ES2299022T3 - Profarmacos de piperazina y agentes antivirales de piperidina sustituida. - Google Patents

Profarmacos de piperazina y agentes antivirales de piperidina sustituida. Download PDF

Info

Publication number
ES2299022T3
ES2299022T3 ES05724510T ES05724510T ES2299022T3 ES 2299022 T3 ES2299022 T3 ES 2299022T3 ES 05724510 T ES05724510 T ES 05724510T ES 05724510 T ES05724510 T ES 05724510T ES 2299022 T3 ES2299022 T3 ES 2299022T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
quad
compound
group
baselineskip
methyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES05724510T
Other languages
English (en)
Inventor
Yasutsugu Ueda
Timothy P. Connolly
John F. Kadow
Nicholas A. Meanwell
Tao Wang
Chung-Pin H. Chen
Kap-Sun Yeung
Zhongxing Zhang
David Kenneth Leahy
Shawn K. Pack
Nachimuthu Soundararajan
Pierre Sirard
Kathia Levesque
Dominique Thoraval
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bristol Myers Squibb Co
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34963934&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2299022(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Application granted granted Critical
Publication of ES2299022T3 publication Critical patent/ES2299022T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A61K31/497—Non-condensed pyrazines containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C215/00—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C215/02—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C215/04—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being saturated
    • C07C215/06—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being saturated and acyclic
    • C07C215/10—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being saturated and acyclic with one amino group and at least two hydroxy groups bound to the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/062—Organo-phosphoranes without P-C bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/572—Five-membered rings
    • C07F9/5728—Five-membered rings condensed with carbocyclic rings or carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/655—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms
    • C07F9/65515—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a five-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
    • C07F9/65586—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system at least one of the hetero rings does not contain nitrogen as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Hydrogenated Pyridines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

Un compuesto de Fórmula I, en la que: X es C o N con la condición de que cuando X es N, R1 no exista; W es C o N con la condición de que cuando W es N, R2 no exista; V es C; R1 es hidrógeno, metoxi o halógeno; R2 es hidrógeno; R3 es metoxi o heteroarilo, pudiendo estar cada uno de ellos independiente y opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado entre G; donde el heteroarilo es triazolilo, pirazolilo u oxadiazolilo; E es hidrógeno o una mono o bis sal farmacéuticamente aceptable del mismo; Y se selecciona entre el grupo compuesto por cada uno de R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16 y R17 es independientemente H o metilo, con la condición de que no más de dos de R10-R17 sean metilo; R18 se selecciona entre el grupo compuesto por C(O)-fenilo, C(O)-piridinilo, piridinilo, pirimidinilo, quinolinilo, iso-quinolinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, ftalazinilo, azabenzofurilo y azaindolilo, pudiendo estar cada uno de ellos independiente y opcionalmente sustituido con uno a dos miembros seleccionados entre el grupo compuesto por metilo, -amino, -NHMe, -NMe2, metoxi, hidroximetilo y halógeno; D se selecciona entre el grupo compuesto por ciano, S(O)2R24, halógeno, C(O)NR21R22, fenilo y heteroarilo; donde dicho fenilo o heteroarilo está independiente y opcionalmente sustituido con uno a tres halógenos iguales o diferentes o de uno a tres sustituyentes iguales o diferentes seleccionados entre G; donde el heteroarilo se selecciona entre el grupo compuesto por piridinilo y oxadiazolilo; A se selecciona entre el grupo compuesto por fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo, donde dichos fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo están independiente y opcionalmente sustituidos con uno a tres halógenos iguales o diferentes o de uno a tres sustituyentes iguales o diferentes seleccionados entre G; G se selecciona entre el grupo compuesto por alquilo (C1-6), alquenilo (C1-6), fenilo, hidroxi, metoxi, halógeno, -NR23C (O)-alquilo (C1-6), -NR24R25, -S(O)2NR24R25, COOR26 y -CONR24R25; donde dicho alquilo (C1-6) está opcionalmente sustituido con hidroxi, dimetilamino o de uno a tres halógenos iguales o diferentes; R26 se selecciona entre el grupo compuesto por hidrógeno y alquilo (C1-6); R20, R21 R22, R23, R24 y R25 se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por hidrógeno, alquilo (C1-6) y -(CH2)nNR27R28; n es 0-6; y cada uno de R27 y R28 es independientemente H o metilo.

