ES2301160T3 - Luciferasas mutantes. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SUMINISTRA MUTACIONES QUE NO SE PRODUCEN DE FORMA NATURAL DE LUCIFERASAS DEL ESCARABAJO Y DNAS QUE CODIFICAN DICHAS MUTACIONES. UNA LUCIFERASA MUTANTE DE LA INVENCION DIFIERE DE LA LUCIFERASA CORRESPONDIENTE DE TIPO SALVAJE POR PRODUCIR BIOLUMINISCENCIA CON UNA LONGITUD DE ONDA DE INTENSIDAD DE PICO QUE DIFIERE EN AL MENOS UN NM DE LA LONGITUD DE ONDA DE LA INTENSIDAD DEL PICO DE LA BIOLUMINISCENCIA PRODUCIDA POR LA ENZIMA DE TIPO SALVAJE. LAS LUCIFERASAS MUTANTES Y LOS DNAS DE LA INVENCION SE EMPLEAN EN DIFERENTES APLICACIONES DE BIODETECCION.
Description
Luciferasas mutantes.
Esta invención se refiere de un modo general a
enzimas luciferasa que producen luminiscencia, iguales que la de las
luciérnagas. Más en particular, la presente invención concierne a
luciferasa mutante de escarabajos. Las luciferasas mutantes de la
presente invención se obtienen por ingeniería genética, no se
presentan en la naturaleza y, en cada caso, incluyen modificaciones
que producen un cambio de color de la luminiscencia que se produce.
Las luciferasas de la presente invención pueden usarse, al igual que
sus contrapartidas de origen natural, para proporcionar señales
luminiscentes en pruebas o ensayos para varias sustancias o
fenómenos.
El uso de moléculas informadoras
("repórter") o etiquetas para observar cualitativa o
cuantitativamente acontecimientos moleculares está bien establecido.
Se encuentran en ensayos para diagnósticos médicos, para la
detección de toxinas y otras sustancias en entornos industriales, y
para investigación básica y aplicada en biología, biomedicina y
bioquímica. Tales ensayos incluyen inmunoensayos, ensayos de
hibridación de sondas de ácidos nucleicos, y ensayos en los que se
produce una enzima informadora u otra proteína por expresión bajo
control de un promotor en particular. Las moléculas informadoras, o
marcadores en tales sistemas de ensayo, llevan incluidos isótopos
radioactivos, agentes fluorescentes, enzimas y agentes
quimioluminiscentes.
Incluidos en el sistema de ensayo que emplea
quimioluminiscencia para observar o medir acontecimientos de
interés, se encuentran ensayos que miden la actividad de una enzima
bioluminiscente, la luciferasa.
Se han conocido sistemas emisores de luz y se
han aislado de muchos organismos luminiscentes, incluyendo
bacterias, protozoos, celentéreos, moluscos, peces, milípedos (o
milpiés), moscas, hongos, gusanos, crustáceos y escarabajos, en
particular escarabajos elatéridos (click beetles) del género
Pyrophorus y las luciérnagas de los géneros Photinus,
Photuris y Luciola. En muchos de estos organismos, las
enzimas catalizan monooxigenaciones y utilizan la energía libre
resultante para excitar una molécula hasta un estado de energía más
elevado. Se emite luz visible cuando la molécula excitada vuelve
espontáneamente al estado fundamental. Esta luz emitida se llama
"bioluminiscencia". En adelante puede denominarse simplemente
como "luminiscencia".
La frecuencia limitada de bioluminiscencia
natural es una ventaja de usar enzimas luciferasa como grupos
informadores para observar acontecimientos moleculares. Como la
bioluminiscencia natural es tan rara, es improbable que la
producción de luz de otros procesos biológicos oculte la actividad
de una luciferasa introducida en un sistema biológico. Por
consiguiente, incluso en un entorno complejo, la detección de luz
proporcionará una indicación clara de la actividad de la
luciferasa.
