KR101153594B1 - 피페라진 및 치환된 피페리딘 항바이러스제의 프로드럭 - Google Patents

피페라진 및 치환된 피페리딘 항바이러스제의 프로드럭 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화학식 I의 프로드럭 화합물, 그의 약제학적 조성물, 및 HIV 감염을 치료하는데 있어서의 그의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 프로드럭 화합물 I을 제조하는데 유용한 중간체 화합물 II를 제공한다.
Figure 112006074171808-pct00133
프로드럭, 항바이러스 활성, HIV 감염

Description

피페라진 및 치환된 피페리딘 항바이러스제의 프로드럭{PRODRUGS OF PIPERAZINE AND SUBSTITUTED PIPERIDINE ANTIVIRAL AGENTS}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2004년 12월 10일에 출원된 미국 가특허출원 제 60/635,231 호 및 2004년 3월 15일에 출원된 제 60/553,320 호의 권리를 청구한다.
본 발명은 약물 및 생물-영향성을 갖는 화합물, 그의 약제학적 조성물 및 사용방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 항바이러스 활성을 갖는 신규한 프로드럭 유도체에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 HIV 및 AIDS의 치료에 유용한 화합물에 관한 것이다.
HIV-1 (인간 면역결핍 바이러스-1) 감염은 2002년 말에 세계적으로 4200만명의 사람이 감염된 것으로 추정되는 주된 의학적 문제로 남아 있다. HIV 및 AIDS (후천성 면역결핍 증후군)의 경우의 수는 빠르게 증가하였다. 2002년에, 약 500만명의 새로운 감염자가 보고되었으며, 310만명의 사람이 AIDS로 인하여 사망하였다. HIV의 치료를 위해서 현재 이용가능한 약제에는 10 개의 뉴클레오사이드 역전사효소 (RT) 억제제 또는 승인된 단일 필 (single pill) 배합물 (지도부딘 (zidovudine) 또는 AZT (또는 레트로비르 (Retrovir™)), 디다노신 (또는 비덱스 (Videx™)), 스타부딘 (또는 제리트 (Zerit™)), 라미부딘 (또는 3TC 또는 에피비르 (Epivir™)), 잘시타빈 (또는 DDC 또는 히비드 (Hivid™)), 아바카비르 석시네이트 (또는 지아겐 (Ziagen™)), 테노포비르 디소프록실 푸마레이트 염 (또는 비리드 (Viread™)), 콤비비르 (Combivir™)(3TC와 AZT를 함유), 트리지비르 (Trizivir™)(아바카비르, 라미부딘 및 지도부딘을 함유), 및 엠트리바 (Emtriva™)(엠트리시타빈); 3 개의 비-뉴클레오사이드 역전사효소 억제제인 네비라핀 (또는 비라뮨 (Viramune™)), 델라비르딘 (또는 레스크립토르 (Rescriptor™)) 및 에파비렌즈 (또는 수스티바 (Sustiva™)), 9 개의 펩티도미메틱 프로테아제 억제제 또는 승인된 제제인 사퀴나비르 인디나비르, 리토나비르, 넬피나비르, 암프레나비르, 로피나비르, 칼레트라 (Kaletra™)(로피나비르 및 리토나비르), 아타자나비르 (레야타즈 (Reyataz™)), 포삼프레나비르 (Fosamprenavir™), 및 바이러스성 gp41 T-20을 표적화한 한가지 융합억제제 (퓨제온 (FUZEON™))가 포함된다. 이들 각각의 약물은 단독으로 사용되는 경우에는 단지 일시적으로 바이러스 복제를 억제한다. 그러나, 배합하여 사용하는 경우에, 이들 약물은 바이러스혈증 및 질병 진행에 대하여 충분한 효과를 갖는다. 실제로, 배합요법의 광범한 적용의 결과로 AIDS 환자 중에서의 사망율에서 유의적인 감소가 최근에 보고되었다. 그러나, 이들 인상적인 결과에도 불구하고 환자의 30 내지 50%는 궁극적으로 배합약물요법에 실패하였다. 특정한 세포 타입에서의 불충분한 약물 효력, 비-순응성 (non-compliance), 제한된 조직 침투 및 약물-특이성 제한 (예를 들어, 대부분의 뉴클레오사이드 동족체는 정지세포에서 포스포릴화될 수 없다)이 민감성 바이러스의 불완전한 억제의 원인이 될 수 있다. 또한, 돌연변이의 빈번한 통합과 조합된 HIV-1의 높은 복제율과 빠른 턴오버 (turnover)는 최적-이하의 약물 농도가 존재하는 경우에 약물-저항성 변이주의 출현 및 치료 실패를 유도한다 (Larder and Kemp; Gulick; Kuritzkes; Morris-Jones et al; Schinazi et al; Vacca and Condra; Flexner; Berkhout and Ren et al; (Ref. 6-14)). 따라서, 추가의 치료옵션을 제공하기 위하여는 독특한 저항성 패턴, 및 바람직한 약력학 및 안전성 프로필을 나타내는 신규의 항-HIV제가 필요하다.
현재 판매되고 있는 HIV-1 약물은 뉴클레오사이드 역전사효소 억제제 또는 펩티도미메틱 프로테아제 억제제가 주된 것이다. 비-뉴클레오사이드 역전사효소 억제제 (NNRTIs)는 최근에 HIV 감염의 치료에서의 중요한 역할이 증가하고 있다 (Pedersen & Pedersen, Ref. 15). 적어도 30 가지의 상이한 부류의 NNRTI가 문헌에 기술되어 있으며 (De Clercq, Ref. 16), 몇가지의 NNRTIs는 임상실험에서 평가되었다. 디피리도디아제피논 (네비라핀), 벤즈옥사지논 (에파비렌즈) 및 비스(헤테로아릴) 피페라진 유도체 (델라비르딘)이 임상적 용도로 승인되었다. 그러나, NNRTIs의 개발 및 적용에 대한 주된 단점은 조직세포 배양물 및 치료된 개체, 특히 단일요법으로 치료한 개체 둘 다에서 약물 저항성 균주가 빠르게 출현하는 경향이다. 따라서, 저항성의 발생 경향이 적은 NNRTIs를 확인하는데 상당한 관심이 있다 (Pedersen & Pedersen, Ref. 15). 비-뉴클레오사이드 역전사효소 억제제에 대한 최근의 개관 ("Perspectives on novel therapeutic compounds and strategies for the treatment of HIV infection")이 제시되었다 (Buckheit, reference 19). NRTI 및 NNRTIs 둘 다에 관한 검토도 이루어졌다 (De Clercq, reference 100). HIV 약물의 현재 상태에 대한 개관이 발표되었다 (De Clercq, reference 101).
인돌-3-설폰, 피페라지노 인돌, 피라지노 인돌 및 5H-인돌[3,2-b][1,5]벤조티아제핀 유도체를 포함하는 몇가지의 인돌 유도체가 HIV-1 역전사효소 억제제로서 보고되었다 (Greenlee et al, Ref. 1; Williams et al, Ref. 2; Romero et al, Ref. 3; Font et al, Ref. 17; Romero et al, Ref. 18; Young et al, Ref. 19; Genin et al, Ref. 20; Silvestri et al, Ref. 21). 인돌 2-카복스아미드도 또한 세포 유착 및 HIV 감염의 억제제로 기술되었다 (Boschelli et al, US 5,424,329, Ref. 4). 3-치환된 인돌 천연생성물 (세미코클리오디놀 A 및 B, 디데메틸아스테리퀴논 및 이소코클리오디놀)은 HIV-1 프로테아제의 억제제로 기술되었다 (Fredenhagen et al, Ref. 22).
구조적으로 관련된 아자-인돌 아미드 유도체는 이전에 기술되었다 (Kato et al, Ref. 23(a); Levacher et al, Ref. 23(b); Dompe Spa, WO-09504742, Ref. 5(a); SmithKline Beecham PLC, WO-09611929, Ref. 5(b); Schering Corp., US-05023265, Ref. 5(c)). 그러나, 이들 구조는 이들이 옥소아세트아미드 유도체가 아니라 모노아자-인돌 모노-아미드라는 점에서 본 발명에서 청구된 화합물과는 상이며, 이들 화합물의 바이러스 감염, 특히 HIV를 치료하는 용도에 대한 언급은 없 다.
역전사효소 또는 프로테아제를 표적으로 하는 상술한 바와 같은 현재 승인된 약물에 대해서 내성이 된 환자의 치료를 위해서 HIV의 치료를 위한 신규한 약물이 필요하다. 이들 약물을 수득하기 위한 한가지 방법은 바이러스의 새롭고 상이한 표적을 억제하는 분자를 찾아내는 것이다. 활발한 연구 중에 있는 억제제의 일반적 부류는 HIV 도입 억제제이다. 이러한 일반적 분류는 케모킨 수용체 억제제 (CCR5 또는 CXCR4) 억제제, 바이러스 gp41을 표적화한 융합 억제제, 및 바이러스 외피 (envelope), gp120 및 그의 인간 세포성 표적 CD4의 부착을 방지하는 억제제를 포함하여 몇가지 표적을 목표로 하는 약물을 포함한다. 바이러스 도입 억제제에 대한 다수의 검토 및 일반적인 논문이 현재 제시되어 있으며, 일부의 선택된 문헌은 다음과 같다:
Figure 112006074171808-pct00001
Figure 112006074171808-pct00002
바이러스 막, gp120의 세포성 CD4에 대한 초기 부착을 방지하기 위한 두가지 일반적인 방법이 있는데, 이들은 a) 인간 CD4에 결합하여 바이러스 외피 (gp120)의 부착을 차단하는 억제제, 및 b) 바이러스 gp120에 결합하여 세포성 CD4의 결합을 방지하는 억제제이다. 두번째 방법은 이것이 바이러스 표적을 억제하고, 선택적인 경우에는 정상적인 인간 생리학을 혼란시키거나 부작용을 야기하는 기회를 최소화시킨다는 이점을 갖는다. 이 방법에 경우에, 바이러스 외피의 서열에서의 가변성에 의해서 야기된 약물에 대한 감수성에서의 스펙트럼을 극복하고 저항성의 발생을 억제하기 위하여는 EC50 또는 바이러스를 사멸시키는데 필요한 약물의 농도의 다른 척도에 비해서 가능한 한 다수 배인 약물의 혈장 레벨을 수득하는 것이 중요하다. 후술하는 바와 같이, 이들 억제제는 인간에게서 광범한 유용성을 갖도록 안전한 것으로 보이며, 따라서 이들은 바이러스 억제를 할 수 있기에 충분한 노출 레벨을 수득할 수 있어야 한다. 바이러스 성장을 억제하는데 필요한 레벨과 비교한 약물 레 벨의 배수가 크면 클수록, 바이러스 증식은 더 효율적이고 완전하게 억제되고, 바이러스 돌연변이 및 그 후의 치료에 대한 저항성의 발생의 기회가 줄어든다. 따라서, 바이러스 부착 억제제의 효능에 기여하는 중요한 관점은 고유한 효력 및 안전성뿐만 아니라, 물리적으로 적합한 용량 및 허용되며, 바람직하게는 편리한 투여 스케줄에서 높은 혈장 노출을 달성을 가능하게 하는 약력학적 및 약제학적 특성이다. 본 발명은 이전에 기술된 부류의 HIV 부착 억제제 중의 효과적인 구성원의 용량 점증에 따라 최대 노출, 및 노출 배수 (즉, EC50 또는 EC90보다 큰 약물 노출의 배수)를 증가시키는 능력을 크게 증진시키는 프로드럭 방법을 기술하고 있다.
일련의 최근의 문헌 및 보고서는 바이러스 gp-120을 표적으로 하고, 숙주 CD4에 대한 바이러스의 부착을 방지하는 바이러스 도입 억제제의 부류의 초기 구성원으로서 BSM-806으로 라벨을 붙인 화합물을 특정화하고 설명하고 있다.
Figure 112006074171808-pct00003
Figure 112006074171808-pct00004
이 부류로부터의 인돌, 아자인돌 및 그 밖의 다른 옥소 아미드 함유 유도체는 다수의 상이한 PCT 및 반포된 미국 특허출원 (Reference 93-95, 106, 108, 109, 110, 111 및 112)에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 직접적으로 본 특허출원의 화합물에 관한 것이다. 선행기술의 이들 문헌에 기술된 화합물 중의 어떤 것도 N-1 질소에 부착된 메틸 디하이드로젠 포스페이트 (또는 포스페이트기의 염 또는 모노 또는 디 에스테르)를 함유하지 않으며, 따라서 본 발명의 화합물은 신규한 물질의 조성을 나타낸다. 이 부위는 인간 노출의 전임상 모델에서 모화합물의 최대 전신적 노출을 현격하게 증가시키는 프로드럭 변형체로 작용함으로써 모화합물의 유용성을 현격하게 증가시킨다. 본 발명자들은 선행기술 문헌들 중의 어떤 것도 본 발명의 신규한 화합물 및 HIV 감염을 억제하는 이들의 용도를 기술하거나 시사하는 것으로 해석될 수 없는 것으로 믿는다.
본 발명은 항바이러스제로서, 특히 항-HIV 약물로서의 모분자의 경구적 유용성을 개선시키는데 매우 효과적인 특정의 인돌 및 아자인돌 케토피페라진 아미드의 프로드럭을 기술하고 있다. 모분자는 비교적 불용성이며, 용해-제한된 또는 용해도 제한된 흡수의 문제가 있는데, 이것은 용량이 최대 레벨 이상으로 증가함에 따라서 순환계 내에 흡수되도록 제때에 용해하는 약물은 점점 더 적어지고, 대신에 이들은 신체를 통과하여 폐기물로서 배설된다는 것을 의미한다. 프로드럭에 의해서 제공되는 개선점은 이들이 체내에서 현저하게 증가된 약물 레벨을 제공하여 HIV 바이러스에 대해서, 및 특히 덜 민감하거나 더 저항성인 균주에 대해서 더 큰 효능을 제공하도록 하는데 필수적이다. 프로드럭은 특히 이러한 부류의 약물에 대해서 중요한데, 이는 약물이 균주마다 서로 다르고, 따라서 최대 노출배수가 필요한 표적인 HIV 바이러스의 외피를 표적으로 하기 때문이다. 프로드럭에 의해서 더 많은 약물이 흡수되어 표적에 도달하기 때문에, 환제 함량 (pill burden), 환자에 대한 비용 및 투약간격을 감소시킬 수 있다. 이들 특성을 갖는 프로드럭의 확인은 어려우며, 간단하지도 않고 문헌에 기술된 성공적인 프로드럭 디자인을 위한 명백한 경로도 아니다. 어떤 프로드럭 화학을 이용하는지에 대해서도 어떤 것이 가장 효과적일 수 있는지에 대해서도 명백한 선행기술의 교시는 없다. 이하의 논문 및 데이타는 본 발명에 기술된 프로드럭이 놀랍게도 잘 작용하는 것을 보여줄 수 있을 것이다. 이들은 매우 빠르고 효율적으로 모약물을 방출하며, 노출을 다수의 프로드럭에 대해서 보고된 것보다 더 높은 레벨로 증진시킨다.
약물의 특성을 현저하게 증진시키거나, 약물의 약제학적 또는 약력학적 특성 에서 고유의 결핍을 극복하기 위한 프로드럭 전략 또는 방법의 사용은 약물의 유용성을 현저하게 증가시키기 위한 특정의 환경에서 사용될 수 있다. 프로드럭은, 화학적 변형이 환자에게 투여하면 체내에서 모분자를 재생하는 완전히 새로운 화학적 실체를 유도한다는 점에서 제제와는 상이하다. 모약물의 재생을 위한 조건, 프로드럭의 물리적, 약제학적 또는 약력학적 특성, 및 프로드럭 변형이 부착될 수 있는 작용기를 조정하는데 있어서의 선택범위를 제공하는 무수한 프로드럭 전략이 존재한다. 그러나, 이들 공개된 문헌 중의 어떤 것도 본 발명에서 발명된 특정의 프로드럭을 제공하는 어떠한 방법을 사용하는지를 교시하지 않았다. 프로드럭 전략에 대한 다수의 검토 또는 논문들이 발표되었으며, 대략적인 리스트는 이하에 제시하였다:
Figure 112006074171808-pct00005
일부의 기술은 특정한 적용분야를 갖는 것으로, 즉 예를 들어, 용해도 또는 흡수를 증가시키는 것으로 알려져 있지만, 프로드럭의 개발은 대부분 경험적 실행으로 남아 있다. 따라서, 반드시 통상적으로 다수의 전략 또는 화학적 변형이 조사되어야 하며, 수득된 화합물은 프로드럭 전략의 성공을 확인하고 판단하기 위하여 생물학적 모델에서 평가되어야 한다.
성공적인 프로드럭 전략은, 분자 내의 화학적 반응성 부위는 프로드럭 부분의 부가를 통해서 변형시키고, 후에 환자에서의 원하는 조건하에서 프로드럭 부분은 차폐가 해제되어 모약물을 방출하는 것을 필요로 한다. 프로드럭 분자는 반드시 투약하기 전에 허용가능한 투약량에서 적합한 안정성을 가져야 한다. 또한, 방 출기전 (release mechanism)은 프로드럭이 모약물을 효율적으로, 질환 표적에서 모약물의 치료학적 레벨을 제공하는 동력학을 가지고 재생시키는 것을 허용하여야 한다. 본 발명의 분자에서, 인돌 또는 아자인돌 질소는 프로드럭 부분을 위한 허용되는 부착점을 나타낸다.
적절한 화학 또는 링커 (linker)에 의해서 결합된 포스페이트 기가 모약물의 경구적 노출을 증진시킬 수 있다는 제안은 본 기술분야에서 공지된 개념이다. 그러나, 후술하는 바와 같이, 프로드럭을 생성시키기 위해서 포스페이트 기를 사용하는 경우에 소정의 약물성분으로 작용할 수 있음을 아는 것은 예측할 수 없는 것이다. 포스페이트 기는 일시적으로 약물의 물리적 특성을 변화시키며, 따라서 이것이 체내에서 알칼리성 포스파타제 또는 이상적으로 디자인된 링커의 다른 화학적 반응에 의해서 분해될 때까지는 생성된 분자의 수용성을 증가시키는 프로드럭이다. 예를 들어, 이하의 문헌에서 저자는 포스페이트가 경구적 효능을 개선시킬 수 있다고 결론을 내렸다. 이 문헌에서, 수난용성이며 친유성인 약물 내의 알콜 기의 포스페이트 유도체는 두가지의 다른 프로드럭 보다 더 우수한 경구적 생체이용율을 나타내었으며, 낮은 경구적 생체이용율을 갖는 모분자를 능가하는 이점을 제공하는 것으로 나타났다.
Evaluation of a targeted prodrug strategy to enhance oral absorption of poorly water - soluble compounds. Chan, O. Helen; Schmid, Heidi L.; Stilgenbauer, Linda A.; Howson, William, Davis C.; Stewart, Barbra H. Pharmaceutica; Research (1998), 15(7), 1012-1018.
두가지의 매우 적절한 최근의 논문이 발표되었으며, 여기에서는 경구적 사용을 위하여 모분자에 비해 유의적인 이점을 갖는 포스페이트 프로드럭을 확인하는 것의 곤란성을 언급하고 있다.
논문 (제목: "Absorption Rate Limit Consideration for Oral Phosphate Prodrugs", Tycho Heimbacj et al., Pharmaceutical Research 2003, Vol. 20, No. 6, pages 848-856)은 "경구적 경로에 의한 포스페이트 프로드럭의 사용의 의의의 불가능성은 흡수 잠재성에 대한 약물 후보군을 선별하기 위해서 사용되는 시스템에서의 연구를 촉진시켰다"라고 언급하였다. 이 논문은 또한, 다수의 포스페이트 프로드럭이 경구적 사용에 부적합하였던 이유를 검토하였으며, 약물 흡수과정에서 몇가지의 잠재적인 속도제한 인자들을 거론하였다. 논문은 또한, 소수의 성공적인 적용을 확인하였다. 논문은 일부의 약물을 포스페이트 프로드럭으로 경구적 송달하기에 적합하도록 만들 수 있는 특성을 확인하고자 시도하였지만, 그 메세지는 명백하게 이것이 여전히 경험과학이라는 것이다. 이것은 동일한 저자의 두번째 논문 (제목: "Enzyme mediated precipitation of patent drugs from their phosphate prodrugs", Tycho Heimbach et al., International Journal of Pharmaceutics 2003, 261, 81-92)의 결론에 의해서 강조된다. 초록에서 저자는 다수의 경구적 포스페이트 프로드럭이 그들의 불용성 모약물에 비해서 흡수율 또는 흡수의 정도를 개선시키는데 실패하였다고 언급하였다. 장내 알칼리성 포스파타제에 의한 빠른 모약물 생성은 과포화된 용액을 제공하여 모약물의 침전을 유도할 수 있다. 이것은 경구적 포스페이트의 유용성을 제한할 수 있다. 이 논문의 결론은 "요약하면, 포스페이트 프로드럭으로부터 모약물의 침전은 효소 매개될 수 있다. 특정 약물의 침전은 또한, 카코 (Caco)-2 모델에서 특정 약물에 대해서 관찰될 수 있다. 유도시간은 감소하고, 핵형성 시간은 높은 과포화율에 따라서 증가하기 때문에, 모약물은 표적화된 프로드럭 농도가 모약물의 용해도, 즉 높은 과포화율을 갖는 모약물에 비해서 훨씬 더 큰 경우에 침전할 수 있다. 프로드럭의 전환 중에 모약물이 침전하는 정도는 프로드럭의 모약물로의 전환율, 모약물의 침전에 대한 프로드럭 영향, 및 모약물의 가용화에 따라 좌우된다"라고 언급되어 있다 (인용구). 저자의 결론으로부터 알 수 있는 바와 같이, 이 과정은 복잡하고, 과포화율, 생체내에서의 프로드럭 전환율, 및 모약물과 프로드럭의 혼합물을 가용화시키는 장내 환경의 능력과 같이 미리 예견하는 것이 불가능한 다수의 인자에 따라 좌우된다.
하임바흐 (Heimbach)에 의한 두개의 문헌은 포스페이트 프로드럭의 임상적 상태를 기술하고 있으며, 다수의 실패와 소수의 성공적인 사례들을 거론하고 있다. 임상적 실패의 한가지 예와 성공의 한가지 예는 이하에 제시된다.
에토포사이드 (Etoposide®)는 정맥내 또는 경구적 경로로 투여되는 항암약물이다. 에토포사이드 포스페이트 프로드럭은 임상적으로 사용되지만, 이 프로드럭은 모약물의 페놀 부분에 대한 직접적인 부착에 의해서 형성된 포스페이트를 함유하기 때문에 이들의 구조는 본 발명의 유도체와는 상이하다. 약물 에토포사이드의 포스페이트 프로드럭을 제조하는 주된 이유는 증가된 용해도와 부형제의 감소를 통해서 정맥내 사용을 개선시키고자 하는 것이었다. 포스페이트 프로드럭은 전임상 및 임상 모두에서 경구적으로 평가되었지만, 이것은 임상적으로는 정맥내 투여 를 위해서만 사용된다.
Synthesis of etoposide phosphate , BMY -40481: a water - soluble clinically active prodrug of etoposide. Saulnier, Mark G.; Langley, David R.; Kadow, John F.; Senter, Peter D.; Knipe, Jay O.; Tun, Min Min; Vyas, Dolatrai M.; Doyle, Terrence W. Bristol-Myers Squibb Co., Wallingford, CT, USA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (1994), 4(21), 2567-72 및 이 안에서 사용된 문헌.
이하의 두가지 문헌으로부터 알 수 있는 바와 같이, 경구적 투약을 위한 포스페이트 부분의 이점은 명백하지 않았었다.
Randomized comparison of etoposide pharmacokinetics after oral etoposide phosphate and oral etoposide. De Jong, R.S.; Mulder, N.H.; Uges, D.R.A.; Kaul, S.; Winograd, B.; Sleijfer, D. Th; Groen, H.J.M.; Willemse, P.H.B.; van der Graaf, W.T.A.; de Vries, E.G.E. Department of Medicinal Oncology, University Hospital Groningen, Groningen, Neth. British Journal of Cancer (1997), 75(11), 1660-1666. 이 논문은 모약물과 프로드럭을 직접적으로 비교하였으며, 경구적 에토포사이드 포스페이트는 경구적 에토포사이드에 비해서 임상적으로 적절한 이점을 제공하지 않는다고 결론을 내렸다.
Etoposide bioavailability after oral administration of the prodrug etoposide phosphate in cancer patients during a phase I study. Chabot, G.G.; Armand, J.-P.; Terref, C.; De Formi, M.; Abigerges, D.; Winograd, B.; Igwemezie, L.; Schacter, L.; Kaul, S.; et al. Department Medicine, Gustave-Roussy Institute, Villejuif, Fr. Journal of Clinical Oncology (1996), 14(7), 2020-2030.
이러한 선행논문은 문헌 데이타와 비교하여 경구적 EP가 저용량 또는 고용량에서 경구적 E에 비해서 19% 더 높은 F 값을 갖는다는 밝혔다. 이들은 경구용 프로드럭 EP로부터의 E에서 이러한 더 높은 F는 이 약물에 대한 잠재적인 약동학적 중요성이 될 수 있는 약물학적 이점인 것으로 보인다고 결론을 내렸다. 그러나, 반대의 결론에 도달한 이전에 언급된 연구가 더 늦게 완료되었으며, 이것은 직접적인 비교 데이타가 더 타당하였음을 나타내고 있다. 따라서, 용해성을 개선시키기 위하여 포스페이트 기를 첨가하는 것이 개선된 경구적 효능을 보장하는 것은 아니다.
HIV 프로테아제 억제제인 암프레나비르 (Amprenavir)의 포스페이트 프로드럭이 제조되었으며, 그의 활성성분은 현재 경구적 사용을 위한 개선된 약물이 되었다. 이것은 이러한 방법에 의한 드문 성공의 예이다. 포스페이트는 하이드록시 부분에 직접 부착되어 용해성을 증진시키는 작용을 한다. 사이토크롬 P450 3A4-매개된 대사 불활성화를 억제하는 작용을 하는 포스암프레나비르 (Fosamprenavir)는 단독으로 또는 다른 프로테아제 억제제 리토나비르와 함께 환자가 더 적은 환제, 더 작은 환제 (더 적은 부형제가 필요하기 때문임)를 복용하고, 덜 빈번한 투약 스케줄을 이용할 수 있도록 한다. 명백하게, 암프레나비르의 구조는 본 발명의 분자와는 현저하게 상이하며, 다른 부류의 약물 또는 포스페이트 링커 화학에 의해서는 성공을 예측하지 못한다. 포스암프레나비르에 대한 두개의 문헌이 이하에 포함되었지만, 가장 최근의 데이타는 IDDB (Current Drugs Ltd.에 의해서 생산된 Investigational Drugs Database라고 불리는 시판 데이타베이스)와 같이 본 기술분야에서 잘 알려진 데이타베이스를 탐색함으로써 찾을 수 있다.
Figure 112006074171808-pct00006
Fosamprenavir vertex Pharmaceuticals / Glaxo SmithKline . [ Erratum to document cited in CA138 :130388]. Corbett, Amanda H.; Kashuba, Angela D.M. School of Pharmacy, The University of North Carolina Hospitals, Chapel Hill, NC, USA. Current Opinion in Investigational Drugs (PharmaPress Ltd.) (2002), 3(5), 824.
Fosamprenavir Vertex Pharmaceuticals / Glaxo SmithKline. Corbett, Amanda H.; Kashuba, Angela D.M. School of Pharmacy, The University of North Carolina Hospitals, Chapel Hill, NC, USA. Current Opinion in Investigational Drugs (PharmaPress Ltd.) (2002), 3(3), 384-390.
핵심어 "인돌의 프로드럭" 또는 "아자인돌의 프로드럭" 하에서 열거된 것을 찾을 수 있는 예에 대한 문헌을 탐색하여 기술된 다수의 문헌을 확인하였다. 본 발명자들은 아자인돌 프로드럭이 N-1에 부착된 메틸 디하이드로젠 포스페이트 (또 는 염 또는 포스페이트 기의 모노 또는 디 에스테르)를 사용하여 제조된 어떠한 문헌도 찾지 못하였다.
인돌 포스페이트 프로드럭에 관하여, 주 (Zhu) 등에 의한 문헌에는 PD 154075의 효과적인 포스페이트 프로드럭을 찾기 위한 연구가 기술되었다. 이 분자에서는 직접적인 인돌 포스페이트 또는 메틸 디하이드로젠 포스페이트 또는 인돌 질소의 염 프로드럭 중의 어떤 것도 모분자의 재생의 느린 속도로 인하여 부적합한 프로드럭이었다. 따라서, 가용화 포스페이트를 결합시키기 위하여 이하에 나타낸 신규하고 복잡한 링커가 개발되었다.
Phosphate prodrugs of PD 154075. Zhu, Zhijian; Chen, Huai-Gu; Goel, Om P.; Chan, O. Helen; Stilgenbauer, Linda A.; Stewart, Barbra H. Division of Warner-Lambert Company, Chemical Development, Parke-Davis Pharmaceutical Research, Ann Arbor, MI, USA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2000), 10(10), 1121-1124.
Figure 112006074171808-pct00007
다수의 문헌들은 용해-제한된 흡수를 극복하는 것과는 다른 목적으로 프로드럭의 디자인을 기술하고 있다. 다수의 프로드럭은 인돌 또는 아자인돌 질소에 부착되지 않거나, 모약물이 아닌 래디칼 중간체를 방출시키도록 디자인되었다. 본 기술분야에 기술된 프로드럭 및 그들의 특성은 모 HIV 부착 억제제의 특성을 개선하기 위한 명백한 해결책을 제시하지 않는다.
본 발명에 이르러, 이하에 나타낸 화학식의 신규한 메틸 디하이드로젠 포스페이트 프로드럭 및 약제학적으로 허용가능한 염이 기존의 약물에 의해서 현재 사용되지 않는 새로운 기전을 갖는 항-HIV제로 유용하다는 것이 밝혀지게 되었다. 환자가 기존의 약물 부류에 대해서 저항성이 되는 경우에 선택할 것이 없기 때문에, 새로운 기전을 갖는 약물에 대한 필요성은 크다. 또한, 저항성 바이러스 균주는 대체 기전을 갖는 약물에 대해서도 여전히 민감할 수 있을 것 같기 때문에, 새로운 기전을 갖는 약물은 공지된 부류의 억제제에 대한 저항성의 출현을 극복하도 록 이들 약물과 함께 사용될 수 있다.
Figure 112006074171808-pct00008
본 발명자들은 이들 프로드럭이 모분자보다 더 수용성이며, 설치류에서 경구 투약한 후에, 또는 인간 효소 또는 조직을 사용한 시험관내 시험에서 모약물로 빠르게 전환하는 것을 확인하였다. 또한, 1회 경구 용량 증량시험에서 프로드럭은 용량의 증가에 따라서 약물 노출 (AUC) 및 최대 농도 (Cmax)의 놀라운 증진을 제공하였다. 이들 예견적 연구는 이들 프로드럭이 개 및 인간에게서 이점을 제공할 것으로 제안하고 있다.
Figure 112006074171808-pct00009
화학식 IVa의 모화합물은 인체 임상실험에서 연구되었다. 이 화합물을 건강한 인간 지원자에게 투여하였다. 노출 대비 용량의 그래프는 도 1에 나타내었다.
알 수 있는 바와 같이, 캅셀 제제 (적색 삼각형)의 1 회 용량은 200 ㎎ 증가량으로 크기가 200-2400 mgs의 범위였다. 또한, 약물 노출의 증가는 용량에 용량에 따라서 훨씬 더 느리고 덜 비례적으로 증가하였다는 것을 경구적인 AUCs로부터 쉽게 알 수 있다. 실제로, 800 mgs 이상에서 노출에서의 차이 또는 증가는 최소이다. 공복조건하에서의 캅셀 처리를 위한 1:2:4:6:9:12의 용량비의 경우에 평균 Cmax 및 AUC 값의 비는 각각 1:1.3:2.4:2.3:2.1:2.7 및 1:1.5:2.3:2.0:1.9:2.4였다. 200-800 ㎎ 용량 범위 사이에서, 전신적 노출의 증가는 용량-관련되지만, 덜 용량-비례적인 반면에, 이러한 노출은 800 ㎎의 용량 이상에서는 용량-비의존적이다. 이러한 현상은, 사용된 캅셀제제에 의한 화학식 IVa 화합물의 흡수가 공복조건하에서 포화가능함을 시사하는 것이다.
전신적 노출에서의 용량 비례성은 급식조건 (고지방 식이)하에서 더 우수하게 나타난 것으로 보이는데, 이는 용량비가 1:2.3 (800 ㎎ 대 1800 ㎎)인 경우에 Cmax 및 AUC의 비가 각각 1.6 및 1.5이기 때문이다. IVa의 용액의 1 회 200 ㎎ 용량 (암적색 사각형)을 200 ㎎ 캅셀 용량의 경우와 비교함으로써 알 수 있는 바와 같이, 용액으로부터의 노출이 더 컸다. 용액에 의한 투약이 화합물 IVa 노출을 증가시켰다. 용액의 Cmax 및 AUC는 캅셀제 (200 ㎎)의 경우에 비해서 각각 대략 8-배 및 3-배였다. 용액 제제에 대한 캅셀제의 상대적 생체이용율 (32%)은 흡수가 용해속도-제한되는 것을 시사하며, 이것은 제제를 개선시킴으로써 전신적 노출을 증진시킨다는 잠재성을 시사하는 것이다.
고지방 식이는 화합물에 대한 양성 식품효과 (positive food effect)를 가졌다. 급식 처리한 후의 Cmax는 공복 처리인 경우에 비해서 800 및 1800 ㎎ 용량의 경우에 각각 대략 2.6 및 4.6 배였다. 급식 처리한 후의 AUCs는 공복 처리인 경우에 비해서 800 및 1800 ㎎ 용량의 경우에 각각 대략 2.5 및 4.7 배였다. 상대적 생체이용율 (급식 대 공복) 값은 800 ㎎ 및 1800 ㎎ 용량의 경우에 각각 293% 및 509%였다. 중앙 Tmax는 1.25 또는 2 (공복) 시간에서 4 시간 (급식)으로 변화하였다.
식품과 함께 800 ㎎ 캅셀제의 경우에, 평균 혈장농도는 투약 후 8 및 12 시간에 각각 1001 및 218 ng/㎖이다. 결과는 수회 용량을 투여한 후에 적어도 200 ng/㎖의 표적화된 Cmin 값을 위한 q12h 또는 q8h 투약 레지멘 (regiment)을 지지하였다. 이 값은 전임상 데이타를 기초로 하여 선택되었다. 막대 그래프로 표시된 이 데이타 중의 일부에 대한 추가의 요약은 도 2B에서 두번째의 막대 그래프로 나타내었다.
건강한 인간에서 수회 용량시험
건강한 인간 피검자에게서 화합물 IVa의 안전성, 내약성 및 약력학을 평가하기 위한 위약-조절된 상승적 수회-용량시험은 수행하였다. 투약은 14 일 동안 12 시간 간격으로 계속하였다. 요약하면, 예비 PK 결과는, 화합물 IVa의 단일 및 수회 Q12H 용량을 투여한 후의 노출은 고지방 식이 및 가벼운 식이 (light meal)와 함께 각각 400 내지 1200 ㎎ 및 400 내지 800 ㎎의 용량 범위에 걸쳐서 용량 비례적이고, 노출은 다양한 식이 형태와 함께 이들 용량 레벨 이상에서는 용량-비의존적인 것으로 보이며, 축적은 저 내지 중등도 (~1.5 배 까지)임을 시사하였으며, 또한 노출이 아침에 투약한 후 보다 저녁에 투약한 후에 더 크다는 노출에서의 주간 변이가 있음을 시사하였다. 따라서, 투약을 고지방 식이와 함께 하는 경우에 노출 은 더 우수하였으며, 용량에 따른 노출 증가는 고지방 식이의 경우에 더 컸다.
이것은 상기 단일 용량시험에서 수득된 결과와 유사하다.
HIV 환자에게서의 수회 용량시험
정상적인 지원자에게서의 시험으로부터 수득된 노출 데이타를 기준으로 하여, HIV 환자에게서 효능시험을 수행하였다. 이 데이타의 최초 발표는 연설 및 공개된 초록에서 이루어졌다 ("Antiviral Activity, Safety, and Tolerability of a Novel, Oral Small-Molecule HIV-1 Attachment Inhibitor, IVa, in HIV-1-Infected Subjects" G. Hanna, J. Lalezari, J. Hellinger, D. Wohl, T. Masterson, W. Fiske, J. Kadow, P-F. Lin, M. Giordano, R. Colonno, D. Grasela. Abstract J-32, 02/11/2004, 11th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Fransisco, CA). 시험 디자인은 항레트로바이러스 치료법을 수행한 적이 없거나 ≥16 주일 동안의 항레트로바이러스 치료법을 중단한 HIV+성인을 포함하였다. 이들의 CD4 수는 ≥250 세포/㎣인 것이 필요하였으며, 혈장 HIV-1 RNA는 5,000-500,000 c/㎖의 범위인 것이 필요하였다. 각각의 용량암 (dose arm)에는 15 명의 피검자가 있었으며, 약물:위약을 투여받는 환자의 비는 4:1이었다.
화합물 IVa의 위약-조절된 순차적 시험 (sequential study)은 매 12 시간 마다 800 ㎎ PO의 초기 용량암에 이어서 매 12 시간마다 투여되는 1800 ㎎ PO의 두번째 용량암을 이용하였다. 약물을 캅셀로 고지방 식이와 함께 투여하여 노출 및 혈장 레벨을 증가시켰음에 주목하는 것이 중요하다. 시험약물은 7 일 동안 및 8 일 째의 아침에 투여하였다. 피검자들은 14 일 동안 추적되었다.
시험결과 (약물 IVa를 투여받는 24 명의 환자 중의 18 명에 대함)
화합물 IVa 위약
14일에 걸친 HIV RNA에서의 8일째의 변화, log10 c/㎖ 평균 (SD) -0.72 (0.51) -0.02 (0.40)
범위 +0.34 내지 -1.37 +0.45 내지 -0.26
14일에 걸친 HIV RNA에서의 최대 변화, log10 c/㎖ 평균 (SD) -1.00 (0.50) -0.30 (0.08)
범위 -0.32 내지 -1.60 -.22 내지 -0.38
CD4에서의 8일째의 변화,
세포/㎣		 평균 (SD) 106 (151) 6 (57)
범위 -214 내지 +272 -35 내지 +47
시험결과 (약물 IVa를 투여받는 24 명의 환자 중의 18 명에 대함)
화합물 IVa 위약
14일에 걸친 HIV RNA에서의 최대 변화 n (%) > 0.5 log10 c/㎖ 8 (67%)8 0
> 1.0 log10 c/㎖ 7 (58%) 0
> 1.5 log10 c/㎖ 3 (25%)
1. 고지방 식이와 함께 800 ㎎ 투약 레벨에 대한 데이타에 의해서 알 수 있는 바와 같이, 유의적인 항바이러스 활성이 관찰되었다. 그러나, 환자의 단지 58% 만이 바이러스 부하량 (virus load)에서 > 1.0 log 저하를 나타내었다. 더 활발한 항바이러스 반응은 고지방 식이와 함께 1800 ㎎ 투약 레지멘을 사용한 경우에 나타났으며, 이 경우에 평균 반응은 바이러스 부하량에서의 -.96 log10 저하였다. 이 데이타는, 이 약물이 고지방 식이와 함께 매 12 시간마다 800 ㎎ 및 1800 ㎎ (및 이들 사이)의 용량에서 유의적인 항바이러스 활성을 가지며, 따라서 이것은 배합요법에서 유의적인 역할을 할 수 있었음을 나타낸다. 남자에게서 BMS-043을 사용한 결과의 갱신된 요약은 구연발표 ("Antiviral Activity, Safety, and Tolerability of a Novel, Oral Small-Molecule HIV-1 Attachment Inhibitor, BMS-488043, in HIV-1-Infected Subjects" G. Hanna, J. Lalezari, J. Hellinger, D. Wohl, T. Masterson, W. Fiske, J. Kadow, P-F. Lin, M. Giordano, R. Colonno, D. Grasela. Abstract J-32, 02/11/2004, 11th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA)로부터의 초록과 슬라이드를 검토함으로써 수득될 수 있다.
불행하게도, 이 약물은 명백한 건강상의 이유로 매 200 ㎎씩의 캅셀제 총 9개를 고지방 식이와 함께 하루에 2번 투여하는 것을 포함하여 수개월 동안 만성적으로 송달하는 것을 실행할 수 없었으며, 따라서 더 저용량으로부터 증가된 노출을 제공하고, 고지방 식이에 대한 필요성이 배제된 새로운 제제가 필요할 수 있다.
따라서, 임상적 데이타는 고지방 식이의 부재하에서 더 저용량으로부터 이 약물의 노출을 개선시키는 방법이 필요함을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 프로드럭에 대한 초기 데이타는 놀랍게도 이들이 IVa와 같은 분자의 노출을 개선시킬 수 있고, 더 낮은 캅셀 함량을 가지고 항레트로바이러스 치료법의 성분으로서 만성적으로, 모약물을 고지방 식이의 부재하에서 사용될 수 있도록 하는 농도로 송달할 수 있다는 것을 예견한다.