Description

Profármacos de piperazina y agentes antivirales de piperidina sustituida.
Referencia cruzada con las solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica las ventajas de las Solicitudes Provisionales de Estados Unidos con Números de Serie 60/635.231 presentada el 10 de diciembre de 2004 y 60/553.320 presentada el 15 de marzo de 2004.
Campo de la invención
Esta invención proporciona compuestos que tienen propiedades terapéuticas y bioactivas, sus composiciones farmacéuticas y procedimiento de uso. En particular, la invención se refiere a nuevos derivados de profármacos con actividad antiviral. Más particularmente, la presente invención se refiere a compuestos útiles para el tratamiento de VIH y SIDA.
Técnica antecedente
La infección por VIH-1 (virus de inmunodeficiencia humana -1) sigue siendo un problema médico de primer orden, con una estimación de 42 millones de personas infectadas en el mundo a finales del 2002. El número de casos de VIH y SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) ha crecido rápidamente. En el 2002, se informó de \sim5,0 millones de nuevas infecciones y 3,1 millones de personas murieron de SIDA. Los fármacos disponibles actualmente para el tratamiento de VIH incluyen diez inhibidores nucleósidos de transcriptasa inversa (RT) o combinaciones de píldora única aprobadas (zidovudina o AZT (o Retrovir®), didanosina (o Videx®), estavudina (o Zerit®), lamivudina (o 3TC o Epivir®), zalcitabina (o DDC o Hivid®), succinato de abacavir (o Ziagen®), sal fumarato de disoproxilo de Tenofovir (o Viread®), Combivir® (contiene -3TC más AZT), Trizivir® (contiene abacavir, lamivudina y zidovudina) y Emtriva® (emtricitabina); tres inhibidores de transcriptasa inversa no nucleósidos: nevirapina (o Viramune®), delavirdina (o Rescriptor®) y efavirenz (o Sustiva®), nueve inhibidores de proteasa peptidomiméticos o formulaciones aprobadas: saquinavir, indinavir, ritonavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir, Kaletra® (lopinavir y Ritonavir), Atazanavir (Reyataz®), Fosam-prenavir® y un inhibidor de fusión que se dirige a la gp41 viral, T-20 (FUZEON®). Cada uno de estos fármacos solamente puede impedir de forma transitoria la replicación viral si se usa en solitario. Sin embargo, cuando se usan en combinación, estos fármacos tienen un efecto profundo sobre la viremia y el desarrollo de la enfermedad. De hecho, recientemente se han documentado reducciones significativas de la tasa de mortalidad en pacientes con SIDA como consecuencia de la aplicación ampliamente extendida de terapia de combinación. Sin embargo, a pesar de estos impresionantes resultados, del 30 al 50% de los pacientes finalmente suspenden las terapias de combinación de fármacos. La insuficiente potencia del fármaco, no conformidad, penetración en tejidos restringida y limitaciones específicas del fármaco en ciertos tipos celulares (por ejemplo, la mayoría de los análogos de nucleósidos no pueden fosforilarse en células en reposo) pueden justificar la incompleta supresión de virus sensibles. Además, el alto índice de replicación y la rápida renovación de VIH-1 combinadas con la frecuente incorporación de mutaciones, conduce a la aparición de variantes resistentes a fármacos y fallos de tratamientos cuando están presentes concentraciones de fármaco por debajo de la óptima (Larder y Kemp; Gulick; Kuritzkes; Morris-Jones y col; Schinazi y col; Vacca y Condra; Flexner; Berkhout y Ren y col; (Ref. 6-14)). Por lo tanto, se necesitan nuevos agentes anti-VIH que muestren patrones de resistencia diferentes y farmacocinética favorable así como perfiles de seguridad para proporcionar más opciones de tratamiento.
Los fármacos contra VIH-1 comercializados actualmente están dominados por inhibidores nucleósidos de transcriptasa inversa o inhibidores de proteasa peptidomiméticos. Los inhibidores de transcriptasa inversa no nucleósidos (NNRTI) han adquirido recientemente un papel cada vez más importante en la terapia de infecciones por VIH (Pedersen & Pedersen, Ref 15). En la bibliografía se han descrito al menos 30 clases diferentes de NNRTI (De Clercq, Ref. 16) y se han evaluado varios NNRTI en ensayos clínicos. Los derivados de dipiridodiazepinona (nevirapina), benzoxazinona (efavirenz) y bis(heteroaril) piperazina (delavirdina) han sido aprobados para uso clínico. Sin embargo, el principal inconveniente para el desarrollo y aplicación de los NNRTI es la propensión a la rápida aparición de cepas resistentes a los fármacos, tanto en cultivo de células del tejido como en individuos tratados, particularmente los sometidos a monoterapia. Como consecuencia existe un interés considerable en la identificación de NNRTI menos propensos al desarrollo de resistencia (Pedersen & Pedersen, Ref 15). Se ha presentado una reciente visión de conjunto de inhibidores de transcriptasa inversa no nucleósidos: "Perspectives on novel therapeutic compounds and strategies for the treatment of HIV infection" (Buckheit, referencia 99). Se ha presentado una revisión que abarca NRTI y NNRTI (De Clercq, referencia 100). Se ha publicado una visión de conjunto del estado actual de los fármacos contra VIH (De Clercq, referencia 101).
Varios derivados de indol incluyendo indolo-3-sulfonas, piperazino indoles, pirazino indoles y derivados de 5H-indolo[3,2-b][1,5]benzotiazepina se han presentado como inhibidores de transcriptasa inversa de VIH-1 (Greenlee y col, Ref. 1; Williams y col, Ref. 2; Romero y col, Ref. 3; Font y col, Ref. 17; Romero y col, Ref. 18; Young y col, Ref. 19; Genin y col, Ref. 20; Silvestri y col, Ref. 21). También se han descrito indolo 2-carboxamidas como inhibidores de la adhesión celular y de la infección por VIH, (Boschelli y col, US 5.424.329, Ref. 4). Los productos naturales de indol 3-sustituido (Semicochliodinol A y B, di-demetilasteriquinona e isocochliodinol) se describieron como inhibidores de la proteasa de VIH-1 (Fredenhagen y col, Ref. 22).
Previamente se han descrito derivados de aza-indol amida relacionados estructuralmente (Kato y col, Ref. 23(a); Le-vacher y col, Ref. 23(b); Dompe Spa, WO-09504742, Ref. 5(a); SmithKline Beecham PLC, WO-09611929, Ref. 5(b); Schering Corp., US-05023265, Ref. 5(c)). Sin embargo, estas estructuras difieren de las reivindicadas en este documento en que son monoaza-indol mono-amida en lugar de derivados de oxoacetamida y no existe mención del uso de estos compuestos para tratar infecciones víricas, particularmente por VIH.
Se necesitan nuevos fármacos para el tratamiento de VIH, para el tratamiento de pacientes que se volvieron resistentes a los fármacos aprobados actualmente descritos anteriormente que se dirigen a transcriptasa inversa o a la proteasa. Un procedimiento para obtener estos fármacos es encontrar moléculas que inhiban nuevas y diferentes dianas del virus. Una clase general de inhibidores que se están estudiando activamente son los inhibidores de la entrada del VIH. Esta clasificación general incluye fármacos dirigidos a varias dianas que incluyen inhibidores del receptor de quimioquina (CCR5 o CXCR4), inhibidores de la fusión dirigidos contra la gp41 viral, e inhibidores que evitan la unión de la envuelta viral, gp120, a su diana celular humana CD4. Recientemente se han presentado varias revisiones sobre inhibidores de la entrada del virus y algunas referencias seleccionadas son:
Chemokine receptor antagonists as HIV entry inhibitors. Expert Opinion on Therapeutic Patents (2004), 14(2), 251-255.
Inhibitors of the entry of HIV into host cells. Meanwell, Nicholas A.; Kadow, John F. Current Opinion in Drug Discovery & Development (2003), 6(4), 451-461.
Virus entry as a target for anti-HIV intervention. Este, Jose A. Retrovirology Laboratory irsiCaixa, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol, Universitat Autonoma de Barcelona, Badalona, Spain. Current Medicinal Chemistry (2003), 10(17), 1617-1632.
New antiretroviral agents. Rachline, A.; Joly, V. Service de Maladies Infectieuses et Tropicales A, Hopital Bichat-Claude Bernard, Paris, Fr. Antibiotiques (2003), 5(2), 77-82.
New antiretroviral drugs. Gulick, R.M. Cornell HIV Clinical Trials Unit, Division of Internacional Medicine and Infectious Diseases, Weill Medical College of Cornell University, New York, NY, USA. Clinical Microbiology and Infection (2003), 9(3), 186-193.
Sensitivity of HIV-1 to entry inhibitors correlates with envelope/coreceptor affinity, receptor density, and fusion kinetics. Reeves, Jacqueline D.; Gallo, Stephen A.; Ahmad, Navid; Miamidian, John L.; Harvey, Phoebe E.; Sharron, Matthew; Pohlmann, Stefan; Sfakianos, Jeffrey N.; Derdeyn, Cynthia A.; Blumenthal, Robert; Hunter, Eric; Doms, Robert W. Department of Microbiology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2002), 99(25), 16249-16254, CODEN: PNASA6 ISSN: 0027-8424.
Opportunities and challenges in targeting HIV entry. Biscone, Mark J.; Pierson, Theodore C.; Doms, Robert W. Department of Microbiology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA. Current Opinion in Pharmacology (2002), 2(5), 529-533.
HIV entry inhibitors in clinical development. O'Hara, Bryan M.; Olson, William C. Progenics Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY, USA. Current Opinion in Pharmacology (2002), 2(5), 523-528.
Resistance mutation in HIV entry inhibitors. Hanna, Sheri L.; Yang, Chunfu; Owen, Sherry M.; Lal, Renu B. HIV Immunology and Diagnostics Branch, Division of AIDS, STD, Atlanta, GA, USA. AIDS (London, United Kingdom) (2002), 16(12), 1603-1608.
HIV entry: are all receptors created equal? Goldsmith, Mark A.; Doms, Robert W. Genencor International, Inc., Palo Alto, CA, USA. Nature Immunology (2002), 3(8), 709-710, CODEN: NIAMCZ ISSN: 1529-2908.
Peptide and non-peptide HIV fusion inhibitors. Jiang, Shibo; Zhao, Qian; Debnath, Asim K. The New York Blood Center, Lindsley F. Kimball Research Institute, New York, NY, USA. Current Pharmaceutical Design (2002), 8(8), 563-580.
\vskip1.000000\baselineskip
Existen dos enfoques generales para evitar la unión inicial de la membrana viral, gp120, al CD4 celular que son a) inhibidores que se unen al CD4 humano y bloquean la unión de la envuelta viral (gp120) y b) inhibidores que se unen a la gp 120 viral y evitan la unión del CD4 celular. El segundo procedimiento tiene la ventaja de inhibir una diana viral y, si es selectivo, minimiza las posibilidades de perturbación de la fisiología humana normal o de causar efectos secundarios. Con este enfoque, para superar un espectro de sensibilidad al fármaco causado por la variabilidad de las secuencias de la envuelta viral y para suprimir el desarrollo de resistencia, es importante conseguir niveles en plasma del fármaco que sean la mayor cantidad posible de múltiplos de la CE50 o de otra medida de la concentración de fármaco necesaria para matar al virus. Como se describe a continuación, estos inhibidores parecen seguros para ser ampliamente utilizados en el ser humano, por lo tanto, deben ser capaces de alcanzar niveles de exposición suficientes como para permitir la supresión del virus. Cuanto mayor sea el múltiplo de los niveles de fármaco sobre el nivel necesario para inhibir el crecimiento viral, más eficaz y completa es la supresión de la replicación viral y menor la posibilidad de mutación viral y el posterior desarrollo de resistencia al tratamiento. Por lo tanto, los aspectos importantes que contribuyen a la eficacia de los inhibidores de la unión viral incluyen no solamente la potencia y la seguridad intrínsecas, sino también la farmacocinética y propiedades farmacéuticas que permiten la consecución de una alta exposición en plasma a una dosis físicamente viable y un programa de administración aceptable, preferiblemente conveniente. Esta invención describe un enfoque de profármaco que potencia enormemente la exposición máxima y la capacidad de aumentar los múltiplos de exposición (es decir, múltiplos de exposición al fármaco mayores de CE_{50} o CE_{90}) después del aumento de la dosis de miembros eficaces de una clase de inhibidores de la unión a VIH descrita anteriormente.
Una serie de publicaciones y descripciones recientes caracterizan y describen un compuesto etiquetado como BMS-806, un miembro inicial de una clase de inhibidores de la entrada del virus que se dirigen a la gp-120 viral y evitan la unión del virus al CD4 hospedador. Un inhibidor de VIH-1 de molécula pequeña que se dirige a la envuelta del VIH-1 e inhibe la unión al receptor CD4. Lin, Pin-Fang; Blair, Wade; Wang, Tao; Spicer, Timothy; Guo, Qi; Zhou, Nannan; Gong, Yi-Fei; Wang, H. -G. Heidi; Rose, Ronald; Yamanaka, Gregory; Robinson, Brett; Li, Chang-Ben; Fridell, Robert; Deminie, Carol; Demers, Gwendeline; Yang, Zheng; Zadjura, Lisa; Meanwell, Nicholas; Colonno, Richard. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2003), 100(19), 11013-11018.
La caracterización bioquímica y genética de un nuevo inhibidor del virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1, que bloquea las interacciones gp120-CD4. Guo, Qi; Ho, Hsu-Tso; Dicker, Ira; Fan, Li; Zhou, Nannan; Friborg, Jacques; Wang, Tao; McAuliffe, Brian V.; Wang, Hwei-gene Heidi; Rose, Ronald E.; Fang, Hua; Scarnati, Helen T.; Langley, David R.; Meanwell, Nicholas A.; Abraham, Ralph; Colonno, Richard J.; Lin, Pin-fang. Journal of Virology (2003), 77(19), 10528-10536, Method using small heterocyclic compounds fon treating HIV infection by preventing interaction of CD4 and gp120, Ho, Hsu-Tso; Dalterio, Richard A.; Guo, Qi; Lin, Pin-Fang. Solicitud Internacional PCT (2003), WO 2003072028A2, Discovery of 4-benzoyl-1-[(4-methoxy-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-3-il)oxoacetyl]-2-(R)-methylpiperazine (BMS-3 78806): A Novel HIV-1 Attachment Inhibitor That Interferes with CD4-gp120 Interactions. Wang, Tao; Zhang, Zhongxing; Wallace, Owen B.; Deshpande, Milind; Fang, Haiquan; Yang, Zheng; Zadjura, Lisa M.; Tweedie, Donald L.; Huang, Stella; Zhao, Fang; Ranadive, Sunanda; Robinson, Brett S.; Gong, Yi-Fei; Ricarrdi, Keith; Spicer, Timothy P.; Deminie, Carol; Rose, Ronald; Wang, Hwei-Gene Heidi; Blair, Wade S.; Shi, Pei-Yong; Lin, Pin-fang; Colonno, Richard J.; Meanwell, Nicholas A. Journal of Medicinal Chemistry (2003), 46(20), 4236-4239.
1
Indol, azaindol y otros derivados que contienen oxo amida de esta clase se han descrito en varias PCT diferentes y Solicitudes de Patente de EE.UU. expedidas (Referencias 93-95, 106, 108, 109, 110, 111 y 112) y estas referencias se refiere directamente a los compuestos en esta Solicitud de Patente. Ninguno de los compuestos en estas referencias de la técnica anterior contiene un grupo dihidrogenofosfato de metilo (o sal o mono o di éster del grupo fosfato) unido al nitrógeno N-1 y por lo tanto los compuestos de la presente invención representan nuevas composiciones de interés. Este resto aumenta drásticamente la utilidad de los compuestos parentales al funcionar como una modificación del profármaco que aumenta drásticamente la exposición sistémica máxima de las moléculas parentales en modelos preclínicos de exposición humana. Creemos que nada en las referencias de técnica anterior puede interpretarse como que describe o sugiere los nuevos compuestos de esta invención y su uso para inhibir infección por VIH.
Esta invención describe profármacos de indol y azaindol cetopiperazina amidas específicas que son extremadamente eficaces para mejorar la utilidad oral de las moléculas parentales como agentes antivirales particularmente como fármacos anti VIH. Las moléculas parentales son relativamente insolubles y padecen de absorción limitada por disolución o por solubilidad lo que significa que a medida que la dosis aumenta por encima de un nivel máximo, cada vez menos fármaco se disuelve a tiempo para ser absorbido en la circulación y en su lugar pasa a través del cuerpo para ser eliminado como desecho. Las mejoras ofrecidas por el profármaco son necesarias, ya que permiten aumentar de forma significativa los niveles de fármaco en el cuerpo, lo que proporciona una mayor eficacia frente al virus VIH y en particular frente a cepas menos sensibles o más resistentes. Los profármacos son especialmente importantes para esta clase de fármacos ya que los fármacos se dirigen a la envuelta del virus VIH, una diana que varía entre cepa y cepa y por lo tanto para la que se desean múltiplos de exposición máximos. Debido a que con un profármaco, más fármaco se absorberá y alcanzará la diana, podían reducirse el número de píldoras, el coste para el paciente y los intervalos de dosificación. La identificación de profármacos con estas propiedades es difícil y no es sencillo ni existe una vía clara para realizar con éxito el diseño de profármacos descrito en la bibliografía. No existe una enseñanza clara de la técnica anterior sobre que química de profármacos emplear ni sobre cual será la más eficaz. La siguiente descripción y datos demostrarán que los profármacos descritos en esta invención funcionan sorprendentemente bien. Liberan el fármaco parental extremadamente rápida y eficazmente y potencian la exposición a niveles que son superiores a los presentados para muchos profármacos.
El uso de estrategias o metodologías de profármacos para potenciar marcadamente las propiedades de un fármaco o para superar una deficiencia inherente en las propiedades farmacéuticas o farmacocinéticas de un fármaco puede usarse en ciertas circunstancias para potenciar marcadamente la utilidad de un fármaco. Los profármacos difieren de las formulaciones en que las modificaciones químicas conducen a una entidad química totalmente nueva que después de la administración al paciente, regenera la molécula parental dentro del cuerpo. Existen una miríada de estrategias de profármacos que proporcionan elecciones para modular las condiciones para la regeneración del fármaco parental, las propiedades físicas, farmacéuticas o farmacocinéticas del profármaco y la funcionalidad a la que puede unirse las modificaciones del profármaco. Sin embargo, ninguna de estas publicaciones enseña qué procedimiento usar para dar como resultado los profármacos inventados de este documento. Se han publicado varias revisiones sobre estrategias de profármacos y a continuación se proporciona una lista no exhaustiva:
Hydrolysis in Drug and prodrug Metabolism. Richard Testa y Joachim Mayer, 2003 Wiley-VCH publisher, ISBN 3-906390-25-x.
Design of Prodrugs, Bundgard, H. Editor, Elsevier, Amsterdam, 1985, Pharmacokinetics of drug targeting: specific implications for targeting via prodrugs. Stella, V. J.; Kearney, A. S. Dep. Pharm. Chem., Univ. Kansas Lawrence, KS, USA. Handbook of Experimental Pharmacology (1991), 100 (Targeted Drug Delivery), 71-103, CODEN: HEPHD2ISSN:0171-2004, Journal; General Review written in English. CAN116:158649 AN 1992:158649 CAPLUS (Copiright 2004 ACS on SciFinder (R)).
Prodrugs. Do they have advantages in clinical practice? Stella, V. J.; Charman, W. N. A.; Naringrekar, V. H. Dep. Pharm. Chem., Univ. Kansas Lawrence, KS, USA. Drugs (1985), 29(5), 455-73, CODEN: DRUGAY ISSN: 0012-6667, Journal; General Review written in English. CAN 103:115407 AN 1985:515407 CAPLUS (Copiright 2004 ACS on SciFinder (R)).
Trends en prodrug research. Stella, V. J.; Naringrekar, V. H.; Charman, W. N. A. Dep. Pharm. Chem., Univ. Kansas Lawrence, KS, USA. Pharmacy International (1984), 5(11), 276-9, CODEN: PHINDQ ISSN: 0167-3157, Journal; General Review written in English. CAN 102:72143 AN 1985:72143 CAPLUS (Copyright 2004 ACS on SciFinder(R)).
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque se sabe que algunas tecnologías tienen aplicaciones específicas, es decir mejoran la solubilidad o absorción por ejemplo, el desarrollo de profármacos sigue siendo, en gran medida, un ejercicio empírico. Por lo tanto normalmente deben estudiarse varias estrategias o modificaciones químicas y los compuestos resultantes evaluarse en modelos biológicos para determinar y calibrar el éxito de las estrategias de profármacos.
Una estrategia de profármacos exitosa requiere que se modifique un sitio químicamente reactivo en una molécula mediante la adición del resto de profármaco y que después en las condiciones deseadas en los pacientes el resto de profármaco se desenmascare y libere el fármaco parental. La molécula del profármaco debe tener una estabilidad adecuada en una forma de dosificación aceptable antes de la dosificación. Además, el mecanismo de liberación debe permitir que el profármaco regenere el fármaco parental eficazmente y con cinéticas que proporcionen niveles terapéuticos de fármaco parental en la diana de la enfermedad. En nuestras moléculas, el nitrógeno del indol o azaindol representa un punto de unión aceptable para un resto de profármaco.
La sugerencia de que un grupo fosfato unido mediante la química o el engarce apropiado puede potenciar la exposición oral de un fármaco parental es un concepto conocido en la técnica. Sin embargo, como se describirá a continuación, es imposible saber si el uso de un grupo fosfato para crear un profármaco funcionará con una sustancia de fármaco dada. El grupo fosfato altera temporalmente las propiedades físicas del fármaco y es, por lo tanto, un profármaco que aumenta la solubilidad acuosa de la molécula resultante, hasta que es escindido por una fosfatasa alcalina en el cuerpo u otra reacción química de un engarce unido racionalmente. Por ejemplo, en la siguiente referencia, los autores concluyen que los fosfatos pueden mejorar la eficacia oral. En esta referencia un derivado de fosfato de un grupo alcohol en un fármaco lipófilo poco soluble en agua mostró mejor biodisponibilidad oral que otros dos profármacos y pareció ofrecer una ventaja sobre la molécula parental que posee biodisponibilidad oral baja.
Evaluation of a targeted prodrug strategy to enhance oral absorption of poorly water-soluble compounds. Chan, O. Helen; Schmid, Heidi L.; Stilgenbauer, Linda A.; Howson, William; Horwell, David C.; Stewart, Barbra H. Pharmaceutical Research (1998), 15(7), 1012-1018.
Se han publicado dos artículos muy relevantes y recientes que describen las dificultades para identificar profármacos de fosfato con ventajas significativas sobre la molécula parental para uso oral.
Un artículo titulado "Absorption Rate Limit Considerations for Oral Phosphate Prodrugs" de Tycho Heimbach y col. en Pharmaceutical Research 2003, Vol 20, No. 6 páginas 848-856 afirma "La sorprendente incapacidad para usar profármacos de fosfato por vía oral dio lugar a un estudio en un sistema que se usaba para seleccionar candidatos a fármaco para absorción potencial." Este artículo también revisa las razones por las que muchos profármacos de fosfato eran inadecuados para uso oral y describe varios potenciales factores limitantes de la velocidad en el proceso de absorción del fármaco. El artículo también identifica las pocas aplicaciones exitosas. El artículo intenta identificar propiedades que pueden hacer a algunos fármacos adecuados para administración oral como profármacos de fosfato pero el mensaje es claro, esto sigue siendo una ciencia empírica. Esto se enfatiza mediante las conclusiones de un segundo artículo de los mismos autores titulado "Enzyme mediated precipitation of parent drugs from their phosphate prodrugs" de Tycho Heimbach y col. en International Journal of Pharmaceutics 2003, 261, 81-92. Los autores afirman en el Resumen que muchos profármacos de fosfato orales no han conseguido mejorar la velocidad o grado de absorción en comparación con sus fármacos parentales insolubles. La rápida generación de fármaco parental mediante fosfatasa alcalina intestinal puede dar como resultado soluciones supersaturadas, conduciendo a la precipitación del fármaco parental. Esto limitaría la utilidad de los fosfatos orales. Las conclusiones de este artículo afirman (entre comillas) "En resumen, la precipitación de fármacos parentales a partir de de profármacos de fosfato puede estar mediada por enzimas. La precipitación de algunos fármacos también puede observarse para algunos fármacos en el modelo Caco-2 model. Como los tiempos de inducción disminuyen y los tiempos de nucleación aumentan con altas proporciones de supersaturación, los fármacos parentales pueden precipitar cuando las concentraciones de los profármacos dirigidos son mucho mayores que la solubilidad del fármaco parental, es decir para fármacos parentales con proporciones de supersaturación altas. El grado en el que un fármaco parental precipita durante la conversión del profármaco depende de las velocidades de conversión de profármaco en fármaco, del efecto del profármaco sobre la precipitación del fármaco parental y de la solubilización del fármaco parental." Como puede observarse mediante las conclusiones del autor, el proceso es complejo y depende de muchos factores que son imposibles de predecir por adelantado tales como proporciones de supersaturación, velocidad de conversión de profármaco in vivo y capacidad del medio intestinal para solubilizar mezclas de compuesto parental y profármaco.
Las dos referencias de Heimbach describen es estatus clínico de profármacos de fosfato y describen los muchos fallos y los pocos ejemplos exitosos. Un ejemplo de un fallo clínico y un ejemplo de un éxito se proporcionan a continuación:
Etoposide® es un fármaco anti-cáncer que se administra mediante la vía iv u oral. Los profármacos de fosfato de Etoposide se usan clínicamente, pero estas estructuras difieren de los derivados de la presente solicitud ya que este profármaco contiene un fosfato formado mediante la unión directa a un resto de fenol del fármaco parental. Las principales razones para preparar un profármaco de fosfato del fármaco etoposide eran mejorar el uso intravenoso mediante la solubilidad aumentada y la reducción de excipientes. Aunque el profármaco de fosfato se evaluó por vía oral tanto preclínica como clínicamente sólo se usa clínicamente para administración iv.
Synthesis of etoposide phosphate, BMY-40481: a water-soluble clinically active prodrug of etoposide. Saulnier, Mark G.; Langley, David R.; Kadow, John F.; Senter, Peter D.; Knipe, Jay O.; Tun, Min Min; Vyas, Dolatrai M.; Doyle, Terrence W. Bristol-Myers Squibb Co., Wallingford, CT, USA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (1994), 4(21), 2567-72 y referencias en ese documento.
Como puede observarse a partir de las siguientes dos referencias, los beneficios del resto de fosfato para dosificación oral no estaban claros.
Randomized comparison of etoposide pharmacokinetics after oral etoposide phosphate and oral etoposide. De Jong, R. S.; Mulder, N. H.; Uges, D. R. A.; Kaul, S.; Winograd, B.; Sleijfer, D.Th.; Groen, H. J. M.; Willemse, P. H. B.; van der Graaf, W. T. A.; de Vries, E. G. E. Department of Medical Oncology, University Hospital Groningen, Groningen, Neth. British Journal of Cancer (1997), 75(11), 1660-1666, Este artículo comparaba el fármaco parental y el profármaco directamente y concluía que el fosfato de etoposide oral no ofrece un beneficio clínico relevante sobre el etoposide oral.
Etoposide bioavailability after oral administration of the prodrug etoposide phosphate in cancer patients during a phase I study. Chabot, G. G.; Armand, J.-P.; Terref, C.; De Forni, M.; Abigerges, D.; Winograd, B.; Igwemezie, L.; Schacter, L.; Kaul, S.; y col. Department Medicine, Gustave-Roussy Institute, Villejuif, Fr. Journal of Clinical Oncology (1996), 14 (7), 2020-2030.
Este artículo anterior descubría que, en comparación con los datos de la bibliografía, EP oral tenía un valor F un 19% más alto en comparación con E oral a dosis bajas o altas. Se concluyó que este F más elevado en E del profármaco oral EP parece ser una ventaja farmacológica que podía ser de importancia farmacocinética potencial para este fármaco. Sin embargo, el estudio mencionado anteriormente que obtenía conclusiones opuestas se realizó posteriormente y parece que los datos de comparación directa eran más válidos. Por lo tanto la adición de un grupo fosfato para mejorar la solubilidad no es una garantía de eficacia oral mejorada.
Se preparó un profármaco de fosfato del inhibidor de proteasa de VIH Amprenavir y es el ingrediente activo del que se ha convertido en un fármaco mejorado para uso oral. Esto es un ejemplo de un éxito poco común de este enfoque. El fosfato se une directamente a un resto hidroxi y sirve para potenciar la solubilidad. Fosamprenavir en solitario o junto con otro inhibidor de proteasa, ritonavir, que sirve para inhibir la desactivación metabólica medida por el Citocromo P450 3A4, permite que los pacientes reciban menos píldoras, píldoras más pequeñas (debido a la necesidad de menos excipientes) y emplear un programa de dosificación menos frecuente. Claramente, la estructura de Amprenavir es significativamente diferente de la de las moléculas de la presente invención y no predice el éxito con otras clases de fármacos o de química de engarce de fosfato. A continuación se incluyen dos referencias sobre Fosamprenavir pero pueden encontrarse datos más recientes buscando en una base de datos bien conocida en la técnica tal como
IDDB (Una base de datos comercial llamada Investigational Drugs Database producida por Current Drugs Ltd.).
2
Fosamprenavir vertex Pharmaceuticals/GlaxoSmithKline. [Erratum to document cited in CA138:130388]. Corbett, Amanda H.; Kashuba, Angela D. M. School of Pharmacy, The University of North Carolina Hospitals, Chapel Hill, NC, USA. Current Opinion in Investigational Drugs (PharmaPress Ltd.) (2002), 3(5), 824.
Fosamprenavir Vertex Pharmaceuticals/GlaxoSmithKline. Corbett, Amanda H.; Kashuba, Angela D. M. School of Pharmacy, The University of North Carolina Hospitals, Chapel Hill, NC, USA. Current Opinion in Investigational Drugs (PharmaPress Ltd.) (2002), 3(3), 384-390.
Buscando en la bibliografía ejemplos que puedan encontrarse con palabras clave como "profármacos de indoles" o "profármacos de azaindoles" se identifican varias referencias que se han descrito. No se conocen referencias en las que se prepararon profármacos de azaindol mediante el uso de un resto de dihidrogenofosfato de metilo (o sal o mono o di éster del grupo fosfato) unido a N-1.
Respecto a los profármacos de fosfato de indol, la publicación de Zhu y col. describe un estudio para encontrar un profármaco de fosfato eficaz de PD 154075. En esta molécula, o el fosfato de indol directo o un dihidrogenofosfato de metilo o profármaco de la sal del nitrógeno del indol eran profármacos inadecuados debido a una lenta velocidad de regeneración de la molécula parental. Por lo tanto se desarrolló el nuevo y complejo engarce representado a continuación para incorporar un fosfato solubilizante. Phosphate prodrugs of PD 154075, Zhu, Zhijian; Chen, Huai-Gu; Goel, Om P.; Chan, O. Helen; Stilgenbauer, Linda A.; Stewart, Barbra H. Division of Warner-Lambert Company, Chemical Development, Parke-Davis Pharmaceutical Research, Ann Arbor, MI, USA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2000), 10(10), 1121-1124.
3
Muchas de las referencias describen el diseño de profármacos para fines diferentes de superar la absorción limitada por la disolución. Varios de los profármacos no están unidos al nitrógeno del A indol o azaindol o se diseñan para liberar intermedios radicales en lugar del fármaco parental. Los profármacos descritos en esta técnica y sus propiedades no proporcionan soluciones obvias para mejorar las propiedades de los inhibidores de la unión de VIH parentales.
Actualmente se ha descubierto que los nuevos profármacos de dihidrogenofosfato de metilo y sales farmacéuticamente aceptables de la estructura general que se muestra a continuación son útiles como agentes anti VIH con un nuevo mecanismo que actualmente no emplean los fármacos existentes. La necesidad de fármacos con nuevos mecanismos es grande ya que los pacientes se quedan sin opciones si se vuelven resistentes a las clases de fármacos actuales. Además, los fármacos con nuevos mecanismos pueden usarse en combinaciones con clases conocidas de inhibidores para abarcar la aparición de resistencia a estos fármacos ya que las cepas de virus resistentes probablemente siguen siendo sensibles a fármacos con un mecanismo alternativo.
\vskip1.000000\baselineskip
4
Hemos descubierto que estos profármacos son más solubles en agua que las moléculas parentales y se convierten rápidamente en los fármacos parentales después de la dosificación oral en roedores o en ensayos in vitro con enzimas o tejidos humanos. Además, en un estudio de aumento de la dosis oral, un profármaco proporcionó aumentos sorprendentes de la exposición del fármaco (AUC) y concentración máxima (Cmax) a medida que la dosis aumentaba. Estos estudios predictivos sugieren que estos profármacos deben proporcionar ventajas en perros y en seres humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
5
El compuesto parental IVa se ha estudiado en ensayos clínicos humanos. El compuesto se dosificó a voluntarios seres humanos sanos. En la figura 1 se muestra un gráfico de la exposición frente a la dosis.
Como puede observarse, las dosis únicas de una formulación de cápsulas (triángulos rojos) varían en tamaño de 200-2400 mg en incrementos de 200 mg. También es muy evidente a partir de las AUC orales, que los aumentos de la exposición del fármaco aumentaban mucho más lentamente y de forma menos que proporcional a la dosis. De hecho las diferencias o el aumento de exposición por encima de 800 mg es mínima. Con las proporciones de dosis de 1:2:4:6:9:12 para el tratamiento con cápsulas en condiciones de ayuno, las proporciones de valores medios de Cmax y AUC son 1:1,3:2,4:2,3:2,1:2,7 y 1:1,5:2,3:2,0:1,9:2,4, respectivamente. En el intervalo de dosis entre 200-800 mg los aumentos de exposición sistémica están relacionados con la dosis pero son menos que proporcionales a la dosis, mientras que dicha exposición es dependiente de la dosis por encima de de dosis de 800 mg. Este fenómeno indica que la absorción del compuesto IVa con la formulación en cápsulas usada es aturable en condiciones de ayuno.
La proporcionalidad con la dosis en la exposición sistémica parece presentarse mucho mejor en condiciones de ayuno (comida rica en grasas) ya que las proporciones de Cmax y AUC son 1,6 y 1,5, respectivamente, cuando la proporción de la dosis es 1:2,3 (800 mg frente a 1800 mg). Como puede observarse comparando la dosis única de 200 mg de una solución de IVa (cuadrado rojo oscuro) con la de la dosis de cápsula de 200, la exposición de la solución era mayor. La dosificación con una solución aumentó la exposición del Compuesto IVa. La Cmax y AUC de la solución eran aproximadamente 8 y 3 veces, respectivamente, las de la cápsula (200 mg). La biodisponibilidad relativa (32%) de la cápsula con respecto a la formulación en solución sugiere que la absorción está limitada por la velocidad de disolución, lo que sugiere un potencial para aumentar la exposición sistémica mejorando la formulación.
Una comida rica en grasas tenía un efecto de alimentación positivo sobre el compuesto. La Cmax después de un tratamiento con alimento era aproximadamente de 2,6 y 4,6 veces para dosis de 800 y 1800 mg, respectivamente, la del tratamiento en ayuno. Las AUC después de un tratamiento con alimento eran aproximadamente de 2,5 y 4,7 veces para dosis de 800 y 1800 mg, respectivamente, las del tratamiento en ayuno. Los valores de biodisponibilidad relativa (alimento frente a ayuno) eran del 293% y del 509% para dosis de 800 mg y 1800 mg, respectivamente. El Tmax medio cambió de 1,25 ó 2 (ayuno) a 4 (alimento) horas.
Para la cápsula de 800 mg con alimento, la concentración media en plasma es 1001 y 218 ng/ml a las 8 y 12 horas después de la dosis, respectivamente. Los resultados apoyaban un régimen de dosificación de q12h o q8h para un valor dirigido de Cmin de al menos 200 ng/ml después de múltiples dosis. Este valor se seleccionó en base a los datos preclínicos. Un resumen adicional de algunos de estos datos presentados como diagrama de barras se muestra en el segundo diagrama de barras de la figura 2B.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudio de múltiples dosis en seres humanos sanos
Se realizó un estudio de múltiples dosis en aumento controlado por placebo para evaluar la seguridad, tolerabilidad y farmacocinética del Compuesto IVa en sujetos seres humanos sanos. La dosificación se continuó a intervalos de 12 h durante 14 días. En resumen, los resultados preliminares de PK indicaban que, después de dosis únicas y múltiples de Q12H del Compuesto IVa, la exposición es generalmente proporcional a la dosis en los intervalos de dosis de 400 a 1200 mg y de 400 a 800 mg con comida rica y comida ligera en grasas, respectivamente, la exposición parece ser independiente de la dosis por encima de estos niveles de dosis con los diferentes tipos de comida, la acumulación es baja a moderada (hasta \sim1,5 veces) y que existe una variación diurna en la exposición ya que la exposición es mayor después de una dosis vespertina que después de una dosis matutina. Por lo tanto, la exposición era mejor cuando la dosificación se combinó con una comida rica en grasas y los aumentos de exposición con la dosis eran mayores con una comida rica en grasas.
Esto es similar a los resultados obtenidos en el anterior estudio de dosis única.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudio de múltiples dosis en pacientes de VIH
En base a los datos de exposición de los estudios en voluntarios normales, se realizó un estudio de eficacia en pacientes de VIH. Se ha realizado una descripción inicial de estos datos en un resumen comunicado oralmente y publicado. "Antiviral Activity, Safety, and Tolerability of a Novel, Oral Small-Molecule HIV-1 Attachment Inhibitor, IVa, in HIV-1-Infected Subjects" G. Hanna, J. Lalezari, J.Hellinger, D.Wohl, T. Masterson, W. Fiske, J. Kadow, P-F. Lin, M. Giordano, R. Colonno, D. Grasela. Abstract J-32, 02/11/2004, 11th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA. El diseño del estudio incluía adultos VIH+ que no habían recibido terapia antiretroviral o que habían abandonado la terapia antiretroviral durante \geq 16 semanas. Se requería que sus recuentos de CD4 fueran \geq 250 células/mm^{3} y era necesario que el ARN de VIH-1 en plasma HIV-1 RNA estuviera en el intervalo de 5.000-500.000 c/ml. Había 15 sujetos en cada rama de dosis y la proporción de pacientes que recibían fármaco:placebo era de 4:1.
El estudio secuencial controlado por placebo de IVa utilizaba una rama de dosis inicial de 800 mg PO cada 12h seguido de una segunda rama de dosificación de 1800 mg PO administrado cada 12h. Es importante observar que el fármaco se administró en una cápsula y junto con una comida rica en grasas para aumentar la exposición y los niveles en plasma. El fármaco del estudio se administró durante 7 días y en la mañana del día 8. Se realizó el seguimiento de los sujetos durante 14 días.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados del Estudio (para 18 de los 24 Pacientes que Recibían el Fármaco IVa)
6
Resultados del Estudio (para 18 de los 24 Pacientes que Recibían el Fármaco IVa)
7
1. Como puede observarse mediante los datos para el nivel de dosificación de 800 mg junto con una comida rica en grasas, se observó una actividad antiviral significativa. Sin embargo, solamente el 58% de los pacientes tenía > 1,0 de caída del log en la carga viral. Se observó una respuesta antiviral más robusta con el régimen de dosificación de 1800 mg con una comida rica en grasas donde la respuesta media era una caída de 0,96 en la carga viral. Estos datos muestran que este fármaco tiene actividad antiviral significativa a dosis de 800 mg y 1800 mg (y por lo tanto entre éstas) cada 12 horas junto con una comida rica en grasas y por lo tanto podía jugar un papel significativo en terapia de combinación. Un resumen actualizado de los resultados con BMS-043 en seres humanos puede obtenerse viendo el resumen o diapositivas de la presentación: "Antiviral Activity, Safety, and Tolerability of a Novel, Oral Small-Molecule HIV-1 Attachment Inhibitor, BMS-488043, in HIV-1-Infected Subjects" G. Hanna, J. Lalezari, J. Hellinger, D. Wohl, T. Masterson, W. Fiske, J. Kadow, P-F. Lin, M. Giordano, R. Colonno, D. Grasela. Abstract J-32, 02/11/2004, 11th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA.
Desafortunadamente, será inviable administrar este fármaco de forma crónica durante muchos meses lo que implica la administración de un total de 9 cápsulas de 200 mg cada una, dos veces al día junto con una comida rica en grasas por razones de salud obvias, de modo que se necesitará una nueva formulación que proporcione exposición aumentada a partir de una dosis más baja y que elimine la necesidad de una comida rica en grasas.
Por lo tanto los datos clínicos muestran que es necesario un procedimiento para mejorar la expresión de este fármaco a partir de dosis más bajas y en ausencia de una comida rica en grasas.
Por lo tanto los datos iniciales de los profármacos de esta invención predicen de forma sorprendente que mejorarán la exposición de moléculas tales como IVa y suministrarán los fármacos parentales en concentraciones que permitirán que los fármacos se usen en ausencia de comidas ricas en grasas, con menor número de cápsulas y de forma crónica como componente de terapia antiretroviral.
Los datos iniciales obtenidos de la dosificación de cápsulas sólidas del profármaco prodrug Iab (sal de lisina) o la molécula parental sólida (IVa) a perros se resumen en el primer diagrama de barras Figura 2A de la Figura 2. Como puede observarse, después de la dosificación del profármaco Iab (sal de monolisina) en perros en ayuno o alimentados con una comida rica en grasas, la exposición es sorprendentemente alta en comparación con la dosificación de la molécula parental. Además, el efecto del estado alimentado frente al ayuno es mínimo si es que hay alguno para el profármaco que ya tiene un efecto obvio sobre la exposición después de dosificación la molécula parental sólida. Por lo tanto, sorprendentemente, la exposición de la molécula parental después de la dosificación del profármaco, no muestra dependencia de una comida rica en grasas lo que predice niveles de exposición más coherentes después de la dosificación que los de la molécula parental. El diagrama de barras de la Figura 2B resume los datos de seres humanos descritos anteriormente para la molécula parental IVa y muestra la dependencia de la exposición de la molécula de la comida rica en grasas, los aumentos de exposición frente a dosis no proporcionales y la mejor exposición a partir de la dosificación de una solución en lugar de una formulación sólida. Como se describe a continuación, esto muestra que la velocidad de disolución o absorción limitaba la exposición que en modelos preclínicos, parece mejorar de forma sorprendente mediante el uso del profármaco de fosfato. El uso de profármacos de fosfato también aumento la exposición de perros en ayunas frente al compuesto parental para otros dos profármacos. Los detalles de estos experimentos se encuentran en la sección experimental. Además, los detalles de diversos estudios en ratas, perros y monos para dos ejemplos de profármaco adicionales y en ratas para otros dos profármacos demuestran la sorprendente utilidad de estos profármacos para aumentar la exposición sobre la que obtenía la molécula parental a dosis que se correlacionan con las que probablemente sean de utilidad para el tratamiento y la inhibición de la replicación viral de VIH.
Referencias citadas Documentos de patentes
1. Greenlee, W.J.; Srinivasan, P.C. Indole reverse transcriptase inhibitors. Patente de Estados Unidos 5.124.327.
2. Williams, T.M.; Ciccarone, T.M.; Saari, W. S.; Wai, J.S.; Greenlee, W.J.; Balani, S.K.; Goldman, M.E.; Theohrides, A.D. Indoles as inhibitors of HIV reverse transcriptase. Patente Europea 530907.
3. Romero, D.L.; Thomas, R.C.; Preparation of substituted indoles as anti-AIDS pharmaceuticals. PCT WO 93/01181.
4. Boschelli, D.H.; Connor, D.T.; Unangst, P.C. Indole-2-carboxamides as inhibitors of cell adhesion. Patente de Estados Unidos 5.424.329.
5. (a) Mantovanini, M.; Melillo, G.; Daffonchio, L. Tropyl 7-azaindol-3-ylcarboxyamides as antitussive agents. PCT WO 95/04742 (Dompe Spa). (b) Cassidy, F.; Hughes, I.; Rahman, S.; Hunter, D. J. Bisheteroaryl-carbonyl and carboxamide derivatives with 5HT 2C/2B antagonists activity. PCT WO 96/11929, (c) Scherlock, M. H.; Tom, W. C. Substituted 1H-pyrrolopyridine-3-carboxamides. Patente de Estados Unidos 5.023.265. (d) Hutchison, D. R.; Martinelli, M. J.; Wilson, T. M. Preparation or pyrrolo[2,3-d]pyrimidines as sPLA2 inhibitors PCT WO 00/00201,
Otras publicaciones
6. Larder, B.A.; Kemp, S.D. Multiple mutations in the HIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine (AZT). Science, 1989, 246,1155-1158.
7. Gulick, R.M. Current antiretroviral therapy: An overview. Quality of Life Research, 1997, 6, 471-474.
8. Kuritzkes, D.R. HIV resistance to current therapies. Antiviral Therapy, 1997, 2 (Suplemento 3), 61-67.
9. Morris-Jones, S.; Moyle, G.; Easterbrook, P.J. Antiretroviral therapies in HIV-1 infection. Expert Opinion on Investigational Drugs, 1997, 6(8), 1049-1061.
10. Schinazi, R.F.; Larder, B.A.; Mellors, J.W. Mutations in retroviral genes associated with drug resistance. International Antiviral News, 1997, 5, 129-142.
11. Vacca, J.P.; Condra, J.H. Clinically effective HIV-1 protease inhibitors. Drug Discovery Today, 1997, 2, 261-272.
12. Flexner, D. HIV-protease inhibitors. Drug Therapy, 1998, 338, 1281-1292.
13. Berkhout, B. HIV-1 evolution under pressure of protease inhibitors: Climbing the stairs of viral fitness. J. Biomed. Sci., 1999, 6, 298-305.
14. Ren, S.; Lien, E. J. Development of HIV protease inhibitors: A survey. Prog. Drug Res., 1998, 51, 1-31.
15. Pedersen, O.S.; Pedersen, E.B. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors: the NNRTI boom. Antiviral Chem. Chemother. 1999, 10, 285-314.
16. (a) De Clercq, E. The role of non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) in the therapy of HIV-1 infection. Antiviral Research, 1998, 38, 153-179. (b) De Clercq, E. Perspectives of non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) in the therapy of HTV infection. IL. Farmaco, 1999, 54, 26-45.
17. Font, M.; Monge, A.; Cuartero, A.; Elorriaga, A.; Martinez-Irujo, J.J.; Alberdi, E.; Santiago, E.; Prieto, I.; Lasarte, J.J.; Sarobe, P. y Borras, F. Indoles and pyrazino[4,5-b]indoles as nonnucleoside analog inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase. Eur. J. Med. Chem., 1995, 30, 963-971.
18. Romero, D.L.; Morge, R.A.; Genin, M.J.; Biles, C.; Busso, M,; Resnick, L.; Althaus, I.W.; Reusser, F.; Thomas, R.C y Tarpley, W.G. Bis(heteroaryl)piperazine (BHAP) reverse transcriptase inhibitors: structure-activity relationships of novel substituted indol analogues and the identification of 1-[(5-methanesulfonamido-1H-indol-2-yl)-carbonyl]-4-[3-[1-methylethyl)amino]-pyridinil]piperazine momomethansulfonate (U-90152S), a second generation clinical candidate. J. Med. Chem., 1993, 36, 1505-1508.
19. Young, S.D.; Amblard, M.C.; Britcher, S.F.; Grey, V.E.; Tran, L.O.; Lumma, W.C.; Huff, J.R.; Schleif, W.A.; Emini, E.E.; O'Brien, J.A.; Pettibone, D.J. 2-Heterocyclic indole-3-sulfones as inhibitors of HIV-reverse transcriptase. Bioorg. Med. Chem. Lett., 1995, 5, 491-496.
\newpage
20. Genin, M.J.; Poel, T.J.; Yagi, Y.; Biles, C.; Althaus, I.; Keiser, B.J.; Kopta, L.A.; Friis, J.M.; Reusser, F.; Adams, W.J.; Olmsted, R.A.; Voorman, R.L.; Thomas, R.C. y Romero, D.L. Synthesis and bioactivity of novel bis(heteroaryl)piperazine (BHAP) reverse transcriptase inhibitors: structure-activity relationships and increased metabolic stability of novel substituted pyridine analogs. J. Med. Chem., 1996, 39, 5267-5275.
21. Silvestri, R.; Artico, M.; Bruno, B.; Massa, S.; Novellino, E.; Greco, G.; Marongiu, M.E.; Pani, A.; De Montis, A y La Colla, P. Synthesis and biological evaluation of 5H-indolo[3,2-b][1,5]benzothiazepine derivatives, designed as conformationally constrained analogues of the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase inhibitor L-737,126, Antiviral Chem. Chemother. 1998, 9, 139-148.
22. Fredenhagen, A.; Petersen, F.; Tintelnot-Blomley, M.; Rosel, J.; Mett, H y Hug, P. J. Semicochliodinol A and B: Inhibitors of HIV-1 protease and EGF-R protein Tyrosine Kinase related to Asterriquinones produced by the fungus Chrysosporium nerdarium. Antibiotics, 1997, 50, 395-401.
23. (a) Kato, M.; Ito, K.; Nishino, S.; Yamakuni, H.; Takasugi, H. New 5-HT3 (Serotonin-3) receptor antagonists. IV. Synthesis and structure-activity relationships of azabicycloalkaneacetamide derivatives. Chem. Pharm. Bull., 1995, 43, 1351-1357. (b) Levacher, V.; Benoit, R.; Duflos, J; Dupas, G.; Bourguignon, J.; Queguiner, G. Broadening the scope of NADH models by using chiral and non chiral pirrolo [2,3-b] pyridine derivatives. Tetrahedron, 1991, 47, 429-440.
24. (a) Resnyanskaya, E. V.; Tverdokhlebov, A. V.; Volovenko, Y. M.; Shishkin, O. V.; Zubatyuk, R. I. A simple synthesis of 1-acyl-3-aryl-3H-pyrrolo[2',3',:4,5]pyrimido[6,1-b]benzothiazol-6-ium-2-olates: Betainic derivatives of a novel heterocyclic system. Synthesis, 2002, 18, 2717-2724. (b) Cook, P. D.; Castle, R. N. Pyrrolopyridazines. 1, Synthesis and reactivity of [2,3-d]pyridazine 5-oxides. J. Het. Chem. 1973, 10(4), 551-557.
25. Shadrina, L.P.; Dormidontov, Yu.P.; Ponomarev, V,G.; Lapkin, I.I. Reactions of organomagnesium derivatives of 7-aza- and benzoindoles with diethyl oxalate and the reactivity of ethoxalylindoles. Khim. Geterotsikl. Soedin., 1987, 1206-1209.
26. Sycheva, T.V.; Rubtsov, N.M.; Sheinker, Yu.N.; Yakhontov, L.N. Some reactions of 5-cyano-6-chloro-7-azaindoles and lactama-lactim tautomerism in 5-cyano-6-hydroxy-7-azaindolines. Khim. Geterotsikl. Soedin., 1987, 100-106.
27. (a) Desai, M.; Watthey, J.W.H.; Zuckerman, M. A convenient preparation of 1-aroylpiperazines. Org. Prep. Proced. Int., 1976, 8, 85-86. (b) Adamczyk, M.; Fino, J.R. Synthesis of procainamide metabolites. N-acetyl desethyl-procainamide and desethylprocainamide. Org. Prep. Proced. Int. 1996, 28, 470-474. (c) Rossen, K.; Weissman, S.A.; Sager, J.; Reamer, R.A.; Askin, D.; Volante, R.P.; Reider, P.J. Asymmetric Hydrogenation of tetrahydropyrazines: Synthesis of (S)-piperazine 2-tert-butylcarboxamide, an intermediate in the preparation of the HIV protease inhibitor Indinavir. Tetrahedron Lett., 1995, 36, 6419-6422. (d) Wang, T.; Zhang, Z.; Meanwell, N.A. Benzoylation of Dianions: Preparation of mono-Benzoylated Symmetric Secondary Diamines. J. Org. Chem., 1999, 64,
7661-7662.
28. Li, H.; Jiang, X.; Ye, Y.-H.; Fan, C.; Romoff, T.; Goodman, M. 3-(Diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4 (3H)-one (DEPBT): A new coupling reagent with remarkable resistance to racemization. Organic Lett., 1999., 1, 91-93.
29. Harada, N.; Kawaguchi, T.; Inoue, I.; Ohashi, M.; Oda, K.; Hashiyama, T.; Tsujihara, K. Synthesis and antitumor activity of quaternary salts of 2-(2'-oxoalcoxy)-9-hydroxyellipticines. Chem. Pharm. Bull., 1997, 45, 134-137.
30. Schneller, S.W.; Luo, J.-K. Synthesis of 4-amino-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine (1,7-Dideazaadenine) and 1H-pyrrolo [2,3-b]pyridin-4-ol (1,7-Dideazahypoxanthine). J. Org. Chem., 1980, 45, 4045-4048.
31. Shiotani, S.; Tanigochi, K. Furopyridines. XXII [1]. Elaboration of the C-substitutents alfa to the heteronitrogen atom of furo[2,3-b]-, -[3,2-b]-, -[2,3-c]- and -[3,2-c]pyridine. J. Het. Chem., 1997, 34, 901-907.
32. Minakata, S.; Komatsu, M.; Ohshiro, Y. Regioselective functionalization of 1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine via its N-oxide. Synthesis, 1992, 661-663.
33. Klemm, L. H.; Hartling, R. Chemistry of thienopyridines. XXIV. Two transformations of thieno[2,3-b]pyridine 7-oxide (1). J. Het. Chem., 1976, 13, 1197-1200.
34. Antonini, I.; Claudi, F.; Cristalli, G.; Franchetti, P.; Crifantini, M.; Martelli, S. Synthesis of 4-amino-1-\beta-D-ribofuranosyl-1H pyrrolo[2,3-b]pyridine (1-Deazatubercidin) as a potential antitumor agent. J. Med. Chem., 1982, 25, 1258-1261.
35. (a) Regnouf De Vains, J.B.; Papet, A.L.; Marsura, A. New symmetric and unsymmetric polifunctionalized 2,2'-bipyridines. J. Het. Chem., 1994, 31, 1069-1077. (b) Miura, Y.; Yoshida, M.; Hamana, M. Synthesis of 2,3-fused quinolines from 3-substituted quinoline 1-oxides. Parte II, Heterocicles, 1993, 36, 1005-1016. (c) Profft, V.E.; Rolle, W. Uber 4-merkaptoverbindungendes 2-metilpiridins. J. Prakt. Chem., 1960, 283 (11), 22-34.
36. Nesi, R.; Giomi, D.; Turchi, S.; Tedeschi, P., Ponticelli, F. A new one step synthetic approach to the isoxazolo [4,5-b]pyridine system. Synth. Comm., 1992, 22, 2349-2355.
37. (a) Walser, A.; Zenchoff, G.; Fryer, R.I. Quinazolines and 1,4-benzodiazepines. 75, 7-Hydroxyaminobenzodiazepines and derivatives. J. Med. Chem., 1976, 19, 1378-1381. (b) Barker, G.; Ellis; G.P. Benzopyrone. Part I. 6-Amino- and 6-hydroxy-2-subtituted chromones. J. Chem. Soc., 1970, 2230-2233.
38. Ayyangar, N.R.; Lahoti, R J.; Daniel, T. An alternate synthesis of 3,4-diaminobenzophenone and mebendazol. Org. Prep. Proced. Int., 1991, 23, 627-631.
39. Mahadevan, I.; Rasmussen, M. Ambident heterocyclic reactivity: The alkylation of pyrrolopyridines (azaindoles, diazaindenes). Tetrahedron, 1993, 49, 7337-7352.
40, Chen, B.K.; Saksela, K.; Andino, R.; Baltimore, D. Distinct modes of human immunodeficiency type 1 proviral latency revealed by superinfection of nonproductively infected cell lines with recombinant luciferase-encoding viruses. J. Virol., 1994, 68, 654-660.
41. Bodanszky, M.; Bodanszky, A. "The Practice of Peptide Synthesis" 2nd Ed., Springer-Verlag: Berlin Heidelberg, Germany, 1994.
42. Albericio, F. y col. J. Org. Chem. 1998, 63, 9678.
43. Knorr, R. y col. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927.
44. (a) Jaszay Z. M. y col. Synth. Commun., 1998 28, 2761 y referencias citadas en ese documento; (b) Bernasconi, S. y col. Synthesis, 1980, 385.
45. (a) Jaszay Z. M. y col. Synthesis, 1989, 745 y referencias citadas en ese documento; (b) Nicolaou, K. C. y col. Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 1669.
46. Ooi, T. y col. Synlett. 1999, 729.
47. Ford, R. E. y col. J. Med. Chem. 1986, 29, 538.
48. (a) Yeung, K.-S. y col. Bristol-Myers Squibb Unpublished Results. (b) Wang, W. y col. Tetrahedron Lett. 1999, 40, 2501.
49. Brook, M. A. y col. Synthesis, 1983, 201.
50. Yamazaki, N. y col. Tetrahedron Lett. 1972, 5047.
51. Barry A. Bunin "The Combinatorial Index" 1998 Academic Press, San Diego/London páginas 78-82.
52. Richard C. Larock Comprehensive Organic Transormations 2nd Ed. 1999, John Wiley and Sons New York.
53. M.D. Mullican y col. J. Med. Chem. 1991, 34, 2186-2194.
54. Protective groups in organic synthesis 3rd ed./Teodora W. Greene y Meter G. M. Wuts. New York: Wiley, 1999.
55. Katritzky, Alan R. Lagowski, Jeanne M. The principles of heterocyclic Chemistry New York: Academic Press, 1968.
56. Paquette, Leo A. Principles of modern heterocyclic chemistry New York: Benjamin.
57. Katritzky, Alan R.; Rees, Charles W.; Comprehensive heterocyclic chemistry: the structure, reactions, synthesis, and uses of heterocyclic compounds 1st ed.Oxford (Oxfordshire); New York: Pergamon Press, 1984, 8 v.
58. Katritzky, Alan R Handbook of heterocyclic 1st ed Oxford (Oxfordshire); New York: Pergamon Press, 1985.
59. Davies, David I Aromatic Heterocyclic Oxford; New York: Oxford University Press, 1991.
60. Ellis, G. P. Synthesis of fused Chichester [Sussex]; New York: Wiley, c1987-c1992, Chemistry of heterocyclic compounds; v. 47.
61. Joule, J. A Mills, K., Smith, G. F. Heterocyclic Chemistry, 3rd ed London; New York Chapman & Hall, 1995.
62. Katritzky, Alan R., Rees, Charles W., Scriven, Eric F. V. Comprehensive heterocyclic chemistry II: a review of the literature 1982-1995.
63. The structure, reactions, synthesis, and uses of heterocyclic compounds 1 st ed. Oxford; New York: Pergamon, 1996, 11 v. in 12: ill.; 28 cm.
64. Eicher, Theophil, Hauptmann, Siegfried. The chemistry of heterocycles: structure, reactions, syntheses, and applications Stuttgart; New York: G. Thieme, 1995.
65. Grimmett, M. R. Imidazole and benzimidazole Synthesis London; San Diego: Academic Press, 1997.
66. Advances in heterocyclic chemistry. Published in New York by Academic Press, starting in 1963-present.
67. Gilchrist, T. L. (Thomas Lonsdale) Heterocyclic chemistry 3rd ed. Harlow, Essex: Longman, 1997, 414 p: ill.; 24 cm.
68. Farina, Vittorio; Roth, Gregory P. Recent advances in the Stille reaction; Adv. Met.-Org. Chem. 1996, 5, 1-53.
69. Farina, Vittorio; Krishnamurthy, Venkat; Scott, William J.The Stille reaction; Org. React. (N. Y.) (1997), 50, 1-652.
70. Stille, J. K. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1986, 25, 508-524.
71. Norio Miyaura y Akiro Suzuki Chem Rev. 1995, 95, 2457.
72. Home, D.A. Heterocycles 1994, 39, 139.
73. Kamitori, Y. y col. Heterocycles, 1994, 37(1), 153.
74. Shawali, J. Heterocyclic Chem. 1976, 13, 989.
75. a) Kende, A.S. y col. Org. Photochem. Synth. 1972, 1, 92. b) Hankes, L.V.; Biochem. Prep. 1966, 11, 63. c) Synth. Meth. 22, 837.
76. Hulton y col. Synth. Comm. 1979, 9, 789.
77. Pattanayak, B.K. y col. Indian J. Chem. 1978, 16, 1030.
78. Chemische Berichte 1902, 35, 1545.
79. Chemische Berichte Ibid 1911, 44, 493.
80. Moubarak, I., Vessiere, R. Synthesis 1980, Vol. 1, 52-53.
81. Ind J. Chem. 1973, 11, 1260.
82. Roomi y col. Can J. Chem. 1970, 48, 1689.
83. Sorrel, T.N. J. Org. Chem. 1994, 59, 1589.
84. Nitz, T.J. y col. J. Org. Chem. 1994, 59, 5828-5832.
85. Bowden, K. y col. J. Chem. Soc. 1946, 953.
86. Nitz, T.J. y col. J. Org. Chem. 1994, 59, 5828-5832.
87. Scholkopf y col. Angew. Int. Ed. Engl. 1971, 10(5), 333.
88. (a) Behun, J. D.; Levine, R. J. Org. Chem. 1961, 26, 3379. (b) Rossen, K.; Weissman, S.A.; Sager, J.; Reamer, R.A.; Askin, D.; Volante, R.P.; Reider, P.J. Asymmetric Hydrogenation of tetrahydropyrazines: Synthesis of (S)-pip-erazine 2-tert-butylcarboxamide, an intermediate in the preparation of the HIV protease inhibitor Indinavir. Tetrahedron Lett., 1995, 36, 6419-6422. (c) Jenneskens, L. W.; Mahy, J.; den Berg, E. M. M. de B.-v.; Van der Hoef, I.; Lugtenburg, J. Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 1995, 114, 97.
89. Wang, T.; Zhang, Z.; Meanwell, N.A. Benzoylation of Dianions: Preparation of mono-Benzoylated Symmetric Secondary Diamines. J Org. Chem., 1999, 64, 7661-7662.
\newpage
90. (a) Adamczyk, M.; Fino, J.R. Synthesis of procainamide metabolites. N-acetyl desethylprocainamide and de-sethylprocainamide. Org. Prep. Proced. Int. 1996, 28, 470-474. (b) Wang, T.; Zhang, Z.; Meanwell, N.A. Regiose-lective mono-Benzoylation of Unsymmetrical Piperazines. J. Org. Chem., in press.
91. Masuzawa, K.; Kitagawa, M.; Uchida, H. Bull Chem. Soc. Jpn. 1967, 40, 244-245.
92. Furber, M.; Cooper, M. E.; Donald, D. K. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 1351-1354.
93. Blair, Wade S.; Deshpande, Milind; Fang, Haiquan; Lin, Pin-fang; Spicer, Timothy P.; Wallace, Owen B.; Wang, Hui; Wang, Tao; Zhang, Zhongxing; Yeung, Kap-sun. Preparation of antiviral indoleoxoacetyl piperazine derivatives Patente de Estados Unidos 6.469.006. Preparation of antiviral indoleoxoacetyl piperazine derivatives. Solicitud Internacional PCT (PCT/LTS00/14359), WO 0076521 A1, presentada el 24 de mayo del 2000, publicada el 21 de diciembre del 2000.
94. Wang, Tao; Wallace, Owen B.; Zhang, Zhongxing; Meanwell, Nicholas A.; Bender, John A. Antiviral azaindole derivatives. Patente de Estados Unidos 6476034 y Wang, Tao; Wallace, Owen B.; Zhang, Zhongxing; Meanwell, Nicholas A.; Bender, John A. Preparation of antiviral azaindole derivatives. Solicitud Internacional
PCT (PCT/US01/02009), WO 0162255 A1, presentada el 19 de enero del 2001, publicada el 30 de agosto
del 2001.
95. Wallace, Owen B.; Wang, Tao; Yeung, Kap-Sun; Pearce, Bradley C.; Meanwell, Nicholas A.; Qiu, Zhilei; Fang, Haiquan; Xue, Qiufen May; Yin, Zhiwei. Composition and antiviral activity of substituted indoleoxoacetic piperazine derivatives. Solicitud de Patente de Estados Unidos Número de Serie 10/027.612 presentada el 19 de diciembre del 2001, que es una continuación en parte de la solicitud de Estados Unidos Número de Serie 09/888,686 presentada el 25 de junio del 2001 (correspondiente a la Solicitud Internacional PCT (PCT/US01/20300), WO 0204440 A1, presentada el 26 de junio del 2001, publicada el 17 de enero del 2002.
96. J. L. Marco, S. T. Ingate, y P. M. Chinchon Tetrahedron 1999, 55, 7625-7644.
97. C. Thomas, F. Orecher y P. Gmeiner Synthesis 1998, 1491.
98. M. P. Pavia, S. J. Lobbestael, C. P. Taylor, F. M. Hershenson, y D. W. Miskell.
99. Buckheit, Robert W., Jr. Expert Opinion on Investigational Drugs 2001, 10(8), 1423-1442.
100. Balzarini, J.; De Clercq, E. Antiretroviral Therapy 2001, 31-62.
101. E. De Clercq Journal of Clinical Virology, 2001, 22, 73-89.
102. Merour, Jean-Yves; Joseph, Benoit. Curr. Org. Chem. (2001), 5(5), 471-506.
103. T. W. von Geldern y col. J. Med. Chem 1996, 39, 968.
104. M. Abdaoui y col. Tetrahedron 2000, 56, 2427.
105. W. J. Spillane y col. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1982, 3, 677.
106. Wang, Tao; Zhang, Zhongxing; Meanwell; Nicholas A.; Kadow, John F.; Yin, Zhiwei; Xue, Qiufen May. (USA). Composition and antiviral activity of substituted azaindoleoxoacetic piperazine derivatives. Solicitud de Patente de Estados Unidos (2003), US 20030207910 A1 publicada el 6 de noviembre del 2003 que es la Solicitud de Patente de Estados Unidos Número de Serie 10/214.982 presentada el 7 de agosto del 2002, que es una continuación en parte de la solicitud de Estados Unidos Número de Serie 10/038.306 presentada el 2 de enero del 2002 (correspondiente a la Solicitud Internacional PCT (PCT/US02/00455), WO 02/062423 A1, presentada el 2 de enero del 2002, publicada el 15 de agosto del 2002.
107. a) Nickel, Bernd; Szelenyi, Istvan; Schmidt, Jurgen; Emig, Peter; Reichert, Dietmar; Gunther, Eckhard; Brune, Kay. Preparation of indolylglyoxilamides as antitumor agents. Solicitud Internacional PCT (1999), 47 págs. CODEN: PIXXD2 WO 9951224 b) Emig, Peter; Bacher, Gerald; Reichert, Dietmar; Baasner, Silke; Aue, Beate; Nickel, Bernd; Guenther, Eckhard. Preparation of N-(6-quinolinyl)-3-indolylglyoxilamides as antitumor agents. Solicitud Internacional PCT (2002), 4WO 2002010152A2 c) Nickel, Bernd; Klenner, Thomas; Bacher, Gerald; Beckers, Thomas; Emig, Peter; Engel, Juergen; Bruyneel, Erik; Kamp, Guenter; Peters, Kirsten. Indolyl-3-glyoxylic acid derivatives comprising therapeutically valuable properties. Solicitud Internacional PCT (2001), WO 2001022954A2.
108. Wang, Tao; Wallace, Owen B.; Meanwell, Nicholas A.; Zhang, Zhongxing; Bender, John A.; Kadow, John F.; Yeung, Kap-Sun. Preparation of indole, azaindole, and related heterocyclic piperazinecarboxamides for treatment of AIDS. Solicitud Internacional PCT WO 2002085301A2.
\newpage
109. Kadow, John F.; Xue, Qiufen May; Wang, Tao; Zhang, Zhongxing; Meanwell, Nicholas A. Preparation of indole, azaindole and related heterocyclic pyrrolidine derivatives as antiviral agents. Solicitud Internacional PCT WO 2003068221A1.
110. Wang, Tao; Wallace, Owen B.; Meanwell, Nicholas A.; Kadow, John F.; Zhang, Zhongxing; Yang, Zhong. Biciclo 4,4,0 antiviral derivatives Solicitud Internacional PCT (2003), WO 2003092695A1.
111. Preparation of indolyl-, azaindolyl-, and related heterocyclic sulfonylureidopiperazines for treatment of HIV and AIDS. Kadow, John F.; Regueiro-Ren, Alicia; Xue, Qiufen May. Solicitud Internacional PCT (2003),
WO2004000210 A2.
112. Composition and antiviral activity of substituted azaindoleoxoacetic piperazine derivatives. Wang, Tao; Zhang, Zhongxing; Meanwell, Nicholas A.; Kadow, John F.; Yin, Zhiwei; Xue, Qiufen May; Regueiro-Ren, Alicia; Matiskella, John D.; Ueda, Yasutsugu. Solicitud de Patente de Estados Unidos (2004), US 2004110785A1.
\vskip1.000000\baselineskip
Sumario de la invención
La presente invención comprende compuestos de Fórmula I, sus formulaciones farmacéuticas y su uso en pacientes que padecen o son sensibles a un virus tal como el VIH. Los compuestos de Fórmula I, que incluyen sales no tóxicas farmacéuticamente aceptables de los mismos, tienen la fórmula y el significado que se describe a continuación.
La presente invención comprende un compuesto de Fórmula I,
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
n en la que:
\quad
X es C o N con la condición de que cuando X es N, R^{1} no exista;
\quad
W es C o N con la condición de que cuando W es N, R^{2} no exista;
\quad
V es C;
\quad
R^{1} es hidrógeno, metoxi o halógeno;
\quad
R^{2} es hidrógeno;
\quad
R^{3} es metoxi o heteroarilo, pudiendo estar cada uno de ellos independiente y opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado entre G; donde el heteroarilo es triazolilo, pirazolilo u oxadiazolilo;
\quad
E es hidrógeno o una mono o bis sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
\quad
Y se selecciona entre el grupo compuesto por
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
cada uno de R^{10}, R^{11}, R^{12}, R^{13}, R^{14}, R^{15}, R^{16} y R^{17} es independientemente H o metilo, con la condición de que no más de dos de R^{10}-R^{17} sean metilo;
\quad
R^{18} se selecciona entre el grupo compuesto por C(O)-fenilo, C(O)-piridinilo, piridinilo, pirimidinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, ftalazinilo, azabenzofurilo y azaindolilo, pudiendo estar cada uno de ellos independiente y opcionalmente sustituido con uno a dos miembros seleccionados entre el grupo compuesto por metilo, -amino, -NHMe, -NMe_{2}, metoxi, hidroximetilo y halógeno;
\quad
D se selecciona entre el grupo compuesto por ciano, S(O)_{2}R^{24}, halógeno, C(O)NR^{21}R^{22}, fenilo y heteroarilo; donde dicho fenilo o heteroarilo está independiente y opcionalmente sustituido con uno a tres halógenos iguales o diferentes o de uno a tres sustituyentes iguales o diferentes seleccionados entre G; donde el heteroarilo se selecciona entre el grupo compuesto por piridinilo y oxadiazolilo;
\quad
A se selecciona entre el grupo compuesto por fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo, donde dichos fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo están independiente y opcionalmente sustituidos con uno a tres halógenos iguales o diferentes o de uno a tres sustituyentes iguales o diferentes seleccionados entre G;
\quad
G se selecciona entre el grupo compuesto por alquilo (C_{1-6}), alquenilo (C_{1-6}), fenilo, hidroxi, metoxi, halógeno, -NR^{23}C (O)-alquilo (C_{1-6}), -NR^{24}R^{25}, -S(O)_{2}NR^{24}R^{25}, COOR^{26} y -CONR^{24}R^{25}; donde dicho alquilo (C_{1-6}) está opcionalmente sustituido con hidroxi, dimetilamino o de uno a tres halógenos iguales o diferentes;
\quad
R^{26} se selecciona entre el grupo compuesto por hidrógeno y alquilo (C_{1-6});
\quad
R^{20}, R^{21}, R^{22}, R^{23}, R^{24} y R^{25} se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por hidrógeno, alquilo (C_{1-6}) y -(CH_{2})_{n}NR^{27}R^{28};
\quad
n es 0-6; y
\quad
cada uno de R^{27} y R^{28} es independientemente H o metilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Una realización más preferida son los compuestos anteriores en los que:
cada uno de X y W es N;
o los compuestos anteriores en los que:
X es C; y
W es N.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra realización preferida son compuestos como se ha descrito anteriormente en los que:
R^{18} es -C(O)-Ph; e
Y es
10
Otra realización preferida son compuestos como se ha descrito anteriormente en los que: R^{3} es metoxi o triazolilo; donde dicho triazolilo está opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado entre G;
cada uno de R^{10}-R^{17} es H; y
G es metilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra realización preferida son compuestos como se ha descrito anteriormente en los que: R^{1} es F, y R^{3} es 1,2,3-triazolilo unido en la posición N-1.
Otra realización preferida son compuestos como se ha descrito anteriormente en los que: R^{1} es OMe, y R^{3} es 3-metil-1,2,4-triazolilo unido en la posición N-1.
Otra realización preferida son compuestos como se ha descrito anteriormente en los que: cada uno de R^{1} y R^{3} es metoxi.
Otra realización preferida son compuestos como se ha descrito anteriormente en los que la sal es sodio, lisina o trometamina.
Otra realización preferida de la invención es una composición farmacéutica que comprende una cantidad antiviral eficaz de un compuesto de Fórmula I, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables del mismo, y uno o más vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
Otra realización preferida es la composición farmacéutica anterior, útil para tratar una infección por VIH, que comprende además una cantidad antiviral eficaz de un agente de tratamiento del SIDA seleccionado entre el grupo compuesto por:
(a)
un agente antiviral para el SIDA;
(b)
un agente anti-infeccioso;
(c)
un inmunomodulador; y
(d)
inhibidores de la entrada del VIH.
\vskip1.000000\baselineskip
También se incluye por las realizaciones el uso, en la preparación de un medicamento para tratar a un mamífero infectado con el virus del VIH, de un compuesto de Fórmula I, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables del mismo, y uno o más vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
Otra realización es el uso descrito anteriormente, donde los medicamentos es para uso en combinación con una cantidad antiviral eficaz de un agente para el tratamiento del SIDA seleccionado entre el grupo compuesto por un agente antiviral para el SIDA; un agente anti-infeccioso; un inmunomodulador; y un inhibidor de la entrada del VIH.