Las luciferasas poseen características
adicionales que las hacen particularmente útiles como moléculas
informadoras para la biodetección (uso de un sistema informador para
revelar propiedades de un sistema biológico). La transducción de
señal en biosensores (sensores que comprenden un componente
biológico) implica generalmente un proceso en dos etapas: generación
de señal por medio de un componente biológico, y transducción y
amplificación de la señal por medio de un componente eléctrico. La
generación de la señal se consigue típicamente mediante unión o
catálisis. La conversión de estos acontecimientos bioquímicos en una
señal eléctrica se basa típicamente en métodos de detección
electroquímicos o calóricos, que están limitados por el cambio de
energía libre de las reacciones bioquímicas. Para la mayor parte de
las reacciones, esta es menor que la energía de hidrólisis para dos
moléculas de ATP, o aproximadamente 70 kJ/mol. Sin embargo, la
luminiscencia producida por luciferasas lleva un contenido de
energía mucho más alto. Los fotones emitidos por la reacción
catalizada por la luciferasa de la luciérnaga (560 nm) tiene 214
Kj/einstein. Además, la reacción catalizada por la luciferasa es una
de las reacciones bioluminiscentes más eficientes que se conocen,
teniendo un rendimiento cuántico de casi 0,9. Esta enzima es por
tanto un transductor de energía química extraordinariamente
eficiente.
Desde los primeros estudios, las luciferasas de
escarabajos, en particular la de la especie de luciérnaga
norteamericana común Photinus pyralis, han servido de
paradigma para entender la bioluminiscencia. El conocimiento de los
fundamentos y las aplicaciones de la luciferasa se han basado en una
sola enzima llamada "luciferasa de la luciérnaga", derivada de
Photinus pyralis. Sin embargo, hay más o menos unas 1800
especies de escarabajos luminosos por todo el mundo. Así, la
luciferasa de Photinus pyralis es un simple ejemplo de un
grupo, grande y diverso, de luciferasas de escarabajos. Se sabe que
todas las luciferasas de escarabajos catalizan una reacción del
mismo sustrato, un ácido orgánico poliheterocíclico, el ácido
D-(-)-2-(6'-hidroxi-2'-benzotiazolil)-\Delta^{2}-tiazolina-4-carboxílico
(en adelante denominado "luciferina" a menos que se indique
otra cosa). que es convertido en una molécula de alta energía. Es
probable que la reacción catalizada conlleve el mismo mecanismo en
cada caso.
El esquema general implicado en el mecanismo de
la bioluminiscencia del escarabajo parece ser uno por el que la
producción de luz tiene lugar después de la descarboxilación
oxidativa de la luciferina, por interacción de la luciferina oxidada
con la enzima. El color de la luz viene determinado aparentemente
por la organización espacial de los aminoácidos de la enzima que
interaccionan con la luciferina oxidada.
La reacción catalizada por luciferasa que
produce bioluminiscencia (en adelante denominada simplemente como
"la reacción luciferasa-luciferina") ha sido
descrita como un proceso en dos etapas en el que interviene la
luciferina, trifosfato de adenosina (ATP) y oxígeno molecular. En la
reacción inicial, la luciferina y el ATP reaccionan para formar
adenilato de luciferilo con la eliminación de pirofosfato
inorgánico, como se indica en la reacción siguiente:
en la que E es la luciferasa,
LH_{2} es luciferina, y PP_{i} es pirofosfato. El adenilato de
luciferilo, LH_{2}-AMP, permanece estrechamente
unido al sitio catalítico de la luciferasa. Cuando esta forma de la
enzima es expuesta a oxígeno molecular, el adenilato de luciferilo
unido a la enzima es oxidado para dar oxiluciferina (L=O) en un
estado electrónicamente excitado. La luciferina oxidada excitada
emite luz al volver al estado fundamental, como se indica en la
reacción
siguiente:
Se emite un cuanto de luz por cada molécula de
luciferina oxidada. El estado electrónicamente excitado de la
luciferina oxidada es un estado característico de la reacción
luciferasa-luciferina de una luciferasa de
escarabajo; el color (y, por consiguiente, la energía) de la luz
emitida al volver la luciferina oxidada al estado fundamental viene
determinado por la enzima, como se pone de evidencia por el hecho de
que varias especies de escarabajos que tienen la misma luciferina
emiten luz de distinto color.
Las luciferasas han sido aisladas directamente
de varias fuentes. Los cDNAs que codifican luciferasas de varias
especies de escarabajos han sido publicados (véanse Wet et
al., Molec. Cell. Biol. 7, 725-737 (1987);
Masuda et al., Gene 77, 265-270 (1989); Word
et al., Science 244, 700-702 (1989)).
Disponiendo del cDNA que codifica una luciferasa de escarabajo, es
muy sencillo para un experto en la técnica preparar grandes
cantidades de la luciferasa aislándola de las bacterias (p. ej.