프로드럭 Iab (라이신 염) 또는 고체 모분자 (IVa)의 고체 캅셀을 개에게 투약하여 수득한 초기 데이타는 도 2의 첫번째 막대 그래프인 도 2A에 요약하였다. 알 수 있는 바와 같이, 프로드럭 Iab (모노 라이신 염)을 공복상태인 개 또는 고지 방 식이를 급식한 개에게 투약한 후에, 노출은 모분자를 투약한 경우에 비해서 놀랍게도 높았다. 또한, 어떠한 프로드럭이라도 고체 모분자를 투약한 후에 노출에 대하여 뚜렷한 효과를 가진다면 급식상태 대 공복상태의 효과는 최소이다. 따라서, 놀랍게도 프로드럭을 투약한 후의 모분자의 노출은 고지방 식이에 대한 의존성을 나타내지 않으며, 이것은 투약한 후에 모분자를 투약한 경우에 비해 더 일정한 노출 레벨을 예견한다. 도 2B의 막대 그래프는 모분자 IVa에 대해서 이전에 거론된 인간 데이타를 요약한 것이며, 분자에 대한 노출의 고지방 식이에 대한 의존성, 노출 대 용량에 있어서의 비례하지 않는 증가, 및 고체 제제보다 용액을 투약한 경우의 더 우수한 노출을 나타낸다. 후술하는 바와 같이, 이것은 전임상 모델에서 포스페이트 프로드럭의 사용에 의해서 놀랍게도 개선되는 것으로 보이는 용해 또는 흡수속도 제한된 노출을 나타낸다. 포스페이트 프로드럭의 사용은 또한, 두가지 다른 프로드럭에 대한 모약물에 대비하여 공복상태의 개에게서 노출을 증가시켰다. 이들 실험의 상세한 사항은 실험 항목에 포함되어 있다. 또한, 두가지 추가의 프로드럭 예에 대하여 랫트, 개 및 원숭이에서, 및 또 다른 두가지 프로드럭에 대하여 랫트에서의 다양한 시험으로부터의 세부사항은 HIV 바이러스 증식의 치료 및 억제를 위한 유용성을 가질 것으로 보이는 것과 상관관계가 있는 용량에서 모분자로부터 수득된 것보다 노출을 증가시키는 이들 프로드럭의 놀라운 유용성을 입증하는 것이다.
인용된 참고문헌
특허문헌
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5. (a) Mantovanini, M.; Melillo, G.; Daffonchio, L. Tropyl 7-azaindol-3-ylcarboxyamides as antitussive agents. PCT WO 95/04742 (Dompe Spa). (b) Cassidy, F.; Hughes, I.; Rahman, S.; Hunter, D.J. Bisheteroaryl-carbonyland carboxamide derivatives with 5HT 2C/2B antagonists activity. PCT WO 96/11929. (c) Scherlock, M.H.; Tom, W.C. Substituted 1H-pyrrolopyridine-3-carboxamides. 미국 특허 제 5,023,265 호. (d) Hutchison, D.R.; Martinelli, M.J.; Wilson, T.M. Preparation or pyrrolo[2,3-d]pyrimidines as sPLA2 inhibitors. PCT WO 00/00201.
그 밖의 문헌.
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발명의 요약
본 발명은 화학식 I의 화합물, 이들의 약제학적 제제, 및 HIV와 같은 바이러스로 고생하거나 이 바이러스에 민감한 환자에게서의 이들의 용도를 포함한다. 비독성인 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 화학식 I의 화합물은 이하에 기술된 바와 같은 화학식 및 의미를 갖는다.
본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 포함한다:
Figure 112006074171808-pct00023
상기 식에서,
X는 C 또는 N이며, 단 X가 N인 경우에 R1은 존재하지 않고;
W는 C 또는 N이며, 단 W가 N인 경우에 R2는 존재하지 않고;
V는 C이며;
R1은 수소, 메톡시 또는 할로겐이고;
R2는 수소이며;
R3는 각각 독립적으로 G로부터 선택된 하나의 치환체로 임의로 치환될 수 있는 메톡시 또는 헤테로아릴이고, 여기에서 헤테로아릴은 트리아졸릴, 피라졸릴 또는 옥사디아졸릴이며;
E는 수소 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 모노 또는 비스 염이고;
Y는 하기 화학식의 기로부터 선택되며
Figure 112006074171808-pct00024
;
R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17은 각각 독립적으로 H 또는 메틸이고, 단 R10-R17 중의 2 개 이하는 메틸이며;
R18은 C(O)-페닐, C(O)-피리디닐, 피리디닐, 피리미디닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 나프티리디닐, 프탈라지닐, 아자벤조푸릴 및 아자인돌릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이들은 각각 독립적으로 메틸, -아미노, -NHMe, -NMe2, 메톡시, 하이드록시메틸 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 2 개의 구성원으로 임의로 치환될 수 있으며;
D는 시아노, S(O)2R24, 할로겐, C(O)NR21R22, 페닐 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기에서 상기의 페닐 또는 헤테로아릴은 독립적으로 1 내지 3 개의 동일하거나 상이한 할로겐, 또는 G로부터 선택된 1 내지 3 개의 동일하거나 상이한 치환체로 임의로 치환되며, 여기에서 헤테로아릴은 피리디닐 및 옥사디아졸릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A는 페닐, 피리디닐, 푸릴, 티에닐, 이속사졸릴, 및 옥사졸릴로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기에서 상기의 페닐, 피리디닐, 푸릴, 티에닐, 이속사졸릴 및 옥사졸릴은 독립적으로 1 내지 3 개의 동일하거나 상이한 할로겐, 또는 G로부터 선택된 1 내지 3 개의 동일하거나 상이한 치환체로 임의로 치환되고;
G는 (C1 -6)알킬, (C1 -6)알케닐, 페닐, 하이드록시, 메톡시, 할로겐, -NR23C(O)-(C1-6)알킬, -NR24R25, -S(O)2NR24R25, COOR26 및 -CONR24R25로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기에서 상기의 (C1 -6)알킬은 하이드록시, 디메틸아미노 또는 1 내지 3 개의 동일하거나 상이한 할로겐으로 임의로 치환되고;
R26은 수소 및 (C1 -6)알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R20, R21, R22, R23, R24, R25는 수소, (C1 -6)알킬 및 -(CH2)nNR27R28로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
n은 0-6이며;
R27 및 R28은 각각 독립적으로 H 또는 메틸이다.
더욱 바람직한 구체예는 X 및 W가 각각 N인 상기의 화합물; 또는 X가 C이고 W가 N인 상기의 화합물이다.
또 다른 바람직한 구체예는 R18이 -C(O)-Ph이고, Y가 화학식
Figure 112006074171808-pct00025
인 상술한 바와 같은 화합물이다.
또 다른 바람직한 구체예는 R3가 메톡시 또는 트리아졸릴이고; 여기에서 트리아졸릴은 G로부터 선택된 하나의 치환체로 임의로 치환되며; R10-R17은 각각 H이고; G는 메틸인 상술한 바와 같은 화합물이다.
또 다른 바람직한 구체예는 R1이 F이고, R3가 N-1 위치에 부착된 1,2,3-트리아졸릴인 상술한 바와 같은 화합물이다.
또 다른 바람직한 구체예는 R1이 OMe이고, R3가 N-1 위치에 부착된 3-메틸-1,2,4-트리아졸릴인 상술한 바와 같은 화합물이다.
또 다른 바람직한 구체예는 R1 및 R3가 각각 메톡시인 상술한 바와 같은 화합물이다.
또 다른 바람직한 구체예는 염이 나트륨, 라이신 또는 트로메타민인 상술한 바와 같은 화합물이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예는 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 화학식 I의 화합물의 항바이러스 유효량, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물이다.
또 다른 바람직한 구체예는 (a) AIDS 항바이러스제; (b) 항감염제; (c) 면역조절제; 및 (d) HIV 도입 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 AIDS 치료제의 항바이러스 유효량을 추가로 포함하는, HIV에 의한 감염을 치료하는데 유용한 상기의 약제학적 조성물이다.
또한, 포유동물에게 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 화학식 I의 화합물의 항바이러스 유효량, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 투여하는 것을 포함하여 HIV 바이러스에 의해서 감염된 포유동물을 치료하는 방법도 구체예로 포함된다.
또 다른 구체예는 포유동물에게 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 화학식 I의 화합물의 항바이러스 유효량을 AIDS 항바이러스제; 항감염제; 면역조절제; 및 HIV 도입 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 AIDS 치료제의 항바이러스 유효량과 함께 투여하는 것을 포함하는 상술한 방법이다.
또 다른 구체예는 화학식 I의 화합물을 제조하는데 유용한 하기 화학식 II의 중간체 화합물이다:
Figure 112006074171808-pct00026
상기 식에서,
X는 C 또는 N이며, 단 X가 N인 경우에 R1은 존재하지 않고;
W는 C 또는 N이며, 단 W가 N인 경우에 R2는 존재하지 않고;
V는 C이며;
R1은 수소, 메톡시 또는 할로겐이고;
R2는 수소이며;
R3는 각각 독립적으로 G로부터 선택된 하나의 치환체로 임의로 치환될 수 있는 메톡시 또는 헤테로아릴이고, 여기에서 헤테로아릴은 트리아졸릴, 피라졸릴 또는 옥사디아졸릴이며;
L 및 M은 독립적으로 수소, C1-C6 알킬, 페닐, 벤질, 트리알킬실릴, 2,2,2-트리클로로에톡시 및 2-트리메틸실릴에톡시로 이루어진 군으로부터 선택되고, 단 L 및 M 중의 하나 이하가 수소일 수 있고;
Y는 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되며
Figure 112006074171808-pct00027
;
R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17은 각각 독립적으로 H 또는 메틸이고, 단 R10-R17 중의 2 개 이하는 메틸이며;
R18은 C(O)-페닐, C(O)-피리디닐, 피리디닐, 피리미디닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 나프티리디닐, 프탈라지닐, 아자벤조푸릴 및 아자인돌릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이들은 각각 독립적으로 메틸, -아미노, -NHMe, -NMe2, 메톡시, 하이드록시메틸 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 2 개의 구성원으로 임의로 치환될 수 있으며;
D는 시아노, S(O)2R24, 할로겐, C(O)NR21R22, 페닐 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기에서 상기의 페닐 또는 헤테로아릴은 독립적으로 1 내지 3 개의 동일하거나 상이한 할로겐, 또는 G로부터 선택된 1 내지 3 개의 동일하거나 상이한 치환체로 임의로 치환되며, 여기에서 헤테로아릴은 피리디닐 및 옥사디아졸릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A는 페닐, 피리디닐, 푸릴, 티에닐, 이속사졸릴, 및 옥사졸릴로 이루어진 군 으로부터 선택되며, 여기에서 상기의 페닐, 피리디닐, 푸릴, 티에닐, 이속사졸릴 및 옥사졸릴은 독립적으로 1 내지 3 개의 동일하거나 상이한 할로겐, 또는 G로부터 선택된 1 내지 3 개의 동일하거나 상이한 치환체로 임의로 치환되고;
G는 (C1 -6)알킬, (C1 -6)알케닐, 페닐, 하이드록시, 메톡시, 할로겐, -NR23C(O)-(C1-6)알킬, -NR24R25, -S(O)2NR24R25, COOR26 및 -CONR24R25로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기에서 상기의 (C1 -6)알킬은 하이드록시, 디메틸아미노 또는 1 내지 3 개의 동일하거나 상이한 할로겐으로 임의로 치환되고;
R26은 수소 및 (C1 -6)알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R20, R21, R22, R23, R24, R25는 수소, (C1 -6)알킬 및 -(CH2)nNR27R28로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R27 및 R28은 각각 독립적으로 H 또는 메틸이며;
n은 0-6이다.
도 1은 화합물 IVa에 대한 인체 임상실험에서의 AUC (곡선하 면적) 대비 용량을 나타낸 것이다.
도 2는 개 및 인체 시험에서 공복 및 급식 조건하의 화합물 IVa 및 프로드럭 Iab에 대한 AUC를 나타낸 것이다.
도 3은 랫트에서의 IVc 경구적 AUC 대비 용량 플롯 (plot)을 나타낸 것이다.
도 4는 랫트에서의 IVc 경구적 Cmax 대비 용량 플롯을 나타낸 것이다.
도 5는 Ic의 경구 투약 후에 랫트에서 IVc의 혈장 프로필을 나타낸 것이다.
도 6은 IVa 또는 Iab를 투여한 수컷 랫트에게서 IVa Cmax 및 AUC의 비교를 나타낸 것이다.
도 7은 IVa 또는 Iab를 투여한 개에게서 IVa Cmax 및 AUC의 비교를 나타낸 것이다.
도 8은 인간 태반 ALP 용액 중의 Iab 및 IVa의 제제의 가수분해를 나타낸 것이다.
도 9는 랫트에서 Iab의 IV 및 경구 투여 후, 및 랫트에서 IVa의 히스토리칼 데이타 (Historical Data)로부터의 Iab 및 IVa의 혈장 농도 대비 시간 프로필을 나타낸 것이다.
도 10은 개에게서 Iab의 IV 및 경구 투여 후, 및 개에게서 IVa의 히스토리칼 데이타로부터의 Iab 및 IVa의 혈장 농도 대비 시간 프로필을 나타낸 것이다.
도 11은 원숭이에게서 Iab의 IV 및 경구 투여 후, 및 원숭이에게서 IVa의 히스토리칼 데이타로부터의 Iab 및 IVa의 혈장 농도 대비 시간 프로필을 나타낸 것이다.
도 12는 IVb 또는 Ibb를 투여한 수컷 랫트에게서 IVb Cmax 및 AUC의 비교를 나타낸 것이다.
도 13은 IVb 또는 Ibb를 투여한 개에게서 IVb Cmax 및 AUC의 비교를 나타낸 것이다.
도 14는 인간 태반 ALP 용액 중의 Ibb 및 IVb의 제제의 가수분해를 나타낸 것이다.
도 15는 랫트에서 Ibb의 IV 및 경구 투여 후, 및 랫트에서 IVb의 히스토리칼 데이타로부터의 Ibb 및 IVb의 혈장 농도 대비 시간 프로필을 나타낸 것이다.
도 16은 개에게서 Ibb의 IV 및 경구 투여 후, 및 개에게서 IVb의 히스토리칼 데이타로부터의 Ibb 및 IVb의 혈장 농도 대비 시간 프로필을 나타낸 것이다.
도 17은 원숭이에게서 Ibb의 IV 및 경구 투여 후, 및 원숭이에게서 IVb의 히스토리칼 데이타로부터의 Ibb 및 IVb의 혈장 농도 대비 시간 프로필을 나타낸 것이다.
도 18은 IVc 또는 Icb를 투여한 수컷 랫트에게서 IVc Cmax 및 AUC의 비교를 나타낸 것이다.
도 19는 IVc 또는 Icb를 투여한 개에게서 IVc Cmax 및 AUC의 비교를 나타낸 것이다.
도 20은 인간 태반 ALP 용액 중의 Icb 및 IVc의 제제의 가수분해를 나타낸 것이다.
도 21은 랫트에서 Icb의 IV 및 경구 투여 후, 및 랫트에서 IVc의 히스토리칼 데이타로부터의 Icb 및 IVc의 혈장 농도 대비 시간 프로필을 나타낸 것이다.
도 22는 개에게서 Icb의 IV 및 경구 투여 후, 및 개에게서 IVc의 히스토리칼 데이타로부터의 Icb 및 IVc의 혈장 농도 대비 시간 프로필을 나타낸 것이다.
도 23은 원숭이에게서 Icb의 IV 및 경구 투여 후, 및 원숭이에게서 IVc의 히스토리칼 데이타로부터의 Icb 및 IVc의 혈장 농도 대비 시간 프로필을 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 화합물은 비대칭 중심을 가질 수 있으며, 따라서 부분입체이성체 및 에난티오머의 혼합물로서 존재할 수 있기 때문에, 본 발명은 부분이체이성체 및 에난티오머의 혼합물 이외에도 화학식 I의 화합물의 개개 부분입체이성체 및 에난티오머 형태를 포함한다.
정의
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 것으로 용어 "C1 -6 알킬"은 (다른 식으로 명시되지 않는 한은) 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 아밀, 헥실 등과 같은 직쇄 또는 측쇄 알킬기를 의미한다.
"할로겐"은 염소, 브롬, 요오드 또는 불소를 나타낸다.
"아릴"기는 완전히 컨쥬게이트된 파이-전자 (pi-electron) 시스템을 갖는 모두 탄소인 모노사이클릭 또는 융합된-환 폴리사이클릭 (즉, 탄소원자의 인접한 쌍 을 공유하는 환) 기를 나타낸다. 아릴기의 예는 페닐, 나프탈레닐 및 안트라세닐이며, 이들로 제한되지는 않는다. 아릴기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 치환된 경우에, 치환된 기(들)는 바람직하게는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릭, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 헤테로알리사이클옥시, 티오하이드록시, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로알리사이클옥시, 시아노, 할로겐, 니트로, 카보닐, O-카바밀, N-카바밀, C-아미도, N-아미도, C-카복시, O-카복시, 설피닐, 설포닐, 설폰아미도, 트리할로메틸, 우레이도, 아미노 및 -NRxRy (여기에서 Rx 및 Ry는 독립적으로 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 카보닐, C-카복시, 설포닐, 트리할로메틸 및 결합된 5- 또는 6-원 헤테로알리사이클릭 환으로부터 선택된다)로부터 선택된 하나 이상이다.
본 명세서에서 사용된 것으로, "헤테로아릴"기는 환 내에 질소, 산소 및 황으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 원자를 가지며, 또한 완전히 컨쥬게이트된 파이-전자 시스템을 갖는 모노사이클릭 또는 융합된 환 (즉, 원자의 인접한 쌍을 공유하는 환) 기를 나타낸다. 다른 식으로 지시되지 않는 한은, 헤테로아릴기는 헤테로아릴기 내의 탄소 또는 질소 원자에서 부착될 수 있다. 용어 헤테로아릴은 모 헤테로아릴의 N-옥사이드가 본 기술분야에서 공지된 바와 같이 화학적으로 가능하다면 이러한 N-옥사이드를 포함하는 것으로 인식되어야 한다. 헤테로아릴기의 예는 푸릴, 티에닐, 벤조티에닐, 티아졸릴, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 벤조티아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 이속사졸릴, 이소티아 졸릴, 피롤릴, 피라닐, 테트라하이드로피라닐, 피라졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퓨리닐, 카바졸릴, 벤즈옥사졸릴, 벤즈이미다졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 피라지닐, 디아지닐, 피라진, 트리아지닐트리아진, 테트라지닐 및 테트라졸릴이며, 이들로 제한되지는 않는다. 치환된 경우에, 치환된 기(들)는 바람직하게는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릭, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 헤테로알리사이클옥시, 티오하이드록시, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로알리사이클옥시, 시아노, 할로겐, 니트로, 카보닐, O-카바밀, N-카바밀, C-아미도, N-아미도, C-카복시, O-카복시, 설피닐, 설포닐, 설폰아미도, 트리할로메틸, 우레이도, 아미노 및 -NRxRy (여기에서 Rx 및 Ry는 상기 정의한 바와 같다)로부터 선택된 하나 이상이다.
본 명세서에서 사용된 것으로, "헤테로알리사이클릭"기는 환(들) 내에 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 원자를 갖는 모노사이클릭 또는 융합된 환을 나타낸다. 환은 결합의 안정한 배열을 제공하는 것으로부터 선택되며, 존재하지 않는 시스템을 실시하고자 하는 것은 아니다. 환은 또한 하나 이상의 이중결합을 가질 수도 있다. 그러나, 환은 완전히 컨쥬게이트된 파이-전자 시스템을 갖지는 않는다. 헤테로알리사이클릭기의 예는 아제티디닐, 피페리딜, 피페라지닐, 이미다졸리닐, 티아졸리디닐, 3-피롤리딘-1-일, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐 및 테트라하이드로피라닐이며, 이들로 제한되지는 않는다. 치환된 경우에, 치환된 기(들)는 바람직하게는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리 사이클릭, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 헤테로알리사이클옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로알리사이클옥시, 시아노, 할로겐, 니트로, 카보닐, 티오카보닐, O-카바밀, N-카바밀, O-티오카바밀, N-티오카바밀, C-아미도, C-티오아미도, N-아미도, C-카복시, O-카복시, 설피닐, 설포닐, 설폰아미도, 트리할로메탄설폰아미도, 트리할로메탄설포닐, 실릴, 구아닐, 구아니디노, 우레이도, 포스포닐, 아미노 및 -NRxRy (여기에서 Rx 및 Ry는 상기 정의한 바와 같다)로부터 선택된 하나 이상이다.
"알킬"기는 직쇄 및 측쇄 기를 포함하는 포화된 지방족 탄화수소를 나타낸다. 바람직하게는, 알킬기는 1 내지 20 개의 탄소원자를 갖는다 (본 명세서에서 숫자적인 범위, 예를 들어, "1-20"이 언급되는 경우에 언제나, 이것은 기, 이 경우에는 알킬기가 1 개의 탄소원자, 2 개의 탄소원자, 3 개의 탄소원자 등으로 20 개 까지의 탄소원자를 함유할 수 있음을 의미한다). 더욱 바람직하게는, 이것은 1 내지 10 개의 탄소원자를 갖는 중간 크기의 알킬이다. 가장 바람직하게는, 이것은 1 내지 4 개의 탄소원자를 갖는 저급 알킬이다. 알킬기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 치환된 경우에, 치환된 기(들)는 바람직하게는 트리할로알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릭, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 헤테로알리사이클옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로알리사이클옥시, 시아노, 할로, 니트로, 카보닐, 티오카보닐, O-카바밀, N-카바밀, O-티오카바밀, N-티오카바밀, C-아미도, C-티오 아미도, N-아미도, C-카복시, O-카복시, 설피닐, 설포닐, 설폰아미도, 트리할로메탄설폰아미도, 트리할로메탄설포닐, 및 결합된 5- 또는 6-원 헤테로알리사이클릭 환으로부터 개별적으로 선택된 하나 이상이다.
"사이클로알킬"기는 하나 이상의 환이 완전히 컨쥬게이트된 파이-전자 시스템을 갖지 않는 모두-탄소인 모노사이클릭 또는 융합된 환 (즉, 탄소원자의 인접한 쌍을 공유하는 환) 기를 의미한다. 사이클로알킬기의 예는 사이클로프로판, 사이클로부탄, 사이클로펜탄, 사이클로펜텐, 사이클로헥산, 사이클로헥사디엔, 사이클로헵탄, 사이클로헵타트리엔 및 아다만탄이며, 이들로 제한되지는 않는다. 사이클로알킬기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 치환된 경우에, 치환된 기(들)는 바람직하게는 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릭, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 헤테로알리사이클옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로알리사이클옥시, 시아노, 할로, 니트로, 카보닐, 티오카보닐, O-카바밀, N-카바밀, O-티오카바밀, N-티오카바밀, C-아미도, C-티오아미도, N-아미도, C-카복시, O-카복시, 설피닐, 설포닐, 설폰아미도, 트리할로-메탄설폰아미도, 트리할로메탄설포닐, 실릴, 구아닐, 구아니디노, 우레이도, 포스포닐, 아미노 및 -NRxRy (여기에서 Rx 및 Ry는 상기 정의한 바와 같다)로부터 개별적으로 선택된 하나 이상이다.
"알케닐"기는 적어도 두개의 탄소원자 및 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합으로 구성된, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기를 의미한다.
"알키닐"기는 적어도 두개의 탄소원자 및 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중결합으로 구성된, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기를 의미한다.
"하이드록시"기는 -OH 기를 의미한다.
"알콕시"기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 -O-알킬 및 -O-사이클로알킬 기 둘 다를 의미한다.
"아릴옥시"기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 -O-아릴 및 -O-헤테로아릴 기 둘 다를 의미한다.
"헤테로아릴옥시"기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 헤테로아릴을 갖는 헤테로아릴-O- 기를 의미한다.
"헤테로알리사이클옥시"기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 헤테로알리사이클릭을 갖는 헤테로알리사이클릭-O- 기를 의미한다.
"티오하이드록시"기는 -SH 기를 의미한다.
"티오알콕시"기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 S-알킬 및 -S-사이클로알킬 기 둘 다를 의미한다.
"티오아릴옥시"기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 -S-아릴 및 -S-헤테로아릴 기 둘 다를 의미한다.
"티오헤테로아릴옥시"기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 헤테로아릴을 갖는 헤테로아릴-S 기를 나타낸다.
"티오헤테로알리사이클옥시"기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 헤테로알리사이클릭을 갖는 헤테로알리사이클릭-S- 기를 나타낸다.
"카보닐"기는 -C(=O)-R" 기를 의미하며, 여기에서 R"는 각각 본 명세서에서 정의된 바와 같은 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 (환 탄소를 통해서 결합됨) 및 헤테로알리사이클릭 (환 탄소를 통해서 결합됨)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
"알데히드"기는 R"가 수소인 경우의 카보닐기를 나타낸다.
"티오카보닐"기는 -C(=S)-R" 기를 의미하며, 여기에서 R"는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"케토"기는 -CC(=O)C- 기를 의미하며, 여기에서 C=O의 어느 한면 또는 양면 상의 탄소는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 또는 헤테로알리아사이클릭 기의 탄소일 수 있다.
"트리할로메탄카보닐"기는 Z3CC(=O)- 기를 나타내며, 여기에서 Z는 할로겐이다.
"C-카복시"기는 -C(=O)O-R" 기를 나타내며, 여기에서 R"는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"O-카복시"기는 R"C(=O)O- 기를 나타내며, 여기에서 R"는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"카복실산"기는 C-카복시기를 나타내며, 여기에서 R"는 수소이다.
"트리할로메틸"기는 -CZ3 기를 나타내며, 여기에서 Z는 본 명세서에 정의된 바와 같은 할로겐기이다.
"트리할로메탄설포닐"기는 Z3CS(=O)2- 기를 나타내며, 여기에서 Z는 상기에서 정의된 바와 같다.
"트리할로메탄설폰아미도"기는 Z3CS(=O)2NRx- 기를 나타내며, 여기에서 Z 및 Rx는 본 명세서에서 정의한 바와 같다.
"설피닐"기는 -S(=O)-R" 기를 나타내며, 여기에서 R"는 본 명세서에서 정의된 바와 같고, 또한 단지 결합이며, 즉 -S(O)-이다.
"설포닐"기는 -S(=O)2R" 기를 나타내며, 여기에서 R"는 본 명세서에서 정의된 바와 같고, 또한 단지 결합이며, 즉 -S(O)2-이다.
"S-설폰아미도"기는 -S(=O)2NRxRy를 나타내며, 여기에서 Rx 및 Ry는 본 명세서에서 정의한 바와 같다.
"N-설폰아미도"기는 R"S(=O)2NRx- 기를 나타내며, 여기에서 Rx는 본 명세서에서 정의한 바와 같다.
"O-카바밀"기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 -OC(=O)NRxRy를 의미한다.
"N-카바밀"기는 RxOC(=O)NRy 기를 나타내며, 여기에서 Rx 및 Ry는 본 명세서에서 정의한 바와 같다.
"O-티오카바밀"기는 -OC(=S)NRxRy 기를 나타내며, 여기에서 Rx 및 Ry는 본 명 세서에서 정의한 바와 같다.
"N-티오카바밀"기는 RxOC(=S)NRy- 기를 나타내며, 여기에서 Rx 및 Ry는 본 명세서에서 정의한 바와 같다.
"아미노"기는 -NH2 기를 의미한다.
"C-아미도"기는 -C(=O)NRxRy 기를 나타내며, 여기에서 Rx 및 Ry는 본 명세서에서 정의한 바와 같다.
"C-티오아미도"기는 -C(=S)NRxRy 기를 나타내며, 여기에서 Rx 및 Ry는 본 명세서에서 정의한 바와 같다.
"N-아미도"기는 RxC(=O)NRy- 기를 나타내며, 여기에서 Rx 및 Ry는 본 명세서에서 정의한 바와 같다.
"우레이도"기는 -NRxC(=O)NRyRy2 기를 의미하며, 여기에서 Rx 및 Ry는 본 명세서에서 정의한 바와 같고, Ry2는 Rx 및 Ry와 동일하게 정의된다.
"티오우레이도"기는 -NRxC(=S)NRyRy2 기를 의미하며, 여기에서 Rx 및 Ry는 본 명세서에서 정의한 바와 같고, Ry2는 Rx 및 Ry와 동일하게 정의된다.
"구아니디노"기는 -RxNC(=N)NRyRy2 기를 의미하며, 여기에서 Rx, Ry 및 Ry2는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"구아닐"기는 RxRyNC(=N)- 기를 나타내며, 여기에서 Rx 및 Ry는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"시아노"기는 -CN 기를 나타낸다.
"실릴"기는 -Si(R")3을 나타내며, 여기에서 R"는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"포스포닐"기는 P(=O)(ORx)2를 나타내며, 여기에서 Rx는 본 명세서에서 정의한 바와 같다.
"하이드라지노"기는 -NRxNRyRy2 기를 나타내며, 여기에서 Rx, Ry 및 Ry2는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
두개의 인접한 R 기들은 어떤 것이라도 결합하여 원래 이들 R 기를 보유하는 환에 융합된 추가의 아릴, 사이클로알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릭 환을 형성할 수 있다.
헤테로아릴 시스템 내의 질소원자가 "헤테로아릴 환 이중결합에 참여"할 수 있다는 것은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 이것은 5-원 환 헤테로아릴기를 포함하는 두개의 호변이성체 구조 내의 이중결합을 형성하는 것을 의미한다. 이것은 질소가 본 기술분야의 화학자들에 의해서 잘 이해되고 있는 바와 같이 치환될 수 있는지 여부를 지시하는 것이다. 본 발명의 설명 및 특허청구범위는 화학적 결합의 공지된 일반적 원칙을 기초로 한다. 특허청구범위는 문헌을 기초로 하여 불안 정하거나, 존재할 수 없는 것으로 알려진 구조는 포함하지 않는 것으로 이해된다.
본 명세서에 기술된 프로드럭 화합물의 생리학적으로 허용가능한 염도 본 발명의 범주 내에 포함된다. 본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 것으로 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 비독성 염기부가염을 포함시키고자 하는 것이다. 본 명세서에서 사용된 것으로 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 또한, 카복실레이트 또는 포스페이트 또는 포스페이트 모노 에스테르와 같은 산성 기와 암모늄과 같은 반대이온과의 염, 알칼리 금속염, 특히 나트륨 또는 칼륨, 알칼리 토금속염, 특히 칼슘 또는 마그네슘, 아연과 같은 전이금속염, 및 저급 알킬아민 (메틸아민, 에틸아민, 사이클로헥실아민 등) 또는 치환된 저급 알킬아민 (예를 들어, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 또는 모노 트로메타민 (또한, TRIS 또는 2-아미노-2-(하이드록시메틸)프로판-1,3-디올이라고도 불림) 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄)과 같은 하이드록시-치환된 알킬아민), 라이신, 아르기닌, 히스티딘, N-메틸글루카민, 또는 피페리딘 또는 모르폴린과 같은 염기와 같은 적합한 유기염기와의 염을 포함시키고자 하는 것이다. 약제학적으로 허용가능한 염은 고체 또는 결정성 형태로 분리되는 경우에 모두 하이드레이트 또는 생성된 화합물 I 물질 내에 포함된 물 분자를 또한 포함하는 것으로 이해된다. 화학량론적 가능성은 본 기술분야의 전문가에게 잘 알려져 있다. 약제학적으로 허용가능한 염의 설명 및 가능한 염의 리스트는 이하의 문헌에 포함되어 있다:
Preparation of water - soluble compounds through salt formation. Stahl, P. Heinrich. Cosmas Consult, Freiburg im Breisgau, Germany. 편집자(들): Wermuth, Camille Georges. Practice of Medicinal Chemistry (2nd Edition) (2003), 601-615. 출판사: Elsevier, London, UK CODEN: 69EOEZ.
Handbook of pharmaceutical salts: properties, selection, and use by Stahl, P. Heinrich, Wermuth, Camille G., International Union of Pure and Applied Chemistry. Weinheim; New York: VHCA; Wiley-VCH, 2002.
본 발명의 또 다른 관점에서는 신규의 포스페이트 에스테르 중간체 화합물 II가 기술되어 있다.
[화학식 II]
Figure 112006074171808-pct00028
포스페이트 에스테르의 경우에는, 모노 또는 비스의 가능성이 있으며, 둘 다 본 발명에 포함된다.
본 발명의 방법에서, 용어 "항바이러스 유효량"은 환자에게서 의미있는 이점, 즉 HIV 감염의 억제를 특징으로 하는 급성 상태의 치유를 나타내는데 충분한, 이 방법의 각각의 활성성분의 총량을 의미한다. 단독으로 투여된 개별적인 활성성분에 적용하는 경우에, 이 용어는 그 성분 단독의 양을 의미한다. 배합물에 적용하는 경우에, 이 용어는 배합물로, 연속적으로 또는 동시에 투여하든지 치료학적 효과를 제공하는 활성성분의 배합량을 의미한다. 본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 것으로 용어 "치료하다, 치료하는, 치료"는 HIV 감염과 연관된 질환을 예방 또는 개선시키는 것을 의미한다.
본 발명은 또한, 화합물과 AIDS의 치료에 유용한 하나 이상의 약제와의 배합물에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 이하의 표에 제시된 것과 같은 AIDS 항바이러스제, 면역조절제, 항감염제 또는 백신의 유효량과 함께 노출-전 및/또는 노출-후의 어떤 기간에든 효과적으로 투여될 수 있다.
항바이러스제
약물명 제조자 적응증
097 획스트(Hoechst)/
바이엘 (Bayer)		 HIV 감염, AIDS, ARC (비-뉴클레오사이드 역전사효소 (RT) 억제제)
암프레나비르 (Amprenavir)
141 W94 / GW 141		 글락소 웰컴
(Glaxo Wellcome)		 HIV 감염, AIDS, ARC (프로테아제 억제제)
아바카비르 (Abacavir) (1592U89) GW 1592 글락소 웰컴
 HIV 감염, AIDS, ARC (프로테아제 억제제)
아세만난 (Acemannan) 캐링톤 랩 (Carrington Labs, Irving, TX) ARC
아사이클로비르 (Acyclovir) 브로우 웰컴
(Burroughs Wellcome)		 HIV 감염, AIDS, ARC,
AZT와 병용
AD-439 타녹스 바이오시스템즈
(Tanox Biosystems)		 HIV 감염, AIDS, ARC
AD-519 타녹스 바이오시스템즈 HIV 감염, AIDS, ARC
아데포비르 디피복실 (Adefovir dipivoxil) AL-721 질리드 사이언시즈 (Gilead Sciences) 에티젠
(Ethigen, Los Angeles, CA)		 HIV 감염 ARC, PGL HIV 양성, AIDS
알파 인터페론 (Alpha Interferon) 글락소 웰컴 카포시 육종, HIV
레트로비르 (Retrovir)와 병용
안사마이신 (Ansamycin)
LM 427		 아드리아 래보래토리즈 (Adria Laboratories, Dublin, OH)
에바몬트 (Erbamont, Stamford, CT)		 ARC
pH 불안정성 알파 변형 인터페론을 중화시키는 항체 어드밴스드 바이오테라피 컨셉트 (Advanced Biotherapy Concepts, Rockville, MD) AIDS, ARC
AR177 아로넥스 팜 (Aronex Pharm) HIV 감염, AIDS, ARC
베타-플루오로-ddA 내쇼날 캔서 인스티튜트 (Nat'l Cancer Institute) AIDS-연관된 질환
BMS-232623
(CGP-73547)		 브리스톨-마이어스 스퀴브 (Bristol-Myers Squibb)/
노바티스 (Norvatis)		 HIV 감염, AIDS, ARC (프로테아제 억제제)
BMS-234475
(CGP-61755)		 브리스톨-마이어스 스퀴브/
노바티스		 HIV 감염, AIDS, ARC (프로테아제 억제제)
CI-1012 워너-램버트 (Warner-Lambert) HIV-1 감염
시도포비르 (Cidofovir) 질리드 사이언시즈 CMV 망막염, 헤르페스,
파필로마바이러스
커들란 설페이트 (Curdlan sulfate) AJI 파르마 (Pharma) USA HIV 감염
사이토메갈로바이러스
면역 글로빈		 메드이뮨 (MedImmune) CMV 망막염
사이토벤 (Cytovene) 신텍스 (Syntex) 시력 악화 (sight threatening)
간시클로비르 (Ganciclovir) CMV
말초 CMV 망막염
델라비리딘 (Delaviridine) 파마시아-업죤 (Pharmacia-Upjohn) HIV 감염, AIDS, ARC (RT 억제제)
덱스트란 설페이트 우에노 파인 켐 인더스트리 리미티드 (Ueno Fine Chem. Ind. Ltd., Osaka, Japan) AIDS, ARC, HIV
양성
무증후성
ddC
디데옥시시티딘		 호프만-라 로슈
(Hoffman-La Roche)		 HIV 감염, AIDS,
ARC
ddI
디데옥시이노신		 브리스톨-마이어스 스퀴브
(Bristol-Myers Squibb)		 HIV 감염, AIDS, ARC;
AZT/d4T와의 배합
DMP-450 AVID (Camden, NJ) HIV 감염, AIDS, ARC
(프로테아제 억제제)
에파비렌즈 (Efavirenz)
(DMP 266) (-)6-클로로-4-(S)-사이클로프로필에티닐-4(S)-트리플루오로메틸-1,4-디하이드로-2H-3,1-벤즈옥사진-2-온, 스토크린 (STOCRINE)		 듀퐁 머크
(DuPont Merck)		 HIV 감염, AIDS, ARC
(비-뉴클레오사이드 RT 억제제)
EL10 엘란 코포레이션, 피엘씨
(Elan Corp, PLC, Gainesville, GA)		 HIV 감염
팜시클로비르 (Famciclovir) 스미스 클라인
(Smith Kline)		 대상포진,
단순포진
FTC 에모리 유니버시티
(Emory University)		 HIV 감염, AIDS, ARC
(역전사효소 억제제)
GS 840 질리드 (Gilead) HIV 감염, AIDS, ARC
(역전사효소 억제제)
HBY097 획스트 마리온 러셀
(Hoechst Marion Roussel)		 HIV 감염, AIDS, ARC (비-뉴클레오사이드 역전사효소 억제제)
하이페리신
(Hypericin)		 빔알엑스 파마
(VIMRx Pharm.)		 HIV 감염, AIDS, ARC
재조합 인간 인터페론 베타 트리톤 바이오사이언시즈 (Triton Biosciences, Almeda, CA) AIDS, 카포시 육종, ARC
인터페론 알파-n3 인터페론 사이언시즈
(Interferon Sciences)		 ARC, AIDS
인디나비르 (Indinavir) 머크 (Merck) HIV 감염, AIDS, ARC, 무증후성 HIV 양성, 또한 AZT/ddI/ddC와 배합.