Otra realización son los compuestos intermedios de Fórmula II, útiles en la preparación de compuestos I,
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\vskip1.000000\baselineskip
donde:
\quad
X es C o N con la condición de que cuando X es N, R^{1} no exista;
\quad
W es C o N con la condición de que cuando W es N, R^{2} no exista;
\quad
V es C;
\quad
R^{1} es hidrógeno, metoxi o halógeno;
\quad
R^{2} es hidrógeno;
\quad
R^{3} es metoxi o heteroarilo, pudiendo estar cada uno de ellos independiente y opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado entre G; donde el heteroarilo es triazolilo, pirazolilo u oxadiazolilo;
\quad
L y M se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, fenilo, bencilo, trialquilsililo, -2,2,2-tricloroetoxi y 2-trimetilsililetoxi, con la condición de que no más de uno de L y M pueda ser hidrógeno;
\newpage
\quad
Y se selecciona entre el grupo compuesto por
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
cada uno de R^{10}, R^{11}, R^{12}, R^{13}, R^{14}, R^{15}, R^{16} y R^{17} es independientemente H o metilo, con la condición de que no más de dos de R^{10}-R^{17} sean metilo;
\quad
R^{18} se selecciona entre el grupo compuesto por C(O)-fenilo, C(O)-piridinilo, piridinilo, pirimidinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, ftalazinilo, azabenzofurilo y azaindolilo, pudiendo estar cada uno de ellos independiente y opcionalmente sustituido con uno a dos miembros seleccionados entre el grupo compuesto por metilo, -amino, -NHMe, -NMe_{2}, metoxi, hidroximetilo y halógeno;
\quad
D se selecciona entre el grupo compuesto por ciano, S(O)_{2}R^{24}, halógeno, C(O)NR^{21}R^{22}, fenilo y heteroarilo; donde dicho fenilo o heteroarilo está independiente y opcionalmente sustituido con uno a tres halógenos iguales o diferentes o de uno a tres sustituyentes iguales o diferentes seleccionados entre G; donde el heteroarilo se selecciona entre el grupo compuesto por piridinilo y oxadiazolilo;
\quad
A se selecciona entre el grupo compuesto por fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo, donde dichos fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo están independiente y opcionalmente sustituidos con uno a tres halógenos iguales o diferentes o de uno a tres sustituyentes iguales o diferentes seleccionados entre G;
\quad
G se selecciona entre el grupo compuesto por alquilo (C_{1-6}), alquenilo (C_{1-6}), fenilo, hidroxi, metoxi, halógeno, -NR^{23}C (O)-alquilo (C_{1-6}), -NR^{24}R^{25}, -S(O)_{2}NR^{24}R^{25}, COOR^{26} y -CONR^{24}R^{25}; donde dicho alquilo (C_{1-6}) está opcionalmente sustituido con hidroxi, dimetilamino o de uno a tres halógenos iguales o diferentes;
\quad
R^{26} se selecciona entre el grupo compuesto por hidrógeno y alquilo (C_{1-6});
\quad
R^{20}, R^{21}, R^{22}, R^{23}, R^{24} y R^{25} se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por hidrógeno, alquilo (C_{1-6}) y -(CH_{2})_{n}NR^{27}R^{28};
\quad
cada uno de R^{27} y R^{28} es independientemente H o metilo; y
\quad
n es 0-6.
\vskip1.000000\baselineskip
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 ilustra el AUC (Área Bajo la Curva) Frente a la Dosificación en Ensayos Clínicos Humanos para el Compuesto IVa.
La Figura 2 ilustra el AUC para el Compuesto IVa y el Profármaco Iab En Condiciones de Ayuno y Alimentación en Estudios en Perro y Ser Humano.
La Figura 3 ilustra representaciones de AUC Oral de IVc en Ratas frente a la Dosis.
La Figura 4 ilustra representaciones de Cmax Oral de IVc en Ratas Frente a la Dosis.
La Figura 5 ilustra Perfiles en Plasma de IVc en Ratas Después de Dosificación Oral de Ic.
La Figura 6 ilustra la Comparación de Cmax y AUC de IVa en Ratas Macho a las que se Administró IVa o Iab.
La Figura 7 ilustra la Comparación de Cmax y AUC de IVa en Perros a los que se Administró IVa o Iab.
La Figura 8 ilustra la Hidrólisis de Iab en Soluciones de ALP Placentaria Humana y la Formación de IVa.
La Figura 9 ilustra Perfiles de Concentración en Plasma frente al Tiempo de Iab y IVa Después de la Administración IV y Oral de Iab en Ratas y a partir de los Datos Históricos de IVa en Ratas.
\newpage
La Figura 10 ilustra Perfiles de Concentración en Plasma frente al Tiempo de Iab y IVa Después de la Administración IV y Oral de Iab en Perros y a partir de los Datos Históricos de IVa en Perros.
La Figura 11 ilustra Perfiles de Concentración en Plasma frente al Tiempo de Iab y IVa Después de la Administración IV y Oral de Iab en Monos y a partir de los Datos Históricos de IVa en Monos.
La Figura 12 ilustra la Comparación de Cmax y AUC de IVb en Ratas Macho a las que se Administró IVb o Ibb.
La Figura 13 ilustra la Comparación de Cmax y AUC de IVb en Perros a los que se Administró IVb o Ibb.
La Figura 14 ilustra la Hidrólisis de Ibb en Soluciones de ALP Placentaria Humana y la Formación de IVb.
La Figura 15 ilustra Perfiles de Concentración en Plasma frente al Tiempo de Ibb y IVb Después de la Administración IV y Oral de Ibb en Rata y los Datos Históricos de IVb en Rata.
La Figura 16 ilustra Perfiles de Concentración en Plasma frente al Tiempo de Ibb y IVb Después de la Administración IV y Oral de Ibb en Perro y los Datos Históricos de IVb en Perro.
La Figura 17 ilustra Perfiles de Concentración en Plasma frente al Tiempo de Ibb y IVb Después de la Administración IV y Oral de Ibb en Mono y los Datos Históricos de IVb en Mono.
La Figura 18 ilustra la Comparación de Cmax y AUC de IVc en Ratas Macho al las que se Administró IVc o Icb.
La Figura 19 ilustra la Comparación de Cmax y AUC de IVc en Perros a los que se Administró IVc o Icb.
La Figura 20 ilustra la Hidrólisis de Icb en Soluciones de ALP Placentaria Humana y la Formación de IVc.
La Figura 21 ilustra Perfiles de Concentración en Plasma frente al Tiempo de Icb y IVc Después de la Administración IV y Oral de Icb en Rata y los Datos Históricos de IVc en Rata.
La Figura 22 ilustra Perfiles de Concentración en Plasma frente al Tiempo de Icb y IVc Después de la Administración IV y Oral de Icb en Perro y los Datos Históricos de IVc en Perro.
La Figura 23 ilustra Perfiles de Concentración en Plasma frente al Tiempo de Icb y IVc Después de la Administración IV y Oral de Icb en Mono y los Datos Históricos de IVc en Mono.
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción detallada de la invención
Ya que los compuestos de la presente invención pueden poseer centros asimétricos y por lo tanto pueden aparecer como mezclas de diastereómeros y enantiómeros, la presente invención incluye las formas diastereoisoméricas y enantioméricas individuales de los compuestos de Fórmula I además de mezclas de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
Definiciones
El término "alquilo C_{1-6}", como se usa en este documento y en las reivindicaciones (a menos que se especifique otra cosa), se refiere a grupos alquilo de cadena lineal o ramificada tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, t-butilo, amilo, hexilo y similares.
"Halógeno" se refiere a cloro, bromo, yodo o flúor.
Un grupo "arilo" se refiere a grupos de anillo monocíclico o condensado con todo carbonos (es decir, anillos que comparten pares de átomos de carbono adyacentes) que tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. Son ejemplos de grupos arilo, pero sin limitación, fenilo, naftalenilo y antracenilo. El grupo arilo puede estar sustituido o sin sustituir. Cuando están sustituidos, el grupo o grupos están sustituidos preferiblemente con uno o más grupos seleccionados entre alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, heteroalicicloxi, tiohidroxi, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheteroalicicloxi, ciano, halógeno, nitro, carbonilo, O-carbamilo, N-carbamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfinilo, sulfonilo, sulfonamido, trihalometilo, ureido, amino y -NR^{x}R^{y}, donde R^{x} y R^{y} se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, carbonilo, C-carboxi, sulfonilo, trihalometilo, y, combinados, un anillo heteroalicíclico de cinco o seis miembros.
Como se usa en este documento, un grupo "heteroarilo" se refiere a un grupo de anillos monocíclicos o condensados (es decir, anillos que comparten un par de átomos adyacentes) que tiene en el anillo o anillos uno o más átomos seleccionados entre el grupo compuesto por nitrógeno, oxígeno y azufre y, además, que tiene un sistema de electrones pi completamente conjugado. A menos que se indique otra cosa, el grupo heteroarilo puede estar unido en cualquier átomo de carbono o nitrógeno dentro del grupo heteroarilo. Debe apreciarse que el término heteroarilo pretende incluir un N-óxido del heteroarilo parental si tal N-óxido es químicamente factible como se conoce en la técnica. Son ejemplos de grupos heteroarilo, pero sin limitación, furilo, tienilo, benzotienilo, tiazolilo, imidazolilo, oxazolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, benzotiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, piranilo, tetrahidropiranilo, pirazolilo, piridilo, pirimidinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, purinilo, carbazolilo, benzoxazolilo, bencimidazolilo, indolilo, isoindolilo, pirazinilo. diazinilo, pirazina, triaziniltriazina, tetrazinilo y tetrazolilo. Cuando están sustituidos, el grupo o grupos están sustituidos preferiblemente con uno o más grupos seleccionados entre alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, heteroalicicloxi, tiohidroxi, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheteroalicicloxi, ciano, halógeno, nitro, carbonilo, O-carbamilo, N-carbamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfinilo, sulfonilo, sulfonamido, trihalometilo, ureido, amino y -NR^{x}R^{y}, donde R^{x} y R^{y} son como se han definido anteriormente.
Como se usa en este documento, un grupo "heteroalicíclico" se refiere a un grupo de anillos monocíclicos o condensados que tiene en el anillo o anillos uno o más átomos seleccionados entre el grupo compuesto por nitrógeno, oxígeno y azufre. Los anillos se seleccionan entre los que proporcionan disposiciones de enlaces adecuadas y no pretenden incluir sistemas que no existen. Los anillos también pueden tener uno o más dobles enlaces. Sin embargo, los anillos no tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. Son ejemplos de grupos heteroalicíclicos, pero sin limitación, azetidinilo, piperidilo, piperazinilo, imidazolinilo, tiazolidinilo, 3-pirrolidin-1-ilo, morfolinilo, tiomorfolinilo y tetrahidropiranilo. Cuando están sustituidos, el grupo o grupos están sustituidos preferiblemente con uno o más grupos seleccionados entre alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, heteroalicicloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheteroalicicloxi, ciano, halógeno, nitro, carbonilo, tiocarbonilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, C-tioamido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfinilo, sulfonilo, sulfonamido, trihalometanosulfonamido, trihalometanosulfonilo, sililo, guanilo, guanidino, ureido, fosfonilo, amino y -NR^{x}R^{y}, donde R^{x} y R^{y} son como se han definido
anteriormente.
Un grupo "alquilo" se refiere a un hidrocarburo alifático, saturado, de cadena lineal o ramificada, incluyendo grupos de cadena lineal y ramificada. Preferiblemente, el grupo alquilo tiene de 1 a 20 átomos de carbono (siempre que se indique en este documento un intervalo numérico; por ejemplo, "1-20", significa que el grupo, en este caso el grupo alquilo, puede contener 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc. hasta e incluyendo 20 átomos de carbono). Más preferiblemente, es un alquilo de tamaño medio que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Más preferiblemente, es un alquilo inferior que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. El grupo alquilo puede estar sustituido o sin sustituir. Cuando están sustituidos, el grupo o grupos sustituyentes son preferiblemente uno o más seleccionados individualmente entre trihaloalquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, heteroalicicloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheteroalicicloxi, ciano, halo, nitro, carbonilo, tiocarbonilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tio-carbamilo, C-amido, C-tioamido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfinilo, sulfonilo, sulfonamido, trihalometanosulfonamido, trihalometanosulfonilo, y combinados, un anillo heteroalicíclico de cinco o seis miembros.
Un grupo "cicloalquilo" se refiere a un grupo de anillos monocíclicos o condensados con todos carbonos (es decir, anillos que comparten un par de átomos de carbono adyacentes) en le que uno o más anillos no tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. Son ejemplos de grupos cicloalquilo, pero sin limitación, ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexadieno, cicloheptano, cicloheptatrieno y adamantano. Un grupo cicloalquilo puede estar sustituido o sin sustituir. Cuando están sustituidos, el grupo o grupos sustituyentes son preferiblemente uno o más seleccionados individualmente entre alquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, heteroalicicloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheteroalicicloxi, ciano, halo, nitro, carbonilo, tiocarbonilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, C-tioamido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfinilo, sulfonilo, sulfonamido, trihalo-metanosulfonamido, trihalometanosulfonilo, sililo, guanilo, guanidino, ureido, fosfonilo, amino y -NR^{x}R^{y} con R^{x} y R^{y} como se han definido anteriormente.
Un grupo "alquenilo" se refiere a un grupo alquilo, como se ha definido en este documento, compuesto por al menos dos átomos de carbono y al menos un doble enlace carbono-carbono.
Un grupo "alquinilo" se refiere a un grupo alquilo, como se ha definido en este documento, compuesto por al menos dos átomos de carbono y al menos un triple enlace carbono-carbono.
Un grupo "hidroxi" se refiere a un grupo -OH.
Un grupo "alcoxi" se refiere a un grupo -O-alquilo y a un grupo -O-cicloalquilo, como se ha definido en este documento.
Un grupo "ariloxi" se refiere a un grupo -O-arilo y a un grupo -O-heteroarilo, como se ha definido en este documento.
Un grupo "heteroariloxi" se refiere a un grupo heteroaril-O- con heteroarilo como se ha definido en este documento.
Un grupo "heteroalicicloxi" se refiere a un grupo heteroalicíclico-O- con heteroalicíclico como se ha definido en este documento.
Un grupo "tiohidroxi" se refiere a un grupo -SH.
Un grupo "tioalcoxi" se refiere a un grupo S-alquilo y a un grupo -S-cicloalquilo, como se ha definido en este documento.
Un grupo "tioariloxi" se refiere a un grupo -S-arilo y a un grupo -S-heteroarilo, como se ha definido en este documento.
Un grupo "tioheteoariloxi" se refiere a un grupo heteroaril-S- con heteroarilo como se ha definido en este documento.
Un grupo "tioheteroalicicloxi" se refiere a un grupo heteroalicíclico-S- con heteroalicíclico como se ha definido en este documento.
Un grupo "carbonilo" se refiere a un grupo -C(=O)-R'', donde R'' se selecciona entre el grupo compuesto por hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo (unido a través de un carbono del anillo) y heteroalicíclico (unido a través de un carbono del anillo), cada uno como se ha definido en este documento.
Un grupo "aldehído" se refiere a un grupo carbonilo donde R'' es hidrógeno.
Un grupo "tiocarbonilo" se refiere a un grupo -C(=S)-R'', con R'' como se ha definido en este documento.
Un grupo "ceto" se refiere a un grupo -CC(=O)C- donde el carbono sobre un lado o ambos lados del C=O puede ser alquilo, cicloalquilo, arilo o un carbono de un grupo heteroarilo o heteroalicíclico.
Un grupo "trihalometanocarbonilo" se refiere a un grupo Z_{3}CC(=O)-, siendo Z un halógeno.
Un grupo "C-carboxi" se refiere a un grupo -C(=O)O-R'', con R'' como se ha definido en este documento.
Un grupo "O-carboxi" se refiere a un grupo R''C(=O)O-, con R'' como se ha definido en este documento.
Un grupo "ácido carboxílico" se refiere a un grupo C-carboxi en el que R'' es hidrógeno.
Un grupo "trihalometilo" se refiere a un grupo -CZ_{3}, en el que Z es un grupo halógeno como se ha definido en este documento.
Un grupo "trihalometanosulfonilo" se refiere a grupos Z_{3}CS(=O)_{2}- con Z como se ha definido anteriormente.
Un grupo "trihalometanosulfonamido" se refiere a un grupo Z_{3}CS(=O)_{2}NR^{x}- con Z y R^{x} como se han definido en este documento.
Un grupo "sulfinilo" se refiere a un grupo -S(=O)-R'', con R'' como se ha definido en este documento y, además, como un solo enlace; es decir, -S(O)-.
Un grupo "sulfonilo" se refiere a un grupo -S(=O)_{2}R'' con R'' como se ha definido en este documento y, además, como un solo enlace; es decir, -S(O)_{2}-.
Un grupo "S-sulfonamido" se refiere a un grupo -S(=O)_{2}NR^{X}R^{Y}, con R^{X} y R^{Y} como se han definido en este documento.
Un grupo "N-sulfonamido" se refiere a un grupo R''S(=O)_{2}NR_{x}- con R_{x} como se ha definido en este documento.
Un grupo "O-carbamilo" se refiere a un grupo -OC(=O)NR^{x}R^{y} como se ha definido en este documento.
Un grupo "N-carbamilo" se refiere a un grupo R^{x}OC(=O)NR^{y}, con R^{x} y R^{y} como se han definido en este documento.
Un grupo "O-tiocarbamilo" se refiere a un grupo -OC(=S)NR^{x}R^{y} con R^{x} y R^{y} como se han definido en este documento.
Un grupo "N-tiocarbamilo" se refiere a un grupo R^{x}OC(=S)NR^{y}- con R^{x} y R^{y} como se han definido en este documento.
Un grupo "amino" se refiere a un grupo -NH_{2}.
Un grupo "C-amido" se refiere a un grupo -C(=O)NR^{x}R^{y} con R^{x} y R^{y} como se han definido en este documento.
\newpage
Un grupo "C-tioamido" se refiere a un grupo -C(=S)NR^{x}R^{y}, con R^{x} y R^{y} como se han definido en este documento.
Un grupo "N-amido" se refiere a un grupo R^{x}C(O)NR^{y}-, con R^{x} y R^{y} como se han definido en este documento.
Un grupo "ureido" se refiere a un grupo NR^{x}C(=O)NR^{y}R^{y2} con R^{x} y R^{y} como se han definido en este documento y R^{y2} se define igual que R^{x} y R^{y}.
Un grupo "tioureido" se refiere a un grupo -NR^{x}C(=S)NR^{y}R^{y2} con R^{x} y R^{y} como se han definido en este documento y R^{y2} se define igual que R^{x} y R^{y}.
Un grupo "guanidino" se refiere a un grupo -R^{x}NC(=N)NR^{y}R^{y2}, con R^{x}, R^{y} y R^{y2} como se han definido en este documento.
Un grupo "guanilo" se refiere a un grupo R^{x}R^{y}NC(=N)-, con R^{x} y R^{Y} como se han definido en este documento.
Un grupo "ciano" se refiere a un grupo -CN.
Un grupo "sililo" se refiere a un grupo -Si(R'')_{3}, con R'' como se ha definido en este documento.
Un grupo "fosfonilo" se refiere a un grupo P(=O)(OR^{x})_{2} con R^{x} como se ha definido en este documento.
Un grupo "hidrazino" se refiere a un grupo -NR^{x}NR^{y}R^{y2} con R^{x}, R^{y} y R^{y2} como se han definido en este documento.
Dos grupos R adyacentes cualesquiera pueden combinarse para formar un anillo arilo, cicloalquilo, heteroarilo o heterocíclico adicional condensado con el anillo que tienen inicialmente los grupos R.
Se conoce en la técnica que los átomos de nitrógeno de los sistemas heteroarilo pueden "participar en un doble enlace de anillo heteroarilo", y esto se refiere a la forma de los dobles enlaces en las dos estructuras tautoméricas que comprenden grupos heteroarilo de anillo de cinco miembros. Esto dicta si los nitrógenos pueden estar sustituidos como se sabe bien por los químicos especialistas en la técnica. La descripción y las reivindicaciones de la presente invención se basan en los principios generales conocidos de unión química. Se entiende que las reivindicaciones no incluyen estructuras conocidas por ser inestables o incapaces de existir en base a la bibliografía.
Las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos profármaco descritos en este documento están dentro del alcance de esta invención. El término "sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en este documento y en las reivindicaciones, pretende incluir sales de adición de bases no tóxicas. El término "sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en este documento, también pretende incluir sales de grupos ácidos, tales como carboxilato o fosfato o monoéster de fosfato, con contraiones tales como amonio, sales de metales alcalinos, particularmente sodio o potasio, sales de metales alcalinotérreos, particularmente calcio o magnesio, sales de metales de transición, tales como cinc y sales con bases orgánicas adecuadas, tales como alquilaminas inferiores (metilamina, etilamina, ciclohexilamina y similares) o con alquilaminas inferiores sustituidas (por ejemplo, alquilaminas hidroxil-sustituidas tales como dietanolamina, trietanolamina o monotrometamina (también denominada TRIS o 2-amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol)tris(hidroximetil)-aminometano), lisina, arginina, histidina, N-metilglucamina, o con bases tales como piperidina o morfolina. Se entiende que ambas sales farmacéuticamente aceptables, cuando se aíslan en forma sólida o cristalina, también incluyen hidratos o moléculas de agua atrapadas dentro de la sustancia resultante del Compuesto I. Las posibilidades estequiométricas son bien conocidas por los especialistas en la técnica. En las siguientes referencias se incluyen discusiones de sales farmacéuticamente aceptables y listas de sales posibles:
Preparation of water-soluble compounds through salt formation. Stahl, P. Heinrich. Cosmas Consult, Freiburg im Breisgau, Alemania. Editor(es): Wermuth, Camille Georges. Practice of Medicinal Chemistry (2ª Edición) (2003), 601-615, Editor: Elsevier, Londres, Reino Unido CODEN: 69EOEZ.
Handbook of pharmaceutical salts: properties, selection, and use por Stahl, P. Heinrich, Wermuth, Camille G., International Union of Pure and Applied Chemistry. Weinheim; Nueva York: VHCA; Wiley-VCH, 2002.
\newpage
En otro aspecto de la invención, se describen nuevos Compuestos II intermedios de éster de fosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso de ésteres de fosfato, existe la posibilidad de mono o bis y los dos se incluyen en esta invención.
Como se usa en este documento, el término procedimiento del término "cantidad antiviral eficaz" se refiere a la cantidad total de cada componente activo del procedimiento que es suficiente para mostrar un beneficio significativo para el paciente, es decir, curación de afecciones agudas caracterizada por la inhibición de la infección por VIH. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, el término se refiere sólo a ese ingrediente. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan como resultado el efecto terapéutico, si se administran en combinación, en serie o simultáneamente. Las expresiones "tratar, para tratar y tratamiento", como se usan en este documento y en las reivindicaciones, significan prevenir o mejorar enfermedades asociadas con infección por VIH.
La presente invención también se refiere a combinaciones de los compuestos con uno o más agentes útiles en el tratamiento del SIDA. Por ejemplo, los compuestos de esta invención pueden administrarse de forma eficaz, a periodos de pre-exposición y/o post-exposición, junto con cantidades eficaces de los antivirales para el SIDA, inmunomoduladores, anti-infecciosos o vacunas, tales como los de la siguiente tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
300
301
302
303
304
305
306
307
308
Además, los compuestos de la invención de este documento pueden usarse junto con otra clase de agentes para tratar el SIDA que se denominan inhibidores de la entrada del VIH. Los ejemplos de tales inhibidores de la entrada del VIH se analizan en DRUGS OF THE FUTURE 1999, 24(12), págs. 1355-1362; CELL, Vol. 9, págs. 243-246, 29 de octubre de 1999; y DRUG DISCOVERY TODAY, Vol. 5, Nº 5, mayo de 2000, págs. 183-194 e Inhibitors of the entry of HIV in host cells. Meanwell, Nicholas A.; Kadow, John F. Current Opinion in Drug Discovery & Development (2003), 6(4), 451-4,61. Específicamente, los compuestos pueden utilizarse junto con otros inhibidores de la unión, inhibidores de la fusión y antagonistas de receptores de quimioquinas destinados al correceptor CCR5 o
CXCR4.
Se apreciará que el alcance de las combinaciones de los compuestos de esta invención con antivirales para el SIDA, inmunomoduladores, anti-infecciosos, inhibidores de la entrada del VIH o vacunas, no se limita a la lista de la Tabla anterior sino que incluye, en principio, cualquier combinación con cualquier composición farmacéutica útil para el tratamiento del SIDA.
Las combinaciones preferidas son tratamientos simultáneos o alternantes con un compuesto de la presente invención y un inhibidor de la proteasa del VIH y/o un inhibidor no nucleósido de la transcriptasa inversa del VIH. Un cuarto componente opcional en la combinación es un inhibidor nucleósido de la transcriptasa inversa del VIH, tal como AZT, 3TC, ddC o ddI. Un inhibidor preferido de la proteasa del VIH es Reyataz® (ingrediente activo Atazanavir). Típicamente, se administra una dosis de 300 a 600 mg una vez al día. Ésta puede co-administrarse con una dosis baja de Ritonavir (de 50 a 500 mg). Otro inhibidor preferido de la proteasa del VIH es Kaletre®. Otro inhibidor útil de la proteasa del VIH es indinavir, que es la sal sulfato de etanolatode N-(2(R)-hidroxi-1-(S)-indanil)-2(R)-fenilmetil-4-(S)-hidroxi-5-(1-(4-(3-piridil-metil)-2(S)-N'-(t-butilcarboxamido)-piperazinil))-pentanoamida, y se sintetiza de acuerdo con el documento U.S. 5.413.999. Indinavir se administra en general a una dosificación de 800 mg tres veces al día. Otros inhibidores de proteasa preferidos son nelfinavir y ritonavir. Otro inhibidor preferido de la proteasa del VIH es saquinavir que se administra en una dosificación de 600 ó 1200 mg tres veces al día. Los inhibidores no nucleósidos preferidos de la transcripatasa inversa del VIH incluyen efavirenz. La preparación de ddC, ddI y AZT también se describe en el documento EPO 0.484.071. Estas combinaciones pueden tener efectos inesperados en la limitación de la propagación y grado de infección del VIH. Las combinaciones preferidas incluyen las que se producen con los siguientes (1) indinavir con efavirenz, y, opcionalmente, AZT y/o 3TC y/o ddI y/o ddC; (2) indinavir, y cualquiera de AZT y/o ddI y/o ddC y/o 3TC, en particular, indinavir y AZT y 3TC; (3) estavudina y 3TC y/o zidovudina; (4) zidovudina y lamivudina y 141W94 y 1592U89; (5) zidovudina y lamivudina.
En tales combinaciones, el compuesto de la presente invención y otros agentes activos pueden administrarse por separado o conjuntamente. Además, la administración de un elemento puede realizarse con anterioridad, a la vez, o después de la administración del otro agente o agentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Abreviaturas
Las siguientes abreviaturas, de las que la mayoría son abreviaturas convencionales bien conocidas por los especialistas en la técnica, se usan a lo largo de la descripción de la invención y de los ejemplos. Algunas de las abreviaturas usadas son las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
h =
hora(s)
t.a. =
temperatura ambiente
mol =
mol(es)
mmol =
milimol(s)
g =
gramo(s)
mg =
miligramo(s)
ml =
mililitro(s)
TFA =
Ácido Trifluoroacético
DCE =
1,2-Dicloroetano
CH_{2}Cl_{2} =
Diclorometano
TPAP =
Perrutenato de tetrapropilamonio
THE =
Tetrahidrofurano
DEPBT =
3-(Dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona
DMAP =
4-dimetilaminopiridina
P-EDC =
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida con soporte de polímero
EDC =
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
DMF =
N,N-dimetilformamida
Base de Hunig =
N,N-Diisopropiletilamina
MCPBA =
Ácido meta-Cloroperbenzoico
azaindol =
1H-Pirrolo-piridina
4-azaindol =
1H-pirrolo[3,2-b]piridina
5-azaindol =
1H-Pirrolo[3,2-c]piridina
6-azaindol =
1H-pirrolo[2,3-c]piridina
7-azaindol =
1H-Pirrolo[2,3-b]piridina
4,6-diazaindol =
5H-Pirrolo[3,2-d]pirimidina
5,6-diazaindol =
1H-Pirrolo[2,3-d]piridazina
5,7-diazaindol =
7H-Pirrolo[2,3-d]pirimidina
PMB =
4-Metoxibencilo
DDQ =
2,3-Dicloro-5, 6-diciano-1,4-benzoquinona
OTf =
Trifluorometanosulfonoxi
NMM =
4-Metilmorfolina
PIP-COPh =
1-Benzoilpiperazina
NaHMDS =
Hexametildisilazida sódica
EDAC =
1-(3-Dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
TMS =
Trimetilsililo
DCM =
Diclorometano
DCE =
Dicloroetano
MeOH =
Metanol
THE =
Tetrahidrofurano
EtOAc =
Acetato de Etilo
LDA =
Diisopropilamida de litio
TMP-Li =
2,2,6,6-tetrametilpiperidinillitio
DME =
Dimetoxietano
DIBALH =
Hidruro de diisobutilaluminio
HOBT =
1-hidroxibenzotriazol
CBZ =
Benciloxicarbonilo
PCC =
Clorocromato de piridinio
TRIS =
Trometamina o 2-amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol
\vskip1.000000\baselineskip
Química
La presente invención comprende compuestos de Fórmula I, sus formulaciones farmacéuticas y su uso en pacientes que padecen o son sensibles a infección por VIH.
El Esquema A representa una visión general del procedimiento para preparar los profármacos I de la invención a partir de las moléculas parentales IV.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página siguiente)
\newpage
Esquema A
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema B
15
Para elaborar el procedimiento, como se muestra en el Esquema A, el compuesto parental antiviral de interés, IV, se convierte en el intermedio de fosfato II, por N-alquilación con el intermedio de cloruro III, en presencia de una base adecuada tal como hidruro sódico, hidruro potásico, amida sódica, t-butóxido sódico, (bis-trimetilsilil)amida sódica, (bis-trimetilsilil)amida potásica o combinaciones de los mismos, tales como hidruro sódico más bis(trimetilsilil)amida sódica. La preparación del reactivo III y la metodología para el uso en la preparación de profármacos por los grupos de alquilación hidroxi se ha descrito en R. Ueda y col., Patente de Estados Unidos 6.362.172B2 que se incorpora como referencia en su totalidad. Las condiciones de alquilación, grupos protectores, retirada de grupos protectores y condiciones para la formación de sales son aplicables en general a esta solicitud a pesar del hecho de que se alquila un azaindol en el anillo indol en lugar de un grupo hidroxi. En la presente solicitud, pueden utilizarse de 1,1 a 5,0 equivalentes de base, prefiriéndose 2 y 4 equivalentes. Pueden usarse de 1,1 hasta 12 equivalentes del reactivo III, prefiriéndose de 5 a 10, dependiendo del sustrato. El reactivo puede añadirse en una porción o de manera creciente en varias porciones a lo largo del tiempo. Habitualmente, a la reacción se le añade una fuente de ión yoduro para proporcionar rendimientos crecientes. Actualmente, se prefiere el yodo elemental como fuente de yoduro. Habitualmente, se añaden de 0,1 a 1,5 equivalentes de yodo por azaindol/indol, alquilándose el NH, prefiriéndose de 1,0 a 1,2 equivalentes de yodo puesto que los rendimientos son aún mayores. Las fuentes alternativas de yodo incluyen, por ejemplo, yoduro sódico, yoduro de litio, yoduro de cesio, yoduro de cobre o yoduro de tetrabutilamonio. Se supone que la función del yodo genera el reactivo de yodometilo III correspondiente in situ a partir del reactivo de clorometilo III. Los reactivos de yodo o bromo correspondientes a III pueden usarse igualmente directamente en la reacción en lugar del cloruro III. La reacción de alquilación de la etapa A se realiza normalmente en un disolvente orgánico inerte, tal como tetrahidrofurano a una temperatura de aproximadamente 0ºC a 50ºC, más preferiblemente entre 20ºC y 40ºC. También pueden encontrar utilidad otros disolventes orgánicos anhidros, tales como metiltetrahidrofurano, metil t-butil éter, dioxano, éter dimetílico y etilenglicol, dimetilacetamida o N,N-dimetilformamida. Después, el intermedio de éster II se somete a una etapa de desprotección convencional para retirar los grupos protectores Pr. Los reactivos usados en dicha etapa dependerán del grupo protector usado, pero serán bien conocidos por los especialistas en la técnica. El grupo protector más preferido es el grupo t-butilo que puede retirarse con ácido trifluoroacético, ácido clorhídrico o ácido fórmico en un disolvente orgánico inerte apropiado. El disolvente inerte puede ser diclorometano, o posiblemente, por ejemplo, dicloroetano, tolueno o trifluorometilbenceno. En cloruro de metileno, la desprotección con ácido trifluoroacético puede realizarse usando de 1 a 15 equivalentes de ácido (o el ácido puede medirse de manera diferente, como por ejemplo, una solución al 5% en disolvente, en volumen) y a temperaturas comprendidas entre 0ºC y 40ºC. En general, cuanto mayor sea el exceso de TFA empleado, menor será la temperatura utilizada. Las condiciones exactas varían con el sustrato. La etapa 3 describe el aislamiento del ácido libre o de las sales que pueden formarse mediante muchas rutas convencionales que son bien conocidas en la técnica. En general, después de la desprotección con TFA, se emplea un tratamiento acuoso en el que el exceso de ácido se neutraliza con una base y las impurezas orgánicas se retiran por extracción con un disolvente orgánico tal como acetato de etilo o diclorometano. Por ejemplo, puede usarse exceso de NaOH acuoso para basificar la mezcla de reacción. Esto se conoce bien por cualquier especialista en la técnica. La reacidificación de la fase acuosa a pH 2,5 con HCl acuoso 1 N y después extracción con un disolvente orgánico proporcionará, después de la retirada del disolvente al vacío, el ácido libre. El ácido libre puede convertirse en sales inorgánicas mediante la adición de bases apropiadas en disolventes tales como agua, metanol, etanol, etc. Por ejemplo, la adición de carbonato sódico a una solución acuosa de profármaco de fosfato y el ajuste del pH a aproximadamente 7,6 proporciona una solución que, después de la retirada del agua por liofilización, deja la sal disódica del profármaco. También puede usarse de forma similar carbonato potásico. También pueden usarse de forma similar soluciones acuosas de bicarbonato sódico o bicarbonato potásico. También pueden generarse sales monopotásicas o monosódicas por titulación cuidadoso de soluciones de ácido fosfato con 2-etilhexanoato de sodio o potasio. Pueden generarse sales de amina disolviendo el ácido libre en disolventes orgánicos tales como acetato de etilo o acetonitrilo o alcoholes de bajo peso molecular o mezclas de estos disolventes que contienen opcionalmente agua. Algunas aminas potencialmente útiles para la formación de sales incluyen: alquilaminas inferiores (metilamina, etilamina, ciclohexilamina y similares) o alquilaminas inferiores sustituidas (por ejemplo, alquilaminas hidroxil-sustituidas tales como dietanolamina, trietanolamina o tris(hidroximetil)-aminometano), lisina, arginina, histidina, N-metilglucamina, o bases tales como piperidina o morfolina. La adición lenta de una amina a una solución en agitación a baja temperatura puede proporcionar la sal mono o bis amina dependiendo de la estequiometría. También pueden obtenerse sales de amina agitando la solución y retirando el disolvente al vacío en lugar de realizar cristalización o precipitación. Los procedimientos de recristalización variarán según el compuesto y la sal, pero serán conocidos por los especialistas en la técnica. El Esquema B representa una secuencia y una serie de reactivos y condiciones para realizar la secuencia general mostrada en el Esquema A. Puede utilizarse un procedimiento alternativo, y en muchos casos, preferido, para realizar la secuencia de la etapa C que incluye la desprotección del diéster para proporcionar el ácido intermedio in situ seguido de formación de la sal en el medio de reacción. Por ejemplo, el calentamiento del diéster II en una mezcla de agua y un codisolvente miscible en agua tal como, por ejemplo, acetona, metanol, etanol o isopropanol puede producir el ácido libre de I en el medio de reacción (in situ). Un disolvente preferido es acetona e isopropanol. Pueden utilizarse temperaturas comprendidas entre la temperatura ambiente y los puntos de ebullición de los disolventes. Típicamente, el intervalo preferido es de 40ºC a 60ºC. La adición de unao más bases, preferiblemente una amina, como se ha descrito anteriormente, a la mezcla de reacción que contiene el ácido libre en el agua y el codisolvente, puede producir la sal directamente. Si se seleccionan las condiciones apropiadas, la sal puede cristalizar o precipitar directamente del medio de reacción y puede aislarse por filtración y secado. Los ejemplos específicos se incluyen en la sección experimental.
El procedimiento preferido de preparación de los intermedios IIa, IIb y IIc y de los ácidos Iac, Ibc e Ic ofrece varias ventajas significativas sobre los procedimientos usados inicialmente para la preparación de IIa, IIb y IIc durante los esfuerzos de investigación exploratoria. Las rutas de descubrimiento inicial para la preparación de los tres intermedios II usaba una preparación de clorometilfosfato de di-terc-butilo que requería el uso muy costoso de di-terc-butilfosfato de tetrabutilamonio que se hacía reaccionar con un exceso de 10 veces de cloroyodometano potencialmente peligroso y muy costoso. El exceso de volátiles y yodometano se retiró al vacío para proporcionar el reactivo bruto, que se usó sin purificación adicional. Se usó al menos un exceso de 5 veces de este reactivo para reaccionar con los compuestos IV, lo que significa que se usaron al menos 5 equivalentes de fosfato de tetrabutilamonio y 50 equivalentes de cloroyodometano en comparación con las cantidades de IVa, b o c. Además, la alquilación de los compuestos IV con este reactivo se consiguió usando NaH como base y yodo como aditivo para promover la alquilación. Estas condiciones produjeron una mezcla de reacción que contenía el compuesto deseado II como producto principal y productos secundarios que se retiraron usando cromatografía sobre gel de sílice, una operación tediosa, larga y cara, especialmente en reacciones de aumento de escala. El fracaso al retirar los productos secundarios dio como resultado los productos I de la siguiente etapa, la retirada de los grupos protectores, que contenían impurezas que eran muy difíciles de retirar de una manera satisfactoria con un rendimiento o en un marco de tiempo razonable.
La preparación mejorada de clorometilfosfato de di-terc-butilo utiliza menos cantidad del costoso di-terc-butil fosfato potásico y sólo un exceso de aproximadamente 2 veces de este reactivo en comparación con el otro reactivo de cloruro de clorometilsulfonilo. El clorometilfosfato de di-terc-butilo preparado por este procedimiento se aísla en forma pura por destilación conveniente.
Para la conversión de IVa en IIa, sólo se usaron 1,2 equivalentes de este reactivo para alquilar los compuestos IV. Además, se usó una base menos reactiva y económica, carbonato potásico, junto con DMSO para conseguir una alquilación en la que se produjeron los compuestos II lo suficientemente libres de productos secundarios para que pudieran usarse sin purificación cromatográfica como aportes para la reacción de desprotección. Puede obtenerse el ácido libre Iac o sales tales como Iab, por ejemplo, en forma pura a partir de IIa preparado de esta manera sin cromatografía.
Para la síntesis de los compuestos IIb y IIc, que reaccionan más lentamente que IVa, se emplearon de 2 a 2,5 equivalentes de clorometilfosfato de di-terc-butilo y se usaron condiciones modificadas (carbonato de cesio como base con KI en el disolvente, NMP) para alquilar IVb y IVc y realizar una alta conversión en IIb y IIc, respectivamente.
De nuevo, las condiciones proporcionaron compuestos IT con una pureza suficiente para que pudieran usarse para producir compuestos I sin necesidad de purificación cromatográfica. Por lo tanto, las nuevas condiciones reducen las cantidades y la estequiometría de los reactivos necesarias para preparar el compuesto I de esta invención y evitan la necesidad de purificación cromatográfica de los intermedios II. Los materiales de partida empleados para preparar el clorometilfosfato de di-terc-butilo son más económicos y menos peligrosos y el producto final se produce con una pureza superior. Finalmente, las condiciones desarrolladas para la alquilación de IVa, IVb y IVc eliminan la necesidad de una base de hidruro sódico reactiva e inflamable que se había usado en exceso y empleaba carbonato potásico o de cesio.
En la etapa de alquilación, puede usarse una base adecuada tal como M_{2}CO_{3} (M es litio, sodio, potasio, rubidio o cesio). Para convertir IVa en IIa, se prefiere K_{2}CO_{3} (1-5 equivalentes molares, preferiblemente 2 equivalentes molares por mol de IVa). Para convertir IVb en IIb o IVc en IIc, se prefiere carbonato de cesio.
Además, se necesita un disolvente adecuado tal como dimetilsulfóxido, N-dimetilformamida, acetona, acetonitrilo, N-metilpirrolidinona, formamida, tetrahidrofurano, etc. (2-50 ml/gramo de IV, prefiriéndose 5 ml/gramo); se prefiere dimetilsulfóxido para convertir IVa en IIa; se prefiere N-metilpirrolidinona para convertir IVb en IIb o IVc en IIc.
Una fuente disolvente de yodo adecuada incluye, pero sin limitación, MI (M es, por ejemplo, litio, sodio, potasio, yodo, tetrabutilamonio, etc.); prefiriéndose yoduro potásico (0,1-5 equivalentes molares/mol del Compuesto IV; prefiriéndose 2 equivalentes).
El agente de alquilación, clorometilfosfato de di-terc-butilo, puede usarse en 1-10 equivalentes molares por mol de IV; pero se prefieren aproximadamente 1,2 equivalentes molares.
La temperatura de reacción puede estar entre 10-60ºC (se prefieren 30ºC).
En la etapa de desprotección, cuando los dos grupos terc-butilo se retiran de IIa para formar Iac, ésta se realiza en presencia de un disolvente adecuado tal como diclorometano (preferido), dicloroetano, cloroformo, tetracloruro de carbono, tolueno, benceno, etc. (2-50 ml/gramo de IV, preferiblemente 10 ml/gramo)
Para la desprotección de IIb y IIc para obtener Ibc e Ic, respectivamente, ésta se realiza en acetona/agua a una temperatura de aproximadamente 40ºC.
Además, durante la desprotección de IIa, se prefiere la presencia de un ácido tal como ácido trifluoroacético (preferido), clorhídrico, sulfúrico, nítrico, etc. (2-100 equivalentes molares basándose en IVa, prefiriéndose 15 equivalentes molares).
Química General
Se incluyen preparaciones adicionales de materiales de partida y precursores en Wang y col., Patente de Estados Unidos 6.476.034 concedida el 5 de noviembre de 2002 que se incorpora por referencia en su totalidad.
Los datos de cromatografía de líquidos (CL) se registraron en un cromatógrafo de líquidos Shimadzu LC-10AS usando un detector de UV-Vis SPD-10AV determinando los datos de espectrometría de masas (EM) mediante el uso de una Plataforma Micromass para CL en modo de electronebulización.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Procedimiento de CL/EM (es decir, identificación de compuestos)
Columna A: columna YMC ODS-A S7 de 3,0 x 50 mm
Columna B: columna PHX-LUNA C18 de 4,6 x 30 mm
Columna C: columna XTERRA ms C18 de 4,6 x 30 mm
Columna D: columna YMC ODS-A C18 de 4,6 x 30 mm
Columna E: columna YMC ODS-A C18 de 4,6 x 33 mm
Columna F: columna YMC C18 S5 de 4,6 x 50 mm
Columna G: columna XTERRA C18 S7 de 3,0 x 50 mm
Columna H: columna YMC C18 S5 de 4,6 x 33 mm
Columna I: columna YMC ODS-A C18 S7 de 3,0 x 50 mm
Columna J: columna XTERRA C-18 S5 de 4,6 x 50 mm
Columna K: columna YMC ODS-A C18 de 4,6 x 33 mm
Columna L: columna Xterra MS C18 5 \muM de 4,6 x 30 mm
Columna M: columna YMC ODS-A C18 S3 de 4,6 x 33 mm
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones convencionales para la realización de CL (usadas a menos que se indique otra cosa)
Gradiente: de 100% de Disolvente A/0% de Disolvente B a 0% de Disolvente A/100% de Disolvente B
Disolvente A = 10% de MeOH - 90% de H_{2}O - 0,1% de TFA,
Disolvente B = 90% de MeOH - 10% de H_{2}O - 0,1% de TFA; y T_{R} en min.
Tiempo de gradiente: 2 minutos
Tiempo de mantenimiento de 1 minuto
Caudal: 5 ml/min
Longitud de onda del detector: 220 nm
Disolvente A: 10% de MeOH/90% de H_{2}O/0,1% de Ácido Trifluoroacético
Disolvente B: 10% de H_{2}O/90% de MeOH/0,1% de Ácido Trifluoroacético
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones B alternativas para la realización de CL
Gradiente: de 100% de Disolvente A/0% de Disolvente B a 0% de Disolvente A/100% de Disolvente B
Disolvente A = 10% de MeOH - 90% de H_{2}O - 0,1% de TFA,
Disolvente B = 90% de MeOH - 10% de H_{2}O - 0,1% de TFA; y T_{R} en min.
Tiempo de gradiente: 4 minutos
Tiempo de mantenimiento de 1 minuto
Caudal: 4 ml/min
Longitud de onda del detector: 220 nm
Disolvente A: 10% de MeOH/90% de H_{2}O/0,1% de Ácido Trifluoroacético
Disolvente B: 10% de H_{2}O/90% de MeOH/0,1% de Ácido Trifluoroacético
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los compuestos purificados por HPLC preparativa se diluyeron en MeOH (1,2 ml) y se purificaron usando los siguientes procedimientos en un sistema de HPLC preparativa automatizado Shimadzu LC-10A o en un sistema de HPLC preparativa automatizado Shimadzu LC-8A con la misma longitud de onda del detector (SPD-10AV UV-VIS) y los mismos sistemas de disolventes (A y B) indicados anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento de HPLC preparativa (es decir, purificación de compuestos)
Procedimiento de purificación: gradiente inicial (40% de B, 60% de A) aumentando hasta el gradiente final (100% de B, 0% de A) durante 20 minutos, mantenido durante 3 minutos (100% de B, 0% de A)
Disolvente A: 10% de MeOH/90% de H_{2}O/0,1% de Ácido Trifluoroacético
Disolvente B: 10% de H_{2}O/90% de MeOH/0,1% de Ácido Trifluoroacético
Columna: columna YMC C18 S5 de 20 x 100 mm
Longitud de onda del detector: 220 nm
\vskip1.000000\baselineskip
Para los siguientes procedimientos experimentales, se emplearon las siguientes condiciones o modificaciones de HPLC de los procedimientos convencionales:
condiciones de HPLC para la pureza por CL convencional:
Detección a 254 nm; Gradiente de 0-100% de B/A; A 10% de CH_{3}CN-90% de H_{2}O-0,1% de TFA, B 90% de CH_{3}CN-10% de H_{2}O-0,1% de TFA; Tiempo de gradiente 4 min; Columna YMC
ODS-AQ u ORD-A de 4,6 x 50 mm y 3 micrómetros.
\vskip1.000000\baselineskip
condiciones de HPLC para el análisis por CL/EM:
Columna J: columna XTERRA C-18 S5 de 4,6 x 50 mm, Gradiente: de 100% de Disolvente A/0% de Disolvente B a 0% de Disolvente A/100% de Disolvente B
Disolvente A = 10% de MeOH - 90% de H_{2}O - 0,1% de TFA,
Disolvente B = 90% de MeOH - 10% de H_{2}O - 0,1% de TFA; y T_{R} en min;
Tiempo de gradiente: 3 minutos; Caudal: 4 ml/min; Longitud de onda del detector: 220 nm
Los materiales de partida pueden adquirirse de fuentes comerciales o prepararse usando procedimientos bibliográficos.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de compuestos parentales IV
La preparación de los compuestos parentales IV se ha descrito previamente en las siguientes referencias, que se incorporan como referencia en su totalidad:
Patente de Estados Unidos 6.469.006 concedida el 22 de octubre de 2002 a W. S. Blair y col.;
Patente de Estados Unidos 6.476.034 concedida el 5 de noviembre de 2002 a Wang y col.;
Patente de Estados Unidos 6.573.262 concedida el 3 de junio de 2003 a Meanwell y col.;
Documento U.S. con Número de Serie 10/630.278 presentado el 30 de julio de 2003 por J. Kadow y col.; que es una continuación en parte del documento U.S. con Número de Serie 10/214.982 presentado el 7 de agosto de 2002, que es una continuación en parte del documento U.S. con Número de Serie 10/038.306 presentado el 2 de enero de 2002; que corresponde al documento PCT WO 02/062423, presentado el 2 de enero de 2002, publicado el 15 de agosto de 2002;
documento U.S. con Número de Serie 10/871.931 presentado el 18 de junio de 2004 por Yeung y col.;
documento U.S. con Número de Serie 10/762.108 presentado el 21 de enero de 2004 por Wang y col., correspondiente al documento PCT WO 2004/043337 publicado el 27 de mayo de 2004:
A continuación se proporcionan procedimientos detallados seleccionados:
Procedimiento típico para la preparación de intermedios para la preparación de compuestos parentales IV 1) Preparación del Azaindol 1
16
Preparación de azaindol, Procedimiento A: Preparación de 7-Cloro-6-azaindol 1e: Se disolvió 2-Cloro-3-nitropiridina 22e (5,0 g) en THF seco (200 ml). Después de enfriar la solución a -78ºC, se añadió un exceso de bromuro de vinilmagnesio (1,0 M en THF, 100 ml). Después, la reacción se dejó a -20ºC durante ocho horas antes de interrumpirse con NH_{4}Cl al 20% (150 ml). La fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 150 ml). La fase orgánica combinada se secó sobre MgSO_{4}. Después de la filtración y la concentración, el producto bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice, proporcionando 1,5 g de 7-cloro-6-azaindol 1e con un rendimiento del 31%. Los compuestos 5an, IVa y 5ap se describen a continuación.
17
El compuesto 1am, 4-bromo-7-cloro-6-azaindol (sólido amarillo) se preparó por el mismo procedimiento usado para el azaindol Ie pero el material de partida empleado fue 5-bromo-2-cloro-3-nitropiridina. (disponible en Aldrich, Co.). EM m/z: (M+H)^{+} calc. para C_{7}H_{5}BrClN_{2}: 230,93; encontrado 231,15, tiempo de retención de HPLC: 1,62 minutos (columna B).
18
Compuesto 1an (4-metoxi-7-cloro-6-azaindol) y Compuesto 1ao (4,7-dimetoxi-6-azaindol): Una mezcla de 4-bromo-7-cloro-6-azaindol (1 g), CuI (0,65 g) y NaOMe (4 ml, 25%) en MeOH (16 ml) se calentó a 110-120ºC durante 16 horas en un tubo cerrado herméticamente. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se neutralizó con HCl 1 N para alcanzar pH 7. La solución acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 30 ml). Después, la fase orgánica combinada se secó sobre MgSO_{4} y se concentró al vacío, proporcionando un residuo, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (50 g) usando 1:7 de EtOAc:hexano como eluyente. (dimensiones de la columna: 20 mm x 30 cm) para dar 0,3 g de 4-metoxi-7-cloro-6-azaindol (sólido blanco) y 0,1 g de 4,7-dimetoxi-6-azaindol (sólido blanco).
Compuesto 1an (4-metoxi-7-cloro-6-azaindol). EM m/z: (M+H)^{+} calc. para C_{8}H_{8}ClN_{2}O: 183,03; encontrado
183,09, tiempo de retención de HPLC: 1,02 minutos (columna B).
Compuesto 1ao (4,7-dimetoxi-6-azaindol). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,28 (m, 2H), 6,63 (m, 1H), 4,14 (s, 3H), 3,95 (s, 3H). EM m/z: (M+H)^{+} calc. para C_{9}H_{11}N_{2}O_{2}: 179,08; encontrado 179,05, tiempo de retención de HPLC: 1,36 minutos (columna B).
19
Acilación de azaindol, procedimiento B: Preparación de (5-azaindol-3-il)-oxoacetato de metilo 2b: Se añadió 5-Azaindol (1b) (0,5 g, 4,2 mmol) a una suspensión de AlCl_{3} (2,8 g, 21,0 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (100 ml). La agitación se continuó a temperatura ambiente durante 1 hora antes de que se añadiera gota a gota clorooxoacetato de metilo (2,5 g, 21,0 mmol). La reacción se agitó durante 8 horas. Después de que se añadieran cuidadosamente 20 ml de MeOH para interrumpir la reacción, los disolventes se retiraron al vacío. El residuo sólido se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (EtOAc/MeOH = 10:1), proporcionando 0,6 g (70%) del producto acilado 2b.
\vskip1.000000\baselineskip
Caracterización de compuestos 2 
\vskip1.000000\baselineskip
20
Compuesto 2b ((5-azaindol-3-il)-oxoacetato de metilo): ^{1}H RMN (500 MHz, CD_{3}OD) \delta 9,61 (s, 1H), 9,02 (s, 1H), 8,59 (d, 1H, J = 6,63 Hz), 8,15 (d, 1H, J = 6,60 Hz), 4,00 (s, 3H); ^{13}C RMN (125 MHz, CD_{3}OD) \delta 178,9, 163,0, 145,6, 144,2, 138,3, 135,0, 124,7, 116,3, 112,1, 53,8. EM m/z: (M+H)^{+} calc. para C_{10}H_{9}N_{2}O_{3}: 205,06; encontrado 205,04, tiempo de retención de HPLC: 0,32 minutos (columna A).
\vskip1.000000\baselineskip
21
El Compuesto 2ao ((4,7-dimetoxi-6-azaindol-3-il)-oxoacetato de metilo) se preparó por el mismo procedimiento que se usó para el compuesto 2b pero el material de partida empleado fue 4,7-dimetoxi-6-azaindol. El compuesto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice usando 2:3 de EtOAc:Hexano como eluyente para dar un aceite amarillo: ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 9,50 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 7,47 (s, 1H), 4,39 (c, 2H, J = 7,05 Hz), 4,13 (s, 3H), 3,93 (s, 3H), 1,40 (t, 3H, J = 7,2 Hz). EM m/z: (M+H)^{+} calc. para C_{13}H_{15}N_{25}: 279,10; encontrado 279,16, tiempo de retención de HPLC: 1,28 minutos (columna B).
\vskip1.000000\baselineskip
22
2) Preparación de azaindol 3-glioxilato de potasio 3
23
Preparación de (7-azaindol-3-il)-oxoacetato de potasio 3a: El Compuesto 2a (43 g, 0,21 mol) y K_{2}CO_{3} (56,9 g, 0,41 mol) se disolvieron en MeOH (200 ml) y H_{2}O (200 ml). Después de 8 horas, el producto 3a precipitó de la solución. La filtración proporcionó 43 g del compuesto 3a en forma de un sólido blanco con un rendimiento del
90,4%.
\vskip1.000000\baselineskip
Caracterización de compuestos 3
Compuesto 3a, (7-azaindol-3-il)-oxoacetato de potasio: ^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 8,42 (d, 1H, J = 7,86 Hz), 8,26 (d, 1H, J = 4,71 Hz), 8,14 (s, 1H), 7,18 (dd, 1H, J = 7,86, 4,71 Hz); ^{13}C RMN (75 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 169,4, 148,9, 143,6, 135,1, 129,3, 118,2, 117,5, 112,9. EM m/z: (N4+H)^{+} del ácido correspondiente del compuesto 3a (3a-K+H) calc. para C_{9}H_{7}N_{2}O_{3}: 191,05; encontrado 190,97, tiempo de retención de HPLC: 0,48 minutos (columna A).
El Compuesto 3ao ((4,7-dimetoxi-6-azaindol-3-il)-oxoacetato de potasio) se preparó (en forma de un sólido amarillo) por el mismo procedimiento usado para preparar el compuesto 3a con la excepción de que se empleó (4,7-dimetoxi-6-azaindol-3-il)-oxoacetato de etilo como material de partida. EM m/z: (M+H)^{+} del ácido correspondiente del compuesto 3ao (M-K+H)^{+} calc. para C_{11}H_{11}N_{2}O_{5}: 251,07; encontrado 251,09, tiempo de retención de HPLC: 0,69 minutos (columna B).
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento de Ejemplo de Prep. de 5a
24
Preparación de (R)-N-(benzoil)-3-metil-N'-[(7-azaindol-3-il)-oxoacetil]-piperazina 5a: Se combinaron 3-glioxilato de 7-azaindol 3a (25,4 g, 0,111 mol), (R)-3-metil-N-benzoilpiperazina 4a (22,7 g, 0,111 mol), 3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona (DEPBT) (33,3 g, 0,111 mol) y Base de Hunig (28,6 g, 0,222 mol) en 500 ml de DMF. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas.
La DMF se retiró por evaporación a presión reducida y el residuo se repartió entre acetato de etilo (2000 ml) y una solución acuosa al 5% de Na_{2}CO_{3} (2 x 400 ml). La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 300 ml). La fase orgánica se combinó y se secó sobre MgSO_{4} anhidro. La concentración al vacío produjo un producto bruto, que se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice con EtOAc/MeOH (50:1) para dar 33 g del producto 5a con un rendimiento del 81%.
\vskip1.000000\baselineskip
Caracterización de compuestos 5 con la siguiente sub-estructura
25
Compuesto 5a, n = 2, R_{7-13} = H, R_{14} = (R)-Me, (R)-N-(benzoil)-3-metil-N'-[(7-azaindol-3-il)-oxoacetil]-piperazina: ^{1}H RMN (300 MHz, CD_{3}OD) \delta 8,57 (d, 1H, J = 5,97 Hz), 8,38 (d, 1H, J = 4,20 Hz), 8,27 (m, 1H), 7,47 (s, 5H), 7,35 (t, 1H, J = 5,13 Hz), 4,75-2,87 (m, 7H), 1,31 (a, 3H); ^{13}C RMN (75 MHz, CD_{3}OD) \delta 185,6, 172,0, 166,3, 148,9, 144,6, 137,0, 134,8, 130,2, 129,9, 128,4, 126,6, 118,6, 118,0, 112,2, 61,3, 50,3, 45,1, 35,5, 14,9, 13,7. EM m/z: (M+H)^{+}
calc. para C_{21}H_{21}N_{4}O_{3}: 377,16; encontrado 377,18, tiempo de retención de HPLC: 1,21 minutos (columna A). Anál. calc. para C_{21}H_{20}N_{4}O_{3}: C, 67,01; H, 5,36; N, 14,88. Encontrado: C, 66,01; H, 5,35; N, 14,61.
26
El Compuesto IVa, N-(benzoil)-N'-[(4,7-dimetoxi-6-azaindol-3-il)-oxoacetil]piperazina, se preparó por el mismo procedimiento usado para preparar el compuesto 5a pero el material de partida fue (4,7-dimetoxi-6-azaindol-3-il)-oxoacetato de potasio. El compuesto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice usando EtOAc como disolvente de elución para dar un sólido blanco. ^{1}H RMN (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,0 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,40 (m, 6H), 4,00 (s, 3H), 3,83 (s, 3H), 3,63-3,34 (m, 8H); ^{13}C RMN (125 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 185,5, 169,3, 166,5, 146,2, 145,7, 136,6, 135,3, 129,6, 128,4, 126,9, 122,2, 122,1, 119,2, 114,4, 56,8, 52,9, 45,5, 39,9. EM m/z: (M+H)^{+} calc. para C_{22}H_{23}N_{4}O_{5}: 423,17; encontrado 423,19, tiempo de retención de HPLC: 1,33 minutos (columna B). Anál. calc. para C_{22}H_{21}N_{4}O_{5}: C, 62,7; H, 5,02; N, 13,29. Encontrado: C, 61,92; H, 5,41; 13,01. Punto de fusión: 229,5-232ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimientos para la preparación de compuestos parentales IVC Preparación de 3-metil-1,2,4-triazol (2-81)
27
Procedimiento: Una mezcla sólida de hidrazida fórmica (68 g, 1,13 mol) y tioacetamida (85 g, 1,13 mol) en un matraz de fondo redondo de 500 ml se calentó con agitación a 150ºC (temp. del baño de aceite) durante 1,5 h con una corriente suave de nitrógeno, retirando el H_{2}S y el agua (se recogieron aproximadamente 18 ml de líquido) formados durante la reacción. La mezcla de reacción se destiló a presión reducida, recogiendo 60,3 g (0,726 mol, R. 63,3%) del compuesto del título a 102ºC/0,35-1 mm Hg en forma de un sólido blanco después de la retirada del líquido anterior: ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta ppm 2,51 (3H, s, 3-Me), 8,03 (1H, s, 5-H), 9,5 (1H, a, NH); TLC F_{R} (MeOH al 10%/CH_{2}Cl_{2}) = 0,3 (carbonización con fosfomolibdato, mancha blanca). Referencia: Vanek, T.; Velkova, V.; Gut, Jiri Coll. Czech. Chem. Comm. 1985, 49, 2492.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de 3-81
28
Procedimiento: Un matraz de fondo redondo de 500 ml se cargó con 4-metoxi-7-cloro-6-azaindol 2e (9,1 g, 50 mmol; se secó al vacío), carbonato potásico (13,8 g, 100 mmol, 2 equiv.), polvo de cobre (6,35 g, 100 mmol, 2 equiv.) y 3-metil-1,2,4-triazol (83 g, 1,0 mol, 20 equiv.). La mezcla sólida se calentó hasta que se fundió a 170-175ºC (temperatura externa del baño de aceite) en una corriente suave de nitrógeno anhidro durante 12 h, tiempo durante el cual el análisis por HPLC indicó que la cantidad del pico para el material de partida se había convertido en un 5-30% y el pico del producto deseado se había convertido en aproximadamente un 45% con una conversión del pico del subproducto isomérico del 15%. A medida que se enfriaba la mezcla de reacción, a la mezcla agitada caliente se le añadió lentamente MeOH (150 ml). Después de la refrigeración, el material insoluble (polvo de cobre) se filtró a través de una capa de Celite y se aclaró con metanol. El filtrado se concentró al vacío hasta una pasta espesa que se diluyó con agua (1 l) y se extrajo con EtOAc (3 x 150 ml). Los extractos de EtOAc se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron, obteniendo aproximadamente 8 g del residuo bruto que se cristalizó disolviéndose en CH_{3}CN caliente (50 ml), seguido de dilución con agua (100 ml) y refrigeración a 0ºC para recoger 1,45 g (12,7%) del compuesto del título en forma de un sólido blanco. El filtrado se purificó con gel de sílice de fase inversa C-18 (YMC ODS-A 75 mm) eluyendo con CH_{3}CN al 15-30%/H_{2}O. Las fracciones apropiadas se combinaron y la solución acuosa, después de la retirada del CH_{3}CN con un evaporador rotatorio, se liofilizó, dando 1,15 g más del compuesto del título 3-81. La fase acuosa bruta se extrajo adicionalmente varias veces con EtOAc. Los extractos de acetato de etilo se secaron (MgSO_{4}), se filtraron, se concentraron y se cristalizaron en MeOH, dando 200 mg más del compuesto del título 3-81. Rendimiento total: 2,8 g (12,2 mmol, R. 24,5%); EM m/z 230 (MH), EMAR (IEN) m/z calc. para C_{11}H_{12}N_{5}O (M+H), 230,1042, encontrado 230,1038 (\Delta - 1,7 ppm); ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta ppm 2,54 (3H, s, CH_{3}), 4,05 (3H, s, OCH_{3}), 6,73 (1H, s, H-3), 7,40 (1H, s, H-2), 7,56 (1H, s, H-5), 9,15 (1H, s, triazol-H-5); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 125,7 MHz) 8 ppm 14,2 (triazol-Me), 56,3 (OMe), 100,5 (C-3), 116,9 (C-5), 123,5, 127,2, 127,5 (C-2), 129,5 (C-7), 141,2 (C-5'), 149,5 (C-4), 161,8 (C-3'); Anál. calc. para C_{11}H_{11}N_{5}O: C 57,63, H 4,83, N 30,55, encontrado C 57,37, H 4,64, N 30,68.
La estructura se confirmó por un análisis cristalográfico de rayos X individual usando los cristales obtenidos de las fracciones de la columna C-18. Una porción de las fracciones de la columna C-18 que contenía una mezcla del análogo de 3-metil-1,2,4-triazolilo deseado 3-81 y el análogo de 5-metil-1,2,4-triazolilo isomérico 4-81 se purificó adicionalmente con una columna de fase inversa C-18 eluyendo con CH_{3}CN al 8-10%/H_{2}O. Las fracciones apropiadas se extrajeron con CH_{2}Cl_{2} y la evaporación lenta del disolvente dio el material cristalino del 7-(5-metil-1,2,4-triazolil)-4-metoxi-6-azaindol isomérico (4-81): EM m/z 230 (MH), ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta ppm 3,05 (3H, s, CH_{3}), 4,07 (3H, s, OCH_{3}), 6,74 (1H, c, J = 2,4, H-2), 7,37 (1H, t, J = 2,4, H-3), 7,65 (1H, s, H-5), 8,07 (1H, s, triazol-H-3). La estructura se confirmó por un análisis cristalográficos de rayos X individual.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de 5-81 
\vskip1.000000\baselineskip
29 
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento: Se disolvió AlCl_{3} (40 g, 0,3 mol, 15 equiv.) en una solución de CH_{2}Cl_{2} (100 ml) y nitrometano (20 ml) en nitrógeno seco. A esta solución se le añadió el compuesto 3-81 (4,58 g, 0,02 mol) con agitación y en atmósfera de N_{2}, seguido de clorooxoacetato de metilo (9,8 g, 0,08 mol, 4 equiv.). La mezcla se agitó en atmósfera de N_{2} a temperatura ambiente durante 1,5 h. La mezcla se añadió gota a gota a una solución agitada y enfriada de una solución acuosa al 20% de acetato amónico (750 ml). La mezcla se agitó durante 20 min y el precipitado resultante se filtró, se lavó minuciosamente con agua y se secó al vacío, obteniendo 4,7 g (0,015 mol, R. 75%) del compuesto del título 5-81 en forma de un sólido blanco: EM m/z 316 (MH); EMAR (IEN) m/z calc. para C_{14}H_{14}N_{5}O_{4} (M+H), 316,1046; encontrado 316,1041 (\Delta -1,6 ppm); ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 500 MHz) \delta ppm 2,58 (3H, s, CH_{3}), 3,96 (3H, s, OCH_{3}), 4,05 (3H, s, OCH_{3}), 7,76 (1H, s, H-5), 8,34 (1H, d, J = 3 Hz, H-2), 9,15 (1H, s, triazol-H-5), 11,0 (1H, s a, NH). Pueden obtenerse más cantidad del compuesto del título 5-81 y del ácido hidrolizado 6-81 a partir del filtrado por extracción de ácido-base con EtOAc.
Preparación de 6-81
30
Procedimiento: A una suspensión del éster metílico 5-81 (2,2 g, 7,0 mmol) en MeOH (50 ml) se le añadió una solución 0,25 M de NaOH en agua (56 ml, 14 mmol, 2 equiv.) a temperatura ambiente y la mezcla se agitó durante 15 min, tiempo durante el cual la HPLC indicó que la hidrólisis se había completado. La mezcla se concentró rápidamente al vacío para retirar el MeOH y a la solución residual se le añadieron agua (100 ml) y HCl 1 N (14 ml) con agitación para neutralizar la mezcla. El precipitado fino resultante se filtró, se lavó con agua y se secó al vacío, obteniendo 1,98 g (6,58 mmol, R. 94%) del compuesto del título 6-81 en forma de un sólido blanquecino: EM m/z 302 (MH); ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 500 MHz) \delta ppm 2,50 (3H, s, solapado con picos de DMSO), 3,98 (3H, s, CH_{3}O) 7,87 (1H, s, H-5), 8,29 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-2), 9,25 (1H, s, triazol-H-5), 12,37 (1H, s, NH).
Procedimiento alternativo: A una suspensión del éster metílico 5-81 (10,7 g, 34 mmol) en MeOH (150 ml) se le añadió una solución 0,25 M de NaOH en agua (272 ml, 68 mmol, 2 equiv.) a temperatura ambiente y la mezcla se agitó durante 20 min, tiempo durante el cual la HPLC indicó que la hidrólisis se había completado. La mezcla se concentró rápidamente al vacío para retirar el MeOH y la solución residual se extrajo con EtOAc para retirar cualquier impureza neutra. A la fase acuosa se le añadió HCl 1 N (68 ml, 68 mmol) para neutralizar el producto. La mezcla resultante se congeló y se liofilizó, obteniendo 14,1 g (33,7 mmol, R. 99,2%) del compuesto del título 6-81, que contenía 2 equivalentes molares de NaCl en forma de un sólido blanquecino. Este material se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional. La sal disódica del compuesto del título 6-81 se obtuvo por cromatografía en columna de fase inversa C-18 después del tratamiento con bicarbonato sódico: HPLC >97% (AP, uv a 254 nm); EMAR (sal Na, ESI) m/z calc. para C_{13}H_{10}N_{5}O_{4} (M-H), 300,0733; encontrado 300,0724 (\Delta -3 ppm); ^{1}H RMN (sal Na, DMSO-d_{6}, 500 MHz) \delta ppm 2,37 (3H, s, Me), 3,83 (3H, s, CH_{3}O), 7,56 (1H, s, H-5), 8,03 (1H, s, H-2), 9,32 (1H, s, triazol-H-5); ^{13}C RMN (sal Na, DMSO-d_{6}, 125,7 MHz) \delta ppm 13,8 (triazol-Me), 57,2 (OMe), 114,8 (C-3), 120,0 (C-5), 125,1, 143,5 (C-5'), 149,8 (C-4), 160,0 (C-3'), 171,7, 191,3.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación del Compuesto IVc
31
Procedimiento: A una solución del ácido 6-81 (3,01 g, 10 mmol) y clorhidrato de benzoilpiperazina (3,39 g, 15 mmol) en DMF (50 ml) se le añadió trietilamina (10,1 g, 100 mmol, 10 equiv.), seguido de clorhidrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDC; 5,75 g, 30 mmol) en atmósfera de N_{2} y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 22 h después de la sonicación y a 40ºC durante 2 h. La mezcla se concentró al vacío para retirar la DMF y el TEA, y a la solución residual se le añadió agua (200 ml) con agitación y sonicación. Los precipitados formados se recogieron, se lavaron con agua y se secaron al vacío, obteniendo 2,8 g (5,9 mmol, R. 59%) del compuesto del título IVc en forma de un sólido blanquecino. El filtrado se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (x 2). Los extractos de CH_{2}Cl_{2} se secaron (Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se concentraron, dando una goma que se trituró con Et_{2}O, obteniendo un sólido. Este sólido se suspendió y se trituró con MeOH, obteniendo 400 mg del compuesto del título IVc en forma de un sólido blanquecino. Rendimiento total: 3,2 g (6,8 mmol, R. 68%): EM m/z 474 (MH); EMAR (IEN) m/z calc. para C_{24}H_{24}N_{7}O_{4} (M+H) 474,1890, encontrado 474,1884 (\Delta -1,2 ppm); ^{1}H RMN (DMSO-d6) 8 ppm 2,50 (3H, s, solapado con picos de DMSO), 3,43 (4H, a, CH_{2}N), 3,68 (4H, a, CH_{2}N), 3,99 (3H, s, CH_{3}O), 7,46 (5H, s a, Ar-Hs), 7,88 (1H, s, indolo-H-5), 8,25 (1H, s, indolo-H-2), 9,25 (1H, s, triazol-H-5), 12,40 (1H, s, NH); ^{13}C RMN (DMSO-d6) 8 ppm 13,78, 40,58, 45,11, 56,78, 114,11, 120,95, 122,71, 123,60, 126,98, 128,34, 129,6, 135,43, 138,52, 142,10, 149,15, 161,29, 166,17, 169,22, 185,42; UV (MeOH) \lambdamáx 233,6 nm (\varepsilon 3,43 x 10^{4}), 314,9 nm (\varepsilon 1,73 x 10^{4}); Anál. calc. para C_{24}H_{24}N_{7}O_{4}\cdot1/5H_{2}O; C 60,42, H 4,94, N 20,55. Encontrado: C 60,42, H 5,03, N 20,65; KF (H_{2}O) 0,75%.
Esta reacción también puede realizarse mediante el uso de HATU y DMAP para proporcionar un rendimiento más uniforme del compuesto del título: A una suspensión del ácido 6-81 (15,6 mmol) y HATU [hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio] (8,90 g, 23,4 mmol; 1,5 equiv.) en DMF (60 ml) y CH_{2}Cl_{2} (60 ml) se le añadió una mezcla de DMAP (5,72 g, 46,8 mmol, 3 equiv.) y clorhidrato de benzoilpiperazina (5,30 g, 23,4 mmol; 1,5 equiv.) en DMF (60 ml) a temperatura ambiente y la mezcla se agitó en atmósfera de nitrógeno durante 4 h. La mezcla se concentró al vacío para retirar el CH_{2}Cl_{2} y la mayor parte de la DMF, y a la solución residual se le añadió agua con agitación y sonicación. Los precipitados formados se recogieron, se lavaron con agua y se secaron al vacío, obteniendo 5,38 g (11,4 mmol, R. 72,8%) del compuesto del título IVc en forma de un sólido blanquecino: HPLC >95% (AP, uv a 254 nm).
32 
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimientos Experimentales Sintéticos para una mejor preparación del Compuesto IVb
33
Se añadió 5-amino-2-metoxipiridina (50 g, 0,4 mol) a una mezcla en agitación de etanol absoluto (280 ml) y HBF_{4} (al 48% en agua, 172 ml) y se enfrió a 0ºC. Se disolvió nitrito sódico (129 g) en agua (52 ml) y se añadió en porciones durante 1 h. La agitación se continuó a 0ºC durante 2 h. La mezcla de reacción se diluyó con éter (1 l). El producto sólido se recogió por filtración y se lavó con 500 ml de 50:50 de EtOH/éter y posteriormente varias veces con éter hasta que el producto se volvió de color ligeramente rosado. El sólido de color rosa pálido, 90 g (rendimiento de \sim100%), se mantuvo en un desecador sobre P_{2}O_{5}.
Se siguió el mismo procedimiento para realizar la reacción a gran escala:
(1) (200 g, 1,6 mol); HBF_{4} (688 ml); NaNO_{2} (116 g); EtOH (1, 12 l); H_{2}O (208 ml)
La reacción se realizó 4 veces (800 gramos en total (1-80)). El producto se secó sobre P_{2}O_{5} durante 48 h. (sólo 24 h para el primer lote).
Se obtuvieron un total de 1,293 g de (2-80), (rendimiento del 91%).
Ref J. Heterociclic Chem., 10, 779, 1973 (para las reacciones anteriores, incluyendo datos analíticos)