E. coli), levaduras, células de mamífero en cultivo, o
similares, que han sido transformadas para expresar el cDNA.
Alternativamente, el cDNA, bajo el control de un promotor apropiado
y otras señales para controlar la expresión, puede ser usado en tal
célula para proporcionar luciferasa, y en definitiva
bioluminiscencia catalizada por ella, como señal para indicar
actividad del promotor. A su vez, la actividad del promotor puede
reflejar otro factor que se procura observar, tal como la
concentración de una sustancia que induce o reprime la actividad del
promotor. Varios sistemas libres de células, que se han hecho
recientemente disponibles para preparar proteínas a partir de los
ácidos nucleicos que las codifican, pueden también usarse para
preparar luciferasas de escarabajos.
Además, la disponibilidad de cDNAs que codifican
luciferasas de escarabajos y la capacidad para el cribado rápido de
cDNAs que codifican enzimas que catalizan la reacción
luciferasa-luciferina (véanse Wet et al.,
supra, y Word et al., supra) permiten también al experto
en la técnica preparar y obtener en grandes cantidades otras
luciferasas que retienen actividad catalizando la producción de
bioluminiscencia mediante la reacción
luciferasa-luciferina. Estas otras luciferasas
pueden también prepararse, y también pueden usarse los cDNAs que las
codifican, como se indicó en el párrafo anterior. En la presente
descripción, la expresión "luciferasa de escarabajo" o
"luciferasa" significa una enzima que es capaz de catalizar la
oxidación de luciferina para dar bioluminiscencia, como se expuso en
líneas generales anteriormente.
La fácil disponibilidad de cDNAs que codifican
luciferasas de escarabajo hace posible el uso de las luciferasas
como informadores en ensayos empleados para señalar, observar o
medir acontecimientos genéticos asociados con la transcripción y la
traducción, acoplando la expresión de tal cDNA, y en consecuencia la
producción de la enzima, a tales acontecimientos genéticos.
La luciferasa de la luciérnaga se ha empleado
con profusión para detectar la actividad de promotor en eucariotas.
Aunque esta enzima ha sido también usada en procariotas, la utilidad
de la luciferasa de la luciérnaga como informador genético en
bacterias no está reconocida de una forma generalizada. Como
informadores genéticos, las luciferasas de escarabajo son
particularmente útiles ya que son productos monómeros de un gen
individual. Además, no se requieren modificaciones
post-traduccionales para la actividad enzimática, y
la enzima no contiene grupos prostéticos, cofactores unidos, ni
puentes disulfuro. La luminiscencia del E. coli que contiene
el gen de la luciferasa de la luciérnaga puede ser disparada
añadiendo el sustrato luciferina al medio de crecimiento. La
luciferina atraviesa fácilmente las membranas biológicas y no puede
ser usada como fuente de carbono o de nitrógeno por el E.
coli. Los otros sustratos requeridos para la reacción
bioluminiscente, el oxígeno y el ATP, están disponibles dentro de
las células vivas. Sin embargo, se necesitarían variaciones medibles
en el color de la luminiscencia de luciferasas, para sistemas que
utilizan dos o más luciferasas distintas como informadores
(generadores de señal).
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Pueden utilizarse clones de diferentes
luciferasas de escarabajo, en particular de un único género o
especie, en sistemas informadores bioluminiscentes. La expresión en
hospedadores exógenos debe diferir poco entre estas luciferasas a
causa de su estrecho parecido de secuencias. Así pues, en
particular, las luciferasas del escarabajo elatérido (click
beetle)pueden proporcionar un sistema informador múltiple que
puede permitir que la actividad de dos o más promotores diferentes
sea observada dentro de un solo hospedador, o para diferentes
poblaciones de células que sean observadas simultáneamente. La
capacidad para distinguir cada una de las luciferasas en una mezcla,
sin embargo, está limitada por la anchura de sus espectros de
emisión.
Uno de los más espectaculares ejemplos de
variación del color de la luminiscencia ocurre en Pyrophorus
plagiophtalamus, un gran escarabajo elatérido autóctono del
Caribe. Este escarabajo tiene dos juegos de órganos luminosos, un
par en la superficie dorsal del protórax, y un único órgano en una
grieta ventral del abdomen. Cuatro clones de luciferasa diferentes
han sido aislados del órgano ventral. Las reacciones
luciferina-luciferasa catalizadas por estas enzimas
producen luz que se encuentra en el margen entre el verde y el
naranja.
