confirmando que se había
obtenido una unión muy estable del yodo en estos
inmunoconjugados.
De este modo, los Ejemplos 7 a 9 demuestran que
los anticuerpos modificados mientras que retienen prácticamente
toda la actividad después de la incubación en el suero, parecen
descomponerse en moléculas de un peso molecular aparente de 116.000.
Como se indicó anteriormente, es posible que esta pérdida de peso
molecular sea debido a la destrucción de los anticuerpos en su
forma monovalente. En cualquier caso, se cree que la pérdida en el
peso molecular aparente es debido a la destrucción de los
anticuerpos modificados en sus fragmentos.
Después de descubrir los cambios inesperados
anteriores en el peso molecular aparente de los anticuerpos
modificados cuando se incubaron en el suero, se probó la
estabilidad de los MAb modificados in vivo. Se realizaron
estas pruebas in vivo con el fin de determinar el tiempo de
eliminación total en el cuerpo. Un ejemplo de estas pruebas se
presenta en el Ejemplo 10.
Se realizaron experimentos en los que a tres
grupos de ratones lampiños atímicos (n = 5) se administraron por
vía intraperitoneal inyecciones de (a) anticuerpo intacto, (b)
fragmentos F(ab')_{2}, o (c) anticuerpo modificado de
Lym-1 marcado con I-131 utilizando
el procedimiento de cloramina T. Se midió con un dosímetro la
actividad en todo el cuerpo en la inyección y en serie a
continuación. Este estudio demostró que la eliminación total de la
radiactividad en el cuerpo variaban con la preparación del
anticuerpo. Los resultados se presentan en la Figura 2.
La Figura 2 demuestra que el
Lym-1 modificado se eliminó más rápidamente de todo
el cuerpo, con una vida media biológica (t_{1/2}) de 20
horas, que el Lym-1 intacto (t_{1/2}= 5 días). La
eliminación de los fragmentos F(ab')_{2} fue, sin embargo,
dos veces más rápida, con una vida media de 10 horas, que el
Lym-1 modificado. Los datos demostraron que
Lym-1 modificado se eliminaba a una velocidad
intermedia entre los fragmentos F(ab')_{2} eliminados
rápidamente y el anticuerpo intacto eliminado lentamente.
Por lo tanto, se puede observar a partir de estos
datos del Ejemplo 10 que los anticuerpos modificados son eliminados
del cuerpo más rápidamente que los anticuerpos intactos muy
persistentes, aún no tan rápidamente como los fragmentos
F(ab')_{2}.
Un agente ideal para la inmunoterapia persistiría
en el torrente sanguíneo durante un periodo de tiempo
suficientemente prolongado como para producir el efecto tóxico
deseado, aún no tan prolongado como para producir efectos
secundarios tóxicos no deseados. Los datos del Ejemplo 10
sugirieron que los anticuerpos modificados presentaban periodos de
persistencia potencialmente ideales cuando se utilizan en
inmunoterapia.
Como se expuso anteriormente, un agente para
inmunoterapia sería también muy específico hacia sus células
objetivo. Así pues, se probó la especificidad de los MAb
modificados en comparación tanto con los MAb intactos como con los
fragmentos F(ab')_{2} en los siguientes ejemplos. El
Ejemplo 11 presenta los procedimientos utilizados en todos los
estudios de biodistribución posteriores.
Se inyectó por vía subcutánea a dos grupos de
ratones lampiños de seis semanas con células Raji (10^{7}) en la
zona del fémur. Se desarrollaron los tumores durante tres semanas
hasta que se hicieron mayores de 1 cm de diámetro. Se realizaron
estudios de marcaje en paralelo, tal como se describió
anteriormente, utilizando cada grupo de ratones. En el primer
grupo (n = 6), cada ratón se inyecto i.p. con una inoculación de
0,2 ml que contenía 10 \mug de Lym-1
modificado marcado con I-131 a 12
\muCi/\mug (120 \muCi/ratón) y 10 \mug de
Lym-1 intacto marcado con I-125 a
2,5 \muCi/\mug (25 \muCi/ratón). En el segundo grupo (n = 4),
los ratones recibieron una inoculación de 0,2 ml que contenía 10
\mug de Lym-1 modificado marcado con
I-131 a 12 \muCi/\mug (120 \muCi/ratón) y 10
\mug de fragmentos F(ab')_{2} marcados con
I-125 a 2,5 \muCi/\mug (25 \muCi/ratón). En
todos los experimentos, los ratones se sacrificaron por dislocación
cervical en periodos preseleccionados, después de la inyección, se
extirparon varios órganos, sangre y tumor y se pesaron en una
balanza analítica. Se hicieron recuentos en las muestras en un
contador gamma para determinar la actividad de ^{131}I y de
^{125}I. Se ajustaron los recuentos de ^{125}I para el cruce
del canal de ^{131}I sustrayendo el 17% de los recuentos del
canal ^{131}I, una fórmula que se determinó experimentalmente
utilizando un contador gamma 1282 Compugamma (LKB). Se corrigieron
asimismo los datos para la caída de la radiación del isótopo
^{131}I según los días en los que se sacrificaron los animales.
Los datos para cada ratón, se expresaron se expresaron en cpm por
gramo de tumor/cpm por gramo de órgano, % de dosis por gramo y % de
dosis/órgano. A partir de estos datos, se calcularon la desviación
media y estándar para cada grupo.
El Ejemplo 12 compara la distribución de los MAb
modificados con el MAb intacto utilizando los procedimientos del
Ejemplo 11.
Para este estudio, se comparó el anticuerpo
Lym-1 intacto con el anticuerpo
Lym-1 modificado en los procedimientos del Ejemplo
11. El Lym-1 intacto produjo una actividad en la
sangre de 0,64% ID/g a los 7 días después de la inyección, como se
presenta en la Tabla I. Al final del mismo intervalo de tiempo, el
tumor tenía una actividad del 3,92% ID/g.
Como se presenta en la Tabla I, en comparación
con el Lym-1 intacto, el Lym-1
modificado se eliminó más rápido en la sangre y produjo una
actividad en la sangre de 0,14% ID/g a los 7 días. Al final del
mismo intervalo de tiempo, el tumor produjo 7,7%, que tendía a ser
significativamente mayor que las correspondientes actividades del
Lym-1.
Los resultados de la reactividad del anticuerpo
del Ejemplo 12 en varios órganos se presenta en la Tabla I y se
presenta gráficamente en la Figura 3 (% dosis/gramo) y en la Figura
4 (tumor/órgano).
(Tabla pasa a página
siguiente)
\hskip1,2cm* Media (desviación estándar).