\vskip1.000000\baselineskip
34
La descomposición de la sal diazonio se realizó en 3 lotes de:
206 g, 219 g y 231 g usando 1,3 l, 1,4 l y 1,6 l de tolueno anhidro, respectivamente.
El tolueno se precalentó en atmósfera de nitrógeno a 100ºC (temperatura interna) en un matraz de fondo redondo de 3 bocas y 2 l equipado con un agitador mecánico. El sólido se añadió en porciones con una paleta a través de un embudo de polvo que se adhirió a un adaptador con un suave flujo de nitrógeno de salida. Durante la adición, la temperatura se mantuvo entre 99-102ºC (se ajustó a 100ºC) y se agitó vigorosamente. El tiempo de adición total fue de 60 min para los dos lotes más pequeños y de 70 min para el último. Después de que finalizara la adición, cada reacción en agitación se calentó a 110ºC durante 1 h. El manto de calentamiento se retiró y la agitación se interrumpió. Las reacciones se dejaron en reposo durante 2 h (se alcanzó la temperatura ambiente). Nota de Seguridad: La reacción contiene BF3, por lo que el trabajo con la reacción caliente produce vapores que provocan irritación de la piel en algunas personas. No se han advertido incidentes a la temperatura ambiente (6 personas diferentes). El tolueno caliente de la reacción se vertió en un Erlenmeyer de 4 l (un aceite pardo oscuro y un residuo permanecieron en el matraz). El residuo se lavó con 50 ml de tolueno y se vertió en los extractos de tolueno originales.
Añadir 1,5 l de NaOH 1 N a la fase de tolueno, extraer y lavar con \sim100 ml de NaCl ac. sat.
Combinar el NaCl con la fase de NaOH, extraer de nuevo con 150 ml de tolueno y lavar con 50 ml de NaCl sat.
Combinar las fases de tolueno.
Añadir 1 l de NaOH 1 N al residuo en el matraz de reacción, remover para disolver tanta cantidad de residuo como sea posible y después añadir 500 ml de Et_{2}O y verter en el Erlenmeyer.
Añadir \sim500 ml más de NaOH 1 N al matraz de reacción y remover con \sim500 ml de Et_{2}O.
Combinar el Et_{2}O oscuro y los lavados de NaOH en el matraz Erlenmyer.
La mezcla de Et_{2}O/NaOH se vertió en un embudo de polvo que contenía lecho de lana de vidrio para recoger el sólido viscoso oscuro. (Añadir \sim500 ml más de éter al lavado) en un embudo de decantación de 6 l.
Extraer. Lavar la fase de éter con \sim200 ml de H_{2}O y después con 100 ml de NaCl sat.
Combinar todos los lavados con la fase ac. de NaOH original y extraer de nuevo con 500 ml de éter. Lavar con 100 ml de H_{2}O y 100 ml de NaCl.
Combinar los extractos de éter. Los extractos de tolueno y éter se comprobaron por CL/EM para el producto limpio.
El éter se concentró en un evaporador rotatorio y el residuo se combinó con los extractos de tolueno para preparar una solución homogénea que se llevó tal cual a la siguiente etapa.
Las otras dos realizaciones se combinaron y se trataron de la misma manera.
Todas la fases acuosas se comprobaron por CL/EM = sin producto.
Ref J. Heterociclic Chem., 10, 779, 1973 (para las reacciones anteriores, incluyendo datos analíticos)
35
Se pusieron un total de 4,6 l de solución de tolueno que contenía 3-80 en varios tubos sellados y se trataron con 900 ml de HCl al 35% a 145ºC durante 2 h. La CL/EM no mostró material de partida, sólo 4. La solución de tolueno se decantó y se desechó. La fase acuosa se lavó con EtOAc y se concentró para retirar los volátiles, proporcionando un sólido pardo que contenía la fluoro-hidroxipiridina deseada 4-80.
Se recogieron un total de 244 g de este sólido y se llevó tal cual a la siguiente etapa (no estaba completamente seco).
Nota: Posteriormente, se ha realizado esto mismo por decantación de la fase de tolueno en primer lugar antes del calentamiento para reducir los volúmenes.
La misma reacción se realizó usando HBr (al 48% en H_{2}O) a 100ºC durante 6 h con un resultado similar al procedimiento bibliográfico, rendimiento del 49%.
Ref: J. Heterociclic Chem., 10, 779, 1973 (para las reacciones anteriores, incluyendo datos analíticos)
\vskip1.000000\baselineskip
36
El sólido anterior que contenía (4-80) se dividió en 4 lotes y se trató con H_{2}SO_{4} y HNO_{3} fumante como se muestra a continuación. Las cantidades usadas fueron:
37
El Compuesto 4-80 se disolvió en ácido sulfúrico (las mayores cantidades indicadas anteriormente) a ta y después se calentó a 65ºC. Se añadió gota a gota una solución preformada de ácido nítrico fumante y ácido sulfúrico (las menores cantidades indicadas anteriormente). La temperatura se mantuvo entre 65ºC y 80ºC (la mezcla de reacción es exotérmica, y aunque el baño estaba a 65ºC, la temperatura aumentó, normalmente hasta 75ºC, y en algunas ocasiones hasta 80ºC). Después de que se completara la adición, la mezcla de reacción se calentó a 65ºC durante 1 h más. Después, la mezcla de reacción se enfrió a ta y se vertió en un matraz que contenía hielo) (20 g de hielo/gramo de compuesto, se produjo desprendimiento de gas). Precipitó un sólido que se recogió por filtración (La ^{1}H RMN mostró 4-80 y algo más (que se desechó)).
La fase acuosa se extrajo varias veces con EtOAc (3-5) y se concentró en un evaporador rotatorio al vacío, proporcionando un sólido que se trituró con éter, proporcionando 5-80 en forma de un sólido amarillo brillante. Se recogieron un total de 117 g del producto deseado en el primer cultivo (rendimiento del 27% a partir de la sal diazonio). Una porción no cristalizó: este aceite se trituró con MeOH y Et_{2}O, proporcionando 3,6 g de 5-80; otra precipitación de las aguas madre produjo 6,23 g más del producto deseado 5-80.
Total: 117,0 + 3,6 + 6,23 = 126,83, 30,4%). Rendimiento en 3 etapas (descomposición de la sal diazonio; desprotección y nitración).
Datos analíticos del Bloc de Notas: 53877-115: ^{1}H RMN (\delta, MeOD): 8,56-8,27 (dd, J = 7,5, 3,3 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 3,3 Hz, 1H); CL/EM (M+1)^{+} = 158,9; ta = 0,15 min.
Nota: Una porción de la solución acuosa ácida se recogió y se neutralizó con Na_{2}CO_{3} hasta que se interrumpió la efervescencia y después se extrajo con EtOAc \rightarrow Se obtuvo un producto diferente. Ningún producto deseado en estos extractos.
\vskip1.000000\baselineskip
38 
\global\parskip0.900000\baselineskip
Un total de 117 g de 5-80 se dividieron en 4 lotes de 30 g x 3 y 27 g x 1 y se trataron con POBr_{3} (3 equiv.; 163 g x 3 y 155 g x 1) y una cantidad catalítica de DMF (15 ml) a ta (se añadió cuidadosamente DMF \rightarrow desprendimiento de gas). Después de 5 min a temperatura ambiente, las soluciones se calentaron a 110ºC durante 3 h. La CL/EM mostró que el material de partida se había consumido. Las mezclas de reacción se dejaron enfriar a ta. Los matraces de reacción se pusieron en un baño de hielo; y después al matraz se le añadió muy lentamente y cuidadosamente hielo, desprendimiento de gas debido a la formación de HBr; el líquido y el sólido negro que se formaron se Vertieron en un vaso de precipitación con hielo. Se añadió EtOAc y después la mezcla se extrajo varias veces con EtOAc. La fase orgánica se lavó con NaHCO_{3} ac. sat.; H_{2}O y salmuera; se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se filtró. El producto se secó en la bomba durante una noche, proporcionando 123 g de 6-80 en forma de un sólido pardo (rendimiento del 77%).
Nota: La reacción se completa en 1 h.
^{1}H RMN (\delta, CDCl_{3}): 8,52 (m, 1H), 7,93 (m, 1H).
39
Se enfriaron 800 ml de bromuro de vinilmagnesio (1 M en THF, Aldrich) por debajo de -60ºC con agitación vigorosa en atmósfera de N_{2}. Se añadió gota a gota 2-bromo-5-fluoro-3-nitropiridina (43,3 g, 0,196 mol) en 200 ml de THF mediante un embudo de adición a una velocidad suficiente para mantener la temperatura por debajo de -60ºC. Esto llevó \sim1,25 h. La mezcla de reacción se calentó de -40ºC a -50ºC y se agitó durante 1 h más. Después, se añadió lenta y cuidadosamente 1 l de NH_{4}Cl acuoso saturado. En principio, se produjo formación de espuma y una considerable presencia de sólido, pero éste se disolvió esencialmente según se completaba la adición y el material se calentaba a ta. Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo 3 veces con acetato de etilo. Los extractos orgánicos se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron, proporcionando \sim 50 g de un sólido gomoso negro. La HPLC indicó el producto al 57-58%. A éste se le añadió CH_{2}Cl_{2} y el sólido se recogió por filtración y se lavó con CH_{2}Cl_{2}, proporcionando 12,5 g del producto en forma de un sólido pardo. La reacción se repitió exactamente a la misma escala y se trató de la misma manera. De la trituración con CH_{2}Cl_{2}, se obtuvieron 12,4 g del Precursor 2i (pureza por HPLC de \sim97%). El producto bruto se recuperó y se dejó en reposo en diclorometano. Después de un periodo de reposo, se separaron 3,6 g más del producto y se recuperaron por filtración.
Rendimiento total = 29,5 g (35%).
^{1}H RMN (\delta, CDCl_{3}): 8,69 (s a, 1H), 7,92 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,41 (m, 1H), 6,77 (m,1H); CL/EM (M+1)^{+}= 216,-217,9; ta = 1,43 min.
40
La reacción se realizó en un matraz de 250 ml (se produjo formación de espuma después del calentamiento y el matraz de tamaño grande es más conveniente). Una mezcla del precursor 2i (3 g, 13,95 mmol), 1,2,3-triazol (15 g, 217,6 mmol, 15 equiv.), K_{2}CO_{3} (1,9 g, 13,95 mmol, 1 equiv.) y Cu(0) (0,9 g, 13,9 mmol, 1 equiv.) se calentó a 160ºC durante 7 h (de ta a 160ºC, total 7 h) en atmósfera de N_{2} (dependiendo del lote de Cu (0), el tiempo de reacción puede variar de 2 h a 7 h). La mezcla resultante se diluyó con MeOH, se filtró a través de papel de filtro (para retirar el cobre) y se lavó con MeOH (20 ml) y agua (30 ml).
\global\parskip1.000000\baselineskip
El filtrado se concentró (el disolvente se retiró en el evaporador rotatorio) y se diluyó con acetato de etilo. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica combinada se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró. El residuo se disolvió en MeOH (20 ml), 7-80 (750 mg) cristalizó del metanol en forma de un sólido blanco y se recogió por filtración. (Volumen de gradiente lento, gel de sílice, hex/EtOAc (0\rightarrow18%) de las aguas madre produce normalmente 5-10% más de 7-80.
^{1}H RMN (\delta, CDCl_{3}): 10,47 (s a, 1H), 8,76 (s, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,89 (s, 1H), 7,53 (m, 1 H), 6,78 (m, 1H); CLEM (M+1)^{+}= 204; ta = 1,29 min.
41
Se puso cloruro de etilmetilimidazolio (4,3 g, 29,6 mmol, 3 equiv.) en un matraz de 250 ml. Al matraz se le añadió en una porción AlCl_{3} (11,8 g, 88,6 mmol, 9 equiv.). Se formó una suspensión líquida (permaneció una pequeña cantidad de AlCl_{3} en forma de un sólido). Después de agitar durante 5-10 min, se añadió en una porción el compuesto (1) (2,0 g, 9,85 mmol) seguido de la adición lenta (mediante una jeringa) de clorooxalacetato de etilo (3,3 ml, 29,6 mmol, 3 equiv.). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 h. La CLEM indicó una mezcla de compuesto 8-80:compuesto 7-80 = 6:2, (El Compuesto I tiene una fuerte absorción de UV). La reacción se interrumpió mediante la adición cuidadosa de agua enfriada con hielo (\sim75 ml) a 0ºC. En este momento, precipitó un sólido amarillo. La suspensión resultante se filtró y el sólido se lavó con agua. Se añadieron MeOH y acetato de etilo (para retirar el material de partida que no había reaccionado) y el sólido se secó al aire. (pureza por CLEM del 70% \sim 80%) Se obtuvieron 2 g de sólido que contenía 8-80 y se llevó a la siguiente etapa sin purificación adicional. CLEM (M+1)^{+} = 276; ta = 0,97 min.
42
Una mezcla del compuesto 8-80 (4,9 g, 17,8 mmol) y clorhidrato de N-benzoilpiperazina 8a-80 (sal HCl; 6,0 g, 26,7 mmol, 1,5 equiv.) en DMF (30 ml) se agitó a TA durante una noche (16 h). Se formó una suspensión. A la suspensión se le añadieron 20 ml más de DMF. Después, se añadió HATU (12,2 g, 26,7 mmol, 1,5 equiv.) seguido de DMAP (4,3 g, 35,6 mmol, 2 equiv.). La mezcla de reacción se agitó durante 30 min. La CLEM indicó que el material de partida 8-80 se había convertido completamente en el producto (EJEMPLO 216). La mezcla resultante se filtró y el sólido se lavó con agua. El filtrado se concentró al vacío. Al residuo se le añadió agua y el sólido se recogió por filtración. Los sólidos se combinaron y se lavaron con agua, MeOH y EtOAc. Después, el sólido se secó al aire. La CLEM y la HPLC mostraron IVb, puro >99%. El producto sólido se purificó adicionalmente por precipitación y cristalización en CH_{3}OH al 5-10%/CHCl_{3}.
\vskip1.000000\baselineskip
Purificación de IVb
El compuesto bruto IVb obtenido anteriormente (15,3 g) se disolvió en MeOH al 10%/CHCl_{3} (600 ml). Se formó una suspensión parda clara, se filtró a través de papel de filtro y se lavó dos veces con MeOH. El sólido parduzco se desechó (\sim1,2 g). El compuesto IVb se cristalizó en el filtrado, el sólido se recogió por filtración y el sólido blanco se secó al aire. El filtrado se usó para repetir varias veces la cristalización. El sólido obtenido de cada filtración se analizó por HPLC. Todas las fracciones puras se combinaron. Las fracciones que no eran muy puras se sometieron de nuevo a cristalización con MeOH y CHCl_{3}. Se obtuvo una cantidad total de 12,7 g del Compuesto IVb a partir de la recristalización y la precipitación. Las aguas madre se concentraron y se purificaron sobre una columna de gel de sílice (EtOAc y después CHCl_{3}/MeOH (al 0-2%)), proporcionando 506 mg del producto) en forma de un sólido blanco.
^{1}H RMN (d, DMSO) 13,1 (s a, 1H), 9,0 (s, 1H), 8,4 (s, 1H), 8,3 (s, 1H), 8,2 (s, 1H), 7,4 (s a, 5H), 3,7 (s a, 4H), 3,5 (s a, 4H); EM m/z 448 (MH). Anál. calc. para C_{22}H_{18}FN_{7}O_{3}; C 59,05, H 4,05, N 21,91, F 4,24. Encontrado: C 57,28, H 4,14, N 21,22; F 4,07%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos 1-4
Preparación de los Profármacos I a partir de los Compuestos Parentales IV Esquema Sintético para los Ejemplos 1-4
43 
\vskip1.000000\baselineskip
44
Ejemplo 1
Preparación de 1a
45
Procedimiento: Una suspensión de IVa (211 mg, 0,5 mmol) en THF (2 ml; Sure Seal) en una atmósfera de N_{2} anhidra se trató con NaH (86 mg, 2,2 mmol; 4,4 equiv.; dispersión en aceite al 60%). Después de unos minutos de agitación a temperatura ambiente, se añadió clorometilfosfato de di-terc-butilo (782 mg, 3,0 mmol; preparación, véase la Patente de Estados Unidos 6.362.172) y la mezcla se agitó durante 1-5 días, controlando que la reacción se completara por HPLC (se requirieron 1-2 equiv. más de NaH y del fosfato para completar prácticamente la reacción). Después de que se consumiera el material de partida, la mezcla se concentró al vacío a sequedad y el residuo, que parecía ser una mezcla de mono- y bis-t-butilfosfato de indol N-alquilado, se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (5 ml) y se trató con TFA (5 ml) a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla se concentró al vacío y el residuo se purificó con gel de sílice de fase inversa C-18, eluyendo con CH_{3}CN al 5-10% en agua que contenía NaHCO_{3}, obteniendo 75 mg (0,13 mmol; R. 26%) del compuesto del título Ia en forma de un polvo blanquecino (sal disódica): HPLC >99% (AP a 254 nm); CL/EM (ESI+) m/z 533 (M+H menos 2Na)^{+}; EMAR (IEN) m/z calc. para C_{23}H_{26}N_{4}O_{9}P (M+H menos 2Na)^{+} 533,1437, encontrado 533,1426 (\Delta -2,1 ppm); ^{1}H RMN (D_{2}O, 500 MHz) \delta ppm 3,51 (2H, m), 3,67 (2H, m), 3,73-3,79 (2H, m), 3,89-3,95 (2H, m), 3,94, 3,95 (3H, 2s), 4,05, 4,07 (3H, 2s), 6,02-6,04-6,05-6,07 (2H, ABc.), 7,43, 7,44 (1H, 2s), 7,45-7,56 (5H, m), 8,49, 8,52 (1H, 2s).
Usando un procedimiento y condiciones similares, se preparó Ib a partir de IVb. Se prepararon Ic e Id a partir de IVc y IVd, respectivamente, pero se utilizó agua en lugar de solución de bicarbonato sódico en la purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
46
Ib: Rendimiento del 13% (sal disódica); HPLC >96% (AP a 254 nm); CL/EM (ESI+) m/z 558 (M+H menos 2Na)^{+};
^{1}H RMN (D_{2}O, 500 MHz) \delta ppm 3,59 (2H, m), 3,70-3,84 (4H, m), 3,93-3,95 (2H, m), 5,28-5,29-5,30-5,32 (2H, ABc.), 7,4-7,6 (5H, m), 8,09, 8,10 (1H, 2s), 8,34, 8,36 (1H, 2s), 8,59, 8,61 (1H, 2s), 8,72, 8,75 (1H, 2s).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
47
Ic: Rendimiento del 37% (forma de ácido). Se usó agua en lugar de bicarbonato sódico acuoso durante la purificación; HPLC >98% (AP a 254 nm); CL/EM (ESI+) m/z 584 (M+H); ^{1}H RMN (DMSO-d6, 500 MHz) \delta ppm 2,40 (3H, s), 3,44 (4H, s a), 3,66 (4H, s a), 4,04 (3H, s), 5,79 (1H, s), 5,82 (1H, s), 7,46 (5H, s a), 8,07 (1H, s), 8,41 (1H, s), 8,88 (1H, s).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
48
Id: Rendimiento del 7% (forma de ácido). Se usó agua en lugar de bicarbonato sódico acuoso durante la purificación; CL/EM (ESI+) m/z 597 (M+H); ^{1}H RMN (DMSO-d6, 500 MHz) \delta ppm 1,16, 1,21 (3H, 2d, J = 6,5 Hz), 2,29 (3H, s), 2,3-4,5 (7H, m), 4,00, 4,01 (3H, 2s), 5,79-5,85 (2H, m), 6,36 (1H, t, J = 2 Hz), 7,42-7,47 (5H, m), 7,99 (1H, s), 8,08, 8,09 (1H, 2s), 8,34, 8,44 (1H, 2s).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 Preparación de Ica, (sal disódica)
49
Procedimiento General: Una suspensión de IVc (0,24 g,0,5 mmol) en THF anhidro (4 ml) en atmósfera de nitrógeno se trató con hidruro sódico (dispersión en aceite al 60%, 0,08 g, 2,0 mmol) y se agitó hasta que cesó el desprendimiento de gas (aproximadamente 5 minutos). La mezcla de reacción se trató con yodo (0,13 g, 0,5 mmol) y se agitó durante 2-3 minutos seguido de la adición de clorometilfosfato de di-terc-butilo (1,6 g, 6,0 mmol, bruto). Se dejó pasar una corriente de nitrógeno por la reacción para facilitar la retirada de gran cantidad o de todo el THF. La mezcla de reacción se agitó durante una noche. El análisis por HPLC del material bruto indicó la presencia del IVc de partida (aprox. 56%) y del aducto deseado (aprox. 32%).
Varias mezclas de reacción brutas (un total de 6,7 mmol en base al material de partida IVc) se disolvieron de nuevo en diclorometano, se combinaron y se concentraron al vacío para retirar cualquier cantidad de THF restante. El residuo se suspendió en diclorometano y TFA (1:1, volumen total de aproximadamente 40 ml). La mezcla se agitó durante 1,5-2 horas y después el disolvente se retiró al vacío. El residuo se suspendió en diclorometano, se extrajo en agua (aproximadamente 60 ml) y se hizo débilmente básico con bicarbonato sódico sólido o acuoso. La fase acuosa se redujo en volumen con un evaporador rotatorio, si era necesario, y la solución se cargó en una columna de fase inversa C-18 (aproximadamente 80 g de C-18, YMC ODS-Aq, 50 micrómetros) eluyendo con agua, seguido de agua que contenía acetonitrilo al 2,5%. Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron y el disolvente orgánico se retiró con un evaporador rotatorio. El producto purificado se recuperó después de la liofilización, dando 1,00 g (1,30 mmol, 19% en 2 etapas) del compuesto del título Ica (sal disódica) en forma de un polvo blanquecino: Pureza de HPLC >99% de AP a 254 nm (gradiente B al 0-100%/A; A 10% de CH_{3}CN-90% de H_{2}O-0,1% de TFA, B 90% de CH_{3}CN-10% de H_{2}O-0,1% de TFA, tiempo de gradiente 4 min, columna YMC ODS-Aq 4,6 x 50 mm 3 micrómetros); EM-IEN- m/z 482 (M-H menos 2Na)-; EMAR (IEN) m/z calc. para C_{25}H_{27}N_{7}O_{8}P (M+H menos 2Na)^{+} 584,1659, encontrado 584,1651 (A -1,3 ppm); ^{1}H RMN (D_{2}O, 500 MHz) \delta ppm 2,53, 2,54 (3H, 2s), 3,56 (2H, s, CH_{2}N), 3,72 (2H, s a, CH_{2}N), 3,78, 3,83 (2H, 2s a, CH_{2}N), 3,94, 3,96 (2H, 2s a, CH_{2}N), 4,14 (3H, s, CH_{3}O), 5,38, 5,40 (2H, 2d, J = 11 Hz), 7,45-7,59 (5H, m, Ar-Hs), 8,07, 8,09 (1H, 2s, indolo-H-5), 8,64, 8,67 (1H, 2s, indolo-H-2), 8,87, 8,89 (1H, 2s, triazol-H-5); ^{13}C RMN (125,7 MHz, D_{2}O) \delta ppm 15,43 (N-Me), 44,03, 44,47, 44,66, 45,05, 48,20, 48,82, 49,60, 50,23, 59,78 (OMe), 75,81 (NCH_{2}O) 115,6, 126,0, 127,2, 129,6, 131,0, 131,7, 132,1, 133,5, 136,8, 147,6, 150,1, 154,2, 164,8, 170,4, 175,8, 189,2; UV (H2O) Xmáx 220 nm (\varepsilon 3,91 x 10^{4}), 249 nm (\varepsilon 2,00 x 10^{4}), 303 nm (\varepsilon 1,60 x 10^{4}); Anál. calc. para C_{25}H_{24}N_{7}O_{8}PNa_{2}\cdot8H_{2}O\cdot0,2NaHCO_{3}; C 38,39, H 5,14, N 12,44, P 3,93, Na 6,42 Encontrado: C 38,16, H 4,81, N 12,43, P 3,72, Na 6,05; KF (H_{2}O) 17,3%. Se recogieron unas fracciones menos polares, obteniendo 0,22 g (0,29 mmol, R. 4%) del compuesto del título Ica (sal disódica): Pureza de HPLC >95% (AP a 254 nm).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 Preparación de Iab (Sal de Lisina Hidratada)
Etapa uno
\vskip1.000000\baselineskip
50
Se combinaron éster de fosfato A (45,1 g, 0,1 mol) y cloroyodometano B (200 g, 1,14 mol) en 100 ml de benceno y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas antes de retirar el benceno al vacío. Después, al residuo se le añadieron 500 ml de éter etílico y el sólido insoluble se retiró por filtración. La concentración del filtrado proporcionó clorometilfosfato de di-terc-butilo, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa dos
\vskip1.000000\baselineskip
51
Se añadió lentamente NaH (2,4 g, al 60% en aceite) en una suspensión de IVa en THF seco (120 ml) y la mezcla se dejó en agitación durante una hora a temperatura ambiente. A la solución en agitación se le añadió lentamente yodo (5 g) disuelto en THF seco (10 ml). Después de que se completara la adición, la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos más y después se añadió el compuesto clorometilfosfato de di-terc-butilo, obtenido en la etapa uno. Después de agitar durante 16 horas, la mezcla de reacción se vertió en agua enfriada con hielo (120 ml), seguido de extracción con EtOAc (3 x 300 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (100 ml) y después con salmuera (100 ml), se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se concentraron al vacío, proporcionando un residuo, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con EtOAc/Et_{3}N (100/1) y después con EtOAc/MeOH (100/1)), dando el diéster IIa con rendimientos del 70-80%.
\newpage
Etapa tres
\vskip1.000000\baselineskip
52 
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución mixta de TFA (50 ml) y diclorometano (450 ml) se añadió a un matraz de fondo redondo que contenía 43,3 g de diéster IIa. Después de agitar a temperatura ambiente durante 16 horas, la mezcla de reacción se concentró al vacío, dando un residuo de Iac que se usó en etapas adicionales sin purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa cuatro
\vskip1.000000\baselineskip
53 
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 55 g del producto anterior Iac a una solución acuosa de L-lisina (1,36 M, 70 ml) a temperatura ambiente. La suspensión resultante (pH = 1,83) se añadió a una solución de lisina (1,36 M, \sim40 ml) a pH 4,88. La suspensión resultante se filtró a través de una capa de Celite. El filtrado amarillo claro transparente (\sim200 ml) se mezcló con acetona (200 ml) y se calentó a 45ºC. Se añadió acetona (1400 ml) durante 2 h a 45ºC. La solución transparente se pipeteó, se agitó a 45ºC durante 2 h y se enfrió lentamente a temperatura ambiente (5 h) y la suspensión se agitó durante una noche. El sólido blanco se recogió por filtración y se secó al vacío a 50ºC durante 24 h, proporcionando 41,2 g de Iab en forma de un sólido blanquecino.
El sólido anterior se disolvió en 1:1 de agua-acetona (560 ml) a 45ºC. Se añadió acetona (700 ml) durante un periodo de 1 h a 45ºC. La solución transparente se pipeteó y se agitó a 45ºC durante 2 h. Se enfrió lentamente a temperatura ambiente (5 h) y la suspensión se agitó a temperatura ambiente durante una noche. El sólido blanco se recogió por filtración y se secó al vacío a 50ºC durante 36 h, proporcionando 33 g de Iab en forma de un sólido blanquecino. El AP era >99% por HPLC.
^{1}H RMN (500 MHz, D_{2}O) \delta 8,42 (s, 1/2H), 8,39 (s, 1/2H), 7,52 (m, 6H), 6,12 (m, 2H), 4,07 (s, 3H), 3,93 (m, 5H), 3,72 (m, 3H), 3,67 (m, 2H), 3,52 (m, 2H), 3,05 (m, 2H), 1,93 (m, 2H), 1,74 (m, 2H), 1,50 (m, 2H); EM m/z: (M+H-lisina)^{+} calc. para C_{23}H_{26}N_{4}O_{9}P 533,14, encontrado 533,03. P.f. de 166,7 a 172,2ºC. Usando integración comparativa de ^{1}H RMN de varios picos diferentes, se calcula que la proporción de lisina a IVa está en el intervalo de 1,05:1 a 1,2:1 equivalentes de lisina a profármaco parental. Se determinó que la forma de sal era un hidrato. Basándose en la DSC (calorimetría de exploración de difracción) y la TGA (análisis térmico de gravedad), el contenido de agua observado es del 2,80%. El cálculo teórico para un monohidrato es del 2,58%. Por lo tanto, la proporción de agua a molécula parental en el hidrato podría estar en el intervalo de 1:1 a \sim1,5:1.
Ejemplo 7 Preparación de Ic cristalino (mono-hidrato de ácido libre) 
\vskip1.000000\baselineskip
54 
\vskip1.000000\baselineskip
A una mezcla de IVc (600 mg, 1,27 mmol) en THF anhidro (10 ml) en un matraz de fondo redondo secado en el horno en atmósfera de nitrógeno a t.a. se le añadió NaH (153 mg, 6,38 mmol, polvo seco, 95%) y la suspensión blanca se agitó hasta que no se observó desprendimiento de gas. Después, a la mezcla se le añadió I_{2} (375 mg, 1,48 mmol) y se agitó a t.a. durante 3 h. A la mezcla de reacción se le añadió NaH (153 mg, 6,38 mmol, polvo seco, 95%) y la mezcla se agitó durante aproximadamente 5 a 10 min. El fosfato de clorometil-di-terc-butilo (2,0 g, aproximadamente 1,6 ml, 7,79 mmol) se añadió a la mezcla, que después se agitó a t.a. durante 15 h. El análisis de la reacción por CLEM mostró una conversión de >97% del material de partida. Después de la evaporación de los volátiles, al residuo se le añadió CH_{2}Cl_{2} (10 ml), se enfrió en un baño de hielo-agua, se añadió lentamente TFA (10 ml) y a se agitó a t.a. durante 3 h. Después, la mezcla de reacción se evaporó y el residuo se repartió entre CH_{2}Cl_{2} (50 ml) y H_{2}O (50 ml). La fase de CH_{2}Cl_{2} se vertió en el matraz de reacción que contenía una pequeña cantidad de sólido parduzco no disuelto, y esta mezcla se extrajo con una solución acuosa diluida de NaHCO_{3} (50 ml). La mezcla acuosa se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (disolvente A: 10% de MeOH-90% de H_{2}O-0,1% de TFA; disolvente B: 90% de MeOH-10% de H_{2}O-0,1% de TFA; % inicial de B = 0, % final de B = 100; tiempo de gradiente = 6 min; caudal = 45 ml/min; columna: phenomenex-Luna 30 x 50 mm, S5; fracción recogida: de 3,65 a 4,05 min). Las fracciones recogidas se evaporaron a sequedad y el residuo se secó a alto vacío, obteniendo el ácido Ic en forma de un sólido amarillo pálido (356,6 mg); ^{1}H RMN: (500 MHz, CD_{3}OD) \delta 9,05 (s, 1H), 8,46 (s, 1H), 8,04 (s, 1H), 7,47 (s a, 5H), 5,93 (d, J = 12,2H), 4,10 (s, 3H), 4,00-3,40 (s a, 8H), 2,53 (s, 3H); El análisis por ^{19}F RMN mostró que el material contenía TFA residual, (el porcentaje no se cuantificó); Procedimiento analítico de HPLC: % inicial de B = 0, % final de B = 100, Tiempo de gradiente = 2 min, Caudal = 5 ml/min, Columna: Xterra MS C18 7 \mu 3,0 x 50 mm, CL/EM: (ES+) m/z (M+H)^{+} = 584, HPLC T_{R} = 0,983.
Se disolvieron 172,2 mg del ácido Ic purificado en 1 ml de H_{2}O y después se añadieron aproximadamente 0,3 ml de EtOH absoluto (pureza 200). La mezcla se dejó en reposo en una nevera (temperatura de aproximadamente 3ºC) durante una noche, tiempo después del cual se observó material cristalino. Después, mezcla se calentó a temperatura ambiente, se diluyó con H_{2}O hasta un volumen de 3 ml y después se añadieron lentamente 20 ml de MeCN. Después de que se completara la adición, la mezcla se agitó a t.a. durante 2 h y después se filtró.
El sólido recogido (90 mg) se secó al vacío y después se secó a alto vacío. Se mostró que este material era cristalino por estudios de polvo de rayos x; Análisis elemental calculado para C_{25}H_{26}N_{7}O_{8}P\cdotH_{2}O: C 49,92; H 4,69; N 16,30; observado: C 49,66; H 4,62; N 15,99; p.f. = 205ºC (medido por calorimetría de exploración diferencial). El patrón de ^{1}H RMN para el material cristalino se comparó con el del ácido purificado y los dos eran coherentes con la
estructura.
\newpage
Ejemplo 8 Preparación de Iab (sal mono L-Lisina): dihidrogenofosfato de {3-[(4-benzoilpiperazin-1-il)(oxo)acetil]-4,7-dimetoxi-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il}metilo, sal L-lisina (1:1). La secuencia de reacciones se describe en el Esquema para el Ejemplo 8 Esquema para el Ejemplo 8
55
Preparación de clorometilfosfato de di-terc-butilo
56
La sal tetrabutilamonio de fosfato de bis-terc-butilo (45,1 g, 0,1 mol) y cloroyodometano (200 g, 1,14 mol) se combinaron en 100 ml de benceno, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas y después el benceno se retiró al vacío. Al residuo se le añadió una porción de 500 ml de éter etílico y el sólido insoluble se retiró por filtración. La concentración del filtrado al vacío y la retirada de los volátiles en una bomba de vacío proporcionaron clorometilfosfato de di-terc-butilo, en forma de un aceite amarillo claro o pardo claro que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Preparación de IIa: di-terc-butil fosfato de (3-(2-(4-benzoilpiperazin-1-il)-2-oxoacetil)-4, 7-dimetoxi-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il)metilo
57
Se añadió lentamente NaH (2,4 g, 60 mmol, al 60% en aceite) a una suspensión de IVa (8,4 g, 20 mmol) en THF seco (120 ml) y la mezcla se dejó en agitación durante una hora a temperatura ambiente. A la solución en agitación se le añadió lenta y cuidadosamente yodo (5 g, 20 mmol) disuelto en THF seco (10 ml) a una velocidad suficiente para mantener la formación de espuma bajo control. Después de que se completara la adición, la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos más y después se añadió el clorometilfosfato de di-terc-butilo \sim0,1 mol, obtenido como se ha descrito en la etapa uno. Después de agitar durante 16 horas, la mezcla de reacción se vertió en NH_{4}OAc enfriado con hielo (al 30%) (120 ml), seguido de extracción con EtOAc (3 x 300 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (100 ml) y después con salmuera (100 ml), se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, y se concentraron al vacío, proporcionando un residuo, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con EtOAc/Et_{3}N (100/1) y después con EtOAc/MeOH (100/1), dando el diéster IIa (9,0-10,3 g, AP \sim75%) en forma de un sólido amarillo claro con un rendimiento del 70-80% en varias realizaciones.
^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,09 (s, 1H), 7,48 (s, 1H), 7,40 (a, 5H), 6,15 (d, 2H, J = 11,5 Hz), 4,05 (s, 3H), 3,90 (s, 3H), 3,90-3,30 (a, 8H), 1,39 (s, 18H); ^{13}C RMN (125 MHz, CDCl_{3}) \delta 185,5, 170,7, 166,5, 146,9, 146,2, 139,6, 135,3, 130,2, 128,7, 128,4, 127,2, 124,5, 122,0, 120,8, 115,8, 83,8, 73,2, 57,3, 53,5, 46,1, 41,7, 29,8; EM m/z: (M+H)^{+}
calc. para C_{31}H_{42}N_{4}O_{9}P 645,27, encontrado 645,10.
Preparación de Iab: dihidrogenofosfato de {3-[(4-benzoilpiperazin-1-il)(oxo)acetil]-4,7-dimetoxi-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il}metilo, sal L-lisina (1:1)
58
59
Se disolvieron 500 mg del diéster IIa en una mezcla de agua (3 ml) y acetona (3 ml). La mezcla resultante se agitó a 40ºC durante 16 horas para permitir que se completara la solvolisis. A esta mezcla de reacción (\sim69 AP) se le añadió una solución acuosa 4 M de lisina para ajustar el pH a 4,83. A la mezcla de reacción se le añadió lentamente acetona (35 ml) durante 30 min a 45-50ºC. A 45ºC, la solución transparente se pipeteó con Iab cristalino y se mantuvo en agitación a esta temperatura durante 45 min. Después de que se completara la adición de la acetona, la solución se enfrió a temperatura ambiente durante 4 horas y la cristalización de Iab se completó durante una noche. El sólido se recogió por filtración y succión en atmósfera de nitrógeno durante 2 horas. El sólido cristalino blanco se secó al vacío a 50-55ºC durante 24 h, proporcionando 343 mg de Iab.
Iab obtenido en la operación anterior: ^{1}H RMN (500 MHz, CD_{3}OD) \delta 8,38 (s, 1H), 7,49 (m, 6H), 6,13 (d, 2H, J = 10,5 Hz), 4,06 (s, 3H), 3,92 (s, 3H), 4,00-3,40 (m, 8H), 3,58 (t, 1H, J = 6 Hz), 2,92 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 1,90-1,40 (m, 6H); ^{13}C RMN (125 MHz, CD_{3}OD) \delta 186,1, 173,2, 171,8, 167,8, 147,4, 146,4, 141,0, 135,4, 130,4, 128,8, 127, 2,124,6, 122,3, 120,2, 114,6, 73,2, 56,6, 54,7, 53,1, 46,0, 41,6, 39,2, 30,5, 27,0, 22,0, EMAR m/z: (M-lisina+H)^{+} calc. para C_{23}H_{26}N_{4}O_{9}P 533,1437, encontrado 533,1437. Anál. calc. C, 51,32; H, 5,79; N, 12,38; P, 4,56; encontrado: C, 48,54; H, 5,32; N, 11,76; P, 4,04. Punto de fusión 170ºC.
Obtenido por otro procedimiento (hidrólisis con TFA en cloruro de metileno), Iab era un hidrato 1,70 molar y sal lisina 1,14 molar. ^{1}H RMN (500 MHz, D_{2}O, 60ºC) \delta 8,72 (s, 1H), 7,84 (m, 6H), 6,44 (d, 2H, J = 10 Hz), 4,41 (s, 3H), 4,27 (s, 3H), 4,3-3,7 (m, 8H), 4,10 (t, 1H, J = 5 Hz), 3,39 (t, 2H, J = 5 Hz), 2,30-1,80 (m, 6H); ^{13}C RMN (125 MHz, D_{2}O, 27ºC) \delta 186,7, 174,9, 173,2, 167,9, 147,7, 145,7, 142,6, 134,3, 131,1, 129,2, 127,1, 124,3, 122,4, 120,1, 113,8, 73,5, 57,1, 54,9, 54,4, 47,7, 47,1, 46,3, 45,7, 42,6, 42,1, 42,0, 41,5, 39,5, 30,2, 26,8, 21,8. EMAR m/z: (M-lisina+H)^{+} calc. para C_{23}H_{26}N_{4}O_{9}P 533,1437, encontrado 533,1425. Anál. calc. C, 49,11; H 6,13; N, 12,05; encontrado: C, 48,93; H 6,26; N 12,07, P.F. 168-172ºC.
Ejemplo 9 Preparación de Ibb (sal mono L-Lisina): dihidrogenofosfato [3-[(4-benzoilpiperazin-1-il)(oxo)acetil]-4-fluoro-7-(1H-1,2,3-triazol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il]metilo, sal L-lisina (1:1). La secuencia de reacciones se describe en el Esquema para el Ejemplo 9 Esquema para el Ejemplo 9
60
Preparación de di-terc-butil clorometilfosfato 
\vskip1.000000\baselineskip
61 
\vskip1.000000\baselineskip
La sal tetrabutilamonio de fosfato de bis-terc-butilo (57 g, 0,126 mol, Digital Specialty Chemicals) y cloroyodometano (221 g, 1,26 mol) se agitaron a temperatura ambiente durante cuatro horas y después los volátiles se retiraron al vacío. Al residuo se le añadieron 500 ml de éter etílico y el sólido insoluble se retiró por filtración. La concentración del filtrado y la retirada final de los volátiles usando una bomba de vacío proporcionaron clorometilfosfato de di-terc-butilo (112 g), típicamente en forma de un aceite amarillo claro o pardo, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de IIb: di-terc-butil-fosfato de (3-(2-(4-benzoilpiperazin-1-il)-2-oxoacetil)-4-fluoro-7-(1H-1,2,3-triazol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il)metilo 
\vskip1.000000\baselineskip
62 
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió lentamente NaH (5,65 g, dispersión al 95% en aceite mineral, 0,224 mol) en una suspensión de IVb (20 g, 44,7 mmol) en THF seco (400 ml) y la mezcla se dejó en agitación durante 0,5 horas a temperatura ambiente. A la solución en agitación se le añadió lentamente una solución de yodo (11,3 g, 44,5 mmol) disuelto en THF seco (20 ml) a una velocidad suficiente para evitar que la reacción se volviera violenta. La mezcla resultante se agitó durante 3 horas más antes de que se introdujera una segunda porción de NaH al 95% (5,65 g, 0,224 mol). Después de 15 minutos a temperatura ambiente, se añadió en una porción clorometilfosfato de di-terc-butilo (112 g), obtenido en la etapa uno. Después de agitar durante 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se vertió en NH_{4}OAc enfriado con hielo (al 30%) (200 ml) y después se extrajo con EtOAc (3 x 500 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (200 ml) y después con salmuera (200 ml), se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se concentraron al vacío, proporcionando un residuo, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con EtOAc/MeOH/Et_{3}N (100/1/1), dando 15,0 g (rendimiento del 43% corregido para el 85% de AP) del diéster IIb en forma de un sólido amarillo claro.
^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,36 (s, 1H), 8,25 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 7,88 (s, 1H), 7,41 (a, 5H), 5,90 (d, 2H, J = 14,5 Hz), 3,90-3,40 (a, 8H), 1,23 (s, 18H); ^{13}C RMN (125 MHz, CDCl_{3}) \delta 182,9; 170,7, 165,1, 154,6, 152,5, 144,1, 135,1, 134,0, 131,9, 130,3, 128,7, 128,3, 127,2, 125,9, 124,3, 114,0, 84,1, 74,1, 46,2, 41,9, 29,6; EMAR m/z: (M+H)^{+}
calc. para C_{31}H_{38}FN_{7}O_{7}P 670,26, encontrado 670,34.
Preparación de Ibb (sal mono L-Lisina): dihidrogenofosfato de [3-[(4-benzoilpiperazin-1-il)(oxo)acetil]-4-fluoro-7-(1H-1,2,3-triazol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il]metilo, sal L-lisina (1:1) 
\vskip1.000000\baselineskip
63 
\vskip1.000000\baselineskip
El diéster IIb (27 g) se disolvió en una mezcla de agua (55 ml) y acetona (55 ml). La mezcla resultante (pH: sin determinar) se agitó a 40ºC durante 16 horas para completar la solvolisis. A esta mezcla de reacción se le añadió una solución acuosa 4 M de lisina para ajustar el pH a 3,51. A la solución se le añadió EtOH (500 ml) y la pared del matraz se recubrió con una pequeña cantidad de producto después de una noche. Después, la solución transparente se transfirió a otro matraz y a la mezcla de reacción se le añadió lentamente EtOH (1500 ml) durante \sim3 h. Después de que se completara la adición del etanol, la solución se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas y el sólido resultante (Ibb) se recogió por filtración y se aclaró con etanol. El sólido cristalino blanco se secó al vacío a 55ºC durante 24 h, proporcionando 10,92 g de Ibb (98 AP).
Este sólido se mezcló adicionalmente con 12,5 g de la sal obtenida de otras operaciones en 70 ml de agua. Después, se añadió EtOH (1000 ml) y la solución resultante se agitó a t.a. durante 20 horas. El sólido se recogió por filtración, se aclaró con EtOH (2 x 80 ml) y se secó al vacío a 50ºC en atmósfera de nitrógeno durante 44 horas, proporcionando 21,5 g de Ibb en AP de 98,7.
Ibb obtenido en el procedimiento anterior era sal lisina \sim1 molar con 1,12% de agua, 0,8% de TFA y 0,05% de etanol. ^{1}H RMN (500 MHz, CD_{3}OD 50ºC) \delta 83,94 (s, 1H), 8,87 (s, 1H), 8,69 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 7,83 (m, 5H), 5,81 (d, 2H, J = 12,5 Hz), 4,30-3,70 (m, 8H), 4,08 (t, 1H, J = 6,5 Hz), 3,67 (t, 2H, J = 10 Hz), 2,26 (m, 2H), 2,07 (m, 2H), 1,88 (m, 2H); ^{13}C RMN (125 MHz, D_{2}O, 30ºC) \delta 185,2, 174,9, 173,3, 166,8, 153,1, 146,8, 134,8, 134,3, 131,3, 131,1, 130,3, 129,3, 128,9, 128,7, 128,5, 127,2, 124,2, 112,6, 74,0, 54,9, 47,9, 47,2, 46,4, 45,9, 42,7, 42,2, 42,0, 41,7, 39,5, 30,3,26,8,21,8. EM m/z: (M-lisina+H)^{+} calc. para C_{23}H_{22}FN_{7}O_{7}P 558,1302, encontrado 558,1293. Anál. calc. C, 48,75; H, 5,07; N, 17,63; P, 4,33; encontrado: C, 49,02; H 4,90; N, 17,90; P, 4,37, P.F. 193ºC. pKa (potenciométrico) 6,1, 9,1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página siguiente)
Ejemplo 10 Preparación de Icb (sal mono trometamina): dihidrogenofosfato de [3-[(4-benzoilpiperazin-1-il)(oxo)acetil]-4-metoxi-7-(3-metil-1H-1,2,4-triazol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il]metilo, sal 2-amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol (1:1). La secuencia de reacciones se describe en el Esquema para el Ejemplo 10 Esquema para el Ejemplo 10
64 
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de di-terc-butil clorometilfosfato
65
Una mezcla de di-terc-butilfosfato de tetrabutilamonio (57 g, 0,126 mol, Digital Specialty Chemicals) y cloroyodometano (221 g, 1,26 mol) se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas antes que retirar los volátiles al vacío. Al residuo se le añadieron 500 ml de éter etílico y el sólido insoluble se retiró por filtración. La concentración del filtrado al vacío y la retirada de los volátiles restantes usando una bomba de vacío proporcionaron clorometilfosfato de di-terc-butilo en forma de un aceite pardo claro o amarillo, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de IIc: di-terc-butil-fosfato de (3-(2-(4-benzoilpiperazin-1-il)-2-oxoacetil)-4-metoxi-7-(3-metil-1H-1,2,4-triazol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il)metilo 
\vskip1.000000\baselineskip
66 
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió lentamente NaH (2,6 g, 10,3 mmol, al 95% en aceite, 5 equiv.) a una suspensión de IVc (10,0 g, 21,1 mmol) en THF seco (100 ml) y la mezcla se dejó en agitación durante 0,5 horas a temperatura ambiente. A la solución en agitación se le añadió lentamente una solución de yodo (5,27 g, 20,8 mmol) disuelta en THF seco (10 ml) a una velocidad suficiente para evitar la formación de espuma o una reacción violenta. La mezcla resultante se agitó durante 3 horas más antes de que se introdujera una segunda porción de 2,6 g de NaH. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, se añadió clorometilfosfato de di-terc-butilo, la extracción completa de clorometilfosfato de di-terc-butilo, obtenida en la etapa uno. Después de agitar durante 16 horas, la mezcla de reacción se vertió en NH_{4}OAc enfriado con hielo (al 30%) (120 ml), seguido de extracción con EtOAc (3 x 300 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (100 ml) y después con salmuera (100 ml), se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se concentraron al vacío, proporcionando un residuo, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con EtOAc/Et_{3}N (50/1) y después con EtOAc/MeOH (100/1)), dando 8,0 g (\sim75% de AP, rendimiento del \sim41%) del diéster IIc en forma de un sólido amarillo claro.
^{1}H RMN (500 MHz, CD_{3}OD) \delta 82 (s, 1H), 8,41 (s, 1H), 8,04 (s, 1H), 7,47 (a, 5H), 6,00 (d, 2H, J = 14,5 Hz), 4,10 (s, 3H), 4,00-3,40 (a, 8H), 2,49 (s, 3H), 1,28 (s, 18H); ^{13}C RMN (125 MHz, CD_{3}OD) \delta 18,6, 176,4, 172,9, 168,0, 162,6, 152,6, 147,5, 144,0, 136,5, 131,5, 130,8, 129,9, 129,1, 128,3, 126,1, 124,0, 116,2, 85,8, 75,4, 61,6, 57,7, 30,1, 22,2, 13,7; EMAR m/z: (M+H)^{+} calc. para C_{33}H_{43}N_{7}O_{8}P 696,29, encontrado 696,34.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de Icb (sal mono L-trometamina): dihidrogenofosfato de [3-[(4-benzoilpiperazin-1-il)(oxo)acetil]-4-metoxi-7-(3-metil-1H-1,2,4-triazol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il]metilo, sal 2-amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol (1:1) 
\vskip1.000000\baselineskip
67 
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 500 mg (AP \sim75, 0,54 mmol) del diéster IIc en una mezcla de agua (2,5 ml) y acetona (2,5 ml). La mezcla resultante se agitó a 40ºC durante 16 horas para completar la solvolisis. A esta mezcla de reacción se le añadió una solución acuosa 3,0 M de TRIS (mono trometamina) para ajustar el pH a 3,32. A la mezcla de reacción se le añadió lentamente acetona (30 ml) durante 1 hora.* Después de que se completara la adición de la acetona, la solución se agitó durante una noche para completar la cristalización de Icb. El sólido se recogió por filtración y se aclaró con 20:1 de acetona-agua (2 x 5 ml). El sólido cristalino blanco se secó al vacío en atmósfera de nitrógeno a 50ºC durante 24 h, proporcionando 290 mg de Icb (>98,5 AP).
*Después de añadir aproximadamente 15 y 20 ml de acetona, la mezcla de reacción se pipeteó con Icb cristalino.
Icb obtenido en la operación anterior: ^{1}H RMN (500 MHz, CD_{3}OD) \delta 8,83 (s, 1H), 8,52 (s, 1H), 8,02 (s, 1H) 7,49 (a, 5H), 5,469 (d, 2H, J = 13 Hz), 4,11 (s, 3H), 4,00-3,40 (m, 8H), 3,66 (s, 6H), 2,50 (s, 3H); ^{13}C RMN (125 MHz, CD_{3}OD) \delta 185,6, 171,9, 167,4, 161,4, 151,7, 146,9, 143,8, 135,4, 130,3, 129,7, 128,8, 127,2, 124,9, 122,6, 114,3, 73,5, 61,8, 59,9, 56,5, 46,0, 41,7, 12,6, EMAR m/z: (M-trisamina+H)^{+} calc. para C_{25}H_{27}N_{7}O_{8}P 584,1659, encontrado 584,1664. Anál. calc. C, 49,43; H, 5,29; N, 15,90; P, 4,39; encontrado: C, 49,18; H, 5,38; N, 15,59; P, 4,26. Punto de fusión 203ºC.
Obtenida por otro procedimiento (hidrólisis con TFA en cloruro de metileno), la sal de Icb es sal mono trometamina \sim1 molar con 0,47% de agua, 0,1% de acetona y 0,05% de metanol. ^{1}H RMN (500 MHz, d_{6}-DMSO, 30ºC) \delta 8,77 (s, 1H), 8,48 (s, 1H), 8,00 (s, 1H) 7,44 (a, 5H), 5,42 (d, 2H, J = 15 Hz), 4,02 (s, 3H), 3,70-3,30 (m, 8H), 3,41 (s, 6H), 2,38 (s, 3H); ^{13}C RMN (125 MHz, CDCl_{3}, 30ºC) \delta 184,8, 169,0, 165,8, 160,3, 150,4, 146,2, 143,2, 135,4, 129,4, 128,9, 128,2, 127,7, 126,9, 123,2, 122,2, 112,9, 72,3, 60,7, 59,0, 56,7, 13,4. EM m/z: (M-trisamina+H)^{+} calc. para C_{25}H_{27}N_{7}O_{8}P 584,2, encontrado 584,0. Anál. calc. C, 49,11; H, 5,37; N, 15,76; P,4,32; encontrado: C, 48,88; H 5,28; N, 15,71; P, 4,16, P.F. 201- 205ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento General para Formar Sales Adicionales de Iac 
\vskip1.000000\baselineskip
68 
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento A
Se añadieron 1,2 equiv. de alcóxido de metal a una solución de ácido fosfórico en THF y el precipitado se recogió en forma de sal.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento B
Se añadieron 2,2 equiv. (para Na, K) o 1,2 equiv. (para Mg) de alcóxido de metal a una solución de ácido fosfórico en THF. Después de 2 horas, el disolvente se evaporó y se añadió MeOH, proporcionando una solución transparente. Después, a la solución se le añadió EtOH o iPrOH hasta que se volvió turbia. Después, se añadió cuidadosamente MeOH para que la solución se volviera casi transparente de nuevo. La solución mixta se dejó abierta al aire 16 horas y el precipitado resultante se recogió en forma de la sal.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento C
Se añadieron 2,2 equiv. de amina a una solución de ácido fosfórico en THF. Después de 2 horas, el disolvente se evaporó y se añadió MeOH, proporcionando una solución transparente. Después, a la solución se le añadió EtOH o iPrOH hasta que se volvió turbia. Después, se añadió cuidadosamente MeOH para que la solución se volviera casi transparente de nuevo. La solución mixta se dejó abierta al aire durante 16 horas y el precipitado resultante se recogió en forma de la sal.
69
70
71
72 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 11 Preparación del Compuesto II'a a partir de IIa 
\vskip1.000000\baselineskip
73 
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió el éster di-fosfato IIa (500 mg) en 5 ml de TFA al 10% en THF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas antes de interrumpirse con una solución acuosa al 10% de Na_{2}CO_{3} (30 ml). Después de que se lavara con EtOAc (50 ml), la fase acuosa se concentró al vacío, proporcionando un residuo que se purificó usando un Sistema de HPLC preparativa automatizada Shimadzu, proporcionando el mono-fosfato deseado II'a (26,5 mg)). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,13 (s, 1H), 7,40 (a, 6H), 6,13 (d, 2H, J = 11,5 Hz), 4,05 (s, 3H), 3,88 (s, 3H), 3,90-3,40 (m, 8H), 1,39 (s, 9H); EM m/z: (M+H)^{+} calc. para C_{27}H_{34}N_{4}O_{9}P 589,21, encontrado 589,13; Tiempo de retención de CL 1,32 min (columna: C18 Xterra 4,6 x 50 mm, 5 \mum).
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación Alternativa de clorometilfosfato de di-terc-butilo 
\vskip1.000000\baselineskip
74 
\vskip1.000000\baselineskip
Reacción
Al reactor inerte se le añadieron manualmente fosfato de di-terc-butil-potasio (1,69 kg), 4,0 equiv. de carbonato sódico y 0,05 equiv. de hidrogenosulfato de tetrabutilamonio. Después, se bombeó cloruro de metileno (7,7 l/kg) a través de la esfera de pulverización para lavar las paredes del reactor. Con la temperatura de la camisa calefactora por debajo de 10ºC, se añadió una carga de agua exotérmica durante diez minutos (7,6 l/kg). La exotermia asociada era menor con una temperatura de extracción creciente de 11,1 a 16,2ºC durante el transcurso de la adición. Con la temperatura de la camisa calefactora y de la extracción cerca de 7 y 15ºC, respectivamente, se cargaron 2,0 equiv. de cloruro de clorometilsulfonilo (CMCS) mediante un embudo de adición. La carga continuó durante 2 horas, mientras se aumentaba lentamente la temperatura de la camisa calefactora a 20ºC durante la carga. La temperatura máxima de la extracción durante la carga de CMCS fue de 25,3ºC. La temperatura de la camisa calefactora se aumentó lentamente durante la carga para garantizar que la exotermia iniciada tal como indicaban los datos preliminares de laboratorio pudiera disminuirse hasta temperaturas de extracción inferiores. La mezcla de reacción se agitó y, después de 3,5 horas, una muestra de RMN indicó que la reacción se había completado en un 72%. Se dejó que procediera la reacción durante una noche con una temperatura de extracción comprendida entre 19,7 y 23,6ºC (Delta V historian). Una muestra de RMN tomada después de 16 horas indicó una conversión de la reacción del 76%. Las extracciones de laboratorio variaban de una conversión del 60 al 80%.
Tratamiento
Después de que se determinara que la reacción se había completado, a la extracción se le añadió más cantidad de agua a 9,3 l/kg para influir en la división de las fases. La fase menos rica en producto se transfirió a un recipiente de gran capacidad y la fase acuosa superior se desechó. Se mantuvo una pequeña fase en bruto con la fase orgánica rica en producto. La fase orgánica se devolvió a R-1A y se añadió más cantidad de agua a 5,1 l/kg como lavado. Las fases se dividieron, y la fase orgánica rica en producto, aproximadamente 18,5 kg, se llevó a un recipiente de gran capacidad mientras que la fase acuosa superior se desechó. No se observó ninguna fase o sólido en bruto en la segunda división. Sin embargo, se recomienda limpiar el filtro de la fase orgánica rica en producto para retirar las sales precipitadas.
Destilación de Cloruro de Metileno
La fase orgánica rica en producto se transfirió al recipiente del evaporador rotatorio de EVAPO-1A. La destilación del cloruro de metileno se inició con una temperatura de la camisa calefactora de aproximadamente 22ºC. La velocidad de destilación se disminuyó después de 4,5 horas y se recogió una muestra de extracción para analizar el contenido de cloruro de metileno. El análisis por RMN indicó una proporción de 4:1 de clorometilfosfato de di-terc-butilo a cloruro de metileno. Los resultados de laboratorio típicos de esta corriente indicaban una proporción 10:11, por lo que la destilación se continuó con un aumento de la temperatura de la camisa calefactora del evaporador rotatorio. Después de 2,5 horas más, se interrumpió la destilación. Una muestra de RMN de la extracción indicó que la proporción había aumentado hasta 5:1 de clorometilfosfato de di-terc-butilo a cloruro de metileno. La temperatura máxima de la camisa calefactora del evaporador rotatorio fue de 28,4ºC.
Pureza del aceite de clorometilfosfato de di-terc-butilo
El análisis por RMN del aceite de clorometilfosfato de di-terc-butilo indicó que la potencia era superior al 100%. El desarrollo del trabajo produjo típicamente el material producido con una potencia del 100\pm10%. El análisis de Karl-Fischer midió el contenido de agua al 0,02% en peso y el análisis por GC midió el cloruro de metileno al 10,69% en peso. Por lo tanto, la potencia indicada es del 89,29% en peso, contando para la contribución con cloruro de metileno y agua en el aceite.
Almacenamiento de clorometilfosfato de di-terc-butilo
El aceite de clorometilfosfato de di-terc-butilo se puso en un lugar frío y la temperatura se controló con un registrador de gráficos de barras. Las extracciones de laboratorio se mantuvieron típicamente entre 0 y 5ºC. Un análisis de RMN del producto después de las 104 horas de almacenamiento en el lugar frío indicó que el material no había perdido potencia.
(Los ensayos de seguridad realizados durante la campaña indican que después del mantenimiento, el aceite se auto-calienta con un aumento posterior de la presión).
Prep. de Patrón de RMN y Prep. de la Muestra Preparación de solución patrón de fosfato de trimetilo (TMPO_{4}):
Debe prepararse una solución patrón de TMPO_{4} basada en un rendimiento teórico de 100% M. Por ejemplo: una entrada de 10 g de la sal fosfato de di-t-butil-potasio debe producir 10,41 g (0,402 mol) de clorometilfosfato de di-terc-butilo. El volumen de diclorometano en la mezcla de reacción será de 75 ml. La molaridad de la solución es de 0,536. Debe prepararse una solución de TMPO_{4} en esa molaridad y deben combinarse 0,5 ml de esa solución con 0,5 ml de la fase de diclorometano de la reacción. Las integrales encontradas en la ^{31}P RMN pueden compararse directamente y darán el % de conversión de clorometilfosfato de di-terc-butilo.
Determinación del % del material de partida sin reaccionar en la fase acuosa de la reacción:
Después de registrar el volumen de la fase acuosa de la reacción, transferir exactamente 0,500 ml a un vial de 1 dracma que contenga un peso conocido del TMPO_{4} patrón interno. Añadir aproximadamente 0,24 ml de D_{2}O. Agitar para mezclar minuciosamente. Obtener el espectro de ^{31}P-cuant.
\vskip1.000000\baselineskip
Cálculo del % de material de partida sin reaccionar:
75 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo:
76 
\vskip1.000000\baselineskip
Determinación del % de potencia del aceite del producto:
Después de registrar el peso neto del aceite del producto destilado, tarar un vial con tapón a rosca de 1-dracma, que contiene un peso conocido del TMPO_{4} patrón interno. Transferir aproximadamente 0,02 ml del aceite del producto al vial y registrar el peso neto del aceite del producto. Añadir aproximadamente 0,7 ml de CDCl_{3}. Agitar para mezclar minuciosamente. Obtener el espectro de ^{31}P-cuant. Inspeccionar el espectro de ^{1}H RMN para determinar la presencia de catalizador de transferencia de fases residual (bisulfato de tetra-n-butil-amonio) y de cloruro de metileno. Indicar éste como % en moles con respecto al producto.
\vskip1.000000\baselineskip
Cálculo del % de potencia:
77 
\newpage
Ejemplo:
78 
\vskip1.000000\baselineskip
Datos de RMN para fosfato de di-terc-butil-cloronzetilo
^{1}H RMN (300,13 MHz, CDCl_{3}): \delta 11,52 (s, 18H), \delta 5,67 (d, J = 15,5, 2H) ^{13}C RMN (75,47 MHz, CDCl_{3}): \delta 29,77 (d, J = 4,5, 6C), \delta 73,34 (d, J = 7,5, 1C), \delta 84,16 (d, J = 1,5, 2C).
^{31}P RMN (121,49 MHz, CDCl_{3}): \delta -10,51 (s, 1P).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 12 Preparación Alternativa de Iab (profármaco de IVa) 
\vskip1.000000\baselineskip
79 
\vskip1.000000\baselineskip
Un matraz de fondo redondo de 4 bocas y de 500 ml equipado con un agitador situado en la parte superior, termopar, embudo de adición, una entrada de nitrógeno y un tabique se cargó IVa (20,01 g, 47,37 mmol), K_{2}CO_{3} (13,13 g, 95,00 mmol) y DMSO (100 ml, 1,41 mol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente, dando como resultado una suspensión heterogénea parda clara. Se añadió clorometilfosfato de di-terc-butilo (14,83 g, 57,32 mmol) mediante un embudo de adición y la reacción se calentó a 30ºC durante 16-24 horas, tiempo después del cual la reacción se enfrió a 10ºC. A la reacción se le añadió DCM (200 ml) y después se interrumpió lentamente con agua (200 ml), manteniendo la temperatura de la reacción por debajo de 20ºC, dando como resultado una mezcla bifásica. La fase del fondo rica en producto se separó, se lavó con agua (200 ml) y después se transfirió a un matraz de fondo redondo de 4 bocas y de 500 ml equipado con un agitador situado en la parte superior, termopar, embudo de adición y entrada de nitrógeno. Se añadió ácido trifluoroacético (53,0 ml, 700,94 mmol) mediante un embudo de adición, dando como resultado una ligera exotermia. La reacción se agitó durante 1-3 horas y después se enfrió a 0ºC. Se añadió metanol (300 ml), manteniendo la temperatura de la reacción por debajo de 20ºC y después se enfrió a 0ºC. El matraz de reacción se equipó con un aparato de destilación y se concentró al vacío hasta un volumen de 200 ml (200 torr, <30ºC). La reacción se pipeteó con Iac (0,200 g) y después se agitó durante una noche a temperatura ambiente, dando como resultado una suspensión. La suspensión se filtró y después la torta húmeda se lavó con THF (300 ml) y después se secó en una estufa de vacío a 50ºC durante una noche, dando como resultado un polvo de color amarillo pálido a blanco (23,94 g, 95%). ^{1}H RMN (400 MHz, DMSO-d6) \delta 8,30 (s, 1H), 7,55 (s, 1H), 7,44 (s, 5H), 6,12 (d, J = 10,6 Hz, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 3,80-3,22 (m, 8H); ^{13}C RMN (100 MHz, DMSO-d6) \delta 185,49, 169,26, 166,06, 146,20, 145,60, 140,64, 135,50, 129,68, 128,41, 127,04, 123,46, 121,17, 120,08, 114,32, 72,43, 56,92, 53,32, 45,22, 40,50; ES^{+} EM m/z (intensidad rel.) 533 (MH^{+}, 100), 453 (MH^{+}- H3PO4, 15).
80
A un reactor de 4 bocas y de 10 l equipado con un termopar, agitador situado en la parte superior, condensador y entrada de nitrógeno se le añadieron Iac (611 g, 1,15 mol) y agua (3875 ml). A la suspensión resultante se le añadió lisina (168 g, 1,15 mol). La reacción se agitó durante una hora a TA, se calentó a 50ºC y después se mantuvo a 50ºC con agitación durante una hora más. La solución brumosa resultante (pH = 4,55) se filtró a través de un filtro cuno de 10 micrómetros en un reactor de 4 bocas y de 20 l equipado con un termopar, agitador situado en la parte superior, condensador y entrada de nitrógeno. La reacción se calentó a 50ºC y después se añadió rápidamente acetona (8 l). La reacción se dejó calentar a 50ºC y después se añadió acetona (4 l) a una velocidad moderada, manteniendo la temperatura de la reacción por encima de 45ºC. La reacción se pipeteó con Iab (0,200 g) y después se enfrió a temperatura ambiente durante 5 horas, dando como resultado una suspensión. La suspensión se agitó durante una noche a temperatura ambiente y después se filtró. La torta húmeda se lavó con acetona (4 l) y después se secó en una estufa de vacío a 25ºC durante una noche con purgado del aire húmedo, dando como resultado un polvo blanco mullido (751 g, 96%).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 13 Preparación alternativa de Icb (Profármaco de IVc)
81
En un reactor de 10 l equipado con un agitador situado en la parte superior, termopar, aparato de destilación y entrada de nitrógeno se cargaron IVc (200,00 g, 422,39 mmol), Cs_{2}CO_{3} (344,06 g, 1,06 mol), KI (140,24 g, 844,81 mmol) y NMP (1,00 l, 10,38 mol). La reacción se agitó a temperatura ambiente, dando como resultado una suspensión heterogénea parda clara. Se añadió clorometilfosfato de di-terc-butilo (273,16 g, 1,06 mol) mediante un embudo de adición y la mezcla de reacción se calentó a 30ºC durante 16-24 horas con agitación, tiempo después del cual la reacción se enfrió a 5ºC. A la reacción se le añadió DCM (1,5 l) y después la reacción se interrumpió lentamente con agua (3,5 l), manteniendo la temperatura de la reacción por debajo de 20ºC, dando como resultado una mezcla bifásica. La fase del fondo rica en producto se separó, se lavó con agua (3,5 L x 3) y después se transfirió de nuevo al reactor. La solución se concentró al vacío hasta un volumen de 1 l, manteniendo la temperatura por debajo de 25ºC. Se añadió IPA (2 l) y después la reacción se concentró al vacío hasta un volumen de 2 l, manteniendo la temperatura por debajo de 25ºC. Después, la reacción se sembró con IIc (0,200 g) y se agitó durante una noche a temperatura ambiente, dando como resultado una suspensión. La suspensión se filtró y la torta húmeda se lavó con MTBE (1 l) y se secó en una estufa de vacío a 50ºC durante una noche, dando como resultado un polvo amarillo/blanco (207,1 g, 70%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,54 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,42 (s, 5H), 5,95 (d, J = 14,2 Hz, 2H), 4,06 (s, 3H), 3,97-3,36 (m, 8H), 2,50 (s, 3H), 1,27 (s, 18H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 184,64, 170,65, 165,91, 161,60, 150,82, 145,38, 141,89, 134,96, 130,20, 129,59, 128,68, 127,58, 127,10, 124,77, 122,64, 115,22, 83,90, 83,83, 73,69, 73,63, 56,95, 46,04, 41,66, 29,61, 29,56, 13,90; ES^{+} EM m/z (intensidad rel.) 696 (MH^{+},10); 640 (MH^{+} - isobutileno, 30), 584 (MH^{+} - 2 isobutileno, 100).
82 
\vskip1.000000\baselineskip
A un reactor de 4 bocas y de 10 l equipado con un termopar, agitador situado en la parte superior, condensador y entrada de nitrógeno se le añadieron IIc (200,24 g, 287,82 mmol), acetona (800,00 ml, 10,88 mol) y agua (800,00 ml, 44,41 mol). La reacción se calentó a 40ºC y se agitó durante 18-24 horas. La reacción se enfrió a 20ºC y después se añadió trometamina (33,62 g, 277,54 mmol). La reacción se calentó a 40ºC y después se agitó durante una hora más hasta que se disolvieron todos los sólidos. La reacción se enfrió a 20ºC y después se filtró a través de un filtro cuno de 10 micrómetros en un reactor de 4 bocas y de 10 l equipado con un termopar, agitador situado en la parte superior y entrada de nitrógeno. Se añadió rápidamente acetona (3 l), seguido de sembrado con Icb (0,500 g), y después se añadió más cantidad de acetona (3 l). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche, dando como resultado una suspensión que después se filtró. La torta húmeda se lavó con acetona (800 ml) y después se secó en una estufa de vacío a 50ºC durante una noche, dando como resultado un polvo blanco mullido (165,91 g, 82%).
\vskip1.000000\baselineskip
Información Suplementaria Aislamiento del Intermedio del Ácido Libre Ic 
\vskip1.000000\baselineskip
83 
\vskip1.000000\baselineskip
A un reactor de 3 bocas y de 250 ml equipado con un termopar, agitador situado en la parte superior, condensador y entrada de nitrógeno se le añadieron IIc (10,0 g, 14,37 mmol), acetona (40,00 ml, 544,15 mmol) y agua (40,00 ml, 2,22 mol). La reacción se calentó a 40ºC y se agitó durante 14-24 horas. La reacción se enfrió a 20ºC y después se agitó durante tres horas, dando como resultado una suspensión. La suspensión se filtró y después la torta húmeda se lavó con acetona (40,00 ml) y después se secó en una estufa de vacío a 50ºC durante una noche, dando como resultado un polvo blanco mullido (7,00 g, 83%). RMN (400 MHz, DMSO-d6) \delta 8,84 (s, 1H), 8,47 (s, 1H), 8,06 (s, 1H), 7,45 (s, 5H), 5,81 (d, J = 12,3 Hz, 2H), 4,03 (s, 3H), 3,91-3,19 (m, 8H), 2,39 (s, 3H); ^{13}C RMN (500 MHz, DMSO-d6) \delta 185,20, 169,32, 165,85, 160,75, 150,51, 146,30, 143,24, 135,53, 129,74, 129,22, 128,46, 127,34, 127,09, 123,67, 122,73, 113,94, 72,90 (d, ^{2}J_{C-P} = 5 Hz), 57,01, 45,2 (s a), 40,8 (s a), 13,66, ES^{+} EM m/z (intensidad rel.) 486 (MH^{+} - H_{3}PO_{4}, 100).
Ejemplo 14 Preparación Alternativa de Ibb (Profármaco de IVb)
84
En un reactor de 10 l equipado con un agitador situado en la parte superior, termopar y entrada de nitrógeno se cargaron IVb (400,00 g, 894,73 mmol), Cs_{2}CO_{3} (873,70 g, 2,68 mol), KI (297,70 g, 1,79 mol) y NMP (1,00 l, 10,38 mol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente, dando como resultado una suspensión heterogénea parda clara. Se añadió clorometilfosfato de di-terc-butilo (460,50 g, 1,78 mol) mediante un embudo de adición y la reacción se calentó a 30ºC durante 16-24 horas, momento en el que la reacción se enfrió a 5ºC. A la reacción se le añadió n-BuOAc (2,4 l) y después la reacción se interrumpió lentamente con agua (4 l), manteniendo la temperatura de la reacción por debajo de 20ºC, dando como resultado una mezcla bifásica. La fase acuosa del fondo se retiró del reactor y después la fase superior rica en producto se pipeteó con IIc (0,40 g) y después se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente, dando como resultado una suspensión. La suspensión se filtró y después la torta húmeda se lavó con MTBE (1,6 l) y después se secó en una estufa de vacío a 50ºC durante una noche, dando como resultado un polvo amarillo/blanco (483,2 g, 81%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,35 (s, 1H), 8,27 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,42, (s, 5H), 5,92, (d, J = 14,9 Hz, 2H), 4,02-3,40 (m, 8H), 1,24 (s, 18H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 182,75, 170,64, 152,07, 144,03, 134,91, 133,96, 131,82, 130,21, 128,68, 128,27, 128,00, 127,07, 125,81, 124,01, 113,82, 84,00, 83,93, 73,97, 46,12, 41,90, 29,57, 29,53; ES^{+}EM m/z (intensidad rel.) 558 (MH^{+}, 100).
85
A un reactor de 4 bocas y de 300 ml equipado con un termopar, agitador situado en la parte superior, condensador y entrada de nitrógeno se le añadieron IIb (18,0 g, 26,87 mmol), IPA (36,00 ml, 470,92 mol) y agua (36,00 ml, 2,0 mol). La reacción se calentó a 40ºC y se agitó durante 18-24 horas. La reacción se enfrió a 20ºC y después se añadió lisina (3,73, 25,54 mmol). La reacción se agitó durante 1 hora hasta que se disolvieron todos los sólidos. Se añadió IPA (54 ml) durante 30 minutos seguido de sembrado con Ibb (0,180 g) y agitación durante 30 minutos más. Se añadió IPA (18 ml) durante 1 hora y después la reacción se calentó a 50ºC, dando como resultado una suspensión fina. La reacción se pipeteó con Ibb (0,180 g), después se añadió IPA (36 ml) durante 2 horas y después se agitó durante 12 horas, dando como resultado una suspensión. La reacción se calentó a 70-80ºC durante 2 a 3 horas y después se enfrió a 50ºC. Se añadió IPA (59 ml) durante 1 hora y después se añadió más cantidad de IPA (121 ml) durante 1 hora. La reacción se enfrió a 20ºC durante 2 horas, después se agitó durante 2 horas más y después se filtró. La torta húmeda se lavó con IPA (180 ml) y después se secó en una estufa de vacío a 50ºC durante una noche, dando como resultado un polvo blanco (15,43 g, 82%).
Información Suplementaria Procedimiento para el Aislamiento del Intermedio del Ácido Libre Ibc
86
A un matraz de 3 bocas y de 500 ml equipado con un termopar, agitador situado en la parte superior, condensador y entrada de nitrógeno se le añadieron IIb (50,00 g, 74,76 mmol), acetona (100,00 ml, 1,36 mol) y agua (100,00 ml, 5,55 mol). La reacción se calentó a 40ºC y se agitó durante 18-24 horas.
A un matraz de 3 bocas y de 250 ml equipado con una sonda de pH, barra de agitación magnética y entrada de nitrógeno se le añadieron 150 ml de la solución de Ibc anterior y después el pH se ajustó a pH = 6,2 con NaOH 10 N. La solución se transfirió a un embudo de decantación, después se lavó con EtOAc (100 ml) y después con DCM (100 ml) y después se transfirió de nuevo al matraz de 3 bocas y de 250 ml. El pH se ajustó a pH = 1,3 con HCl 2 N seguido de agitación durante tres horas, dando como resultado una suspensión que se filtró. La torta húmeda se suspendió de nuevo en MTBE (150 ml) y después se filtró, seguido de una nueva suspensión en THF/Agua (100:1, 130 ml) durante 45 minutos, después se filtró y se secó en una estufa de vacío a 50ºC durante una noche, dando como resultado un polvo blanco (10,0 g, 33%). RMN (400 MHz, DMSO-d6) \delta 8,69 (s, 1H), 8,62 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 7,98 (s, 1H), 7,41 (s, 5H), 5,47 (d, J = 13,3 Hz, 2H), 3,99-3,18 (m, 8H); ^{13}C RMN (100 MHz, DMSO-d6) \delta 183,97, 169,23, 165,20, 151,69, 145,91, 135,48, 133,83, 131,59, 129,65, 129,11, 129,03, 128,42, 127,77, 127,49, 127,03, 122,62, 112,08, 72,57, ES^{+} EM m/z (intensidad rel.) 558(MH^{+}, 100).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 15 Preparación del Profármaco Ie
Etapa uno
\vskip1.000000\baselineskip
87 
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de 2-(1-(2-(4-metoxi-7-(3-metil-1H-1,2,4-v-triazol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-3-il)-2-oxoacetil)piperidin-4-ilideno)-2-(piridin-2-il)acetonitrilo (IVe): Se combinaron ácido 2-(4-metoxi-7-(3-metil-1H-1,2,4-triazol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-3-il)-2-oxoacético (1,5 g), clorhidrato de 2-(piperidin-4-ilideno)-2-(piridin-2-il)acetonitrilo (1,5 g), 3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona (DEPBT) (2,1 g) y Base de Hunig (2 ml) en 20 ml de DMF. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La DMF se retiró por evaporación a presión reducida y el residuo se repartió en MeOH (80 ml). El precipitado se recogió por filtración, proporcionando 0,85 g del producto, 2-(1-(2-(4-metoxi-7-(3-metil-1H-1,2,4-triazol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-3-il)-2-oxoacetil)piperidin-4-ilideno)-2-(piridin-2-il)acetonitrilo (IVe). ^{1}H RMN (500 MHz, DMSO-d6) \delta 12,42 (s, 1H), 9,23 (m, 1H), 8,69 (m, 1H), 8,27 (m, 1H), 7,89 (m, 2H), 7,58 (m, 1H), 7,52 (m, 1H), 3,98 (s, 3H), 3,99-2,70 (m, 8H), 2,60 (m, 3H). EM m/z: (M+H)^{+} calc. para C_{25}H_{23}N_{8}O_{3} 483,19, encontrado 483,18.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Etapa dos
88
Se combinaron éster fosfato (45,1 g, 0,1 mol) y cloroyodometano (200 g, 1,14 mol) en 100 ml de benceno y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas, antes de que el benceno se retirara al vacío. Después, al residuo se le añadieron 500 ml de éter etílico y el sólido insoluble se retiró por filtración. La concentración del filtrado proporcionó clorometilfosfato de di-terc-butilo, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa tres
89