Los datos espectrales de la reacción
luciferasa-luciferina catalizada por estas cuatro
luciferasas muestran cuatro picos solapantes de espaciado casi
uniforme, que emiten luz verde (intensidad de pico: 546 nanómetros),
amarillo-verde (intensidad de pico: 560 nanómetros),
amarillo (intensidad de pico: 578 nanómetros) y naranja (intensidad
de pico: 593 nanómetros). Las correspondientes proteínas se llaman
LucPplGR, LucPplYG, LucPplYE y LucPplOR.
Aunque las longitudes de onda de intensidad de pico de la luz
emitida por estas luciferasas están en un intervalo de
aproximadamente 50 nm, hay todavía un considerable solapamiento
entre los espectros, incluso los que tienen picos a 546 y 593 nm.
Aumentar la diferencia de longitud de onda de la intensidad de pico
sería entonces útil para obtener una mayor precisión de la medida en
sistemas que usan dos o más luciferasas.
Las secuencias de aminoácidos de las cuatro
luciferasas procedentes del órgano ventral son muy similares. Las
comparaciones de las secuencias muestran que son idénticas en un 95
a 99%.
Sería deseable potenciar la utilidad de las
luciferasas de escarabajo para su uso en sistemas que utilizan
múltiples informadores para efectuar mutaciones en cDNAs que
codifican luciferasa para producir luciferasas mutantes que, en la
reacción luciferasa-luciferina, producen luz con
diferencias entre longitudes de onda de intensidad de pico, que son
mayores que las disponibles usando luciferasas actualmente
disponibles.
Las luciferasas de escarabajos están
particularmente adaptadas para producir estas luciferasas mutantes
ya que la variación del color es un resultado directo de los cambios
en la secuencia de aminoácidos.
Las luciferasas mutantes de luciérnagas del
género Luciola son conocidas en la técnica. Véanse Kajiyama
et al., patente de EE.UU. nº 5.219.737 y nº 5.229.285. Las
luciferasas mutantes de escarabajos elatéridos son también conocidas
en la técnica. En una serie de trabajos, Woods et al.
(Journal of Bioluminiscence and Chemiluminiscence, 1989, Vol. 4,
31-39; 1990 Vol. 5, 107-114 y 1989,
Vol. 4, 289-301) describen tales luciferasas
mutantes de escarabajo elatérido que muestran desplazamientos en el
color de emisión.
En el uso de la expresión de la luciferasa en
células eucariotas para biodetección, sería deseable reducir el
transporte de la luciferasa a los peroxisomas. Sommer et al.
Mol. Biol. Cell 3, 749-759 (1992), han
descrito mutaciones en los tres aminoácidos
carboxi-terminales de la luciferasa de P.
pyralis que reducen significativamente el direccionamiento al
peroxisoma de la enzima.
Se conocen las secuencias de loc cDNAs que
codifican varias luciferasas de escarabajo elatérido y de
luciérnaga, y las secuencias de aminoácidos deducidas de las
secuencias de cDNA, como se indica en la Tabla I.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Las secuencias de cDNA y de aminoácidos de
LucPplGR, la luciferasa que emite luz verde del escarabajo
elatérido Pyrophorus plagiophtalamus, se muestran en SEQ ID
No: 1.
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La presente invención proporciona luciferasas
mutantes de escarabajos elatéridos y DNAs que codifican las
luciferasas mutantes como se define en las reivindicaciones 1ª y
18ª. Las luciferasas mutantes producen una luz de color diferente
que la que produce la correspondiente luciferasa de tipo silvestre,
y esta diferencia de color es tal que la longitud de onda de
intensidad de pico de la luminiscencia del mutante difiere en al
menos 1 nm de la longitud de onda de la enzima de tipo
silvestre.
Las luciferasas mutantes de la presente
invención difieren de las correspondientes enzimas de tipo silvestre
por una o más, pero típicamente menos de tres, sustituciones de
aminoácidos. Las luciferasas de la presente invención pueden también
conllevar cambios en uno o más de los tres aminoácidos
carboxi-terminales para reducir el direccionamiento
al peroxisoma.
En un sorprendente aspecto de la presente
invención, se ha descubierto que, combinando en un solo mutante dos
sustituciones de aminoácido, cada una de las cuales, por sí sola,
ocasiona un cambio en el color de la bioluminiscencia
(desplazamiento en la longitud de onda de intensidad de pico), se
provoca que el mutante tenga un desplazamiento en la longitud de
onda de intensidad de pico que es mayor que cualquier otro
desplazamiento causado por las sustituciones de un solo
aminoácido.