En la Figura 3 se puede observar que los
anticuerpos modificados produjeron una señal mayor en el tumor que
los anticuerpos intactos. Además, los anticuerpos modificados
reaccionaron menos fuertemente que los MAb intactos para cada órgano
probado, excepto para el riñón. No es de esperar que la señal mayor
se encuentre en el riñón, porque los anticuerpos es de esperar que
se eliminen a través de este órgano. Debido a la velocidad de
eliminación más rápida de los MAb modificados en comparación con los
MAb intactos hallada en el Ejemplo 10, es de esperar una cantidad
mayor de MAb modificados en el riñón.
Con referencia a la Figura 4, que muestra los
mismos datos que la Figura 3 de forma diferente, se puede observar
que los MAb modificados produjeron una proporción tumor/órgano
significativamente mayor que los MAb intactos en cada órgano
probado, excepto en el riñón. De este modo, sería de esperar que los
anticuerpos modificados produjeran un fondo significativamente
menor cuando se utilizan en inmunogammagrafía. Además, sería
también de esperar que los anticuerpos modificados fuesen más
eficaces cuando se utilizan en inmunoterapias debido tanto a su
mayor afinidad para el tumor como a la menor afinidad para los
tejidos no reconocidos. Cuando se utilizan en inmunoterapias, sería
de esperar que los anticuerpos modificados, de este modo, fuesen
mucho más tóxicos para los tumores y menos tóxicos para los tejidos
no reconocidos. La utilización inmunoterapéutica de los anticuerpos
modificados de la presente invención se explica en lo sucesivo con
más detalle.
Se compara a continuación la biodistribución de
los MAb modificados con fragmentos F(ab')_{2} del
anticuerpo sin modificar de otra forma. El Ejemplo 13 es
ilustrativo de estos experimentos.
Para este estudio, se compararon los fragmentos
F(ab')_{2} con los MAb de Lym-1
modificado. Se realizaron experimentos como en el Ejemplo 11. Los
resultados se presentan en la Tabla II y se presentan gráficamente
en las Figuras 4 y 5.
\hskip1,5cm* Media (desviación estándar).
La Tabla II demuestra que el
Lym-1 modificado se eliminó más lentamente en la
sangre que en los fragmentos F(ab')_{2}. El
Lym-1 modificado produjo una actividad en la sangre
de 0,09% ID/g mayor que la de los fragmentos (0,05%) a los 5 días
después de la inyección. La Figura 5 demuestra que la actividad
tumoral del Lym-1 modificado fue aproximadamente
dos y media veces mayor que la correspondiente actividad de los
fragmentos F(ab')_{2}. La actividad de
Lym-1 modificado fue mayor que la de los fragmentos
F(ab')_{2} para todos los diversos órganos probados,
incluyendo el riñón. Esto es coherente con la teoría de que los
anticuerpos que se eliminan más rápidamente se acumulan en el
riñón.
Además, la Figura 6 demuestra que las
proporciones tumor a órgano para Lym-1 modificado
son mayores que las de los fragmentos F(ab')_{2} para todos
los órganos tratados. De este modo, los experimentos de los
Ejemplos 12 y 13 confirman que los anticuerpos modificados de la
presente invención tienen una actividad mayor para su tumor
objetivo que ambos MAb o los fragmentos F(ab')_{2}. Además,
los datos tumor a órgano de estos experimentos demuestran que los
anticuerpos modificados tienen mayor especificidad para el tumor
que los MAb intactos o los fragmentos F(ab')_{2}.
Así pues, se probó la capacidad de los MAb
modificados de la presente invención para producir resultados de
inmunogammagrafía mejorados. Un ejemplo de estas pruebas se
presenta en el Ejemplo 14.
Se diagnosticaron por imagen ratones lampiños con
tumor utilizando un colimador de orificio y una cámara gamma de
spectrum 91 (Raytheon). Los análisis de la imagen de estos animales
proporcionaron una estimación de la distribución del anticuerpo en
el tumor/todo el cuerpo después de la inyección. Siete después de
la inyección, se anestesiaron los ratones con 2 mg de Cetamina HCl
y 0,4 mg de Xilazina administrados como una inoculación s.c. de 0,2
ml. Se diagnosticó a continuación por imagen a los ratones
inmovilizados en una posición posterior con la cámara preinstalada
para registrar 10.000 recuentos. No se realizó ninguna sustracción
del fondo. Se obtuvieron imágenes fotográficas utilizando la
película de Polaroid tipo 330 Pack. Se definieron dos áreas en cada
imagen: (a) zona 1, todo el cuerpo; (b) zona 2, tumor. Las Figuras
6 a 8 presentan ejemplos de gammagrafías (conocidas también como
gammagramas) producidas por estos experimentos.
El diagnóstico por imagen de inmunogammagrafía en
Lym-1 intactos se intentó 7 días después de la
inyección y no fue satisfactorio, como se aprecia en la Figura 6.
La Figura 6 presenta que aunque el tumor se visualizó, el resto del
animal también fue visualizado. Las Figuras 7 y 8 presentan las
imágenes de dos animales diferentes con tumor de Raji inyectados
con Lym-1 modificado, marcado en el mismo momento
después de la inyección. Se puede observar que ambas Figuras 7 y 8
presentan la concentración de Lym-1 modificado,
marcado en el tumor a concentraciones mucho mayores que las
producidas en el tumor por Lym-1 intacto, observado
en la Figura 6. De forma más importante, la proporción de marcador
en el tumor a fondo de todo el ratón producida por
Lym-1 modificado fue varias veces mayor que la de
Lym-1 intacto. Así pues, las Figuras 7 y 8 presentan
una definición clara del tumor, con poca o ninguna radioactividad
de fondo.
Además, una visualización satisfactoria del tumor
se podría obtener 5 días después de la inyección al utilizar
Lym-1 modificado. La Figura 10 presenta una imagen a
los 5 días tomada en el mismo animal mostrado en la Figura 9 a los
7 días. Como se puede apreciar, la imagen a los 5 días de la Figura
10 fue significativamente superior a la imagen producida por
Lym-1 intacto a los 7 días (Figura 7). Los
resultados fueron similares para todos los animales probados.
Este estudio sugiere que la utilización de
fragmentos de anticuerpo modificados presentan mayor actividad
específica en los antígenos tumorales, permitiendo más
concentración absoluta de anticuerpo para acumularse en el tumor.
Esto se confirma por nuestros resultados que demuestran que la
concentración absoluta de los fragmentos de Lym-1
modificados es aproximadamente 2 veces la concentración de
Lym-1 intacto 7 días después de la inyección y
aproximadamente dos veces y media los fragmentos F(ab')_{2}
a los cinco días.
La eliminación mucho más rápida de los fragmentos
de Lym-1 modificados también disminuyó
significativamente el tiempo necesario para alcanzar proporciones
grandes de tumor a fondo y de este modo produce mejor diagnóstico
por imagen en menos tiempo que el anticuerpo intacto.
Para demostrar la utilidad general de la
modificación la presente invención en la mejora de la especificidad
y de la actividad de los anticuerpos, se modificaron además los
MAb. Las pruebas de los diversos MAb modificados se presentan en los
Ejemplo 15 a 18.