Se añadió lentamente NaH (0,2 g, 95%) en una suspensión de 2-(1-(2-(4-metoxi-7-(3-metil-1H-1,2,4-triazol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-3-il)-2-oxoacetil)piperidin-4-ilideno)-2-(piridin-2-il)acetonitrilo (IVe) en THF seco (20 ml) y la mezcla se dejó en agitación durante una hora a temperatura ambiente. A la solución en agitación se le añadió lentamente yodo (0,4 g) disuelto en THF seco (2 ml). La mezcla se agitó durante 3 horas más antes de que se cargaran 0,2 g de NaH. Después de que se completara la adición, la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos más y después se añadió clorometilfosfato de di-terc-butilo, obtenido en la etapa dos. Después de agitar durante 16 horas, la mezcla de reacción se vertió en NH_{4}OAc enfriado con hielo (al 30%) (50 ml), seguido de la extracción con EtOAc (3 x 100 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (50 ml) y después con salmuera (50 ml), se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se concentraron al vacío, proporcionando un residuo, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con EtOAc/Et_{3}N (100/1)), dando 330 mg de (3-(2-(4-(ciano(piridin-2-il)metileno)piperidin-1-il)-2-oxoacetil)-4-metoxi-7-(3-metil-1H-1,2,4-triazol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il)metilfosfato de di-terc-butilo (IIe). ^{1}H RMN (500 MHz, CD_{3}OD) \delta 8,85 (m, 1H), 8,66 (m, 1H), 8,45 (m, 1H), 8,06 (m, 1H), 7,92 (m, 1H), 7,60 (m, 1H), 7,43 (m, 1H), 6,05 (m, 2H), 4,11 (s, 3H), 4,00 (m, 1H), 3,82 (m, 1H), 3,76 (m, 1H), 3,60 (m, 1H), 3,04 (m, 1H), 2,95 (m, 1H), 2,85 (m, 1 H), 2,80 (m, 1H), 2,52 (s, 3H), 1,30 (m, 18H). EM m/z: (M+H)^{+} calc. para C_{34}H_{42}N_{8}O_{7}P 705,29, encontrado 605,30.
Etapa cuatro
90
Se disolvió (3-(2-(4-(ciano(piridin-2-il)metileno)piperidin-1-il)-2-oxoacetil)-4-metoxi-7-(3-metil-1H-1,2,4-tria-
zol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il)metilfosfato de di-terc-butilo (IIe) en 8 ml de una solución mixta de TFA y diclorometano (TFA al 10%/CH_{2}Cl_{2}) y la mezcla se agitó durante tres horas. Todos los disolventes se retiraron al vacío y el residuo se purificó usando un Sistema de HPLC preparativa automatizada Shimadzu, dando 25 mg de (3-(2-(4-(ciano(piridin-2-il)metileno)piperidin-1-il)-2-oxoacetil)-4-metoxi-7-(3-metil-1H-1,2,4-triazol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il)metilhidrogenofosfato de terc-butilo (II'e) y 33 mg de dihidrogenofosfato de (3-(2-(4-(ciano(piridin-2-il)metileno)piperidin-1-il)-2-oxoacetil)-4-metoxi-7-(3-metil-1H-1,2,4-triazol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il)metilo (Ie).
\global\parskip1.000000\baselineskip
(3-(2-(4-(Ciano(piridin-2-il)metileno)piperidin-1-il)-2-oxoacetil)-4-metoxi-7-(3-metil-1H-1,2,4-triazol-1-il)-1H-
pirrolo[2,3-c]piridin-1-il)metilhidrogenofosfato de terc-butilo (II'e): ^{1}H RMN (500 MHz, CD_{3}OD) \delta 8,83 (m, 1H), 8,55 (m, 1H), 8,35 (m, 1H), 7,92 (m, 2H), 7,54 (m, 1H), 7,41 (m, 1H), 5,86 (m, 2H), 3,98 (s, 3H), 3,96 (m, 1H), 3,72 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 3,47 (m, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,85 (m, 1H), 2,71 (m, 1H), 2,65 (m, 1H), 2,40 (s, 3H), 1,15 (m, 9H). EM m/z: (M+H)^{+} calc. para C_{30}H_{34}N_{8}O_{7}P 649,23, encontrado 649,22.
Dihidrogenofosfato de (3-(2-(4-(ciano(piridin-2-il)metileno)piperidin-1-il)-2-oxoacetil)-4-metoxi-7-(3-metil-1H-1,2,4-triazol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il)metilo (Ie): ^{1}H RMN (500 MHz, DMSO-d6) \delta 8,88 (m, 1H), 8,65 (m, 1H), 8,50 (m, 1H), 8,06 (m, 1H), 7,90 (m, 1H), 7,49 (m, 2H), 5,82 (m, 2H), 4,04 (s, 3H), 3,96 (m, 1H), 3,88 (m, 1H), 3,72 (m, 1H), 3,46 (m, 1H), 2,94 (m, 1H), 2,82 (m, 2H), 2,73 (m, 1H), 2,40 (m, 3H); ^{13}C RMN (125 MHz, DMSO-d6) \delta 185,2, 165,6, 160,6, 159,1, 151,0, 150,4, 149,5, 146,2, 143,1, 137,4, 129,1, 127,2, 124,4, 123,6, 122,6, 117,4, 116,3, 113,9, 110,0, 72,8, 56,9, 48,4, 44,4, 36,4, 34,0, 13,6. EM m/z: (M+H)^{+} calc. para C_{26}H_{26}N_{8}O_{7}P 593,17, encontrado 593,14.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 16 Preparación del Profármaco If
91
A una mezcla de IVf (99,5 mg, 0,21 mmol) en 1-metil-2-pirrolidinona (1,0 ml) a t.a. en un vial tapado se le añadieron KI (144 mg, 0,87 mmol) y Cs_{2}CO_{3} (416 mg, 1,28 mmol) y la mezcla se agitó durante aproximadamente 5 min. Después, se añadió gota a gota reactivo de clorometilfosfato de di-terc-butilo (218 mg, 0,84 mmol). Después, la mezcla resultante se agitó de 35 a 40ºC durante 20 horas. Después, la mezcla se diluyó con H_{2}O (aproximadamente 8 ml) y se extrajo con EtOAc (aproximadamente 8 ml). El extracto orgánico se separó y se evaporó, dando el clorometilfosfato de di-t-butilo; Procedimiento de HPLC analítica: Disolvente A 10% de MeOH-90% de H_{2}O-0,1% de TFA; Disolvente B 90% de MeOH-10% de H_{2}O-0,1% de TFA; % de partida de B = 0, % final de B = 100, Tiempo de gradiente = 2 min, Caudal = 5 ml/min, Columna: Xterra MS C18 S7 3,0 x 50 mm; CL/EM: (ES) m/z (M+H)^{+} = 694,22, HPLC T_{R} = 1,243.
Una mezcla del Intermedio IIf en H_{2}O/isopropanol (1,0 ml/1,0 ml) en un matraz de fondo redondo tapado se agitó a 40ºC durante 9,5 horas. Después, la mezcla se enfrió a t.a. y la solución se transfirió a un vial usando una pipeta. A esta solución se le añadió MeCN (1,0 ml), y después se añadió lentamente isopropanol con agitación intermitente usando una espátula. Después, los precipitados blanquecinos se filtraron, se lavaron con isopropanol (2 x 1,0 ml) y después se secaron a alto vacío, dando el profármaco If; ^{1}H RMN (500 MHz): (DMSO-d_{6}) \delta 8,76 (s, 1H), 8,71 (s, 1H), 8,69 (s, 1H), 8,49 (s, 1H), 8,09 (d, J = 8, 1H), 8,06 (s, 1H), 7,89 (d, J = 7, 1H), 7,85 (t ap., 1H), 7,59 (t ap., 1H), 5,68 (d, J = 13, 2H), 4,00 (m a, 2H), 3,90 (m a, 2H), 3,85 (m a, 2H), 3,65 (m a, 2H); Procedimiento de HPLC analítica: Disolvente A 10% de MeOH-90% de H_{2}O-0,1% de TFA; Disolvente B 90% de MeOH-10% de H_{2}O-0,1% de TFA; % de partida de B = 0, % final de B = 100, Tiempo de gradiente = 2 min, Caudal = 5 ml/min, Columna: Xterra MS C18 S7 3,0 x 350 mm; CL/EM: (ES) m/z (M+H)^{+} = 582,00, HPLC T_{R} = 1,797.
Para que sea satisfactoria, la conversión del profármaco en el compuesto parental debe iniciarse con fosfatasas alcalinas en seres humanos. Los estudios cualitativos in vitro que usaban fosfatasa alcalina de placenta humana y los estudios in vivo en ratas mostraron que la conversión de los profármacos era rápida tanto in vitro con enzimas humanas como in vivo en ratas. Idealmente, la velocidad de conversión será rápida de manera que sólo se produzca una exposición limitada al profármaco y se dé como resultado una exposición máxima al agente antiviral parental activo. Los datos de los estudios (que se muestran a continuación) demuestran que en los tres ejemplos de profármacos evaluados en ratas, el profármaco se convierte directamente en el fármaco parental activo y que los niveles plasmáticos del profármaco son muy bajos en comparación con el fármaco parental en todos los puntos de datos. Estos estudios se realizaron a dosis en las que dichas dosis de fármaco parental y la dosis equivalente de profármaco fosfato eran bajas y aproximadamente iguales, \sim5 mg/kg. Como las ventajas de los profármacos son superar la absorción limitada en disolución, a bajas dosis las ventajas de los profármacos sobre las moléculas parentales menos solubles para uso clínico en pacientes no serán evidentes. Se usaron estudios in vivo con dosis bajas para determinar si los profármacos generaban la molécula parental. La solubilidad de las moléculas parentales IV depende de la forma cristalina. Se prefiere una forma cristalina para el desarrollo de fármacos. Los datos para todas las moléculas parentales pueden resumirse diciendo que la solubilidad acuosa del material cristalino para todas las moléculas parentales IV es <50 mg/ml y en algunos casos mucho menor. Por lo tanto, la solubilidad acuosa intrínseca de las moléculas parentales es baja y juega un papel importante a la hora de provocar la absorción limitada por la disolución a dosis superiores.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 Propiedades Biológicas y Farmacéuticas de derivados de piperazina azaindolooxoacética de dihidrogenofosfato de N-metil (o sales)
92
93 
\vskip1.000000\baselineskip
En las tablas a continuación el término "LLQ" significa límite inferior de cuantificación (es decir no detectado).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2 Estudios MAP A: Resumen de PK después de PO y IV Administración del profármaco Ia a Ratas. Comparación con la PO Histórica del Compuesto IVa en Ratas
94
95 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 Estudio MAP B: Resumen de PK después de la administración PO y IV del Profármaco Ib a Ratas. Comparación con la PO Histórica del Compuesto IVb en Ratas
96
97 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 Estudio MAP C: Resumen de PK después de la Administración PO e IV del Profármaco Ic a Ratas. Comparación con la PO Histórica del Compuesto IVc en Ratas
98
99
Clave para las tres tablas 2, 3 y 4:
100
Se realizó un estudio de aumento de la dosis D de uno de los profármacos (Ica) en ratas para demostrar las ventajas significativas de los profármacos sobre el compuesto parental para el uso potencial en el tratamiento de pacientes de VIH-1 después de la dosificación oral. Los datos de la exposición y los parámetros medidos del estudio de aumento de la dosis del profármaco se compararon con datos similares de estudios históricos realizados con moléculas parentales.
Las Figuras 3 y 4 comparan el AUC (el área bajo la curva, una medida de exposición al fármaco en rata) de IVc a partir de la dosificación oral del profármaco Ica (estudio D) con los obtenidos de la dosificación de la molécula parental IVc (estudio E) y un estudio tóxico cinético de rata (TK). Los detalles para el estudio de aumento de dosis IVc histórico (estudio E) y el de TK de rata (F) se muestran en estas figuras.
Como puede observarse a partir de las Figuras 3 y 4, el AUC y la Cmax de la molécula parental después de la administración oral del profármaco (triángulos) es mayor que el resultante de la administración del fármaco parental en dos estudios diferentes. Claramente, los datos muestran que para maximizar los múltiplos de exposición del fármaco en el plasma, el profármaco ofrece una ventaja sorprendente. Puesto que las estructuras químicas de este tipo de molécula son similares, se espera que los profármacos de esta clase muestren una potenciación de la exposición a partir de la administración de profármacos en lugar de la del compuesto parental. Dada la incertidumbre de la mejora de la exposición oral con profármacos de fosfato y la novedad de los nuevos compuestos, este resultado no era obvio y es sorprendente en toda su magnitud.
101 
\vskip1.000000\baselineskip
Protocolo del Estudio de PK IV y Oral en Ratas de los Estudios de los Profármacos de Fosfato A, B y C
Los compuestos Ic (profármaco de fosfato de IVc), Ib (profármaco de fosfato de IVb) e Ia (profármaco de fosfato de IVa) se administraron por separado a grupos de tres ratas macho Sprague-Dawley mediante embolada IV (1 mg/kg; todas las dosis que se presentan en este documento eran equivalentes al compuesto parental) o mediante sonda oral (5 mg/kg). Las ratas para los estudios de dosificación oral se mantuvieron en ayunas durante una noche. El compuesto Ic se administró como ácido libre, mientras que los otros dos se administraron como sales de sodio. Las soluciones de dosificación de los tres profármacos para la administración IV y oral se prepararon en solución salina normal al 100% a 1 mg/ml (las concentraciones de la solución de dosificación eran equivalentes al compuesto parental). Las muestras de plasma se recogieron en vacutainers con EDTA durante 24 horas y se analizaron mediante CL/EM/EM para las moléculas de los profármacos y del compuesto parental. El análisis farmacocinético se realizó en Kinetica^{TM}.
Los procedimientos para los análisis de CL/EM/EM se muestran en los protocolos a continuación.
Los resultados de este estudio se muestran en las Tablas 2-4, en las dos columnas centrales.
\vskip1.000000\baselineskip
Protocolo del Estudio de Aumento de Dosis Oral de Ica en Ratas (Estudio D)
A grupos de tres ratas macho Sprague-Dawley en ayunas se les administró por vía oral el compuesto Ica (sal disódica) a 4,5, 21, y 163 mg/kg (las dosis era equivalente a IVc). Las soluciones de dosificación se prepararon en agua a 1, 5, y 20 mg (compuesto Ic (ácido libre) equivalente)/ml para las dosis de 4,5, 21, y 163 mg (equivalente de compuesto IVc)/kg, respectivamente. Las muestras de plasma se recogieron en vacutainers con EDTA durante 24 horas, y se analizaron mediante CL/EM/EM para Ic e IVc. El análisis farmacocinético se realizó en Kinetica^{TM}.
Los resultados de este estudio se muestran en la Tabla 46 y en las Figuras 3-5.
\vskip1.000000\baselineskip
102
103
Procedimientos In Vivo Procedimiento para el Estudio A1: Administración PO e IV de IVa a Ratas; la Dosis de PO era de 5 mg/kg
El compuesto IVa se administró en una solución de polietilenglicol 400 (PEG400)/etanol (EtOH) (90/10, v/v) a menos que se indique otra cosa. Se recogieron muestras de plasma y de tejido y se almacenaron a -20ºC hasta el análisis. Se usaron ratas Sprague-Dawley macho (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottdale, PA 15683) con cánulas implantadas en la vena yugular y/o en el conducto biliar en los estudios farmacocinéticos del compuesto IVa. Las ratas se mantuvieron en ayunas durante una noche en los estudios de PO. Se recogieron muestras de sangre (0,3 ml) de la vena yugular en tubos microtainer que contenían EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07147), para obtener el plasma. En los estudios IV, se administró una dosis de 1 mg/kg a 3 ratas durante 0,5 minutos y se recogieron muestras de plasma en serie antes de la dosificación y 2, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480, y 1440 minutos después de la dosificación. En los estudios de PO, las ratas (n = 3) recibían dosis PO de 5 y 100 mg/kg. Se tomaron muestras de plasma en serie antes de la dosificación y 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480, y 1440 minutos después de la dosificación.
Los resultados orales (PO) de este estudio se muestran en la última columna más a la derecha de la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudio del Fármaco Parental B1
Para los estudios farmacocinéticos IV y PO del COMPUESTO IVb en ratas, se disolvió el COMPUESTO IVb en PEG-400/etanol (90/10) como solución. Para los estudios farmacocinéticos IV y PO del COMPUESTO IVB en perros, el COMPUESTO IVb se disolvió en PEG-400/etanol (90/10) con un ajuste del pH con NaOH 0,1 N. Los detalles de las formulaciones se proporcionan en la Tabla 6.
Rata. Se usaron ratas Sprague-Dawley macho (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottdale, PA) con cánulas implantadas en la vena yugular y/o en el conducto biliar. Las ratas se mantuvieron en ayunas durante una noche en el estudio farmacocinético de PO. Se recogieron muestras de sangre de 0,3 ml de la vena yugular en tubos microtainer que contenían EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y se centrifugaron para separar el plasma.
En el estudio de IV, El COMPUESTO IVb se suministró a 1 mg/kg como una embolada durante 0,5 min (n = 3). Se recogieron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y 2, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 y 1440 minutos después de la dosificación.
En el estudio de PO del COMPUESTO IVb, las ratas (n = 3) recibían una dosis oral de 5 mg/kg del COMPUESTO IVB. Se recogieron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480, y 1440 minutos después de la dosificación.
Los resultados de este estudio oral (PO) se muestran en la Tabla 3, columna más a la derecha.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 6 Formulación de IVb para los estudios in vivo
104 
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimientos Bioanalíticos para Estudios In Vivo que Analizan IVb
Esto se refiere a procedimientos para analizar los niveles de concentración de IVb en muestras de plasma de rata (usadas para los estudios B y B1).
Cuantificación del Compuesto IVb mediante CL/EM/EM en Plasma. Se prepararon alícuotas de muestras de plasma de estudios de rata, perro, mono o chimpancé para el análisis precipitando proteínas del plasma con dos volúmenes de acetonitrilo que contenía el patrón interno, COMPUESTO IVa. Los sobrenadantes resultantes se separaron de las proteínas precipitadas mediante centrifugación durante 10 minutos y se transfirieron a viales del automuestreador. Las muestras se prepararon de forma manual o con el uso del manipulador de líquidos automatizado de Tomtec. Se inyectó una alícuota de 5 ml para el análisis.
El sistema de HPLC estaba constituido por dos bombas Shimadzu LC10AD (Columbia, MD), un toma-muestras automático Shimadzu SIL-HTC (Columbia, MD) y un compartimiento de columna de Hewlett Packard Series 1100 (Palo Alto, CA). La columna era una YMC Pro C18 (2,0 x 50 mm, partículas de 3 \mum, Waters Co., Milford, MA), mantenida a 60ºC y un caudal de 0,3 ml/min. La fase móvil estaba constituida por formiato de amonio 10 mM y ácido fórmico al 0,1% en agua (A) y formiato de amonio 10 mM al 100% y ácido fórmico al 0,1% en metanol (B). La composición de la fase móvil inicial era del 95% de A. Después de la inyección de la muestra, la fase móvil cambio al 15% de A /85% de B durante 2 minutos y se mantuvo en esta composición durante un minuto adicional. La fase móvil volvió después a las condiciones iniciales y la columna se re-equilibró durante 1 minuto. El tiempo total del análisis era de 4 minutos.
La HPLC se conectó con un Micromass Quattro LC. Se usó nitrógeno de pureza ultra alta como gas de nebulización y desolvatación a caudales de 100 l/h para la nebulización y 1100 l/h para la desolvatación. La temperatura de desolvatación era de 300ºC y la temperatura de partida era de 150ºC. La adquisición de los datos utilizaba la monitorización de reacción seleccionada (SRM). Se seleccionaron iones que representaban las especies (M+H)^{+} para IVb y para el patrón interno en EM 1 y se disociaron mediante colisión con argón a una presión de 2 x 10^{-3} torr para formar iones del producto específico que se controlaron posteriormente mediante EM2. Las transiciones, voltajes y tiempos de retención se resumen en la Tabla 7.
TABLA 7 Parámetros para el Análisis EM/EM del Compuesto IVB y del Compuesto IVa (IS) 
\vskip1.000000\baselineskip
105 
\vskip1.000000\baselineskip
La curva patrón para el plasma variaba entre 4 y 8000 ng/ ml y la curva del cerebro de 1-1000 ng/ ml. Las curvas se ajustaron con una regresión cuadrática ponderada mediante concentración recíproca (1/x). Los patrones se analizaron por duplicado. También se analizaron por triplicado muestras de control de calidad (QC) preparados en plasma blanco, a tres concentraciones en el intervalo de la purga de calibración con cada conjunto analítico de plasma. Para este compuesto, las concentraciones predichas del 90% de las QC de plasma estaban en un 20% de concentración nominal, lo que indicaba un comportamiento del ensayo aceptable.
Vehículos y Formulaciones. En referencia a la Tabla 8, cuando el vehículo usado contiene NaOH, las formulaciones de la solución del Compuesto IVc se ajustaron a pH usando NaOH para obtener un pH de 8,6-9,0, en el que el compuesto se ioniza parcialmente, en base a su pKa a 8,4,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 8 Formulaciones del Compuesto IVc para Estudios In Vivo
106
Cuantificación del Compuesto IVc mediante CL/EM/EM en Plasma (Utilizada en los Estudios C, C1 y D). Se prepararon alícuotas de muestras de plasma de estudios de rata, perro, mono, y chimpancé para el análisis precipitando proteínas del plasma con dos volúmenes de acetonitrilo que contenían el patrón interno, el compuesto IVa. Los sobrenadantes resultantes se separaron de las proteínas precipitadas mediante centrifugación durante 10 minutos y se trasfirieron a viales de automuestreo. Las muestras se prepararon de forma manual o mediante el uso de un manipulador de líquidos automatizado de Tomtec. El sistema de HPLC esta constituido por dos bombas Shimadzu LC10AD (Columbia, MD), un automuestreador Shimadzu SIL-HTC (Columbia, MD) y un compartimento de columna de Hewlett Packard Series 1100 (Palo Alto, CA). La columna era una YMC Pro C18 (2,0 x 50 mm, partículas de 3 \mum, Waters Co., Milford, MA), mantenida a 60ºC y un caudal de 0,3 ml/min. La fase móvil estaba constituida por formiato de amonio 10 mM y ácido fórmico al 0,1% en agua (A) y formiato de amonio 10 mM al 100% y ácido fórmico al 0,1% en metanol (B). La composición de la fase móvil inicial era del 95% de A. Después de la inyección de la muestra, la fase móvil se cambio al 15% de A/85% de B durante 2 minutos y se mantuvo en esta composición durante 1 minuto adicional. La fase móvil volvió después a las condiciones iniciales y la columna se re-equilibró durante 1 minuto. El tiempo total del análisis era de 4 minutos.
El HPLC se conecto con un Micromass Quattro LC. Se usó nitrógeno de pureza ultra alta como el gas de nebulización y de desolvatación a caudales de 100 l/h para la nebulización y 1100 l/h para desolvatación. La temperatura de desolvatación era de 300ºC y la temperatura de partida era de 150ºC. La adquisición de los datos utilizaba la monitorización de reacción seleccionada (SRM). Se seleccionaron iones que representaban las especies (M+H)^{+} para IVc y para el patrón interno en EM1 y se disociaron mediante colisión con argón a una presión de 2 x 10^{-3} torr para formar iones del producto específico que después se controlaron mediante EM2. Las transiciones, voltajes y tiempos de retención se resumen en la Tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 9 Parámetros del Análisis de EM/EM de IVc e IVa (IS)
107 
\vskip1.000000\baselineskip
La curva patrón del plasma variaba entre 4 y 8000 ng/ ml, la curva del cerebro entre 1-1000 ng/ ml. Las curvas se ajustaron con regresión cuadrática ponderada mediante la concentración recíproca (1/x). Los patrones se analizaron por duplicado. También se analizaron por triplicado muestras de control de calidad (QC) preparadas en plasma blanco, a tres concentraciones dentro del intervalo de la curva de calibración con cada conjunto analítico de plasma. Para este compuesto, las concentraciones predichas del 90% de las QC de plasma estaban dentro del 20% de la concentración nominal, lo que indicaba un comportamiento del ensayo aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuantificación de Tres Profármacos y de sus Compuestos Parentales Mediante CL/EM/EM en Matrices Biológicas
Este ensayo de CL/EM/EM se desarrolló para investigar tres compuestos de profármaco y sus moléculas parentales respectivas en matrices biológicas. Los tres compuestos de profármaco fueron: compuestos Ia, Ic e Ib y sus sales o ácidos libres respectivos. Véase que este ensayo se usa para las forma de ácido libre y de sales de los tres profármacos ya que el ión molecular detectado es independiente del contraión salino. Sus compuestos parentales respectivos eran: IVa, IVc y IVb.
El sistema de HPLC estaba constituido por bombas Shimadzu LC10ADvp (Columbia, MD) y un auto-muestreador HTC PAL (Leap Technologies, Cary, NC) unido a una columna analítica Synergi Hydro-RP (2,0 x 50 mm, Phenomenex, Torrance, CA). La fase móvil A estaba constituida por ácido fórmico al 0,1% en agua; la fase móvil B era ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo. El caudal de CL era de 0,4 ml/min en el espectrómetro de masas. La composición inicial de la fase móvil era del 10% de B aumentada hasta el 75% de B durante 1,75 minutos, mantenida a esta composición durante 0,25 minutos, aumentada al 100% de B durante 0,1 minuto, mantenida durante 0,6 minutos y devuelta a las condiciones iniciales durante los próximos 0,1 minutos y después re-equilibrada. El tiempo total del análisis era de 4 minutos. Los tiempos de retención para todos los analitos variaban entre 1,5 y 2,6 minutos.
El sistema de HPLC se conectó con un espectrómetro de masas de cuadrupolo triple Sciex API3000 (Toronto, Canadá) equipado con el conjunto fuente Turboionspray a 450ºC y un ajuste de voltaje de chorro de iones a 4,5 kV. Se usó nitrógeno UHP como nebulizador y gases auxiliares con presiones de 80 psi (0,55 MPa) y 7 l/min, respectivamente. El análisis se realizó en modo de ion positivo. Las transiciones controladas para todos los compuestos y sus energías de colisión (EC) eran: m/z 533,41 > 435,24 para Ia (EC = 19); m/z 584,46 > 486,29 para Ic (EC = 23); m/z 558,31 > 432,13 para Ib (EC = 19); 423,39 > 204,96 para IVa (EC = 31); 474,36 > 255,97 para IVc (EC = 29); 448,35 > 105,20 para IVb (EC = 35).
Para alojar una amplia diversidad de matrices de muestras biológicas, se usó precipitación con acetonitrilo para la preparación de las muestras. Las muestras del ensayo y los patrones se transfirieron a una placa de 96 pocillos usando Packard Multiprobe II (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Se añadieron 200 \mul de acetonitrilo que contenían el patrón interno (BMS-647257, 500 nM) a alícuotas de 100 \mul de las muestras de ensayo y de los patrones en la placa de 96 pocillos usando el instrumento Tomtec Quadra 96. Después se agitó en vórtice la placa durante aproximadamente 3 minutos y se centrifugó a 3000 rpm durante 15 minutos. Usando el instrumento Tomtec Quadra 96, se transfirieron 150 \mul de sobrenadante de la placa a una placa de 96 pocillos limpia. Después se añadieron 150 \mul de ácido fórmico al 0,2% a cada pocillo usando el Tomtec Quadra 96 y la placa se agitó en vórtice antes del análisis.
Se prepararon las curvas patrón a ocho puntos de concentración de 5 nM a 10 \muM a partir de soluciones madre en acetonitrilo y se diluyeron en serie en la matriz para los profármacos y los compuestos parentales. Las curvas patrón se transfirieron en alícuotas de 100 ul por duplicado a una placa de 96 pocillos que contenía las muestras de ensayo, se extrajeron con las muestras de ensayo como se ha descrito anteriormente y se inyectaron al principio, en el centro, y al final de la secuencia analítica. Las curvas patrón se ajustaron con una regresión lineal ponderada 1/x^{2}. Los datos y los picos cromatográficos se procesaron y las concentraciones de los patrones y las concentraciones desconocidas se cuantificaron usando el PEBiosystems Analyst^{TM} 1.1.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimientos In Vivo Condiciones para el Estudio C1, E y F (Estudios PK, MAP y TK de Rata)
Para los estudios farmacocinéticos de IV y PO del compuesto IVc en ratas, el compuesto IVc se disolvió en PEG-400/etanol (90/10) como solución. Por favor remítase a la Tabla 8.
Rata. Se usaron ratas Sprague-Dawley macho (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottdale, PA) con cánulas implantadas en la vena yugular y/o el conducto biliar. Las ratas se mantuvieron en ayunas durante una noche en los estudios farmacocinéticos PO. Se recogieron muestras de sangre de 0,3 ml de la vena yugular en tubos de microtainer que contenían EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y se centrifugaron para separar el plasma.
En un estudio de IV, el compuesto IVc se suministró a 1 mg/kg como una embolada durante 0,5 minutos (n = 3). Las muestras de sangre en serie se recogieron antes de la dosificación y 2, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480, y 1440 minutos después de la dosificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudio de Dosis Única de PO C1
En el estudio C1 de PO del Compuesto IVc, las ratas (n = 3) recibían una dosis oral de 5 mg/kg del Compuesto IVc. Las muestras de sangre en serie se recogieron antes de la dosificación y 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 y 1440 minutos después de la dosificación. Los resultados orales (PO) del estudio C1 están en la Tabla 4, columna más a la derecha.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudio de Aumento de la Dosis Oral (PO) E
En el estudio de aumento de la dosis oral E del Compuesto IVc, grupos de ratas (n = 2 por grupo) recibían dosis orales de 25, 75, y 200 mg/kg. A 25 mg/kg, la solución de dosificación estaba en solución; a las dosis más altas, las soluciones de dosificación eran suspensiones. Se recogieron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480, y 1440 minutos después de la dosificación. Se recogieron muestras del cerebro a los 1440 minutos para evaluar la penetración en el cerebro. Las muestras del cerebro se transfirieron en seco y los pesos húmedos se registraron. Los resultados orales (PO) del estudio E se muestran en la Tabla 46.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudio F de Toxicología en Rata de la Dosis Oral a las 2 Semanas
En el estudio F oral en rata a las 2 semanas (n = seis/sexo/grupo), el Compuesto IVc se administró a dosis diarias de 15, 75, ó 200 mg/kg. Las evaluaciones toxicocinéticas en los días 1 y 14 indicaban que las exposiciones sistémicas (AUC_{0-24h}) del Compuesto IVc estaban generalmente relacionadas con la dosis pero no eran proporcionales a la dosis (véase Tabla 5), sin ninguna prueba de auto inducción o acumulación. En el día 14, los valores de AUC_{0-24h} eran ligeramente superiores en hembras (\leq 644 \mug*h/ml) en comparación con los machos (\leq 526,88 \mug*h/ml) a dosificaciones \leq 200 mg/kg/día. Los resultados orales (PO) del estudio F están en la Tabla 5.
Estudio Map G: Estudio de la Dosificación PO e IV del Diéster IIa en Ratas Estructura del Compuesto IIa
109
Se siguió el procedimiento para la rama de dosificación oral del estudio MAP A1 excepto que se utilizó el diéster IIa en lugar del compuesto IVa. El análisis para el compuesto IVa mostraba que la dosificación del diéster IIa mediante la vía oral producía IVa sustancial. Los datos se describen en la Tabla 10 a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 10 para el estudio Map G
110 
\vskip1.000000\baselineskip
Estudio Map H: Estudio de Dosificación PO y IV del Monoéster II'a en Ratas Estructura del Compuesto II'a
111 
\vskip1.000000\baselineskip
Se siguió el procedimiento de la rama de dosificación oral del estudio MAP A1 excepto que se utilizó el monoéster II'a en lugar del compuesto IVa. El análisis para el compuesto IVa mostraba que la dosificación del monoéster II'a mediante la vía oral producía IVa sustancial. Los datos se describen en la Tabla a continuación:
\newpage
TABLA 11 para el estudio Map H
112
Se realizaron una cantidad significativa de estudios para demostrar y caracterizar la utilidad sorprendente de los profármacos I. Se realizaron experimentos de exposición a dosis en aumento que comparaban la exposición de las moléculas parentales después de la dosificación del profármaco y del compuesto parental en ratas y perros para los profármacos I de las moléculas parentales IVa, IVb e IVc. El efecto de la alimentación y de la dosis sobre la exposición de IVa después de la dosificación del profármaco Iab o del compuesto parental IVa se comparó en perros. El profármaco mostraba una capacidad sorprendente para mejorar la exposición y para evitar los efectos de alimentación en comparación con el compuesto parental. Los estudios farmacocinéticos completos de baja dosificación (dosificación oral e IV) se realizaron en ratas, perros y monos para los profármacos Iab, Ibb e Icb para mostrar la conversión en el compuesto parental IVa, IVb'' y IVc respectivamente. Se realizaron estudios de dosificación oral en ratas para el profármaco Ie (ácido libre) y para el compuesto parental IVf para demostrar la conversión y la exposición sistémica de los compuestos parentales IVe y IVf respectivamente. Los datos se muestran anteriormente o a continuación en esta solicitud.
\vskip1.000000\baselineskip
Sección de caracterización adicional 1 Estudios adicionales con Iab
Iac es el profármaco de fosfato del ácido libre del aducto N-hidroximetilo de IVa y se hidroliza mediante fosfatasa alcalina (ALP) para formar IVa. Se usó Iab, una sal de mono-lisina de Iac para los siguientes estudios.
Se realizaron estudios farmacocinéticos IV y PO de Iab en ratas, perros y monos. En todos los casos, se recogieron muestras de sangre en presencia de EDTA. La presencia de EDTA, un inhibidor de ALP conocido, minimizó la conversión ex vivo significativa de Iab durante el procesado de las muestras. Se formó IVa rápidamente después de la administración IV de Iab. Se observaron buenas biodisponibilidades orales (62-94%) de IVa después de la administración de Iab en ratas, perros y monos con muy poco o nada de Iab presente en el plasma. Puesto que existen niveles altos de expresión de ALP en el intestino, es probable que después de la administración oral de Iab, Iab se hidrolice mediante la ALP presente en las membranas del borde en cepillo del lumen intestinal para formar IVa, que se absorbe rápidamente debido a su alta permeabilidad.
Se realizaron estudios de incubación in vitro para una evaluación cualitativa de la hidrólisis dependiente de ALP de Iab en diferentes tejidos. Iab se hidrolizó en presencia de suero y hepatocitos de rata, perro, mono y ser humano así como ALP de la placenta humana. En las ocasiones en las que se midieron Iab e IVa, la conversión de Iab en IVa era casi estequiométrica. Debido a la hidrólisis en el suero, la unión de proteínas a Iab no pudo determinarse. En base a los datos in vitro, se anticipa que Iab se hidrolizará por ALP humana y que IVa se formará después de la administración oral de Iab a sujetos humanos.
La solubilidad cristalina de Iab a temperatura ambiente aumenta de 0,22 mg/ml a pH 1,4 a > 12 mg/ml a pH 5,4 y pH 8,9; las soluciones acuosas que contenían > 100 mg/ml se han preparado para estudios de toxicología in vivo. En comparación, se determinó que la solubilidad acuosa del compuesto parental, IVa a temperatura ambiente con material cristalino era 0,04-0,9 mg/ml (intervalo de pH de 1,5-10). Iab muestra una estabilidad en solución y sólida aceptable.
La mayor solubilidad acuosa de Iab proporciona un medio para superar la absorción limitada por la velocidad de disolución de IVa por debajo de algunas dosis y por lo tanto aumentan las exposiciones de IVa en estudios de aumento de dosis oral y toxicocinéticos. Iab, cuando se administra por vía oral a \sim200 mg/kg de equivalente de IVa, proporcionó una AUC 2 veces mayor de IVa en ratas y perros, sin exposición de plasma significativa para el profármaco, en comparación con el AUC para los estudios de suspensión de IVa históricos a una dosis similar. Además, los valores de AUC y Cmax de IVa en perros en ayunas que recibían cápsulas rellenadas en seco con Iab (200 mg/perro de equivalente de IVa) eran 38 y 58 veces, respectivamente, los obtenidos en perros en ayunas a los que se administraba la formulación de cápsula clínica de IVa y 4 y 6 veces, respectivamente, los obtenidos en perros alimentados a los que se administraba la formulación de cápsula clínica de IVa.
No se observaron diferencias significativas en AUC y Cmax de Na entre los perros en ayunas y alimentados que recibían y Iab, mientras que se observó una mejora de 9 veces en perros alimentados en comparación con perros en ayunas que recibían IVa. Estos datos sugieren que pueden conseguirse niveles en sangre eficaces de IVa en pacientes infectados por VIH sin el requisito de una comida rica en grasas. La forma secada por pulverización de IVa dio origen a niveles de exposición similares de Na a los observados de Iab en perros.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudio de tolerabilidad toxicocinética de dosis única en ratas CD
Se realizó un estudio toxicocinético oral de 1 día en ratas usando el profármaco Iab (sal de monolisina). Iab se administró a dosificaciones de 16, 72 y 267 mg/kg (ácido libre) mediante una sonda oral a 3 ratas macho/grupo usando agua como vehículo (formulación de solución). Las dosificaciones del ácido sin profármaco corresponden a dosificaciones equivalentes molares de IVa (compuesto parental) de 13, 57, y 211 mg/kg, respectivamente. El criterio de valoración evaluado era la toxicocinética en plasma de Iab e IVa en ratas individuales.
Los valores toxicocinéticos medios se proporcionan en la Tabla 12.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 12 Valores toxicocinéticos medios para Iab e IVa en ratas macho a las que se administró \leq 267 mg/kg de Iab como única dosis oral
113
La concentración en plasma máxima (Cmax) media de Iab (profármaco) y IVa (compuesto parental) se consiguió a 1,1 horas después de la dosis. El área bajo la curva de concentración de plasma-tiempo del plasma (AUC) del profármaco era \leq 0,03% que la del compuesto parental. (En ratas a las que se administró \leq 267 mg/kg de Iab, el AUC de IVa aumentaba proporcionalmente con la dosificación de Iab y la Cmax aumentaba de forma menos que proporcional a la dosis entre 72 y 267 mg/kg de Iab.
Una comparación de AUC de IVa obtenida en ratas a las que se administro IVa (2) o Iab se muestra en la Figura 6.
La solubilidad en las formulaciones preclínicas ha sido un problema. El AUC de IVa es equivalente para el compuesto parental y el profármaco a dosificaciones más bajas (por ejemplo \leq 50 mg/kg) ya que ambos se formularon como soluciones (PEG-400 para el compuesto parental y agua para el profármaco) pero a una dosificación alta (por ejemplo, 200 mg/kg) el compuesto parental neutro se formuló como una suspensión mientras que la sal del profármaco se formuló como una solución acuosa.
Se está realizando un estudio de toxicidad de ratas de 2 semanas usando dosificaciones de 5, 50 ó 500 mg/kg BID para apoyar al IND (3). La fase en vida del estudio se ha completado y no había observaciones en vida merecedoras de atención.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudio de toxicocinética y tolerabilidad de dosis única en perros
Se realizó un estudio de fases múltiples para evaluar la tolerabilidad del profármaco, Iab (sal monolisina) a dosificaciones de 24, 90 ó 240 mg/kg (ácido libre, equivalente molar a 19, 71 ó 190 mg/kg del compuesto parental IVa, respectivamente) y la toxicocinética de Iab y IVa (4). Iab se administró a dos perros hembra/grupo una vez al día como solución acuosa (24 ó 90 mg/kg) o como cápsulas rellenadas en seco (24, 90 [una y dos veces al día] ó 240 mg/kg). Los criterios de valoración eran: signos clínicos, peso corporal, consumo de alimento y toxicocinética en el plasma de Iab e IVa. En todos los casos, se usó un periodo de eliminación de una semana entre dosis para todas las fases del estudio.
Los valores de toxicocinética en el plasma desde la fase inicial del estudio se muestran en la Tabla 13.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 13 Valores toxicocinéticos para IVa en perros hembra a los que se administró \leq 90 mg/kg de Iab como una única dosis oral
114
No se detectó Iab en las muestras de plasma. La concentración máxima en el plasma (Cmax) media de IVa se consiguió entre 1-2 horas después de la dosis. Cuando se administraba Iab como solución, la Cmax y el AUC aumentaban de manera menos que proporcional a la dosis entre 24 y 90 mg/kg. La emesis se observó a aproximadamente 30 minutos después de la dosificación en ambos perros a los que se administró 90 mg/kg. La Cmax y el AUC de IVa eran equivalentes después de la administración del Iab a 24 mg/kg usando cápsulas rellenadas en seco o una solución acuosa.
Aparte de la emesis, no se observaron signos clínicos y no había efecto sobre el peso corporal y el consumo de alimento.
Para determinar si la emesis podía eliminarse/reducirse mediante la administración de Iab como cápsulas rellenadas en seco, se realizó la siguiente fase del estudio usando dosificaciones de 90 ó 240 mg/kg, y 90 mg/kg administradas dos veces con una separación de 4 horas (BID). Los valores toxicocinéticos se muestran en la Tabla 14.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 14 Valores toxicocinéticos para IVa en perros hembra a los que se administró \leq 240 mg/kg de Iab como una única dosis oral o con una dosificación de dos veces al día (BID)
115
No existían diferencias en Cmax o AUC entre los perros a los que se administró 90 ó 240 mg/kg de Iab administrado como cápsulas rellenadas en seco. La emesis se observó en los perros #1201, #2201 y #2202 aproximadamente 1 hora después de la dosificación. Se recogió el vomito y se evaluó el contenido de Iab para estimar la cantidad de dosis total que se perdía; el porcentaje de dosis total perdida estimado era de < 1% para el Nº 1201, = 90% para el 2201, = 9% para el numero 2202. Aunque las estimaciones de "dosis perdida" no parecen ser cuantitativamente coherentes con los datos del AUC en el plasma, indican que el artículo del ensayo puede encontrarse en poco tiempo después de la dosificación. El Iab se detectó en el plasma de los perros, de 0,005-0,049 \muM a 1 hora después de la dosis y 0,005-0,006 \muM a 2 horas después de la dosis; el profármaco no era detectable en puntos temporales posteriores.
Una comparación de AUC de IVa obtenida en perros a los que se administraba IVa (5, 6) o Iab, se muestra en la Figura 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Vehículos y Formulaciones Resumen de Formulaciones Usadas para Estudios de PK claves y de Seguridad
Todos los estudios de PK in vivo en ratas, perros y monos se realizaron usando soluciones acuosas para la dosificación PO e IV. Los estudios de toxicología y exposición en perros se realizaron con soluciones acuosas a dosificaciones de 24 y 90 mg/kg y el fármaco a formulaciones en cápsula a dosificaciones de 24, 90 y 240 mg/kg de Iab, sal de mono-lisina.
En el estudio de aumento de dosis oral de ratas, el Iab se dosificó como soluciones acuosas a concentraciones de 4,5, 20,0 y 73,5 mg/ml (forma de sal de mono-lisina del profármaco). Se observó una mejora significativa en el AUC y Cmax de IVa, compuesto parental, después de la dosificación de Iab, profármaco en comparación con los datos históricos de la dosificación oral de IVa.
Se usó el fármaco en formulaciones en cápsula de Iab a dosis de 20 mg/kg de equivalente de IVa para los estudios de efectos sobre la alimentación en perros. El profármaco se comparó con la formulación de cápsula clínica del compuesto parental, IVa a 20 mg/kg. Cuando se dosificaba la cápsula clínica de IVa, se observó un aumento de 4 veces en la exposición en perros alimentados con una comida rica en grasas en comparación con perros en ayunas. Después de la dosificación del profármaco, Iab, la exposición de IVa era significativamente mayor y como se esperaba, la exposición no era significativamente diferente entre los perros en ayunas y los alimentados.
Resumen del metabolismo y farmacocinética Resumen de descubrimientos e interpretación
Iab es el profármaco de fosfato del aducto de N-hidroximetilo de IVa y se hidroliza mediante fosfatasa alcalina (ALP) para formar IVa. Después de la administración de Iab a los animales, por lo tanto, se prepararon muestras de plasma a partir de sangre recogida en presencia de EDTA, un inhibidor de ALP conocido. La conversión de Iab en IVa era mínima (< 2%) en sangre de rata, mono y ser humano que contenía EDTA y aproximadamente del 6% en sangre de perro que contenía EDTA. No se espera una conversión ex vivo significativa de Iab durante el almacenamiento de la muestra (-20ºC) y el análisis de Iab.
La hidrólisis de Iab se estudió en sistemas in vitro animales y humanos. Debido a que múltiples isoformas de ALP están ampliamente distribuidas en diversos tejidos, no se intentaron correlaciones in vitro con in vivo cuantitativas (Fishman y col., 1968; Komoda y col., 1981; Moss, 1983; Yora y Sakagishi, 1986; Sumikawa y col., 1990). Por lo tanto, los estudios se limitaron a una evaluación cualitativa de la hidrólisis dependiente de ALP en diferentes tejidos. Iab se hidrolizaba en presencia de suero y hepatocitos de rata, perro, mono y ser humano así como en ALP placentaria humana. En las ocasiones en las que se midieron Iab e IVa, la conversión de Iab en IVa era casi estequiométrica. Debido a la hidrólisis en el suero, la unión a proteínas de Iab no pudo determinarse.
No se detectaron niveles o se detectaron niveles muy bajos de Iab en plasma de rata, perro y mono después de la administración oral de Iab. IVa se formó rápidamente después de la administración IV de Iab en ratas, perros y monos. Las proporciones de conversión de AUC IV eran de 1,5 en ratas, 0,80 en perros y 0,70 en monos, lo que sugería una buena conversión de Iab en IVa.
Se observaron buenas biodisponiblidades orales (62-94%) de IVa después de la administración de Iab en ratas, perros y monos. De forma más significativa, la mayor solubilidad acuosa de Iab rebajó la absorción limitada por la velocidad de disolución de IVa por debajo de ciertas dosis y de este modo aumentaba las exposiciones de IVa en estudios de aumento de dosis oral y toxicocinéticos (Tablas 12-14 y Fig. 6-7). Los niveles de AUC de IVa en perros alimentados que recibían cápsulas de Iab eran de aproximadamente 40 veces los niveles en perros alimentados a los que se administraban cápsulas de la forma clínica de IVa. Aunque una diferencia de 40 veces es probablemente una sobre-predicción de la situación clínica, en base a la experiencia del desarrollo con IVa, Iab demostró claramente el potencial para mejorar la absorción limitada por la velocidad de disolución observada con el IVa parental.
Para investigar el efecto de la alimentación sobre la absorción oral de IVa en perros, se administraron Iab y IVa en cápsulas en condiciones de ayuno y alimentación. No se observaron diferencias significativas en AUC y Cmax con Iab, mientras que se observó una mejora de 9 veces con IVa después de la alimentación. Estos datos sugieren los potenciales beneficios clínicos para pacientes infectados por VIH en cuanto a niveles sanguíneos eficaces de IVa que pueden conseguirse sin los requisitos de una comida rica en grasas.
Procedimientos
Los estudios descritos en este informe usaban la sal de monolisina de Iab, a menos que se indique otra cosa.
Cuantificación de Iab e IVa mediante CL/EM/EM
Se desarrolló un procedimiento de CL/EM/EM para el análisis de Iab e IVa en muestras de plasma de los estudios farmacocinéticos animales así como en el sobrenadante de acetonitrilo de estudios de incubación in vitro. Para el análisis en plasma, se usó un instrumento Packard Multiprobe para transferir 50 ml de cada patrón, QC, y una muestra de plasma a una placa de 96 pocillos limpia para la extracción por precipitación de proteínas. Después de la adición de 200 ml de acetonitrilo que contenía el patrón interno IVc, las muestras se mezclaron con agitación en vórtice y el sobrenadante resultante se separó de las proteínas precipitadas mediante centrifugación durante 10 minutos. Para el análisis en el sobrenadante generado a partir de los estudios in vitro, se mezcló un volumen igual del sobrenadante y de acetonitrilo que contenía el patrón interno. Se transfirió una alícuota del sobrenadante anterior usando un manipulador de líquidos automatizado de Tomtec a una segunda placa de 96 pocillos limpia. Se añadió un volumen igual de agua y la placa se cerró y se agitó en vórtice.
El sistema de HPLC estaba constituido por bombas Shimadzu LCIOADvp (Columbia, MD) y un automuestreador HTC PAL (Leap Technologies, Cary, NC) unido a columna analítica Phenomenex Synergi Fusion-RP (2,0 x 50 mm, 5 \mu; Torrance, CA). La fase móvil A estaba constituida por formiato de amonio 5 mM en agua; la fase móvil B era acetonitrilo al 100%. El caudal de CL era de 0,38 ml/min. La composición inicial de la fase móvil era 3% de B, aumentada al 60% de B durante 1,75 min y mantenida durante 0,25 min, aumentada al 100% de B durante 0,1 min y mantenida durante 0,8 min, devuelta a las condiciones iniciales durante el próximo 0,1 min, y re-equilibrada. El tiempo de análisis total era de 4,0 min. El tiempo de retención para Iab, IVa e IVc era de 1,50, 1,67 y 1,73 min, respectivamente.
El sistema de HPLC se conectó con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Sciex API4000 (Toronto, Canadá) equipado con la fuente Turboionspray ajustada a 550ºC y el voltaje de chorro de iones ajustado a 4,5 kV. Se usó nitrógeno UHP como nebulizador y gas auxiliar con la presión de 80 psi (0,55 MPa) y 7 l/min, respectivamente. Las energías de colisión para Iab, IVa e IVc eran 21, 29 y 31 voltios, respectivamente. La adquisición de los datos utilizaba la monitorización de reacción seleccionada (SRM). Los iones que representan el modo de ion positivo (M+H)^{+} para Iab, IVa y el patrón interno se seleccionaron en EM 1 y se disociaron mediante colisión con nitrógeno y las energías de colisión optimizadas para formar los iones de productos específicos se controlaron posteriormente mediante EM2. Las transiciones de SRM para Iab, IVa e IVc eran m/z 533\rightarrow435, 423\rightarrow205 y 474\rightarrow256, respectivamente.
Se prepararon curvas patrón que variaban de 5 nM a 10 \muM a partir de soluciones madre y se diluyeron de forma seriada en matrices para Iab y IVa. Se tomaron por duplicado alícuotas de las curvas patrón, se extrajeron con las muestras y se inyectaron al principio, en el centro y al final de la secuencia analítica. Las curvas patrón se ajustaron con una regresión lineal ponderada mediante concentración recíproca1/x^{2}. Los datos y los picos cromatográficos se procesaron y se cuantificaron las concentraciones de los patrones y las desconocidas usando PEBiosystems Analyst^{TM} 1,1.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimientos In Vitro (1) Estabilidad de Iab en Sangre con EDTA, Suero y Tampón Tris-HCl
La estabilidad de Iab se estudió en sangre recién recogida y suero de rata, perro, mono y ser humano (n = 2). La sangre se recogió en vacutainers que contenían K_{2}EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). El suero se recogió en vacutainers que no contenían anticoagulante. Iab se incubó a una concentración de partida de aproximadamente 10 \muM durante 60-90 min a 37ºC. Las muestras en serie se tomaron en momentos predeterminados. En primer lugar las alícuotas de las muestras de sangre (200 \mul) se mezclaron con 100 \mul de agua seguido de 400 \mul de acetonitrilo. Las muestras de suero (50 \mul) se añadieron en microtainers que contenían K_{2}EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) seguido de la adición de 100 \mul de acetonitrilo. El sobrenadante se analizó para Iab e IVa mediante CL/EM/EM.
También se evaluó la estabilidad de Iab, como se ha descrito anteriormente, en tampón Tris-HCl (0,1 M, pH 7,5).
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Hidrólisis de Iab en Presencia de ALP Placentaria Humana
Se obtuvo ALP placentaria humana sólida de Sigma (P-3895, St. Louis, MO). Se preparó una solución de 1000 unidades/l en tampón Tris-HCl (0,1 M, pH 7,5). Se obtuvieron soluciones de 100 y 10 unidades/l mediante diluciones seriadas. Se incubó Iab en las soluciones de 10, 100 y 1000 unidades/l (n = 2) a 37ºC durante 2 horas. La concentración de partida de Iab en la incubación era de 10 \muM. Se tomaron alícuotas de 100 \mul de las muestras en momentos predeterminados y se añadieron a microtainers con K_{2}EDTA seguido de la adición de 200 \mul de acetonitrilo. El sobrenadante se analizó para Iab e IVa mediante CL/EM/EM.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudios In Vivo
Todas las muestras de sangre (0,3 ml) se recogieron en microtainers que contenían K_{2}EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y se colocaron en hielo picado. Después de la centrifugación, el plasma se separó y se almacenó a -20ºC hasta el análisis. La sal de monolisina de Iab (Forma 3, Lote 1) se usó para los estudios farmacocinéticos. Las soluciones de dosificación de Iab se prepararon en agua estéril (para administración IV en perros y monos) o en agua destilada (para el resto de administración de dosis).
\vskip1.000000\baselineskip
(1) Estudios In Vivo en Rata
Se usaron ratas Sprague-Dawley macho (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottsdale, PA) con cánulas implantadas en la vena yugular. Las ratas se mantuvieron en ayunas durante una noche en estudios de farmacocinética PO. Se recogieron muestras de sangre de la vena yugular.
En el estudio IV, se administró Iab a 1,4 mg/kg (ácido libre, o 1,1 mg/kg de equivalente de IVa) como una embolada durante 0,5 min (n = 3). La concentración de la solución de dosificación era de 1,4 mg/ml y el volumen de dosificación era 1 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y a 2, 10, 15, 30, 45 min y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
En el estudio de PO, se administró Iab a 7,9 mg/kg (ácido libre, o 6,3 mg/kg de equivalente de IVa) mediante una sonda oral (n = 3). La concentración de la solución era de 4,0 mg/ml, y el volumen de dosificación era 2 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y a 15, 30, 45 min y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.930000\baselineskip
(2) Estudios In Vivo en Perro
Los estudios de IV y PO de Iab se realizaron de forma cruzada en tres perros Beagle macho (11 \pm 1,1 kg, Marshall Farms USA Inc., North Rose, NY). Existía un periodo de eliminación de dos semanas entre los estudios IV y PO.
En el estudio de IV se inyectó Iab mediante la vena cefálica a 1,2 mg/kg (ácido libre, o 0,95 mg/kg de equivalente de IVa) durante 5 min a una velocidad constante de 0,1 ml/kg/min. La concentración de la solución de dosificación era de 2,4 mg/ml y el volumen de dosificación era de 0,5 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie de la arteria femoral antes de la dosificación y a 5, 10, 15, 30, 45 min y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
En el estudio de PO, los perros se mantuvieron en ayunas durante una noche antes de la dosificación. Se administró Iab mediante una sonda oral a 6,6 mg/kg (ácido libre, o 5,2 mg/kg de equivalente de IVa). La concentración de la solución de dosificación era de 13,2 mg/ml y el volumen de dosificación era de 0,5 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y a los 15, 30, 45 min y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
Para estudiar el efecto del alimento sobre la absorción oral de IVa después de la administración de Iab y IVa, estos dos compuestos se administración en cápsulas como un sólido a un grupo de tres perros de forma cruzada en condiciones de ayuno durante una noche y alimentación. Existía un periodo de eliminación de una semana entre cada estudio. Iab se administró a 200 mg por perro (ca 20 mg/kg) de equivalente de IVa; IVa se administró en una formulación de cápsula clínica a 200 mg por perro (ca 20 mg/kg). En los estudios en los que se alimentó a los perros, se preparó el siguiente alimento: 2 tiras de bacon, 2 huevos, 2 piezas de pan tostado con mantequilla y gelatina, 4 onzas (113,40 g) de croquetas de patata hervida y cebolla y 8 onzas (226,80 g) de leche entera. Después de la homogeneización usando un mezclador de laboratorio, la comida se dividió a partes iguales en cinco porciones y se almacenó congelada. Antes del estudio, el alimento se descongeló y a cada perro se le administró una porción.
Se realizaron estudios de formulación adicional de IVa en perros en ayunas (n = 2 por grupo de dosis). A cada perro se le administró la forma clínica o la forma secada por pulverización de IVa en cápsulas. La forma de cápsula clínica de IVa se administró en una única dosis de 20 mg/kg. La forma secada por pulverización de IVa se administró a 20, 75 y 200 mg/kg.
(3) Estudio In Vivo en Mono
Los estudios de IV y PO de Iab se realizaron de forma cruzada en tres monos cynomolgus macho (11 \pm 1,2 kg, Charles River Biomedical Research Foundation, Houston, TX). Existía un periodo de eliminación de dos semanas entre los estudios IV y PO.
En el estudio IV, se inyectó Iab mediante la vena femoral a 1,3 mg/kg (ácido libre, o 1,1 mg/kg de equivalente de IVa) durante 5 min a una velocidad constante de 0,1 ml/kg/min. La concentración de la solución de dosificación era de 2,6 mg/ml y el volumen de dosificación era de 0,5 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie de la arteria femoral antes de la dosificación y a los 5, 10, 15, 30, 45 min y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
En el estudio de PO, los monos se mantuvieron en ayunas durante una noche antes de la dosificación. Se administró Iab mediante una sonda oral a 7,1 mg/kg (ácido libre, o 5,6 mg/kg de equivalente de IVa). La concentración de la solución de dosificación era de 14,2 mg/ml y el volumen de dosificación era de 0,5 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y a los 15, 30, 45 min y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
(4) Análisis de los Datos
Todos los resultados se expresan como la media \pm DT, a menos que se especifique otra cosa.
Los parámetros farmacocinéticos de Iab y IVa se calcularon mediante análisis no compartimental usando el programa KINETICA^{TM} (versión 4.0.2, InnaPhase Co., Philadelphia, PA). Los valores de Cmax y Tmax se registraron a partir de observaciones experimentales. Los valores de AUC0-n y AUCtot se calcularon usando las sumas totales log-lineal trapezoidal mezcladas la eliminación total del cuerpo (Cl), el tiempo de residencia medio (MRT) y el volumen de estado constante de la distribución (Vss) también se calcularon después de la administración intravenosa. La biodisponibilidad oral absoluta (expresada como %) se estimó tomando la proporción de los valores de AUC normalizados para la dosis después de dosis orales con respecto a los de dosis intravenosas.
La eliminación hepática Cl_{H} se calculó a partir de la siguiente ecuación usando el modelo de compartimentos bien agitados:
116
donde Qh es el flujo sanguíneo del hígado de 55, 31, 44 y 21 ml/min/kg para rata, perro, mono y ser humano, respectivamente. (Davis y Morris, 1993).
\global\parskip1.000000\baselineskip
El índice de extracción hepática (ER) se calculó de la siguiente manera:
ER = Cl_{H}/Qh
Se usó el ensayo de t de Student para el análisis estadístico (Microsoft®Excel, Redmond, WA). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a nivel de P < 0,05.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudios In Vitro Estabilidad de Iab en Sangre con EDTA, Suero y Tampón Tris-HCl
Como parte de la validación del ensayo analítico, se estudió la estabilidad de Iab en sangre que contenía EDTA, que se sabe que es un inhibidor de las fosfatasas alcalinas. (Bowers, Jr. y McComb, 1966; Yora y Sakagishi, 1986). Después de la incubación a 37ºC durante 60 min, existía un 1,2% de conversión de la concentración inicial de Iab en IVa en la sangre de rata (Tabla 15), y menos del 1% de conversión en la sangre de mono y humana (Tablas 15 y 16). Había aproximadamente un 6% de conversión en la sangre de perro y los porcentajes de conversión eran similares entre dos perros diferentes así como en el mismo perro en dos ensayos diferentes (Tablas 15 y 16). En las condiciones de almacenamiento de la muestra de -20ºC, no se espera que los anteriores pequeños porcentajes de conversión observados a 37ºC introduzcan ninguna conversión ex vivo significativa durante el análisis de Iab.
Iab era estable en el tampón Tris-HCl a 37ºC durante el periodo de estudio de 60 min (Tabla 17).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 15 Estabilidad de Iab en la sangre con EDTA recién extraída de rata, perro y mono
118 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 16 Estabilidad de Iab en la sangre con EDTA recién extraída de perro (repetición) y ser humano
119
TABLA 17 Estabilidad de Iab en tampón Tris-HCl
120
Para investigar la hidrólisis de Iab en la circulación sistémica, se incubó Iab en suero recién preparado (perro, rata, mono y ser humano) a 37ºC durante 90 min. La velocidad de hidrólisis era más rápida en el suero de rata, seguido de los sueros de perro, mono y ser humano (Tabla 18). La conversión de Iab en IVa era casi estequiométrica.
El suero contiene poca actividad de ALP en comparación con los tejidos (McComb y col., 1979a). Además, el suero también contiene isoformas de ALP de fuentes tisulares tales como el hueso, el hígado y el intestino, que se atribuyen a la filtración a través de los vasos sanguíneos (Moss, 1983). Por lo tanto, la hidrólisis de Iab en el suero estaba mediada probablemente por múltiples isoformas de ALP.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 18 Estabilidad de Iab en suero recién extraído de rata, perro, mono y ser humano
121 
\vskip1.000000\baselineskip
Hidrólisis de Iab en presencia de ALP Placentaria Humana
Para estudiar la hidrólisis de Iab en forma purificada de ALP humana, se incubó Iab en soluciones de ALP placentaria humana a 10, 100 y 1000 unidades/l a 37ºC durante 2 horas. El t_{1/2} de desaparición de Iab se determinó y se presentó en la Tabla 19. Como se esperaba, la velocidad de hidrólisis era más rápida en las soluciones con mayores actividades de ALP. También se formó IVa de forma correspondiente (Fig. 8). Esto indica que Iab se hidroliza mediante ALP obtenida de seres humanos para formar IVa.
TABLA 19 Hidrólisis de Iab en soluciones de ALP placentaria humana
122 
\vskip1.000000\baselineskip
Estudios In Vivo Estudios In Vivo en Rata
Los parámetros farmacocinéticos de Iab y IVa en ratas después de la administración IV y oral de Iab se resumen en la Tabla 20. Los perfiles de concentración en plasma frente al tiempo se muestran en la Figura 9. Para comparación, también se muestran los datos históricos de los estudios de farmacocinética de IVa en ratas.
La eliminación corporal total (Cl) de Iab después de la administración IV era de 14 ml/min/kg, lo que sugería que Iab es un compuesto de eliminación lenta en ratas. La semi-vida de eliminación (t_{1/2}) y el tiempo de residencia medio (MRT) después de la administración IV eran de 0,16 horas y 0,14 horas, respectivamente. No se detectó Iab después de 2 horas. El volumen de distribución de Iab en el estado constante (Vss) era de 0,12 l/kg, lo que sugería una distribución tisular muy limitada. La formación de IVa a partir de Iab después de la administración IV era rápida; se detectó IVa en el primer punto temporal de muestreo de 2 min (no se muestran los datos). La proporción de AUC IV de IVa formado a partir de Iab frente al estudio de IVa histórico era de 1,5 (valor teórico para la conversión completa = 1), lo que sugería una conversión completa de Iab en IVa.
Con la excepción de una muestra (5 nM; Tabla 20), no se detectó Iab en ninguna muestra después de la administración oral. El Tmax de IVa después de la administración oral de Iab era de 0,83 horas, que es menor que el Tmax histórico de IVa de 2,0 horas, lo que indicaba una absorción más rápida de IVa después de la administración oral del profármaco. La absorción más rápida de IVa a partir del profármaco es probablemente el resultado de una mejor solubilidad acuosa de Iab así como de la rápida hidrólisis de Iab para formar IVa en el intestino. Aunque la biodisponibilidad oral absoluta de IVa a partir de Iab es del 62%, menor que los datos de IVa históricos, la exposición de IVa a partir del estudio de aumento de dosis oral en rata de Iab era superior en comparación con los datos históricos con IVa (Tabla 16 y Fig. 8).
Los perfiles de concentración en plasma terminal frente al tiempo de IVa formada a partir de Iab son similares a los perfiles de IVa históricos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 20 Parámetros farmacocinéticos de Iab y IVa después de la administración IV y oral de Iab en ratas (Media \pm DT, n = 3)
123
31. Estudios In Vivo en Perro
Los parámetros farmacocinéticos de Iab y IVa en perros después de la administración IV y oral de Iab se resumen en la Tabla 21. Los perfiles de concentración en plasma frente al tiempo se muestran en la Figura 10. Por comparación, también se muestran los datos históricos de los estudios de farmacocinética de IVa en perros.
El Cl de Iab después de la administración IV era de 70 ml/min/kg, que es significativamente más alto que el flujo sanguíneo del hígado de 31 ml/min/kg en perros, lo que sugería la implicación potencial de la hidrólisis extrahepática y/o otra(s) vía(s) de eliminación (por ejemplo, excreción renal). El t_{1/2} y MRT después de la administración IV eran de 0,15 horas y 0,07 horas, respectivamente. No se detectó Iab después de 45 minutos. El Vss de Iab era de 0,30 l/kg, lo que sugería un potencial bajo de distribución tisular. La formación de IVa a partir de Iab después de la administración IV era rápida; se detectó IVa en el primer punto temporal de muestreo a los 5 min (no se muestran los datos). La proporción de AUC IV de IVa formado a partir de Iab frente a la del estudio de IVa histórico era de 0,80, lo que sugería una buena conversión de Iab en IVa.
Se detectó Iab a 5 nM (LLQ) solamente a los 15 minutos y a los 30 minutos en un perro después de la administración oral. El Tmax de IVa después de la administración oral de Iab era 0,25 horas, que es menor que el Tmax histórico de IVa de 2,9 horas, lo que indicaba una absorción más rápida de Iab después de la administración oral del profármaco. La biodisponibilidad oral absoluta de IVa a partir de Iab era del 94%, mayor que los datos de IVa históricos del 57%. Los perfiles de concentración en plasma terminal frente al tiempo de IVa formado a partir de Iab son similares a los perfiles de IVa históricos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 21 Parámetros Farmacocinéticos de Iab y IVa Después de la Administración IV y Oral de Iab en Perros (Media \pm DT, n = 3)
124 
\newpage
Para estudiar el efecto del alimento sobre la absorción oral de IVa después de la administración de Iab e IVa, se les administró a los perros Iab o IVa en cápsulas en condiciones de ayuno y de alimentación. El estudio se realizó de forma cruzada, con un periodo de eliminación de una semana entre cada estudio. No se observaron diferencias significativas en AUC y Cmax entre las condiciones de ayuno y de alimentación después de la administración de Iab (Tabla 22), mientas que se observó una mejora de 9 veces en AUC y Cmax después de la administración de IVa con alimentación (Tabla 23). En general, el efecto de la alimentación era más pronunciado en perros (Tabla 23) que en sujetos seres humanos (Tabla 24) que recibían IVa. Esto sugiere diferencias cuantitativas entre especies en el efecto del alimento sobre la absorción oral de IVa.
Se demostró que la absorción oral de IVa estaba limitada por la velocidad de disolución en seres humanos y en especies animales. La mejora de la exposición a IVa en seres humanos después de la alimentación con una comida rica en grasas, se debe presumiblemente al aumento de la secreción de sales biliares que facilitaba la disolución de IVa. En perros, la falta de efecto del alimento sobre la absorción oral de IVa después de la administración de Iab sugiere beneficios potenciales en seres humanos, para los que puede no ser necesaria una modificación en la dieta.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 22 Efecto del Alimento sobre la Exposición Oral de IVa en Perros después de la Administración Oral de Iab en Cápsulas Rellenadas en Seco (20 mg/kg de equivalente de IVa) (Media \pm DT n = 3)
125 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 23 Efecto del Alimento sobre la Exposición Oral de IVa en Perros Después de la Administración Oral de IVa en Cápsulas en Forma Clínica (20 mg/kg) (Media \pm DT, n = 3)
126 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 24 Efecto del Alimento sobre la Exposición Oral de IVa en el Primer Estudio en Seres Humanos (Media \pm DT, n = 6)
128 
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron estudios de la formulación en cápsulas adicionales en los mismos perros en ayunas con las formas clínicas y secadas por pulverización de IVa para compararlo con Iab. Como se muestra en la Tabla 25, a 20 mg/kg de equivalente de IVa se observó una exposición similar de IVa después de la administración de Iab y de la forma secada por pulverización de IVa. Sin embargo, Iab proporcionaba una exposición significativamente mayor de IVa en comparación con la forma clínica de IVa. El AUC y Cmax de IVa a partir del profármaco era 37 veces y 45 veces mayores, respectivamente, que los valores de la forma clínica de IVa. Este aumento en perros es probablemente una sobrepredicción de la situación clínica en base a los experimentos con IVa en desarrollo (no se muestran los datos).
En el estudio de aumento de la dosis de la forma secada por pulverización de IVa en perros, los aumentos de AUC y Cmax de 20 mg/kg a 75 mg/kg eran aumentos menores a los proporcionales a la dosis (Tabla 26). No se observaron aumentos adicionales significativos en la exposición desde 75 mg/kg a 200 mg/kg.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 25 Exposición Oral de IVa en Perros Después de la Administración Oral de Iab y Diferentes Formulaciones de IVa en Cápsulas
(Estudios Cruzados)
129
TABLA 26 Exposición Oral de IVa en Perros Después de la Administración Oral de la Forma Secada por Pulverización de IVa en Cápsulas
130 
\vskip1.000000\baselineskip
Estudios In Vivo en Mono
Los parámetros farmacocinéticos de Iab e IVa en monos después de la administración IV y oral de Iab se resumen en la Tabla 27. Los perfiles de concentración en plasma frente al tiempo se muestran en la Figura 11. Para comparación, también se muestran los datos históricos de los estudios farmacocinéticos de IVa en monos.