Los cDNAs que codifican las luciferasas mutantes
de la presente invención pueden ser obtenidas sencillamente por
cualquier procedimiento estándar de mutagénesis dirigida al sitio,
llevada a cabo con un cDNA que codifica la correspondiente enzima de
tipo silvestre u otro mutante. Las luciferasas mutantes de la
presente invención pueden preparase por procedimientos estándar para
expresar los cDNAs que las codifican en células procariotas o
eucariotas.
eucariotas.
Se obtendrá una apreciación más completa de la
invención al examinar la siguiente descripción detallada de la
invención.
En la descripción y ejemplos que siguen, se
llevan a cabo las etapas del proceso y se miden las concentraciones
a temperatura ambiente (aproximadamente de 20ºC a 25ºC) y a presión
atmosférica, a menos que se especifique otra cosa.
Todos los aminoácidos mencionados en la memoria,
excepto la glicina no enantiomórfica, son
L-aminoácidos a menos que se especifique otra cosa.
Un aminoácido puede ser nombrado usando la designación de una letra
o de tres letras, como se indica en la Tabla II siguiente.
"X" significa uno cualquiera de los veinte
aminoácidos listados en la Tabla II.
Las secuencias de péptidos o polipéptidos se
escriben y se numeran desde la metionina de iniciación, que se
numera "1", hasta el aminoácido
carboxi-terminal.
Una sustitución en una posición de un
polipéptido se indica con [designación para el aminoácido
original]_{(número \ de \ posición)}[designación para el aminoácido sustituyente]. Por ejemplo, la sustitución de una alanina en posición 100 de un polipéptido con un ácido glutámico sería indicada por Ala_{100}Glu o A_{100}E. Típicamente, la sustitución será precedida por una designación para el polipéptido en el que ocurre la sustitución. Por ejemplo, si la sustitución A_{100}E ocurre en una proteína hipotética designada "Luck", la sustitución sería indicada como Luck-Ala_{100}Glu o Luck-A_{100}E. Si hay más de una sustitución en un polipéptido, las indicaciones de las sustituciones se separan por barras (/). Por ejemplo, si la hipotética proteína "Luck" tiene una sustitución de ácido glutámico en vez de alanina en la posición 100 y una sustitución de asparagina en vez de lisina en la posición 150, el polipéptido con las sustituciones se indicaría como Luck-Ala_{100}Glu/Lys_{150}Asn o Luck-A_{100}E/K_{150}N. Para indicar diferentes sustituciones en una posición en un polipéptido, las designaciones para los aminoácidos sustituyentes se separan por comas. Por ejemplo, si la "Luck" hipotética tiene sustituciones de ácido glutámico, glicina o lisina en vez de alanina en la posición 100, la designación sería Luck-Ala_{100}/Glu, Gly, Lys o Luck-A_{100}/E, G, K.
original]_{(número \ de \ posición)}[designación para el aminoácido sustituyente]. Por ejemplo, la sustitución de una alanina en posición 100 de un polipéptido con un ácido glutámico sería indicada por Ala_{100}Glu o A_{100}E. Típicamente, la sustitución será precedida por una designación para el polipéptido en el que ocurre la sustitución. Por ejemplo, si la sustitución A_{100}E ocurre en una proteína hipotética designada "Luck", la sustitución sería indicada como Luck-Ala_{100}Glu o Luck-A_{100}E. Si hay más de una sustitución en un polipéptido, las indicaciones de las sustituciones se separan por barras (/). Por ejemplo, si la hipotética proteína "Luck" tiene una sustitución de ácido glutámico en vez de alanina en la posición 100 y una sustitución de asparagina en vez de lisina en la posición 150, el polipéptido con las sustituciones se indicaría como Luck-Ala_{100}Glu/Lys_{150}Asn o Luck-A_{100}E/K_{150}N. Para indicar diferentes sustituciones en una posición en un polipéptido, las designaciones para los aminoácidos sustituyentes se separan por comas. Por ejemplo, si la "Luck" hipotética tiene sustituciones de ácido glutámico, glicina o lisina en vez de alanina en la posición 100, la designación sería Luck-Ala_{100}/Glu, Gly, Lys o Luck-A_{100}/E, G, K.