이시스 (ISIS) 2922 이시스 파마슈티칼스
(ISIS Pharmaceuticals)		 CMV 망막염
KNI-272 내쇼날 캔서 인스티튜트 HIV-연관된 질환
라미부딘 (Lamivudine),
3TC		 글락소 웰컴 HIV 감염, AIDS, ARC (역전사효소 억제제); 또한 AZT와 병용
로부카비르 (Lobucavir) 브리스톨-마이어스 스퀴브 CMV 감염
넬피나비르 (Nelfinavir) 아고우론 파마슈티칼스
(Agouron Pharmaceuticals)		 HIV 감염, AIDS, ARC
(프로테아제 억제제)
네비라핀 (Nevirapine) 베링거 인겔하임
(Boehringer Ingelheim)		 HIV 감염, AIDS, ARC
(RT 억제제)
노바프렌 (Novapren) 노바페론 랩 인코포레이티드 (Novaferon Labs, Inc., Akron, OH) HIV 억제제
펩타이드 T
옥타펩타이드 서열		 페닌술라 랩 (Peninsula Labs, Belmont, CA) AIDS
트리나트륨
포스포노포르메이트		 아스트라 팜 프로덕츠 인코포레이티드 (Astra Pharm. Products, Inc.) CMV 망막염, HIV 감염,
그 밖의 다른 CMV 감염
PNU-140690 파마시아 업죤 HIV 감염, AIDS, ARC
(프로테아제 억제제)
프로부콜 (Probucol) 바이렉스 (Vyrex) HIV 감염, AIDS
RBC-CD4 쉐필드 메드 테크
(Sheffield Med. Tech, Houston, TX)		 HIV 감염, AIDS, ARC
리토나비르 (Ritonavir) 애보트 (Abbott) HIV 감염, AIDS, ARC
(프로테아제 억제제)
사퀴나비르 (Saquinavir) 호프만-라로슈
(Hoffmann-LaRoche)		 HIV 감염, AIDS, ARC
(프로테아제 억제제)
스타부딘 (Stavudine); d4T
디데하이드로데옥시-티미딘		 브리스톨-마이어스 스퀴브 HIV 감염, AIDS, ARC
발라시클로비르
(Valaciclovir)		 글락소 웰컴 생식기 HSV 및 CMV 감염
바이라졸 (Virazole)
리바비린 (Ribavirin)		 바이라텍 (Viratek)/ICN
(Costa Mesa, CA)		 무증후성 HIV 양성
LAS, ARC
VX-478 베르텍스 (Vertex) HIV 감염, AIDS, ARC
잘시타빈 (Zalcitabine) 호프만-라로슈 HIV 감염, AIDS, ARC
AZT와 병용
지도부딘 (Zidovudine);
AZT		 글락소 웰컴 HIV 감염, AIDS, ARC, 카포시 육종, 그 밖의 다른 치료법과 병용
하이페리신
(Hypericin)		 빔알엑스 파마
(VIMRx Pharm.)		 AIDS, ARC
테노포비르 디소프록실 (Tenofovir disoproxil),
푸마레이트 염 (Viread®)		 질리드 HIV 감염, AIDS
(역전사효소 억제제)
엠트리바 (Emtriva®)
(엠트리시타빈)		 질리드 HIV 감염, AIDS
(역전사효소 억제제)
콤비비르 (Combivir®) GSK HIV 감염, AIDS
(역전사효소 억제제)
아바카비르 (Abacavir) 석시네이트 (또는 Ziagen®) GSK HIV 감염, AIDS
(역전사효소 억제제)
레야타즈 (Reyataz®)
(또는 아타자나비르)		 브리스톨-마이어스 스퀴브 HIV 감염, AIDs, 프로테아제 억제제
푸제온 (Fuzeon®)
(또는 T-20)		 로슈 (Roche) / 트리메리스 (Trimeris) HIV 감염, AIDs,
바이러스 융합 억제제
렉시바 (Lexiva®)
(또는 포스암프레나비르 칼슘)		 GSK / 베르텍스 HIV 감염, AIDS
바이러스 프로테아제 억제제
면역조절제
약물명 제조자 적응증
AS-101 와이어스-아이어스트
(Wyeth-Ayerst)		 AIDS
브로피리민 (Bropirimine) 파마시아 업죤 진행된 AIDS
아세만난 캐링톤 랩, 인코포레이티드
(Irving, TX)		 AIDS, ARC
CL246,738 아메리칸 시아나미드
(American Cyanamid)
레더럴 랩 (Lederle Labs)		 AIDS, 카포시 육종
FP-21399 푸키 이뮤노팜
(Fuki ImmunoPharm)		 CD4+ 세포와의 HIV 융합을 차단
감마 인터페론 제넨텍
(Genentech)		 ARC, TNF와 병용 (종양괴사인자)
과립구 대식세포 콜로니
자극인자		 제네틱스 인스티튜트 (Genetics Institute)
산도즈 (Sandoz)		 AIDS
과립구 대식세포 콜로니
자극인자		 훽스트-러셀 (Hoechst-Roussel)
임뮤넥스 (Immunex)		 AIDS
과립구 대식세포 콜로니
자극인자		 쉐링-플라우
(Schering-Plough)		 AIDS,
AZT와 병용
HIV 코어 입자 면역촉진제 로러 (Rorer) 혈청양성 HIV
IL-2
인터류킨-2		 세투스
(Cetus)		 AIDS,
AZT와 병용
IL-2
인터류킨-2		 호프만-라로슈
임뮤넥스		 AIDS, ARC, HIV
AZT와 병용
IL-2
인터류킨-2 (알데슬루킨)		 치론
(Chiron)		 AIDS, CD4 세포수의 증가
면역 글로불린
정맥내 (인간)		 커터 바이올로지칼
(Cutter Biological, Berkeley, CA)		 소아과 AIDS,
AZT와 병용
IMREG-1 임레그 (Imreg,
New Orleans, LA)		 AIDS, 카포시 육종, ARC, PGL
IMREG-2 임레그 (Imreg,
New Orleans, LA)		 AIDS, 카포시 육종, ARC, PGL
이뮤티올 디에틸 디티오
카바메이트		 메리욱스 인스티튜트
(Merieux Institute)		 AIDS, ARC
알파-2 인터페론 쉐링 플라우 카포시 육종
AZT와 병용, AIDS
메티오닌-엔케팔린 TNI 파마슈티칼스
(Chicago, IL)		 AIDS, ARC
MTP-PE
뮤라밀-트리펩타이드		 시바-가이기 코포레이션
(Ciba-Geigy Corp.)		 카포시 육종
과립구 콜로니 자극인자 암젠 (Amgen) AIDS, AZT와 병용
레뮨
(Remune)		 이뮨 리스폰스 코포레이션
(Immune Response Corp.)		 면역요법제
rCD4
재조합 가용성 인간 CD4		 제넨텍
(Genentech)		 AIDS, ARC
rCD4-IgG 하이브리드 AIDS, ARC
재조합 가용성 인간 CD4 바이오젠 (Biogen) AIDS, ARC
인터페론 알파 2a 호프만-라로슈 카포시 육종, AIDS, ARC,
AZT와 병용
SK&F106528
가용성 T4		 스미스 클라인
(Smith Kline)		 HIV 감염
티모펜틴
(Thymopentin)		 임뮤노비올로지 리서치 인스티튜트 (Immunobiology Resarch Institute, Annandale, NJ) HIV 감염
종양괴사인자; TNF 제넨텍 ARC, 감마 인터페론과 병용
항감염제
약물명 제조자 적응증
프리마퀸과 함께
클린다마이신		 파마시아 업죤 PCP
플루코나졸 화이자 (Pfizer) 크립토코커스 수막염, 칸디다증
파스틸 (Pastille)
나이스타틴 파스틸		 스퀴브 코포레이션
(Squibb Corp.)		 경구적 칸디다증의 예방
오르니딜 에플로니틴
(Ornidyl Eflornithine)		 메렐 다우
(Merrell Dow)		 PCP
펜타미딘 이세티오네이트
(IM & IV)		 리포메드
(LyphoMed, Rosemont, IL)		 PCP 치료
트리메토프림
(Trimethoprim)		 항균제
트리메토프림/설파 항균제
피리트렉심 (Piritrexim) 보로우 웰컴 PCP 치료
흡입용 펜타미딘 이세티오네이트 피존스 코포레이션
(Fisons Corporation)		 PCP 예방
스피라마이신 롱-프랑
(Rhone-Poulenc)		 크립토스포리디아 설사
인트라코나졸-
R51211		 얀센-팜.
(Janssen-Pharm.)		 히스토플라스마증;
크립토코커스 수막염
트리메트렉세이트
(Trimetrexate)		 워너-램버트
(Warner-Lambert)		 PCP
다우노루비신
(Daunorubicin)		 넥스타 (NeXstar),
세쿠스 (Sequus)		 카포시 육종
재조합 인간
에리트로포이에틴		 오르토 팜. 코포레이션
(Ortho Pharm. Corp.)		 AZT 치료법과 연관된 중증의 빈혈
재조합 인간 성장호르몬 세로노 (Serono) AIDS-관련된 쇠약, 악액질
메제스트롤 아세테이트 브리스톨-마이어스 스퀴브 AIDS와 연관된 식욕부진의 치료
테스토스테론 알자 (Alza)
스미스 클라인		 AIDS-관련된 쇠약
총 장내영양 노르위치 이튼 파마슈티칼스
(Norwich Eaton Pharmaceuticals)		 AIDS-관련된 설사 및
흡수불량
추가로, 본 발명의 화합물은 HIV 도입 억제제라 불리는 또 다른 부류의 AIDS 치료제와 병용하여 사용될 수 있다. 이러한 HIV 도입 억제제의 예는 문헌 (DRUGS OF THE FUTURE 1999, 24(12), pp. 1355-1362; CELL, Vol. 9, pp. 243-246, Oct. 29, 1999; 및 DRUG DISCOVERY TODAY, Vol. 5, No. 5, May 2000, pp. 183-194 및 Inhibitors of the entry of HIV into host cells, Meanwell, Nicholas A.; Kadow, John F. Current Opinion in Drug Discovery & Development (2003), 6(4), 451-461)에 언급되어 있다. 구체적으로, 화합물은 그 밖의 다른 부착 억제제, 융합 억제제, 및 CCR5 또는 CXCR4 공동수용체를 목적으로 하는 케모킨 수용체 길항제와 병용하여 이용될 수 있다.
본 발명의 화합물과 AIDS 항바이러스제, 면역조절제, 항감염제, HIV 도입 억제제 또는 백신과의 배합물의 범위는 상기 표의 리스트로 제한되지 않으며, 원칙적으로 AIDS의 치료에 유용한 어떤 약제학적 조성물과의 배합물도 포함되는 것으로 이해될 수 있다.
바람직한 배합물은 본 발명의 화합물 및 HIV 프로테아제의 억제제 및/또는 HIV 역전사효소의 비-뉴클레오사이드 억제제에 의한 동시 또는 교대성 치료이다. 배합물 내의 임의의 4번째 성분은 AZT, 3TC, ddC 또는 ddI와 같은 HIV 역전사효소의 뉴클레오사이드 억제제이다. HIV 프로테아제의 바람직한 억제제는 레야타즈 (Reyataz™; 활성성분 아타자나비르)이다. 일반적으로, 300 내지 600 ㎎의 용량이 하루에 한번 투여된다. 이것은 저용량의 리토나비르 (Ritonavir)(50 내지 500 mgs)와 함께 공동-투여될 수 있다. HIV 프로테아제의 또 다른 바람직한 억제제는 칼레트라 (Kaletra™)이다. HIV 프로테아제의 또 다른 유용한 억제제는 N-(2(R)-하이드록시-1-(S)-인다닐)-2(R)-페닐메틸-4-(S)-하이드록시-5-(1-(4-(3-피리딜-메틸)-2(S)-N'-(t-부틸카복스아미도)-피페라지닐))-펜탄아미드 에탄올레이트의 설페이트 염이며, U.S. 5,413,999에 따라 합성되는 인디나비르 (indinavir)이다. 인디나비르는 일반적으로 1일에 3회, 800 ㎎의 용량으로 투여된다. 그 밖의 다른 바람 직한 프로테아제 억제제는 넬피나비르 (nelfinavir) 및 리토나비르 (ritonavir)이다. HIV 프로테아제의 또 다른 바람직한 억제제는 600 또는 1200 ㎎의 용량으로 tid로 투여되는 사퀴나비르 (saquinavir)이다. HIV 역전사효소의 바람직한 비-뉴클레오사이드 억제제로는 에파비렌즈 (efavirenz)가 포함된다. ddC, ddI 및 AZT의 제제는 또한 EPO 0,484,071에 기술되어 있다. 이들 배합물은 HIV 감염의 확산 및 정도를 제한하는데 대한 예상치 못한 효과를 가질 수 있다. 바람직한 배합물에는 다음의 (1) 인디나비르와 에파비렌즈, 및 임의로 AZT 및/또는 3TC 및/또는 ddI 및/또는 ddC; (2) 인디나비르, 및 AZT 및/또는 ddI 및/또는 ddC 및/또는 3TC, 특히 인디나비르 및 AZT 및 3TC; (3) 스타부딘 및 3TC 및/또는 지도부딘; (4) 지도부딘 및 라미부딘 및 141W94 및 1592U89; (5) 지도부딘 및 라미부딘과의 배합물이 포함된다.
이러한 배합물에서, 본 발명의 화합물 및 그 밖의 다른 활성제는 별도로 또는 함께 투여될 수 있다. 또한, 하나의 성분의 투여는 다른 약제(들)의 투여의 전에, 동시에 또는 이어서 이루어질 수 있다.
약어
대부분이 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있는 통상적인 약어인 이하의 약어들이 본 발명의 설명 및 실시예 전체에 걸쳐서 사용된다. 사용된 약어들 중의 일부는 다음과 같다:
h = 시간
r.t. = 실온
mol = 몰
mmol = 밀리몰
g = 그램
㎎ = 밀리그램
㎖ = 밀리리터
TFA = 트리플루오로아세트산
DCE = 1,2-디클로로에탄
CH2Cl2 = 디클로로메탄
TPAP = 테트라프로필암모늄 퍼루테네이트
THF = 테트라하이드로푸란
DEPBT = 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온
DMAP = 4-디메틸아미노피리딘
P-EDC = 폴리머 지지된 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드
EDC = 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드
DMF = N,N-디메틸포름아미드
휴니그 염기 (Hunig's base) = N,N-디이소프로필에틸아민
MCPBA = 메타-클로로퍼벤조산
아자인돌 = 1H-피롤-피리딘
4-아자인돌 = 1H-피롤로[3,2-b]피리딘
5-아자인돌 = 1H-피롤로[3,2-c]피리딘
6-아자인돌 = 1H-피롤로[2,3-c]피리딘
7-아자인돌 = 1H-피롤로[2,3-b]피리딘
4,6-디아자인돌 = 5H-피롤로[3,2-d]피리미딘
5,6-디아자인돌 = 1H-피롤로[2,3-d]피리다진
5,7-디아자인돌 = 7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
PMB = 4-메톡시벤질
DDQ = 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논
OTf = 트리플루오로메탄설포닐옥시
NMM = 4-메틸모르폴린
PIP-COPh = 1-벤조일피페라진
NaHMDS = 나트륨 헥사메틸디실라지드
EDAC = 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드
TMS = 트리메틸실릴
DCM = 디클로로메탄
DCE = 디클로로에탄
MeOH = 메탄올
THF = 테트라하이드로푸란
EtOAc = 에틸 아세테이트
LDA = 리튬 디이소프로필아미드
TMP-Li = 2,2,6,6-테트라메틸피페리디닐 리튬
DME = 디메톡시에탄
DIBALH = 디이소부틸알루미늄 하이드라이드
HOBT = 1-하이드록시벤조트리아졸
CBZ = 벤질옥시카보닐
PCC = 피리디늄 클로로크로메이트
TRIS = 트로메타민 또는 2-아미노-2-(하이드록시메틸)프로판-1,3-디올
화학
본 발명은 화학식 I의 화합물, 그들의 약제학적 제제, 및 HIV 감염을 앓고 있거나, HIV 감염에 민감한 환자에게서의 그들의 용도를 포함한다.
반응식 A는 모분자 IV로부터 본 발명의 프로드럭 I을 제조하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
Figure 112006074171808-pct00029
Figure 112006074171808-pct00030
반응식 A에 나타낸 바와 같은 방법을 상세히 설명하기 위해서, 문제의 화학식 IV의 항바이러스성 모화합물은 나트륨 하이드라이드, 칼륨 하이드라이드, 나트륨 아미드, 나트륨 t-부톡사이드, 나트륨 (비스트리메틸실릴)아미드, 칼륨 (비스 트리메틸실릴) 아미드, 또는 나트륨 하이드라이드 + 나트륨 비스 (트리메틸실릴) 아미드와 같은 이들의 배합물과 같은 적합한 염기의 존재하에서 클로라이드 중간체 III과의 N-알킬화 반응에 의해서 포스페이트 중간체 II로 전환시킨다. 시약 III의 제조 및 알킬화 하이드록시기에 의해서 프로드럭을 제조하는데 사용되는 방법은 그대로 참고로 포함되어 있는 미국 특허 제 6,362,172B2 호 (Y. Ueda et al.)에 기술되어 있다. 알킬화 조건, 보호기, 보호기 제거, 및 염 형성을 위한 조건은 본 발명이 하이드록시기가 아니라 인돌 환 내의 아자인돌을 알킬화시킨다는 사실에도 불구하고 본 출원에 일반적으로 적용할 수 있다. 본 출원에서는 1.1 내지 5.0 당량의 염기가 이용될 수 있으며, 2 내지 4 당량이 바람직하다. 1.1 내지 12 당량의 시약 III이 사용될 수 있으며, 기질에 따라서 5 내지 10 당량이 바람직하다. 시약은 한꺼번에 또는 시간이 경과함에 따라 몇 부분으로 나누어 증량식으로 첨가될 수 있다. 요오다이드 이온의 공급원은 통상적으로 증가된 수율을 제공하기 위해서 반응에 첨가될 수 있다. 요오다이드 공급원으로는 현재 요오드 원소가 바람직하다. 알킬화되는 아자인돌/인돌 NH 당, 0.1 내지 1.5 당량의 요오드가 통상적으로 사용되며, 1.0 내지 1.2 당량의 요오드가 바람직한데, 이는 수율이 최고이기 때문이다. 요오드의 대체 공급원에는 예를 들어, 나트륨 요오다이드, 리튬 요오다이드, 세슘 요오다이드, 구리 요오다이드, 또는 테트라부틸 암모늄 요오다이드가 포함된다. 요오드의 기능은 아마도 클로로메틸 시약 III으로부터 동일계 내에서 상응하는 요오도메틸 시약 IIIa를 생성시키는 것일 것이다. III에 상응하는 요오도 또는 브로모 시약이 클로라이드 III 대신에 반응에서 직접 사용될 수도 있다. 단계 A의 알킬화 반응은 통상적으로 약 0℃ 내지 50℃, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 40℃의 온도에서 테트라하이드로푸란과 같은 불활성 유기용매 중에서 수행된다. 메틸 테트라하이드로푸란, 메틸 t-부틸 에테르, 디옥산, 에틸렌 글리콜 디메틸 에테르, 디메틸 아세트아미드 또는 N,N-디메틸포름아미드와 같은 그 밖의 다른 무수 유기용매도 또한 유용성을 가질 수 있다. 그 후, 에스테르 중간체 II를 통상적인 탈보호 단계에 적용하여 보호기 Pr을 제거한다. 이러한 단계에서 사용되는 시약은 사용되는 보호기에 따라서 달라질 수 있으며, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있다. 가장 바람직한 보호기는 t-부틸기이며, 이것은 적절한 불활성 유기용매 중에서 트리플루오로아세트산, 염산 또는 포름산에 의해서 제거될 수 있다. 불활성 용매는 디클로로메탄, 또는 가능하게는 예를 들어, 디클로로에탄, 톨루엔 또는 트리플루오로메틸 벤젠일 수 있다. 메틸렌 클로라이드 중에서 트리플루오로아세트산 탈보호반응은 1 내지 15 당량의 산 (또는 산은 예를 들어, 용매 중의 5 용량% 용액으로 다르게 측정될 수 있다) 및 0℃ 내지 40℃의 온도를 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 더 과량의 TFA가 사용될수록 이용되는 온도는 더 낮다. 정확한 조건은 기질에 따라서 변화한다. 단계 3은 본 기술분야에서 잘 알려져 있는 다수의 표준방식에 의해서 형성될 수 있는 유리산 또는 염의 분리에 대해 기술한 것이다. 일반적으로, TFA 탈보호반응에 이어서 수성 후처리가 사용되는데, 여기에 서는 과량의 산을 염기로 중화시키고, 유기 불순물은 에틸 아세테이트 또는 디클로로메탄과 같은 유기용매로 추출함으로써 제거한다. 예를 들어, 과량의 수성 NaOH를 사용하여 반응혼합물을 염기화시킬 수 있다. 이것은 본 기술분야에서 숙련된 어떤 화학자에게도 잘 알려져 있다. 수성상을 수성 1 N HCl을 사용하여 pH 2.5로 재산성화시킨 다음에, 유기용매로 추출하고 진공 중에서 용매를 제거한 후에 유리산을 제공할 수 있다. 유리산은 물, 메탄올, 에탄올 등과 같은 용매 중에서 적절한 염기를 첨가함으로써 무기 염기로 전환시킬 수 있다. 예를 들어, 포스페이트 프로드럭의 수용액에 탄산나트륨을 첨가하고, pH를 약 7.6으로 조정하여 용액을 수득하고, 이것은 동결건조에 의해서 물을 제거함으로써 프로드럭의 디나트륨 염을 남긴다. 중탄산나트륨 또는 중탄산칼륨의 수용액이 유사하게 사용될 수 있다. 모노 칼륨 또는 모노 나트륨 염은 포스페이트 산용액을 칼륨 또는 나트륨 2-에틸 헥사노에이트로 주의해서 적정함으로써 생성될 수 있다. 아민 염은 유리산을 에틸 아세테이트 또는 아세토니트릴 또는 저분자량 알콜 또는 임의로 물을 함유하는 이들 용매의 혼합물과 같은 유기용매에 유리산을 용해시킴으로써 생성될 수 있다. 염 형성에 잠재적으로 유용한 일부의 아민에는 저급 알킬아민 (메틸아민, 에틸아민, 사이클로헥실아민 등) 또는 치환된 저급 알킬아민 (예를 들어, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 또는 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄과 같은 하이드록실-치환된 알킬아민), 라이신, 아르기닌, 히스티딘, N-메틸글루카민, 또는 피페리딘 또는 모르폴린과 같은 염기가 포함된다. 저온에서 교반하는 용액에 아민을 서서히 첨가하여 화학량론에 따라서 모노 또는 비스 아민 염을 제공할 수 있다. 아민 염은 또 한, 재결정화 또는 침전이 아니라 용액을 교반하고 용매를 진공 중에서 제거함으로써 수득할 수도 있다. 재결정화 과정은 화합물 및 염에 따라서 달라질 수 있지만, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 이용할 수 있다. 반응식 B는 반응식 A에 나타낸 일반적 순서를 수행하기 위한 바람직한 순서 및 시약과 조건의 셋트를 도시한 것이다. 대신으로 대부분의 경우에, 디에스테르를 탈보호시켜 동일계에서 중간체 산을 제공하고, 이어서 반응매질 중에서 염을 형성시키는 것을 포함하는 단계 C에서 순서를 수행하는 바람직한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 물 및 예를 들어, 아세톤, 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올과 같은 수혼화성 공용매의 혼합물 중에서 디에스테르 II를 가열하여 반응매질 중에서 (동일계에서) 화학식 I의 유리산을 생성할 수 있다. 바람직한 용매는 아세톤 및 이소프로판올이다. 주위온도와 용매의 비점 사이의 온도가 이용될 수 있다. 일반적으로 40℃ 내지 60℃가 바람직한 범위이다. 물 및 공용매 중에서 유리산을 함유하는 반응혼합물에 염기 또는 더욱 바람직하게는 상술한 바와 같은 아민을 첨가하여 직접 염을 생성시킬 수 있다. 적절한 조건이 선택되면, 염은 반응매질로부터 직접적으로 결정화시키거나 침전시키고, 여과 및 건조에 의해서 분리시킬 수 있다. 구체적인 예는 실험항목에 포함되어 있다.
중간체 IIa, IIb 및 IIc 및 산 Iac, Ibc 및 Ic의 바람직한 제조방법은 탐구적인 조사 노력 중에 IIa, IIb 및 IIc의 제조를 위해서 초기에 사용된 방법에 비해서 다수의 유의적인 이점을 제공한다. 3 가지 중간체 모두를 제조하기 위한 일차적 발견 경로는 10 배 과량의 고가이며 잠재적으로 유해한 클로로 요오도메탄과 반 응하는 비교적 고가의 테트라부틸암모늄 디 tert-부틸 포스페이트의 사용을 필요로 하는 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트의 제조를 사용하였다. 과량의 휘발성 물질 및 요오도메탄을 진공 중에서 제거하여 조 시약을 제공하고, 이것은 더 정제하지 않고 사용되었다. 적어도 5 배 과량의 이 시약을 사용하여 화합물 IV와 반응시켰으며, 이것은 IVa, b 또는 c의 양에 비해서 적어도 5 당량의 테트라부틸암모늄 포스페이트 및 50 당량의 클로로요오도메탄이 사용되었음을 의미한다. 또한, 이 시약에 의한 화합물 IV의 알킬화는 염기로서 NaH 및 알킬화를 촉진시키기 위한 첨가제로서 요오드를 사용하여 달성되었다. 이들 조건은 주생성물로서 목적하는 화합물 II, 및 특히 증가 스케일의 반응 상에서 지루하고 시간 소모적이며 비용이 많이 드는 실리카겔 크로마토그라피를 사용하여 제거되는 부산물을 함유하는 반응혼합물을 생성시켰다. 부산물 제거의 실패는 다음 단계인 보호기의 제거단계로부터, 합리적인 수율 또는 시간 구조로 만족스러운 방식으로 제거하기가 매우 어려운 불순물을 함유하는 생성물 I을 생성하였다.
디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트의 개선된 제조방법은 덜 비싼 디-tert-부틸 칼륨 포스페이트, 및 다른 반응물인 클로로메틸 설포닐 클로라이드에 비해서 단지 약 2 배 과량의 이 시약을 이용한다. 이 방법에 의해서 제조된 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트는 편리한 증류에 의해서 순수한 형태로 분리된다.
IVa를 IIa로 전환시키기 위해서는, 단지 1.2 당량의 이 시약을 사용하여 화합물 IV를 알킬화시켰다. 또한, 덜 반응성이고 경제적인 염기인 탄산칼륨을 DMSO와 함께 사용하여 알킬화 반응을 수행하였으며, 여기에서는 생성된 화합물 II가 충 분히 부산물을 함유하지 않아서 이들은 크로마토그라피 정제가 없이 탈보호 반응을 위한 투입물 (input)로서 사용될 수 있다. 유리산 Iac 또는 Iab와 같은 염은 예를 들어, 크로마토그라피가 없이 이 방식으로 제조된 IIa로부터 순수한 형태로 수득될 수 있다.
IVa보다 더 느리게 반응하는 화합물 IIb 및 IIc의 합성을 위해서는 2 내지 2.5 당량의 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트가 사용되었으며, 변형된 조건 (용매인 NMP 중에서 KI와 함께 염기로서 탄산세슘)을 사용하여 IVb 및 IVc를 알킬화시켰으며, 각각 IIb 및 IIc로의 높은 전환율을 실현시켰다.
또한, 새로운 조건은 화합물 II를 충분한 순도로 제공함으로써 이들으 크로마토그라피 정제에 대한 필요가 없이 화합물 I을 생성하는데 사용될 수 있도록 하였다. 따라서, 새로운 조건은 본 발명의 화합물 I을 제조하기 위해서 필요한 시약의 양 및 화학량론을 감소시키며, 중간체 II의 크로마토그라피 정제에 대한 필요성을 회피한다. 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트를 제조하기 위해서 사용된 출발물질은 더 경제적이고 덜 유해하며, 최종 생성물은 고순도로 생산된다. 마지막으로, IVa, IVb 및 IVc를 알킬화시키기 위해서 개발된 조건은 과량으로 사용된 반응성이고 가연성인 수소화나트륨 염기에 대한 필요성을 배제하며, 탄산칼륨 또는 탄산세슘을 사용한다.
알킬화 단계에서는 M2CO3 (M은 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐 또는 세슘이다)와 같은 적합한 염기가 사용될 수 있다. IVa를 IIa로 전환시키기 위해서는 K2CO3가 바람직하다 (IVa의 몰당, 1-5 몰당량, 바람직하게는 2 몰당량). IVb를 IIb로 또는 IVc를 IIc로 전환시키기 위해서는 탄산세슘이 바람직하다.
또한, 디메틸설폭사이드, N-디메틸포름아미드, 아세톤, 아세토니트릴, N-메틸피롤리디논, 포름아미드, 테트라하이드로푸란 등과 같은 적합한 용매가 필요하며 (2-50 ㎖/IV의 그램, 바람직하게는 5 ㎖/그램); IVa를 IIa로 전환시키는데는 디메틸설폭사이드가 바람직하고; IVb를 IIb로 또는 IVc를 IIc로 전환시키는데는 N-메틸피롤리디논이 바람직하다.
적합한 용매 요오드 공급원으로는 MI (M은 예를 들어, 리튬, 나트륨, 칼륨, 요오드, 테트라하이드로푸란 등이다)가 포함되나, 이들로 제한되지는 않으며; 요오드화칼륨이 바람직하다 (0.1-5 몰당량/화합물 IV의 몰; 바람직하게는 2 당량).
알킬화제인 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트는 IV의 몰당, 1-10 몰당량으로 사용될 수 있으며; 약 1.2 몰당량이 바람직하다.
반응온도는 10-60℃ (바람직하게는 30℃)일 수 있다.
탈보호 단계에서, 두개의 tert-부틸기가 IIa로부터 제거되어 Iac를 형성시키는 경우에, 이 반응은 디클로로메탄 (바람직함), 디클로로에탄, 클로로포름, 사염화탄소, 톨루엔, 벤젠 등과 같은 적합한 용매 (2-50 ㎖/IV의 그램, 바람직하게는 10 ㎖/그램)의 존재 하에서 수행된다.
IIb 및 IIc를 탈보호시켜 Ibc 및 Ic를 각각 수득하기 위해서는 이 반응은 약 40℃의 온도에서 아세톤/물 중에서 수행된다.
추가로, IIa의 탈보호 중에는 트리플루오로아세트산 (바람직함), 염산, 황산 등과 같은 산 (IVa를 기준으로 하여 2-100 몰당량, 바람직하게는 15 몰당량)이 존재하도록 하는 것이 바람직하다.
화학
일반론:
출발물질 및 전구체의 추가의 제조방법은 그대로 참고로 포함된 2002년 11월 5일자 미국 특허 제 6,476,034 호 (Wang et al.)에 포함되어 있다.
모든 액체 크로마토그라피 (LC) 데이타는 SPD-10AV UV-Vis 검출기를 사용하여 시마주 (Shimadzu) LC-10AS 액체 크로마토그라프 상에 기록하였으며, 질량분광분석 (Mass Spectrometry; MS) 데이타는 전자스프레이 모드로 LC에 대한 미이크로매스 플랫폼 (Micromass Platform)을 사용하여 측정되었다.
LC / MS 방법 (즉, 화합물 동정)
칼럼 A: YMC ODS-A S7 3.0×50 ㎜ 칼럼
칼럼 B: PHX-LUNA C18 4.6×30 ㎜ 칼럼
칼럼 C: XTERRA ms C18 4.6×30 ㎜ 칼럼
칼럼 D: YMC ODS-A C18 4.6×30 ㎜ 칼럼
칼럼 E: YMC ODS-A C18 4.6×33 ㎜ 칼럼
칼럼 F: YMC C18 S5 4.6×50 ㎜ 칼럼
칼럼 G: XTERRA C18 S7 3.0×50 ㎜ 칼럼
칼럼 H: YMC C18 S5 4.6×33 ㎜ 칼럼
칼럼 I: YMC ODS-A C18 S7 3.0×50 ㎜ 칼럼
칼럼 J: XTERRA C-18 S5 4.6×50 ㎜ 칼럼
칼럼 K: YMC ODS-A C18 4.6×33 ㎜ 칼럼
칼럼 L: Xterra MA C18 5 μM 4.6×30 ㎜ 칼럼
칼럼 M: YMC ODS-A C18 S3 4.6×33 ㎜ 칼럼
표준 LC 주행조건 (다른 식으로 언급되지 않는 한):
구배: 100% 용매 A / 0% 용매 B 내지 0% 용매 A / 100% 용매 B
용매 A = 10% MeOH - 90% H2O - 0.1% TFA, 용매 B = 90% MeOH - 10% H2O - 0.1% TFA; 및 Rt는 분으로 표시함.
구배시간: 2 분
체류시간: 1 분
유속: 5 ㎖/분
검출기 파장: 220 nm
용매 A: 10% MeOH / 90% H2O / 0.1% 트리플루오로아세트산
용매 B: 10% H2O / 90% MeOH / 0.1% 트리플루오로아세트산
대용 LC 주행조건 B:
구배: 100% 용매 A / 0% 용매 B 내지 0% 용매 A / 100% 용매 B
용매 A = 10% MeOH - 90% H2O - 0.1% TFA, 용매 B = 90% MeOH - 10% H2O - 0.1% TFA; 및 Rt는 분으로 표시함.
구배시간: 4 분
체류시간: 1 분
유속: 4 ㎖/분
검출기 파장: 220 nm
용매 A: 10% MeOH / 90% H2O / 0.1% 트리플루오로아세트산
용매 B: 10% H2O / 90% MeOH / 0.1% 트리플루오로아세트산
정제용 HPLC에 의해서 정제된 화합물을 MeOH (1.2 ㎖)로 희석하고, 상기한 바와 동일한 검출기 (SPD-10AV UV-VIS) 파장 및 용매 시스템 (A 및 B)을 사용하는 시마주 LC-10A 자동화된 정제용 HPLC 시스템 또는 시마주 LC-8A 자동화된 정제용 HPLC 시스템 상에서의 이하의 방법을 사용하여 정제하였다.
정제용 HPLC 방법 (즉, 화합물 정제)
정제방법: 20 분에 걸쳐서 초기 구배 (40% B, 60% A)에서 최종 구배 (100% B, 0% A)로 경사지며, 4 분 동안 유지시킴 (100% B, 0% A).
용매 A: 10% MeOH / 90% H2O / 0.1% 트리플루오로아세트산
용매 B: 10% H2O / 90% MeOH / 0.1% 트리플루오로아세트산
칼럼: YMC C18 S5 20×100 ㎜ 칼럼
검출기 파장: 220 nm
이하의 실험적 절차를 위해서는 표준절차로부터의 다음과 같은 HPLC 조건 또는 변형이 이용되었다:
일상적인 LC 순도를 위한 HPLC 조건:
254 nm에서의 검출; 구배 0-100% B/A; A 10% CH3CN-90% H2O-0.1% TFA, B 90% CH3CN-10% H2O-0.1% TFA; 구배시간 4 분; 칼럼 YMC ODS-AQ 또는 ORD-A 4.6×50 ㎜ 3 미크론.
LC/MS 분석을 위한 HPLC 조건:
칼럼 J: XTERRA C-18 S5 4.6×50 ㎜ 칼럼, 구배: 100% 용매 A/0% 용매 B 내지 0% 용매 A/100% 용매 B.
용매 A= 10% MeOH-90% H2O-0.1% TFA, 용매 B= 90% MeOH-10% H2O-0.1% TFA; 및 분으로서의 Rt; 구배시간: 3 분; 유속: 4 ㎖/분; 검출파장: 220 nm.
출발물질은 상업적 공급원으로부터 구입할 수 있거나, 문헌 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
모화합물 IV 의 제조:
모화합물 IV의 제조는 이하의 문헌에 이미 기술되어 있으며, 이들은 다음과 같이 모두 본 명세서에 그대로 참고로 포함되어 있다:
2002년 10월 22일자 허여된 미국 특허 제 6,469,006 호 (W.S. Blair et al);
2002년 11월 5일자 허여된 미국 특허 제 6,476,034 호 (Wang et al);
2003년 6월 3일자 허여된 미국 특허 제 6,573,262 호 (Meanwell et al);
2002년 1월 2일에 출원되고 2002년 8월 15일에 공개된 PCT WO 02/062423에 상응하는 2002년 1월 2일자 출원된 미국 특허출원 제 10/038,306 호의 부분연속출원인 2002년 8월 7일자 출원된 미국 특허출원 제 10/214,982 호의 부분연속출원인 2003년 7월 30일자 출원된 미국 특허출원 제 10/630,278 호 (Kadow et al);
2004년 6월 18일자 출원된 미국 특허출원 제 10/871,931 호 (Yeung et al);
2004년 5월 27일에 공개된 PCT WO 2004/043337에 상응하는 2004년 1월 21일자 출원된 미국 특허출원 제 10/762,108 호 (Wang et al).
선택된 상세한 절차는 이하에 제시되어 있다:
모화합물 IV 의 제조를 위한 중간체의 전형적인 제조방법
1) 아자인돌 1의 제조
Figure 112006074171808-pct00031
아자인돌의 제조, 방법 A: 7-클로로-6-아지인돌 1e의 제조: 2-클로로-3-니트로피리딘 22e (5.0 g)을 무수 THF (200 ㎖)에 용해시켰다. 용액을 -78℃로 냉각시킨 후에, 과량의 비닐 마그네슘 브로마이드 (THF 중의 1.0 M, 100 ㎖)를 첨가하였다. 그 후, 반응액을 -20℃에서 8 시간 동안 유지시킨 후에 20% NH4Cl (150 ㎖)로 켄칭하였다. 수성상을 EtOAc (3×150 ㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하여 MgSO4 상에서 건조시켰다. 여과 및 농축시킨 후에, 조생성물을 실리카겔 칼럼 크로마토 그라피에 의해서 정제하여 1.5 g의 7-클로로-6-아자인돌 1e를 31% 수율로 수득하였다.
화합물 5an, IVa 및 5ap는 다음과 같이 기술된다.
Figure 112006074171808-pct00032
화합물 1 am인 4-브로모-7-클로로-6-아자인돌 (황색 고체)은 아자인돌 1e에 대해서 사용된 것과 동일한 방법에 의해서 제조되었으며, 사용된 출발물질은 5-브로모-2-클로로-3-니트로피리딘 (Aldrich Co.로부터 입수)이었다. MS m/z: (M+H)+ C7H5BrClN2에 대한 계산치: 230.93; 실측치 231.15. HPLC 체류시간: 1.62 분 (칼럼 B).
Figure 112006074171808-pct00033
화합물 1 an (4-메톡시-7-클로로-6-아자인돌) 및 화합물 1 ao (4,7-디메톡시-6-아자인돌): MeOH (16 ㎖) 중의 4-브로모-7-클로로-6-아자인돌 (1 g), CuI (0.65 g) 및 NaOMe (4 ㎖, 25%)의 혼합물을 밀봉된 튜브 내에서 110-120℃로 16 시간 동 안 가열하였다. 주위온도로 냉각시킨 후에, 반응혼합물을 1 N HCl로 중화하여 pH 7을 수득하였다. 수용액을 EtOAc (3×30 ㎖)로 추출하였다. 그 후, 유기층을 합하여 MgSO4 상에서 건조시키고, 진공 중에서 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이것을 용출제로서 1:7 EtOAc:헥산을 사용하여 실리카겔 (50 g) 크로마토그라피 (칼럼 크기: 20 ㎜×30 ㎝)함으로써 정제하여 0.3 g의 4-메톡시-7-클로로-6-아자인돌 (백색 고체) 및 0.1 g의 4,7-디메톡시-6-아자인돌 (백색 고체)을 수득하였다.
화합물 1 an (4-메톡시-7-클로로-6-아자인돌). MS m/z: (M+H)+ C8H8ClN2O에 대한 계산치: 183.03; 실측치 183.09. HPLC 체류시간: 1.02 분 (칼럼 B).
화합물 1 ao (4,7-디메톡시-6-아자인돌). 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.28 (m, 2H), 6.63 (m, 1H), 4.14 (s, 3H), 3.95 (s, 3H). MS m/z: (M+H)+ C9H11N2O2에 대한 계산치: 179.08; 실측치 179.05. HPLC 체류시간: 1.36 분 (칼럼 B).
Figure 112006074171808-pct00034
아자인돌의 아실화 , 방법 B: 메틸 (5- 아자인돌 -3-일)- 옥소아세테이트 2b 의 제조: 5-아자인돌 (1b)(0.5 g, 4.2 mmol)을 CH2Cl2 (100 ㎖) 중의 AlCl3 (2.8 g, 21.0 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 실온에서 1 시간 동안 교반을 계속한 후에, 메틸 클로로옥소아세테이트 (2.5 g, 21.0 mmol)를 적가하였다. 반응액을 8 시간 동안 교반하였다. 20 ㎖의 MeOH를 주의해서 첨가하여 반응을 켄칭한 후에, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 고체 잔류물을 실리카겔 크로마토그라피 (EtOAc/MeOH = 10:1)에 의해서 정제하여 0.6 g (70%)의 아실화된 생성물 2b를 수득하였다
화합물 2의 특정화:
Figure 112006074171808-pct00035
화합물 2b (메틸 (5- 아자인돌 -3-일)- 옥소아세테이트): 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 9.61 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 8.59 (d, 1H, J= 6.63 Hz), 8.15 (d, 1H, J= 6.60 Hz), 4.00 (s, 3H). 13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ 178.9, 163.0, 145.6, 144.2, 138.3, 135.0, 124.7, 116.3, 112.1, 53.8. MS m/z: (M+H)+ C10H9N2O3에 대한 계산치: 205.06; 실측치 205.04. HPLC 체류시간: 0.32 분 (칼럼 A).
Figure 112006074171808-pct00036
화합물 2 ao (에틸 (4,7-디메톡시-6-아자인돌-3-일)-옥소아세테이트)는 화합물 2b에 대해서 사용된 것과 동일한 방법에 의해서 제조되었으며, 사용된 출발물질은 4,7-디메톡시-6-아자인돌이었다. 화합물은 용출제로서 2:3 EtOAc:헥산을 사용하는 실리카겔 크로마토그라피에 의해서 정제하여 황색 오일을 수득하였다: 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.50 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 4.39 (q, 2H, d= 7.05 Hz), 4.13 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 1.40 (t, 3H, d= 7.2 Hz). MS m/z: (M+H)+ C13H15N2O5에 대한 계산치: 279.10; 실측치 279.16. HPLC 체류시간: 1.28 분 (칼럼 B).
Figure 112006074171808-pct00037
2) 칼륨 아자인돌 -3- 글리옥실레이트 3의 제조
Figure 112006074171808-pct00038
칼륨 (7- 아자인돌 -3-일)- 옥소아세테이트 3a 의 제조: 화합물 2a (43 g, 0.21 mol) 및 K2CO3 (56.9 g, 0.41 mol)를 MeOH (200 ㎖) 및 H2O (200 ㎖)에 용해시켰다. 8 시간 후에, 용액으로부터 생성물 3a가 침전하였다. 여과하여 백색 고체로서 43 g의 화합물 3a를 90.4% 수율로 수득하였다.
화합물 3의 특정화:
화합물 3a, 칼륨 (7- 아자인돌 -3-일)- 옥소아세테이트: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.42 (d, 1H, J= 7.86 Hz), 8.26 (d, 1H, J= 4.71 Hz), 8.14 (s, 1H), 7.18 (dd, 1H, J= 7.86, 4.71 Hz); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 169.4, 148.9, 143.6, 135,1. 129.3, 118.2, 117.5, 112.9. 화합물 3a의 상응하는 산 (3a-K+H)의 MS m/z: (M+H)+ C9H7N2O3에 대한 계산치: 191.05; 실측치 190.97. HPLC 체류시간: 0.48 분 (칼럼 A).
화합물 3 ao (칼륨 (4,7-디메톡시-6-아자인돌-3-일)-옥소아세테이트)는 에틸 (4,7-디메톡시-6-아자인돌-3-일)-옥소아세테이트를 출발물질로 사용하는 것을 제외하고는 화합물 3a를 제조하기 위해서 사용된 것과 동일한 방법에 의해서 제조되었다 (황색 고체로서). MS m/z: 화합물 3 ao의 상응하는 산 (M-K+H)+의 (M+H)+ C11H11N2O5에 대한 계산치: 251.07; 실측치 251.09. HPLC 체류시간: 0.69 분 (칼럼 B).
5a의 제조방법 예
Figure 112006074171808-pct00039
(R)-N-( 벤조일 )-3- 메틸 - N' -[(7- 아자인돌 -3-일)- 옥소아세틸 ]-피페라진 5a 의 제조: 칼륨 7-아자인돌-3-글리옥실레이트 3a (25.4 g, 0.111 mol), (R)-3-메틸-N-벤조일피페라진 4a (22.7 g, 0.111 mol), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온 (DEPBT)(33.3 g, 0.111 mol) 및 휴니그 염기 (28.6 g, 0.222 mol)를 500 ㎖의 DMF 중에서 배합하였다. 혼합물을 실온에서 8 시간 동안 교반하였다.
DMF를 감압 하에서 증발시켜 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트 (2000 ㎖)와 5% Na2CO3 수용액 (2×400 ㎖) 사이에 분배시켰다. 수층을 에틸 아세테이트 (3×300 ㎖)로 추출하였다. 진공 중에서 농축시켜 조생성물을 수득하고, 이것을 EtOAc/MeOH (50:1)를 사용한 실리카겔 칼럼 크로마토그라피에 의해서 정제하여 33 g의 생성물 5a를 81% 수율로 수득하였다.
