MXPA04008639A - Dimeros de avidina eficaces para aumentar la concentracion de biotina radioactiva en radioinmunoterapia predireccionada. - Google Patents

Abstract

Se describen dimeros de avidina y estreptavidinas (diavidinas) en donde el ligador es suberato, que a su vez, esta enlazado con diferentes grupos funcionales (-NH2 o -COOH) de avidina. En comparacion con la avidina, las diavidinas han demostrado la habilidad de incrementar la cantidad de biotina marcada en el objetivo, cuando se utilizan en una prueba de especificidad previa hacia el objetivo in vitro usando tenascina soportada de humano, anticuerpo monoclonal de antitenascina biotinilada (Mab-B), avidina/diavidina y biotina-3H. Tambien se describe el uso de las diavidinas para el diagnostico de cancer y terapia anticancerigena basandose en el procedimiento de radioinmunoterapia con especificidad previa hacia el objetivo en tres pasos.

Description

DIMEROS DE AVIDINA EFICACES PARA AUMENTAR LA CONCENTRACION DE BIOTINA RADIOACTIVA EN RADIOINMUNOTERAPIA PREDIRECCIONADA Campo de la invención La invención descrita en la presente se relaciona con derivados de avidina que son útiles para el diagnóstico y tratamiento de tumores particularmente el método predireccionado en tres pasos. La invención descrita en la presente se relaciona con . avidinas modificadas que son útiles para usarse en terapia y diagnóstico en humanos y animales y particularmente para el diagnóstico y tratamiento contra estados patológicos como tumores. La invención descrita en la presente se relaciona con el campo técnico de la preparación de medicamentos y métodos de diagnóstico y proporciona compuestos, métodos para su preparación, métodos para su uso y composiciones que los contienen que son adecuadas para la aplicación industrial en el campo farmacéutico. La invención descrita en la presente proporciona compuestos, composiciones y métodos que son útiles para el diagnóstico y medicamentos terapéuticos como técnicas de formación de imágenes y tratamientos contra estados patológicos de órganos y tejidos. REF. :157749 En particular, pero no exclusivamente, la invención se relaciona con el campo de la terapia contra tumores por medio de productos radiofarmacéuticos .