Los códigos estándar de una letra "A",
"C", "G" y "T", se usan en el presente texto para los
nucleótidos adenilato, citidilato, guanilato y timidilato,
respectivamente. El experto en la técnica entenderá que, en los
DNAs, los nucleótidos son
2'-desoxirribonucleótido-5'fosfatos
(o, en el extremo 5', trifosfatos) mientras que en los RNAs los
nucleótidos son
ribonucleótido-5'-fosfatos (o, en el
extremo 5', trifosfatos) y aparece uridilato (U) en vez de T.
"N" significa uno cualquiera de los cuatro nucleótidos.
Las secuencias de oligonucleótidos o
polinucleótidos se escriben del extremo 5' al extremo 3'.
La expresión "luciferasa mutante" se usa en
el presente texto para referirse a una luciferasa que no es de
origen natural y tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de
la secuencia de las luciferasas que se presentan en la
naturaleza.
En uno de sus aspectos, la presente invención es
una luciferasa mutante de escarabajo que produce bioluminiscencia
(esto es, que cataliza la oxidación de luciferina para producir
bioluminiscencia) que tiene un desplazamiento en la longitud de onda
de intensidad de pico de al menos 1 nm de la longitud de onda de
intensidad de pico de la bioluminiscencia producida por la
correspondiente luciferasa de tipo silvestre, y tiene una secuencia
de aminoácidos que difiere de la secuencia de la correspondiente
luciferasa de tipo silvestre por una sustitución en una posición o
sustituciones en dos posiciones; siempre y cuando, si hay una
sustitución en una posición, la posición corresponda a una posición
en la secuencia de aminoácidos de LucPplGR elegida entre el
grupo consistente en la posición 232, 236, 237, 242, 244, 245, 248 y
348; siempre y cuando además que, si hay sustituciones en dos
posiciones, al menos una de las posiciones corresponda a una
posición en la secuencia de aminoácidos de LucPplGR elegida
entre el grupo consistente en la posición 232, 236, 237, 242, 244,
245, 248 y 348; y siempre y cuando el mutante tenga opcionalmente
una secuencia que evite el direccionamiento al peroxisoma en su
término carboxi.
Luciferasas mutantes ejemplares de la presente
invención son las del grupo que consiste en
LucPplGR-V_{232}E,
-V_{236}H, -V_{236}W, -Y_{237}S, -Y_{237}C, -H_{242}A, -F_{244}L, -G_{245}S, -G_{245}E, -I_{248}R, -I_{248}V, -I_{248}F, -I_{248}T, -I_{248}S, -I_{248}N, -H_{348}N, -H_{348}Q, -H_{348}E, -H_{348}C, -s_{247}F/I_{248}C y -s_{247}F/I_{248}T.
-V_{236}H, -V_{236}W, -Y_{237}S, -Y_{237}C, -H_{242}A, -F_{244}L, -G_{245}S, -G_{245}E, -I_{248}R, -I_{248}V, -I_{248}F, -I_{248}T, -I_{248}S, -I_{248}N, -H_{348}N, -H_{348}Q, -H_{348}E, -H_{348}C, -s_{247}F/I_{248}C y -s_{247}F/I_{248}T.
La Tabla III que sigue muestra propiedades
espectrales de estas y otras luciferasas mutantes del escarabajo
elatérido.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
"Posiciones correspondientes" en
luciferasas distintas de LucPplGR pueden ser determinadas
bien sea por alineaciones al nivel de aminoácidos que son ya
conocidas en la técnica (véanse, p. ej., Wood et al., Science
244, 700-702 (1989); Devine et al.,
Biochem. et Biophys. Acta 1173, 121-132
(1993)) o simplemente alineando al nivel de aminoácidos para
maximizar la alineación de restos idénticos o sustituidos
conservadoramente, y teniendo en cuenta en particular que los
aminoácidos 195-205 de la secuencia de
LucPplGR están muy altamente conservados en todas las
luciferasas de escarabajo y que no hay huecos durante más de 300
posiciones después de ese 11-mero altamente
conservado en cualquier secuencia de aminoácidos de la luciferasa de
escarabajo.