B72.3 (IgG_{1}), anticuerpo monoclonal contra
el carcinoma de colon, se obtuvo como en Colcher, D. et al,
A Spectrum of Monoclonal antibodies Reactive with Human Mammary
Tumor Cells, Proc. Natl. Acad. Sci.
78:3199-3203 (1981), cuya descripción se
incorpora en la presente memoria como referencia. Los MAb de B72.3
se funcionalizaron con un promedio de un grupo PDP por molécula
según el procedimiento del Ejemplo 1.
Los MAb de B72.3 modificados se radiomarcaron por
el procedimiento del Ejemplo 3. Los tiempos de eliminación en todo
el cuerpo se midieron como en el Ejemplo 10. La Figura 11 presenta
los resultados de estos experimentos de eliminación en todo el
cuerpo. Los anticuerpos modificados presentaban una disminución en
todo el cuerpo de la eliminación en la mitad del tiempo de los
aproximadamente 6 días de los MAb intactos en aproximadamente 2,5
días para los anticuerpos modificados. La eliminación en la tiempo
medio de los fragmentos F(ab')_{2} fue, como para los
fragmentos de Lym-1, más rápida que para los
anticuerpos modificados, con un tiempo medio de aproximadamente 12
horas. De este modo, los resultados demostraron que los B72.3
modificados se comportaban de forma similar a los
Lym-1 modificados teniendo una eliminación en el
tiempo medio intermedia entre la de los fragmentos
F(ab')_{2} y el anticuerpo intacto.
Se realizaron estudios de biodistribución del
marcador por parejas para dos grupos de cinco ratones cada uno en
ratones lampiños atímicos con carcinoma de colon LS174T humano. Se
inyectó un grupo con el B72.3 marcado con I-125,
mientras que el otro se inyectó con B72.3 modificado, marcado con
I-131. El experimento comparó también la
biodistribución en el tumor, sangre y varios órganos. Los
procedimientos empleados fueron como en los Ejemplos 11 a 13. Los
datos se presentan en la Tabla III y se muestran gráficamente en
las Figuras 11 y 12.
\hskip1,2cm* Media (desviación estándar)
Como se puede apreciar en la Tabla III, el
anticuerpo B72.3 intacto produjo una actividad en la sangre a 1,34%
ID/g a los 4 días después de la inyección y una actividad de 4,04%
en el tumor, tal como se presenta en la Tabla III. Comparado con el
B72.3 intacto, el B72.3 modificado produjo menor actividad en la
sangre (1,1% ID/g) y mayor actividad en el tumor (6,02% ID/g) a los
4 días.
Como se puede apreciar en la Figura 13, todas las
diversas actividades del órgano fueron mayores para el B72.3
modificado, excepto el riñón, como es de esperar para un anticuerpo
eliminado más rápidamente. Por lo tanto, como se presenta en la
Figura 14, la relación tumor a órgano para el B72.3 modificado fue
sensiblemente mayor que las relaciones correspondientes para el
B72.3 intacto. La relación tumor a órgano mejoró aún para el riñón
debido a la mayor actividad del anticuerpo modificado en la zona del
tumor.
Los análisis de imagen de ratones con tumor
LS174T inyectados con B72.3 modificado proporcionaron una
estimación de la distribución de anticuerpos en el tumor/total
después de la inyección. La Figura 14 presenta una inmunogammagrafía
1 día después de la inyección. La imagen presenta una definición
clara del tumor con poca radioactividad de fondo. La Figura 15
presenta una inmunogammagrafía a los 4 días después de la inyección.
Durante 4 días, el tumor se observó claramente con la poca
radioactividad que queda en la mezcla de sangre del animal. Los
resultados fueron similares para todos los animales.
De este modo, se observó que el B72.3 modificado
era muy útil para obtener inmunogammagrafías de gran calidad en un
corto periodo de inyección de tumores reactivos con B72.3.
TNT-1 es un anticuerpo monoclonal
IgG_{2a} que utiliza tumor necrótico como objetivo para su unión
selectiva a cánceres humanos. Se modificó este anticuerpo con un
promedio de un grupo PDP por molécula como en el Ejemplo 1, y se
analizó el tiempo de retención en el cuerpo total como se presenta
en el Ejemplo 18.
Se obtuvo TNT-1 como en Epstein,
A.L. et al., A Novel Method for the Detection of Necrotic
Lesions in Human Cancer, Cancer Res.
48:5842-5848 (1988), cuya descripción se incorpora
a la presente memoria como referencia.
Se radiomarcaron los MAb de TNT-1
por el procedimiento del Ejemplo 3. Se midieron los tiempos de
eliminación en todo el cuerpo como en el Ejemplo 10. La Figura 16
presenta los resultados de estos experimentos de eliminación en todo
el cuerpo. Los MAb de TNT-1 modificados presentaron
una disminución del tiempo de eliminación total en la mitad del
tiempo en todo el cuerpo en comparación con el TNT-1
intacto y un aumento en comparación con los fragmentos
F(ab')_{2} de TNT-1.
De este modo, el TNT-1 modificado
se comportó de igual modo que otros anticuerpos modificados. Es de
esperar, por lo tanto, que la utilidad de los MAb modificados de
TNT-1 sea equivalente a la de otros anticuerpos
modificados probados.
El Ejemplo 19 describe un procedimiento útil para
preparar anticuerpos biotinilados.
El TNT-1 y los MAb de
Lym-1 se conjugaron independientemente al hexanoato
de 6-(biotinamido) por reacción con su éster de sulfo
N-hidroxisuccinimida
(NHS-LC-biotina). Se preparó de
forma típica una solución patrón de 2 mg de
NHS-LC-biotina en 1 ml de solución
salina al 0,9%. A un tubo de ensayo de 5 ml que contenía 1 ml de
anticuerpo (10 mg/ml) en tampón de bicarbonato de sodio, pH 8,5, se
añadió 1 ml de solución patrón de
NHS-LC-biotina
(NHS-LC-biotina/MAb relación molar
50:1). Se incubó la mezcla reactiva durante 2,5 horas a temperatura
ambiente con agitación continua a baja velocidad. Después de la
incubación, se cromatografió el anticuerpo acoplado en una columna
PD-10 (Pharmacia) equilibrada con PBS, pH 7,2. La
pureza de las preparaciones del anticuerpo acoplado se evaluó por
FPLC utilizando una columna de superosa-12. Los
resultados de estos procedimientos indicaron que el anticuerpo
biotinilado se obtuvo con una pureza de por lo menos el 99%.
Se determinó espectroscópicamente el número medio
de grupos de biotina acoplados a cada molécula de anticuerpo según
el procedimiento descrito por Green en Biochem. J.