Antecedentes de la invención La terapia antitumoral se implementa principalmente por medio del uso de sustancias que tienen como objetivo la eliminación de células tumorales. Esto se puede lograr con sustancias citotóxicas que tienen que entrar en la célula tumoral a fin de ejercer su efecto completo o por medio del-tratamiento de células tumorales con radiación de suficiente energía para eliminar la misma. En ambos casos, existe el problema de administrar la sustancia tan selectivamente como sea posible en la célula objetivo para evitar el posible daño a las células sanas circundantes. En el caso de productos radio armacéuticos , es decir sustancias que llevan porciones radioactivas, es particularmente importante el problema de administrar selectivamente la parte activa (esto es, la porción radioactiva) en el objetivo tumoral, evitando la diseminación del radionúclido en el cuerpo o en células sanas que rodean el tumor. Un método particularmente efectivo para la terapia y detección de tumores se describe en la Patente EP 0 496 074. El protocolo de esta patente ha sido aplicado en la Radioinmunoterapia Predireccionada Guiada por Anticuerpo (Pretargeted Antibody-Guided Radioimmunotherapy o PAGRIT por sus siglas en inglés) de tumores cerebrales. En este método, se inyecta avidina en el paciente humano, después del anticuerpo monoclonal de antitenascina biotinilada (Mab-B) , para eliminar cualquier Mab-B libre, y que no esté unida al tumor, de la corriente sanguínea mediante la formación de complejos con ésta que se eliminan efectivamente por el hígado (efecto de búsqueda) . Luego se administra una infusión de estreptoavidina para el propósito de obtener una mejor adivinación del tumor en comparación a la que puede obtenerse en comparación con avidina, cuya permanencia en la sangre es demasiado corta en comparación a la estreptoavidina. Aunque el sistema ha mostrado respuestas clínicas positivas {Cremonesi, M. et al., 1999; Paganelli, G. et al., 1999, Paganelli G. et al., 2001), un principal factor limitante que comprende la fuerte respuesta inmunitaria causada por estreptoavidina (.Paganelli G. et al., 1997) . Para el propósito de sobreponerse estos dos obstáculos, es decir, el elevado grado de inmunogenicidad de estreptoavidina y la rápida depuración de avidina, se han utilizado avidinas que están químicamente modificadas mediante la unión covalente de cadenas de polioxietilenglicol (PEG) con avidina, con varios niveles de derivatización basándose en el uso de PEG de cadena recta o ramificada de diferentes pesos moleculares. Los estudios preliminares han revelado que aumentando el grado de funcionalización de avidina con PEG (de aquí en adelante llamado pegilación), existe un incremento en la vida media plasmática de avidina, una reducción de su inmunogenicidad y un me oramiento en la biodistribución específica de la sustancia en relación con el tumor. Ya que la habilidad de la avidina-PEG para unirse con biotina Mab B se reduce mediante la pegilación, el resultado es una reducción en la potencia de los derivados (Chinol, M. et al.) . Se ha propuesto una solución a este problema en la Solicitud de Patente WO 94/23759, presentada con el nombre de Immunomedics , en donde se describen multipolímeros de avidina basados en la derivatización química de moléculas de elevado peso molecular, preferiblemente mayor que 5,000 Da, como el dextrán, proteínas y ácidos policarboxílicos . Pero ninguno de los cinco multímeros descrito efectivamente en la Patente ha sido caracterizado el término de su potencia de acción en el procedimiento predireccionado o en otros procedimientos. Como se demuestra en la invención descrita en la presente, el concepto general de multimerización (también incluyendo la dimerización) , proporcionado en la Solicitud de Patente anteriormente mencionada, WO 94/237599, no proporciona instrucciones completas y suficientes para el técnico promedio para poder encontrar un multímero de avidina genérico capaz de cumplir con los requisitos necesarios en la Solicitud del método predireccionado en tres pasos. Ciertamente, las diferentes diavidinas obtenidas usando diferentes agentes de entrecruzamiento bifuncionales , aunque tiene la misma habilidad de unirse a la biotina libre, difieren en cuanto a su potencia cuando se valoran in vitro el predireccionamiento en tres pasos, hasta el grado que, en ciertos casos, han probado ser completamente ineficaces. Esta observación indica que la multimerización de avidina no produce automáticamente productos funcionales útiles, pero que es necesaria la caracterización biológica para la elección de una molécula potencializada adecuada para el predireccionamiento.

Breve descripción de la invención Se ha descubierto que al unir dos moléculas de avidina con un ligador bifuncional, capaz de unir los grupos amino y/o carboxilo de avidina, seleccionado a partir de suberato de disuccinimidilo (un dímero llamado de aquí en adelante diavidina 1) y diamina de PEG con peso molecular de 3,400 (dímero de aquí en adelante llamado diavidina 2) , con dos dímeros de avidina que pueden obtenerse y cumplen con los requisitos para usarse en el método de tratamiento contra tumores conocido como PAGRIT. Por lo tanto, los objetivos de la invención descrita en la presente son un dímero de avidina en donde dos moléculas de avidina se unen mediante grupos -NH2 por medio de un suberato y un dímero de avidina en donde dos moléculas de avidina se unen por medio de grupos -COOH por medio de polietilenglicol con peso molecular de 3,400. Otros objetivos de la invención descrita en la presente son composiciones de diagnóstico y/.o farmacéuticas que contienen las diavidinas anteriormente mencionadas . Otros objetivos de la presente invención son el uso de las diavidinas como medicamentos o agentes de diagnóstico para estados patológicos de órganos y tej idos y particularmente para la preparación de medicamentos útiles para la terapia o diagnóstico de tumores. Estos y otros objetivos relacionados con la presente invención serán ilustrados con mayor detalle a continuación y también por medio de los Ejemplos Experimentales.