이하의 서브-구조식을 갖는 화합물 5의 특정화:
Figure 112006074171808-pct00040
화합물 5a, n= 2, R7 -13= (R)-Me, (R)-N-( 벤조일 )-3- 메틸 - N' -[(7- 아자인 돌-3-일)- 옥소아세틸 ]-피페라진: 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 8.57 (d, 1H, J= 5.97 Hz), 8.38 (d, 1H, J= 4.20 Hz), 8.27 (m, 1H), 7.47 (s, 5H), 7.35 (t, 1H, J= 5.13 Hz), 4.75-2.87 (m, 7H), 1.31 (b, 3H); 13C NMR (75 MHz, CD3OD) δ 185.6, 172.0, 166.3, 148.9, 144.6, 137.0, 134.8, 130.2, 129.9, 128.4, 126.6, 118.6, 118.0, 112.2, 61.3, 50.3, 45.1, 35.5, 14.9, 13.7. MS m/z: (M+H)+ C21H21N4O3에 대한 계산치: 377.16; 실측치 377.18. HPLC 체류시간: 1.21 분 (칼럼 A). C21H20N4O3에 대한 분석 계산치: C, 67.01; H, 5.35; N, 14.88. 실측치: C, 66.01; H, 5.35; N, 14.61.
Figure 112006074171808-pct00041
화합물 IVa, N-(벤조일)-N'-[(4,7-디메톡시-6-아자인돌-3-일)-옥소아세틸]피페라진은 화합물 5a를 제조하기 위해서 사용된 것과 동일한 방법에 의해서 제조되었으며, 단 출발물질은 칼륨 (4,7-디메톡시-6-아자인돌-3-일)-옥소아세테이트였다. 화합물을 용출용매로서 EtOAc를 사용한 실리카겔 크로마토그라피에 의해서 정제하여 백색 고체를 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.0 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.40 (m, 6H), 4.00 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.63-3.34 (m, 8H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 185.5, 169.3, 166.5, 146.2, 145.7, 136.6, 135.3, 129.6, 128.4, 126.9, 122.2, 122.1, 119.2, 114.4, 56.8, 52.9, 45.5, 39.9. MS m/z: (M+H)+ C22H23N4O5에 대한 계산치: 423.17; 실측치 423.19. HPLC 체류시간: 1.33 분 (칼럼 B). C22H21N4O5에 대한 분석 계산치: C, 62.7; H, 5.02; N, 13.29. 실측치: C, 61.92; H, 5.41; N, 13.01. 융점: 229.5-232℃.
모화합물 IVc 의 제조를 위한 방법
3- 메틸 -1,2,4- 트리아졸 (2-81)의 제조
Figure 112006074171808-pct00042
방법: 500 ㎖-둥근 바닥 플라스크 내에서 포르믹 하이드라지드 (68 g, 1.13 mol) 및 티오아세트아미드 (85 g, 1.13 mol)의 고체 혼합물을 질소의 온화한 스트림으로 반응 중에 형성된 H2S 및 물 (수거된 약 18 ㎖의 액체)을 제거하면서 1.5 시간 동안 150℃ (오일욕 온도)에서 교반하면서 가열하였다. 반응혼합물을 감압 하에 증류시켜 102℃/0.35-1 mmHg에서, 액체 전류물 (forerun)을 제거한 후에 백색 고체로서 60.3 g (0.726 mol, 수율 63.3%)의 표제화합물을 수거하였다: 1H NMR (CDCl3) δ ppm 2.51 (3H, s, 3-Me), 8.03 (1H, s, 5-H), 9.5 (1H, br, NH); TLC Rf (10% MeOH/CH2Cl2)= 0.3 (포스포몰리브데이트-차링 (charring), 백색 스포트) (참조: Vanek, T.; Velkova, V.; Gut, Jiri Coll. Czech . Chem . Comm . 1985, 49, 2492).
3-81의 제조
Figure 112006074171808-pct00043
방법: 500 ㎖ 둥근 바닥 플라스크를 4-메톡시-7-클로로-6-아자인돌 2e (9.1 g, 50 mmol; 진공 중에서 건조됨), 탄산칼륨 (13.8 g, 100 mmol, 2 eq.), 구리 분말 (6.35 g, 100 mmol, 2 eq.), 및 3-메틸-1,2,4-트리아졸 (83 g, 1.0 mol, 20 eq.)로 충진하였다. 고체 혼합물을 12 시간 동안, 무수 질소의 온화한 스트림 하에서 170-175℃ (외부 오일욕 온도)에서 용융물로 가열하였으며, 이 시간에 HPLC 분석은 출발물질에 대한 피크의 양은 5-30%가 되었으며, 목적하는 생성물 피크는 약 45%가 되고 이성체 부산물 피크는 15%가 되었음을 나타내었다. 반응혼합물이 냉각함에 따라서, MeOH (150 ㎖)를 가온된 교반 혼합물에 서서히 첨가하였다. 냉각시켜 불용성 물질 (구리 분말)을 셀라이트 패드 (Celite pad)를 통해서 여과하고, 메탄올로 세정하였다. 여액을 진공 하에서 농조한 페이스트로 농축시키고, 이것을 물 (1 L)로 희석하여 EtOAc (3×150 ㎖)로 추출하였다. EtOAc 추출물을 건조시키고 (MgSO4), 여과하고 농축시켜 약 8 g의 조 잔류물을 수득하고, 이것을 뜨거운 CH3CN (50 ㎖)에 용해시키고, 이어서 물 (100 ㎖)로 희석하고 0℃에서 냉각시켜 백 색 고체로서 1.45 g (12.7%)의 표제화합물을 수거하였다. 여액을 15-30% CH3CN/H2O로 용출시키는 C-18 역상 실리카겔 (YMC ODS-A 75 ㎛)에 의해서 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 회전 증발기에 의해서 CH3CN을 제거한 후에 수용액을 동결건조시켜 추가로 1.15 g의 표제화합물 3-81을 수득하였다. 조 수층을 EtOAc로 수회 더 추출하였다. 에틸 아세테이트 추출물을 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시키고, MeOH로부터 결정화시켜 추가로 200 ㎎의 표제화합물 3-18을 수득하였다. 총수율: 2.8 g (12.2 mmol, 수율 24.5%); MS m/z 230 (MH), HRMS (ESI) m/z C11H12N5O에 대한 계산치 (M+H), 230.1042, 실측치 230.1038 (Δ -1.7 ppm); 1H NMR (CDCl3) δppm 2.54 (3H, s, CH3), 4.05 (3H, s, OCH3), 6.73 (1H, s, H-3), 7.40 (1H, s, H-2), 7.56 (1H, s, H-5), 9.15 (1H, s, 트리아졸-H-5); 13C NMR (CDCl3, 125.7 MHz) δppm 14.2 (트리아졸-Me), 56.3 (OMe), 100.5 (C-3), 116.9 (C-5), 123.5, 127.2, 127.5 (C-2), 129.5 (C-7), 141.2 (C-5'), 149.5 (C-4), 116.9 (C-5), 123.5, 127.2, 127.5 (C-2), 129.5 (C-7), 141.2 (C-5'), 149.5 (C-4), 161.8 (C-3'); C11H11N5O에 대한 분석 계산치: C, 57.63; H, 4.83; N, 30.55, 실측치: C, 57.37; H, 4.64; N, 30.68.
구조는 C-18 칼럼 분획으로부터 수득된 결정을 사용한 단일 X-선 결정학적 분석에 의해서 확인되었다. 목적하는 3-메틸-1,2,4-트리아졸릴 동족체 3-81 및 이 성체 5-메틸-1,2,4-트리아졸릴 동족체 4-81의 혼합물을 함유하는 C-18 칼럼 분획의 일부분을 8-10% CH3CN/H2O로 용출시키는 C-18 역상 칼럼에 의해서 더 정제하였다. 적절한 분획을 CH2Cl2로 추출하고, 용매를 느리게 증발시켜 이성체 7-(5-메틸-1,2,4-트리아졸릴)-4-메톡시-6-아자인돌 (4-81)의 결정성 물질을 수득하였다: MS m/z 230 (MH), 1H NMR (CDCl3) δppm 3.05 (3H, s, CH3), 4.07 (3H, s, OCH3), 6.74 (1H, q, J= 2.4, H-2), 7.37 (1H, t, J= 2.4, H-3), 7.65 (1H, s, H-5), 8.07 (1H, s, 트리아졸-H-3). 구조는 단일 X-선 결정학적 분석에 의해서 확인되었다.
5-81의 제조
Figure 112006074171808-pct00044
방법: AlCl3 (40 g, 0.3 mol, 15 eq.)를 건조 질소 하에서 CH2Cl2 (100 ㎖) 및 니트로메탄 (20 ㎖)의 용액에 용해시켰다. 이 용액에 교반 및 N2 하에서 화합물 3-81 (4.58 g, 0.02 mol)을 첨가하고, 이어서 메틸 클로로옥소아세테이트 (9.8 g, 0.08 mol, 4 eq.)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 하에 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 20% 암모늄 아세테이트 수용액 (750 ㎖)의 냉각 및 교반된 용액에 적가하였다. 혼합물을 20 분 동안 교반하고, 생성된 침전을 여과하여 물로 철저히 세척하고, 진공 중에서 건조시켜 백색 고체로서 4.7 g (0.015 mol, 수율 75%)의 표제화합물 5-81을 수득하였다: MS m/z 316 (MH); HRMS (ESI) m/z C14H14N5O4에 대한 계산치 (M+H), 316.1046; 실측치 316.1041 (Δ -1.6 ppm); 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δppm 2.58 (3H, s, CH3), 3.96 (3H, s, OCH3), 4.05 (3H, s, OCH3), 7.76 (1H, s, H-5), 8.34 (1H, d, J= 3Hz, H-2), 9.15 (1H, s, 트리아졸-H-5), 11.0 (1H, brs, NH). 추가의 표제화합물 5-81 및 가수분해된 산 6-81은 EtOAc에 의한 산-염기 추출에 의해서 여액으로부터 수득될 수 있다.
6-81의 제조
Figure 112006074171808-pct00045
방법: MeOH (50 ㎖) 중의 메틸 에스테르 5-81 (2.2 g, 7.0 mmol)의 현탁액에 실온에서 물 중의 0.25 M NaOH 용액 (56 ㎖, 14 mmol, 2 eq.)을 첨가하고, 혼합물을 15 분 동안 교반하였으며, 이때에 HPLC는 가수분해가 완료되었음을 나타내었다. 혼합물을 진공 중에서 빠르게 농축시켜 MeOH를 제거하고, 잔류하는 용액에 교반하면서 물 (100 ㎖) 및 1 N HCl (14 ㎖)을 첨가하여 혼합물을 중화시켰다. 생성된 미세한 침전을 여과하여 물로 세척하고, 진공 중에서 건조시켜 회백색 고체로서 1.98 g (6.58 mmol, 수율 94%)의 표제화합물 6-81을 수득하였다: MS m/z 302 (MH); 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δppm 2.50 (3H, s, DMSO 피크와 중복됨), 3.98 (3H, s, CH3O), 7.87 (1H, s, H-5), 8.29 (1H, d, J= 3.5Hz, H-2), 9.25 (1H, s, 트리아졸-H-5), 12.37 (1H, s, NH).
대체방법: MeOH (150 ㎖) 중의 메틸 에스테르 5-81 (10.7 g, 34 mmol)의 현탁액에 실온에서 물 중의 0.25 M NaOH 용액 (272 ㎖, 68 mmol, 2 eq.)을 첨가하고, 혼합물을 20 분 동안 교반하였으며, 이때에 HPLC는 가수분해가 완료되었음을 나타내었다. 혼합물을 진공 중에서 빠르게 농축시켜 MeOH를 제거하고, 잔류하는 용액을 EtOAc로 추출하여 모든 중성 불순물을 제거하였다. 수성상에 1 N HCl (68 ㎖, 68 mmol)을 첨가하여 생성물을 중화시켰다. 생성된 혼합물을 동결 및 동결건조시켜 회백색 고체로서 2 몰당량의 NaCl을 함유하는 14.1 g (33.7 mmol, 수율 99.2%)의 표제화합물 6-81을 수득하였다. 이 물질은 더 정제하지 않고 다음 반응에 사용되었다. 표제화합물 6-81의 디나트륨 염은 중탄산나트륨 처리한 후에 C-18 역상 칼럼 크로마토그라피에 의해서 수득되었다: HPLC >97% (AP, 254 nm에서 uv); HRMS (Na 염, ESI) m/z C13H10N5O4에 대한 계산치 (M-H), 300.0733; 실측치 300.0724 (Δ -3 ppm); 1H NMR (Na 염, DMSO-d6, 500 MHz) δppm 2.37 (3H, s, Me), 3.83 (3H, s, CH3O), 7.56 (1H, s, H-5), 8.03 (1H, s, H-2), 9.32 (1H, s, 트리아졸-H-5); 13C NMR (Na 염, DMSO-d6, 125.7 MHz) δppm 13.8 (트리아졸-Me), 57.2 (OMe), 114.8 (C-3), 120.0 (C-5), 125.1, 143.5 (C-5'), 149.8 (C-4), 160.0 (C-3'), 171.7, 191.3.
화합물 IVc 의 제조
Figure 112006074171808-pct00046
방법: DMF (50 ㎖) 중의 산 6-81 (3.01 g, 10 mmol) 및 벤조일피페라진 하이드로클로라이드 (3.39 g, 15 mmol)의 용액에 트리에틸아민 (10.1 g, 100 mmol, 10 eq.)을 첨가하고, 이어서 N2 하에서 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC; 5.75 g, 30 mmol)를 첨가하여, 혼합물을 초음파처리한 후에 실온에서 22 시간, 및 40℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 중에서 농축시켜 DMF 및 TEA를 제거하고, 잔류하는 용액에 교반 및 초음파처리 하에서 물 (200 ㎖)을 첨가하였다. 형성된 침전을 수거하여 물로 세척하고, 진공 중에서 건조시켜 회백색 고체로서 2.8 g (5.9 mmol, 수율 59%)의 표제화합물 IVc를 수득하였다. 여액을 CH2Cl2 (×2)로 추출하였다. CH2Cl2 추출물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고 농축시켜 고무상 물질을 수득하고, 이것을 Et2O와 함께 분쇄하 여 고체를 수득하였다. 이 고체를 현탁시키고 MeOH와 함께 분쇄하여 회백색 고체로서 400 ㎎의 표제화합물 IVc를 수득하였다. 총수율: 3.2 g (6.8 mmol, 수율 68%); MS m/z 474 (MH); HRMS (ESI) m/z C24H24N7O4에 대한 계산치 (M+H) 474.1890; 실측치 474.1884 (Δ -1.2 ppm); 1H NMR (DMSO-d6) δppm 2.50 (3H, s, DMSO 피크와 중복됨), 3.43 (4H, br, CH2N), 3.68 (4H, br, CH2N), 3.99 (3H, s, CH3O), 7.46 (5H, br. s, Ar-Hs), 7.88 (1H, s, 인돌-H-5), 8.25 (1H, s, 인돌-H-2), 9.25 (1H, s, 트리아졸=H-5), 12.40 (1H, s, NH); 13C NMR (DMSO-d6) δppm 13.78, 40.58, 45.11, 56.78, 114.11, 120.95, 122.71, 123.60, 126.98, 128.34, 129.6, 135.43, 138.52, 142.10, 149.15, 161.29, 166.17, 169.22, 185.42; UV (MeOH) λmax 233.6 nm (ε 3.43×104), 314.9 nm (ε 1.73×104); C24H24N7O4.1/5H2O에 대한 분석 계산치; C 60.42, H 4.94, N 20.55, 실측치; C 60.42, H 5.03, N 20.65; KF (H2O) 0.75%.
이 반응은 또한, HATU 및 DMAP의 사용에 의해서 수행하여 더 일관된 수율의 표제화합물을 수득할 수 있다: DMF (60 ㎖) 및 CH2Cl2 (60 ㎖) 중의 산 6-81 (15.6 mmol) 및 HATU [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스포네이트] (8.90 g, 23.4 mmol, 1.5 eq.)의 현탁액에 실온에서 DMF (60 ㎖) 중의 DMAP (5.72 g, 46.8 mmol, 3 eq.) 및 벤조일피페라진 하이드로클로라이드 (5.30 g, 23.4 mmol, 1.5 eq.)의 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 질소 대기 하에서 4 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 중에서 농축시켜 CH2Cl2 및 대부분의 DMF를 제거하고, 잔류하는 용액에 교반 및 초음파처리 하에서 물을 첨가하였다. 형성된 침전을 수거하고 물로 세척하고, 진공 중에서 건조시켜 회백색 고체로서 5.38 g (11.4 mmol, 수율 72.8%)의 표제화합물 IVc를 수득하였다: HPLC >95% (AP, 254 nm에서 uv).
Figure 112006074171808-pct00047
화합물 IVb 의 최상의 제조를 위한 실험적 합성방법
Figure 112006074171808-pct00048
5-아미노-2-메톡시피리딘 (50 g, 0.4 mol)을 무수 에탄올 (280 ㎖) 및 HBF4 (물 중의 48%, 172 ㎖)의 교반 혼합물에 첨가하고, 0℃로 냉각시켰다. 나트륨 니트라이트 (129 g)를 물 (52 ㎖)에 용해시키고, 1 시간에 걸쳐서 조금씩 첨가하였 다. 교반은 0℃에서 2 시간 동안 계속하였다. 반응혼합물을 에테르 (1 L)로 희석하였다. 고체 생성물을 여과에 의해서 수거하고, 50:50 EtOH:에테르 500 ㎖로 세척하고, 이어서 생성물이 약한 분홍색의 색상을 띄울 때까지 에테르로 수회 세척하였다. 연분홍색 고체 90 g (~100% 수율)을 P2O5 상에서 건조기 내에 유지시켰다.
동일한 방법에 따라서 반응을 대규모로 수행하였다:
(1) (200 g, 1.6 mol ); HBF 4 (688 ㎖); NaNO 2 (116 g); EtOH (1.12 L); H 2 O (208 ㎖)
반응은 4 회 수행하였다 (총 800 그램 (1-80)). 생성물을 P2O5 상에서 48 시간 동안 건조시켰다 (처음 배취에 대해서는 단지 24 시간).
참조: J. Heterocyclic Chem , 10, 779, 1973 (분석 데이타를 포함하여 상기 반응에 대함)
Figure 112006074171808-pct00049
디아조늄 염의 분해반응은 각각 1.3 K, 1.4 L 및 1.6 L을 사용하는 206 g, 219 g 및 231 g의 3 개의 배취에서 수행되었다.
톨루엔은 기계적 교반기가 장치된 2 L 3-구 둥근 바닥 플라스크 내에서 질소 하에 100℃ (내부 온도)로 예열하였다. 고체는 약한 외향의 양의 질소 흐름에 의해 어댑터 (adapter)에 부착된 분말 깔때기를 통해서 스쿠프 (sccop)를 경유하여 고체에 조금씩 첨가하였다. 첨가하는 중에, 온도는 99-102℃ (100℃로 설정됨)로 유지시켰으며 격렬하게 교반하였다. 총 첨가시간은 더 작은 두개의 배취에 대해서는 60 분이고, 마지막 하나에 대해서는 70 분이었다. 첨가가 끝난 후에, 각각의 교반 반응액을 110℃에서 1 시간 동안 가열하였다. 가열 맨틀 (heating mantle)을 치우고, 교반을 중지하였다. 반응액을 2 시간 동안 정치시켰다 (주위온도에 도달하였다). 안전성 노트: 반응액은 BF3 를 함유하며, 따라서 반응에 의한 작업은 일부의 사람에게 피부 자극을 야기하는 뜨거운 증기에 노출된다. 주위온도에서는 사건이 기록되지 않았다 (6 명의 다른 사람). 반응액으로부터의 뜨거운 톨루엔을 4 L 삼각 플라스크에 부었다 (플라스크 내에는 암갈색 오일 및 잔류물이 남았다). 잔류물을 50 ㎖의 톨루엔으로 세척하고, 원래의 톨루엔 추출물에 부었다.
1.5 L의 1 N NaOH를 톨루엔 층에 첨가하고, 추출하고, ~100 ㎖의 포화 수성 NaCl로 세척하였다.
NaCl을 NaOH 층과 합하고, 150 ㎖의 톨루엔으로 재-추출하고, 50 ㎖의 포화 NaCl로 세척하였다.
톨루엔 층을 합하였다.
1 L의 1 N NaOH를 반응 플라스크 내의 잔류물에 첨가하고, 소용돌이를 일으켜 잔류물을 가능한 한 많이 용해시킨 다음에, 500 ㎖의 Et2O를 첨가하고, 삼각플라 스크에 부었다.
~500 ㎖의 추가의 1 N NaOH를 반응 플라스크에 첨가하고, ~500 ㎖의 Et2O를 소용돌이를 일으켰다.
삼각플라스크 내에서 어두운 색의 Et2O 및 NaOH 세척액을 합하였다.
Et2O/NaOH 혼합물을 유리솜의 플러그를 함유하는 분말 깔때기를 통해서 부어 어두운 색의 점성 고체를 수거하였다 (~500 ㎖의 추가의 에테르를 6 L 분리 깔때기 내의 세척액에 첨가하였다).
추출물. 에테르 층을 ~200 ㎖의 H2O 및 이어서 100 ㎖의 포화 NaCl로 세척하였다.
모든 세척액을 원래의 NaOH 수층과 합하여, 500 ㎖의 에테르로 재-추출하였다. 세척액을 100 ㎖의 H2O 및 100 ㎖의 NaCl로 세척하였다.
에테르 추출물을 배합하였다. 톨루엔과 에테르 추출물을 LC/MS 순수 생성물에 의해서 검사하였다.
에테르를 회전증발기 상에서 농축시키고, 잔류물을 톨루엔 추출물과 합하여 균질한 용액을 만들고, 이것은 다음 단계에 그대로 사용된다.
그 밖의 두개의 수득물을 배합하여 동일한 방식으로 후처리한다.
모든 수층은 LC/MS = 생성물 없음으로 검사하였다.
(참조: J. Heterocyclic Chem ., 10, 779, 1973 (분석 데이타를 포함한 상기 반응에 대하여))
Figure 112006074171808-pct00050
3-80을 함유하는 톨루엔 용액 총 4.6 L를 몇개의 밀봉된 튜브 내에 넣고, 900 ㎖의 35% HCl로 145℃에서 2 시간 동안 처리하였다. LC/MS는 출발물질을 나타내지 않았으며, 단지 4만을 나타내었다. 톨루엔 용액을 경사시켜 버렸다. 수성상을 EtOAc로 세척하고, 농축시켜 휘발성 물질을 제거하여 목적하는 플루오로-하이드록시피리딘 4-80을 함유하는 갈색 고체를 수득하였다.
총 244 g의 이 고체를 수거하여 그대로 다음 단계에 사용한다 (이것은 완전히 건조하지 않았다).
주의: 본 발명자들은 계속해서, 가열하여 용적을 감소시키기 전에 우선 톨루엔층을 경사시킴으로써 이것을 처리하였다. 동일한 반응을 HBr (H2O 중의 48%)을 사용하여 100℃에서 6 시간 동안 수행하여 문헌 방법의 49% 수율과 유사한 결과를 얻었다.
(참조: J. Heterocyclic Chem ., 10, 779, 1973 (분석 데이타를 포함한 상기 반응에 대하여))
Figure 112006074171808-pct00051
(4-80)을 함유하는 상기 반응으로부터의 고체를 4 개의 배취로 분할하고, 이하에 나타낸 바와 같이 H2SO4 및 발연 HNO3로 처리하였다. 사용된 양은 다음과 같다:
배취 1 배취 2 배취 3 배취 4
(1) 25 g 54 g 75 g 90 g
발연 HNO3 20.8 ㎖ 45 ㎖ 62.4 ㎖ 75 ㎖
H2SO4 (첨가를 위함) 5.6 ㎖+ 12 ㎖+ 16.8 ㎖+ 20 ㎖+
(용해를 위함) 56 ㎖ 120 ㎖ 168 ㎖ 200 ㎖
화합물 4-80을 실온에서 황산 (상기 나타낸 더 큰 양)에 용해시킨 다음에, 65℃로 가열하였다. 발연 질산 및 황산 (상기 나타낸 더 소량)의 전형성된 용액을 적가하였다. 온도를 65℃와 80℃ 사이에서 유지시켰다 (반응은 발열반응이고, 욕은 65℃이지만 온도는 더 고온, 통상적으로 75℃, 때때로는 80℃가 된다). 첨가를 완료한 후에, 반응혼합물을 추가로 1 시간 동안 65℃에서 가열하였다. 그 후, 반응혼합물을 실온으로 냉각시키고, 얼음을 함유하는 플라스크 내에 부었다 (20 g의 얼음/화합물의 gr, 가스의 방출이 일어났다). 고체가 침전하였으며, 이것을 여과에 의해서 수거하였다 (1HNM"은 4-80 및 다른 어떤 것 (버린다)을 나타내었다).
수층을 AcOEt로 수회 (3-5 회) 추출하고, 진공 하에 회전증발기 상에서 농축 시켜 고체를 수득하고, 이것을 에테르와 함께 분쇄하여 밝은 황색 고체로서 5-80을 수득하였다. 총 117 g의 목적하는 생성물을 일차 수확물로서 수거하였다 (디아조늄염으로부터 27% 수율). 일부분을 결정화하지 않았다: 이 오일을 MeOH 및 Et2O와 함께 분쇄하여 3.6 g의 5-80을 수득하였으며; 모액으로부터의 또 다른 침전으로 추가로 6.23 g의 목적하는 생성물 5-80을 수득하였다.
총: 117.0+3.6+6.23 = 126.83 (30.4%). 3 단계 (디아조늄염의 분해; 탈보호 및 니트로화)에 대한 수율.
노트북으로부터의 분석 데이타: 53877-115: 1HNMR (δ, MeOD): 8.56-8.27 (dd, J= 7.5, 3.3 Hz, 1H), 8.01 (d, J= 3.3 Hz, 1H); LC/MS (M+1)+= 158.9; rt= 0.15 분.
주의: 산성 수용액의 일부분을 취하여 발포가 중지할 때까지 Na2CO3로 중화시킨 다음에, 이것을 AcOEt로 추출하였다 ⇒ 상이한 생성물이 수득되었다. 이들 추출물에는 목적하는 생성물이 없었다.
Figure 112006074171808-pct00052
총 117 g의 5-80을 30 g×3 및 27 g×1의 4 개의 배취로 분할하고, 실온에서 POBr3 (3 당량; 163 g×3 및 155 g×1) 및 촉매량의 DMF (15 ㎖)로 처리하였다 (DMF는 주의해서 첨가하였다 ⇒ 가스 방출). 실온에서 5 분 후에, 용액을 3 시간 동안 110℃에서 가열하였다. LC/MS는 출발물질이 소비되었음을 나타내었다. 반응혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 반응 플라스크는 빙욕 중에 넣은 다음에 얼음을 매우 느리고 조심스럽게 조금씩 플라스크에 첨가하였으며, HBr 형성으로 인하여 가스 방출이 일어났고; 형성된 액체 및 흑색 고체를 얼음이 있는 비이커에 부었다. EtOAc를 첨가한 다음에, 혼합물을 EtOAc로 수회 추출하였다. 유기층을 포화 수성 NaHCO3, H2O 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 여과하였다. 생성물을 펌프에서 밤새 건조시켜 갈색 고체로서 123 g의 6-80을 제공하였다 (77% 수율).
주의: 반응은 1 시간 이내에 완료된다.
1HNMR (δ, CDCl3): 8.52 (m, 1H), 7.93 (m, 1H).
Figure 112006074171808-pct00053
800 ㎎의 비닐 마그네슘 브로마이드 (THF 중의 1 M, Aldrich)를 N2 하에서 격렬하게 교반하면서 -60℃ 이하로 냉각시켰다. 200 ㎖의 THF 중의 2-브로모-5-플루오로-3-니트로 피리딘 (43.3 g, 0.196 mol)을 온도가 -60℃ 이하로 유지되도록 하는 속도로 첨가 깔때기 (addition funnel)를 통해서 적가하였다. 이 공정은 ~1.25 시간이 걸렸다. 반응혼합물을 -40 내지 -50℃로 가온하고, 1 시간 동안 더 교반하였다. 그 후, 1 L의 포화 수성 NH4Cl을 서서히 조심스럽게 첨가하였다. 처음에 발포가 일어났으며, 상당한 고체가 존재하였지만, 이것은 첨가가 완료되고 물질을 실온으로 가온함에 따라서 본질적으로 용해하였다. 층을 분리시키거, 수층을 에틸 아세테이트로 3 회 추출하였다. 유기 추출물을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 ~ 50 g의 흑색 고무상 고체를 수득하였다. HPLC는 57-58%의 생성물을 나타내었다. 여기에 CH2Cl2를 첨가하고, 고체를 여과에 의해서 수거하여 CH2Cl2로 세척하여 갈색 고체로서 12.5 g의 생성물을 수득하였다. 반응액을 동일한 스케일로 정확하게 반복하고, 동일한 방식으로 후처리하였다. CH2Cl2 분쇄하여 12.4 g의 전구체 2i (HPLC ~97% 순도)를 수득하였다. 조생성물을 회수하여 디클로로메탄 중에서 정치시켰다. 정치시켜 3.6 g의 추가의 생성물을 분리시키고, 여과에 의해서 회수하였다.
총 수율= 29.5 g (35%).
1HNMR (δ, CDCl3): 8.69 (bs, 1H), 7.92 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 7.41 (m, 1H), 6.77 (m, 1H); LC/MS (M+1)+= 216-217.9; rt= 1.43 분.
Figure 112006074171808-pct00054
반응은 250 ㎖ 플라스크 중에서 수행되었다 (가열하면 발포가 일어났으며, 큰 크기의 플라스크가 더 편리하다). 전구체 2i (3 g, 13.95 mmol), 1,2,3-트리아졸 (15 g, 217.6 mmol, 15 eq.), K2CO3 (1.9 g, 13.95 mmol, 1 eq.) 및 Cu(O) (0.9 g, 13.9 mmol, 1 eq.)의 혼합물을 N2 하에 160℃에서 7 시간 (실온에서 160℃까지 총 7 시간) 동안 가열하였다 (Cu(O) 로트 (lot)에 따라서 반응시간은 2 시간에서 7 시간까지 변화할 수 있다). 생성된 혼합물을 MeOH로 희석하고, 여과지를 통해서 여과 (구리를 제거하기 위함)하였다. MeOH (20 ㎖) 및 물 (30 ㎖)로 세척하였다.
여액을 농축시키고 (회전증발기에서 용매를 제거), 에틸아세테이트로 희석하였다. 수층을 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 합하여 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 MeOH (20 ㎖)에 용해시키고, 7-80 (750 ㎎)을 메탄올로부터 백색 고체로 결정화시키고, 여과에 의해서 수거하였다. (모액의 느린 구배 용적, 실리카겔 헥산/AcOEt (0→18%)로 통상적으로 7-80을 5- 10% 더 수득한다.)
1HNMR (δ, CDCl3): 10.47 (bs, 1H), 8.76 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.53 (m, 1H), 6.78 (m, 1H); LCMS (M+1)+= 204; rt= 1.29 분.
Figure 112006074171808-pct00055
에틸 메틸이미다졸륨 클로라이드 (4.3 g, 29.6 mmol, 3 eq.)를 250 ㎖ 플라스크에 넣었다. AlCl3 (11.8 g, 88.6 mmol, 9 eq.)를 한꺼번에 플라스크에 첨가하였다. 액체 현탁액을 형성시켰다 (AlCl3의 일부분은 고체로 남았다). 5-10 분 동안 교반한 후에, 화합물 (1) (2.0 g, 9.85 mmol)을 한꺼번에 첨가하고, 이어서 에틸 클로로옥살아세테이트 (3.3 ㎖, 29.6 mmol, 3 eq.)를 느리게 첨가하였다 (시린지를 통해서). 반응액을 실온에서 20 시간 동안 교반하였다. LCMS는 화합물 8-80:화합물 7-80 = 6:2를 나타내었다 (화합물 I은 강력한 UV 흡수를 가졌다). 반응액은 0℃에서 빙수 (~75 ㎖)를 주의해서 첨가함으로써 켄칭하였다. 이 시점에 황색 고체가 침전하였다. 생성된 현탁액을 여과하고, 고체를 물로 세척하였다. MeOH 및 에틸 아세테이트로 미반응 출발물질을 제거하고, 고체를 공기 중에서 건조시켰다 (LCMS 순도 70%~80%). 8-80을 함유하는 2 g의 고체를 수득하여 더 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다. LCMS (M+1)+= 276; rt= 0.97 분.
Figure 112006074171808-pct00056
DMF (30 ㎖) 중의 화합물 8-80 (4.9 g, 17.8 mmol) 및 N-벤조일피페라진 하이드로클로라이드 8a-80 (HCl 염; 6.0 g, 26.7 mmol, 1.5 eq.)의 혼합물을 실온에서 밤새 (16 시간) 교반하였다. 슬러리가 형성되었다. 추가로 20 ㎖의 DMF를 슬러리에 첨가하였다. 그 후, HATU (12.2 g, 26.7 mmol, 1.5 eq.)를 첨가하고, 이어서 DMAP (4.3 g, 35.6 mmol, 2 eq.)를 첨가하였다. 반응혼합물을 30분 동안 교반하였다. LCMS는 출발물질 8-80이 완전히 생성물로 전환되었음을 시사하였다 (실시예 216). 생성된 혼합물을 여과하고, 고체를 물로 세척하였다. 여액을 진공 중에서 농축시켰다. 잔류물에 물을 첨가하고, 고체를 여과에 의해서 수거하였다. 고체를 합하여 물, MeOH 및 EtOAc로 세척하였다. 그 후, 고체를 공기 중에서 건조시켰다. LCMS & HPLC는 IVb가 >99% 순수함을 나타내었다. 고체 생성물을 침전 및 5-10% CH3OH/CHCl3 중에서 결정화시켜 더 정제하였다.
IVb 의 정제
상기한 바와 같이 수득된 조화합물 IVb (15.3 g)를 10% MeOH/CHCl3 (600 ㎖)에 용해시켰다. 담갈색 현탁액이 형성되었으며, 여과지를 통해서 여과하여 MeOH로 2 회 세척하였다. 갈색을 띈 고체를 여과해서 버렸다 (1-2 g). 화합물 IVb가 여액에서 결정화되었으며, 고체를 여과하여 수거하고 백색 고체를 공기 중에서 건조시켰다. 여액을 사용하여 결정화를 수회 반복하였다. 각각의 여과로부터 수득된 고체를 HPLC에 의해서 분석하였다. 모든 순수한 분획을 합하였다. 그렇게 순수하지 않은 분획은 MeOH 및 CHCl3에 의한 결정화에 재적용하였다. 총 12.7 g의 화합물 IVb가 재결정화 및 침전으로부터 수득되었다. 모액을 농축시키고, 실리카겔 칼럼 (EtOAc, 다음에 CHCl3/MeOH (0-2%)) 상에서 정제하여 백색 고체로서 506 ㎎의 생성물을 수득하였다.
1HNMR (d, DMSO) 13.1 (bs, 1H), 9.0 (s, 1H), 8.4 (s, 1H), 8.3 (s, 1H), 8.2 (s, 1H), 7.4 (bs, 5H), 3.7 (bs, 4H), 3.5 (bs, 4H); MS m/z 448 (MH). 분석치: C22H18FN7O3에 대한 계산치; C 59.05, H 4.05, N 21.91, F 4.24. 실측치: C 57.28, H 4.14, N 21.22, F 4.07%.
실시예 1-4:
모화합물 IV 로부터 프로드럭 I의 제조
실시예 1-4에 대한 합성 반응식
Figure 112006074171808-pct00057
실시예 1
Ia 의 제조
Figure 112006074171808-pct00058
방법: 무수 N2 대기 하에 THF (2 ㎖; 반드시 밀봉) 중의 IVa (211 ㎎, 0.5 mmol)의 현탁액을 NaH (86 ㎎, 2.2 mmol; 4.4 eq.; 60% 오일 현탁액)로 처리하였다. 실온에서 몇 분 동안의 교반 후에, 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트 (782 ㎎, 3.0 mmol; 제조, 미국 특허 제 6,362,172 호를 참조)를 첨가하고, 혼합물을 HPLC에 의해서 반응의 완결을 모니터하면서 1-5일 동안 교반하였다 (반응이 거의 완결되도록 유도하기 위해서 추가로 각각 1-2 eq.의 NaH 및 포스페이트가 필요할 수도 있다). 출발물질이 소비된 후에, 혼합물을 진공 중에서 농축 건고시키고, N-알킬화된 인돌 모노- 및 비스-t-부틸 포스페이트의 혼합물인 것으로 보이는 잔류물을 CH2Cl2 (5 ㎖)에 용해시키고, 실온에서 2 시간 동안 TFA (5 ㎖)로 처리하였다. 혼합물을 진공 중에서 농축시키고, 잔류물을 NaHCO3를 함유하는 물 중의 5-10% CH3CN으로 용출시키는 C-18 역상 실리카겔에 의해서 정제하여 회백색 분말로서 75 ㎎ (0.13 mmol; 수율 26%)의 표제화합물 Ia를 수득하였다 (디나트륨 염): HPLC >99% (254 nm에서 AP); LC/MS (ESI+) m/z 533 (M+H-2Na)+; HRMS (ESI) m/z C23H26N4O9P에 대한 계산치 (M+H-2Na)+ 533.1437, 실측치 533.1426 (Δ -2.1 ppm); 1H NMR (D2O, 500 MHz) δppm 3.51 (2H, m), 3.67 (2H, m), 3.73-3.79 (2H, m), 3.89-3.95 (2H, m), 3.94, 3.95 (3H, 2s), 4.05, 4.07 (3H, 2s), 6.02-6.04-6.05-6.07 (2H, ABq.), 7.43, 7.44 (1H, 2s), 7.45-7.56 (5H, m), 8.49, 8.52 (1H, 2s).
유사한 방법 및 조건을 사용하여 Ib가 IVb로부터 제조되었다. Ic 및 Id는 각각 IVc 및 IVd로부터 제조되었으며, 정제에 중탄산나트륨 용액 대신에 물이 사용되었다.
실시예 2
Figure 112006074171808-pct00059
Ib : 수율 13% (디나트륨 염); HPLC >96% (254 nm에서 AP); LC/MS (ESI+) m/z 558 (M+H-2Na)+; 1H NMR (D2O, 500 MHz) δppm 3.59 (2H, m), 3.70-3.84 (4H, m), 3.93-3.95 (2H, m), 5.28-5.29-5.30-5.32 (2H, ABq.), 7.4-7.6 (5H, m), 8.09, 8.10 (1H, 2s), 8.34, 8.36 (1H, 2s), 8.59, 8.61 (1H, 2s), 8.72, 8.75 (1H, 2s).
실시예 3
Figure 112006074171808-pct00060
Ic : 수율 37% (산 형태, 정제 중에 수성 중탄산나트륨 대신에 물이 사용되었다); HPLC >98% (254 nm에서 AP); LC/MS (ESI+) m/z 584 (M+H);1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δppm 2.40 (3H, s), 3.44 (4H, br.s), 3.66 (4H, brs), 4.04 (3H, s), 5.79 (1H, s), 5.82 (1H, s), 7.46 (5H, brs), 8.07 (1H, s), 8.41 (1H, s), 8.88 (1H, 2s).
실시예 4
Figure 112006074171808-pct00061
Id : 수율 7% (산 형태). 정제 중에 수성 중탄산나트륨 대신에 물이 사용되 었다; LC/MS (ESI+) m/z 597 (M+H); 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δppm 1.16, 1.21 (3H, 2d, J= 6.5 Hz), 2.29 (3H, s), 2.3-4.5 (7H, m), 4.00, 4.01 (3H, 2s), 5.79-5.85 (2H, m), 6.36 (1H, t, J= 2Hz), 7.42-7.47 (5H, m), 7.99 (1H, s), 8.08, 8.09 (1H, 2s), 8.34, 8.44 (1H, 2s).
실시예 5
Ica 의 제조 ( 디나트륨 염)
Figure 112006074171808-pct00062
일반적 방법: 질소 대기 하에 무수 THF (4 ㎖) 중의 IVc (0.24 g, 0.5 mmol)의 현탁액을 나트륨 하이드라이드 (60% 오일 분산액, 0.08 g, 2.0 mmol)로 처리하고, 가스 방출이 중지될 때까지 (약 5 분) 교반하였다. 반응혼합물을 요오드 (0.13 g, 0.5 mmol)로 처리하고, 2-3 분 동안 교반한 다음에, 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트 (1.6 g, 6.0 mmol, 조물질)를 첨가하였다. 질소의 스트림이 반응에 걸쳐서 통과하도록 하여 THF의 대부분 또는 전부의 제거를 촉진시켰다. 반응혼합물을 밤새 교반하였다. 조물질의 HPLC 분석은 출발물질인 IVc (약 56%) 및 목적하는 부가물 (약 32%)을 나타내었다.