Una "secuencia que evita el direccionamiento
al peroxisoma en su término carboxi" significa que (1) los tres
aminoácidos carboxi-terminales de la correspondiente
luciferasa de tipo silvestre están enteramente perdidos del mutante;
o (2) los tres aminoácidos carboxi-terminales de la
correspondiente luciferasa de tipo silvestre están reemplazados con
un secuencia de uno, dos o tres aminoácidos que, de acuerdo con
Sommer et al., supra, reducirán el direccionamiento al
peroxisoma en al menos un 50%. Si los tres aminoácidos
carboxi-terminales de la luciferasa de tipo
silvestre son reemplazados por una secuencia en el mutante de tres
aminoácidos que evita el direccionamiento al peroxisoma, y si la
secuencia en el mutante es X_{1}X_{2}X_{3}, en donde X_{3}
es carboxi-terminal, X_{1} es cualquiera de los
veinte aminoácidos excepto A, C, G, H, P, N, Q, T y S, X_{2} es
cualquiera de los veinte aminoácidos excepto H, M, N, Q, R, S y K, y
X_{3} es cualquiera de los veinte aminoácidos excepto I, M, Y y L.
Además, uno cualquiera de dos, o los tres, de X_{1}, X_{2} y
X_{3} podría estar ausente del mutante (es decir, ningún
aminoácido correspondiente a la posición). La secuencia que evita el
direccionamiento al peroxisoma más preferida es IAV, en la que V
está en el término carboxi.
En otro de sus aspectos, la invención conlleva
una combinación de luciferasas, en una célula (eucariota o
procariota), una solución (libre o enlazada como informador a un
anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo, una sonda de ácido
nucleico, o similares), o adherida a una superficie sólida,
opcionalmente a través de un anticuerpo, un fragmento de un
anticuerpo o un ácido nucleico, y expuesta a una solución, con la
condición de que al menos una de las luciferasas es un mutante,
ambas luciferasas se mantienen activas en la producción de
bioluminiscencia, y las longitudes de onda de intensidades de pico
de la bioluminiscencia de las luciferasas difieren a causa de que
las secuencias de aminoácidos de las luciferasas difieren en al
menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 232,
236, 237, 242, 244, 245, 248 y 348 en la secuencia de aminoácidos de
LucPplGR, siempre y cuando una o las dos luciferasas tenga
opcionalmente secuencias que evitan el direccionamiento al
peroxisoma.
En otro de sus aspectos, la invención conlleva
una molécula de DNA, que puede ser un vector de expresión
eucariótico o procariótico, que comprende un segmento que tiene una
secuencia que codifica una luciferasa mutante de escarabajo de la
presente invención.
Los más preferidos entre los DNAs de la presente
invención son aquellos con segmentos que codifican una luciferasa
mutante preferida de la invención.
(1) INFORMACION GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Promega Corporation
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCION: Luciferasas mutantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCION PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Foley and Lardner
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: P. O. Box 1497
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Madison
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Wisconsin
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: 53701-1497
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NUMERO DE SOLICITUD: US 08/177.081
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACION: 3 de enero de 1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACION DE ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Scanlon, William J.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NUMERO DE REGISTRO: 30136
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 19017/148P
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACION PARA COMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELEFONO: (608) 258-4284
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (608) 258-4258
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID No: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1632 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID No: 1:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACION GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: PROMEGA CORPORATION
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2800, WORDS HOLLOW ROAD
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: MADISON
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: WISCONSIN
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL (CP): WI 53701-1497
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCION: LUCIFERASAS MUTANTES
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco blando
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº1, versión nº 1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- NUMERO DE SOLICITUD: EP 95910074.4
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID No: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1632 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID No: 1:
Claims (18)
1. Una luciferasa mutante del escarabajo
elatérido que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la
de la luciferasa del elatérido de tipo silvestre LucPplGR de
SEQ ID No: 1, en la que la luciferasa mutante del escarabajo
elatérido comprende una sustitución de aminoácido en una posición
que corresponde a una posición en la secuencia de aminoácidos de
LucPplGR de SEQ ID No: 1 elegida entre el grupo consistente
en las posiciones 232, 236, 237, 242, 244, 245, 248 y 348; y en la
que la sustitución de aminoácido está asociada con la luciferasa
mutante del escarabajo elatérido que produce luminiscencia que tiene
un desplazamiento en la longitud de onda de intensidad de pico de al
menos 1 nanómetro en relación con la luminiscencia producida por una
luciferasa de escarabajo elatérido correspondiente de tipo
silvestre.
2. La luciferasa mutante del escarabajo
elatérido según la reivindicación 1ª, en la que la posición de la
sustitución de aminoácido corresponde a la posición 232 de
LucPplGR de SEQ ID No: 1.