Descripción detallada de la invención Como se pretende en la presente invención, el término avidina abarca tanto avidina como estreptavidina , pero se especificará el caso en donde estreptavidina se utilice como la modalidad particular de la presente invención. Se prepara diavidina 1 haciendo reaccionar avidina con suberato de disuccinimidilo (DSS) , teniendo N-hidroxisuccinimidilo (éster NHS) como el éster activo, DSS es un agente de entrecruzamiento homobifuncional que es reactivo para unirse al grupo -NH2 de avidina. Se generó diavidina 2 y diavidina 3 (control negativo) usando diamina de PEG (PEG(NH2)2) con un peso molecular de 3,400 y ácido polietilenglicol-disuccinimidilpropiónico [PEG (SPA)21 con un peso molecular de 3,400, respectivamente como agentes de . reticulación homobifuncionales . Debido a la eliminación más lenta de estreptavidina en comparación con avidina en la circulación, la diestreptavidina es una modalidad particular de la presente invención. La vida media más larga es crucial para lograr el máximo aumento en cuanto a eficacia de avidina. El protocolo para el entrecruzamiento de estreptavidina es similar al usado para la producción de diavidina 1. Las composiciones farmacéuticas o de diagnóstico según la presente invención contienen al menos una de las diavidinas descritas aquí . La diavidina está en una mezcla con vehículos y/o excipientes adecuados comúnmente utilizados en la farmacia y como aquellos descritos en "Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook" última edición. Las composiciones según la presente invención contienen una cantidad eficaz de diavidina. Los ejemplos preferidos de las composiciones farmacéuticas son aquellos que permiten la administración parenteral y locorregional . Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el propósito de la invención son soluciones, suspensiones o formas liofilizadas que se han de reconstituir al momento de usar. Con respecto al uso de diavidinas según la presente invención, estas son particularmente adecuadas para la preparación de medicamentos o métodos de diagnóstico para el diagnóstico o las terapias contra estados patológicos de tejidos, por ejemplo, tumores por medio de la técnica conocida como predireccionada (pretargeting) con anticuerpos y por esta razón, también son adecuadas para las técnicas in vi tro predireccionados . En una realización, a manera de ejemplo, la técnica predireccionada se implementa con un anticuerpo antitenascina biotinilada, preferiblemente un anticuerpo monoclonal . Las formas adecuadas de aplicación industrial de la presente invención también son estuches o juegos de reactivos para el diagnóstico o terapia, particularmente la radioterapia de tumores como por ejemplo los que se describen en EP O 496 074, en el estudio llevado a cabo por Paganelli, Chinol et al., publicado en el European Journal of Nuclear Medicament Vol . 26, No. 4; Abril 1999; US 5,968,405 y literatura relacionada. Otro objetivo de la invención descrito en la presente es un estuche o juego de reactivos para el diagnóstico o terapia contra tumores, particularmente por medio de radioactividad como por ejemplo, con el método predireccionado, preferiblemente el de tres pasos, caracterizado en que al menos uno de los componentes del juego de reactivos contiene diavidina. En este juego de reactivos, un anticuerpo biotinilado preferido es un anticuerpo antitenascina e incluso con mayor preferencia un anticuerpo monoclonal . Los siguientes Ejemplos ilustran aún más la invención.

Ejemplo 1 Diavidina 1 Se mezcla 1 mi de solución de avidina, 300 µ? en PBS, pH 7.4 con 25 µ? de DSS (de Pierce) 25 mM en DMSO (proporción avidina: DSS, 1:2). La mezcla se incuba durante dos horas a 0°C antes de bloquear la reacción con 50 µ? TRIS 1M, pH 8.0. La elección de la proporción de reacción anteriormente mencionada fue basada en pruebas preliminares usando proporciones de 1:1 a 1:10.