몇개의 조반응혼합물 (출발물질 IVc를 기준으로 하여 총 6.7 mmol)을 디클로로메탄에 재용해시키고, 배합하고 진공 중에서 농축시켜 잔류하는 THF를 제거하였다. 잔류물을 디클로로메탄과 THF (1:1, 대략 40 ㎖의 총용적)에 현탁시켰다. 혼합물을 1.5-2 시간 동안 교반한 다음에, 용매를 진공 중에서 제거하였다. 잔류물을 디클로로메탄에 현탁시키고, 고체 또는 수성 중탄산나트륨으로 염기성으로 만든 물 (대략 60 ㎖)로 추출하였다. 수층은 필요한 경우에 회전증발기에 의해서 용적을 감소시켰으며, 용액을 C-18 역상 칼럼 (대략 80 g의 C-18, YMC ODS-Aq, 50 미크론) 상에 부하하고, 물로 용출시킨 다음에, 2.5% 아세토니트릴을 함유하는 물로 용출시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 모아서 회전증발기에 의해서 유기용매를 제거하였다. 정제된 생성물을 동결건조 후에 회수하여 회백색 분말로서 1.00 g (1.30 mmol, 2 단계에 걸쳐서 19%)의 표제화합물 Ica (디나트륨 염)을 수득하였다: HPLC 순도 >99% (254 nm에서 AP) (구배 0-100% B/A; A 10% CH3CN-90% H2O-0.1% TFA, B 90% CH3CN-10% H2O-0.1% TFA, 구배시간 4분, 칼럼 YMC ODS-Aq 4.6×50 ㎜ 3 미크론); MS-ESI-m/z 482 (M-H-2Na); HRMS (ESI) m/z C25H27N7O8P에 대한 계산치 (M+H-2Na)+ 584.1659, 실측치 584.1651 (Δ -1.3 ppm); 1H NMR (D2O, 500 MHz) δppm 2.53, 2.54 (3H, 2s), 3.56 (2H, s, CH2N), 3.72 (2H, br.s, CH2N), 3.78, 3.83 (2H, 2br.s, CH2N), 3.94, 3.96 (2H, 2br.s, CH2N), 4.14 (3H, s, CH3O), 5.38, 5.40 (2H, 2d, J= 11 Hz), 7.45-7.59 (5H, m, Ar-Hs), 8.07, 8.09 (1H, 2s, 인돌- H-5), 8.64, 8.67 (1H, 2s, 인돌-H-2), 8.87, 8.89 (1H, 2s, 트리아졸-H-5); 13C-NMR (125.7 MHz, D2O) δppm 15.43 (N-Me), 44.03, 44.47, 44.66, 45.05, 48.02, 48.82, 49.60, 50.23, 59.78 (OMe), 75.81 (NCH2O), 115.6, 126.0, 127.2, 129.6, 131.0, 131.7, 132.1, 133.5, 136.8, 147.6, 150.1, 154.2, 164.8, 170.4, 175.8, 189.2; UV (H2O) λmax 220 nm (ε3.91×104), 249 nm (ε2.00×104), 303 nm (ε1.60×104); C25H24N7O8PNa2.8H2O.0.2NaHCO3에 대한 분석 계산치: C 38.39, H 5.14, N 12.44, P 3.93, Na 6.42, 실측치: C 38.16, H 4.81, N 12.43, P 3.72, Na 6.05; KF (H2O) 17.3%. 덜 순수한 분획을 수거하여 0.22 g (0.29 mmol, 수율 4%)의 표제화합물 Ica (디나트륨 염)를 수득하였다: HPLC 순도 >95% (254 nm에서 AP).
실시예 6
Iab (수화된 라이신 염)의 제조
단계 1
Figure 112006074171808-pct00063
포스페이트 에스테르 A (45.1 g, 0.1 mol) 및 클로로요오도메탄 B (200 g, 1.14 mol)을 100 ㎖의 벤젠 중에서 배합하고, 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반한 후에 진공 하에서 벤젠을 제거하였다. 그 후, 500 ㎖의 에틸 에테르를 잔류물에 첨가하고, 불용성 고체를 여과하였다. 여액을 농축시켜 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트를 수득하였으며, 이것을 어떠한 정제도 하지 않고 다음 단계에서 이용하였다.
단계 2
Figure 112006074171808-pct00064
NaH (2.4 g, 오일 중의 60%)를 무수 THF (120 ㎖) 중의 IVa의 현탁액에 서서히 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하도록 하였다. 무수 THF (10 ㎖)에 용해된 요오드 (5 g)를 교반 용액에 서서히 첨가하였다. 첨가를 완료한 후에, 생성된 혼합물을 주위온도에서 추가로 15 분 동안 교반한 다음에, 단계 1로부터 수득된 화합물 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트를 첨가하였다. 16 시간 동안 교반한 후에, 반응혼합물을 빙수 (120 ㎖)에 붓고, 이어서 EtOAc (3×300 ㎖)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하여 물 (100 ㎖)로 세척한 다음에 염수 (100 ㎖)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이것을 실리카겔 크로마토그라피 (EtOAc/Et3N (100/1)로 용출시킨 다음에 EtOAc/MeOH (100/1)로 용출)에 의해서 정제하여 70-80%의 수율로 디에스테르 IIa를 수득하였다.
단계 3
Figure 112006074171808-pct00065
TFA (50 ㎖) 및 디클로로메탄 (450 ㎖)의 혼합된 용액을 43.3 g의 디에스테르 IIa를 함유하는 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 실온에서 16 시간 동안 교반한 후에, 반응혼합물을 진공 하에서 농축시켜 Iac의 잔류물을 수득하고, 이것을 어떠한 정제도 없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 4
Figure 112006074171808-pct00066
상기의 55 g의 조생성물 Iac를 실온에서 L-라이신의 수용액 (1.36 M, 70 ㎖) 에 첨가하였다. 생성된 현탁액 (pH= 1.83)을 pH 4.88까지 라이신 용액 (1.36 M, ~ 40 ㎖)에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 셀라이트의 패드를 통해서 여과하였다. 맑은 담황색 여액 (~200 ㎖)을 아세톤 (200 ㎖)과 혼합시키고, 45℃로 가열하였다. 아세톤 (1400 ㎖)을 45℃에서 2 시간에 걸쳐서 첨가하였다. 맑은 용액을 접종하여 45℃에서 2 시간 동안 교반하고, 실온으로 서서히 냉각시키고 (5 시간), 현탁액을 밤새 교반하였다. 백색 고체를 여과에 의해서 수거하고, 하우스 (house) 진공 하에 50℃에서 24 시간에 걸쳐서 건조시켜 회백색 고체로서 41.2 g의 Iab를 수득하였다.
상기의 고체를 45℃에서 1:1 물-아세톤 (560 ㎖)에 용해시켰다. 아세톤 (700 ㎖)을 45℃에서 1 시간의 기간에 걸쳐서 첨가하였다. 맑은 용액을 접종하고, 45℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 서서히 실온으로 냉각시키고 (5 시간), 현탁액을 실온에서 밤새 교반하였다. 백색 고체를 여과하여 수거하고, 하우스 진공 하에서 50℃에서 36 시간에 걸쳐서 건조시켜 회백색 고체로서 33 g의 Iab를 수득하였다. AP는 HPLC에 의해서 >99%였다.
1H NMR (500 MHz, D2O) δ 8.42 (s, 1/2H), 8.39 (s, 1/2H), 7.52 (m, 6H), 6.12 (m, 2H), 4.07 (s, 3H), 3.93 (m, 5H), 3.72 (m, 3H), 3.67 (m, 2H), 3.52 (m, 2H), 3.05 (m, 2H), 1.93 (m, 2H), 1.74 (m, 2H), 1.50 (m, 2H); MS m/z: (M+H-라이신)+ C23H26N4O9P에 대한 계산치 533.14, 실측치 533.03. M.P. 166.7 내지 172.2℃. 몇개의 상이한 피크의 비교 1H NMR 집적을 사용하여 IVa에 대한 라이신의 비는 모 프로드럭에 대하여 라이신 1.05:1 내지 1.2:1의 범위로 계산된다. 염 형태는 하이드레이트인 것으로 결정되었다. DSC (시차주사열량측정법 (differential scanning calorimetry)) 및 TGA (열중력분석 (thermal gravity analysis))를 기초로 하여, 관찰된 수분 함량은 2.80%이다. 모노하이드레이트에 대한 이론적 계산은 2.58%이다. 따라서, 하이드레이트에서 모분자에 대한 물의 비는 1:1 내지 ~1.5:1의 범위가 될 수 있다.
실시예 7
결정성 Ic (유리산 모노-하이드레이트)의 제조
Figure 112006074171808-pct00067
질소 하에 실온에서, 오븐-건조된 둥근 바닥 플라스크 내의 무수 THF (10 ㎖) 중의 IVc (600 ㎎, 1.27 mmol)의 혼합물에 NaH (153 ㎎, 6.38 mmol, 건조 분말, 95%)를 첨가하고, 백색 현탁액을 가스 방출이 관찰되지 않을 때까지 교반하였다. 그 후, 혼합물에 I2 (375 ㎎, 1.48 mmol)를 첨가하고, 실온에서 3 시간 동안 교반하 였다. 반응혼합물에 NaH (153 ㎎, 6.38 mmol, 건조 분말, 95%)를 첨가하고, 혼합물을 약 5 내지 10 분 동안 교반하였다. 조 클로로메틸 디-tert-부틸포스페이트 (2.0 g, 약 1.6 ㎖, 7.79 mmol)를 혼합물에 첨가한 다음에, 실온에서 15 시간 동안 교반하였다. 반응액의 LCMS 분석은 출발물질의 >97% 전환을 나타내었다. 휘발성 물질을 증발시킨 후에, 잔류물을 CH2Cl2 (10 ㎖)에 첨가하고, 얼음-수욕 중에서 냉각시키고, TFA (10 ㎖)를 서서히 첨가하고, 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응혼합물을 증발시키고, 잔류물을 CH2Cl2 (50 ㎖)와 H2O (50 ㎖) 사이에 분배시켰다. CH2Cl2 층을 약간의 비용해된 갈색을 띈 고체를 함유하는 반응 플라스크에 붓고, 이 혼합물을 묽은 NaHCO3 수용액 (50 ㎖)으로 추출하였다. 수성 혼합물을 역상 정제용 HPLC (용매 A: 10% MeOH-90% H2O-0.1% TFA; 용매 B: 90% MeOH-10% H2O-0.1% TFA; 출발 %B= 0, 최종 %B= 100; 구배시간= 6 분; 유속= 45 ㎖/분; 칼럼: 페노메넥스-루나 (phenomenex-Luna) 30×50 ㎜, S5; 수거된 분획: 3.65 내지 4.05 분)에 의해서 정제하였다. 수거된 분획을 증발 건고시키고, 잔류물을 고진공 하에서 건조시켜 연황색 고체로서 산 Ic를 수득하였다 (356.6 ㎎); 1H NMR: (500 MHz, CD3OD) δ 9.05 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.47 (b s, 5H), 5.93 (d, J= 12, 2H), 4.10 (s, 3H), 4.00-3.40 (b s, 8H), 2.53 (s, 3H); 19F NMR 분석은 물질이 잔류하는 TFA를 함유하였음을 나타내었다 (백분율은 정량화되지 않았다); 분석적 HPLC 방 법: 시작 %B= 0, 최종 %B= 100, 구배시간= 2 분, 유속= 5 ㎖/분, 칼럼: Xterra MS C18 7u 3.0×50 ㎜, LC/MS: (ES+) m/z (M+H)+= 584, HPLC Rt= 0.983.
172.2 ㎎의 정제된 산 Ic를 1 ㎖의 H2O에 용해시킨 다음에, 약 0.3 ㎖의 무수 EtOH (200 프루프 (proof))를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 냉장고 (온도 약 3℃)에서 정치시켰으며, 그 후에 결정성 물질이 관찰되었다. 그 후, 혼합물을 주위온도로 가온하고, H2O를 사용하여 3 ㎖의 용적으로 희석한 다음에, 20 ㎖의 MeCN을 서서히 첨가하였다. 첨가가 완료된 후, 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반한 다음에 여과하였다. 수거된 고체 (90 ㎎)를 진공 중에서 건조시킨 다음에, 고진공 하에서 건조시켰다. 이 물질은 분말 x-선 시험에 의해서 결정성인 것으로 나타났다; C25H26N7O8PㆍH2O에 대해 계산된 원소분석: C 49.92; H 4.69; N 16.30; 관찰치: C 49.66; H 4.62; N 15.99; mp= 205℃ (시차주사열량분석법에 의해서 측정됨). 결정성 물질에 대한 1H NMR 패턴을 정제된 산으로부터의 패턴과 비교하였으며, 둘 다 구조와 일치하였다.
실시예 8
Iab (모노 L 라이신 염)의 제조: {3-[(4- 벤조일피페라진 -1-일)(옥소)아세틸]-4,7-디 메 톡시-1H- 피롤로[2,3-c]피리딘 -1-일} 메틸 디하이드로젠 포스페이트 , L-라이신 염 (1:1).
반응의 순서는 실시예 8에 대한 반응식에 기술되어 있다.
실시예 8에 대한 반응식
Figure 112006074171808-pct00068
디- tert -부틸 클로로메틸 포스페이트의 제조
Figure 112006074171808-pct00069
비스-tert 부틸 포스페이트의 테트라부틸암모늄 염 (45.1 g, 0.1 mol) 및 클로로요오도메탄 (200 g, 1.14 mol)을 100 ㎖의 벤젠 내에서 배합시키고, 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반한 다음에, 벤젠을 진공 하에서 제거하였다. 500 ㎖의 에틸 에테르의 일부분을 잔류물에 첨가하고, 불용성 고체를 여과하였다. 여액을 진공 중에서 농축시키고, 진공 펌프 상에서 휘발성 물질을 제거하여 담황색 또는 담갈색 오일로서 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트를 제공하였으며, 이것을 더 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
IIa 의 제조: (3-(2-(4- 벤조일피페라진 -1-일)-2- 옥소아세틸 )-4,7- 디메톡 시-1H- 피롤로[2,3-c]피리딘 -1-일) 메틸 디- tert -부틸 포스페이트
Figure 112006074171808-pct00070
NaH (2.4 g, 60 mmol, 오일 중의 60%)를 무수 THF (120 ㎖) 중의 IVa의 현탁액 (8.4 g, 20 mmol)에 서서히 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 무수 THF (10 ㎖)에 용해된 요오드 (5 g, 20 mmol)를 발포가 억제되도록 하는 속도로 교반 용액에 서서히 주의해서 첨가하였다. 첨가가 완료된 후, 생성된 혼합 물을 주위온도에서 추가로 15 분 동안 교반한 다음에, 단계 1 에 기술된 바와 같이 수득된 ~0.1 mol 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트를 첨가하였다. 16 시간 동안 교반한 후에, 반응혼합물을 얼음으로 냉각시킨 NH4OAc (30%) (120 ㎖)에 붓고, 이어서 EtOAc (3×300 ㎖)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하여 물 (100 ㎖)로 세척한 다음에 염수 (100 ㎖)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 중에서 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이것을 실리카겔 크로마토그라피 (EtOAc/Et3N (100/1)로 용출시킨 다음에 EtOAc/MeOH (100/1)로 용출시킴)에 의해서 정제하여 몇번의 주행으로 담황색 고체로서 디에스테르 IIa (9.0-10.3 gs, AP ~75%)를 70-80%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.09 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.40 (b, 5H), 6.15 (d, 2H, J= 11.5 Hz), 4.05 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.90-3.30 (b, 8H), 1.39 (s, 18H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 185.5, 170.7, 166.5, 146.9, 146.2, 139.6, 135.3, 130.2, 128.7, 128.4, 127.2, 124.5, 122.0, 120.8, 115.8, 83.8, 73.2, 57.3, 53.5, 46.1, 41.7, 29.8; MS m/z (M+H)+ C31H42N4O9P에 대한 계산치 645.27, 실측치 645.10.
Iab 의 제조: {3-[(4- 벤조일피페라진 -1-일)(옥소)아세틸]-4,7- 디메톡시 -1H-피 롤로[2,3-c]피리 딘-1-일} 메틸 디하이드로젠 포스페이트 , L-라이신 염 (1:1)
Figure 112006074171808-pct00071
500 ㎎의 디에스테르 IIa를 물 (3 ㎖)과 아세톤 (3 ㎖)의 혼합물에 용해시켰다. 생성된 혼합물을 40℃에서 16 시간 동안 교반하여 가용매분해가 완결되도록 하였다. 이 반응혼합물 (~69 AP)에 4 M 라이신 수용액을 첨가하여 pH를 4.83으로 조정하였다. 반응혼합물에 아세톤 (35 ㎖)을 45-50℃에서 30분 이내에 서서히 첨가하였다. 45℃에서, 맑은 용액을 결정성 Iab로 접종하고, 이 온도에서 45 분 동안 교반상태로 유지시켰다. 아세톤의 첨가가 완료된 후에, 용액을 4 시간 이내에 실온으로 냉각시키고, Iab의 결정화를 밤새 완결시켰다. 고체를 여과에 의해서 수거하여 질소 하에서 2 시간 동안 흡인하였다. 백색 결정성 고체를 하우스 진공 하에 50-55℃에서 24 시간 동안 건조시켜 343 ㎎의 Iab를 수득하였다.
상기 공정에서 수득된 Iab: 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.38 (s, 1H), 7.49 (m, 6H), 6.13 (d, 2H, J= 10.5 Hz), 4.06 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 4.00-3.40 (m, 8H), 3.58 (t, 1H, J= 6 Hz), 2.92 (t, 2H, J= 7.5 Hz), 1.90-1.40 (m, 6H); 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ 186.1, 173.2, 171.8, 167.8, 147.4, 146.4, 141.0, 135.4, 130.4, 128.8, 127.2, 124.6, 122.3, 120.2, 114.6, 73.2, 56.6, 54.7, 53.1, 46.0, 41.6, 39.2, 30.5, 27.0, 22.0. HRMS m/z: (M-라이신+H)+ C23H26N4O9P에 대한 계산치 533.1437, 실측치 533.1437. 분석 계산치: C, 51.32; H, 5.79; N, 12.38; P, 4.56; 실측치: C, 48.54; H, 5.32; N, 11.76; P, 4.04. 융점 170℃.
다른 방법 (메틸렌 클로라이드 중에서 TFA에 의한 가수분해)을 통해서 수득된 Iab는 1.70 몰 하이드레이트 및 1.14 몰 라이신 염이었다. 1H NMR (500 MHz, D2O, 60℃) δ 8.72 (s, 1H), 7.84 (m, 6H), 6.44 (d, 2H, J= 10 Hz), 4.41 (s, 3H), 4.27 (s, 3H), 4.3-3.7 (m, 8H), 4.10 (t, 1H, J= 5 Hz), 3.39 (t, 2H, J= 5 Hz), 2.30-1.80 (m, 6H); 13C NMR (125 MHz, D2O, 27℃) δ 186.7, 174.9, 173.2, 167.9, 147.7, 145.7, 142.6, 134.3, 131.1, 129.2, 127.1, 124.3, 122.4, 120.1, 113.8, 73.5, 57.1, 54.9, 54.4, 47.7, 47.1, 46.3, 45.7, 42.6, 42.1, 42.0, 41.5, 39.5, 30.2, 26.8, 21.8. HRMS m/z: (M-라이신+H)+ C23H26N4O9P에 대한 계산치 533.1437, 실측치 533.1425. 분석 계산치: C, 49.11; H, 6.13; N, 12.05; 실측치: C, 48.93; H, 6.26; N, 12.07. 융점 168-172℃.
실시예 9
Ibb (모노 L 라이신 염)의 제조: [3-[(4- 벤조일피페라진 -1-일)(옥소)아세틸]-4-플 루오 로-7-(1H-1,2,3- 트리아졸 -1-일)-1H- 피롤로[2,3-c]피리딘 -1-일] 메틸 디 하이드로젠 포스페이트 , L-라이신 염 (1:1)
반응의 순서는 실시예 9에 대한 반응식에 기술되어 있다.
실시예 9에 대한 반응식
Figure 112006074171808-pct00072
디- tert -부틸 클로로메틸 포스페이트의 제조
Figure 112006074171808-pct00073
비스-tert-부틸 포스페이트의 테트라부틸암모늄 염 (57 g, 0.126 mol, Digital Specialty Chemicals) 및 클로로요오도메탄 (221 g, 1.26 mol)을 실온에서 4 시간 동안 교반한 다음에, 휘발성 물질을 진공 중에서 제거하였다. 잔류물에 500 ㎖의 에틸 에테르를 첨가하고, 불용성 고체를 여과하여 제거하였다. 여액을 농축시키고, 진공 펌프를 사용하여 마지막으로 휘발성 물질을 제거하여 일반적으로 담황색 또는 담갈색 오일로서 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트 (112 g)를 제공하였으며, 이것은 더 정제하지 않고 다음 단계에 사용되었다.
IIb 의 제조: (3-(2-(4- 벤조일피페라진 -1-일)-2- 옥소아세틸 )-4- 플루오로 -7-(1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-1-일)메틸 디- tert -부틸 포스페이트
Figure 112006074171808-pct00074
NaH (5.65 g, 광유 중의 95% 분산액, 0.224 mol)를 무수 THF (400 ㎖) 중의 IVa (20 g, 44.7 mmol)의 현탁액에 서서히 첨가하고, 혼합물을 실온에서 0.5 시간 동안 교반하였다. 무수 THF (20 ㎖)에 용해된 요오드 (11.3 g, 44.5 mmol)의 용액을 반응이 격렬하게 되는 것을 방지하는 속도로 교반 용액에 서서히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 추가로 3 시간 동안 교반한 다음에, 두번째 분량의 95% NaH (5.65 g, 0.224 mol)를 도입시켰다. 주위온도에서 15 분 후에, 단계 1로부터 수득된 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트 (112 g)를 한꺼번에 첨가하였다. 주위온도에서 16 시간 동안 교반한 후에, 반응혼합물을 얼음으로 냉각시킨 NH4OAc (30%) (200 ㎖)에 붓고, 이어서 EtOAc (3×500 ㎖)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하여 물 (200 ㎖)로 세척한 다음에 염수 (200 ㎖)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 중에서 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이것을 실리카겔 크로마토그라피 (EtOAc/MeOH/Et3N (100/1/1)로 용출)에 의해서 정제하여 담황색 고체로서 15.0 gs (85% AP에 대해 보정된 수율 43%)의 디에스테르 IIb를 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.36 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.41 (b, 5H), 5.90 (d, 2H, J= 14.5 Hz), 3.90-3.40 (b, 8H), 1.23 (s, 18H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 182.9, 170.7, 165.1, 154.6, 152.5, 144.1, 135.1, 134.0, 131.9, 130.3, 128.7, 128.3, 127.2, 125.9, 124.3, 114.0, 84.1, 74.1, 46.2, 41.9, 29.6; MS m/z (M+H)+ C31H38FN7O7P에 대한 계산치 670.26, 실측치 670.34.
Ibb (모노 L 라이신 염)의 제조: [3-[(4- 벤조일피페라진 -1-일)(옥소)아세틸]-4- 플루오로 -7-(1H-1,2,3- 트리아졸 -1-일)-1H- 피롤로[2,3-c]피리딘 -1-일]메틸 디하이드로젠 포스페이트 , L-라이신 염 (1:1)
Figure 112006074171808-pct00075
디에스테르 IIb (27 g)를 물 (55 ㎖)과 아세톤 (55 ㎖)의 혼합물에 용해시켰다. 생성된 혼합물 (pH: 측정되지 않음)을 40℃에서 16 시간 동안 교반하여 가용매분해를 완결시켰다. 이 반응혼합물에 4 M 라이신 수용액을 첨가하여 pH를 3.51 로 조정하였다. 용액에 EtOH (500 ㎖)를 첨가하였으며, 플라스크 벽은 밤새 약간의 생성물로 코팅되었다. 그 후, 맑은 용액을 또 다른 플라스크에 옮기고, EtOH (1500 ㎖)를 반응혼합물에 ~3 시간 이내에 서서히 첨가하였다. 에탄올의 첨가가 완료된 후에, 용액을 실온에서 48 시간 동안 교반하고, 생성된 고체 (Ibb)를 여과에 의해서 수거하고, 에탄올로 세정하였다. 백색 결정성 고체를 하우스 진공 하에 55℃에서 24 시간 동안 건조시켜 10.92 g의 Ibb (98 AP)를 수득하였다.
이 고체를 또 다른 공정으로부터 수득된 12.5 g의 염과 70 ㎖의 물 중에서 더 혼합시켰다. 그 후, EtOH (1000 ㎖)를 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 20 시간 이상 동안 교반하였다. 고체를 여과하여 수거하고, EtOH (2×80 ㎖)로 세정하고, 질소 대기 하에 50℃에서 하우스 진공 하에 44 시간 동안 건조시켜 21.5 g의 Ibb를 98.7의 AP로 수득하였다.
상기 방법에서 수득된 Ibb는 1.12%의 물, 0.8%의 TFA 및 0.05%의 에탄올을 함유하는 ~1 몰 라이신 염이었다. 1H NMR (500 MHz, CD3OD, 50℃) δ 8.94 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.2 (s, 1H), 7.83 (m, 5H), 5.81 (d, 2H, J= 12.5 Hz), 4.30-3.70 (m, 8H), 4.08 (t, 1H, J= 6.5 Hz), 3.67 (t, 2H, J= 10 Hz), 2.26 (m, 2H), 2.07 (m, 2H), 1.88 (m, 2H); 13C NMR (125 MHz, D2O, 30℃) δ 185.2, 174.9, 173.3, 166.8, 153.1, 146.8, 134.8, 134.3, 131.3, 131.1, 130.3, 129.3, 128.9, 128.7, 128.5, 127.2, 124.2, 112.6, 74.0, 54.9, 47.9, 47.2, 46.4, 45.9, 42.7, 42.2, 42.0, 41.7, 39.5, 30.3, 26.8, 21.8. MS m/z: (M-라이신+H)+ C23H22FN7O7P에 대한 계산치 558.1302, 실측치 558.1293. 분석 계산치: C, 48.75; H, 5.07; N, 17.63; P, 4.33; 실측치: C, 49.02; H, 4.90; N, 17.90; P, 4.37. 융점 193℃. pKa (전위차) 6.1, 9.1.
실시예 10
Icb (모노 트로메타민 염)의 제조: [3-[(4- 벤조일피페라진 -1-일)(옥소)아세틸]-4- 메톡시 -7-(3- 메틸 -1H-1,2,4- 트리아졸 -1-일)-1H- 피롤로[2,3-c]피리딘 -1-일] 메틸 디하이드로젠 포스페이트 , 2-아미노-2-( 하이드록시메틸 )프로판-1,3- 디 올 염 (1:1)
반응의 순서는 실시예 10에 대한 반응식에 기술되어 있다.
실시예 10에 대한 반응식
Figure 112006074171808-pct00076
디- tert -부틸 클로로메틸 포스페이트의 제조
Figure 112006074171808-pct00077
테트라부틸암모늄 디-tert-부틸 포스페이트 (57 g, 0.126 mol, Digital Specialty Chemicals) 및 클로로요오도메탄 (221 g, 1.26 mol)의 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반한 다음에, 휘발성 물질을 진공 중에서 제거하였다. 잔류물에 500 ㎖의 에틸 에테르를 첨가하고, 불용성 고체를 여과하여 제거하였다. 여액을 진공 중에서 농축시키고, 진공 펌프를 사용하여 잔류하는 휘발성 물질을 제거하여 담갈색 또는 담황색 오일로서 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트를 제공하였으며, 이것은 더 정제하지 않고 다음 단계에 사용되었다.
IIc 의 제조: (3-(2-(4- 벤조일피페라진 -1-일)-2- 옥소아세틸 )-4- 메톡시 -7-(3-메틸-1H-1,2,4- 트리아졸 -1-일)-1H- 피롤로[2,3-c]피리딘 -1-일) 메틸 디- tert -부틸 포스페이트
Figure 112006074171808-pct00078
NaH (2.6 g, 10.3 mmol, 오일 중의 95%, 5 eq.)를 무수 THF (100 ㎖) 중의 IVc (10.0 g, 21.1 mmol)의 현탁액에 서서히 첨가하고, 혼합물을 실온에서 0.5 시간 동안 교반하였다. 무수 THF (10 ㎖)에 용해된 요오드 (5.27 g, 20.8 mmol)의 용액을 발포하거나 반응이 격렬하게 되는 것을 방지하는 속도로 교반 용액에 서서히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 추가로 3 시간 동안 교반한 다음에, 두번째의 2.6 g 분량의 NaH (5.65 g, 0.224 mol)를 도입시켰다. 주위온도에서 15 분 후에, 단계 1로부터 수득된 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트의 전 배취인 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트를 첨가하였다. 주위온도에서 16 시간 동안 교반한 후에, 반응혼합물을 얼음으로 냉각시킨 NH4OAc (30%) (120 ㎖)에 붓고, 이어서 EtOAc (3×300 ㎖)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하여 물 (100 ㎖)로 세척한 다음에 염수 (100 ㎖)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 중에서 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이것을 실리카겔 크로마토그라피 (EtOAc/Et3N (50/1)로 용출시킨 다음에 EtOAc/MeOH (100/1)로 용출시킴)에 의해서 정제하여 담황색 고체로서 8.0 g (~75% AP, ~41% 수율)의 디에스테르 IIc를 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.82 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.47 (b, 5H), 6.00 (d, 2H, J= 14.5 Hz), 4.10 (s, 3H), 4.00-3.40 (b, 8H), 2.49 (s, 3H), 1.28 (s, 18H); 13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ 18.6, 176.4, 172.9, 168.0, 162.6, 152.6, 147.5, 144.0, 136.5, 131.5, 130.8, 129.9, 129.1, 129.3, 126.1, 124.0, 116.2, 85.8, 75.4, 61.6, 57.7, 30.1, 22.2, 13.7; HRMS m/z: (M+H)+ C33H43N7O8P에 대한 계산치 696.29, 실측치 696.34.
Icb (모노 L 트로메타민 염)의 제조: [3-[(4- 벤조일피페라진 -1-일)(옥소)아세틸]-4- 메톡시 -7-(3- 메틸 -1H-1,2,4- 트리아졸 -1-일)-1H- 피롤로[2,3-c]피 리딘-1-일] 메틸 디하이드로젠 포스페이트 , 2-아미노-2-( 하이드록시메틸 )프로판-1,3-디올 염 (1:1)
Figure 112006074171808-pct00079
500 ㎎ (~75 AP, 0.54 mmol)의 디에스테르 IIc를 물 (2.5 ㎖)과 아세톤 (2.5 ㎖)의 혼합물에 용해시켰다. 생성된 혼합물을 40℃에서 16 시간 동안 교반하여 가용매분해를 완결시켰다. 이 반응혼합물에 3.0 M TRIS (모노 트로메타민) 수용액을 첨가하여 pH를 3.32로 조정하였다. 반응혼합물에 아세톤 (30 ㎖)을 1 시간 이내에 서서히 첨가하였다.* 아세톤의 첨가가 완료된 후에, 용액을 밤새 교반하여 Icb의 결정화를 완결시켰다. 고체를 여과에 의해서 수거하여 20:1 아세톤-물 (2×5 ㎖)로 세정하였다. 백색 결정성 고체를 질소 대기 하에 50℃에서 하우스 진공 하에 24 시간 동안 건조시켜 290 ㎎의 Icb를 수득하였다 (>98.5 AP).
* 약 15 및 20 ㎖의 아세톤을 첨가한 후에, 반응혼합물을 결정성 Icb로 접종하였다.
상기 공정에서 수득된 Icb: 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.83 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.49 (b, 5H), 5.469 (d, 2H, J= 13 Hz), 4.11 (s, 3H), 4.00-3.40 (m, 8H), 3.66 (s, 6H), 2.50 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ 185.6, 171.9, 167.4, 161.4, 151.7, 146.9, 143.8, 135.4, 130.3, 129.7, 128.8, 127.2, 124.9, 122.6, 114.3, 73.5, 61.8, 59.9, 56.5, 46.0, 41.7, 12.6. HRMS m/z: (M-트리스아민+H)+ C25H27N7O8P에 대한 계산치 584.1659, 실측치 584.1664. 분석 계산치: C, 49.43; H, 5.29; N, 15.90; P, 4.39; 실측치: C, 49.18; H, 5.38; N, 15.59; P, 4.26. 융점 203℃.
다른 방법 (메틸렌 클로라이드 중에서 TFA에 의한 가수분해)을 통해서 수득된 Icb는 0.47%의 물, 0.1%의 아세톤 및 0.05%의 메탄올을 함유하는 ~ 1 몰 모노 트로메타민 염이었다. 1H NMR (500 MHz, d6-DMSO, 30℃) δ 8.77 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.44 (b, 5H), 5.42 (d, 2H, J= 15 Hz), 4.02 (s, 3H), 3.70-3.30 (m, 8H), 3.41 (s, 6H), 2.38 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3, 30℃) δ 184.8, 169.0, 165.8, 160.3, 150.4, 146.2, 143.2, 135.4, 129.4, 128.9, 128.2, 127.7, 126.9, 123.2, 122.2, 112.9, 72.3, 60.7, 59.0, 56.7, 13.4. MS m/z: (M-트리스아민+H)+ C25H27N7O8P에 대한 계산치 584.2, 실측치 584.0. 분석 계산 치: C, 49.11; H, 5.37; N, 15.76; P, 4.32; 실측치: C, 48.88; H, 5.28; N, 15.71; P, 4.16. 융점 201-205℃.
Iac 의 추가의 염을 형성하는 일반적 방법
Figure 112006074171808-pct00080
방법 A:
1.2 eq.의 금속 알콕사이드를 THF 중의 인산의 용액에 첨가하고, 염 형태로서 침전물을 수거하였다.
방법 B:
2.2 eq. (Na, K의 경우) 또는 1.2 eq. (Mg의 경우)의 금속 알콕사이드를 THF 중의 인산의 용액에 첨가하였다. 2 시간 후에, 용매를 증발시키고, MeOH를 첨가하여 맑은 용액을 제공하였다. 그 후, EtOH 또는 iPrOH를 용액이 혼탁하게 될 때까지 용액에 첨가하였다. 그 후, MeOH를 주의해서 첨가하여 용액이 바로 다시 맑아지게 하였다. 혼합된 용액을 공기 중에 16 시간 동안 개방시키고, 생성된 침전을 염 형태로 수거하였다.
방법 C:
2.2 eq.의 아민을 THF 중의 인산의 용액에 첨가하였다. 2 시간 후에, 용매를 증발시키고 MeOH를 첨가하여 맑은 용액을 제공하였다. 그 후, EtOH 또는 iPrOH 를 용액이 혼탁하게 될 때까지 용액에 첨가하였다. 그 후, MeOH를 주의해서 첨가하여 용액이 바로 다시 맑아지게 하였다. 혼합된 용액을 공기 중에 16 시간 동안 개방시키고, 생성된 침전을 염 형태로 수거하였다.
Figure 112006074171808-pct00081
Figure 112006074171808-pct00082
실시예 11
IIa 로부터 화합물 II'a 의 제조
Figure 112006074171808-pct00083
디-포스페이트 에스테르 IIa (500 ㎎)를 THF 중의 10% TFA 5 ㎖에 용해시켰다. 반응혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반한 후에, 10% Na2CO3 수용액 (30 ㎖)에 의해서 켄칭하였다. EtOAc (50 ㎖)로 세척한 후에, 수성상을 진공 하에서 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이것을 시마주 (Shimadzu) 자동화 정제용 HPLC 시스템을 사용해서 정제하여 목적하는 모노-포스페이트 II'a (26.5 ㎎)를 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) d 8.13 (s, 1H), 7.40 (b, 6H), 6.13 (d, 2H, J= 11.5 Hz), 4.05 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.90-3.40 (m, 8H), 1.39 (s, 9H); MS m/z: (M+H)+ C27H34N4O9P에 대한 계산치 589.21, 실측치 589.13; LC 체류시간 1.32 분 (칼럼: Xterra 4.6×50 ㎜ C18 5 ㎛).
디- tert -부틸 클로로메틸 포스페이트의 대체 제조방법
Figure 112006074171808-pct00084
반응
불활성화된 반응기에 디-tert-부틸 칼륨 포스페이트 (1.69 ㎏), 4.0 eq.의 탄산나트륨 및 0.05 eq.의 테트라부틸 암모늄 하이드로젠 설페이트를 맨웨이 (manway)를 통해서 첨가하였다. 그 후, 메틸렌 클로라이드 (7.7 L/㎏)를 스프레이볼 (sprayball)을 통해서 펌핑하여 반응기 벽을 씻어 내렸다. 10℃ 이하의 자켓 (jaket) 온도에서 발열성 물 충진물을 10 분의 기간에 걸쳐서 첨가하였다 (7.6 L/㎏). 관련된 발열은 최소였으며, 배취 온도를 첨가의 과정에 걸쳐서 11.1℃에서 16.2℃로 상승하였다. 자켓 및 배취 온도가 각각 거의 7℃ 및 15℃인 상태에서 2.0 eq.의 클로로메틸설포닐클로라이드 (CMCS)를 추가의 깔때기를 통해서 충진하였다. 충진은 2 시간 동안 계속하였으며, 자켓 온도는 충전하는 중에 20℃로 서서히 상승시켰다. CMCS 충진 중에 최대 배취 온도는 25.3℃였다. 예비 실험실 데이타가 더 낮은 배취 온도에서는 발열이 느릴 수 있음을 시사하였기 때문에, 자켓 온도는 충진하는 중에 발열이 시작하는 것을 보장도록 서서히 상승시켰다. 반응혼합물을 교반하였으며, 3.5 시간 후에 NMR 샘플은 반응이 72% 진행하였음을 나타내었다. 반응을 19.7 내지 23.6℃의 배취 온도에서 밤새 진행시켰다 (델타 V 히스토리안 (Delta V historan)). 16 시간 후에 취한 NMR 샘플은 76%의 반응 전환을 나타내었다. 실험실 배취는 60 내지 80%의 전환율 범위였다.
후처리
반응이 완료되는 것으로 생각된 후에 추가로 9.3 L/㎏의 물을 배취에 첨가하여 상을 분리하였다. 생성물이 풍부한 하부상은 카보이 (carboy)에 옮기고, 상부 수성상은 폐기물로 보내졌다. 작은 래그 (rag) 층은 생성물이 풍부한 유기층으로 유지되었다. 유기상을 R-1A로 다시 보내고, 추가로 5.1 L/㎏의 물을 세척액으로 첨가하였다. 상을 분리시켰으며, 약 18.5 ㎏의 생성물이 풍부한 유기층은 카보이로 보내지고, 상부 수성상은 폐기물로 보내졌다. 래그 층 또는 고체는 두번째 분리시에는 관찰되지 않았다. 그러나, 생성물이 풍부한 유기층을 폴리시 여과하여 침전된 염을 제거하도록 추천된다.
메틸렌 클로라이드 증류
생성물이 풍부한 유기층을 EVAPO-1A의 회전증발기 보울 (bowl)에 옮겼다. 메틸렌 클로라이드의 증류는 약 22℃의 자켓 온도에서 개시되었다. 증류속도는 4.5 시간 후에 느려졌으며, 배취 샘플을 취하여 메틸렌 클로라이드 함량을 분석하였다. NMR 분석은 메틸렌 클로라이드에 대한 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트의 4:1 비를 나타내었다. 이 스트림의 전형적인 실험실 결과는 10:1을 나타내었으며, 따라서 증류는 회전증발기 자켓 온도의 증가에 따라 계속되었다. 추가로 2.5 시간 후에, 증류속도는 중지하였다. 배취의 NMR 샘플은 메틸렌 클로라이드에 대한 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트의 비가 5:1로 상승하였음을 시사하였다. 최대 회전증발기 자켓 온도는 28.4℃였다.
디- tert -부틸 클로로메틸 포스페이트 오일의 순도
디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트 오일의 NMR 분석은 역가가 100% 이상인 것을 나타냈다. 개발작업은 일반적으로 100±10%의 역가를 갖는 물질을 생산하였다. 칼-피셔 (Karl-Fischer) 분석은 0.02 wt%의 수분 함량을 측정하였으며, GC 분 석은 10.69 wt%의 메틸렌 클로라이드를 측정하였다. 따라서, 보고된 역가는 오일 내의 메틸렌 클로라이드 및 수분 기여로 인하여 82.29 wt%이다.
디- tert -부틸 클로로메틸 포스페이트의 저장
디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트 오일은 냉장실 (cold room) 내에 넣고, 온도를 스트립챠트 기록계 (stripchart recorder)로 모니터하였다. 실험실 배취는 일반적으로 0 내지 5℃ 사이에서 유지시켰다. 냉장실에서 104 시간 유지시킨 후에 생성물의 NMR은 물질이 역가를 상실하지 않았음을 시사하였다. (캠페인 중에 수행된 안전성 시험은 유지하는 중에 오일이 후속 압력 증강에 의하여 자체-가열됨을 나타낸다).
NMR 표준품 제조 및 샘플 제조
트리메틸 포스페이트 ( TMPO 4 ) 표준용액의 제조
TMPO4의 표준용액은 100 M% 이론적 수율을 기초로 제조되어야 한다. 예를 들어, 디-t-부틸 칼륨 포스페이트 염의 10 g 투입량은 10.41 g (0.402 moles)의 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트를 수득하여야 한다. 반응혼합물 내의 디클로로메탄의 용적은 75 ㎖가 될 수 있다. 용액의 몰농도는 0.536이다. TMPO4 용액은 이러한 몰농도로 제조되어야 하며, 이 용액의 0.5 ㎖를 반응으로부터의 0.5 ㎖의 디클로로메탄 층과 배합하여야 한다. 31P NMR에서 나타난 적분치는 직접 비교될 수 있으며, 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트의 전환율 %를 제공할 수 있다.
반응 수성상에서 미반응 출발물질 %의 측정
반응 수성상의 용적을 기록한 후에, 기지의 중량의 내부 표준물 TMPO4를 함유하는 1-드램 (dram) 바이알 내에 0.500 ㎖를 정확하게 옮겼다. 대략 0.24 ㎖의 D2O를 첨가하였다. 진탕하여 철저히 혼합하였다. 31P-콴트 스펙트럼 (quant spectra)을 수득하였다.