El Cl de Iab después de la administración IV era de 4,4 ml/min/kg, lo que sugería que Iab es un compuesto de eliminación baja en monos. El t_{1/2} y MRT después de la administración IV eran de 1,0 horas y 0,18 horas, respectivamente. El MRT reflejaba una estimación más realista de la duración de Iab en el plasma ya que las concentraciones en plasma de Iab en la fase terminal eran bajas (Figura 11). Iab no se detectó después de 6 horas. El Vss de Iab era 0,048 l/kg, lo que sugería una distribución tisular muy limitada. La formación de IVa a partir de Iab después de la administración IV era rápida. IVa se detectó en el primer punto temporal de muestreo de 5 minutos (no se muestran los datos). La proporción de AUC IV de IVa formado a partir de Iab frente al estudio de IVa histórico era de 0,70, lo que sugería una buena conversión de Iab en IVa.
Iab se detectó a una concentración de 18 nM a los 15 minutos en sólo un mono después de la administración oral. El Tmax de IVa después de la administración oral de Iab era de 0,83 horas, que es menos que el Tmax histórico de IVa de 2,7 horas, lo que indicaba una absorción más rápida de IVa después de la administración oral del profármaco. La biodisponibilidad oral absoluta de IVa a partir de Iab era del 66%, similar a los datos históricos de IVa del 60%.
Los perfiles de concentración en plasma terminal frente al tiempo de IVa formado a partir de Iab son similares a los perfiles de IVa históricos.
TABLA 27 Parámetros farmacocinéticos de Iab y IVa Después de la Administración IV y Oral de Iab en Monos (Media \pm DT, n = 3)
131 
\vskip1.000000\baselineskip
Sección de caracterización adicional 2 Estudios adicionales con el Profármaco Ibb
Se realizaron estudios farmacocinéticos de IV y PO de Ibb en ratas, perros y monos. En todos los casos, se recogieron muestras de sangre en presencia de EDTA. La presencia de EDTA, un inhibidor de ALP conocido, minimizaba de forma significativa la conversión ex vivo de Ibb durante el procesamiento de las muestras. IVb se formó rápidamente después de la administración IV de Ibb. Se observaron buenas biodisponibilidades orales de IVb (50-310%; calculadas usando el AUC de IV histórico de IVb) después de la administración de Ibb en ratas, perros y monos con niveles muy bajos de Ibb presente en plasma. Puesto que existen altos niveles de expresión de ALP en el intestino, es probable que después de la administración oral de Ibb, Ibb se ha hidrolizado por ALP presente en las membranas del borde en cepillo del lumen intestinal para formar IVb, que se absorbe rápidamente debido a su alta permeabilidad.
Se realizaron estudios de incubación in vitro para una evaluación cualitativa de la hidrólisis dependiente de ALP de Ibb en diferentes tejidos. Se hidrolizó Ibb en presencia de suero y hepatocitos de rata, perro, mono y ser humano, así como de ALP placentaria humana. En las ocasiones en las que midieron Ibb e IVb, la conversión de Ibb en IVb era casi estequiométrica. Debido a la hidrólisis en suero, la unión a proteínas de Ibb no pudo determinarse. En base a los datos in vitro, se prevé que Ibb se hidrolizará por ALP humana y que se formará IVb después de la administración oral de Ibb a sujetos humanos.
La solubilidad cristalina de Ibb-03 a temperatura ambiente es > 11 mg/ml en el intervalo de pH de 1,5 a 8,7; se han preparado soluciones acuosas que contenían > 75 mg/ml para estudios de toxicología in vivo. En comparación, la solubilidad acuosa del compuesto parental, IVb a temperatura ambiente como material cristalino se determinó como 0,007-0,19 mg/ml (intervalo de pH de 1,0-9,6). Ibb-03 muestra estabilidades en solución y sólida aceptables.
La mayor solubilidad acuosa de IVb proporciona un medio para superar la absorción limitada por la velocidad de disolución de IVb por debajo de ciertas dosis y de este modo aumenta las exposiciones de IVb en estudios de aumento de dosis oral y toxicocinéticos. Ibb, cuando se dosifica por vía oral hasta 200 mg/kg de equivalente de IVb, proporcionaba un AUC de 11 y 2,6 veces mayor (BID) de IVb en ratas y perros respectivamente, con una exposición en plasma relativamente baja del profármaco (< 0,9 \muM), en comparación con el AUC de los estudios de suspensión de IVb históricos a una dosis similar.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudio Toxicocinético de Dosis Única en Ratas Sprague Dawley
Se realizó un estudio toxicocinético oral de 1 día en ratas usando el profármaco Ibb (sal de monolisina). Se administró Ibb a dosificaciones de 19, 65 y 236 mg/kg (ácido libre) mediante una sonda oral a tres ratas macho/grupo usando agua como vehículo (formulación en solución). Las dosificaciones de ácido libre del profármaco corresponden a dosificaciones de equivalente molar de IVb (compuesto parental) de 15, 51 y 190 mg/kg, respectivamente. El criterio de valoración evaluado fue la toxicocinética del plasma de Ibb e IVb en las ratas individuales.
Los valores toxicocinéticos medios se proporcionan en la Tabla 28.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 28 Valores Toxicocinéticos Medios para Ibb y IVb en Ratas Macho a las que se Administró \leq 200 mg/kg de Ibb como una Única Dosis Oral (mg/kg)
133
La concentración en el plasma máxima media (Cmax) de IVb (compuesto parental) se alcanzó a las \approx1,3 horas después de la dosis. En las ratas a las que se administró \leq 236 mg/kg de Ibb, el aumento de AUC de IVb era prácticamente proporcional a la dosificación de Ibb y Cmax aumentaba de manera menos que proporcional a la dosis entre 19 y 236 mg/kg de Ibb. Se detectó Ibb en plasma de ratas a las que se les administró \geq 19 mg/kg de Ibb pero a concentraciones muy bajas con respecto a las de IVb.
Una comparación de Cmax y AUC de IVb obtenida en ratas a las que se administró IVb o Ibb, se muestra en la Figura 12.
La exposición a IVb aumenta sustancialmente después de la administración de Ibb en comparación con la conseguida después de dosificar IVb.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudio de Toxicocinética y Tolerabilidad de Dosis Única en Perros
Se realizó un estudio de dos fases para evaluar la tolerabilidad del profármaco, Ibb (sal de monolisina) a dosificaciones de 25, 92 ó 250 mg/kg (ácido libre, equivalente molar a 20, 74 ó 201 mg/kg de IVb parental, respectivamente) y la toxicocinética de Ibb y IVb (1). El día 1, se administró Ibb a un perro/sexo/grupo una vez al día en cápsulas rellenadas en seco a las dosificaciones anteriores. Se usó un periodo de eliminación de una semana entre las dosis en el estudio. En el día 8, se administró Ibb a un perro/sexo/grupo una vez al día como solución acuosa a 25 mg/kg o dos veces al día en cápsulas rellenadas en seco a 46 ó 125 mg/kg BID. Los criterios de valoración eran: signos clínicos, peso corporal, consumo de alimentos, química del suero, hematología y toxicocinética en el plasma de Ibb e IVb.
Los valores de toxicocinética en el plasma de perros individuales se muestran en la Tabla 29.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 29 Valores toxicocinéticos para IVb en Perros a los que se Administró \leq 250 mg/kg de Ibb
134
Se detectaron niveles bajos (\leq 0,9 \muM) de Ibb en algunas muestras de plasma los días 1 y 8. La concentración máxima en plasma (Cmax) media de IVb se consiguió entre 1-4 horas después de la dosis para la dosificación QD, y 1-2 horas después de la segunda dosis para la dosificación BID. A 25 mg/kg QD, se observaron Cmax y AUC equivalentes de IVb cuando se administraba Ibb como cápsulas rellenadas en seco o como solución acuosa. El día 1, la emesis (blanco, veteado de rojo que contenía remanentes de cápsula) se observó a aproximadamente 0,5-1,25 horas después de la dosificación en todos los perros a los que se administró \geq 92 mg/kg QD (3101M, 3201F, 4101M, y 4201F), lo que contribuyo probablemente a la exposición fija entre 92 y 250 mg/kg. El día 8, se observó la emesis (blanca o marrón) a las 2 horas después de la dosificación en todos los perros a los que se administró \geq 46 mg/kg BID; solamente se observaron remanentes de cápsula en el vómito de dos perros (3101M después de la primera dosis y 4201F después de la segunda dosis). La dosificación dos veces al día proporcionó más exposición a IVb en perros que la dosificación una vez al día.
Aparte de la emesis, no se observaron signos clínicos y no existían efectos sobre el peso corporal y sobre el consumo de alimento.
A pesar de la emesis observada en perro, se observa una mayor AUC de IVb en perros a los que se administró Ibb que en los perros a los que se administró IVb. Una comparación de AUC de IVb obtenida en perros a los que se administró Ibb o IVb (2), se muestra en la Figura 13.
La biodisponibilidad oral absoluta de IVb, compuesto parental, después de la administración de soluciones acuosas de Ibb-03, el profármaco de fosfato, variaba entre 50% y el 310% en ratas, perros y monos. Estos cálculos se basan en datos de IV históricos. La exposición de IVb, después de la administración oral de soluciones acuosas del profármaco, Ibb-03, dosificado hasta 190 mg/kg de equivalente IVb es 3-10 veces superior en el estudio de aumento de dosis oral de rata en comparación con los datos históricos con IVb. Cuando se dosifica Ibb-03 BID como un fármaco en cápsulas en perro, se consigue una mejora de 2-3 veces en la exposición en comparación con los datos históricos de estudios de toxicología pre-ECN con dosificación BID de IVb como suspensión. Los datos de exposición in vivo del fármaco en formulaciones en cápsulas sugieren que la exposición oral de IVb en seres humanos podría mejorarse significativamente mediante la administración de formas de dosificación oral sólidas tradicionales de Ibb.
Ibb es el profármaco de fosfato del aducto N-hidroximetilo de de IVb y se hidroliza mediante fosfatasa alcalina (ALP) para forma IVb. Después de la administración de Ibb a animales, por lo tanto, se prepararon muestras de plasma a partir de sangre recogida en presencia de EDTA, un conocido inhibidor de ALP. La conversión de Ibb en IVb era mínima (< 2%) en la sangre que contenía EDTA (rata, perro, mono y ser humano). No se espera conversión ex vivo significativa de Ibb durante el almacenamiento de la muestra (-20ºC) y el análisis de Ibb.
La hidrólisis de Ibb se estudió en sistema in vitro animales y humanos. Puesto que múltiples isoformas de ALP se distribuyen ampliamente en diversos tejidos, no se intentaron correlaciones cuantitativas in vitro con respecto a in vivo (Fishman y col., 1968; Komoda y col., 1981; Moss, 1983; Yora y Sakagishi, 1986; Sumikawa y col., 1990). Por lo tanto, los estudios se limitaban a una evaluación cualitativa de la hidrólisis dependiente de ALP en diferentes tejidos. Ibb se hidrolizó en presencia de suero (rata, perro, mono y ser humano), hepatocitos (rata, perro y ser humano) así como en ALP plancetaria humana. No se observó renovación en hepatocitos de mono. La conversión de Ibb en IVb era casi estequiométrica. Debido a la hidrólisis en suero, la unión a proteína de Ibb no puedo determinarse.
Ibb se hidrolizó completamente para formar IVb en células Caco-2 y, como se esperaba, se detectaron niveles muy bajos de Ibb en plasma de rata, perro y ser humano después de la administración oral de Ibb. Estos datos son coherentes con los informes que describen los altos niveles de expresión de ALP en el intestino (McComb y col., 1979a; Butterworth, 1983). La ALP unida a la membrana se sitúa en su mayor parte en las membranas del borde en cepillo de las microvellosidades que recubren el lumen intestinal (Butterworth, 1983; Testa y Mayer, 2003). Es probable que después de la administración oral de Ibb, Ibb se hidrolice mediante el ALP presente en las membranas de los bordes en cepillo del lumen intestinal para formar IVb, que se absorbe rápidamente debido a su alta permeabilidad.
Aunque existen diferentes isoformas de ALP en diferentes tejidos y especies, la especificidad del sustrato por ALP es relativamente amplia (Heimbach y col., 2003), lo que es coherente con los descubrimientos anteriores para Ibb.
IVb se formó rápidamente después de la administración IV de Ibb en ratas, perros y monos. Las proporciones de conversión de AUC IV eran de 0,62 en ratas, 1,6 en perros y 1,7 en monos, lo que sugería una conversión de satisfactoria a buena de Ibb en IVb.
Se observaron buenas biodisponibilidades orales (50-310%; calculados usando el AUC de IV histórico de IVb) de IVb después de la administración de Ibb en ratas, perros y monos. De forma más significativa, los mayor solubilidad acuosa de IVb rebajaba la absorción limitada por la velocidad de disolución de IVb y de este modo aumentaba las exposiciones de IVb en los estudios aumento de dosis oral y de toxicocinética en comparación con las exposiciones de los estudios de IVb históricos (sección de Toxicología Tablas 28-29 y Figuras 12-13).
Procedimientos
Los estudios descritos en este informe usaban la sal de monolisina de Ibb.
Cuantificación de Ibb e IVb mediante CL/EM/EM
Se desarrollo un procedimiento de CL/EM/EM para el análisis de Ibb e IVb en muestras de plasma de los estudios de farmacocinética animal así como en sobrenadantes de acetonitrilo de estudios de incubación in vitro. Para el análisis en el plasma, se usó un instrumento Packard Multiprobe para transferir 50 \mul de cada patrón, QC y cada muestra de plasma a placas de 96 pocillos limpias para la extracción por precipitación de proteínas. Después de la adición de 200 \mul de acetonitrilo que contenía el patrón interno IVc, las muestras se agitaron en vórtice y se mezclaron y el sobrenadante resultante se separó de las proteínas precipitadas mediante centrifugación durante 10 minutos. Para el análisis en el sobrenadante generado a partir de los estudios in vitro, se mezcló un volumen igual del sobrenadante y de acetonitrilo que contenía el patrón interno. Se transfirió una alícuota del sobrenadante anterior usando un manipulador de líquidos automatizado de Tomtec a una segunda placa de 96 pocillos limpia. Se añadió un volumen igual de agua y la placa se tapó y se agitó en vórtice.
El sistema de HPLC estaba constituido por bombas Shimadzu LC10ADvp (Columbia, MD) y un automuestreador HTC PAL (Leap Technologies, Cary, NC) unido a una columna analítica Phenomenex Synergi Fusion-RP (2,0 x 50 mm, 5 \mu; Torrance, CA). La fase móvil A estaba constituida por formiato de amonio 5 mM en agua; la fase móvil B era acetonitrilo al 100%. El caudal de CL era de 0,38 ml/minuto. La composición inicial de la fase móvil era del 2% de B, aumentada al 50% de B durante 1,8 minutos y mantenida durante 0,5 minutos, aumentada al 100% de B durante 0,1 minutos y mantenida durante 0,5 minutos, y devuelta a las condiciones iniciales durante los próximos 0,1 minutos y re-equilibrada. El tiempo de análisis total era de 4,0 minutos. El tiempo de retención para Ibb, IVb e IVc era de 1,42, 2,21 y 1,73 minutos, respectivamente.
El sistema de HPLC se conectó a una espectómetro de masas de cuadrupolo triple Sciex API4000 (Toronto, Canadá) equipado con una fuente Turboionspray ajustada a 550ºC y el voltaje del chorro de iones ajustado a 4,5 kV. Se usó nitrógeno LTHP como nebulizador y gas auxiliar con la presión de 80 psi (0,55 MPa) y 7 l/min, respectivamente. Las energías de colisión para Ibb, IVb e IVc eran 19, 25 y 29 voltios, respectivamente. La adquisición de los datos utilizó la monitorización de reacción seleccionada (SRM). Los iones que representaban el modo de ion positivo (M+H)^{+} para Ibb, IVb y el patrón interno se seleccionaron en EM 1 y se seleccionaron mediante colisión con nitrógeno y las energías de colisión se optimizaron para formar iones del producto específico controlados posteriormente mediante EM2. Las transiciones de SRM para Ibb, IVb e IVc eran m/z 558\rightarrow432, 448\rightarrow202 y 474\rightarrow256, respectivamente.
Se prepararon curvas patrón que variaban entre 5 nM y 10 \muM a partir de soluciones madre y se diluyeron de forma seriada en matrices para Ibb e IVb. Se tomaron alícuotas de las curvas patrón por duplicado, se extrajeron con las muestras y se inyectaron en el principio, la zona media y al final de la secuencia analítica. Las curvas patrón se ajustaron con una regresión lineal ponderada mediante concentración recíproca 1/x^{2}. Los datos y los picos cromatográficos se procesaron y se cuantificaron las concentraciones de los patrones y las desconocidas usando PEBiosystems Analyst^{TM} 1.1.
Procedimientos In Vitro (1) Estabilidad de Iab en Sangre con EDTA, Suero y Tampón Tris-HCl
La estabilidad de Ibb se estudió en sangre recién extraída y suero de rata, perro, mono y ser humano (n = 2). La sangre se recogió en vacutainers que contenían K_{2}EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). El suero se recogió en vacutainers que no contenían anticoagulante. Ibb se incubó a una concentración de partida de aproximadamente 15 \muM durante 90 min a 37ºC. Las muestras en serie se tomaron en los tiempos predeterminados. En primer lugar las alícuotas de las muestras de sangre (200 \mul) se mezclaron con 100 \mul de agua seguido de 400 \mul de acetonitrilo. Las muestras de suero (50 \mul) se añadieron a microtainers que contenían K_{2}EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) seguido de la adición de 100 \mul de acetonitrilo. El sobrenadante se analizó para Ibb e IVb mediante CL/EM/EM.
También se evaluó la estabilidad de Ibb, como se ha descrito anteriormente, en tampón Tris-HCl (0,1 M, pH 7,5).
(2) Hidrólisis de Ibb en Presencia de ALP Placentaria Humana
Se obtuvo ALP placentaria humana sólida de Sigma (P-3895, St. Louis, MO). Se preparó una solución de 1000 unidades/l en tampón Tris-HCl (0,1 M, pH 7,5). Se obtuvieron soluciones de 100 y 10 unidades/l mediante dilución seriada. Se incubó Ibb en las soluciones de 10, 100 y 1000 unidades/l (n = 2) a 37ºC durante 2 horas. La concentración de partida de Ibb en la incubación era de 10 \muM. Se tomaron alícuotas de muestras 100 \mul en tiempos predeterminados y se añadieron a microtainers con K_{2}EDTA seguido de la adición de 200 \mul de acetonitrilo. El sobrenadante se analizó para Ibb e IVb mediante CL/EM/EM.
Estudios In Vivo
Todas las muestras de sangre (0,3 ml) se recogieron en microtainers que contenían K_{2}EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y se colocaron en hielo picado. Después de la centrifugación, el plasma se separó y se almacenó a -20ºC hasta el análisis. Se usó la sal de monolisina de Ibb (Forma 3) para los estudios farmacocinéticos. Las soluciones de dosificación de Ibb se prepararon en agua estéril (para administración IV en perros y monos) o agua destilada (para las demás administraciones de la dosis).
(1) Estudios In Vivo en Rata
Se usaron ratas Sprague-Dawley macho (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottsdale, PA) con cánulas implantadas en la vena yugular. Las ratas se mantuvieron en ayunas durante una noche en los estudios farmacocinéticos de PO. Se recogieron muestras de sangre de la vena yugular.
En el estudio IV, se administró Ibb a 1,3 mg/kg (ácido libre, o 1,0 mg/kg de equivalente de IVb) como una embolada durante 0,5 min (n = 3). La concentración de la solución de dosificación era de 1,3 mg/ml y el volumen de dosificación era 1 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y a los 2, 10, 15, 30, 45 minutos y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
En el estudio de PO, se administró Ibb a 6,6 mg/kg (ácido libre, o 5,2 mg/kg de equivalente de IVb) mediante una sonda oral (n = 3). La concentración de la solución de dosificación era de 1,3 mg/ml y el volumen de dosificación era 5 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y a los 15, 30, 45 min y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
(2) Estudios In Vivo en Perro
Los estudios de IV y PO de Ibb se realizaron en perros Beagle macho (10 \pm 0,78 kg, Marshall Farms USA Inc., North Rose, NY). Se usaron tres perros en cada estudio. De los tres perros, se usaron dos perros para los estudios de IV Y PO. Existía un periodo de eliminación de dos semanas entre los estudios de IV y PO.
En el estudio de IV se inyectó Ibb mediante la vena cefálica a 1,3 mg/kg (ácido libre, o 1,0 mg/kg de equivalente de IVb) durante 5 minutos a una velocidad constante de 0,1 ml/kg/minuto. La concentración de la solución de dosificación era de 2,6 mg/ml y el volumen de dosificación era de 0,5 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie de la arteria femoral antes de la dosificación y a los 5, 10, 15, 30, 45 minutos y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
En el estudio de PO, los perros se mantuvieron en ayunas durante una noche antes de la dosificación. Ibb se administró mediante una sonda oral a 7,0 mg/kg (ácido libre, o 5,6 mg/kg de equivalente de IVb). La concentración de la solución de dosificación era de 7,0 mg/ml y el volumen de dosificación era de 1 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y a los 15, 30, 45 minutos y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
(3) Estudios In Vivo en Mono
Los estudios de IV y PO de Ibb se realizaron de forma cruzada en tres monos cynomolgus macho (9,9 \pm 2,4 kg, Charles River Biomedical Research Foundation, Houston, TX). Existía un periodo de eliminación de dos semanas entre los estudios de IV y PO.
En el estudio de IV, se inyectó Ibb mediante la vena femoral a 1,3 mg/kg (ácido libre, o 1,1 mg/kg de equivalente de IVb) durante 5 minutos a una velocidad constante de 0,1 ml/kg/minuto. La concentración de la solución de dosificación era de 2,7 mg/ml y el volumen de dosificación era de 0,5 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie de la arteria femoral antes de la dosificación y a los 5, 10, 15, 30, 45 minutos y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
En el estudio de PO, los monos se mantuvieron en ayunas durante una noche antes de la dosificación. Se administró Ibb mediante una sonda oral a 5,8 mg/kg (ácido libre, o 4,7 mg/kg de equivalente de IVb). La concentración de la solución de dosificación era de 5,8 mg/ml y el volumen de dosificación era de 1 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y a los 15, 30, 45 minutos y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
(4) Análisis de los Datos
Todos los resultados se expresan como la media \pm DT, a menos que se especifique otra cosa.
Los parámetros farmacocinéticos de Ibb y IVb se calcularon mediante análisis no compartimental usando el programa KINETICA^{TM} (versión 4.0.2, InnaPhase Co., Philadelphia, PA). Los valores de Cmax y Tmax se registraron directamente de las observaciones experimentales. Los valores de AUC_{0-n} y AUC_{tot} se calcularon usando las sumas totales log-lineal trapezoidal mezcladas. La eliminación corporal total (Cl), el tiempo medio de residencia (MRT) y el volumen de distribución del estado constante (Vss) también se calcularon después de la administración intravenosa. La biodisponibilidad oral absoluta (expresada como %) se estimó tomando la proporción de los valores de AUC normalizados para la dosis después de las dosis orales con respecto a los de después de dosis intravenosas.
La eliminación intrínseca in vitro de Ibb en hepatocitos (Cl_{int}) se calculó de la siguiente manera:
Cl_{int} (\mul/min/millón de células) = velocidad/C_{E}
donde velocidad es la velocidad del metabolismo de los hepatocitos (pmol/minuto/millón de células) y C_{E} es la concentración de Ibb en la incubación.
La eliminación hepática intrínseca in vivo de Ibb (Cl_{int, \ \mathit{in \ vivo}}) se calculó de la siguiente manera:
136
donde \chi es 40, 32, 30 y 26 g de hígado/kg de peso corporal para la rata, perro, mono y ser humano, respectivamente. (Davis y Morris, 1993).
\vskip1.000000\baselineskip
La eliminación hepática Cl_{H} se calculó a partir de la siguiente ecuación usando el modelo de contenedor bien agitado:
137
donde Qh es el flujo sanguíneo en el hígado de 55, 31, 44 y 21 ml/min/kg para la rata, perro, mono y ser humano, respectivamente (Davis y Morris, 1993).
El índice de extracción hepática (ER) se calculó de la siguiente manera:
ER = Cl_{H}/Qh
Se usó el ensayo de t de Student para el análisis estadístico (Microsoft® Excel, Redmond, WA). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas al nivel de P < 0,05.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudios In Vitro Estabilidad de Ibb en sangre con EDTA, Suero y Tampón Tris HCl
Como parte de la validación del ensayo analítico, se estudió la estabilidad de Ibb en sangre que contenía EDTA, que se sabe que es un inhibidor de ALP (Bowers, Jr. y McComb, 1966; Yora y Sakagishi, 1986). Después de la incubación a 37ºC durante 90 minutos, había menos del 2% de conversión de Ibb en IVb en sangre que contenía EDTA y en presencia de tampón Tris-HCl (Tablas 30 y 31). Los pequeños porcentajes de conversión anteriores observados a 37ºC indican que la conversión en las condiciones de almacenamiento de la muestra (-20ºC) es improbable. Por lo tanto, se espera una conversión ex vivo relativamente mínima en IVb durante el análisis de Ibb.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 30 Estabilidad de Ibb en sangre con EDTA Recién Extraída de Rata, Perro y Mono
139
TABLA 31 Estabilidad de Ibb en Sangre de EDTA Recién Extraída de Ser Humano y Tampón Tris-HCl
141 
\vskip1.000000\baselineskip
Para investigar la hidrólisis de Ibb en la circulación sistémica, se incubó Ibb en suero recién preparado (rata, perro, mono y ser humano) a 37ºC durante 90 minutos. La velocidad de hidrólisis era más rápida en el suero de mono, seguido por el de ser humano, el de perro y el de rata (Tabla 3). La conversión de Ibb en IVb era casi estequiométrica.
El suero contiene menos actividades de ALP en comparación con los tejidos (McComb y col., 1979a). Además, el suero también contiene isoformas de ALP de fuentes tisulares tales como el hueso, el hígado y el intestino, como resultado de la filtración de enzimas a través de los vasos sanguíneos (Moss, 1983). Por lo tanto, la hidrólisis de Ibb en el suero estaba medida probablemente por múltiples isoformas de ALP.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 32 Estabilidad de Ibb en Suero Recién Extraído de Rata, Perro, Mono y Ser Humano
142 
\newpage
Hidrólisis de Ibb en presencia de ALP Placentaria Humana
Para estudiar la hidrólisis de Ibb en una forma purificada de ALP humana, se incubó Ibb a 37ºC (2 horas) con soluciones que contenían ALP placentaria humana (10, 100 y 1000 unidades/l). La desaparición t_{1/2} de Ibb se determinó (Tabla 4). Como se esperaba, la velocidad de hidrólisis era más rápida en las soluciones con mayores actividades de ALP. También se formó IVb de forma correspondiente (Figura. 14). Esto indica que Ibb es hidrolizado por ALP obtenido de seres humanos para formar IVb.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 33 Hidrólisis de Ibb en Soluciones de ALP Placentaria Humana Actividad de ALP (Unidades/l) (n = 2)
143 
\vskip1.000000\baselineskip
Estudios In Vivo Estudios In Vivo en Rata
Los parámetros farmacocinéticos de Ibb y IVb en ratas después de la administración IV y oral de Ibb se resumen en la Tabla 34. Los perfiles de concentración en plasma frente al tiempo se muestran en la Figura 15. Para comparación, también se muestran los datos históricos de los estudios farmacocinéticos de IVb en ratas.
La eliminación corporal total (Cl) de Ibb después de la administración IV era de 19 ml/min/kg, lo que sugería que Ibb es un compuesto de eliminación baja a moderada en ratas. La semi-vida de eliminación (t_{1/2}) y el tiempo de residencia medio (MRT) después de la administración IV eran de 0,18 horas y 0,079 horas, respectivamente. No se detectó Iab después de 2 horas. El volumen de distribución de Ibb en el estado constante (Vss) era de 0,10 l/kg, lo que sugería una distribución tisular muy limitada. La formación de IVb a partir de Ibb después de la administración IV era rápida; se detectó IVb en el primer punto temporal de muestreo de 2 min (no se muestran los datos). La proporción de AUC IV de IVb formado a partir de Ibb frente al estudio de IVb histórico era de 0,62 (valor teórico para la conversión completa = 1), lo que indicaba una conversión satisfactoria de Ibb en IVb en ratas después de la dosificación IV.
Ibb se detectó (< 10 nM) en el plasma (0,25 y 0,5 horas) después de la administración oral. El Tmax de IVb después de la administración oral de Ibb era de 0,83 horas, que es menor que el Tmax histórico de IVb de 4,7 horas, lo que indicaba una absorción más rápida de IVb después de la administración oral del profármaco. La absorción más rápida de IVb a partir del profármaco es probablemente el resultado de una mejor solubilidad acuosa de Ibb así como de la rápida hidrólisis de Ibb para formar IVb en el intestino. La biodisponibilidad oral absoluta de IVb a partir de Ibb es del 50%, similar al valor histórico de IVb del 60% (Tabla 34). Además, la exposición de IVb a partir del estudio de aumento de dosis oral de Ibb en rata era superior en comparación con los datos históricos con IVa (Tabla 31 y Fig. 14).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 34 Parámetros Farmacocinéticos de Ibb y de IVb después de la administración IV y Oral de Ibb en Ratas (Media \pm DT, n = 3)
144 
\newpage
Estudios In Vivo en Perro
Los parámetros farmacocinéticos de Ibb y IVb en perros después de la administración IV y oral de Ibb se resumen en la Tabla 35. Los perfiles de concentración en plasma frente al tiempo se muestran en la Figura 16. Para comparación, también se muestran los datos históricos de los estudios farmacocinéticos de IVb en perros.
El Cl de Ibb después de la administración IV era de 27 ml/min/kg, similar al flujo sanguíneo del hígado de 31 ml/min/kg en perros, lo que sugería que Ibb es un compuesto de alta eliminación en perros. El t_{1/2} y MRT después de la administración IV eran de 0,83 horas y 0,21 horas, respectivamente. El MRT reflejaba una estimación más realista de la duración de Ibb en el plasma ya que las concentraciones en plasma de Ibb en la fase terminal eran bajas (Figura 3). Ibb no se detectó después de 4 horas. El Vss de Ibb era de 0,35 l/kg, lo que sugería una distribución tisular limitada. La formación de IVb a partir de Ibb después de la administración IV era rápida; se detectó IVb en el primer punto temporal de muestreo de 5 min (no se muestran los datos). La proporción de AUC IV de IVb formado a partir de Ibb frente a la del estudio de IVb histórico era de 1,6, lo que sugería una completa conversión de Ibb en IVb en perros después de la administración IV.
Se detectó Ibb (Cmax = 0,034 nM) en muestras de plasma en puntos temporales tempranos (de hasta 2 horas en un perro) después de la administración oral. El Tmax de IVb después de la administración oral de Ibb era 0,40 horas, similar al Tmax histórico de IVb de 0,50 horas. La biodisponibilidad oral absoluta de IVb a partir de Ibb era del 310%, similar a los datos de IVb históricos del 179%. Además, la exposición de IVb a partir del estudio de tolerabilidad de Ibb en perros (aumento de dosis) era mayor cuando se comparaba con los datos históricos con IVb (Tabla 31 y Figura 15).
Los perfiles de concentración en plasma terminal frente al tiempo de IVb formado a partir de Ibb son similares a los perfiles de IVb históricos (Figura 16).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 35 Parámetros Farmacocinéticos de Ibb y IVb después de administración IV y oral de Ibb en perro (Media \pm DT, n = 3) 
\vskip1.000000\baselineskip
145 
\newpage
Estudios In Vivo en Mono
Los parámetros farmacocinéticos de Ibb e IVb en monos después de la administración IV y oral de Ibb se resumen en la Tabla 36. Los perfiles de concentración en plasma frente al tiempo se muestran en la Figura 17. Para comparación, también se muestran los datos históricos de los estudios de farmacocinética de IVb en monos.
El Cl de Ibb después de la administración IV era de 28 ml/min/kg, lo que sugería que Ibb es un compuesto de eliminación moderada a alta en monos. El t_{1/2} y MRT después de la administración IV eran de 0,10 horas y 0,093 horas, respectivamente. El Vss de Ibb era 0,15 l/kg, lo que sugería una distribución tisular muy limitada. La formación de IVb a partir de Ibb después de la administración IV era rápida. IVb se detectó en el primer punto temporal de muestreo de 5 minutos (no se muestran los datos). La proporción de AUC IV de IVb formado a partir de Ibb frente a la del estudio de IVb histórico era de 1,7, lo que sugería una completa conversión de Ibb en IVb después de la dosificación IV.
Ibb no se detectó (LLQ = 5 nM) en ninguna muestra de plasma después de la administración oral. El Tmax de IVb después de la administración oral de Ibb era de 1,5 horas, similar al Tmax histórico de IVb de 2,5 horas. La biodisponibilidad oral absoluta de IVb a partir de Ibb era del 187%, que es mayor que los datos de IVb históricos del 49% (Tabla 36).
Los perfiles de concentración en plasma terminal frente al tiempo de IVb formado a partir de Ibb son similares a los perfiles de IVb históricos (Figura 17).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 36 Parámetros Farmacocinéticos de Ibb y IVb después de la administración IV y oral de Ibb en el mono (Media \pm DT, n = 3)
146 
\vskip1.000000\baselineskip
Sección de Caracterización 3 Estudios Adicionales con el Profármaco Icb Estudio Toxicocinético de Tolerabilidad de Dosis Únicas en Ratas CD
Se realizó un estudio toxicocinético oral de 1 día en ratas usando el profármaco Icb (sal disódica); se administró Icb a dosificaciones de 5, 25 y 200 mg/kg (ácido libre) mediante una sonda oral a tres ratas macho/grupo usando agua como vehículo (formulación en solución). Las dosificaciones del profármaco ácido libre, corresponden a dosificaciones de equivalente molar de IVc (compuesto parental) de 4,5, 21, y 163 mg/kg, respectivamente. El criterio de valoración evaluado era la toxicocinética del plasma de Icb e IVc en las ratas individuales.
Los valores toxicocinéticos medios se proporcionan en la Tabla 37.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 37 Valores toxicocinéticos medios para Icb y Nc en ratas macho a las que se les administró \leq 200 mg/kg de Icb como una única dosis oral
148 
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración en plasma máxima media (Cmax) de IVc (compuesto parental) se alcanzó a las \approx1,7 horas después de la dosis. En ratas a las que se administró \leq 267 mg/kg de Icb, el aumento de AUC de IVc era casi proporcional a la dosificación de Icb, y la Cmax aumentó de manera menos que proporcional a la dosis entre 25 y 200 mg/kg de Icb. Icb no se detectó en plasma de ratas a las que se les administró \leq 25 mg/kg de Icb y se detectaron concentraciones muy bajas (\approx0,02-0,04 \muM) en plasma de ratas a las que se administró 200 mg/kg de Icb en varios puntos temporales.
Una comparación de AUC de IVc obtenida en ratas a las que se administró IVc (1) o Icb, se muestra en la Figura 18.
El AUC de IVc es similar después de la administración del compuesto parental o del profármaco a dosificaciones más bajas (por ejemplo, \leq 25 mg/kg) ya que ambas pueden formularse como soluciones (PEG-400/etanol/NaOH 0,1 N para el compuesto parental y agua para el profármaco) pero a una dosificación alta (por ejemplo, 200 mg/kg) el compuesto parental neutro sólo puede formularse como suspensión mientras que la sal del profármaco puede formularse como solución acuosa, lo que proporciona una exposición de IVc superior.
Estudio de Toxicocinética y Tolerabilidad de Dosis Única en Perros
Se realizó un estudio de dos fases para evaluar la tolerabilidad del profármaco, Icb (sal de monotrometamina) a dosificaciones de 25, 92 ó 250 mg/kg (ácido libre, equivalente molar a 20, 75 ó 203 mg/kg del compuesto parental IVc, respectivamente) y la toxicocinética de Icb y IVc (2). El día 1, se administró Icb a un perro/sexo/grupo una vez al día en cápsulas rellenadas en seco a las dosificaciones anteriores. Se usó un periodo de eliminación de una semana entre las dosis en el estudio. El día 8, se administró Icb a un perro/sexo/grupo una vez al día como solución acuosa a 25 mg/kg o dos veces al día en cápsulas rellenadas en seco a 46 ó 125 mg/kg BID. Los criterios de valoración eran: signos clínicos, peso corporal, consumo de alimentos, química del suero, hematología y toxicocinética del plasma de Icb e IVc.
Los valores de toxicocinética del plasma de perros individuales se muestran en la Tabla 38.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 38 Valores toxicocinéticos para IVc en perros a los que se administró \leq 250 mg/kg de Icb
149 
\vskip1.000000\baselineskip
Los niveles bajos (\leq 0,1 \muM) de Icb se detectaron en algunas muestras de plasma los días 1 y 8. La concentración en plasma máxima media (Cmax) de IVc se alcanzó entre 1-2 horas después de la dosificación para dosificación QD y 1-2 horas después de la segunda dosificación para la dosificación BID. A 25 mg/kg QD, se observó una Cmax y AUC equivalente cuando se administraba Icb como cápsulas rellenadas en seco o como solución acuosa. El día 1, se observó emesis (blanca o marrón, veteada de rojo que contenía remanentes de cápsula) a aproximadamente 1-1,25 horas después de la dosificación en todos los perros a los que se administró \geq 92 mg/kg QD (3101M, 4101M y 4201F), que contribuyó probablemente a la exposición fija entre 92 y 250 mg/kg. El día 8, se observó emesis a las 2 horas después de la dosificación en perros a los que se administró 125 mg/kg BID pero con diferentes resultados. El animal 4101M tenia una exposición sustancial a pesar de la emesis, coherente con la ausencia de remanentes de cápsula en el vomito.
Solamente se detectaron niveles bajos (\leq 0,1 \muM) de Icb en algunas muestras de plasma los días 1 y 8.
Aparte de la emesis, no se observaron signos clínicos y no había efecto sobre el peso corporal y el consumo de alimento.
A pesar de la emesis observada en los perros, se observa un valor más alto de AUC de IVc en perros a los que se administró Icb que en los perros a los que se administró IVc. Una comparación del AUC de IVc obtenida en perros a los que se administró Icb o IVc (3, 4), se muestra en la Figura 19.
Vehículos y Formulaciones Resumen de Formulaciones Usadas Para Estudios de PK claves y de Seguridad
Todos los estudios de PK in vivo en ratas, perros y monos se realizaron usando soluciones acuosas para la dosificación PO e IV. Los estudios de toxicología Pre-ECN se realizaron con soluciones acuosas preparadas a dosis de 20 mg/kg de equivalentes de IVc y como fármaco en formulaciones en cápsula a dosis de 20, 75 y 203 mg/kg de equivalentes de IVc.
En el estudio de aumento de dosis oral de rata, se dosificó Icb-03 como solución acuosa a dosis de 4,5, 21 y 163 mg/ml de equivalentes de IVc. Se observaron mejoras significativas de AUC y Cmax de IVc, compuesto parental, después de la dosificación oral de Icb, en comparación con los datos históricos después de la dosificación oral de IVc.
Metabolismo y Resumen de Farmacocinética Resumen de descubrimientos e interpretación
Icb es el profármaco de fosfato del aducto de N-hidroximetilo de IVc y se hidroliza mediante fosfatasa alcalina (ALP) para formar IVc. Después de la administración de Icb a animales, por lo tanto, se prepararon muestras de plasma a partir de sangre recogida en presencia de EDTA, un inhibidor de ALP conocido. La conversión de Icb en IVc era mínima (< 2%) en la sangre que contenía EDTA (rata, perro, mono y ser humano). No se espera conversión ex vivo significativa de Icb durante el almacenamiento de las muestras (-20ºC) y el análisis de Icb.
La hidrólisis de Icb se estudió en sistemas in vitro animales y humanos. Ya que están ampliamente distribuidas múltiples isoformas de ALP en diversos tejidos, no se intentaron correlaciones cuantitativas in vitro con respecto a in vivo (Fishman y col., 1968; Komoda y col., 1981; Moss, 1983; Yora y Sakagishi, 1986; Sumikawa y col., 1990). Por lo tanto, los estudios se limitaban a una evaluación cualitativa de la hidrólisis dependiente de ALP en diferentes tejidos. Icb se hidrolizó en presencia de suero (rata, perro, mono y ser humano) hepatocitos (rata, perro y ser humano) así como ALP placentaria humana. No se observó renovación en hepatocitos de mono. La conversión de Icb en IVc era casi estequiométrica. Debido a la hidrólisis en el suero, la unión a proteínas de Icb no pudo determinarse.
IVc se formó rápidamente después de la administración IV de Icb en ratas, perros y monos. Las proporciones de conversión de AUC IV eran de 1,0 en ratas, 0,67 en perros y 0,90 en monos, lo que sugería una buena conversión de Icb a IVc.
Se observaron buenas biodisponiblidades orales (80-122%) de IVc después de la administración de Icb en ratas, perros y monos. De forma más significativa, la mayor solubilidad acuosa de Icb rebajó la absorción limitada por la velocidad de disolución de IVc por debajo de ciertas dosis y de este modo aumentó las exposiciones de IVc en estudios de aumento de la dosis oral y de toxicocinética en comparación con las exposiciones de los estudios IVc históricos.
Procedimientos
Los estudios descritos en este informe usaban la sal de monotrometamina de Icb, a menos que se indique otra cosa.
Cuantificación de Icb e IVc mediante CL/EM/EM
Se desarrolló un procedimiento de CL/EM/EM para el análisis de Icb e IVc en muestras de plasma de los estudios farmacocinéticos animales así como en sobrenadante de acetonitrilo de estudios de incubación in vitro. Para el análisis en plasma, se usó un instrumento Packard Multiprobe para transferir 50 \mul de cada patrón, QC, y la muestra de plasma a una placa de 96 pocillos limpia para la extracción por precipitación de proteínas. Después de la adición de 200 \mul de acetonitrilo que contenía el patrón interno Compuesto X a continuación, las muestras se mezclaron con agitación en vórtice y el sobrenadante resultante se separó de las proteínas precipitadas mediante centrifugación durante 10 minutos. Para el análisis en el sobrenadante generado a partir de los estudios in vitro, se mezcló un volumen igual del sobrenadante y de acetonitrilo que contenía el patrón interno. Se transfirió una alícuota del sobrenadante anterior usando un manipulador de líquidos automatizado de Tomtec hasta una segunda placa de 96 pocillos limpia. Se añadió un volumen igual de agua, la placa se tapó y se agitó en vórtice.
\newpage
Compuesto X
\vskip1.000000\baselineskip
151 
\vskip1.000000\baselineskip
4-metoxi-3-(2-oxo-2-(4-(quinazolin-4-il)piperazin-1-il)acetil)-1H-pirrol[2,3-c]piridin-7-carboxamida
El sistema de HPLC estaba constituido por bombas Shimadzu LCIOADvp (Columbia, MD) y un automuestreador HTC PAL (Leap Technologies, Cary, NC) unido a columna analítica Phenomenex Synergi Fusion-RP (2,0 x 50 mm, 5 \mu; Torrance, CA). La fase móvil A estaba constituida por formiato de amonio 5 mM en agua; la fase móvil B era acetonitrilo al 100%. El caudal de CL era de 0,4 ml/min. La composición inicial de la fase móvil era del 3% de B, aumentada al 60% de B durante 1,75 min y mantenida durante 0, 5 min, elevada al 100% de B durante 0,1 min y mantenida durante 0,5 min, devuelta a las condiciones iniciales durante el próximo 0,1 min y re-equilibrada. El tiempo de análisis total era de 4,0 min. El tiempo de retención para Icb, IVc y el Compuesto X era de 1,2, 1,7 y 1,6 minutos, respectivamente.
El sistema de HPLC estaba conectado con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Sciex API4000 (Toronto, Canadá) equipado con la fuente Turboionspray ajustada a 550ºC y el voltaje del chorro de iones ajustado a 4,5 kV. Se usó nitrógeno UHP como nebulizador y gas auxiliar con la presión de 80 psi (0,55 MPa) y 7 l/min, respectivamente. Las energías de colisión para Icb, IVc y el Compuesto X eran 23, 29 y 37 voltios, respectivamente. La adquisición de los datos utilizó la monitorización de la reacción seleccionada (SRM). Los iones que representan las especies del modo de ion positivo (M+H)^{+} para Icb, IVc y el patrón interno se seleccionaron en EM 1 y se disociaron mediante colisión con nitrógeno y se optimizaron las energías de colisión para formar iones del producto específico controlados posteriormente mediante EM2. Las transiciones de SRM para Icb, IVc y el Compuesto X eran m/z 584\rightarrow486, 474\rightarrow256 y 460\rightarrow218, respectivamente.
Se prepararon curvas patrón que variaban de 5 nM a 10 \muM a partir de soluciones madre y se diluyeron de forma seriada en matrices para Icb y IVc. Se tomaron por duplicado alícuotas de las curvas patrón, se extrajeron con las muestras y se inyectaron en la parte del principio, parte central y parte final de la secuencia analítica. Las curvas patrón se ajustaron con una regresión lineal ponderada mediante concentración recíproca 1/x^{2}. Los datos y los picos cromatográficos se procesaron y se cuantificaron las concentraciones de los patrones y las desconocidas usando PEBiosystems Analyst^{TM} 1,1.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimientos In Vitro (1) Estabilidad de Icb en Sangre con EDTA, Suero y Tampón Tris-HCl
La estabilidad de Icb se estudió en sangre recién extraída y suero de rata, perro, mono y ser humano (n = 2). La sangre se recogió en vacutainers que contenían K_{2}EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). El suero se recogió en vacutainers que no contenían anticoagulante. Icb se incubó a una concentración de partida de aproximadamente 10 \muM durante 90 min a 37ºC. Se tomaron muestras en serie en los tiempos predeterminados. En primer lugar las alícuotas de las muestras de sangre (200 \mul) se mezclaron con 100 \mul de agua seguido de 400 \mul de acetonitrilo. Las muestras de suero (50 \mul) se añadieron a microtainers que contenían K_{2}EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) seguido de la adición de 100 \mul de acetonitrilo. El sobrenadante se analizó para Icb e IVc mediante CL/EM/EM.
También se evaluó la estabilidad de Icb, como se ha descrito anteriormente, en tampón Tris-HCl (0,1 M, pH 7,5).
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Hidrólisis de Icb en Presencia de ALP Placentaria Humana
Se obtuvo ALP placentaria humana sólida de Sigma (P-3895, St. Louis, MO). Se preparó una solución de 1000 unidades/l en tampón Tris-HCl (0,1 M, pH 7,5). Se obtuvieron soluciones de 100 y 10 unidades/l mediante dilución seriada. Se incubó Icb en las soluciones de 10, 100 y 1000 unidades/l (n = 2) a 37ºC durante 2 horas. La concentración de partida de Icb en la incubación era de 10 \muM. Se tomaron alícuotas de muestras 100 \mul en tiempos predeterminados y se añadieron a microtainers con K_{2}EDTA seguido de la adición de 200 \mul de acetonitrilo. El sobrenadante se analizó para Icb e IVc mediante CL/EM/EM.
(1) Estudios In Vivo en Rata
Se usaron ratas Sprague-Dawley macho (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottsdale, PA) con cánulas implantadas en la vena yugular. Las ratas se mantuvieron en ayunas durante una noche en los estudios farmacocinéticos de PO. Se recogieron muestras de sangre de la vena yugular.
En el estudio IV, se administró Icb a 1,4 mg/kg (ácido libre, o 1,1 mg/kg de equivalente de IVc) como una embolada durante 0,5 min (n = 3). La concentración de la solución de dosificación era de 1,4 mg/ml y el volumen de dosificación era 1 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y a los 2, 10, 15, 30, 45 minutos y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
En el estudio de PO, se administró Icb a 6,9 mg/kg (ácido libre, o 5,6 mg/kg de equivalente de IVc) mediante una sonda oral (n = 3). La concentración de la solución de dosificación era de 1,4 mg/ml, y el volumen de dosificación era 5 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y a los 15, 30, 45 min y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
(2) Estudios In Vivo en Perro
Los estudios de IV y PO de Icb se realizaron de forma cruzada en tres perros Beagle macho (12 \pm 2,8 kg, Marshall Farms USA Inc., North Rose, NY). Existía un periodo de eliminación de dos semanas entre los estudios de IV y PO.
En el estudio de IV se inyectó Icb mediante la vena cefálica a 1,3 mg/kg (ácido libre, o 1,0 mg/kg de equivalente de IVc) durante 5 minutos a una velocidad constante de 0,1 ml/kg/minuto. La concentración de la solución de dosificación era de 2,6 mg/ml, y el volumen de dosificación era de 0,5 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie de la arteria femoral antes de la dosificación y a los 5, 10, 15, 30, 45 minutos y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
En el estudio PO, los perros se mantuvieron en ayunas durante una noche antes de la dosificación. Icb se administró mediante una sonda oral a 6,0 mg/kg (ácido libre, o 4,9 mg/kg de equivalente de IVc). La concentración de la solución de dosificación era de 12 mg/ml y el volumen de dosificación era de 0,5 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y a los 15, 30, 45 minutos y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
(3) Estudios In Vivo en Mono
Los estudios de IV y PO de Icb se realizaron de forma cruzada en tres monos cynomolgus macho (10 \pm 1,6 kg, Charles River Biomedical Research Foundation, Houston, TX). Existía un periodo de eliminación de dos semanas entre los estudios de IV y PO.
En el estudio de IV, se inyectó Icb mediante la vena femoral a 1,4 mg/kg (ácido libre, o 1,1 mg/kg de equivalente de IVc) durante 5 minutos a una velocidad constante de 0,1 ml/kg/minuto. La concentración de la solución de dosificación era de 2,8 mg/ml y el volumen de dosificación era de 0,5 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie de la arteria femoral antes de la dosificación y a los 5, 10, 15, 30, 45 minutos y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
En el estudio de PO, los monos se mantuvieron en ayunas durante una noche antes de la dosificación. Se administró Icb mediante una sonda oral a 4,9 mg/kg (ácido libre, o 4,0 mg/kg de equivalente de IVc). La concentración de la solución de dosificación era de 9,8 mg/ml y el volumen de dosificación era de 0,5 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y a los 15, 30, 45 minutos y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
(4) Análisis de los Datos
Todos los resultados se expresan como la media \pm DT, a menos que se especifique otra cosa.
Los parámetros farmacocinéticos de Icb y IVc se calcularon mediante un análisis no compartimental usando el programa KINETICA^{TM} (versión 4.0.2, InnaPhase Co., Philadelphia, PA). Los valores de Cmax y Tmax se registraron directamente a partir de las observaciones experimentales. Los valores de AUC_{0-n} y AUC_{tot} se calcularon usando las sumas totales log-lineal trapezoidal mezcladas. La eliminación corporal total (Cl), el tiempo medio de residencia (MRT) y el volumen de distribución del estado constante (Vss) también se calcularon después de la administración intravenosa. La biodisponibilidad oral absoluta (expresada como %) se estimó tomando la proporción de los valores de AUC normalizados para la dosis después de las dosis orales con respecto a los de después de dosis intravenosas.
La eliminación intrínseca in vitro de Icb en hepatocitos (Cl_{int}) se calculó de la siguiente manera:
Cl_{int} (\mul/min/millón de células) = velocidad/C_{E}
donde velocidad es la velocidad del metabolismo de los hepatocitos (pmol/minuto/millón de células) y C_{E} es la concentración de Icb en la incubación.
La eliminación hepática intrínseca in vivo de Icb (Cl_{int, \ \mathit{in \ vivo}}) se calculó de la siguiente manera:
152
donde \chi es 40, 32, 30 y 26 g de hígado/kg de peso corporal para la rata, perro, mono y ser humano, respectivamente. (Davis y Morris, 1993).
La eliminación hepática Cl_{H} se calculó a partir de la siguiente ecuación usando el modelo de compartimentos bien agitados:
153
donde Qh es el flujo sanguíneo en el hígado de 55, 31, 44 y 21 ml/min/kg para la rata, perro, mono y ser humano, respectivamente (Davis y Morris, 1993).
El índice de extracción hepática (ER) se calculó de la siguiente manera:
ER = Cl_{H}/Qh
Se usó el ensayo de t de Student para el análisis estadístico (Microsoft® Excel, Redmond, WA). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas al nivel de P < 0,05.
Estudios In Vitro Estabilidad de Icb en sangre con EDTA, Suero y Tampón Tris HCl
Como parte de la validación del ensayo analítico, se estudió la estabilidad de Icb en sangre que contenía EDTA, que se sabe que es un inhibidor de fosfatasas alcalinas (Bowers, Jr. y McComb, 1966; Yora y Sakagishi, 1986). Después de la incubación a 37ºC durante 90 minutos, había menos del 2% de conversión de Icb en IVc en sangre que contenía EDTA y en presencia de tampón Tris-HCl (Tablas 39 y 40). En las condiciones de almacenamiento de la muestra de -20ºC, no se espera que los pequeños porcentajes de conversión observados anteriormente a 37ºC introduzcan ninguna conversión ex vivo significativa durante el análisis de Icb.
TABLA 39 Estabilidad de Icb en sangre con EDTA recién recogida de rata, perro y mono
155
TABLA 40 Estabilidad de Icb en sangre con EDTA recién recogida de ser humano y en tampón Tris-HCl
156 
\vskip1.000000\baselineskip
Para investigar la hidrólisis de Icb en la circulación sistémica, se incubó Icb en suero recién extraído (rata, perro, mono y ser humano) a 37ºC durante 90 minutos. La velocidad de hidrólisis era más rápida en el suero de mono, seguido por el de rata, el de ser humano y el de perro (Tabla 41). La conversión de Icb en IVc era casi
estequiométrica.
El suero contiene menos actividades de ALP en comparación con los tejidos (McComb y col., 1979a). Además, el suero también contiene isoformas de ALP de fuentes tisulares tales como el hueso, el hígado y el intestino, como resultado de la filtración de enzimas a través de los vasos sanguíneos (Moss, 1983). Por lo tanto, la hidrólisis de Icb en el suero estaba medida probablemente por múltiples isoformas de ALP.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 41 Estabilidad de Icb en Suero Recién Extraído de Rata, Perro, Mono y Ser Humano
157 
\newpage
Hidrólisis de Icb en presencia de ALP Placentaria Humana
Para estudiar la hidrólisis de Icb en una forma purificada de ALP humana, se incubó Icb a 37ºC (2 horas) con soluciones que contenían ALP placentaria humana (10, 100 y 1000 unidades/l). La desaparición t_{1/2} de Icb se determinó (Tabla 42). Como se esperaba, la velocidad de hidrólisis era más rápida en las soluciones con mayores actividades de ALP. También se formó IVc de forma consecuente (Figura 20). Esto indica que Icb se hidroliza por ALP obtenida de seres humanos para formar IVc.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 42 Hidrólisis de Icb en Soluciones de ALP Placentaria Humana
158 
\vskip1.000000\baselineskip
Estudios In Vivo Estudios In Vivo en Rata
Los parámetros farmacocinéticos de Icb y IVc en ratas después de la administración IV y oral de Icb se resumen en la Tabla 43. Los perfiles de concentración en plasma frente al tiempo se muestran en la Figura 21. Para comparación, también se muestran los datos históricos de los estudios farmacocinéticos de IVc en ratas.
La eliminación corporal total (Cl) de Icb después de la administración IV era de 49 ml/min/kg, lo que sugería que Icb es un compuesto de alta eliminación en ratas. La semi-vida de eliminación (t_{1/2}) y el tiempo de residencia medio (MRT) después de la administración IV eran de 0,084 horas y 0,072 horas, respectivamente. El volumen de distribución de Icb en el estado constante (Vss) era de 0,21 l/kg, lo que sugería una distribución tisular muy limitada. La formación de IVc a partir de Icb después de la administración IV era rápida; se detectó IVc en el primer punto temporal de muestreo de 2 minutos (no se muestran los datos). La proporción de AUC IV de IVc formado a partir de Icb frente a la del estudio de IVc histórico era de 1,0 (valor teórico para la conversión completa = 1), lo que sugería la conversión completa de Icb en IVc.
No se detectó Icb (LLQ = 5 nM) en ninguna muestra de plasma después de la administración oral. El Tmax de IVc después de la administración de Icb era de 0,80 horas, que es menor que el Tmax histórico de IVc de 4,0 horas, lo que indicaba una absorción más rápida de IVc después de la administración oral del profármaco. La absorción más rápida de IVc del profármaco es probablemente el resultado de una mejor solubilidad acuosa de Icb así como una rápida hidrólisis de Icb para formar IVc en el intestino. La biodisponibilidad oral absoluta de IVc a partir de Icb es del 80%, similar al valor histórico de IVc del 82% (Tabla 43). Además, la exposición de IVc del estudio de aumento de dosis oral de Icb en rata era superior en comparación con los datos históricos con IVc (Tabla 37 y Fig. 18).
Los perfiles de concentración en plasma terminal frente al tiempo de IVc formado a partir de Icb son similares a los perfiles de IVc históricos (Fig. 21).
TABLA 43 Parámetros Farmacocinéticos de Icb y de IVc después de la administración IV y Oral de Icb en Rata (Media \pm DT, n = 3)
159 
\newpage
Estudios In Vivo en Perro
Los parámetros farmacocinéticos de Icb y IVc en perros después de la administración IV y oral de Icb se resumen en la Tabla 44. Los perfiles de concentración en plasma frente al tiempo se muestran en la Figura 22. Para comparación, también se muestran los datos históricos de los estudios farmacocinéticos de IVc en perros.
El Cl de Icb después de la administración IV era de 64 ml/min/kg, significativamente más alto que el flujo sanguíneo del hígado de 31 ml/min/kg en perros y sugiere la implicación de hidrólisis extrahepática y/o otra(s) vía(s) de eliminación (por ejemplo, excreción renal). El t_{1/2} y MRT después de la administración IV eran de 0,25 horas y 0,14 horas, respectivamente. No se detectó Icb después de 2 horas. El Vss de Icb era de 0,50 l/kg, lo que sugería un bajo potencial de distribución tisular. La formación de IVc a partir de Icb después de la administración IV era rápida; se detectó IVc en el primer punto temporal de muestreo de 5 min (no se muestran los datos). La proporción de AUC IV de IVc formado a partir de Icb frente a la del estudio de IVc histórico era de 0,67, lo que sugería una conversión moderada de Icb en IVc en perros después de la administración IV.
No se detectó Icb (LLQ = 5 nM) en ninguna muestra de plasma después de la administración oral. El Tmax de IVc después de la administración oral de Icb era de 0,58 horas, que es menor que el Tmax histórico de IVc de 1,3 horas lo que indicaba una absorción más rápida de IVc después de la administración oral del profármaco. La biodisponibilidad oral absoluta de IVc a partir de Icb era del 104%, similar a los datos de IVc históricos del 89%. Además, la exposición de IVc a partir del estudio de tolerabilidad de Icb en perros (aumento de dosis) era mejor en comparación con los datos históricos con IVc (Tabla 41 y Figura 21).
Los perfiles de concentración en plasma terminal frente al tiempo de IVc formado a partir de Icb son similares a los perfiles de IVc históricos (Figura 22).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 44 Parámetros Farmacocinéticos de Icb y IVc después de la administración IV y oral de Icb en Perro (Media \pm DT, n = 3)
160 
\newpage
Estudios In Vivo en Mono
Los parámetros farmacocinéticos de Icb e IVc en monos después de la administración IV y oral de Icb se resumen en la Tabla 45. Los perfiles de concentración en plasma frente al tiempo se muestran en la Figura 23. Para comparación, también se muestran los datos históricos de los estudios de farmacocinética de IVc en monos.
El Cl de Icb después de la administración IV era de 47 ml/min/kg, similar al flujo sanguíneo del hígado de 44 ml/min/kg en monos, lo que sugiere que Icb es un compuesto de eliminación alta en monos. El t_{1/2} y MRT después de la administración IV eran de 0,089 horas y 0,097 horas, respectivamente. El Vss de Icb era 0,27 l/kg, lo que sugería una distribución tisular limitada. La formación de IVc a partir de Icb después de la administración IV era rápida. IVc se detectó en el primer punto temporal de muestreo de 5 minutos (no se muestran los datos). La proporción de AUC IV de IVc formado a partir de Icb frente a la del estudio de IVc histórico era de 0,90, lo que sugería una buena conversión de Icb en IVc.
Icb no se detectó (LLQ = 5 nM) en ninguna muestra de plasma después de la administración oral. El Tmax de IVc después de la administración oral de Icb era de 0,92 horas, que es menor que el Tmax histórico de IVc de 2,3 horas, lo que indicaba una absorción más rápida de IVc después de la administración oral del profármaco. La biodisponibilidad oral absoluta de IVc a partir de Icb era del 122%, que es mayor que los datos de IVc históricos del 64% (Tabla 45).
Los perfiles de concentración en plasma terminal frente al tiempo de IVc formado a partir de Icb son similares a los perfiles históricos de IVc (Figura 23).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 45 Parámetros Farmacocinéticos de Icb y IVc después de la administración IV y oral de Icb en el mono (Media \pm DT, n = 3)
161 
\newpage
Sección de Caracterización Adicional 4 Estudios Adicionales con el Profármaco Ie
El profármaco Ie se dosificó por vía oral a ratas usando una metodología similar a la descrita anteriormente para los otros profármacos. Después de la dosificación PO se detectó la molécula parental IVe en el plasma.
\vskip1.000000\baselineskip
Sección de Caracterización Adicional 5 Estudios Adicionales con el Profármaco If
El profármaco If se dosificó por vía oral a ratas usando una metodología similar a la descrita anteriormente para los otros profármacos. Después de la dosificación PO se detectó la molécula parental IVf en el plasma.
La siguiente Tabla 47 muestra los datos obtenidos a partir de estudios de dosificación oral en ratas como se describe en las secciones de caracterización adicional 4 y 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
162 
\newpage
Biología
\bullet"\muM" significa micromolar;
\bullet"ml" significa mililitro;
\bullet"\mul" significa microlitro;
\bullet"mg" significa miligramo;
\bullet"DMSO" significa dimetilsulfóxido
Los materiales y procedimientos experimentales usados para evaluar la actividad anti-VIH de los compuestos parentales que se generan a partir de los profármacos in vivo se describen a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Células
\bullet La línea de células T humanas MT-2 y PM1 (AISD Research and Reference Reagent Program, National Institutes of Health) se mantuvieron y se propagaron en medio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contenía suero fetal bovino al 10% (FBS, Sigma, St. Louis, MO).
\vskip1.000000\baselineskip
Virus
\bulletLas cepas de laboratorio de VIH-1 la cepa del trópico LAI se obtuvieron a través del programa AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institutes of Health. Se amplificó en células MT-2 y tituló usando un ensayo de producción de virus (2). La detección se consiguió a través del uso de un ensayo de transcriptasa inversa (3), adaptado para su uso con un protocolo de detección mediante proximidad de escintilación (1) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento
1. Se prepararon soluciones madre de los compuestos disolviendo en DMSO hasta 30 mM. Para las placas de dilución, los compuestos se diluyeron de forma seriada 3 veces en DMSO, usando placas de propileno de 96 pocillos, de modo que las concentraciones eran 100 veces mayores que la concentración final de ensayo. Para los ensayos antivirales y de citotoxicidad, se añadieron 2 \mul por pocillo (concentración de DMSO final del 1%).
2. Se añadieron los compuestos de las placas de dilución a placas de cultivo tisular de 96 pocillos, que contenían 100 \mul de medio RPMI-1640, que contenía suero fetal bovino al 10% a una concentración de < 20 \muM.
3. Para los ensayos antivirales, las células se infectaron a una multiplicidad de infección de 0,005. Después de 1 hora a 37ºC, las células infectadas se diluyeron a 200.000 células por ml en medio RPMI-1640, que contenía suero fetal bovino al 10%. Se añadieron 100 \mul de esta solución por pocillo, dando un volumen final de 200 \mul.
4. Las placas se incubaron a 37ºC en una incubadora humidificada con CO_{2} y se recogieron después de 5 días.
5. Las infecciones víricas se controlaron midiendo la actividad de transcriptasa inversa en los sobrenadantes de pocillos infectados como se ha descrito anteriormente. La inhibición porcentual de cada compuesto se calculó cuantificando el nivel de lectura en las células infectadas en presencia de cada compuesto como porcentaje del observado para las células infectadas en ausencia del compuesto y restando dicho valor determinado de 100.
6. Una CE_{50} proporciona un procedimiento para comparar la potencia antiviral de los compuestos de esta invención. Loa concentración eficaz para la inhibición del 50% (CE_{50}) se calculó con el software de ajuste de curva Microsoft Excel Xlfit. Para cada compuesto, se generaron curvas para la inhibición del porcentaje calculada en 8 diferentes concentraciones usando un modelo logístico de cuatro parámetros (modelo 205). Los datos de CE_{50} de los compuestos se muestran en la Tabla 48.
Resultados Clave de los Datos Biológicos para CE_{50}s
163 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 48 Actividad Antiviral de Compuestos IV (Moléculas Parentales)
164 
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad anti-VIH de los propios profármacos no es relevante ya que las moléculas parentales, como se muestra en los estudios a continuación, se generan a partir de los profármacos in vivo y son el ingrediente activo y también la especie principal en el plasma. Además, los profármacos pueden convertirse lentamente en compuestos parentales en los ensayos in vitro al menos hasta un grado limitado complicando de este modo la interpretación de los datos antivirales.
\vskip1.000000\baselineskip
Citotoxicidad
1. Se realizaron ensayos de citotoxicidad con las mismas células MT-2, usando metodología bien conocida en la técnica. Este procedimiento se ha descrito en la bibliografía (4). En resumen, se incubaron las células en presencia del fármaco durante 6 días, después de lo cual se midió la viabilidad celular usando un ensayo de reducción de colorante redox-activo. Se añadieron 50 \mul de reactivo XTT (1 mg/ml de 2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazolio-5-carboxanilida, 10 mg/ml metosulfato de fenazina disuelto en solución salina tamponada con fosfato) a cada pocillo y se incubaron durante 3 horas. La formación de color mediante células con respiración activa se cuantificó en un lector de placas a 450 nm y se usó para determinar la CC_{50,} La CC50 para las moléculas parentales IVa, IVb, IVc e IVd era mayor de 10 \muM cuando se medía mediante este procedimiento. Los datos de citotoxicidad son una selección secundaria que demuestra que los compuestos no están destruyendo de forma no específica las células cuando se usaron en el ensayo antiviral y proporciona un apoyo adicional para el argumento de que los compuestos poseen actividad
antiviral.
Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención se proporciona adicionalmente un procedimiento de tratamiento y una composición farmacéutica para tratar infecciones víricas tales como infecciones por VIH y SIDA. El tratamiento implica administrar a un paciente que necesite dicho tratamiento una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéutico y una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención.
La composición farmacéutica puede estar en forma de suspensiones o comprimidos administrables por vía oral; pulverizadores nasales, preparaciones inyectables estériles, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleosas inyectables estériles o supositorios.
Cuando se administran por vía oral en forma de suspensión, estas composiciones se preparan de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica y pueden contener celulosa microcristalina para otorgar volumen, ácido argínico o alginato sódico como agente de suspensión, metilcelulosa como potenciador de la viscosidad y agentes edulcorantes/aromatizantes conocidos en la técnica. Como comprimidos de liberación inmediata, estas composiciones pueden contener celulosa microcristalina, fosfato dicálcico, almidón, estearato de magnesio y lactosa y/o otros excipientes, aglutinantes, prolongadores, disgregantes, diluyentes y lubricantes conocidos en la técnica.
\newpage
Las soluciones o suspensiones inyectables pueden formularse de acuerdo con la técnica conocida, usando diluyentes o disolventes adecuados no tóxicos, parenteralmente aceptables, tales como manitol, 1,3-butanodiol, agua, solución de Ringer o solución de cloruro sódico isotónico o agentes de suspensión de dispersión o humectantes adecuados, tales como aceites fijos estériles, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos y ácidos grasos, incluyendo ácido oleico.
Los compuestos de esta invención pueden administrarse por vía oral a seres humanos en un intervalo de dosificación de 1 a 100 mg/kg de peso corporal en dosis divididas. Un intervalo de dosificación preferida es de 1 a 10 mg/kg de peso corporal por vía oral en dosis divididas. Otros intervalos de dosificación preferidos son de 1 a 20 mg/kg y de 1 a 30 mg/kg de peso corporal por vía oral en dosis divididas. Se entenderá sin embargo, que el nivel de dosis y la frecuencia de dosificación específicos para cualquier paciente particular pueden modificarse y dependerán de diversos factores incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y la duración de acción de este compuesto, la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la dieta, el modo y el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la combinación de fármacos, la gravedad de la afección particular y la terapia a la que se somete el hospedador.