El esquema de reacción es- el siguiente: Avidina-NH2 + DSS + H2N-Avidina Avidina-NH-CO (CH2) 6CONH-Avidina + 2NHS (Diavidina 1) Ejemplo 2 Diavidina 2 Se mezcla 1 mi dé solución de avidina, 450 µ? en PBS, pH 7.4 con 120 µ? de PEG (NH2)2 (de Shearwater Corp.), 9 mM en H20 y 50 µ? de 1 - (3 -dimetilaminopropil ) -3 -etilcarbodiimida-HCl (EDAC) , 260 mM en DMSO (proporción avidina: PEG, 1:2.5 aproximadamente) y se permite reaccionar durante dos horas a temperatura ambiente. Al final de este período sé agrega 50 µ? TRIS 1 , pH 8.0. y se somete a filtración en gel . La proporción avidina: PEG fue investigada a partir de una amplia gama entre 1:1 a 1:10 a un pH de reacción de 4.0 a 8.0. El valor de la proporción PEG: avidina en el producto final de diavidina 2 purificada fue 0.9, usando el método descrito por Sims et al, 1980. En breve, se diluye diavidina 2 a 300 en agua, 250 µ? de 5% BaCl2 en HC1 1N se agrega a un volumen de 1 mi y luego se preparan 250 µ? de una solución al mezclar 1.27 g de I2 en 100 mi de KI al 2%. La mezcla se incuba durante 15 minutos y luego se obtiene la lectura de absorbancia a 535 nm. La curva estándar se obtiene con PEG (NH2)2.

El esquema de reacción para diavidina 2 es el siguiente : Avidina - COOH + H2N - PEG - NH2 + HOOC - Avidina i EDAC Avidina - CONH - PEG - NHCO - Avidina (Diavidina 2) Ejemplo 3 Diavidina 3 Se mezcla 1 mi de avidina 150 µ? en PBS, pH 7.4 con 20 µ? de PEG disuccinimidil -propionato (SPA - PEG - SPA) 20 mM en H20 (proporción avidina: PEG, 1:3.5) y se le permite reaccionar durante dos horas a 0°C. La proporción de reacción se seleccionó en base a las pruebas preliminares llevadas a cabo con proporciones que abarcan de 1:2 a 1:10. El valor de la proporción PEG: avidina en el dímero purificado, como se determinó utilizando el método desarrollado por Sims et al., fue 3:1. El esquema de la reacción es el siguiente: Avidina-NH2 + NHS -CO-CH2CH2OPEGOCH2CH2CONHS + H2N-Avidina i Avidina-NHCOCH2CH2OPEGOCH2CH2CONH-Avidina (Diavidina 3) La producción de diavidina en las tres reacciones descritas en los Ejemplos 1, 2 y 3 fue de aproximadamente 20-30%. Al incrementar la cantidad de los tres ligadores en las reacciones, se obtuvieron mayores cantidades finales de oligómeros de avidina (trímero, etc., no se muestra) , con dificultad en separación cromatográfica como resultado. Las mezclas de reacción se analizaron sobre una columna de filtración en gel Superdex 200-10/30, mientras que la purificación de los productos se llevó a cabo en una columna Superdex 200-16/60. Los perfiles cromatográficos de las mezclas de reacción para diavidina 1 , 2 y 3 se muestran en las Figuras la, Ib y le, respectivamente. Los pesos moleculares de una serie de proteínas convencionales (calibración) se indican en los respectivos tiempos de elución. La calibración de la columna se muestra en la Figura Id: dextrán azul (Vo) , ferritina (444 KDa) , aldolasa (158 KDa) , albúmina (67 KDa) y ribonucleasa (14 KDa) fueron utilizados . Los dímeros de avidina purificados se presentan en las Figuras le, lf y lg. Las muestras fueron separadas en Superdex 200-10/15 a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min (a-d) y 1 ml/min (e-g) en PBS en el sistema Jasco HPLC conectado con un espectrofotómetro de 280 nm. Ejemplo 4 Dies reptavidina Se mezcla 1 mi de estreptavidina (300 µ? en PBS, pH 7.4) con 25 µ? de DSS (25 mM en DMSO) a una proporción de estreptavidina: DSS de 1:2 y se incuba durante 2 horas a 0°C antes de extinguir la reacción con 50µ1 1M TRIS, pH 8.0. Se analizaron un total de 4 estados de reacción con una proporción de estreptavidina : DSS que abarca de 1:1 a 1:10. Seleccionamos la proporción anteriormente descrita de 1:2. El esquema de reacción es análogo a los mencionados en los Ejemplos previos. El perfil cromatográfico de la mezcla de entrecruzamiento al final de la reacción para diestreptavidina se muestra en la Figura 5a. La diestreptavidina purificada se muestra en la Figura 5b y estreptavidina en 5c. Las muestras se analizaron en una columna Superdex 200-10/15 a una velocidad de flujo de lml/min en PBS en un sistema Jasco HPLC conectado con un espectrofotómetro que mide la absorbancia a 280 nm.