94: 23c-24c (1965). En resumen, el anticuerpo
biotinilado se digirió enzimáticamente con 1% de proteasa a 37ºC
durante cuatro horas. A una solución de 5 ml que contiene 800
\muL de HABA 100 \muM en PBS 0,1 M, pH 7,2, se añadió 70 \muL
de una solución 17 \muM de estreptavidina. La solución de
estreptavidina-HABA se valoró a continuación con
volúmenes crecientes de la solución de anticuerpo biotinilado
digerido y se determinó el cambio en la absorbancia a 500 nm. A
partir de este tratamiento, se calculó la concentración de biotina
en la solución de anticuerpo tratada con proteasa utilizando una
curva patrón de solución de biotina. Los resultados indicaron que
se incorporó un promedio de 3 a 4 grupos de biotina en cada
molécula de anticuerpo.
Los conjugados biotina-anticuerpo
se radiomarcaron con ^{125}I utilizando el procedimiento de
cloramina T esencialmente como se describe en el Ejemplo 3.
El Ejemplo 20 describe los procedimientos
utilizados para la radioyodación de anticuerpos y fragmentos de
anticuerpo.
Todos los anticuerpos (intactos, modificados y
fragmentos F(ab')_{2}) se yodaron con ^{125}I o
^{131}I utilizando un procedimiento con cloramina T modificado tal
como se describe en el Ejemplo 3. Se añadieron de forma típica, 0,5
a 1,0 mCi de yodo-125 o yodo-131 y
10 \muL de una solución acuosa 43 mM de cloramina T a un tubo de
ensayo que contenía 50 a 100 \mug de anticuerpo monoclonal en 100
\muL de PBS. La reacción se enfrió bruscamente después de tres
minutos con 20 \muL de una solución 120 mM de metabisulfito de
sodio. Se purificaron los anticuerpos radiomarcados utilizando una
columna Sephadex G-25. Esta columna constaba de una
pipeta serológica de plástico (8 x 200 mm) tapada en el extremo con
algodón (V_{0} = 4,5 ml, V_{1} = 12 ml). Se cargó cada mezcla de
reacción en una columna y se eluyó con PBS, pH 7,2. Se hizo el
recuento en un contador de centelleo en los tubos individuales que
contenían alícuotas de 1 ml. Se recuperaron de forma típica los
anticuerpos radiomarcados con un rendimiento del 85 al 90%. Se
analizaron todos los anticuerpos radiomarcados por el procedimiento
de cloramina T utilizando un sistema analítico de cromatografía en
capa fina instantánea (ITCL) en fibras de vidrio impregnadas en gel
de sílice. Se activaron tiras (2 x 20 cm) por calentamiento a 110ºC
durante 15 minutos antes de su utilización, se salpicaron con 1
\muL de muestra, se secaron con aire y se eluyeron con
metanol/H_{2}O (80:20) para aproximadamente 12 cm, se secaron
otra vez con aire, se cortaron por la mitad y se hizo un recuento
para determinar la radioactividad ligada a la proteína y la no
ligada a la proteína. Los resultados de este procedimiento
indicaron que más del 99% del anticuerpo estaba ligado a la
proteína, confirmando de este modo que se podrían obtener
anticuerpos biotinilados radiomarcados funcionales con gran
pureza.
Los anticuerpos biotinilados radiomarcados
preparados según el procedimiento descrito anteriormente se
almacenaron a 4ºC y se administraron a ratones durante cuatro horas
de marcaje.
Los dos Ejemplos siguientes exponen los
resultados de los procedimientos analíticos utilizados para
demostrar que los anticuerpos biotinilados radiomarcados
conservaban la capacidad para unirse a los antígenos objetivo y eran
estables en presencia de constituyentes del suero.
El Ejemplo 21 describe los procedimientos
utilizados para demostrar que los anticuerpos que han sido
modificados por biotinilación y radiomarcaje conservaban tanto la
capacidad de unión al antígeno como la integridad estructural.
Se evaluaron las inmunorreactividades in
vitro de las preparaciones de Lym-1 radiomarcado
con un ensayo en células vivas utilizando células Raji según el
procedimiento descrito por Epstein et al., en Cancer
Res., 47:830 (1987), células de Raji (10^{6}/tubo de
ensayo) se volvieron a poner en suspensión en 100 \muL de albúmina
de suero bovino al 1% (BSA) en PBS. Se añadieron
Lym-1 marcados (100 \muL) a cada tubo de ensayo
(aproximadamente 10 \muCi/\mug; 100.000 cpm/tubo) por triplicado
y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con mezclado
continuo utilizando un agitador orbital. Después de la incubación,
se lavaron las células tres veces con BSA al 1% en PBS centrifugando
los tubos a 1.000 rpm durante cinco minutos, decantando el
sobrenadante y volviendo a poner en suspensión las células en 200
\muL de PBS. Después de la terminación de los lavados, se detectó
el Lym-1 ligado midiendo la radioactividad asociada
al sedimento celular utilizando un contador gamma. Los resultados de
este procedimiento fueron sustancialmente idénticos a los
presentados en el Ejemplo 6. Más específicamente, el 75% del
Lym-1 intacto radiomarcado y el 75% del
Lym-1 biotinilado radiomarcado se unió a las
células objetivo. Esto indicaba que la actividad de unión al
antígeno de Lym-1 biotinilado radiomarcado era
comparable a la del Lym-1 radiomarcado intacto que
servía como referencia patrón.
Se evaluó la inmunorreactividad del MAb de
TNT-1 modificado utilizando un radioinmunoanálisis
de células fijadas descrito por Gaffar et al. en J.
Immunoassay, 2:11 (1991). En resumen, se incubaron
TNT-1 radiomarcados y TNT-1
radiomarcados biotinilados durante 30 minutos con células de Raji
previamente fijadas con paraformaldehído al 20% en PBS, a
temperatura ambiente y a continuación se trataron con acetona a
-20ºC. Se lavaron a continuación las células con BSA al 1% en PBS y
se hizo el recuento en un contador gamma. Los resultados de este
procedimiento indicaban que aproximadamente el 60% de ambas
preparaciones de anticuerpo se unían a las células fijadas. Esto
indicaba que la actividad de unión al antígeno de
TNT-1 biotinilado radiomarcado era comparable a la
del TNT-1 intacto radiomarcado que servía como
referencia patrón.
El Ejemplo 22 describe los procedimientos
utilizados para demostrar que los anticuerpos biotinilados
radiomarcados no estaban sometidos inusualmente a la degradación en
presencia de suero.
Se añadieron los MAb marcados directamente con
^{125}I a una serie por triplicado de tubos que contenían suero
de ratón reciente hasta una concentración final de 100 \mug/ml.