미반응 출발물 %의 계산:
Figure 112006074171808-pct00085
실시예:
Figure 112006074171808-pct00086
생성물 오일의 역가 -%의 측정
증류된 생성물 오일의 순중량을 기록한 후에, 기지의 중량의 내부 표준물 TMPO4을 함유하는 1-드램 스크류-탑 (screw-top) 바이알의 중량을 단다. 약 0.02 ㎖의 생성물 오일을 바이알 내로 옮기고, 생성물 오일의 순중량을 기록한다. 약 0.7 ㎖의 CDCl3를 첨가한다. 진탕하여 철저히 혼합한다. 31P-콴트 스펙트럼을 수 득한다. 잔류하는 상-전이촉매 (테트라-n-부틸-암모늄 비설페이트) 및 메틸렌 클로라이드의 존재에 대하여 1H NMR 스펙트럼을 조사한다. 이들을 생성물에 대한 몰%로서 보고한다.
역가-%의 계산:
Figure 112006074171808-pct00087
실예:
Figure 112006074171808-pct00088
디- tert -부틸 클로로메틸 포스페이트에 대한 NMR 데이타
1H NMR (300.13 MHz, CDCl3): δ 1.52 (s, 18H), δ 5.67 (d, J= 15.5, 2H)
13C NMR (75.47 MHz, CDCl3): δ 29.77 (d, J= 4.5, 6C), δ 73.44 (d, J= 7.5, 1C), δ 84.16 (d, J= 1.5, 2C).
31P NMR (121.49 MHz, CDCl3): δ -10.51 (s, 1P)
실시예 12
Iab ( IVa 의 프로- 드럭 )의 대용 제조방법
Figure 112006074171808-pct00089
오버헤드 교반기, 서모커플 (thermocouple), 첨가 깔때기, 질소 유입구 및 셉타 (septa)가 장치된 500 ㎖ 4-구 둥근 바닥 플라스크를 IVa (20.01 g, 47.37 mmol), K2CO3 (13.13 g, 95.00 mmol) 및 DMSO (100 ㎖, 1.41 moles)로 충진하고, 반응액을 실온에서 교반하여 담갈색 불균질 현탁액을 수득하였다. 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트 (14.83 g, 57.32 mmol)를 첨가 깔때기를 통해서 첨가하고, 반응액을 16-24 시간 동안 30℃로 가열한 후에, 반응액을 10℃로 냉각시켰다. 반응액에 DCM (200 ㎖)을 첨가한 다음에, 20℃ 하의 반응온도를 유지시키면서 물 (200 ㎖)로 켄칭하여 이상 혼합물을 수득하였다. 생성물이 풍부한 하부층을 분리하여 물 (200 ㎖)로 세척한 다음에, 오버헤드 교반기, 서모커플, 첨가 깔때기, 및 질소 유입구가 장치된 500 ㎖ 4-구 둥근 바닥 플라스크에 옮겼다. 트리플루오로아세트산 (53.0 ㎖, 700.94 mmol)을 첨가 깔때기를 통해서 첨가하여 약한 발열반응을 야기시켰다. 반응액을 1-3 시간 동안 교반한 다음에 0℃로 냉각시켰다. 메탄올 (300 ㎖)을 30℃ 하의 반응온도를 유지시키면서 첨가한 다음에, 0℃로 냉각시켰다. 반응 플라스크를 증류장치에 설치하고, 진공하에서 200 ㎖의 용적까지 농축시켰다 (200 토르, <30℃). 반응액을 Iac (0.200 g)로 접종한 다음에 실온에서 밤새 교반하여 슬러리를 수득하였다. 슬러리를 여과한 다음에, 습윤 케이크를 THF (300 ㎖)로 세척하고, 이어서 진공오븐 내에서 50℃로 밤새 건조시켜 연황색 내지 백색 분말 (23.94 g, 95%)을 생성시켰다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.30 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.44 (s, 5H), 6.12 (d, J= 10.6 Hz, 2H), 3.97 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.80-3.22 (m, 8H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 185.49, 169.26, 166.06, 146.20, 145.60, 140.64, 135.50, 129.68, 128.41, 127.04, 123.46, 121.17, 120.08, 114.32, 72.43, 56.92, 53.32, 45.22, 40.50; ES+ MS m/z (상대강도) 533 (MH+, 100), 453 (MH+-H3PO4, 15).
Figure 112006074171808-pct00090
서모커플, 오버헤드 교반기, 컨덴서 (condenser) 및 질소 유입구가 장치된 10 L 4-구 반응기에 Iac (611 g, 1.15 mol) 및 물 (3875 ㎖)을 첨가하였다. 생성된 현탁액에 라이신 (168 g, 1.15 mol)을 첨가하였다. 반응액을 실온에서 1 시간 동안 교반하고, 50℃로 가열한 다음에, 추가로 1 시간 동안 교반하면서 50℃에서 유지시켰다. 생성된 혼탁한 용액 (pH= 4.55)을 10 미크론 큐노 필터 (cuno filter)를 통해서 서모커플, 오버헤드 교반기, 컨덴서 및 질소 유입구가 장치된 20 L 4-구 반응기 내로 여과하였다. 반응액을 50℃로 가열한 다음에, 아세톤 (8 L)을 빠르게 첨가하였다. 반응액을 50℃로 가온한 다음에, 아세톤 (4 L)을 45℃ 이상의 반응온도를 유지시키면서 중등도의 속도로 첨가하였다. 반응액을 Iab (0.200 g)로 접종한 다음에, 5 시간에 걸쳐서 실온으로 냉각시켜 슬리러리를 생성시켰다. 슬러리를 실온에서 밤새 교반한 다음에, 여과하였다. 습윤 케이크를 아세톤 (4 L)으로 세척한 다음에, 진공오븐 내에서 25℃로 밤새 습윤 공기를 배출시키면서 건조시켜 솜털 모양의 백색 분말 (751 g, 96%)을 수득하였다.
실시예 13
Icb ( IVc 의 프로- 드럭 )의 대용 제조방법
Figure 112006074171808-pct00091
오버헤드 교반기, 서모커플, 증류장치 및 질소 유입구가 장치된 10 L 반응기에 IVc (200.00 g, 422.39 mmol), Cs2CO3 (344.06 g, 1.06 mol), KI (140.24 g, 844.81 mmol) 및 NMP (1.00 L, 10.38 mol)를 충진하였다. 반응액을 실온에서 교반하여 담갈색 불균질 현탁액을 수득하였다. 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트 (273.16 g, 1.06 mol)를 첨가 깔때기를 통해서 첨가하고, 반응혼합물을 16-24 시간 동안 교반하면서 30℃로 가열한 후에, 반응액을 5℃로 냉각시켰다. 반응액에 DCM (1.5 L)을 첨가한 다음에, 20℃ 하의 반응온도를 유지시키면서 물 (3.5 L)로 서서히 켄칭하여 이상 혼합물을 수득하였다. 생성물이 풍부한 하부층을 분리하여 물 (3.5 L×3)로 세척한 다음에, 반응기에 다시 옮겼다. 용액을 25℃ 이하의 온도를 유지시키면서 진공 하에서 1 L의 용적으로 농축시켰다. 그 후, 반응액을 IIc (0.200 g)로 접종하고, 실온에서 밤새 교반하여 슬러리를 수득하였다. 슬러리를 여과하고, 습윤 케이크를 MTBE (1 L)로 세척하고, 진공오븐 내에서 50℃로 밤새 건조시켜 황색/백색 분말 (207.1 g, 70%)을 생성시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.54 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.42 (s, 5H), 5.95 (d, J= 14.2 Hz, 2H), 4.06 (s, 3H), 3.97-3.36 (m, 8H), 2.50 (s, 3H), 1.27 (s, 18H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 184.64, 170.65, 165.91, 161.60, 150.82, 145.38, 141.89, 134.96, 130.20, 129.59, 128.68, 127.58, 127.10, 124.77, 122.64, 115.22, 83.90, 83.83, 73.69, 73.63, 56.95, 46.04, 41.66, 29.61, 29.56, 13.90; ES+ MS m/z (상대강도) 696 (MH+, 10), 640 (MH+-이소부틸렌, 30), 584 (MH+-2 이소부틸렌, 100).
Figure 112006074171808-pct00092
서모커플, 오버헤드 교반기, 컨덴서 및 질소 유입구가 장치된 10 L 4-구 반응기에 IIc (200.24 g, 287.82 mmol), 아세톤 (800.00 ㎖, 10.88 mol) 및 물 (800.00 ㎖, 44.41 mol)을 첨가하였다. 반응액을 20℃로 냉각시킨 다음에, 트로메타민 (33.62 g, 277.54 mmol)을 첨가하였다. 반응액을 40℃로 가열한 다음에, 모든 고체가 용해될 때까지 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응액을 20℃로 냉각시킨 다음에 10 미크론 큐노 필터를 통해서 서모커플, 오버헤드 교반기, 및 질소 유입구가 장치된 10 L 4-구 반응기 내로 여과하였다. 아세톤 (3 L)을 빠르게 첨가하고, 이어서 Icb (0.500 g)을 접종한 다음에, 추가의 아세톤 (3 L)을 첨가하였다. 반응액을 실온에서 밤새 교반하여 슬러리를 생성시킨 다음에 여과한다. 습윤 케이크를 아세톤 (800 ㎖)으로 세척한 다음에, 진공오븐 내에서 50℃로 밤새 건조시켜 솜털 모양의 백색 분말 (165.91 g, 82%)을 수득하였다.
추가의 정보: 유리산 중간체 Ic 의 분리
Figure 112006074171808-pct00093
서모커플, 오버헤드 교반기, 컨덴서 및 질소 유입구가 장치된 250 ㎖ 3 구 반응기 내에 IIc (10.0 g, 14.37 mmol), 아세톤 (40.00 ㎖, 544.15 mmol) 및 물 (40.00 ㎖, 2.22 mol)을 첨가하였다. 반응액을 40℃로 가열하고, 14-24 시간 동안 교반하였다. 반응액을 20℃로 냉각시킨 다음에, 3 시간 동안 교반하여 슬러리를 생성시켰다. 슬러리를 여과한 다음에 습윤 케이크를 아세톤 (40.00 ㎖)으로 세척하고, 이어서 진공오븐 내에서 50℃로 밤새 건조시켜 솜털 모양의 백색 분말 (7.00 g, 83%)을 생성시켰다. NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.84 (s, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.45 (s, 5H), 5.81 (d, J= 12.3 Hz, 2H), 4.03 (s, 3H), 3.91-3.19 (m, 8H), 2.39 (s, 3H); 13C NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 185.20, 169.32, 165.85, 160.75, 150.51, 146.30, 143.24, 135.53, 129.74, 129.22, 128.46, 127.34, 127.09, 123.67, 122.73, 113.94, 72.90 (d, 2 J C -P= 5 Hz), 57.01, 45.2 (bs), 40.8 (bs), 13.66. ES+ MS m/z (상대강도) 486 (MH+-H3PO4, 100).
실시예 14
Ibb ( IVb 의 프로- 드럭 )의 대용 제조방법
Figure 112006074171808-pct00094
오버헤드 교반기, 서모커플 및 질소 유입구가 장치된 10 L 반응기에 IVb (400.00 g, 894.73 mmol), Cs2CO3 (873.70 g, 2.68 mol), KI (297.70 g, 1.79 mol) 및 NMP (1.00 L, 10.38 mol)를 충진하였다. 반응혼합물을 실온에서 교반하여 담갈색 불균질 현탁액을 수득하였다. 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트 (460.50 g, 1.78 mol)를 첨가 깔때기를 통해서 첨가하고, 반응액을 16-24 시간 동안 30℃로 가열한 후에, 반응액을 5℃로 냉각시켰다. 반응액에 n-BuOAc (2.4 L)을 첨가한 다음에, 20℃ 하의 반응온도를 유지시키면서 물 (4 L)로 서서히 켄칭하여 이상 혼합물을 수득하였다. 하부 수층을 반응기로부터 분리한 다음에, 생성물이 풍부한 상부층을 IIc (0.40 g)로 접종하고, 실온에서 3 시간 동안 반하여 슬러리를 수득하였다. 슬러리를 여과한 다음에, 습윤 케이크를 MTBE (1.6 L)로 세척하고, 진공오븐 내에서 50℃로 밤새 건조시켜 황색/백색 분말 (483.2 g, 81%)을 생성시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.35 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.42 (s, 5H), 5.92 (d, J= 14.9 Hz, 2H), 4.02-3.40 (m, 8H), 1.24 (s, 18H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 182.75, 170.64, 152.07, 144.03, 134.91, 133.96, 131.82, 130.21, 128.68, 128.27, 128.00, 127.07, 125.81, 124.01, 113.82, 84.00, 83.93, 73.97, 46.12, 41.90, 29.57, 29.53; ES+ MS m/z (상대강도) 558 (MH+, 100).
Figure 112006074171808-pct00095
서모커플, 오버헤드 교반기, 컨덴서 및 질소 유입구가 장치된 300 ㎖ 4-구 반응기에 IIb (18.0 g, 26.87 mmol), IPA (36.00 ㎖, 470.92 mol) 및 물 (36.00 ㎖, 2.0 mol)을 첨가하였다. 반응액을 40℃로 가열하고, 18-24 시간 동안 교반하였다. 반응액을 20℃로 냉각시킨 다음에, 라이신 (3.73 g, 25.54 mmol)을 첨가하였다. 반응액을 모든 고체가 용해될 때까지 1 시간 동안 교반하였다. IPA (54 ㎖)를 30 분에 걸쳐서 첨가하고, 이어서 Ibb (0.180 g)로 접종하고, 추가로 30 분 동안 교반하였다. IPA (18 ㎖)를 1 시간에 걸쳐서 첨가한 다음에, 반응액을 50℃로 가열하여 묽은 슬러리를 생성시켰다. 반응액을 Ibb (0.180 g)을 접종한 다음에, IPA (36 ㎖)를 2 시간에 걸쳐서 첨가하고, 12 시간 동안 교반하여 슬러리를 생성시켰다. 반응액을 2 내지 3 시간 동안 70-80℃로 가열한 다음에 50℃로 냉각시켰다. IPA (59 ㎖)를 1 시간에 걸쳐서 첨가한 다음에 추가의 IPA (121 ㎖)를 1 시간에 걸쳐서 첨가하였다. 반응액을 2 시간에 걸쳐서 20℃로 냉각시킨 다음에 추가로 2 시간 동안 교반하고, 여과하였다. 습윤 케이크를 IPA (180 ㎖)으로 세척한 다음에, 진공오븐 내에서 50℃로 밤새 건조시켜 백색 분말 (15.43 g, 82%)을 수득하였다.
추가의 정보: 유리산 중간체 Ibc 의 분리를 위한 방법
Figure 112006074171808-pct00096
서모커플, 오버헤드 교반기, 컨덴서 및 질소 유입구가 장치된 500 ㎖ 3-구 플라스크 내에 IIb (50.00 g, 74.76 mmol), 아세톤 (100.00 ㎖, 1.36 mol) 및 물 (100.00 ㎖, 5.55 mol)을 첨가하였다. 반응액을 40℃로 가열하고, 18-24 시간 동안 교반하였다.
pH 프로브 (probe), 자기 교반봉 및 질소 유입구가 장치된 250 ㎖ 3 구 플라스크 내에 150 ㎖의 상기 Ibc 용액을 첨가한 다음에, 10 N NaOH로 pH를 pH= 6.2로 조정하였다. 용액을 분리 깔때기에 옮긴 다음에, EtOAc (100 ㎖) 및 이어서 DCM (100 ㎖)로 세척하고, 250 ㎖ 3-구 플라스크에 다시 옮겼다. 2 N HCl에 의해서 pH를 pH= 1.3으로 조정하고, 이어서 3 시간 동안 교반하여 슬러리를 생성시키고 여과하였다. 습윤 케이크를 MTBE (150 ㎖) 중에 재-슬러리화시킨 다음에, 여과하고, 이어서 THF/물 (100:1, 130 ㎖) 중에서 45 분 동안 재-슬러리화시키고, 여과하여 진공 오븐 내에서 50℃로 밤새 건조시켜 백색 분말 (10.0 g, 33%)을 생성시켰다. NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.69 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.41 (s, 5H), 5.47 (d, J= 13.3 Hz, 2H), 3.99-3.18 (m, 8H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 183.97, 169.23, 165.20, 151.69, 145.91, 135.48, 133.83, 131.59, 129.65, 129.11, 129.03, 128.42, 127.77, 127.49, 127.03, 122.62, 112.08, 72.57. ES+ MS m/z (상대강도) 558 (MH+, 100).
실시예 15
프로드럭 Ie 의 제조
단계 1
Figure 112006074171808-pct00097
2-(1-(2-(4- 메톡시 -7-(3- 메틸 -1H-1,2,4- 트리아졸 -1-일)-1H- 피롤로[2,3- c]피리딘-3-일)-2- 옥소아세틸 )피페리딘-4- 일리덴 )-2-(피리딘-2-일) 아세토니트 릴 ( IVe ) 의 제조: 2-(4-메톡시-7-(3-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-3-일)-2-옥소아세트산 (1.5 g), 2-(피페리딘-4-일리덴)-2-(피리딘-2-일)아세토니트릴 하이드로클로라이드 (1.5 g), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온 (DEPBT) (2.1 g) 및 휴니그 염기 (2 ㎖)를 20 ㎖의 DMF 중에서 배합하였다. 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 을 를 감압 하에서 증발시켜 제거하고, 잔류물을 MeOH (80 ㎖)에 의해서 분배시켰다. 침전을 여과에 의해서 수거하여 0.85 g의 생성물, 2-(1-(2-(4-메톡시-7-(3-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-3-일)-2-옥소아세틸)피페리딘-4-일리덴)-2-(피리딘-2-일)아세토니트릴 (IVe)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 12.42 (s, 1H), 9.23 (m, 1H), 8.69 (m, 1H), 8.27 (m, 1H), 7.89 (m, 2H), 7.58 (m, 1H), 7.52 (m, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.99-2.70 (m, 8H), 2.60 (m, 3H). MS m/z: (M+H)+ C25H23N8O3에 대한 계산치 483.19, 실측치 483.18.
단계 2
Figure 112006074171808-pct00098
포스페이트 에스테르 (45.1 g, 0.1 mol) 및 클로로요오도메탄 (200 g, 1.14 mol)을 100 ㎖의 벤젠 중에서 배합하고, 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반한 후 에, 벤젠을 진공 하에서 제거하였다. 그 후, 500 ㎖의 에틸 에테르를 잔류물에 첨가하고, 불용성 고체를 여과하여 제거하였다. 여액을 농축시켜 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트를 수득하고, 이것은 더 정제하지 않고 다음 단계에서 사용되었다.
단계 3
Figure 112006074171808-pct00099
NaH (0.2 g, 95%)를 무수 THF (20 ㎖) 중의 2-(1-(2-(4-메톡시-7-(3-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-3-일)-2-옥소아세틸)피페리딘-4-일리덴)-2-(피리딘-2-일)아세토니트릴 (IVe)의 현탁액에 서서히 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 무수 THF (2 ㎖)에 용해된 요오드 (0.4 g)를 교반 용액에 서서히 첨가하였다. 혼합물을 추가로 3 시간 동안 교반한 후에, 0.2 g의 NaH를 충진하였다. 첨가가 완료된 후에, 생성된 혼합물을 주위온도에서 추가로 15 분 동안 교반한 다음, 단계 2로부터 수득된 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트를 첨가하였다. 16 시간 동안 교반한 후에, 반응혼합물을 얼음으로 냉각된 NH4OAc (30%) (50 ㎖)에 붓고, 이어서 EtOAc (3×100 ㎖)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하여 물 (50 ㎖)로 세척한 다음에 염수 (50 ㎖)로 세척하고, Na2SO4 상 에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이것을 실리카겔 크로마토그라피 (EtOAc/Et3N (100/1)로 용출)에 의해서 정제하여 330 ㎎의 디-tert-부틸 3-(2-(4-(시아노(피리딘-2-일)메틸렌)피페리딘-1-일)-2-옥소아세틸)-4-메톡시-7-(3-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-1-일)메틸 포스페이트 (IIe)를 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.85 (m, 1H), 8.66 (m, 1H), 8.45 (m, 1H), 8.06 (m, 1H), 7.92 (m, 1H), 7.60 (m, 1H), 7.43 (m, 1H), 6.05 (m, 2H), 4.11 (s, 3H), 4.00 (m, 1H), 3.82 (m, 1H), 3.76 (m, 1H), 3.60 (m, 1H), 3.04 (m, 1H), 2.95 (m, 1H), 2.85 (m, 1H), 2.80 (m, 1H), 2.52 (s, 3H), 1.30 (m, 18H). MS m/z: (M+H)+ C34H42N8O7P에 대한 계산치 705.29, 실측치 605.30.
단계 4
Figure 112006074171808-pct00100
디-tert-부틸 3-(2-(4-(시아노(피리딘-2-일)메틸렌)피페리딘-1-일)-2-옥소아 세틸)-4-메톡시-7-(3-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-1-일)메틸 포스페이트 (IIe)를 TFA와 디클로로메탄의 혼합 용액 (10% TFA/CH2Cl2) 8 ㎖에 용해시키고, 혼합물을 3 시간 동안 교반하였다. 모든 용매를 진공 하에서 제거하고, 잔류물을 시마주 자동화 정제용 HPLC 시스템을 사용해서 정제하여 25 ㎎의 tert-부틸 3-(2-(4-(시아노(피리딘-2-일)메틸렌)피페리딘-1-일)-2-옥소아세틸)-4-메톡시-7-(3-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-1-일)메틸 하이드로젠 포스페이트 (II'e) 및 33 ㎎의 3-(2-(4-(시아노(피리딘-2-일)메틸렌)피페리딘-1-일)-2-옥소아세틸)-4-메톡시-7-(3-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-1-일)메틸 디하이드로젠 포스페이트 (Ie)를 수득하였다.
tert-부틸 3-(2-(4-(시아노(피리딘-2-일)메틸렌)피페리딘-1-일)-2-옥소아세틸)-4-메톡시-7-(3-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-1-일)메틸 하이드로젠 포스페이트 (II'e): 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.83 (m, 1H), 8.55 (m, 1H), 8.35 (m, 1H), 7.92 (m, 2H), 7.54 (m, 1H), 7.41 (m, 1H), 5.86 (m, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.96 (m, 1H), 3.72 (m, 1H), 3.65 (m, 1H), 3.47 (m, 1H), 2.92 (m, 1H), 2.85 (m, 1H), 2.71 (m, 1H), 2.65 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 1.15 (m, 9H). MS m/z: (M+H)+ C30H34N8O7P에 대한 계산치 649.23, 실측치 649.22.
3-(2-(4-(시아노(피리딘-2-일)메틸렌)피페리딘-1-일)-2-옥소아세틸)-4-메톡시-7-(3-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-1-일)메틸 디하이 드로젠 포스페이트 (Ie): 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.88 (m, 1H), 8.65 (m, 1H), 8.50 (m, 1H), 8.06 (m, 1H), 7.90 (m, 1H), 7.49 (m, 2H), 5.82 (m, 2H), 4.04 (s, 3H), 3.96 (m, 1H), 3.88 (m, 1H), 3.72 (m, 1H), 3.46 (m, 1H), 2.94 (m, 1H), 2.82 (m, 2H), 2.73 (m, 1H), 2.40 (m, 3H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 185.2, 165.6, 160.6, 159.1, 151.0, 150.4, 149.5, 146.2, 143.1, 137.4, 129.1, 127.2, 124.4, 123.6, 122.6, 117.4, 116.3, 113.9, 110.0, 72.8, 56.9, 48.4, 44.4, 36.4, 34.0, 13.6. MS m/z: (M+H)+ C26H26N8O7P에 대한 계산치 593.17, 실측치 593.14.
실시예 16
프로드럭 If 의 제조
Figure 112006074171808-pct00101
마개를 한 바이알 내에서 실온에서 1-메틸-2-피롤리디논 (1.0 ㎖) 중의 IVf (99.5 ㎎, 0.21 mmol)의 혼합물에 KI (144 ㎎, 0.87 mmol) 및 Cs2CO3 (416 ㎎, 1.28 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 약 5 분 동안 교반하였다. 그 후, 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트 시약 (218 ㎎, 0.84 mmol)을 적가하였다. 그 후, 생성된 혼합물을 35 내지 40℃에서 20 시간 동안 교반하였다. 그 후, 혼합물을 H2O (약 8 ㎖)로 희석하고, EtOAc (약 8 ㎖)로 추출하였다. 유기 추출물을 분리하고 증발시켜 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트를 수득하였다; 분석적 HPLC 방법: 용매 A 10% MeOH-90% H2O-0.1% TFA; 용매 B 90% MeOH-10% H2O-0.1% TFA; 출발 %B= 0, 최종 %B= 100, 구배시간= 2 분, 유속= 5 ㎖/분, 칼럼: Xterra MS C18 S7 3.0×50 ㎜; LC/MS: (ES) m/z (M+H)+= 694.22, HPLC Rt= 1.243.
스토퍼가 있는 둥근 바닥 플라스크 내에서 H2O/이소프로판올 (1.0 ㎖/1.0 ㎖) 중의 중간체 IIf의 혼합물을 40℃에서 9.5 시간 동안 교반하였다. 그 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 용액을 파이펫 (pipette)을 사용하여 바이알에 옮겼다. 이 용액에 MeCN (1.0 ㎖)을 첨가한 다음에, 이소프로판올을 서서히, 스파툴라 (spatula)를 사용하여 간헐적으로 교반하면서 첨가하였다. 그 후, 회백색 침전을 여과하고, 이소프로판올 (2×1.0 ㎖)로 세척한 다음에, 고진공 하에서 건조시켜 생성물 If를 수득하였다; 1H NMR (500 MHz): (DMSO-d6) δ 8.76 (s, 1H), 8.71 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.09 (d, J= 8, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.89 (d, J= 7, 1H), 7.85 (app t, 1H), 7.59 (app t, 1H), 5.68 (d, J= 13, 2H), 4.00 (b m, 2H), 3.90 (b m, 2H), 3.85 (b m, 2H), 3.65 (b m, 2H); 분석적 HPLC 방법: 용매 A 10% MeOH-90% H2O-0.1% TFA; 용매 B 90% MeOH-10% H2O-0.1% TFA; 출발 %B= 0, 최종 %B= 100, 구배시간= 2 분, 유속= 5 ㎖/분, 칼럼: Xterra MS C18 S7 3.0×50 ㎜; LC/MS: (ES) m/z (M+H)+= 582.00, HPLC Rt= 1.797.
성공적이기 위해서 프로드럭의 모분자로의 전환은 인간에게서 반드시 알칼리성 포스파타제에 의해서 개시되어야 한다. 인간 태반 알칼리성 포스파타제를 사용한 정성적 시험관내 시험 및 랫트에서의 생체내 시험은 프로드럭의 전환이 인간 효소를 사용한 시험관내 및 랫트에서의 생체내 시험 모두에서 신속하였음을 나타내었다. 이상적으로, 전환율은 프로드럭에 대해서는 단지 제한된 노출만이 일어나고, 활성 모 항바이러스제에 대해서 최대 노출이 일어날 수 있도록 신속하여야 할 것이다. 시험으로부터의 데이타 (이하)는, 랫트에서 평가된 3 가지 프로드럭 예 모두에서 프로드럭이 신속하게 활성 모약물로 전환되고, 프로드럭의 혈장 레벨은 모든 데이타 포인트에서 모약물에 비해서 매우 낮음을 나타낸다. 이들 시험은 모약물의 용량 및 포스페이트 프로드럭으로부터의 동등한 용량이 작고 대략 ~5 ㎎/㎏과 동등한 용량에서 수행하였다. 프로드럭의 이점은 용해 제한된 흡수를 극복하기 위한 것이기 때문에, 저용량에서는 환자에게서 임상적인 사용을 위한 덜 가용성인 모분자를 능가하는 프로드럭의 이점은 명백하지 않다.
저용량 생체내 시험을 사용하여 프로드럭이 모분자를 생성시켰는지 여부를 측정하였다. 모분자 IV의 용해도는 결정성 형태에 따라 좌우된다. 결정성 형태가 약물 개발에 바람직하다. 모든 모분자에 대한 데이타는 모든 모분자 IV에 대한 결정성 물질의 수용성이 < 50 ㎍/㎖이고, 일부의 경우에는 훨씬 덜 하다고 말함으로써 요약될 수 있다. 따라서, 모분자의 고유 수용성은 낮으며, 고용량에서 용해-제한된 흡수를 야기하는데 주된 역할을 한다.
[표 1]
N-메틸 디하이드로젠 포스페이트 (또는 염) 아자인돌옥소아세트산 피페라진 유도체의 생물학적 및 약제학적 특성
화합물 Ia
(디나트륨 염)		 화합물 Ib
(디나트륨 염)		 화합물 Ic
(산 형태)
용해도 (㎎/미리,
pH 6.5		 > 18 > 8 1
알칼리성 포스파타제
내에서의 시험관내
전환율 (주 1)		 어떤 중간체 형성도 없이 완전하고 빠른 모분자로의 전환 어떤 중간체 형성도 없이 완전하고 빠른 모분자로의 전환 어떤 중간체 형성도 없이 완전하고 빠른 모분자로의 전환
랫트에서 생체내
전환율-경구적 (주 2)
MAP 시험		 혈장 내에서 모분자의 빠른 생성 혈장 내에서 모분자의 빠른 생성 혈장 내에서 모분자의 빠른 생성
랫트에서 생체내
전환율-정맥내 (주 2)
MAP 시험		 혈장 내에서 모분자의 빠른 생성 혈장 내에서 모분자의 빠른 생성 혈장 내에서 모분자의 빠른 생성
주 1: 프로드럭 유도체 (농도 ~0.2 mM)를 pH 8 트리스 완충액 (농도 ~0.03 M, 1 ㎖) 중에서 알칼리성 포스파타제 (인간 태반, Sigma, ~1.4 유니트)와 함께 배양하고, 프로드럭의 소실 및 모분자의 형성을 HPLC 및 LC/MS에 의해서 모니터하였다. 대부분의 경우에, 1 또는 2 시간 이내에 모분자의 형성과 상응하게 프로드럭은 완전히 소실하였으며, 다른 중간체를 검출되지 않았다.
주 2: 프로드럭은 경구 (모분자 5 ㎎/㎏에 해당하는 용량) 또는 정맥내 경로 (모분자 1 ㎎/㎏에 해당하는 용량)로 랫트에게 투여하였다. 혈장 레벨은 검출가능한 양의 프로드럭이 없이 모분자로의 빠른 전환을 나타낸다 (po).
이하의 표에서 용어 "LLQ"는 정량화의 하한을 의미한다.
[표 2]
MAP 시험 A: 랫트에게 프로드럭 Ia를 PO 및 IV 투여한 후의 PK에 대한 요약 - 랫트에게서 화합물 IVa의 히스토릭 PO에 대한 비교
Figure 112006074171808-pct00102
[표 3]
MAP 시험 B: 랫트에게 프로드럭 Ib를 PO 및 IV 투여한 후의 PK에 대한 요약 - 랫트에게서 화합물 IVb의 히스토릭 PO에 대한 비교
Figure 112006074171808-pct00103
[표 4]
MAP 시험 C: 랫트에게 프로드럭 Ic를 PO 및 IV 투여한 후의 PK에 대한 요약 - 랫트 에게서 화합물 IVc의 히스토릭 PO에 대한 비교
Figure 112006074171808-pct00104
3 가지 표 2, 3 및 4에 대한 키 (key):
*AUCtot 비 = 프로드럭의 IV 투여 후의 모분자의 총 AUC / 모분자의 IV 투여 후의 모분자의 총 AUC (히스토릭 데이타)
**AUCtot 비 = 프로드럭의 PO 투여 후의 모분자의 총 AUC / 모분자의 PO 투여 후의 모분자의 총 AUC (히스토릭 데이타)
프로드럭 중의 하나 (Ica)의 용량 증가시험 D는 경구 투여 후에 HIV-1 환자의 치료에서의 모약물에 대비한 프로드럭의 유의적인 이점을 설명하기 위해서 랫트에게서 수행되었다. 프로드럭 용량 증가시험으로부터의 노출 데이타 및 측정된 파라메터는 모분자를 사용하여 수행된 히스토리칼 시험으로부터의 유사한 데이타와 비교하였다.
도 3 및 4는 프로드럭 Ica의 경구 투약으로부터의 IVc의 AUC (곡선하 면적, 랫트에서의 약물에 대한 노출의 척도)(시험 D)를 모분자 IVc의 투약으로부터 수득한 AUC (시험 E) 및 랫트 독력학 시험 (TK)을 비교한 것이다. 히스토리칼 IVc 용량 증가 (시험 E) 및 랫트 TK 시험 (F)에 대한 상세한 사항은 이들 도면에 나타내었다.
도 3 및 4로부터 볼 수 있는 바와 같이, 프로드럭 (삼각형)의 경구 투여 후에 모분자의 AUC 및 Cmax는 두가지 별개의 시험에서 모약물의 투여로부터 수득한 결과보다 더 크다. 명백하게, 데이타는 혈장 내에서 약물의 노출 배수를 최대화시키기 위해서는 프로드럭이 놀라운 이점을 제공하는 것을 보여준다. 이 부류의 분자의 화학적 구조는 유사하기 때문에, 이 부류의 프로드럭은 모분자 보다는 프로드럭을 투여한 경우에 노출의 증진을 나타내는 것으로 예상된다. 포스페이트 프로드럭에 의해 경구적 노출이 개선되는 것의 불확실성 및 새로운 화합물의 신규성을 가정하면, 이러한 결과는 명백한 것이 아니었으며, 그의 중요성에 있어서 놀라운 것 이다.
랫트 TK 시험; 시험 F; 3 가지 용량으로 랫트에서 PO IVc의 히스토리칼 시험
화합물 IVc (히스토리칼 데이타)
용량 (㎎/㎏) 15 (용액) 75 (현탁액) 200 (현탁액)
비히클 80/10/10 PEG-400/에탄올/0.1 N NaOH
평균 Cmax (μM) 42 65 76
평균 AUC0-24 hr
(μM*hr)		 418 792 1077
용량 비 1:5:13
Cmax 비 1:1.5:1.8
AUC 비 1:1.9:2.6
포스페이트 프로드럭 시험 A, B 및 C의 IV 및 경구적 랫트 PK 시험 프로토콜
화합물 Ic (IVc의 포스페이트 프로드럭), Ib (IVb의 포스페이트 프로드럭) 및 Ia (IVa의 포스페이트 프로드럭)를 3 마리의 수컷 스프라그-도울리 (Sprague-Dawley) 랫트의 군에게 IV 볼루스 (1 ㎎/㎏; 본 명세서에 열거된 모든 용량은 모화합물에 해당하는 것이었다) 또는 경구적 가바즈 (oral gavage) (5 ㎎/㎏)에 의해서 별도로 투여하였다. 경구 투약시험을 위한 랫트는 밤새 단식시켰다. 화합물 Ic는 유리산으로 투여되는 반면에 다른 두가지 화합물은 나트륨 염으로 투여되었다. IV 및 경구 투여 모두를 위한 3 가지 약물 모두의 투약 용액은 100% 생리식염수 중에서 1 ㎎/㎖로 제조되었다 (투약 용액 농도는 모화합물에 해당하는 것이었다). 혈장 샘플은 24 시간에 걸쳐서 EDTA 배큐테이너 (vacutainer) 내에 수거되었으며, 프로드럭 및 모분자 둘 다에 대해서 LC/MS/MS에 의해서 분석되었다. 약력학적 분석은 키네티카 (Kinetica™) 상에서 수행되었다.
LC/MS/MS 분석을 위한 방법은 이하의 프로토콜에서 나타내었다.
이 시험의 결과는 표 2-4의 중간의 두개의 칼럼에서 나타내었다.
랫트에서 Ica 의 경구적 용량 증가시험 프로토콜 (시험 D)
3 마리의 단식한 수컷 스프라그-도울리 랫트의 군에게는 화합물 Ica (디나트륨 염)를 4.5, 21 및 163 ㎎/㎏ (용량은 IVc에 해당하는 것이다)으로 경구로 투여하였다. 투약 용액은 4.5, 21 및 163 ㎎ (화합물 IVc에 해당)의 용량을 위해서 각각 물 중에서 1, 5 및 20 ㎎ (화합물 Ic (유리산)에 해당)/㎖로 제조되었다. 혈장 샘플은 24 시간에 걸쳐서 EDTA 배큐테이너 내에 수거되었으며, Ic 및 IVc 둘 다에 대해서 LC/MS/MS에 의해서 분석되었다. 약력학적 분석은 키네티카 (Kinetica™) 상에서 수행되었다.
이 시험의 결과는 표 46 및 도 3-5에서 나타내었다.
랫트 경구적 용량 증가시험
Ica의 투약
포스페이트 프로드럭 Ica (Na 염) 후의 IVc (모든 용량은 IVc에 해당함)(n=3)		 IVc (n=2)
히스토리칼 데이타
용량 (㎎/
㎏)		 5
(용액)		 25
(용액)		 200
(용액)		 25
(용액)		 75
(현탁액)		 200
(현탁액)
비히클 물 80/10/10 PEG-400/에탄올/0.1 N NaOH
입자 크기
(㎛)		 용액 용액 용액 용액 27 31
평균 Cmax
(μM)		 29±14 98±21 281±55 46 86 42
C-24 hr
(μM)		 0.029±0.008 0.35±0.13 58±36 0.61 5.2 10 (n=1)
평균 AUCtot
(μM*hr)		 109±15 586±53 2925±304* 458 1071 518*
평균 Tmax (hr) 0.50±0.25 1.7±2.0 1.1±0.80 4.0 5.0 4.0
평균 T1/2
(hr)		 2.3±0.07 2.5±0.15 13±7.5 3.4 6.8 20
용량 비 1:5:40 1:3:8
평균 Cmax 비 1:3.4:9.7 1:1.9:0.91
평균 AUC 비 1:5.4:27 1:2.6:1.1*
1. * AUC (24 시간-무한대)가 적어도 총 AUC (0-무한대)의 35% 이상이었기 때문에 AUC는 0-24 시간 범위였다. 이 부분은 너무 커서 총 AUC의 정확한 측정치를 가질 수 없었다.
2. Ica 투약 후의 IVc AUC를 IVc의 직접적인 투약 후의 IVc AUC로 나눈 비로 계산된 Ica로부터의 IVc의 5 ㎎/㎏에서 AUC 전환비는 0.99였다.
3. 프로드럭 Ica는 200 ㎎/㎏ 용량군 내의 각각의 랫트에서 두가지 샘플 중의 하나에서 단지 ~20-40 nM에서만 검출되었다.
생체내 시험
시험 A1을 위한 방법: 랫트에게 IVa 의 PO 및 IV 투여; PI 용량은 5 ㎎/㎏였다.
화합물 IVa는 다른 식으로 나타내지 않는 한은, 폴리에틸렌 글리콜 400 (PEG400)/에탄올 (EtOH) 용액 (90/10, v/v) 중에서 투여되었다. 혈장 및 조직 샘플을 수거하여 분석할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 경정맥 및/또는 담관 내에 이식된 카눌라를 갖는 수컷 스프라그-도울리 랫트 (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottdale, PA 15683)를 화합물 IVa의 약력학적 시험에서 사용하였다. 랫트는 PO 시험에서 밤새 단식시켰다. 혈액 샘플 (0.3 ㎖)을 경정맥으로부터 EDTA-함유 마이크로테이너 튜브 (microtainer tube) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07147) 내에 수거하여 혈장을 수득하였다. IV 시험에서는 1 ㎎/㎏의 용량을 3 마리의 랫트에게 0.5 분에 걸쳐서 투여하였으며, 일련의 혈장 샘플을 투약 전 및 투약 후 2, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 및 1440 분에 수거하였다. PO 시험에서 랫트 (n=3)는 5 및 100 ㎎/㎏의 PO 용량을 투여받았다. 일련의 혈장 샘플은 투약 전 및 투약 후 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 및 1440 분에 수거하였다.
이 시험의 경구적 (PO) 결과는 표 2의 오른쪽의 가장 마지막 칼럼에 나타내었다.
모약물 시험 B1
랫트에게서 화합물 IVb의 IV 및 PO 약력학적 시험을 위해서는 화합물 IVb를 용액으로서 PEG-400/에탄올 (90/10)에 용해시켰다. 개에게서 화합물 IVb의 IV 및 PO 약력학적 시험을 위해서는 화합물 IVb를 0.1 N NaOH로 pH 조정을 하여 PEG-400/에탄올 (90/10)에 용해시켰다. 제제의 상세한 사항은 표 6에 제시되었다.
랫트 . 경정맥 및/또는 담관 내에 이식된 카눌라를 갖는 수컷 스프라그-도울리 랫트 (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottdale, PA)가 사용되었다. PO 약력학적 시험에서는 랫트를 밤새 단식시켰다. 0.3 ㎖의 혈액 샘플을 경정맥으로부터 EDTA-함유 마이크로테이너 튜브 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 내에 수거하고, 원심분리하여 혈장을 분리시켰다.
IV 시험에서, 화합물 IVb는 0.5 분에 걸쳐서 볼루스로서 1 ㎎/㎏의 용량으로 송달하였다 (n=3). 일련의 혈장 샘플을 투약 전 및 투약 후 2, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 및 1440 분에 수거하였다.
화합물 IVb의 PO 시험에서 랫트 (n=3)는 5 ㎎/㎏의 화합물 IVb의 경구 용량을 투여받았다. 일련의 혈액 샘플은 투약 전 및 투약 후 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 및 1440 분에 수거하였다.
이 경구 (PO)시험의 결과는 표 3의 가장 오른쪽 칼럼에 나타내었다.
생체내 시험을 위한 IVb의 제제
화합물 IVb 시험 형태 비히클 농도 (㎎/㎖) 입자 크기
랫트 PK
(시험 B1)		 무정형 90:10, PEG400/EtOH
pH 8.6-9.0으로 조정됨		 3 NA (용액)
IVb 에 대한 생체내 시험 분석을 하기 위한 생물분석방법
이것은 랫트 혈장 샘플 (시험 B 및 B1을 위해서 사용됨)에서 IVb의 농도 레벨을 분석하는 방법을 나타낸다.