Determinación de la habilidad de las diavidinas para unirse a biotina Para comparar la capacidad de avidina y diavidina para unirse a biotina se utilizó el método HABA (ácido 4-hidroxiazobencen-2 ' -carboxílico) . La avidina- y diavidina estuvieron a una concentración que corresponde a 3 µ? de monómero de avidina 67 KDa en 0.1 M fosfato, 0.4 mM HABA a pH 7.0. Luego se agregó biotina disuelto en fosfato a una concentración final que abarcó de 0 a 20 µ? y la absorbancia se inhibió a 500 nm. Se evaluó la capacidad para unirse a la biotina como la concentración de biotina necesaria para desplazar 50% de HABA encontrado. Aproximadamente 5 µ? de biotina fueron capaces de desplazar 50% de HABA tanto con avidina como con las tres diavidinas (Figura 2) , mediante lo cuál puede deducirse que las diavidinas conservan la cantidad total de sitios de unión después de la reticulación. Las propiedades de unión a la biotina de la diavidina son comparables a la de avidina .

Valoraciones de especificidad previa hacia objetivo in vi tro Para analizar la habilidad de diavidinas para incrementar la cantidad de biotina radiomarcada que se une a tenascina por medio del anticuerpo monoclonal antitenascina biotinilado (Mab-B) , se utilizó la valoración in vi tro de especificidad previa hacia el objetivo que se ilustra esquemáticamente en la Figura 3. En breve, se adsorbió una placa de 96 pocilios con 0.5 H-j/P00-.!].0 de tenascina de humano (Tn-C) durante 16 horas a 4°C. Después de tres lavados con PBS y 0.1% Tween 20, los sitios adsorbentes residuales en los pocilios se bloquearon con PBS, 2% BSA, 2% y 0.1% Tween 20, durante una hora a temperatura ambiente. Luego se incubaron durante 2 horas dos anticuerpos monoclonales antitenascina biotinilados (ST2146 ó ST2077) en los pocilios a una concentración de saturación de 10 9/p?1. Después de lavar como se indica anteriormente, se incubó avidina o diavidina por duplicado en los pocilios a concentraciones cada vez mayores. Por último, una cantidad saturante de 5 pmol de biotina-3H (1.6 TBq/mmol) se incubó durante una hora en cada pocilio. Después de los lavados, se obtuvo la lectura de la placa en un contador ß. Como se muestra en' las Figuras 4a-4b, para ambas MAb utilizadas, diavidina 1 y diavidina 2 producen un aumento en biotina unida en comparación con avidina; diavidina 3 no muestra incremento con MAb ST2146 o muestra una reducción de la habilidad de unión con MAb ST2077. En comparación con avidina, diavidina 2 a la concentración de 2.5 µg/ml muestra un incremento en la cantidad de biotina-3H unida por un factor de 2.1 (media en tres experimentos) con Mab ST2077. Para diavidina 1, el incremento fue un factor de 1.6 (media en 6 experimentos), mientras que para diavidina 3 la habilidad de unión fue menor (90%) en comparación al monómero de avidina. A partir de estos experimentos puede concluirse que tanto la longitud del ligador como los sitios de unión involucrados en el dímero de diavidina afectan la actividad del dímero predireccionado mediada por anticuerpos biotinilados . La diestreptavidina probó ser más potente que estreptavidina in vitro como se muestra en la Figura 6. Se recubrieron placas con 96 pocilios para microtitulación con 0.5 µ /??s?11? de TnC de humano durante 16 horas a 4°C, se lavó tres veces con PBS, 0.1% Tween 20 y luego se bloqueó para una unión inespecífica con PBS/2%BSA/0.1% Tween-20. El anticuerpo anti-TnC biotinilado ST2146 se agregó a una concentración de 10 µg/ml durante 2 horas. Los pocilios se lavaron 3 veces con PBS/Tween-20 y después se agregó estreptavidina o diestreptavidina a las concentraciones indicadas. Finalmente, se agregó 5 pmol 3H-biotina (1.6 TBq/mmol), los pocilios se incubaron durante 2 horas, se lavaron y se contaron en un contador ß. Como se muestra en la Figura 6, la diestreptavidina interviene en una mayor unión de biotina radiomarcada en comparación a estreptavidina.