Se incubaron todas las muestras 37ºC en un incubador humidificado
mantenido con CO_{2} en aire al 5%. Se determinó en varias veces
entre 0 y 8 días, el radiomarcador ligado a la proteína añadiendo
900 \muL de ácido tricloroacético (TCA) al 100% a alícuotas de
100 \muL de cada muestra, incubando a temperatura ambiente durante
cinco minutos y recuperando por centrifugación los precipitados de
proteína. Se extrajeron alícuotas (500 \mul) de sobrenadante de
cada tubo y se hizo el recuento para radioactividad utilizando un
contador gamma. Los resultados indicaron que el anticuerpo
radiomarcado biotinilado era estable in vitro en todos los
puntos de tiempo. Más específicamente, por lo menos el 97% del
radiomarcado permanecía asociado a la proteína después de 8 días de
incubación. Esto confirmó que los grupos de biotina presentes en
los MAb no producían efecto perjudicial en la estabilidad de los
radiomarcadores asociados a la proteína.
Las mismas alícuotas de cada mezcla de suero
incubado se comprobaron también en serie por
SDS-PAGE no reductor y autorradiografía. Para este
estudio, se electroforizaron muestras en geles de poliacrilamida al
10% y se visualizaron por exposición a película de rayos X. Se
determinaron los pesos moleculares de las muestras por comparación
con los pesos moleculares patrón. Los resultados de estos
procedimientos indicaron que el MAb intacto radiomarcado y el MAb
biotinilado radiomarcado tenían pesos moleculares sustancialmente
similares. Más específicamente, las bandas principales para el
Lym-1 radiomarcado y para Lym-1
biotinilado radiomarcado tenía unos M_{r} de aproximadamente
200.000. Igualmente, las bandas principales para
TNT-1 radiomarcado y TNT-1
biotinilado radiomarcado tenían unos M_{r} de aproximadamente
150.000.
Se realizó el enfoque isoeléctrico en geles de
poliacrilamida en una célula Mini IEF modelo 111 de BioRad. Se
electroforizaron las muestras a través de un gradiente de pH
construido con una mezcla de anfolitos BioLyte (BioRad) a las
concentraciones de anfolito 3/10 de 1,2% y de anfolito 5/8 de 0,8%
según los protocolos proporcionados por BioRad. Se incluyeron
patrones IEF (BioRad) en cada ensayo para calibración de pl. Se
tiñeron geles IEF con Coomassie Blue R-250 y se
secaron durante la noche. Los resultados de estos procedimientos
confirmaron que la biotinilación de los MAb alteró sustancialmente
las propiedades de carga eléctrica de las macromoléculas. Mientras
que el Lym-1 radiomarcado tenía un valor de pl de 7
a 8, el Lym-1 biotinilado radiomarcado tenía un pl
de 5 a 6. Igualmente, mientras que el MAb de TNT-1
radiomarcado tenía un valor pl de 5,5 a 6,5, el MAb de
TNT-1 biotinilado radiomarcado tenía un pl de 4,5 a
5,0. De este modo, como es de esperar, la modificación de los
grupos amino libres en la proteína MAb eliminaron o neutralizaron
eficazmente alguna de las cargas positivas en las proteínas como
demostró la pérdida de caracter básico de los anticuerpos
biotinilados.
El Ejemplo 23 describe los procedimientos
utilizados para demostrar que los MAb que tienen grupos aminosido
químicamente modificados para producir una macromolécula con pl
reducido en comparación con el anticuerpo natural presentaban
ventajosamente: (1) aumento de la especificidad para el objetivo,
(2) disminución de la unión no específica y (3) disminución del
tiempo de eliminación.
Se inyectaron a dos grupos de ratones lampiños de
seis semanas con células Raji de linfoma, células
LS-174T de carcinoma de colon o células
ME-180 de carcinoma cervical según los
procedimientos descritos por Khawli et al., en Antibody,
Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 6:13 (1993).
Los tumores se desarrollaron durante 10 a 21 días hasta que fueron
aproximadamente de 1 cm de diámetro.
En el primer grupo de ratones (n = 6), se inyectó
a cada ratón por vía intravenosa una inoculación de 0,2 ml que
contenía 120 \muCi/10 \mug de MAb modificado marcado con
^{131}I y 25 \muCi/10 \mug de MAb intacto marcado con
^{125}I. En el segundo grupo (n = 4), los ratones recibieron una
inoculación de 0,2 ml que contenía 120 \muCi/10 \mug de MAb
modificado marcado con ^{131}I y 25 \muCi/10 \mug de
F(ab')_{2} de MAb marcado con ^{125}I. En todos los
experimentos, se sacrificaron los ratones por dislocación cervical
en tiempos preseleccionados después de la inyección y se extrajeron
y pesaron varios órganos, sangre y tumor. A continuación se hizo un
recuento en las muestras en un contador gamma para cuantificar las
actividades de ^{131}I e ^{125}I. Se ajustaron los recuentos de
^{125}I para el cruce del canal ^{131}I sustrayendo el 17% de
los recuentos del canal ^{131}I, fórmula que se determinó
experimentalmente para el contador Compu-Gamma
1282. Se corrigieron también los datos para el descenso de radiación
del isótopo ^{131}I de acuerdo con el momento en que se
sacrificaron los animales. Los datos para cada ratón se expresaron
en cpm por gramo de tumor/cpm por gramo de órgano y en % de
dosis/gramo. A partir de estos datos, se calcularon la media y la
desviación estándar de cada grupo. Los mismos estudios de
biodistribución de marcador emparejado se realizaron utilizando
Lym-1 en el modelo de linfoma de Raji y B72.3 en el
modelo de carcinoma de colon humano LS-174T.
Los resultados de estos procedimientos se
presentan en la Figura 17. Como se indica en el panel 17A, mientras
que ambos MAb modificados por TNT-1 intacto y TNT-
1/biotina localizados en el tejido del tumor un día después de la
inyección, el anticuerpo biotinilado presentaba una localización
mayor, medida en % de dosis inyectada/gramo de tumor. La unión
específica de los dos MAb marcados fue también evidente en una
variedad de tejidos. De forma importante, la cantidad de
TNT-1 biotinilado que no se asoció específicamente
con estos tejidos fue uniformemente menor que la cantidad de
TNT-1 intacto que presentaba dicha unión no
específica. De este modo, se elevó el nivel de unión específica y
se redujo el nivel de unión no específica para el anticuerpo
biotinilado en comparación con el anticuerpo sin modificar. La
ventaja de este anticuerpo modificado se representa
cuantitativamente en la Figura 17B, en la que se presenta para cada
tejido la proporción de anticuerpo localizado en el tumor a
anticuerpo no específicamente localizado. Como se ilustra, la
ventaja del anticuerpo biotinilado como reactivo de diagnóstico por
imagen quedo patente particularmente en el músculo y en el
páncreas.