Claims (31)

1. Un compuesto de Fórmula I,
165
en la que:
\quad
X es C o N con la condición de que cuando X es N, R^{1} no exista;
\quad
W es C o N con la condición de que cuando W es N, R^{2} no exista;
\quad
V es C;
\quad
R^{1} es hidrógeno, metoxi o halógeno;
\quad
R^{2} es hidrógeno;
\quad
R^{3} es metoxi o heteroarilo, pudiendo estar cada uno de ellos independiente y opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado entre G; donde el heteroarilo es triazolilo, pirazolilo u oxadiazolilo;
\quad
E es hidrógeno o una mono o bis sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
\quad
Y se selecciona entre el grupo compuesto por
166
\quad
cada uno de R^{10}, R^{11}, R^{12}, R^{13}, R^{14}, R^{15}, R^{16} y R^{17} es independientemente H o metilo, con la condición de que no más de dos de R^{10}-R^{17} sean metilo;
\quad
R^{18} se selecciona entre el grupo compuesto por C(O)-fenilo, C(O)-piridinilo, piridinilo, pirimidinilo, quinolinilo, iso-quinolinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, ftalazinilo, azabenzofurilo y azaindolilo, pudiendo estar cada uno de ellos independiente y opcionalmente sustituido con uno a dos miembros seleccionados entre el grupo compuesto por metilo, -amino, -NHMe, -NMe_{2}, metoxi, hidroximetilo y halógeno;
\quad
D se selecciona entre el grupo compuesto por ciano, S(O)_{2}R^{24}, halógeno, C(O)NR^{21}R^{22}, fenilo y heteroarilo; donde dicho fenilo o heteroarilo está independiente y opcionalmente sustituido con uno a tres halógenos iguales o diferentes o de uno a tres sustituyentes iguales o diferentes seleccionados entre G; donde el heteroarilo se selecciona entre el grupo compuesto por piridinilo y oxadiazolilo;
\quad
A se selecciona entre el grupo compuesto por fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo, donde dichos fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo están independiente y opcionalmente sustituidos con uno a tres halógenos iguales o diferentes o de uno a tres sustituyentes iguales o diferentes seleccionados entre G;
\quad
G se selecciona entre el grupo compuesto por alquilo (C_{1-6}), alquenilo (C_{1-6}), fenilo, hidroxi, metoxi, halógeno, -NR^{23}C (O)-alquilo (C_{1-6}), -NR^{24}R^{25}, -S(O)_{2}NR^{24}R^{25}, COOR^{26} y -CONR^{24}R^{25}; donde dicho alquilo (C_{1-6}) está opcionalmente sustituido con hidroxi, dimetilamino o de uno a tres halógenos iguales o diferentes;
\quad
R^{26} se selecciona entre el grupo compuesto por hidrógeno y alquilo (C_{1-6});
\quad
R^{20}, R^{21} R^{22}, R^{23}, R^{24} y R^{25} se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por hidrógeno, alquilo (C_{1-6}) y -(CH_{2})_{n}NR^{27}R^{28};
\quad
n es 0-6; y
\quad
cada uno de R^{27} y R^{28} es independientemente H o metilo.
2. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que:
\quad
R^{1} es metoxi o fluoro;
\quad
R^{18} se selecciona entre el grupo compuesto por C(O)-fenilo, C(O)-piridinilo, isoquinolinilo, quinazolinilo y ftalazinilo; donde dicho isoquinolinilo, quinazolinilo o ftalazinilo puede estar opcional e independientemente sustituido con uno a dos miembros seleccionados entre el grupo compuesto por metilo, -amino, -NHMe, -NMe_{2}, metoxi, hidroximetilo y halógeno;
\quad
D se selecciona entre el grupo compuesto por ciano, fenilo y heteroarilo; donde dicho heteroarilo es piridinilo u oxadiazolilo; donde dicho fenilo o heteroarilo está independiente y opcionalmente sustituido con uno a tres sustituyentes iguales o diferentes seleccionados entre el grupo compuesto por alquilo C_{1-6}, trifluorometilo, metoxi y halógeno;
\quad
A se selecciona entre el grupo compuesto por fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo u oxazolilo, donde dicho fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo u oxazolilo está independiente y opcionalmente sustituido con uno a tres halógenos iguales o diferentes o de uno a tres sustituyentes iguales o diferentes seleccionados entre el grupo compuesto por metilo, halógeno, metoxi y -NH_{2}; y
\quad
cada uno de R^{10}, R^{11}, R^{12}, R^{13}, R^{14}, R^{15}, R^{16} y R^{17} es independientemente H o metilo, con la condición de que un máximo de uno de R^{10}-R^{17} sea un metilo.
3. Un compuesto de la reivindicación 2, en el que:
cada uno de X y W es N.
4. Un compuesto de la reivindicación 2, en el que:
X es C; y
W es N.
5. Un compuesto de la reivindicación 4, en el que:
R^{18} es -C(O)-Ph; e
Y es
\vskip1.000000\baselineskip
167
6. Un compuesto de la reivindicación 5, en el que:
\quad
R^{3} es metoxi o triazolilo; donde dicho triazolilo está opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado entre G;
\quad
cada uno de R^{10}-R^{17} es H; y
\quad
G es metilo.
7. Un compuesto de la reivindicación 6, en el que:
R^{1} es F y R^{3} es 1,2,3-triazolilo unido en la posición N-1.
\newpage
8. Un compuesto de la reivindicación 6, en el que:
R^{1} es metoxi; y
R^{3} es 3-metil-1,2,4-triazolilo unido en la posición N-1.
9. Un compuesto de la reivindicación 6, en el que:
cada uno de R^{1} y R^{3} es metoxi.
10. Un compuesto de la reivindicación 6, donde la sal es sodio, lisina o trometamina.
11. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad antiviral eficaz de un compuesto de Fórmula 1, de acuerdo con la reivindicación 1, y uno o más vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11, útil para tratar una infección por VIH, que comprende adicionalmente una cantidad antiviral eficaz de un tratamiento para el SIDA seleccionado entre el grupo compuesto por:
(a)
un agente antiviral para el SIDA;
(b)
un agente anti-infeccioso;
(c)
un inmunomodulador; y
(d)
inhibidores de la entrada del VIH.
13. Uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero infectado por el virus del VIH, de un compuesto de Fórmula I, de acuerdo con la reivindicación 1, y uno o más vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
14. El uso de la reivindicación 13, donde el medicamento para uso junto con una cantidad antiviral eficaz de un agente para el tratamiento del SIDA se selecciona entre el grupo compuesto por un agente antiviral para el SIDA; un agente anti-infeccioso; un inmunomodulador; y un inhibidor de la entrada del VIH.
15. Un compuesto de Fórmula II,
168
en la que:
\quad
X es C o N con la condición de que cuando X es N, R^{1} no exista;
\quad
W es C o N con la condición de que cuando W es N, R^{2} no exista;
\quad
V es C;
\quad
R^{1} es hidrógeno, metoxi o halógeno;
\quad
R^{2} es hidrógeno;
\quad
R^{3} es metoxi o heteroarilo, pudiendo estar cada uno de ellos independiente y opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado entre G; donde el heteroarilo es triazolilo, pirazolilo u oxadiazolilo;
\quad
L y M se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, fenilo, bencilo, trialquilsililo, 2,2,2-tricloroetoxi y 2-trimetilsililetoxi, con la condición de que no más de uno de L y M pueda ser hidrógeno;
\quad
Y se selecciona entre el grupo compuesto por
169
\quad
cada uno de R^{10}, R^{11}, R^{12}, R^{13}, R^{14}, R^{15}, R^{16} y R^{17} es independientemente H o metilo, con la condición de que no más de dos de R^{10}-R^{17} sean metilo;
\quad
R^{18} se selecciona entre el grupo compuesto por C(O)-fenilo, C(O)-piridinilo, piridinilo, pirimidinilo, quinolinilo, iso-quinolinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, ftalazinilo, azabenzofurilo y azaindolilo, pudiendo estar cada uno de ellos independiente y opcionalmente sustituido con uno a dos miembros seleccionados entre el grupo compuesto por metilo, -amino, -NHMe, -NMe_{2}, metoxi, hidroximetilo y halógeno;
\quad
D se selecciona entre el grupo compuesto por ciano, S(O)_{2}R^{24}, halógeno, C(O)NR^{21}R^{22}, fenilo y heteroarilo; donde dicho fenilo o heteroarilo está independiente y opcionalmente sustituido con uno a tres halógenos iguales o diferentes o de uno a tres sustituyentes iguales o diferentes seleccionados entre G; donde el heteroarilo se selecciona entre el grupo compuesto por piridinilo y oxadiazolilo;
\quad
A se selecciona entre el grupo compuesto por fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo, donde dichos fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo están independiente y opcionalmente sustituidos con uno a tres halógenos iguales o diferentes o de uno a tres sustituyentes iguales o diferentes seleccionados entre G;
\quad
G se selecciona entre el grupo compuesto por alquilo (C_{1-6}), alquenilo (C_{1-6}), fenilo, hidroxi, metoxi, halógeno, -NR^{23}C (O)-alquilo (C_{1-6}), -NR^{24}R^{25}, -S(O)_{2}NR^{24}R^{25}, COOR^{26} y -CONR^{24}R^{25}; donde dicho alquilo (C_{1-6}) está opcionalmente sustituido con hidroxi, dimetilamino o de uno a tres halógenos iguales o diferentes;
\quad
R^{26} se selecciona entre el grupo compuesto por hidrógeno y alquilo (C_{1-6});
\quad
R^{20}, R^{21}, R^{22}, R^{23}, R^{24} y R^{25} se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por hidrógeno, alquilo (C_{1-6}) y -(CH_{2})_{n}NR^{27}R^{28};
\quad
cada uno de R^{27} y R^{28} es independientemente H o metilo; y
\quad
n es 0-6.
16. Un compuesto de la reivindicación 7, donde la sal es lisina.
17. Un compuesto de la reivindicación 8, donde la sal es trometamina.
18. Un compuesto de la reivindicación 9, donde la sal es lisina.
19. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que:
Y es
170
\quad
y
\quad
cada uno de R^{10}, R^{11}, R^{12}, R^{13}, R^{14}, R^{15}, R^{16} y R^{17} es independientemente H o metilo, con la condición de que no más de dos de R^{10}-R^{17} sean metilo;
20. Un compuesto de la reivindicación 19, en el que:
\quad
R^{1} es metoxi o fluoro;
\quad
D se selecciona entre el grupo compuesto por ciano, fenilo y piridinilo, donde dicho fenilo o piridinilo está independiente y opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado entre el grupo compuesto por metilo y halógeno; y
\quad
A se selecciona entre el grupo compuesto por fenilo, piridinilo, donde dicho fenilo o piridinilo está independiente y opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado entre el grupo compuesto por metilo y halógeno.
21. Un compuesto de la reivindicación 20, en el que:
\quad
D es ciano;
\quad
A se selecciona entre el grupo compuesto por fenilo o piridinilo;
\quad
X es C;
\quad
W es N;
\quad
G es metilo;
\quad
R^{3} es metoxi o triazolilo, donde dicho triazolilo puede estar independiente y opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado entre G; y
\quad
cada uno de, R^{10}, R^{11}, R^{12}, R^{13}, R^{14}, R^{15}, R^{16} y R^{17} es H.
22. Un compuesto de la reivindicación 20, en el que:
\quad
R^{1} es metoxi; y
\quad
R^{3} es triazolilo, donde dicho triazolilo puede estar independiente y opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado entre G.
23. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que:
\quad
Y es
171
\quad
y
\quad
R^{18} se selecciona entre el grupo compuesto por quinolinilo, isoquinolinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo o ftalazinilo, pudiendo estar cada uno de ellos independiente y opcionalmente sustituido con uno a dos miembros seleccionados entre el grupo compuesto por metilo, -amino, -NHMe, -NMe_{2}, metoxi, hidroximetilo y halógeno.
24. Un compuesto de la reivindicación 23, en el que:
\quad
R^{1} es metoxi o fluoro;
\quad
R^{18} se selecciona entre el grupo compuesto por isoquinolinilo, quinazolinilo y ftalazinilo; donde dicho isoquinolinilo, quinazolinilo o ftalazinilo puede estar opcional e independientemente sustituido con un grupo metilo o halógeno; y
\quad
cada uno de R^{10}, R^{11}, R^{12}, R^{13}, R^{14}, R^{15}, R^{16} y R^{17} es independientemente H.
25. Un compuesto de la reivindicación 24, en el que:
\quad
X es C;
\quad
W es N;
\quad
G es metilo; y
\quad
R^{3} es metoxi o triazolilo, donde dicho triazolilo puede estar independiente y opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado entre G.
26. Un compuesto de la reivindicación 25, en el que:
\quad
R^{1} es metoxi;
\quad
R^{3} es triazolilo, donde dicho triazolilo puede estar independiente y opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado entre G; y
\quad
R^{18} es quinazolinilo.
\vskip1.000000\baselineskip
27. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que:
R^{1} es metoxi o fluoro;
R^{18} es C(O)-fenilo;
cada uno de R^{10}, R^{11}, R^{12}, R^{13}, R^{14}, R^{15}, R^{16} y R^{17} es H; y
G es metilo.
\vskip1.000000\baselineskip
28. Un compuesto de la reivindicación 27, en el que:
X es C; y
W es N.
\vskip1.000000\baselineskip
29. Un procedimiento para preparar un compuesto Iac que tiene la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
172 
\vskip1.000000\baselineskip
que comprende:
(a) alquilar el Compuesto IVa que tiene la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
173 
\newpage
con aproximadamente 1,2 equivalentes molares de clorometilfosfato de di-terc-butilo por mol de IVa, que tiene la estructura Z
\vskip1.000000\baselineskip
174 
\vskip1.000000\baselineskip
en presencia de aproximadamente 2 equivalentes molares de K_{2}CO_{3} como base, por mol del Compuesto IVa, y aproximadamente 5-10 ml de N-metilpirrolidinona como disolvente por gramo de IVa, a una temperatura de reacción de aproximadamente 30ºC, para formar el Compuesto R que tiene la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
175 
\vskip1.000000\baselineskip
(b) desproteger a temperatura ambiente el Compuesto R de grupos terc-butilo por adición a la mezcla de reacción resultante de la etapa (a) de aproximadamente 10 ml de disolvente de diclorometano por gramo de IVa y aproximadamente 15 equivalentes molares de ácido trifluoroacético por mol de IVa; y
(c) recuperar el Compuesto Iac.
30. Un procedimiento para preparar el Compuesto Ic que tiene la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
176 
\vskip1.000000\baselineskip
que comprende:
\newpage
(a) alquilar el Compuesto IVc que tiene la estructura
177
con aproximadamente 2,5 equivalentes molares de clorometilfosfato de di-terc-butilo por mol de IVc que tiene la estructura Z
178
en presencia de aproximadamente 2,5 equivalentes molares de Cs_{2}CO_{3} como base por mol de IVc, aproximadamente 2 equivalentes molares de KI por mol de IVc y aproximadamente 5-10 ml de N-metilpirrolidinona por gramo de IVc, a una temperatura de reacción de aproximadamente 25-30ºC, para formar un Compuesto IIc que tiene la estructura
179
(b) desproteger a una temperatura de aproximadamente 40ºC el Compuesto IIc de los dos grupos terc-butilo en un exceso de acetona y agua; y
(c) recuperar el Compuesto Ic.
31. Un procedimiento para preparar el Compuesto Ibc que tiene la estructura
180
que comprende:
(a) alquilar el Compuesto IVb que tiene la estructura
181
con aproximadamente 2 equivalentes molares de clorometilfosfato de di-terc-butilo por mol de IVb que tiene la estructura Z
182
en presencia de aproximadamente 2 equivalentes molares de Cs_{2}CO_{3} como base por mol de IVb, aproximadamente 2 equivalentes molares de KI por mol de IVb y aproximadamente 2,5 ml de N-metilpirrolidinona por gramo de IVb, a una temperatura de reacción de aproximadamente 30ºC, para formar un Compuesto IIb que tiene la estructura
183
(b) desproteger a una temperatura de aproximadamente 40ºC el Compuesto IIb de los dos grupos terc-butilo en un exceso de acetona y agua; y
(c) recuperar el Compuesto Ibc.
ES05724510T 2004-03-15 2005-03-03 Profarmacos de piperazina y agentes antivirales de piperidina sustituida. Active ES2299022T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US55332004P 2004-03-15 2004-03-15
US553320P 2004-03-15
US63523104P 2004-12-10 2004-12-10
US635231P 2004-12-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2299022T3 true ES2299022T3 (es) 2008-05-16