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un dímero de avidina, caracterizado porque dos moléculas de avidina se unen por medio de grupos -NH2 por medio de suberato. 2. El dímero de avidina, caracterizado porque dos moléculas de avidina se unen por medio de grupos -COOH mediante polietilenglicol con un peso molecular de 3400.
3. 3. El dímero de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la avidina es estreptavidina .
4. 4. La composición farmacéutica y/o de diagnóstico caracterizada porque contiene el dímero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. 5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque puede administrarse parenteralmente o locorregionalmente .
6. 6. El uso del dímero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para la preparación de medicamentos y métodos de diagnóstico.
7. 7. El uso del dímero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para la preparación de un medicamento útil para el diagnóstico o tratamiento contra estados patológicos de órganos o tejidos.
8. 8. El uso del dimero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para la preparación de medicamentos o métodos de diagnóstico útiles para la terapia o diagnóstico de tumores.
9. 9. El uso del dimero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en métodos predireccionados usando anticuerpos in vi tro.
10. 10. El uso del dimero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento contra enfermedades usando métodos predireccionados con anticuerpos.
11. 11. El uso de conformidad con la reivindicación 10, donde la enfermedad es un tumor.
12. 12. El uso de conformidad con la reivindicación 10, donde el anticuerpo es un anticuerpo ant itenascina .
13. 13. El uso de conformidad con la reivindicación 12, donde el anticuerpo de antitenascina es monoclonal .
14. 14. El uso de conformidad con la reivindicación 10, donde el medicamento es parte de un juego de reactivos que es útil en el diagnóstico y tratamiento contra tumores por medio de una técnica predireccionada en tres pasos.
15. 15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, donde el juego de reactivos contiene un producto radiofarmacéutico .
16. 16. El juego de reactivos para radioterapia o diagnóstico de tumores, caracterizado porque al menos uno de los componentes del mismo, contiene un dímero de conformidad con la reivindicación 1 ó 2. '
17. 17. El juego de reactivos de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque es para usarse en la técnica predireccionada.
18. 18. El juego de reactivos de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la técnica predireccionada se lleva a cabo en tres pasos.
19. 19. El juego de reactivos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16, 17 ó 18, caracterizado porque contiene una antitenascina biotinilada .
20. 20. El juego de reactivos de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.