LC / MS / MS 에 의한 혈장 내의 화합물 IVb 의 정량화. 랫트, 개, 원숭이 또는 침팬지 시험으로부터 수득한 혈장 샘플의 분취물은 내부 표준물인 화합물 IVa를 함유하는 2 용적의 아세토니트릴로 혈장 단백질을 침전시킴으로써 분석을 위해서 제조되었다. 생성된 상등액을 10 분 동안 원심분리시킴으로써 침전된 단백질로부터 분리시키고, 오토샘플러 (autosampler) 바이알에 옮겼다. 샘플은 수작업에 의해서, 또는 톰테크 자동화 액체 핸들러 (Tomtec automated liquid handler)를 사용하여 제조되었다. 분석을 위해서는 5 ㎕의 분취물이 주입되었다.
HPLC 시스템은 두개의 시마주 LC10AD 펌프 (Columbia, MD), 시마주 SIL-HTC 오토샘플러 (Columbia, MD), 및 휴렛 팩카드 시리즈 (Hewlett Packard series) 1100 칼럼 구획 (Palo Alto, CA)로 구성되었다. 칼럼은 60℃ 및 0.3 ㎖/분의 유속으로 유지되는 YMC Pro C18 (2.0×50 ㎜, 3 ㎛ 입자, Waters Co., Milford, MA)였다. 이동상은 물 중의 10 mM 암모늄 포르메이트 및 0.1% 포름산 (A) 및 메탄올 중의 100% 10 mM 암모늄 포르메이트 및 0.1% 포름산으로 구성되었다. 초기 이동상 조성물은 95% A였다. 샘플 주입 후에, 이동상은 2 분에 걸쳐서 15% A/85% B로 변화되었으며, 추가로 1 분 동안 이 조성물로 유지시켰다. 그 후, 이동상을 초기 상태로 복귀시키고, 칼럼을 1 분 동안 재-평형화시켰다. 총분석시간은 4 분이었다.
HPLC는 마이크로매스 쿠아트로 LC (Micromass Quatro LC)에 연결시켰다. 초고순도 질소가 분무화 (nebulization)를 위해서는 100 L/hr 및 탈용매화 (desolvation)를 위해서는 1100 L/hr의 유속으로 분무화 및 탈용매화 가스로서 사용되었다. 탈용매화 온도는 300℃였으며, 공급원 온도는 150℃였다. 데이타 획득은 선택된 반응 모니터링 (selected reation monitoring; SRM)을 이용하였다. IVb 및 내부 표준물을 위한 (M+H)+ 종을 나타내는 이온은 MS1에서 선택되었으며, 2×10-3 토르의 압력에서 아르곤으로 충돌적으로 해리시켜 특정한 생성물 이온을 형성시키고, 이어서 이것을 MS2에 의해서 모니터하였다. 전이, 전압 및 체류시간은 표 7에 요약하였다.
화합물 IVb 및 화합물 IVa의 MS/MS 분석을 위한 파라메터 (IS)
화합물 IVb 화합물 IVa
SRM 전이 mz 448 > 105 423 > 205
콘 (cone) 전압 (V) 22 30
충돌 에너지 (V) 16 30
체류시간 (분) 2.6 2.4
혈장 표준곡선은 4 내지 8000 ng/㎖의 범위였으며, 뇌곡선 (brain curve)은 1-1000 ng/㎖였다. 곡선은 역수 농도 (1/x)에 의해서 가중된 이차방정식 회귀 (quadratic regression)에 적합하였다. 표준물은 이중으로 분석되었다. 검정곡선의 범위 내의 3 가지 농도로 블랭크 (blank) 혈장에서 제조된 품질관리 (QC) 샘플도 또한, 각각의 혈장 분석셋트를 사용하여 삼중으로 분석되었다. 이 화합물의 경우에, 혈장 QCs의 90%의 예견된 농도는 공칭 농도의 20% 이내였으며, 이것은 허용가능한 시험성능을 시사하는 것이다.
비히클 및 제제. 표 8을 참고로 하여, 사용된 비히클이 NaOH를 함유하는 경우에 화합물 IVc 용액 제제는 NaOH를 사용해서 pH를 조정하여 8.4에서의 그의 pKa를 기준으로 하여 화합물이 부분적으로 이온화되는 8.6-9.0의 pH를 수득하였다.
생체내 시험을 위한 화합물 IVc의 제제
화합물 IVc
시험		 제제
롯트		 상태 비히클 농도
(㎎/㎖)		 입자 크기
랫트 PK
(시험 C1)		 02-001
02-003		 모름 90:10
PEG400/ EtOH
pH 8.6-9.0으로 조정됨		 3 NA
전-독성
증가식 용량
(시험 E) 		02-004 결정성 80:10:10
PEG400/ErOH/
0.1 N NaOH		 2.5
7.5
20		 NA
평균= 27.22 ㎛ (95% < 84.4 ㎛)
멀티모달 (multi-modal) 분포, 3 피크
전체 평균= 31.07 ㎛ (95% < 157.7 ㎛)
전-ECN
랫트 독성
(랫트 TK)
(시험 F)		 02-005 모름 80:10:10
PEG400/ErOH/
0.1 N NaOH		 3
15
40		 NA
멀티모달 분포, 2 피크
전체 평균= 19.25 ㎛ (95% < 52.3 ㎛)
멀티모달 분포, 2 피크
전체 평균= 21.78 ㎛ (95% < 57.5 ㎛)
혈장 (시험 C, C1 및 D에서 사용됨) 내에서 LC / MS / MS 에 의한 화합물 IVc 의 정량화. 랫트, 개, 원숭이 및 침팬지 시험으로부터 수득한 혈장 샘플의 분취물은 내부 표준물인 화합물 IVa를 함유하는 2 용적의 아세토니트릴로 혈장 단백질을 침전시킴으로써 분석을 위해서 제조되었다. 생성된 상등액을 10 분 동안 원심분리시킴으로써 침전된 단백질로부터 분리시키고, 오토샘플러 바이알에 옮겼다. 샘플은 수작업에 의해서, 또는 톰테크 자동화 액체 핸들러를 사용하여 제조되었다. HPLC 시스템은 두개의 시마주 LC10AD 펌프 (Columbia, MD), 시마주 SIL-HTC 오토샘플러 (Columbia, MD), 및 휴렛 팩카드 시리즈 1100 칼럼 구획 (Palo Alto, CA)로 구성되었다. 칼럼은 60℃ 및 0.3 ㎖/분의 유속으로 유지되는 YMC Pro C18 (2.0×50 ㎜, 3 ㎛ 입자, Waters Co., Milford, MA)였다. 이동상은 물 중의 10 mM 암모늄 포르메이트 및 0.1% 포름산 (A) 및 메탄올 중의 100% 10 mM 암모늄 포르메이트 및 0.1% 포름산으로 구성되었다. 초기 이동상 조성물은 95% A였다. 샘플 주입 후에, 이동상은 2 분에 걸쳐서 15% A/85% B로 변화되었으며, 추가로 1 분 동안 이 조성물로 유지시켰다. 그 후, 이동상을 초기 상태로 복귀시키고, 칼럼을 1 분 동안 재-평형화시켰다. 총분석시간은 4 분이었다.
HPLC는 마이크로매스 쿠아트로 LC에 연결시켰다. 초고순도 질소가 분무화를 위해서는 100 L/hr 및 탈용매화를 위해서는 1100 L/hr의 유속으로 분무화 및 탈용매화 가스로서 사용되었다. 탈용매화 온도는 300℃였으며, 공급원 온도는 150℃였다. 데이타 획득은 선택된 반응 모니터링 (SRM)을 이용하였다. IVc 및 내부 표준물을 위한 (M+H)+ 종을 나타내는 이온은 MS1에서 선택되었으며, 2×10-3 토르의 압력에서 아르곤으로 충돌적으로 해리시켜 특정한 생성물 이온을 형성시키고, 이어서 이것을 MS2에 의해서 모니터하였다. 전이, 전압 및 체류시간은 표 9에 요약하였다.
화합물 IVc 및 화합물 IVa의 MS/MS 분석을 위한 파라메터 (IS)
화합물 IVb 화합물 IVa
SRM 전이 mz 474 > 256 423 > 205
콘 전압 (V) 22 30
충돌 에너지 (V) 22 30
체류시간 (분) 2.5 2.4
혈장 표준곡선은 4 내지 8000 ng/㎖의 범위였으며, 뇌곡선은 1-1000 ng/㎖였다. 곡선은 역수 농도 (1/x)에 의해서 가중된 이차방정식 회귀에 적합하였다. 표준물은 이중으로 분석되었다. 검정곡선의 범위 내의 3 가지 농도로 블랭크 혈장에서 제조된 품질관리 (QC) 샘플도 또한, 각각의 혈장 분석셋트를 사용하여 삼중으로 분석되었다. 이 화합물의 경우에, 혈장 QCs의 90%의 예견된 농도는 공칭 농도의 20% 이내였으며, 이것은 허용가능한 시험성능을 시사하는 것이다.
생물학적 매트릭스 내에서 LC / MS / MS 에 의한 3 가지 프로- 드럭 및 그들의 모화합물의 정량화
이 LC/MS/MS 시험은 생물학적 매트릭스 내에서 3 가지 프로드럭 화합물 및 그들 각각의 모분자를 조사하기 위해서 개발되었다. 3 가지 프로드럭 화합물은 화합물 Ia, Ic 및 Ib 및 이들의 그 밖의 각각의 염 또는 유리산이었다. 검출된 분자이온은 염 반대이온과는 무관하기 때문에 이 시험은 3 가지 프로드럭의 유리산 및 염 형태에 대해서 사용됨을 알아야 한다. 이들의 각각의 모화합물은 IVa, IVc 및 IVb였다.
HPLC 시스템은 시너지 하이드로-RP (Synergi Hydro-RP) 분석용 칼럼 (2.0×50 ㎜, Phenomenex, Torrance, CA)에 연결된 시마주 LC10ADvp 펌프 (Columbia, MD) 및 HTC PAL 오토샘플러 (Leap Technologies, Cary, NC)로 구성되었다. 이동상 A는 물 중의 0.1% 포름산으로 구성되었으며; 이동상 B는 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산으로 구성되었다. LC 유속은 질량분광계 내로 0.4 ㎖/분이었다. 초기 이동상 조성물은 1.75 분에 걸쳐서 10% B에서 75% B로 증가되었으며, 이 조성물에서 0.25 분 동안 유지시키고, 0.1 분에 걸쳐서 100% B로 증가시키고, 0.6 분 동안 유지시키고, 다음 0.1 분에 걸쳐서 초기 상태로 복귀시킨 다음에, 재-평형화시켰다. 총분석시간은 4 분이었다. 모든 피분석물에 대한 체류시간은 1.5 내지 2.6 분의 범위였다.
HPLC는 40℃로 설정된 터보이온스프레이 공급원 (Turboionspray source) 및 4.5 kV로 설정된 이온스프레이 전압이 장치된 시엑스 (Sciex) API3000 삼중 사극자 질량분광계 (Toronto, Canada)에 연결시켰다. UHP 질소가 분무화 및 보조 가스로서 각각 80 psi 및 7 L/분의 압력으로 사용되었다. 분석은 양이온 모드로 수행되었다. 모든 화합물에 대해서 모니터된 전이 및 그들의 충돌 에너지 (CE)는 다음과 같았다: Ia의 경우에 m/z 533.41 > 435.24 (CE= 19); Ic의 경우에 m/z 584.46 > 486.29 (CE= 23); Ib의 경우에 m/z 558.31 > 432.13 (CE= 19); IVa의 경우에 423.39 > 204.96 (CE= 31); IVc의 경우에 474.36 > 255.97 (CE= 29); IVb의 경우에 448.35 > 105.20 (CE= 35).
광범한 종류의 생물학적 샘플 매트릭스를 수용하기 위해서, 샘플 제조에는 아세토니트릴 침전이 사용되었다. 시험 샘플 및 표준물을 패카드 멀티프로브 (Packard Multiprobe) II (Packard Instruments, Downers Grove, IL)를 사용하여 96 웰 플레이트에 옮겼다. 내부 표준물 (BMS-647257, 500 nM)을 함유하는 200 ㎕의 아세토니트릴을 톰테크 쿠아드라 (Tomtec Quadra) 96을 사용하여 96 웰 플레이트 내의 시험 샘플 및 표준물 둘 다의 100 ㎕ 분취물에 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 약 3 분 동안 소용돌이를 일으키고, 3000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하였다. 톰테크 쿠아드라 96을 사용하여 150 ㎕의 상등액을 플레이트로부터 깨끗한 96 딥웰 (deep well) 플레이트에 옮겼다. 그 후, 물 중의 0.2% 포름산 150 ㎕를 톰테크 쿠아드라 96을 사용하여 각각의 웰에 첨가하고, 분석하기 전에 플레이트를 소용돌이를 일으켰다.
5 nM 내지 10 μM의 8 가지 농도점에서의 표준곡선은 아세토니트릴 중의 저장용액으로부터 프로드럭 및 모화합물 둘 다에 대해서 매트릭스 내에서 계열희석하여 제조되었다. 표준곡선을 시험 샘플을 함유하는 96 웰 플레이트에 이중으로 100 ㎕ 분취액으로 옮기고, 상술한 바와 같이 시험 샘플로 추출하고, 분석순서의 처음, 중간 및 마지막에 주입하였다. 표준곡선은 1/x2에 의해서 가중된 선형회귀에 적합하였다. 데이타 및 크로마토그라피 피크를 처리하고, 표준물 및 미지물질의 농도는 피이바이오시스템 아날리스트 (PEBiosystems Analyst™) 1.1을 사용하여 정량화되었다.
생체내 방법
시험 C1 , E 및 F ( 랫트 PK , MAP 및 TK 시험)를 위한 조건
랫트에서 화합물 IVc의 IV 및 PO 약력학적 시험을 위해서는 화합물 IVc를 PEG-400/에탄올 (90/10) 중에 용액으로서 용해시켰다. 표 8을 참고로 한다.
랫트 . 경정맥 및/또는 담관 내에 이식된 카눌라를 갖는 수컷 스프라그-도울리 랫트 (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottdale, PA)가 사용되었다. PO 약력학적 시험에서는 랫트를 밤새 단식시켰다. 0.3 ㎖의 혈액 샘플을 경정맥으로부터 EDTA-함유 마이크로테이너 튜브 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 내에 수거하고, 원심분리시켜 혈장을 분리시켰다.
IV 시험에서는 화합물 IVc를 0.5 분에 걸쳐서 볼루스로서 0.1 ㎎/㎏으로 송달하였다 (n= 3). 일련의 혈액 샘플을 투약 전 및 투약 후 2, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 및 1440 분에 수거하였다.
PO 단일용량 시험 C1
화합물 IVc의 PO 시험 C1에서는 랫트 (n= 3)에게 5 ㎎/㎏의 화합물 IVc의 경구 용량을 투여하였다. 일련의 혈액 샘플은 투약 전 및 투약 후 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 및 1440 분에 수거하였다. 시험 C1으로부터의 경구적 (PO) 결과는 표 4의 가장 오른쪽 칼럼에 나타내었다.
경구적 ( PO ) 용량 증가시험 E
화합물 IVc의 경구 용량 증가시험 E에서는 랫트의 군 (n= 각 군당, 3)에게 25, 75 및 200 ㎎/㎏의 경구 용량을 투여하였다. 25 ㎎/㎏에서, 투약 용액은 용액이었으며; 더 고용량에서는 투약 용액이 현탁액이었다. 일련의 혈액 샘플은 투약 전 및 투약 후 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 및 1440 분에 수거하였다. 뇌 샘플은 1440 분에 수거하여 뇌 침투를 평가하였다. 뇌 샘플은 건조하게 빨아들였으며, 습윤 중량을 기록하였다. 시험 E로부터의 경구적 (PO) 결과는 표 46에 나타내었다.
2-주일 경구 용량 랫트 독성시험 F
2-주일 경구 랫트 시험 F (n= 6/성별/군)에서, 화합물 IVc는 15, 75 또는 200 ㎎/㎏의 1 일 용량으로 투여되었다. 1 및 14 일에 독력학적 평가는, 화합물 IVc의 전신적 노출 (AUC0 -24h)은 일반적으로 용량-관련되었지만, 용량-비례적은 아니었으며 (참조 표 5), 자가유도 (autoinduction) 또는 축적의 증거는 없음을 나타내었다. 14 일에 AUC0 -24h 값은 ≤200 ㎎/㎏/일의 투약량에서 수컷 (≤526.88 ㎍*hr/㎖)에 비해 암컷 (≤644 ㎍*hr/㎖)에게서 약간 더 높았다. 시험 F로부터의 경구적 (PO) 결과는 표 5에 제시되었다.
MAP 시험 G: 랫트에게서 디에스테르 IIa 의 PO 및 IV 투약 시험
화합물 IIa 의 구조
Figure 112006074171808-pct00105
디에스테르 IIa를 화합물 IVa 대신에 이용하는 것을 제외하고는 MAP 시험 A1의 경구 투약 레그 (leg)를 위한 방법을 수행하였다. 화합물 IVa에 대한 분석은 경구 경로에 의한 디에스테르 IIa의 투약이 상당한 IVa를 생산하였음을 나타내었다. 데이타는 이하의 표 10에 기술되어 있다.
MAP 시험 G
디에스테르 IIa (IVa의 디-tert 부틸 에스테르 프로드럭)의 PO 투약 후에 IVa에 대해서 측정된 데이타
용량 및 경로: PO 5 ㎎/㎏
Cmax p.o. (nM) 1123±270 ('IVa conc)
Tmax p.o. (hr) 2.7±1.2 (IVa)
F (%) 33 (IVa)
AUC p.o. (μM*hr) 4.0±1.0 (IVa)
Cp @ 24 hr p.o. (nM) 검출되지 않음
T1/2 p.o. (hr) 1.3±0.26 (IVa)
Map 시험 H: 랫트에게서 모노에스테르 II'a 의 PO 및 IV 투약시험
화합물 II'a 의 구조
Figure 112006074171808-pct00106
모노에스테르 II'a를 화합물 IVa 대신에 이용하는 것을 제외하고는 MAP 시험 A1의 경구 투약 레그를 위한 방법을 수행하였다. 화합물 IVa에 대한 분석은 경구 경로에 의한 모노에스테르 II'a의 투약이 상당한 IVa를 생산하였음을 나타내었다. 데이타는 이하의 표에 기술되어 있다.
MAP 시험 H
디에스테르 II'a (IVa의 디-tert 부틸 에스테르 프로드럭)의 PO 투약 후에 IVa에 대해서 측정된 데이타
용량 및 경로: PO 5 ㎎/㎏
Cmax p.o. (nM) 1586±615 ('IVa conc)
Tmax p.o. (hr) 2.0±1.7 (IVa)
F (%) 44 (IVa)
AUC p.o. (μM*hr) 5.9±2.2 (IVa)
Cp @ 24 hr p.o. (nM) 3.61 (n= 2/3)
T1/2 p.o. (hr) 2.8±1.6 (IVa)
상당한 수의 시험을 수행하여 프로드럭 I의 놀라운 유용성을 입증하고 특정화하였다. 프로드럭 및 모약물을 투약한 후에 모분자의 노출을 비교한 용량 증가 노출실험은 모분자 IVa, IVb 및 IVc의 프로드럭 I에 대하여 랫트 및 개에게서 수행되었다. 프로드럭 Iab 또는 모약물 IVa을 투약한 후에 IVa의 노출에 대한 식이 및 용량의 효과를 개에게서 비교하였다. 프로드럭은 모약물에 비해서, 노출을 개선시키고 식의 영향을 피하는 놀라운 능력을 나타내었다. 저용량 완전 (full) 약력학적 시험 (경구 및 IV 투약)을 프로드럭 Iab, Ibb 및 Icb에 대하여 랫트, 개 및 원숭이에게서 수행하여 각각 모화합물 IVa, IVb 및 IVc로의 전환을 나타내었다. 랫트에서의 경구 투약시험을 프로드럭 Ie (유리산) 및 모화합물 IVf에 대해서 수행하여 각각 모화합물 IVe 및 IVf의 전환 및 전신적 노출을 나타내었다. 데이타는 본 명세서의 상기 또는 이하에서 나타내었다.
추가의 프로파일링 항목 ( profiling section ) 1
Iab 를 사용한 추가의 시험:
Iac는 IVa의 N-하이드록시메틸 부가물의 유리산 포스페이트 프로드럭이며, 알칼리성 포스파타제 (ALP)에 의해서 가수분해되어 IVa를 형성시킨다. Iac의 모노-라이신 염인 Iab는 이하의 시험 모두에 대해서 사용되었다.
Iab의 IV 및 PO 약력학적 시험을 랫트, 개 및 원숭이에게서 수행하였다. 모든 경우에, 혈액 샘플은 EDTA의 존재 하에서 수거하였다. 공지된 ALP 억제제인 EDTA의 존재는 샘플 처리 중에 Iab의 유의적인 생체외 전환을 최소화하였다. IVa는 Iab의 IV 투여에 따라서 빠르게 형성되었다. IVa의 우수한 경구적 생체이용율 (62-94%)은 랫트, 개 및 원숭이에게서 Iab를 투여한 후에 관찰되었으며, 혈장 내에 Iab가 매우 적게 존재하거나 존재하지 않았다. 장에서는 높은 레벨의 ALP 발현이 있기 때문에, Iab의 경구 투여 후에 Iab는 소장강의 쇄자연막 (brush border membrane)에 존재하는 ALP에 의해서 가수분해되어 IVa를 형성하고, 이것은 그의 높은 투과성으로 인하여 빠르게 흡수되는 것으로 보인다.
시험관내 배양시험은 다양한 조직에서 Iab의 ALP-의존성 가수분해를 정성적으로 평가하기 위해서 수행되었다. Iab는 랫트, 개, 원숭이 및 인간으로부터 유래하는 혈청 및 간세포, 및 인간 태반 ALP의 존재 하에서 가수분해되었다. Iab 및 IVa가 측정된 경우에 Iab의 IVa로의 전환은 거의 화학량론적이었다. 혈청 내에서의 가수분해로 인하여, Iab의 단백질 결합은 측정될 수 없었다. 시험관내 데이타를 기초로 하여, Iab는 인간 ALP에 의해서 가수분해될 수 있을 것이고, 인체 피검자에게 Iab를 경구 투여한 후에 IVa가 형성될 것으로 예상된다.
실온에서 Iab의 결정성 용해도는 pH 1.4에서 0.22 ㎎/㎖로부터 pH 5.4 및 8.9에서 > 12 ㎎/㎖로 상승하며; > 100 ㎎/㎖를 함유하는 수용액이 생체내 독성시험을 위해서 제조되었다. 비교시에, 결정성 물질로서 실온에서 모화합물 IVa의 수용성은 0.04-0.9 ㎎/㎖ (1.5-10의 pH 범위)인 것으로 측정되었다. Iab는 허용가능한 용액 및 고체 안정성을 나타낸다.
Iab의 더 큰 수용성은 특정의 용량 이하에서 IVa의 용해-속도 제한된 흡수를 극복하는 수단을 제공하며, 이에 의해서 경구 용량 증가 및 독력학적 시험에서 IVa의 노출을 증가시켰다. ~200 ㎎/㎏의 IVa 등가물을 경구적으로 투여한 경우에 Iab는 유사한 용량에서 히스토리칼 IVa 현탁액 시험으로부터의 AUC와 비교하여, 프로드럭에 대한 유의적인 혈장 노출이 없이 랫트 및 개에게서 IVa의 2-배 더 큰 AUC를 제공하였다. 또한, Iab 건식-충진된 캅셀제 (200 ㎎/개의 IVa 동등물)를 투여하는 단식한 개에게서 IVa의 AUC 및 Cmax는 IVa 임상적 캅셀제제를 투여한 단식한 개에서 수득된 것보다 각각 38 및 58 배, 및 IVa 임상적 캅셀제제를 투여한 급식한 개에서 수득된 것보다 각각 4 및 6 배였다.
IVa의 AUC 및 Cmax에서의 유의적인 차이는 Iab를 투여하는 단식 및 급식한 개 사이에서 관찰되지 않았으며, 그 반면에 급식한 개에서는 IVa를 투여한 단식한 개에 비해서 9-배 증가가 관찰되었다. 이들 데이타는 IVa의 효과적인 혈액 레벨이 고지방 식이에 대한 필요성이 없이도 HIV-감염된 환자에게서 수득될 수 있음을 시사한다. IVa의 스프레이 건조된 형태는 개에서 Iab로부터 관찰된 것과 유사한 IVa의 노출 레벨을 유도한다.
CD 랫트에서 단일-용량 독력학적 내약성 ( tolerability ) 시험
랫트에서의 1-일 경구 독력학적 시험은 프로드럭 Iab (모노라이신 염)를 사용하여 수행되었다. Iab는 16, 72 및 267 ㎎/㎏ (유리산)의 투약량으로 경구 가바즈에 의해서 비히클로 물을 사용하여 (용액 제제) 군당, 3 마리의 수컷 랫트에게 투여하였다. 프로드럭 유리산의 투약량은 각각 13, 57 및 211 ㎎/㎏의 IVa (모화합물) 몰 동가의 투약량에 상응한다. 평가된 종말점 (endpoint)은 개개 랫트에서 Iab 및 IVa의 혈장 독력학이었다.
평균 독력학적 값은 표 12에 제시되어 있다.
단일 경구용량으로 ≤267 ㎎/㎏의 Iab를 투여한 수컷 랫트에서 Iab 및 IVa에 대한 평균 독력학적 값
투약량 (㎎/㎏)
Iab 16
IVa 몰당량 13		 72
57		 267
211
Iab IVa Iab IVa Iab IVa
Cmax (μM) 0.068 26 0.095 104 0.11 214
C24 (μM) <LLQ1 0.090 <LLQ 0.027 <LLQ 1.9
AUC (μMㆍh) 0.0202 673 0.0492 2613 0.0572 11613
T1/2 (h) 0.64 3.2 0.37 2.3 0.045 3.4
값들은 Iab 데이타에 대해서는 1-3 랫트/군, IVa 데이타에 대해서는 3 랫트/군으로부터의 평균을 나타낸다.
1 정량화의 하한선 이하
2 0부터 마지막 정량가능한 샘플의 시간까지의 AUC
3 0부터 ∞까지의 AUC
Iab (프로드럭) 및 IVa (모화합물) 둘 다의 평균 최대 혈장농도 (Cmax)는 투약-후 1.1 시간 이내에 달성되었다. 프로드럭의 혈장농도-시간 곡선 (AUC) 이하의 혈장 면적은 모화합물의 경우의 ≤0.03%였다. ≤267 ㎎/㎏의 Iab를 투여한 랫트에서 IVa의 AUC는 Iab 투약량과 비례하여 증가하였으며, Cmax는 72 및 267 ㎎/㎏의 Iab 사이에서 덜 용량-비례적인 방식으로 증가하였다.
IVa (2) 또는 Iab를 투여한 랫트에서 수득된 IVa AUC의 비교는 도 6에 나타내었다.
전임상적 제제에서의 용해도가 문제가 되고 있다. 저용량에서는 모화합물과 프로드럭이 둘 다 용액 (모화합물에 대해서는 PEG-400이고, 프로드럭에 대해서는 물)으로 제제화되었고, 그 반면에 고용량 (예를 들어, 200 ㎎/㎏)에서는 중성 모화합물은 현탁액으로 제제화되는 반면에 프로드럭 염은 수용액으로 제제화되었기 때문에, IVa의 AUC는 저용량 (예를 들어, ≤50 ㎎/㎏)에서 모화합물과 프로드럭 둘 다에 대해서 동등하다.
IND를 지지하기 위해서 5, 50 또는 500 ㎎/㎏ BID의 투약량을 사용하여 2-주일 랫트 독성시험이 진행중이다 (3). 시험의 생존기가 완료되었으며, 주목할 만한 생존 중의 관찰결과는 없었다.
개에서 단일-용량 독력학 및 내약성 시험
24, 90 또는 240 ㎎/㎏의 프로드럭 Iab (모노라이신 염) (유리산, 각각 모 IVa의 19, 71 또는 190 ㎎/㎏와 동등한 몰량)의 내약성, 및 Iab 및 IVa의 독력학을 평가하기 위해서 다상 시험 (multi-phase study)을 수행하였다 (4). Iab는 2 마리의 암컷 개/군에게 매일 한번씩 수용액 (24 또는 90 ㎎/㎏) 또는 건식-충진된 캅셀제 (24, 90 [하루에 한번 및 두번] 또는 240 ㎎/㎏)로서 투여되었다. 종말점은 다음과 같았다: 임상적 징후, 체중, 식품 소비, 및 Iab 및 IVa의 혈장 독력학. 모든 경우에, 시험의 모든 상에 대해서 투약 사이에는 1-주일 세척기간 (washout period)이 사용되었다.
시험의 초기상으로부터의 혈장 독력학 값은 표 13에 나타내었다.
단일 경구용량으로 ≤90 ㎎/㎏의 Iab를 투여한 암컷 개에서 IVa에 대한 독력학적 값
투약량 (㎎/㎏)
Ibb 24
IVa 몰당량 19
제제 용액
개 #1201 개 #1202		 90
71
용액
개 #3201 개 #3202		 24
19
건식-충진된 캅셀제
개 #4201 개 #4202
Cmax (μM) 72.3 66.5 124 125 79.7 85.6
C24 (μM) 0.61 0.33 3.2 2.2 1.4 0.87
AUC0 -∞ (μMㆍh) 465 330 844 838 486 514
T1/2 (h) 3.2 3.1 4.4 3.9 4.2 3.4
Iab는 혈장 샘플에서 검출되지 않았다. IVa의 평균 최대 혈장농도 (Cmax)는 투여-후 1-2 시간 사이에 달성되었다. Iab가 용액으로 투여되는 경우에, Cmax 및 AUC는 둘 다 24 및 90 ㎎/㎏ 사이에서 덜 투약량-비례적인 방식으로 증가하였다. 구토는 90 ㎎/㎏를 투여한 개에게서 투약한 지 약 30 분 후에 관찰되었다. IVa의 Cmax 및 AUC는 건식-충진된 캅셀제 또는 수용액을 사용하여 24 ㎎/㎏으로 Iab를 투여한 후에 동등하였다.
구토 이외의 임상적 징후는 관찰되지 않았으며, 체중 및 식품 소비에 대한 영향은 없었다.
Iab를 건식-충진된 캅셀제로 투여함으로써 구토가 제거/감소될 수 있는지 여부를 측정하기 위해서는, 90 또는 240 ㎎/㎏, 및 4 시간 간격으로 2 회 투여된 90 ㎎/㎏ (BID)의 투약량을 사용하여 시험의 다음 상을 수행하였다. 독력학적 값은 표 14에 나타내었다.
단일 경구용량으로 ≤267 ㎎/㎏의 Iab를 투여한 수컷 랫트에서 Iab 및 IVa에 대한 평균 독력학적 값
투약량 (㎎/㎏)
Ibb 90
IVa 몰당량 71
제제 용액
개 #1201 개 #1202		 240
190
용액
개 #2201 개 #2202		 180 (90 BID)
142 (71 BID)
건식-충진된 캅셀제
개 #3201 개 #3202
Cmax (μM) 214 152 172 189 311 248
C24 (μM) 4.6 0.89 2.8 6.6 34 50
AUC0 -∞ (μMㆍh) 1740 960 1186 1584 33051 2485
T1/2 (h) 3.6 2.9 3.7 4.5 6.1 13
1 0부터 24 시간까지의 AUC
건식-충진된 캅셀제에 의해서 투여되는 90 또는 240 ㎎/㎏의 Iab를 공급한 개 사이에서는 Cmax 또는 AUC에서 차이가 없었다. 구토는 투약한 지 약 1 시간 후에 개 #1201, #2201 및 #2202에서 관찰되었다. 구토물을 수거하여 Iab 함량에 대해서 시험하여 손실된 총용량의 양을 추정하였으며; 추정된 손실된 총용량의 백분율은 #1201의 경우는 <1%, #2201의 경우는 ~90%, #2202의 경우는 ~9%였다. "손실된 용량"의 추정치는 혈장 AUC 데이타와 정량적으로 일치하는 것으로 보이지 않았지만, 이것은 시험 항목이 투약 후의 단시간 이내에 구토물에서 발견될 수 있음을 나타내는 것이다. Iab는 개의 혈장 내에서 투약 1 시간 후에 0.005-0.049 μM, 투약 2 시간 후에는 0.005-0.006 μM으로 검출되었으며; 프로드럭은 나중의 시점에는 검출될 수 없었다.
IVa (5, 6) 또는 Iab를 투여한 개에게서 수득된 IVa AUC의 비교는 도 7에 나타내었다.
비히클 및 제제
키 PK 및 안전성 시험을 위해서 사용된 제제의 요약
랫트, 개 및 원숭이에게서의 모든 생체내 PK 시험은 PO 및 IV 투약을 위한 수용액을 사용하여 수행되었다. 개에게서 독물학 및 노출 시험은 24 및 90 ㎎/㎏의 투약량으로 수용액, 및 24, 90 및 240 ㎎/㎏의 Iab 모노-라이신 염의 투약량으로 캅셀 제제 중의 약물을 사용하여 수행되었다.
랫트 경구 용량 증가시험에서, Iab는 4.5, 20.0 및 73.5 ㎎/㎖ (프로드럭의 모노-라이신 염 형태)의 농도의 수용액으로 투약되었다. IVa 경구 투여 히스토리칼 데이타에 비해서, Iab 프로드럭을 경구 투약한 후에 IVa 모화합물의 AUC 및 Cmax의 상당한 개선이 관찰되었다.
개에게서 식품효과 시험을 위해서는 20 ㎎/㎏의 IVa 등가물의 용량의 Iab의 캅셀 제제 형태의 약물을 사용하였다. 프로드럭은 20 ㎎/㎏의 모화합물 IVa의 임상적 캅셀제제에 비유되었다. IVa 임상적 캅셀제를 투여한 경우에, 고지방 식이를 급식한 개에게서는 단식한 개의 경우에 비해 노출에서 9-배 증가가 나타났다. 프로드럭을 투약하면, IVa의 노출은 현저하게 더 컸으며, 예상한 바와 같이 노출은 단식한 개와 급식한 개 사이에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
대사 및 약력학 요약
결과의 요약 및 해석
Iab는 IVa의 N-하이드록시메틸 부가물의 포스페이트 프로드럭이며, 알칼리성 포스파타제 (ALP)에 의해서 가수분해되어 IVa를 형성한다. 따라서, Iab를 동물에게 투여한 후에 혈장 샘플은 공지의 ALP 억제제인 EDTA의 존재 하에서 수거된 혈액으로부터 제조되었다. Iab의 IVa로의 전환은 EDTA를 함유하는 랫트, 원숭이 및 인간 혈액에서 최소 (<2%)였으며, EDTA를 함유하는 개 혈액에서는 약 6%였다. 샘플 저장 (-20℃) 및 Iab의 분석 중에 Iab의 유의적인 생체외 전환은 예상되지 않는다.
Iab의 가수분해는 동물 및 인체 시험관내 시험에서 시험하였다. 다수의 ALP 이소형태 (isoform)는 다양한 조직 내에 광범하게 분포되어 있기 때문에, 정량적인 시험관내에 대한 생체내의 상관관계는 시도되지 않았다 (Fishman et al., 1968; Komoda et al., 1981; Moss 1983; Yora and Sakagishi, 1986; Sumikawa et al., 1990). 따라서, 시험은 다양한 조직에서의 ALP-의존성 가수분해의 정성적 평가로 제한되었다. Iab는 랫트, 개, 원숭이 및 인간으로부터 유래하는 혈청 및 간세포 및 인간 태반 ALP의 존재 하에서 가수분해되었다. Iab 및 IVa가 측정되는 경우에, Iab의 IVa로의 전환은 거의 화학량론적이었다. 혈청 내에서의 가수분해로 인하여, Iab의 단백질 결합은 측정될 수 없었다.
Iab의 경구 투여 후에 랫트, 개 및 원숭이 혈장에서 Iab는 매우 낮은 레벨로 검출되거나 검출되지 않았다. IVa는 랫트, 개 및 원숭이에게서 Iab의 IV 투여 후에 빠르게 형성되었다. IV AUC 전환비는 랫트에서는 1.5, 개에서는 0.80 및 원숭이에서는 0.70이었으며, 이것은 Iab로부터 IVa로의 우수한 전환을 시사하는 것이다.
IVa의 우수한 경구적 생체이용율 (62-94%)은 랫트, 개 및 원숭이에게서 Iab를 투여한 후에 관찰되었다. 더욱 유의적으로, Iab의 더 큰 수용성은 특정한 용량 이하에서 IVa의 용해-속도 제한된 흡수를 감소시켰으며, 이에 의해서 경구적 용량 증가 및 독력학적 시험에서 IVa의 노출을 증가시켰다 (표 12-14 및 도 6-7). Iab 캅셀제를 투여한 단식한 개에게서의 IVa의 AUC 레벨은 IVa 임상적 형태 캅셀제를 투여한 단식한 개에서의 레벨의 약 40 배였다. 40-배의 차이는 임상적 상황의 과도한 예견인 것 같지만, IVa의 개발 경험을 기초로 하여 Iab는 모 IVa에 의해서 나타나는 용해-속도 제한된 흡수를 개선시키는 가능성을 명백하게 나타내었다.
개에게서 IVa의 경구적 흡수에 대한 식품의 영향을 조사하기 위해서 Iab 및 IVa를 단식 및 급식한 상태에서 캅셀제로 투여하였다. AUC 및 Cmax에서의 유의적인 차이는 Iab에 의해서 관찰되지 않았지만, 9-배의 개선은 급식시에 IVa에 의해서 관찰되었다. 이들 데이타는 IVa의 효과적인 혈액 레벨이 고지방 식이에 대한 필요성이 없이 달성될 수 있다는 HIV-감염된 환자에 대한 잠재적인 임상적 이점을 시사하는 것이다.
방법
여기에 기술된 시험은 다른 식으로 언급되지 않은 한은 Iab의 모노-라이신 염을 사용하였다.
LC / MS / MS 에 의한 Iab 및 IVa 의 정량화
LC/MS/MS 방법은 동물 약력학적 시험으로부터의 혈장 샘플 내에서 및 시험관내 배양시험으로부터의 아세토니트릴 상등액 내에서 Iab 및 IVa를 분석하기 위해서 개발되었다. 혈장 내에서의 분석을 위해서는 패카드 멀티프로브 장치를 사용하여 표준품, QC 및 혈장 샘플 각각의 50 ㎕씩을 단백질 침전 추출을 위해서 깨끗한 96-웰 플레이트에 옮겼다. 내부 표준물 IVc를 함유하는 200 ㎕의 아세토니트릴을 첨가한 후에, 샘플을 소용돌이시켜 혼합시키고, 생성된 상등액을 10 분 동안 원심분리시킴으로써 침전된 단백질로부터 분리시켰다. 시험관내 시험으로부터 생성된 상등액에서의 분석을 위해서는, 동등한 용적의 상등액 및 내부 표준물을 함유하는 아세토니트릴을 혼합시켰다. 상기 상등액의 분취액을 톰테크 자동화 액체 핸들러를 사용하여 두번째의 깨끗한 96-웰 플레이트에 옮겼다. 동등한 용적의 물을 첨가하고, 플레이트를 마개를 하고 소용돌이를 일으켜 혼합시켰다.
HPLC 시스템은 페노메넥스 시너지 퓨존-RP (Phenomenex Synergi Fusion-RP) 분석용 칼럼 (2.0×50 ㎜, 5 μ; Torrance, CA)에 연결된 시마주 LC10ADvp 펌프 (Columbia, MD) 및 HTC PAL 오토샘플러 (Leap Technologies, Cary, NC)로 구성되었다. 이동상 A는 물 중의 5 mM 암모늄 포르메이트로 구성되었으며; 이동상 B는 100% 아세토니트릴이다. LC 유속은 0.38 ㎖/분이었다. 초기 이동상 조성물은 3% B였으며, 1.75 분에 걸쳐서 60% B로 증가되었으며, 0.25 분 동안 유지시키고, 0.1 분에 걸쳐서 100% B로 증가시키고, 0.8 분 동안 유지시키고, 다음 0.1 분에 걸쳐서 초기 상태로 복귀시킨 다음에, 재-평형화시켰다. 총분석시간은 4.0 분이었다. Iab, IVa 및 IVc에 대한 체류시간은 각각 1.50, 1.67 및 1.73 분이었다.
HPLC 시스템은 550℃로 설정된 터보이온스프레이 공급원 및 4.5 kV로 설정된 이온스프레이 전압이 장치된 시엑스 API4000 삼중 사극자 질량분광계 (Toronto, Canada)에 연결시켰다. UHP 질소가 분무화 및 보조 가스로서 각각 80 psi 및 7 L/분의 압력으로 사용되었다. Iab, IVa 및 IVc에 대한 충돌 에너지는 각각 21, 29 및 31 볼트였다. 데이타 획득은 선택된 반응 모니터링 (SRM)을 이용하였다. Iab, IVa 및 내부 표준물을 위한 양이온 모드 (M+H)+ 종을 나타내는 이온은 MS1에서 선택되었으며, 질소 및 최적화된 충돌 에너지에 의해서 충돌적으로 해리시켜 특정한 생성물 이온을 형성시키고, 이어서 이것을 MS2에 의해서 모니터하였다. Iab, IVa 및 IVc에 대한 SRM 전이는 각각 m/z 533 → 435, 423 → 205 및 474 →256이었다.
5 nM 내지 10 μM 범위의 표준곡선은 Iab 및 IVa 둘 다에 대해 저장용액으로부터 매트릭스 내에서 계열희석하여 제조되었다. 표준곡선은 이중으로 분취하여, 샘플로 추출하고, 분석절차의 초기, 중기 및 말기에 주입하였다. 분석곡선은 역수 농도 1/x2에 의해서 가중된 선형회귀에 적합하였다. 데이타 및 크로마토그라피 피크를 처리하고, 표준물 및 미지물질의 농도는 피이바이오시스템 아날리스트 1.1을 사용하여 정량화되었다.