3. La luciferasa mutante del escarabajo
elatérido según la reivindicación 1ª, en la que el aminoácido
sustituido en la posición 232, que está asociado con la luciferasa
mutante del escarabajo elatérido que produce luminiscencia que tiene
un desplazamiento en la longitud de onda de intensidad de pico de al
menos 1 nanómetro, es E.
4. La luciferasa mutante del escarabajo
elatérido según la reivindicación 1ª, en la que la posición de la
sustitución de aminoácido corresponde a la posición 236 de
LucPplGR de SEQ ID No: 1.
5. La luciferasa mutante del escarabajo
elatérido según la reivindicación 1ª, en la que el aminoácido
sustituido en la posición 236 que está asociado con la luciferasa
mutante del escarabajo elatérido que produce luminiscencia que tiene
un desplazamiento en la longitud de onda de intensidad de pico de al
menos 1 nanómetro, es H o W.
6. La luciferasa mutante del escarabajo
elatérido según la reivindicación 1ª, en la que la posición de la
sustitución de aminoácido corresponde a la posición 237 de
LucPplGR de SEQ ID No: 1.
7. La luciferasa mutante del escarabajo
elatérido según la reivindicación 1ª, en la que el aminoácido
sustituido en la posición 237, que está asociado con la luciferasa
mutante del escarabajo elatérido que produce luminiscencia que tiene
un desplazamiento en la longitud de onda de intensidad de pico de al
menos 1 nanómetro, es S o C.
8. La luciferasa mutante del escarabajo
elatérido según la reivindicación 1ª, en la que la posición de la
sustitución de aminoácido corresponde a la posición 242 de
LucPplGR de SEQ ID No: 1.
9. La luciferasa mutante del escarabajo
elatérido según la reivindicación 1ª, en la que el aminoácido
sustituido en la posición 242 que está asociado con la luciferasa
mutante del escarabajo elatérido que produce luminiscencia que tiene
un desplazamiento en la longitud de onda de intensidad de pico de al
menos 1 nanómetro, es A o S.
10. La luciferasa mutante del escarabajo
elatérido según la reivindicación 1ª, en la que la posición de la
sustitución de aminoácido corresponde a la posición 244 de
LucPplGR de SEQ ID No: 1.
11. La luciferasa mutante del escarabajo
elatérido según la reivindicación 1ª, en la que el aminoácido
sustituido en la posición 244 que está asociado con la luciferasa
mutante del escarabajo elatérido que produce luminiscencia que tiene
un desplazamiento en la longitud de onda de intensidad de pico de al
menos 1 nanómetro, es L.
12. La luciferasa mutante del escarabajo
elatérido según la reivindicación 1ª, en la que la posición de la
sustitución de aminoácido corresponde a la posición 245 de
LucPplGR de SEQ ID No: 1.
13. La luciferasa mutante del escarabajo
elatérido según la reivindicación 1ª, en la que el aminoácido
sustituido en la posición 245 que está asociado con la luciferasa
mutante del escarabajo elatérido que produce luminiscencia que tiene
un desplazamiento en la longitud de onda de intensidad de pico de al
menos 1 nanómetro, es S o E.
14. La luciferasa mutante del escarabajo
elatérido según la reivindicación 1ª, en la que la posición de la
sustitución de aminoácido corresponde a la posición 248 de
LucPplGR de SEQ ID No: 1.
15. La luciferasa mutante del escarabajo
elatérido según la reivindicación 1ª, en la que el aminoácido
sustituido en la posición 248 que está asociado con la luciferasa
mutante del escarabajo elatérido que produce luminiscencia que tiene
un desplazamiento en la longitud de onda de intensidad de pico de al
menos 1 nanómetro, es R, V, F, T, S o N.
16. La luciferasa mutante del escarabajo
elatérido según la reivindicación 1ª, en la que la posición de la
sustitución de aminoácido corresponde a la posición 348 de
LucPplGR de SEQ ID No: 1.
17. La luciferasa mutante del escarabajo
elatérido según la reivindicación 1ª, en la que el aminoácido
sustituido en la posición 348 que está asociado con la luciferasa
mutante del escarabajo elatérido que produce luminiscencia que tiene
un desplazamiento en la longitud de onda de intensidad de pico de al
menos 1 nanómetro, es N, Q, A o C.
18. Una molécula de DNA aislada que comprende un
segmento que tiene una secuencia que codifica la luciferasa mutante
del escarabajo elatérido según una cualquiera de las
reivindicaciones 1ª a 17ª.
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