Se observaron tendencias similares para las
mediciones tomadas tres días después de la inyección. La Figura 17C
demuestra que el anticuerpo TNT-1 biotinilado se
localizó más eficazmente en el tejido tumoral que el anticuerpo de
la contrapartida no biotinilado. Al mismo tiempo, la cantidad de
unión no específica fue inferior ventajosamente para las especies
biotiniladas. La Figura 17D confirma cuantitativamente que la
proporción tumor/órgano, que refleja la relación señal a ruido en
varios tejidos, fue mayor en el músculo y en el páncreas. De forma
notable, las Figuras 17C y 17D incluyen los resultados obtenidos
utilizando los fragmentos F(ab')_{2} de
TNT-1 que presentan velocidades rápidas de
eliminación en todo el cuerpo. Aunque la proporción tumor/órgano fue
superior para los fragmentos de anticuerpo en comparación con
TNT-1 biotinilado en varios tipos de tejido, la
fracción de TNT-1 biotinilado inyectada que se
localizó en el tumor fue ventajosamente mayor. Estos resultados
ilustraban que un MAb biotinilado localizado en el tejido tumoral de
una manera que era superior a MAb intacto no modificado o a los
fragmentos F(ab')_{2} de MAb.
Se realizaron experimentos en los que se
administraron inyecciones i.v. de anticuerpos radiomarcados a
diferentes grupos de ratones Balb/c (n = 45). Se midió a
continuación la actividad a la inyección en todo el cuerpo y en
momentos seleccionados con un calibrador de dosis.
Las Figuras 18 y 19 exponen los resultados de
estudios de la velocidad de eliminación en todo el cuerpo para los
anticuerpos TNT-1 y Lym-1 y sus
derivados. Los resultados presentados en la Figura 18 indicaban que
MAb de TNT-1 modificado por SPDP o biotina han
reducido los tiempos de eliminación en comparación con el anticuerpo
intacto. El fragmento F(ab')_{2} de TNT-1
que tenía la velocidad de eliminación más rápida de todos los
anticuerpos probados se utilizó como referencia positiva en este
procedimiento. De este modo, el MAb de TNT-1
biotinilado presentó de forma ventajosa una velocidad de eliminación
más rápida que el anticuerpo no biotinilado. Igualmente, los
resultados presentados en la Figura 19 indicaban que MAb de
Lym-1 modificado bien por SPDP o biotina habían
reducido los tiempos de eliminación en comparación con el
anticuerpo intacto. Esto ilustró que los agentes que modificaban
químicamente los grupos amino libres para reducir el pl del
anticuerpo aumentaban de forma ventajosa la especificidad de unión
al anticuerpo y la velocidad de eliminación en todo el cuerpo.
Se cree que las modificaciones en cualquier
anticuerpo que utilice los procedimientos de la presente invención
proporcionarán un reactivo útil para mejorar el diagnóstico por
imagen del tumor, para producir una imagen de cualquier tipo de
tejido deseado utilizando los procedimientos de la presente
invención, los anticuerpos para este tipo de tejido deben ser
obtenidos en primer lugar. Los anticuerpos policlonales se pueden
obtener de una manera convencional como sabe cualquier experto en
la técnica. Como alternativa, los anticuerpos monoclonales se
pueden preparar con el fin de obtener el aumento de especificidad
proporcionado por estos anticuerpos, como es sabido por los expertos
en la técnica. Los anticuerpos se modifican a continuación
químicamente en grupos amino libres, por conjugación con un agente
heterobifuncional, biotina u otro agente que conducirá a un
producto de anticuerpo modificado con un punto isoeléctricoque es
inferior al punto isoeléctrico del anticuerpo no modificado.
Después de la conjugación, se aplica un marcador adecuado a los
anticuerpos modificados.
Aunque los Ejemplos anteriores hacen uso del
diagnóstico por imagen de un marcador que comprende una radiación
gamma que emite el radionucleido, se contemplan otros muchos tipos
de marcadores y de sistemas de diagnóstico por imagen dentro del
alcance de la presente invención. Por ejemplo, materiales
radio-opacos, tales como bario, cesio o yodo pueden
ser diagnosticados por imagen utilizando rayos X convencionales. Se
pueden utilizar como marcadores partículas paramagnéticas o
superparamagnéticas, utilizando la tecnología de diagnóstico por
imagen MRI para producir una imagen de la localización de los
anticuerpos. Además, se puede utilizar el technicium como marcador.
Estos marcadores alternativos se pueden conjugar con anticuerpos
modificados utilizando procedimientos convencionales.
Se pueden incluir anticuerpos marcados en
preparaciones farmacéuticas para la introducción del marcador en un
paciente incluyendo excipientes, vehículos o bases
farmacéuticamente aceptables. Los excipientes, vehículos o bases
adecuados comprenden solución salina, solución salina tamponada con
fosfato, glicerol, carbonato de calcio y similares. Estas
composiciones se introducen a continuación mediante cualquiera de
los diversos medios, tales como inyección local, inyección
intravenosa o administración oral en casos en los que se requiere
una intensidad de señal reducida o en los que se desea un
diagnóstico por imagen del tejido en la cavidad oral. Sin embargo,
preferentemente, la administración se realiza mediante inyección
generalizada con el fin de maximizar la exposición del tejido
reconocido por el anticuerpo.
Se cree que la modificación química de los grupos
amino libres dispuestos en los anticuerpos por adición de un agente
heterobifuncional, biotina u otro agente para producir un
anticuerpo modificado con un punto isoeléctrico inferior al del
correspondiente anticuerpo intacto no modificado, según la presente
invención, producirá resultados significativamente mejorados cuando
estos anticuerpos modificados se incorporen a un agente
inmunoterapéutico. Dichos agentes terapéuticos comprenden
generalmente un anticuerpo específico para un tumor u otro tejido
enfermo combinado con una o más moléculas biológicamente activas.
Las moléculas biológicamente activas adecuadas que funcionan en
dichos agentes son las toxinas, tal como la cadena A de la toxina de
la difteria (ricino) o una cualquiera de las diversas toxinas
vegetales conocidas por los expertos en la técnica; radionucleidos,
tales como los isótopos radioactivos de itrio, yodo, fósforo y
otros agentes radioterapéuticos utilizados generalmente; fármacos,
tales como metotrexato,
5-fluoro-uracilo o adriamicina;
quelatos, incluyendo EDTA y EGTA; cis-platino y
otros agentes tóxicos organometálicos y cualquier otro agente
terapéutico.
En lo sucesivo, la expectativa de una
inmunoterapia eficaz ha de ser todavía totalmente realizada. Se
cree que el aumento de actividad y especificidad de los anticuerpos
modificados de la presente invención producirá agentes
inmunoterapéuticos con actividad y especificidad suficientes para
que sus tejidos objetivo superen las deficiencias de los agentes
inmunoterapéuticos anteriores. De este modo, los tejidos enfermos
objetivo pueden ser destruidos sin afectar de forma significativa a
los tejidos sanos del paciente, cuando el paciente se inyecta con
el agente inmunoterapéutico apropiado.