Family

ID=34963934

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES05724510T Active ES2299022T3 (es) 2004-03-15 2005-03-03 Profarmacos de piperazina y agentes antivirales de piperidina sustituida.

Country Status (27)

Country Link
US (12) US7745625B2 (es)
EP (1) EP1725569B1 (es)
JP (1) JP4734318B2 (es)
KR (1) KR101153594B1 (es)
CN (1) CN101941990B (es)
AR (1) AR048039A1 (es)
AT (1) ATE384728T1 (es)
AU (1) AU2005223736C1 (es)
BR (1) BRPI0508876B8 (es)
CA (1) CA2560253C (es)
CY (1) CY1107419T1 (es)
DE (1) DE602005004517T2 (es)
DK (1) DK1725569T3 (es)
ES (1) ES2299022T3 (es)
GE (1) GEP20094736B (es)
HK (2) HK1096687A1 (es)
HR (1) HRP20080064T5 (es)
IL (1) IL211961A (es)
MY (1) MY139243A (es)
NO (1) NO336742B1 (es)
NZ (2) NZ585294A (es)
PE (1) PE20051151A1 (es)
PL (1) PL1725569T3 (es)
PT (1) PT1725569E (es)
RS (1) RS50567B (es)
TW (1) TWI344843B (es)
WO (1) WO2005090367A1 (es)

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040110785A1 (en) * 2001-02-02 2004-06-10 Tao Wang Composition and antiviral activity of substituted azaindoleoxoacetic piperazine derivatives
TWI329105B (en) 2002-02-01 2010-08-21 Rigel Pharmaceuticals Inc 2,4-pyrimidinediamine compounds and their uses
SG176311A1 (en) * 2002-07-29 2011-12-29 Rigel Pharmaceuticals Methods of treating or preventing autoimmune diseases with 2,4-pyrimidinediamine compounds
US20050075364A1 (en) * 2003-07-01 2005-04-07 Kap-Sun Yeung Indole, azaindole and related heterocyclic N-substituted piperazine derivatives
CN102358738A (zh) * 2003-07-30 2012-02-22 里格尔药品股份有限公司 2,4-嘧啶二胺化合物及其预防和治疗自体免疫疾病的用途
US7745625B2 (en) * 2004-03-15 2010-06-29 Bristol-Myers Squibb Company Prodrugs of piperazine and substituted piperidine antiviral agents
US7130185B2 (en) * 2004-06-02 2006-10-31 Research In Motion Limited Handheld computing device having drop-resistant LCD display
US20060100209A1 (en) * 2004-11-09 2006-05-11 Chong-Hui Gu Formulations of 1-(4-benzoyl-piperazin-1-yl)-2-[4-methoxy-7-(3-methyl-[1,2,4]triazol-1-yl)-1H-pyrrolo[2,3-c]pyridin-3-yl]-ethane-1,2-dione
US20060100432A1 (en) * 2004-11-09 2006-05-11 Matiskella John D Crystalline materials of 1-(4-benzoyl-piperazin-1-yl)-2-[4-methoxy-7-(3-methyl-[1,2,4]triazol-1-yl)-1H-pyrrolo[2,3-c]pyridin-3-yl]-ethane-1,2-dione
CA2591948C (en) 2005-01-19 2013-11-12 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Prodrugs of 2,4-pyrimidinediamine compounds and their uses
US7723338B2 (en) * 2005-01-31 2010-05-25 Bristol-Myers Squibb Company Crystalline forms of 1-benzoyl-4-[2-[4,7-dimethoxy-1-[(phosphonooxy)methyl]-1H-pyrrolo[2,3-C]pyridin-3-yl]-1,2-dioxoethyl]-piperazine
US7601715B2 (en) * 2005-06-22 2009-10-13 Bristol-Myers Squibb Company Process for preparing triazole substituted azaindoleoxoacetic piperazine derivatives and novel salt forms produced therein
US7396830B2 (en) 2005-10-04 2008-07-08 Bristol-Myers Squibb Company Piperazine amidines as antiviral agents
US7851476B2 (en) * 2005-12-14 2010-12-14 Bristol-Myers Squibb Company Crystalline forms of 1-benzoyl-4-[2-[4-methoxy-7-(3-methyl-1H-1,2,4-triazol-1-YL)-1-[(phosphonooxy)methyl]-1H-pyrrolo[2,3-C]pyridin-3-YL]-1,2-dioxoethyl]-piperazine
US7807671B2 (en) 2006-04-25 2010-10-05 Bristol-Myers Squibb Company Diketo-piperazine and piperidine derivatives as antiviral agents
US7501419B2 (en) * 2006-04-25 2009-03-10 Bristol-Myers Squibb Company 4-Squarylpiperazine derivatives as antiviral agents
US7504399B2 (en) * 2006-06-08 2009-03-17 Bristol-Meyers Squibb Company Piperazine enamines as antiviral agents
US7572810B2 (en) * 2006-06-08 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Alkene piperidine derivatives as antiviral agents
EP2054422B1 (en) 2006-07-20 2017-06-14 Debiopharm International SA Acrylamide derivatives as fab i inhibitors
EP2303876B1 (en) 2008-06-25 2014-03-19 Bristol-Myers Squibb Company Diketo azolopiperidines and azolopiperazines as anti-hiv agents
ES2389478T3 (es) * 2008-06-25 2012-10-26 Bristol-Myers Squibb Company Derivados de dicetopiperidina como inhibidores de la fijación del VIH
WO2010028108A2 (en) * 2008-09-04 2010-03-11 Bristol-Myers Squibb Company Stable pharmaceutical composition for optimized delivery of an hiv attachment inhibitor
CN102186804A (zh) * 2008-10-20 2011-09-14 克塞诺波特公司 合成左旋多巴酯前药的方法
US8399513B2 (en) 2008-10-20 2013-03-19 Xenoport, Inc. Levodopa prodrug mesylate hydrate
CA2766033C (en) * 2009-06-25 2016-09-20 Alkermes, Inc. Prodrugs of nh-acidic compounds
RU2537137C2 (ru) * 2009-11-09 2014-12-27 Ксенопорт, Инк. Фармацевтические композиции и пероральные дозированные формы пролекарства леводопы и способы применения
ES2612452T3 (es) 2010-06-04 2017-05-17 VIIV Healthcare UK (No.5) Limited Derivados de ácido betulínico C-3 modificados como inhibidores de la maduración del VIH
BR112012030810A2 (pt) 2010-06-04 2019-09-24 Bristol-Myers Squibb Company "c-28 amidas de derivados de ácido c-3 betulínico modificados como inibidores de maturação de hiv"
WO2012019003A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Bristol-Myers Squibb Company Substituted indole and azaindole oxoacetyl piperazinamide derivatives
ES2585396T3 (es) 2010-12-02 2016-10-05 VIIV Healthcare UK (No.5) Limited Alquilamidas como inhibidores de la unión del VIH
PL2670764T3 (pl) 2011-01-31 2016-02-29 Bristol Myers Squibb Co C-28 aminy zmodyfikowanych C-3 pochodnych kwasu betulinowego jako inhibitory dojrzewania HIV
CA2826113C (en) 2011-01-31 2018-09-04 Bristol-Myers Squibb Company C-17 and c-3 modified triterpenoids with hiv maturation inhibitory activity
EA021726B1 (ru) * 2011-01-31 2015-08-31 Бристол-Маерс Сквибб Компани Способы получения соединений, являющихся пролекарствами ингибиторов присоединения вируса вич, и их интермедиатов
ES2636312T3 (es) 2011-04-12 2017-10-05 VIIV Healthcare UK (No.5) Limited Derivados de tioamida, amidoxima y amidrazona como inhibidores de la fijación del VIH
EP2751118B1 (en) 2011-08-29 2016-10-12 Bristol-Myers Squibb Company Spiro bicyclic diamine derivatives as hiv attachment inhibitors
ES2616268T3 (es) 2011-08-29 2017-06-12 VIIV Healthcare UK (No.5) Limited Derivados condensados de diamina bicíclica como inhibidores de la unión de VIH
WO2013043778A1 (en) 2011-09-21 2013-03-28 Bristol-Myers Squibb Company Novel betulinic acid derivatives with antiviral activity
US20140356863A1 (en) 2011-11-21 2014-12-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the susceptibility of a virus to an attachment inhibitor
US8426450B1 (en) * 2011-11-29 2013-04-23 Helsinn Healthcare Sa Substituted 4-phenyl pyridines having anti-emetic effect
US9248139B2 (en) 2011-12-21 2016-02-02 Bristol-Myers Squibb Company Co-processing method and formulations for HIV attachment inhibitor prodrug compound and excipients
PT2812332T (pt) * 2012-02-08 2017-11-15 Viiv Healthcare Uk (No 4) Ltd Métodos para a preparação do composto profármaco piperazina inibidor da conjugação ao vih
US8906889B2 (en) 2012-02-15 2014-12-09 Bristol-Myers Squibb Company C-3 cycloalkenyl triterpenoids with HIV maturation inhibitory activity
US9193725B2 (en) 2012-03-14 2015-11-24 Bristol-Meyers Squibb Company Cyclic hydrazine derivatives as HIV attachment inhibitors
US8889854B2 (en) 2012-05-07 2014-11-18 Bristol-Myers Squibb Company C-17 bicyclic amines of triterpenoids with HIV maturation inhibitory activity
JP6085026B2 (ja) 2012-06-19 2017-02-22 デビオファーム インターナショナル エスエーＤｅｂｉｏｐｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓａ （ｅ）−ｎ−メチル−ｎ−（（３−メチルベンゾフラン−２−イル）メチル）−３−（７−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−３−イル）アクリルアミドのプロドラッグ誘導体
WO2014025852A1 (en) 2012-08-09 2014-02-13 Bristol-Myers Squibb Company Tricyclic alkene derivatives as hiv attachment inhibitors
US9505752B2 (en) 2012-08-09 2016-11-29 Viiv Healthcare Uk (No. 5) Limited Piperidine amide derivatives as HIV attachment inhibitors
US20140221361A1 (en) 2013-02-06 2014-08-07 Bristol-Myers Squibb Company C-19 modified triterpenoids with hiv maturation inhibitory activity
BR112015019590A2 (pt) 2013-02-25 2017-07-18 Bristol Myers Squibb Co derivados de ácido betulínico modificado com c-3 alquila e alquenila úteis no tratamento de hiv
EP2978762A1 (en) * 2013-03-27 2016-02-03 Bristol-Myers Squibb Company Piperazine and homopiperazine derivatives as hiv attachment inhibitors
PT2978763T (pt) * 2013-03-27 2018-04-16 Viiv Healthcare Uk No 5 Ltd Derivados de 2-cetoamida como inibidores da ligação do vih
MA39374A1 (fr) 2014-04-11 2018-06-29 Viiv Healthcare Uk No 4 Ltd Triterpénoïdes présentant une activité d'inhibition de la maturation du vih, substitués en 3ème position par un cycle non aromatique portant un substituant halogénoalkyle
WO2015195776A1 (en) 2014-06-19 2015-12-23 Bristol-Myers Squibb Company Betulinic acid derivatives with hiv maturation inhibitory activity
BR112017009850A2 (pt) 2014-11-14 2018-01-16 Viiv Healthcare Uk No 5 Ltd composto, composição, e, uso de uma quantidade melhoradora de hiv de um composto
CN107250152A (zh) 2014-11-14 2017-10-13 Viiv保健英国第五有限公司 C17‑芳基取代的桦木酸类似物
PT3233853T (pt) 2014-12-18 2019-05-27 Viiv Healthcare Uk No 4 Ltd Processo para preparar compostos de azaindole halogenados utilizando boroxina
CN107428748A (zh) 2014-12-18 2017-12-01 Viiv保健英国第四有限公司 使用pybrop制备卤化氮杂吲哚化合物的方法
US10221208B2 (en) 2015-04-14 2019-03-05 ViiV Healthcare UK (No.4) Limited Methods of producing an HIV maturation inhibitor
HUE055321T2 (hu) 2015-10-01 2021-11-29 Olema Pharmaceuticals Inc Tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol anti-ösztrogén hatóanyagok
WO2017102893A1 (en) * 2015-12-14 2017-06-22 Ludwig-Maximilians-Universität München Water-soluble derivatives of 3,5-diphenyl-diazole compounds
EP3411033A1 (en) 2016-02-04 2018-12-12 ViiV Healthcare UK (No.5) Limited Fostemsavir for use in heavily treatment-experienced hiv-1 infected individuals
AR107512A1 (es) 2016-02-04 2018-05-09 VIIV HEALTHCARE UK Nº 5 LTD Triterpenoides modificados en c-3 y c-17 como inhibidores del vih-1
US10751351B2 (en) 2016-02-26 2020-08-25 Debiopharm International S.A. Medicament for treatment of diabetic foot infections
KR102395451B1 (ko) 2017-11-21 2022-05-09 화이자 인코포레이티드 4-(4-(1-이소프로필-7-옥소-1,4,6,7-테트라히드로스피로[인다졸-5,4'-피페리딘]-1'-카르보닐)-6-메톡시피리딘-2-일)벤조산의 결정질 2-아미노-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올 염
JP7429236B2 (ja) 2019-01-17 2024-02-07 ヴィーブ ヘルスケア ユーケー（ナンバー４）リミテッド ホステムサビルの調製方法
AU2022409827A1 (en) 2021-12-17 2024-06-20 Viiv Healthcare Company Combination therapies for hiv infections and uses thereof
US20240166728A1 (en) 2022-11-02 2024-05-23 VIIV Healthcare UK (No.5) Limited Antigen binding proteins

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5619238A (en) 1992-07-24 1997-04-08 Canon Kabushiki Kaisha Method of making replaceable ink cartridge
US6469006B1 (en) 1999-06-15 2002-10-22 Bristol-Myers Squibb Company Antiviral indoleoxoacetyl piperazine derivatives
US20020061892A1 (en) * 2000-02-22 2002-05-23 Tao Wang Antiviral azaindole derivatives
US6476034B2 (en) 2000-02-22 2002-11-05 Bristol-Myers Squibb Company Antiviral azaindole derivatives
CA2413044A1 (en) * 2000-07-10 2002-01-17 Bristol-Myers Squibb Company Composition and antiviral activity of substituted indoleoxoacetic piperazine derivatives
US20030207910A1 (en) 2001-02-02 2003-11-06 Tao Wang Composition and antiviral activity of substituted azaindoleoxoacetic piperazine derivatives
JP4328527B2 (ja) 2001-02-02 2009-09-09 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー 置換アザインドールオキソアセチックピペラジン誘導体の組成物と抗ウイルス活性
US20040110785A1 (en) 2001-02-02 2004-06-10 Tao Wang Composition and antiviral activity of substituted azaindoleoxoacetic piperazine derivatives
WO2003082881A2 (en) 2002-03-28 2003-10-09 Procyon Biopharma Inc. Pyridoxal-5-phosphate derivatives as hiv integrase inhibitors
US7745625B2 (en) * 2004-03-15 2010-06-29 Bristol-Myers Squibb Company Prodrugs of piperazine and substituted piperidine antiviral agents
US7776863B2 (en) 2004-03-24 2010-08-17 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating HIV infection
US7130185B2 (en) * 2004-06-02 2006-10-31 Research In Motion Limited Handheld computing device having drop-resistant LCD display
US7723338B2 (en) * 2005-01-31 2010-05-25 Bristol-Myers Squibb Company Crystalline forms of 1-benzoyl-4-[2-[4,7-dimethoxy-1-[(phosphonooxy)methyl]-1H-pyrrolo[2,3-C]pyridin-3-yl]-1,2-dioxoethyl]-piperazine
US7851476B2 (en) * 2005-12-14 2010-12-14 Bristol-Myers Squibb Company Crystalline forms of 1-benzoyl-4-[2-[4-methoxy-7-(3-methyl-1H-1,2,4-triazol-1-YL)-1-[(phosphonooxy)methyl]-1H-pyrrolo[2,3-C]pyridin-3-YL]-1,2-dioxoethyl]-piperazine
EA021726B1 (ru) * 2011-01-31 2015-08-31 Бристол-Маерс Сквибб Компани Способы получения соединений, являющихся пролекарствами ингибиторов присоединения вируса вич, и их интермедиатов
PT2812332T (pt) * 2012-02-08 2017-11-15 Viiv Healthcare Uk (No 4) Ltd Métodos para a preparação do composto profármaco piperazina inibidor da conjugação ao vih

Also Published As

Publication number Publication date
US20120238755A1 (en) 2012-09-20
US8461333B2 (en) 2013-06-11
NZ585294A (en) 2011-09-30
RS50567B (sr) 2010-05-07
RU2006136390A (ru) 2008-04-27
NO336742B1 (no) 2015-10-26
NO20064062L (no) 2006-12-08
AU2005223736A1 (en) 2005-09-29
CN101941990B (zh) 2012-04-25
AU2005223736C1 (en) 2011-10-06
US8168615B2 (en) 2012-05-01
AR048039A1 (es) 2006-03-22
US20100210599A1 (en) 2010-08-19
US20210023098A1 (en) 2021-01-28
CY1107419T1 (el) 2012-12-19
IL211961A (en) 2013-08-29
US20150232414A1 (en) 2015-08-20
EP1725569A1 (en) 2006-11-29
RU2374256C2 (ru) 2009-11-27
US20150315218A1 (en) 2015-11-05
BRPI0508876A (pt) 2007-09-04
DK1725569T3 (da) 2008-06-02
KR20060129533A (ko) 2006-12-15
HRP20080064T5 (en) 2008-10-31
HK1096687A1 (en) 2007-06-08
MY139243A (en) 2009-09-30
US20200046743A1 (en) 2020-02-13
CA2560253A1 (en) 2005-09-29
AU2005223736B2 (en) 2011-05-26
TW200600096A (en) 2006-01-01
ATE384728T1 (de) 2008-02-15
TWI344843B (en) 2011-07-11
US11369624B2 (en) 2022-06-28
BRPI0508876B1 (pt) 2020-05-26
JP2007529519A (ja) 2007-10-25
EP1725569B1 (en) 2008-01-23
US20150025240A1 (en) 2015-01-22
PE20051151A1 (es) 2006-01-20
JP4734318B2 (ja) 2011-07-27
CN101941990A (zh) 2011-01-12
US20190111066A1 (en) 2019-04-18
BRPI0508876B8 (pt) 2021-05-25
US20180000849A1 (en) 2018-01-04
CA2560253C (en) 2013-01-15
HRP20080064T3 (en) 2008-03-31
US7745625B2 (en) 2010-06-29
HK1148533A1 (en) 2011-09-09
GEP20094736B (en) 2009-07-27
DE602005004517D1 (de) 2008-03-13
KR101153594B1 (ko) 2012-07-05
US8871771B2 (en) 2014-10-28
NZ549867A (en) 2010-07-30
DE602005004517T2 (de) 2009-01-22
PT1725569E (pt) 2008-03-28
US20130253196A1 (en) 2013-09-26
WO2005090367A1 (en) 2005-09-29
US20050209246A1 (en) 2005-09-22
PL1725569T3 (pl) 2008-09-30
US20160361328A1 (en) 2016-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2299022T3 (es) Profarmacos de piperazina y agentes antivirales de piperidina sustituida.
ES2641893T3 (es) Composición y actividad antivírica de derivados de piperazina con sustitución de azaindoloxoacético
ES2347253T3 (es) Agentes antivirales de diazaindol-dicarbonil-piperazinilo.
CN1953985B (zh) 哌嗪和取代的哌啶抗病毒药物的前药
MXPA06010412A (es) Profarmacos de piperazina y agentes antivirales de piperidina sustituidos
UEDA et al. Patent 2560253 Summary
IL177945A (en) Prodrugs of piperazine and substituted piperidine antiviral agents