En la utilización de estos agentes
inmunoterapéuticos, se deben obtener en primer lugar los
anticuerpos específicos para determinados tipos de tejido no
deseados. Si los anticuerpos deseados no están disponibles, se
deben aumentar los anticuerpos en un organismo adecuado inyectando
el organismo con antígenos y obteniendo suero del mamífero, como es
sabido por los expertos en la técnica. Los anticuerpos se conjugan
químicamente a continuación con un agente tal como un agente
heterobifuncional, biotina u otro agente capaz de modificar los
grupos amino libres presentes en la molécula de anticuerpo. Después
de la conjugación, los anticuerpos modificados resultantes se
modifican más por conjugación con un agente biológicamente activo,
tal como un agente terapéutico o un marcador detectable tal como se
describió anteriormente. Los anticuerpos se combinan en las
composiciones farmacéuticas que contienen un vehículo, excipiente o
base farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos, excipientes o
bases farmacéuticamente aceptables comprenden solución salina
normal para inyectables generalizados, glicerol y carbonato de
calcio. Las composiciones están preparadas a continuación para su
introducción en un paciente, tal como un mamífero.
Los anticuerpos se introducen a continuación en
el paciente por cualquier vía de administración conocida. Por
ejemplo, las composiciones se pueden introducir por inyección
generalizada, por inyección local en los tejidos afectados, se puede
aplicar por vía tópica a los tejidos afectados externamente y se
puede tomar por vía oral en los casos en los que se requiera
intensidad de señal reducida o en los que se desee terapia de tejido
en la cavidad oral.
La dosificación del agente biológicamente activo
que contiene el anticuerpo dependerá de la sensibilidad a la toxina
del tejido objetivo, la cantidad de tejido afectado, la vía de
administración, la afinidad del anticuerpo, las velocidades de
eliminación y de otros factores. Sin embargo, las dosis
representativas estarán generalmente comprendidas en el intervalo
de 1 \mug/kg de masa corporal total a 1 mg/kg. En la mayoría de
las aplicaciones, la dosis estará comprendida preferentemente entre
5 y 200 \mug/kg.
El siguiente Ejemplo es ilustrativo de una
inmunoterapia eficaz contra los tumores de Raji en ratones. Aunque
en el Ejemplo se emplean anticuerpos modificados en PDP, los
anticuerpos con grupos amino modificados por otros agentes, tal como
biotina, que producirá un anticuerpo modificado con un pl inferior
al del correspondiente anticuerpo intacto es de esperar que
funcionen igualmente bien.
El Lym-1 modificado por PDP se
obtiene como en el Ejemplo 1. El anticuerpo modificado se trata a
continuación para introducir, por término medio, una cadena A de
ricino por molécula de anticuerpo. El Lym-1 intacto
y los fragmentos F(ab')_{2} se combinan igualmente con la
toxina.
Los veinticinco ratones se dividieron en cinco
grupos. El grupo I recibe inyecciones intraperitoneales a razón de
10 \mug/kg de peso corporal total de Lym-1
modificado por PDP y ricino en solución salina tamponada con fosfato
(PBS) una vez por semana durante 8 semanas. El grupo II recibe
inyecciones de una cantidad equivalente de Lym intacto con ricino.
El grupo III recibe cantidades equivalentes de fragmentos
F(ab')_{2} con ricino de Lym-1. El grupo
IV recibe una cantidad equivalente de ricino no conjugado. El grupo
V recibe PBS solo.
Después de 8 semanas, se realizó la
inmunogammagrafía de todos los ratones supervivientes utilizando el
procedimiento del Ejemplo 14. Los ratones del grupo I presentan una
visualización reducida del tumor comparado con cualquiera de los
otros grupos. Los ratones supervivientes del grupo II y del grupo
III presentan alguna mejora, aunque menos drástica que los ratones
del grupo I. Los ratones del grupo IV se ponen muy enfermos o
mueren.
Así pues, el Ejemplo 24 presenta un tratamiento
particular de un tumor utilizando los anticuerpos modificados de la
presente invención. El ejemplo 19 presenta los resultados
superiores que se obtienen utilizando los anticuerpos modificados
por PDP según la presente invención. Sustituyendo la utilización de
otros anticuerpos específicos para otros tumores o tejidos enfermos
en ratones u otros mamíferos, tales como el hombre, se cree que
producen resultados igualmente eficaces en el tratamiento de
aquellos tumores específicos o de tejidos enfermos. Además, la
sustitución de otras toxinas conocidas se cree que produce también
resultados igualmente eficaces. El Ejemplo 20 presenta la
utilización de una terapia similar eficaz contra el cáncer
pancreático en el hombre. Aunque en el Ejemplo se emplean
anticuerpos modificados por PDP, los anticuerpos con grupos amino
libres modificados por otros agentes, tal como biotina, que
producirán un anticuerpo modificado con un pl inferior al del
anticuerpo intacto correspondiente es de esperar que funcionen
igualmente bien.
Se obtiene un anticuerpo monoclonal que es
específico para un antígeno descubierto en los tumores pancreáticos
humanos. Este anticuerpo se modifica por conjugación, por término
medio, con un grupo PDP por molécula de anticuerpo, como en el
Ejemplo 1. Se conjuga a continuación metotrexato con estos
anticuerpos modificados tal como se describe para el ricino en el
Ejemplo 19.
Se tratan dos grupos de diez pacientes con cáncer
pancreático. El primer grupo recibe inyecciones intravenosas de MAB
con PDP y fármaco en PBS a razón de 20 \mug/kg de peso corporal
total semanalmente en combinación con la terapia tradicional. El
segundo grupo recibe inyecciones de PBS en combinación con la
terapia tradicional como referencia. Después de 10 semanas, se
realiza la inmunogammagrafía de los pacientes supervivientes.
En inmunogammagrafía, el tamaño medio de los
tumores diagnosticados por imagen en el primer grupo de pacientes
es reducido en comparación con el grupo de referencia.
Así pues, el ejemplo anterior ilustra la utilidad
de los anticuerpos modificados en inmunoterapia en el hombre.
Como se describió anteriormente, en una forma
preferida de la presente invención, los anticuerpos modificados
están formulados en composiciones farmacéuticas. Así pues, los
anticuerpos modificados por PDP que están conjugados con un fármaco
para inmunoterapia se pueden incorporar en una composición
inyectable con una cantidad citotóxica eficaz de conjugados
modificados anticuerpo-toxina de la presente
invención. El siguiente es un ejemplo de composición eficaz para la
citotoxicidad eficaz contra los linfomas de linfocito B en el
hombre.
Composición farmacéutica eficaz contra el
linfoma de linfocito B en el
hombre
| 10 mg/ml | Lym-1 modificado radiomarcado del Ejemplo 18 |
| Equilibrio | Solución salina tamponada con fosfato (0,9%) |
Además, los MAb modificados radiomarcados se
pueden formular en composiciones eficaces para visualizar sus
antígenos específicos en inmunogammagrafía. El siguiente es un
ejemplo de dicha composición.
Composición farmacéutica eficaz en
inmunogammagrafía de carcinoma de
colon
| 10 mg/ml | B72.3 modificado radiomarcado del Ejemplo 15 |
| Equilibrio | Solución salina tamponada con fosfato (0,9%) |
Aunque el Ejemplo 23 ilustraba un procedimiento
para localizar anticuerpos biotinilados radiomarcados, aquellos que
tengan experiencia habitual en la técnica reconocerán que también
serán aplicables procedimientos alternativos para localizar
anticuerpos marcados. Por ejemplo, la distribución de anticuerpos
biotinilados radioyodados se puede localizar mediante diagnóstico
inmunogammagráfico por imagen exactamente como se describe en el
Ejemplo 14. Así pues, por ejemplo, el MAb biotinilado radioyodado
con especificidad de unión para un antígeno tumoral sería útil en
procedimientos de diagnóstico. El Ejemplo siguiente describe cómo
se podría realizar dicho procedimiento de diagnóstico por
imagen.
El Ejemplo 28 describe un procedimiento en el que
los MAb biotinilados radiomarcados se pueden utilizar para
diagnosticar por imagen células tumorales in vivo.
Se identifica en primer lugar un paciente humano
que ha sido diagnosticado de melanoma metastásico. El análisis
inmunohistológico indica que el melanoma del paciente expresa un
antígeno en la superficie de la célula susceptible de ser teñido con
MAb anti-melanoma. En primer lugar el MAb
anti-melanoma se modifica químicamente por
biotinilación de grupos amino libres según el procedimiento del
Ejemplo 19 y se radioyoda con ^{131}I según el procedimiento del
Ejemplo 20. El MAb anti-melanoma biotinilado,
radiomarcado, sustancialmente purificado se combina a continuación
con un excipiente farmacéuticamente aceptable y se administra al
paciente. Después de tres días, los MAb modificados inyectados han
localizado sustancialmente las células que expresan los antígenos de
melanoma. Los MAb localizados se visualizan a continuación por
diagnóstico inmunogammagráfico por imagen utilizando un colimador
de orificio y una cámara gamma spectrum 91 que se puede adquirir en
Raytheon. El registro fotográfico indica una pequeña área de
radioactividad en la piel de los pacientes, identificando de este
modo un tumor secundario.
Se debe reconocer que determinadas variaciones
mecánicas o químicas se les pueden sugerir a los expertos en la
técnica. Los siguientes ejemplos y la descripción detallada se ha
de entender claramente que proporcionan, a título de ilustrativo, el
espíritu y el alcance de la presente invención estando limitados
únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Claims (13)
1. Composición de materia, que comprende:
- un anticuerpo conjugado con biotina en una primera zona de unión que es por lo menos una de las variedades de grupos amino libres dispuestos en el anticuerpo para producir un anticuerpo modificado, presentando dicho anticuerpo una carga neta positiva reducida comparada con el anticuerpo intacto, presentando dicho anticuerpo una velocidad de eliminación in vivo entre las velocidades de eliminación de los fragmentos F(ab')_{2} y de los anticuerpos intactos del mismo tipo; y
- un grupo químico unido al anticuerpo en otra segunda zona de unión distinta de la primera zona de unión en la que el anticuerpo se conjuga con la biotina.
2. Composición según la reivindicación 1, en la
que dicho anticuerpo se selecciona de entre el grupo constituido
por un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.
3. Composición según la reivindicación 1, en la
que el grupo químico es un marcador.
4. Composición según la reivindicación 3, en la
que el marcador es un radionucleido.
5. Composición según la reivindicación 4, en la
que el radionucleido halógeno o Technicium está unido al
anticuerpo modificado.
6. Composición según la reivindicación 5, en la
que dicho radionucleido halógeno se selecciona de entre el grupo
constituido por ^{125}I y ^{131}I.
7. Composición según la reivindicación 3, en la
que dicho marcador es detectable por diagnóstico por imagen de
resonancia magnética.
8. Composición según la reivindicación 1, en la
que dicho grupo químico es una molécula biológicamente activa.
9. Composición según la reivindicación 8, en la
que dicha molécula biológicamente activa se selecciona de entre el
grupo constituido por una toxina, un fármaco y un quelato.
10. Composición según la reivindicación 9, en la
que dicho fármaco se selecciona de entre el grupo constituido por
metotrexato, 5-fluoto-uracilo,
cis-platino y adriamicina.
11. Composición de materia, que comprende:
- un anticuerpo conjugado con un colorante, un quelante o biotina en una primera zona de unión que es por lo menos una de las variedades de grupos amino libres dispuestos en el anticuerpo para producir un anticuerpo modificado, presentando dicho anticuerpo una carga neta positiva reducida comparada con el anticuerpo intacto, presentando dicho anticuerpo una velocidad de eliminación in vivo comprendida entre las velocidades de eliminación de los fragmentos F(ab')_{2} y de los anticuerpos intactos del mismo tipo, con la condición de que dicho colorante, quelante o biotina no sea un agente heterobifuncional; y
- una toxina unida al anticuerpo en una segunda zona de unión distinta de la primera zona de unión en la que el anticuerpo está conjugado con el colorante, quelante o biotina,
en la que la toxina comprende la cadena A de
ricino.
12. Procedimiento para la preparación de un
anticuerpo modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1, 9
ó 10, en el que dicho anticuerpo tiene aumentada la especificidad
de unión al antígeno, tiene la unión no específica reducida y el
tiempo de eliminación in vivo reducido, que comprende las
siguientes etapas:
- obtención de dicho anticuerpo, en el que dicho anticuerpo está intacto;
- reacción de dicho anticuerpo intacto en una primera zona de unión que es por lo menos uno de los grupos amino libres con biotina para producir dicho anticuerpo modificado, de manera que dicho anticuerpo modificado presente un punto isoeléctrico inferior al punto isoeléctrico del anticuerpo intacto; y
- unión de un radionucleótido, de una toxina, de un fármaco o de un quelato al anticuerpo modificado en una segunda zona de unión distinta de la primera zona de unión en la que el anticuerpo está conjugado con la biotina.
\newpage
13. Procedimiento para la preparación de un
anticuerpo modificado según la reivindicación 11, en el que dicho
anticuerpo tiene aumentada la especificidad de unión al antígeno,
tiene la unión no específica reducida y el tiempo de eliminación
in vivo reducido, que comprende las siguientes etapas:
- obtención de dicho anticuerpo, en el que dicho anticuerpo está intacto;
- reacción de dicho anticuerpo intacto en una primera zona de unión que es por lo menos uno de los grupos amino libres con un colorante, quelante o biotina para producir dicho anticuerpo modificado, de manera que dicho anticuerpo modificado presente un punto isoeléctrico inferior al punto isoeléctrico del anticuerpo intacto; y
- unión de la cadena A de ricino al anticuerpo modificado en una segunda zona de unión distinta de la primera zona de unión en la que el anticuerpo está conjugado con el colorante, el quelante o la biotina.
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