시험관내 방법
(1) EDTA 혈액, 혈청 및 트리스 - HCl 완충액 중에서 Iab 의 안정성
Iab의 안정성은 랫트, 개, 원숭이 및 인간 (n=2)으로부터의 신선한 혈액 및 혈청에서 시험하였다. 혈액을 K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 함유하는 배큐테이너 내에 수거하였다. 혈청을 항응고제를 함유하지 않는 배큐테이너 내에 수거하였다. Iab를 약 10 μM의 출발농도로 37℃에서 60-90 분 동안 배양하였다. 일련의 샘플을 예정된 시간에 취하였다. 혈액 샘플의 분취물 (200 ㎕)을 우선 100 ㎕의 물과 혼합시키고, 이어서 400 ㎕의 아세토니트릴과 혼합시켰다. 혈청 샘플 (50 ㎕)을 K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 함유하는 마이크로테이너 내에 첨가하고, 이어서 100 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하였다. 상등액을 LC/MS/MS에 의해서 Iab 및 IVa 둘 다에 대해서 분석하였다.
Iab의 안정성은 또한, 트리스-HCl 완충액 (0.1 M, pH 7.5) 내에서 상술한 바와 같이 평가되었다.
(2) 인간 태반 ALP 의 존재 하에서 Iab 의 가수분해
고체 인간 태반 ALP를 시그마 (Sigma, P-3895, St. Louis, MO)로부터 수득하였다. 1000 유니트/L의 용액을 트리스-HCl 완충액 (0.1 M, pH 7.5) 중에서 제조하였다. 100 및 10 유니트/L의 용액은 계열 희석함으로써 수득되었다. Iab를 10, 100 및 1000 유니트/L 용액 (n=2) 중에서 37℃로 2 시간 동안 배양하였다. 배양시에 Iab의 출발농도는 10 μM이었다. 100 ㎕ 샘플의 분취물을 예정된 시간에 취하고, K2EDTA 마이크로테이너 내에 첨가하고, 이어서 200 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하였다. 상등액을 LC/MS/MS에 의해서 Iab 및 IVa 둘 다에 대해서 분석하였다.
생체내 시험
모든 혈액 샘플 (0.3 ㎖)을 K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 함유하는 마이크로테이너 내에 수거하고, 분쇄된 얼음 상에 놓았다. 원심분리한 후에, 혈장을 분리하여 분석할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 약력학적 시험을 위해서는 Iab의 모노-라이신 염 (형태 3, 롯트 1)을 사용하였다. Iab의 투약용액은 멸균수 (개 및 원숭이에게서 IV 투여를 위함) 또는 증류수 (모든 다른 용량 투여를 위함) 중에서 제조하였다.
(1) 랫트에서의 생체내 시험
경정맥에 카눌라를 이식한 수컷 스프라그-도울리 랫트 (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottsdale, PA)가 사용되었다. 랫트를 PO 약력학적 시험에서는 밤새 단식시켰다. 혈액 샘플은 경정맥으로부터 수거되었다.
IV 시험에서, Iab는 볼루스로 0.5 분에 걸쳐서 1.4 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVa 등가물로서 1.1 ㎎/㎏)으로 송달하였다 (n=3). 투약용액의 농도는 1.4 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 1 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 2, 10, 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 수거하였다.
PO 시험에서, Iab는 경구 가바즈에 의해서 7.9 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVa 등가물로서 6.3 ㎎/㎏)으로 투여하였다 (n=3). 투약용액의 농도는 4.0 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 2 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 수거하였다.
(2) 개에서의 생체내 시험
Iab의 IV 및 PO 시험은 3 마리의 수컷 비글 개 (11±1.1 ㎏, Marshall Farms USA Inc., North Rose, NY)에게서 크로스오버 (crossover) 방식으로 수행되었다. IV 및 PO 시험 사이에는 2-주일 세척기간을 두었다.
IV 시험에서, Iab는 0.1 ㎖/㎏/분의 일정속도로 5 분에 걸쳐서 1.2 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVa 등가물로서 0.95 ㎎/㎏)으로 요측피정맥을 통해서 주입하였다. 투약용액의 농도는 2.4 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 0.5 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 5, 10, 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 대퇴동맥으로부터 수거하였다.
PO 시험에서, 개는 투약하기 전에 밤새 단식시켰다. Iab는 경구 가바즈에 의해서 6.6 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVa 등가물로서 5.2 ㎎/㎏)로 투여하였다. 투약용액의 농도는 13.2 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 0.5 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 수거하였다.
Ia 및 IVa의 투여 후에 IVa의 경구적 흡수에 대한 식품의 영향을 시험하기 위해서, 이들 두가지 화합물은 밤새 단식 및 급식 조건 하에 크로스-오버 방식으로 3 마리의 개의 군에게 고체로서 캅셀제로 투여하였다. 각각의 시험 사이에는 1-주일의 세척기간을 두었다. Iab는 IVa 등가물로서 개에게 마리당, 200 ㎎ (약 20 ㎎/㎏)으로 투여하였으며; IVa는 개에게 마리당, 200 ㎎ (약 20 ㎎/㎏)으로 임상적 캅셀제제로 투여하였다. 개에게 급식한 시험에서는 다음의 식이가 제조되었다: 2 조각의 베이컨, 2개의 계란, 2 조각의 버터와 젤리를 바른 토스트, 4 oz.의 해쉬브라운 (hash brown) 및 8 oz.의 전유. 실험실 블렌더 (blender)를 사용하여 균질화시킨 후에, 식이를 균등하게 5 부분으로 나누고, 동결시켜 유지시켰다. 시험하기 전에 식이를 해동시키고, 각각의 개에게 한 부분씩 급식하였다.
IVa의 추가의 제제시험은 단식한 개 (n= 용량군당 2)에게서 수행되었다. 개에게는 임상적 형태 또는 스프레이 건조된 형태의 IVa를 캅셀제로 투여하였다. IVa의 임상적 캅셀 형태는 20 ㎎/㎏의 단일 용량으로 투여되었다. IVa의 스프레이 건조된 형태는 20, 75 및 200 ㎎/㎏으로 투여되었다.
(3) 원숭이에서의 생체내 시험
Iab의 IV 및 PO 시험은 3 마리의 수컷 사이노몰구스 (cynomolgus) 원숭이 (11±1.2 ㎏, Charles River Biochemical Research Foundation, Houston, TX)에게서 크로스오버 방식으로 수행되었다. IV 및 PO 시험 사이에는 2-주일 세척기간을 두었다.
IV 시험에서, Iab는 0.1 ㎖/㎏/분의 일정속도로 5 분에 걸쳐서 1.3 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVa 등가물로서 1.1 ㎎/㎏)으로 대퇴정맥을 통해서 주입하였다. 투약용액의 농도는 2.6 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 0.5 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 5, 10, 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 대퇴동맥으로부터 수거하였다.
PO 시험에서, 원숭이는 투약하기 전에 밤새 단식시켰다. Iab는 경구 가바즈에 의해서 7.1 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVa 등가물로서 5.6 ㎎/㎏)로 투여하였다. 투약용액의 농도는 14.2 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 0.5 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 수거하였다.
(4) 데이타 분석
모든 결과는 다른 식으로 규정되지 않는 한은 평균±SD로 표현된다.
Iab 및 IVa의 약력학적 파라메터는 키네티가 (KINETICA™) 소프트웨어 프로그램 (버젼 4.0.2, InnaPhase Co., Philadelphia, PA)을 사용하여 비-구획화 분석 (Non-Compartmental Analysis)에 의해서 계산되었다. Cmax 및 Tmax 값은 실험적 관찰로부터 직접적으로 기록되었다. AUC0-n 및 AUCtot 값은 혼합된 로그-선형 사다리꼴 가중법 (mixed log-linear trapezoidal summation)을 사용하여 계산되었다. 전체 체소실율 (total body clearance) (C1), 평균 체류시간 (MRT), 및 분포의 정상상태 용적 (Vss)도 또한 정맥내 투여한 후에 계산되었다. 절대적 경구 생체이용율 (absolute oral bioavailability) (%로 표현됨)은 정맥내 투여한 후의 용량-표준화된 AUC 값에 대한 정맥내 투여한 후의 값의 비를 구함으로써 추정되었다.
간청소율 ClH은 잘-섞여진 모델 (well-stirred model)을 사용하여 다음의 식으로부터 계산되었다:
Figure 112006074171808-pct00107
여기에서 Qh는 랫트, 개, 원숭이 및 인간에 대해서 각각 55, 31, 44 및 21 ㎖/분/㎏의 간 혈류이다 (Davis and Morris, 1993).
간추출 레이션 (hepatic extraction ration; ER)은 다음과 같이 계산되었다:
ER = ClH / Qh
통계학적 분석을 위해서는 스투던츠 t-시험 (Student's t-test)이 사용되었다 (Microsoft™ Excel, Redmond, WA). 차이는 P<0.05의 레벨에서 통계학적으로 유의적인 것으로 생각되었다.
시험관내 시험
EDTA 혈액, 혈청 및 트리스 - HCl 완충액 중에서 Iab 의 안정성
분석시험 타당성의 일부로서, Iab의 안정성은 알칼리성 포스파타제의 억제제인 것으로 알려진 EDTA를 함유하는 혈액에서 시험하였다 (Bowers, Jr. and McComb, 1966; Yora and Sakagishi, 1986). 37℃에서 60분 동안 배양한 후에, 랫트 혈액 중에서는 Iab의 초기 농도로부터 IVa로의 1.2% 전환이 일어났으며 (표 15), 원숭이 및 인간 혈액 중에서는 1% 미만의 전환이 있었다 (표 15 및 16). 개 혈액에서는 약 6% 전환이 있었으며, 전환의 백분율은 두가지 상이한 개 사이에서뿐만 아니라 두가지 상이한 시험의 경우에서의 동일한 개에서도 유사하였다 (표 15 및 16). -20℃의 샘플 저장조건 하에서, 37℃에서 관찰된 상기한 작은 백분율의 전환은 Iab의 분석 중에 어떠한 유의적인 생체외 전환도 도입시키는 것으로 예상되지 않는다.
Iab는 60-분의 시험기간 중에 37℃에서 트리스-HCl 중에서 안정하였다 (표 17).
랫트, 개 및 원숭이로부터의 신선한 EDTA 혈액 내에서 Iab의 안정성

시간
(분)		 랫트 혈액 (n=2) 개 A 혈액 (n=2) 원숭이 혈액 (n=2)
Iab
(μM)		 형성된 IVa
(μM)		 형성된 IVa %* Iab
(μM)		 형성된 IVa
(μM)		 형성된 IVa %* Iab
(μM)		 형성된 IVa
(μM)		 형성된 IVa %*
0 8.0 0.019 0.24 12 0.036 0.30 8.5 0.011 0.13
20 8.8 0.056 0.70 12 0.29 2.4 9.2 0.024 0.28
40 10 0.072 0.90 11 0.49 4.1 9.2 0.041 0.48
60 10 0.093 1.2 11 0.74 6.2 8.7 0.048 0.56
* Iab의 출발 농도로서 형성된 백분율
개 (반복) 및 인간으로부터의 신선한 EDTA 혈액 내에서 Iab의 안정성

시간
(분)		 개 A 혈액 (n=2) 개 B 혈액 (n=2) 인간 혈액 (n=2)
Iab
(μM)		 형성된 IVa
(μM)		 형성된 IVa %* Iab
(μM)		 형성된 IVa
(μM)		 형성된 IVa %* Iab
(μM)		 형성된 IVa
(μM)		 형성된 IVa %*
0 11 0.069 0.63 12 0.084 0.68 11 0.061 0.55
15 11 0.25 2.3 11 0.25 2.0 11 0.067 0.59
30 11 0.37 3.4 11 0.43 3.5 7.1 0.057 0.50
45 11 0.53 4.8 13 0.56 4.5 9.8 0.073 0.65
60 10 0.67 6.1 14 0.72 5.8 9.8 0.084 0.75
* Iab의 출발 농도로서 형성된 백분율
트리스-HCl 완충액 중에서 Iab의 안정성
시간
(분)		 트리스-HCl (n=2)
Iab (μM) 형성된 IVa (μM) 형성된 IVa %*
0 10 0.011 0.11
20 10 0.008 0.081
40 7.6 0.008 0.076
60 10 0.009 0.088
* Iab의 출발 농도로서 형성된 백분율
전신적 순환에서 Iab의 가수분해를 조사하기 위해서, Iab는 신선한 혈청 (랫트, 개, 원숭이 및 인간) 내에서 90 분 동안, 37℃에서 배양하였다. 가수분해의 속도는 랫트 혈청에서 가장 빨랐으며, 그 다음에 개, 원숭이 및 인간 혈청에서였다 (표 18). Iab의 IVa로의 전환은 거의 화학량론적이었다.
혈청은 조직에 비해서 더 낮은 ALP 활성을 함유한다 (MaComb et al., 1979a). 또한, 혈청은 또한 혈관을 통한 누출에 기인하는 뼈, 간 및 장과 같은 조직 공급원으로부터의 ALP 이소형태를 함유한다 (Moss, 1983). 따라서, 혈청 내에서의 Iab의 가수분해는 아마도 ALP의 다수의 이소형태에 의해서 매개될 것이다.
랫트, 개, 원숭이 및 인간으로부터의 신선한 혈청 내에서 Iab의 안정성

시간
(분)		 랫트 혈청 (n=2) 개 혈청 (n=2) 원숭이 혈청 (n=2) 인간 혈청 (n=2)
Iab
(μM)		 형성된 IVa
(μM)		 Iab
(μM)		 형성된 IVa
(μM)		 Iab
(μM)		 형성된 IVa
(μM)		 Iab
(μM)		 형성된 IVa
(μM)
0 6.8 0.25 9.2 0.066 9.0 0.20 9.5 0.10
15 5.8 1.1 9.0 0.85 7.3 0.48 9.2 0.10
30 5.4 1.8 7.8 1.6 6.8 0.75 9.0 0.15
45 4.9 2.8 7.8 2.5 6.5 1.2 9.6 0.20
60 4.3 3.7 7.1 3.2 6.3 1.5 9.1 0.24
90 3.3 5.4 6.7 4.4 6.3 2.0 9.4 0.32
t1 /2(분)* 80 182** 365** >2000
* Iab의 소실로서 계산됨. ** 반감기는 배양기간보다 더 길다.
인간 태반 ALP 의 존재 하에서 Iab 의 가수분해
인간 ALP의 순수한 형태 중에서 Iab의 가수분해를 시험하기 위해서는, Iab를 인간 태반 ALP 용액 중에서 10, 100, 1000 유니트/L로 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. Iab의 소실 t1 /2를 측정하여 표 19에 기록하였다. 예상한 바와 같이, 가수분해의 속도는 더 높은 ALP 활성을 갖는 용액에서 더 빨랐다. IVa도 또한 이에 상응하게 형성되었다 (도 8). 이것은 Iab가 인간으로부터 유도된 ALP에 의해서 가수분해되어 IVa를 형성함을 시사하는 것이다.
인간 태반 ALP 용액 중에서 Iab의 가수분해
ALP 활성 (유니트/L) (n=2)
10 100 1000
t1 /2 (분) 186 14 1.4
주: Iab는 37℃에서 ~10 μM의 출발 농도로 120 분 동안 배양하였다.
생체내 시험
랫트에서의 생체내 시험
Iab의 IV 및 경구 투여 후에 랫트에서 Iab 및 IVa의 약력학적 파라메터는 표 20에 요약하였다. 혈장 농도 대비 시간 프로필은 도 9에 나타내었다. 비교를 위해서, 랫트에서 IVa의 약력학적 시험으로부터의 히스토리칼 데이타를 또한 나타낸다.
IV 투여한 후의 Iab의 전체 체소실율 (C1)은 14 ㎖/분/㎏이었으며, 이것은 Iab가 랫트에서 낮은 청소율 화합물임을 시사하는 것이다. IV 투여한 후의 제거 반감기 (t1 /2) 및 평균 체류시간 (MRT)은 각각 0.16 시간 및 0.14 시간이었다. Iab는 2 시간이 지나서는 검출되지 않았다. 정상상태에서 Iab의 분포 용적 (Vss)은 0.12 L/㎏이었으며, 이것은 매우 제한된 조직분포를 시사하는 것이다. IV 투여한 후에 Iab로부터의 IVa의 형성은 빨랐으며; IVa는 2 분의 최초 샘플링 시점에서 검출되었다 (데이타는 나타내지 않음). Iab로부터 형성된 IVa 대비 히스토리칼 IVa 시험으로부터 형성된 IVa의 IV AUC 비는 1.5 (완전한 전환에 대한 이론적 값= 1)였으며, 이것은 Iab의 IVa로의 완전한 전환을 시사한다.
한가지 샘플 (5 nM; 표 20)을 제외하고는, Iab는 경구 투여한 후의 어떤 샘플에서도 검출되지 않았다. Iab를 경구 투여한 후에 IVa의 Tmax는 2.0 시간인 IVa의 히스토리칼 Tmax 보다 더 짧은 0.83 시간이었으며, 이것은 프로드럭의 경구 투여 후의 IVa의 더 빠른 흡수를 시사하는 것이다. 프로드럭으로부터 IVa의 더 빠른 흡수는 Iab의 더 우수한 수용성뿐만 아니라, 장에서 IVa를 형성시키는 Iab의 빠른 가수분해의 결과인 것으로 보인다. Iab로부터의 IVa의 절대적 경구 생체이용율은 히스토리칼 IVa 데이타보다 더 작은 62%였지만, Iab 랫트 경구적 용량 증가시험으로부터의 IVa의 노출은 IVa에 의한 히스토리칼 데이타에 비해서 더 탁월하였다 (표 16 및 도 8).
Iab로부터 형성된 IVa의 말기 혈장 농도 대비 시간 프로필은 히스토리칼 IVa 프로필과 유사하다.
랫트에서 Iab의 IV 및 경구 투여 후에 Iab 및 IVa의 약력학적 파라메터 (평균±SD, n=3)
PK 파라메터 Iab Iab를 투약한 후에
형성된 IVa		 히스토리칼 IVa
IV
용량 (㎎/㎏) 1.4 유리산, 또는
1.1 IVa 등가물		 1
AUCtot (μMㆍhr) 3.3±1.0 5.4±0.93 3.3±1.1
CLtot (㎖/분/㎏) 14±4.2 NA 13±4.0
t1 /2 (hr) 0.16±0.052 4.4±1.9 2.4±0.32
MRT (hr) 0.14±0.020 NA 2.2±1.5
Vdss (L/㎏) 0.12±0.019 NA 1.5±0.25
IVa의 IV AUC 비 NA 1.5* NA
PO
용량 (㎎/㎏) 7.9 유리산, 또는
6.3 IVa 등가물		 5
Tmax (hr) ND 0.83±0.29 2.0
Cmax (μM) ND** 3.9±0.98 4.5±1.5
C-24 hr (μM) ND ND 9 (n=1)
AUCtot (μMㆍhr) ND 13±1.4 15±6.3
t1 /2 (hr) ND 1.5±0.24 1.7±0.92
생체이용율 (%) ND 62*** 90
IVa의 PO AUC 비 NA 0.69* NA
NA - 적용할 수 없음; ND - 검출되지 않음 (< 5 nM)
* 비는 IV 및 PO에 대해서 각각, 프로드럭 투약한 후의 '043 AUC/'043 투약한 후의 '043 AUC로부터 계산되었다.
** Iab는 한마리의 랫트에서만 15 분에 검출되었다 (5 nM).
*** IVa의 히스토리칼 IV 데이타로부터 계산됨.
개에서의 생체내 시험
Iab의 IV 및 경구 투여 후에 개에서 Iab 및 IVa의 약력학적 파라메터는 표 21에 요약하였다. 혈장 농도 대비 시간 프로필은 도 10에 나타내었다. 비교를 위해서, 개에서 IVa의 약력학적 시험으로부터의 히스토리칼 데이타를 또한 나타낸다.
IV 투여한 후의 Iab의 C1은 간외 가수분해의 잠재적인 관련성 및/또는 제거의 다른 경로(들) (예를 들어, 신성 배설)를 시사하는 것으로, 개에서 31 ㎖/분/㎏의 간 혈류보다 현저하게 더 큰 70 ㎖/분/㎏이었다. IV 투여한 후의 제거 t1 /2 및 MRT는 각각 0.15 시간 및 0.07 시간이었다. Iab는 45 분이 지나서는 검출되지 않았다. Iab의 Vss는 0.30 L/㎏이었으며, 이것은 조직분포의 낮은 잠재성을 시사하는 것이다. IV 투여한 후에 Iab로부터의 IVa의 형성은 빨랐으며; IVa는 5 분의 최초 샘플링 시점에서 검출되었다 (데이타는 나타내지 않음). Iab로부터 형성된 IVa 대비 히스토리칼 IVa 시험으로부터 형성된 IVa의 IV AUC 비는 0.80이었으며, 이것은 Iab의 IVa로의 우수한 전환을 시사한다.
Iab는 경구 투여한 후에 한마리의 개에서 단지 15 분 및 30 분에만 5 nM (LLQ)로 검출되었다. Iab를 경구 투여한 후에 IVa의 Tmax는 2.9 시간인 IVa의 히스토리칼 Tmax 보다 더 짧은 0.25 시간이었으며, 이것은 프로드럭의 경구 투여 후의 IVa의 더 빠른 흡수를 시사하는 것이다. Iab로부터의 IVa의 절대적 경구 생체이용율은 57%의 히스토리칼 IVa 데이타보다 더 큰 94%였다. Iab로부터 형성된 IVa의 말기 혈장 농도 대비 시간 프로필은 히스토리칼 IVa 프로필과 유사하다.
개에서 Iab의 IV 및 경구 투여 후에 Iab 및 IVa의 약력학적 파라메터 (평균±SD, n=3)
PK 파라메터 Iab Iab를 투약한 후에
형성된 IVa		 히스토리칼 IVa
IV
용량 (㎎/㎏) 1.2 유리산, 또는
0.95 IVa 등가물		 1
AUCtot (μMㆍhr) 0.56±0.12 13±2.2 17±3.5
CLtot (㎖/분/㎏) 70±16 NA 2.4±0.43
t1 /2 (hr) 0.15±0.010 5.2±1.0 2.6±1.2
MRT (hr) 0.07±0.006 NA 3.3±0.71
Vdss (L/㎏) 0.30±0.094 NA 0.45±0.083
IVa의 IV AUC 비 NA 0.80 NA
PO
용량 (㎎/㎏) 6.6 유리산, 또는
5.2 IVa 등가물		 5
Tmax (hr) ND 0.25 2.9±1.9
Cmax (μM) ND* 14±1.3 6.5±1.2
C-24 hr (μM) ND 0.26±0.12 0.15±0.093
AUCtot (μMㆍhr) ND 83±16 47±7.2
t1 /2 (hr) ND 4.1±0.52 3.8±0.81
생체이용율 (%) ND 94 57±17
IVa의 PO AUC 비 NA 1.7 NA
* Iab는 한마리의 개에서 단지 15 분 및 30 분에만 5 nM (LLQ)로 검출되었다.
Ia 및 IVa의 투여 후에 IVa의 경구적 흡수에 대한 식품의 영향을 시험하기 위해서, Iab 또는 IVa를 개에게 단식 및 급식 조건 하에 캅셀제로 투여하였다. 시험은 크로스-오버 방식으로 수행되었으며, 각각의 시험 사이에는 1-주일의 세척기간을 두었다. AUC와 Cmax 사이에서의 유의적인 차이는 Iab를 투여한 후에 단식 및 급식 조건 사이에서 관찰되지 않았으며 (표 22), 그 반면에 급식과 함께 IVa를 투여한 후에는 AUC 및 Cmax에서 9-배 증가가 관찰되었다 (표 23). 전체적으로, 급식의 효과는 IVa를 투여하는 인간 피검자 (표 24)에서 보다는 개 (표 23)에게서 더 현저하였다. 이것은 IVa의 경구적 흡수에 대한 식품의 영향에서 정량적인 종간 차이를 시사하는 것이다.
IVa의 경구적 흡수는 인간 및 동물 종에서 용해-속도 제한되는 것으로 나타났다. 고지방 식이를 급식한 인간에게서 IVa 노출의 개선은 IVa의 용해를 촉진시키는 담즙염의 증가된 분비에 기인하는 것으로 추측된다. 개에게서 Iab 투여 후에 IVa의 경구적 흡수에 대한 식품의 영향이 결여된 것은 인간에게서 그를 위한 다이어트 변형이 필요하지 않을 수 있다는 잠재적인 이점을 시사하는 것이다.
건식-충진된 캅셀제 (IVa 등가물로 20 ㎎/㎏)로 Iab를 경구 투여한 후에 개에게서 IVa의 경구적 노출에 대한 식품의 영향 (평균±SD, n=3)
파라메터 단식 급식
AUCtot (μMㆍhr) 414±70 422±57
Cmax (μM) 70±12 130±102
Tmax (μM) 2.0 1.5±0.87
t1 /2 (hr) 4.2±0.42 3.2±1.0
주: Iab는 이른 시점에 몇개의 샘플에서 <200 nM에서 검출되었다.
임상적 형태의 캅셀제로 IVa (20 ㎎/㎏)를 경구 투여한 후에 개에게서 IVa의 경구적 노출에 대한 식품의 영향 (평균±SD, n=3)
파라메터 단식 급식 급식/단식 비
AUCtot (μMㆍhr) 11±1.4 96±10* 9.0±2.2
Cmax (μM) 1.2±0.22 11±0.99* 9.1±0.92
Tmax (μM) 3.3±1.2 4.0
t1 /2 (hr) 5.3±2.7 8.0±3.1
* 단식 조건 하에서의 값과 유의적으로 상이함.
인간에게서 일차적인 시험 (first-in-human study)에서 IVa의 경구적 노출에 대한 식품의 영향 (평균±SD, n=6)
800 ㎎ 1800 ㎎
단식 급식 급식/단식 비 단식 급식 급식/단식 비
AUCtot (μMㆍhr) 22±12 53±10 2.4 19±5.8 82±16 4.3
Cmax (μM) 3.7±1.1 9.8±1.3 2.6 3.3±0.84 15±5.0 4.5
추가의 캅셀제제 시험은 임상적 및 스프레이 건조된 형태의 IVa를 사용하여 동일한 단식한 개에서 수행하여 Iab와 비교하였다. 표 25에 나타낸 바와 같이, IVa 등가물의 20 ㎎/㎏에서 Iab 및 IVa의 스프레이 건조된 형태를 투여한 후에 IVa의 유사한 노출이 관찰되었다. 그러나, Iab는 IVa의 임상적 형태에 비해서 IVa의 유의적으로 더 높은 노출을 제공하였다. 프로드럭으로부터의 IVa의 AUC 및 Cmax는 IVa의 임상적 형태로부터 수득한 값보다 각각 37 배 및 45 배였다. 개에서의 배수 증가는 개발시에 IVa에 의한 경험을 기초로 하여 임상적 상황의 과도한 예견인 것으로 보인다 (데이타는 제시되지 않음).
개에서의 스프레이-건조 형태의 IVa의 용량 증가시험에서, 20 ㎎/㎏에서 75 ㎎/㎏까지의 AUC 및 Cmax의 증가는 용량 증가에 덜 비례적이었다 (표 26). 노출에서의 유의적인 추가의 증가는 75 ㎎/㎏에서 200 ㎎/㎏까지에서 관찰되지 않았다.
Iab 및 IVa의 다양한 제제를 캅셀제로 경구 투여한 후에 개에서의 IVa의 경구적 노출 (크로스-오버 시험)
파라메터 개 #4201 개 #4202 개 #4201 개 #4202 개 #4201 개 #4202
제제 Iab Lab IVa 스프레이-건조 IVa 스프레이-건조 'IVa 임상적 형태 'IVa 임상적 형태
용량 (㎎/㎏; 'IVa eq.) 19 19 20 20 20 20
AUVtot
(μMㆍhr)		 486 514 303* 338 11 16
Cmax (μM) 80 86 46 81 1.3 2.4
Tmax (hr) 1.0 1.0 2.0 1.0 1.0 4.0
t1 /2 (hr) 4.2 3.4 3.4 4.2 7.1 4.5
* AUC는 0-24 시간이었다.
IVa의 스프레이-건조된 형태를 캅셀제로 경구 투여한 후에 개에서의 IVa의 경구적 노출
파라메터 개 #4201* 개 #4202* 개 #1201 개 #1202 개 #2201 개 #2202
용량 (㎎/㎏) 20 20 75 75 200 200
AUVtot (μMㆍhr) 303** 338 759 923 935** 1209
Cmax (μM) 46 81 156 192 178 210
Tmax (hr) 2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0
t1 /2 (hr) 57 4.2 2.1 1.9 3.0 2.3
용량비 1 : 3.8 : 10
평균 AUC 비 1 : 2.6 : 3.4
평균 Cmax 비 1 : 2.7 : 3.0
** 표 25에서의 As. ** AUC는 0-24 시간이었다.
원숭이에서의 생체내 시험
Iab의 IV 및 경구 투여 후에 원숭이에서 Iab 및 IVa의 약력학적 파라메터는 표 27에 요약하였다. 혈장 농도 대비 시간 프로필은 도 11에 나타내었다. 비교를 위해서, 원숭이에서 IVa의 약력학적 시험으로부터의 히스토리칼 데이타를 또한 나타낸다.
IV 투여한 후의 Iab의 C1은 4.4 ㎖/분/㎏이었으며, 이것은 원숭이에서의 Iab의 낮은 청소율 화합물임을 시사하는 것이다. IV 투여한 후의 t1 /2 및 MRT는 각각 1.0 시간 및 0.18 시간이었다. 말기상에서 Iab의 혈장 농도는 낮았기 때문에 MRT는 혈장 내에서의 Iab의 지속시간의 더 현실적인 추정치이다 (도 11). Iab는 6 시간이 지나서는 검출되지 않았다. Iab의 Vss는 0.048 L/㎏이었으며, 이것은 매우 제한된 조직분포를 시사하는 것이다. IV 투여한 후에 Iab로부터의 IVa의 형성은 빨랐으며; IVa는 5 분의 최초 샘플링 시점에서 검출되었다 (데이타는 나타내지 않음). Iab로부터 형성된 IVa 대비 히스토리칼 IVa 시험으로부터 형성된 IVa의 IV AUC 비는 0.70이었으며, 이것은 Iab의 IVa로의 우수한 전환을 시사한다.
Iab는 경구 투여한 후에 단지 한마리의 개에서 15 분에 18 nM의 농도에서 검출되었다. Iab를 경구 투여한 후에 IVa의 Tmax는 2.7 시간인 IVa의 히스토리칼 Tmax 보다 더 짧은 0.83 시간이었으며, 이것은 프로드럭의 경구 투여 후의 IVa의 더 빠른 흡수를 시사하는 것이다. Iab로부터의 IVa의 절대적 경구 생체이용율은 66%로 60%의 히스토리칼 IVa 데이타와 유사하였다.
Iab로부터 형성된 IVa의 말기 혈장 농도 대비 시간 프로필은 히스토리칼 IVa 프로필과 유사하다.
원숭이에서 Iab의 IV 및 경구 투여 후에 Iab 및 IVa의 약력학적 파라메터 (평균±SD, n=3)
PK 파라메터 Iab Iab를 투약한 후에
형성된 IVa		 히스토리칼 IVa
IV
용량 (㎎/㎏) 1.3 유리산, 또는
1.1 IVa 등가물		 1
AUCtot (μMㆍhr) 9.5±0.38 7.1±1.0 9.2±0.53
CLtot (㎖/분/㎏) 4.4±0.18 NA 4.3±0.26
t1 /2 (hr) 1.0±0.78 4.8±1.9 4.7±0.31
MRT (hr) 0.18±0.059 NA 2.4±0.15
Vdss (L/㎏) 0.048±0.017 NA 0.63±0.39
IVa의 IV AUC 비 NA 0.70 NA
PO
용량 (㎎/㎏) 7.1 유리산, 또는
5.6 IVa 등가물		 5
Tmax (hr) ND 0.83±0.14 2.7±1.2
Cmax (μM) ND* 16±6.4 5.8±1.2
C-24 hr (μM) ND 0.067±0.039 0.074±0.032
AUCtot (μMㆍhr) ND 34±2.7 27±2.9
t1 /2 (hr) ND 4.8±1.3 4.2±0.64
생체이용율 (%) ND 66 60±4
IVa의 PO AUC 비 NA 1.1 NA
* Iab는 단지 한마리의 원숭이에서 15 분에 18 nM로 검출되었다.
추가의 프로파일링 항목 2
프로드럭 Ibb 를 사용한 추가의 시험:
Ibb의 IV 및 PO 약력학적 시험을 랫트, 개 및 원숭이에게서 수행하였다. 모든 경우에, 혈액 샘플은 EDTA의 존재 하에서 수거하였다. 공지된 ALP 억제제인 EDTA의 존재는 샘플 처리 중에 Ibb의 유의적인 생체외 전환을 최소화하였다. IVb는 Ibb의 IV 투여에 따라서 빠르게 형성되었다. IVb의 우수한 경구적 생체이용율 (50-310%; IVb의 히스토리칼 IV AUC를 사용하여 계산됨)은 랫트, 개 및 원숭이에게서 Ibb를 투여한 후에 관찰되었으며, Ibb는 혈장 내에 매우 낮은 레벨로 존재하였다. 장에서는 높은 레벨의 ALP 발현이 있기 때문에, Ibb의 경구 투여 후에 Ibb는 소장강의 쇄자연막에 존재하는 ALP에 의해서 가수분해되어 IVa를 형성하고, 이것은 그의 높은 투과성으로 인하여 빠르게 흡수되는 것으로 보인다.
시험관내 배양시험은 다양한 조직에서 Ibb의 ALP-의존성 가수분해를 정성적으로 평가하기 위해서 수행되었다. Ibb는 랫트, 개, 원숭이 및 인간으로부터 유래하는 혈청 및 간세포, 및 인간 태반 ALP의 존재 하에서 가수분해되었다. Ibb 및 IVb가 측정된 경우에 Ibb의 IVb로의 전환은 거의 화학량론적이었다. 혈청 내에서의 가수분해로 인하여, Ibb의 단백질 결합은 측정될 수 없었다. 시험관내 데이타를 기초로 하여, Ibb는 인간 ALP에 의해서 가수분해될 수 있을 것이고, 인체 피검자에게 Ibb를 경구 투여한 후에 IVb가 형성될 것으로 예상된다.
실온에서 Ibb-03의 결정성 용해도는 1.5 내지 8.7의 pH 범위에서 > 11 ㎎/㎖이며; > 75 ㎎/㎖를 함유하는 수용액이 생체내 독성시험을 위해서 제조되었다. 비교시에, 결정성 물질로서 실온에서 모화합물 IVb의 수용성은 0.007-0.19 ㎎/㎖ (1.0-9.6의 pH 범위)인 것으로 측정되었다. Ibb는 허용되는 용액 및 고체 안정성을 나타낸다.
Ibb의 더 큰 수용성은 특정의 용량 이하에서 IVb의 용해-속도 제한된 흡수를 극복하는 수단을 제공하며, 이에 의해서 경구 용량 증가 및 독력학적 시험에서 IVb의 노출을 증가시켰다. 200 ㎎/㎏ 이하의 IVb 등가물을 경구적으로 투여한 경우에 Ibb는 유사한 용량에서 히스토리칼 IVb 현탁액 시험으로부터의 AUC와 비교하여, 프로드럭에 대한 비교적 낮은 혈장 노출 (< 0.9 μM)을 가지고 랫트 및 개에게서 각각 IVb의 11- 및 2.6-배 (BID) 더 큰 AUC를 제공하였다.
스프라그 - 도울리 랫트에서 단일-용량 독력학적 시험
랫트에서의 1-일 경구 독력학적 시험은 프로드럭 Ibb (모노라이신 염)를 사용하여 수행되었다. Ibb는 19, 64 및 236 ㎎/㎏ (유리산)의 투약량으로 경구 가바즈에 의해서 비히클로 물을 사용하여 (용액 제제) 군당, 3 마리의 수컷 랫트에게 투여하였다. 프로드럭 유리산의 투약량은 각각 15, 51 및 190 ㎎/㎏의 IVb (모화합물) 몰 동가의 투약량에 상응한다. 평가된 종말점은 개개 랫트에서 Ibb 및 IVb의 혈장 독력학이었다.
평균 독력학적 값은 표 28에 제시되어 있다.
단일 경구용량으로 ≤200 ㎎/㎏의 Ibb를 투여한 수컷 랫트에서 Ibb 및 IVb에 대한 평균 독력학적 값
투약량 (㎎/㎏)
Ibb 19
IVb 몰당량 15		 64
51		 236
190
Ibb IVb Ibb IVb Ibb IVb
Cmax (μM) 0.027 58 0.14 135 0.25 290
C24 (μM) < LLQ 0.048 < LLQ 0.29 < LLQ 29
AUC (μMㆍh) 0.0301 2832 0.181 9972 0.491 37002
T1/2 (h) 1.3 2.1 4.6 2.1 3.6 5.8
값들은 Ibb 데이타에 대해서는 1-3 랫트/군, IVb 데이타에 대해서는 3 랫트/군으로부터의 평균을 나타낸다.
1 0부터 마지막 시점까지의 AUC
2 0부터 ∞까지의 AUC
IVb (모화합물)의 평균 최대 혈장농도 (Cmax)는 투약-후 약 1-3 시간 이내에 달성되었다. ≤236 ㎎/㎏의 Ibb를 투여한 랫트에서 IVb의 AUC에서의 증가는 Ibb 투약량과 거의 비례하였으며, Cmax는 19 및 236 ㎎/㎏의 Ibb 사이에서 덜 용량-비례적인 방식으로 증가하였다. Ibb는 ≥19 ㎎/㎏의 Ibb를 투여한 랫트의 혈장에서 검출되었지만, IVb의 경우에 비해서는 매우 낮은 농도에서 이루어졌다.
IVb 또는 Ibb를 투여한 랫트에서 수득된 IVb Cmax 및 AUC의 비교는 도 12에 나타내었다.
IVb의 노출은 IVb를 투약한 후에 수득된 것에 비해서 Ibb를 투여한 후에 실질적으로 증가하였다.
개에서 단일-용량 독력학 및 내약성 시험
25, 92 또는 250 ㎎/㎏의 투약량의 프로드럭 Ibb (모노라이신 염) (유리산, 각각 모 IVb의 20, 74 또는 201 ㎎/㎏와 동등한 몰량)의 내약성, 및 Ibb 및 IVb의 독력학을 평가하기 위해서 2-상 시험을 수행하였다 (1). 1 일에, Ibb는 1 마리의 개/성별/군에게 상기 투약량으로 매일 한번씩 건식-충진된 캅셀제로 투여되었다. 시험에서 투약 사이에는 1-주일의 세척기간을 사용하였다. 8 일째에 Ibb는 1 마리의 개/성별/군에게 25 ㎎/㎏의 수용액으로 매일 한번씩, 또는 46 또는 125 ㎎/㎏ BID의 건식-충진된 캅셀제로 매일 2 회씩 투여되었다. 종말점은 다음과 같았다: 임상적 징후, 체중, 식품 소비, 혈청 화학, 혈액학, 및 Ibb 및 IVb의 혈장 독력학.
각각의 개로부터의 혈장 독력학 값은 표 29에 나타내었다.
≤250 ㎎/㎏의 Ibb를 투여한 개에서 IVb에 대한 독력학적 값
투약량 (㎎/㎏)
Ibb 251
IVb 몰등가물 20		 922
75		 2503
203
동물 2101M 2201F 3101M 3201F 4101M 4201F
Cmax (μM)
1 일 72 34
8 일 56 33
284 664
744 1085
614 934
1585 884,5
C24h (μM)
1 일 0.008 0.688
8 일 0.547 0.107
1.90 0.202
10.6 0.307
2.61 0.704
54.2 1.96
AUC0 -∞ (μMㆍh)
1 일 259 136
8 일 324 139
1144 3294
4784 10535
3344 7454
13935 9784,5
T1/2 (h)
1 일 1.5 4.5
8 일 3.3 3.4
3.6 2.3
5.2 2.4
4.1 3.2
8.0 3.3
1 1 일에는 건식-충진된 캅셀로서 제제화되고, 8 일에는 수용액으로 제제화된다 (양일에 모두 QD 투약).
2 1 일에는 92 ㎎/㎏ QD, 8 일에는 46 ㎎/㎏ BID; 양일에 모두 건식-충진된 캅셀제로 제제화됨.
3 1 일에는 250 ㎎/㎏ QD, 8 일에는 125 ㎎/㎏ BID; 양일에 모두 건식-충진된 캅셀제로 제제화됨.
4 구토가 투약한 지 2 시간 이내에 관찰되며, 캅셀 잔류물이 존재함.
5 구토가 투약한 지 2 시간 이내에 관찰되나, 캅셀 잔류물은 없음.
낮은 레벨 (≤0.9 μM)의 Ibb는 1 및 8 일에 일부의 혈장 샘플에서 검출되었다. IVb의 평균 최대 혈장농도 (Cmax)는 QD 투약의 경우에는 투여-후 1-4 시간 사이에 달성되었으며, BID 투약의 경우에는 이차 투여-후 1-2 시간에 달성되었다. 25 ㎎/㎏ QD에서는 Ibb가 건식-충진된 캅셀제로 또는 수용액으로 투여된 경우에 IVb의 동등한 Cmax 및 AUC가 관찰되었다. 1 일에 ≥92 ㎎/㎏ QD를 투여한 모든 개 (3101M, 3201F, 4101M 및 4201F)에게서 투약한 지 약 0.5-1.25 시간 후에 구토 (흰색이며 캅셀 잔류물을 함유하는 붉은 색의 줄무늬가 있음)가 관찰되었으며, 이것은 92 및 250 ㎎/㎏ 사이에서의 단조로운 노출에 기인하는 것으로 보인다. 8 일에는 ≥46 ㎎/㎏ BID로 투여한 모든 개에게서 투약한 지 2 시간 이내에 구토 (백색 또는 갈색)가 관찰되었으며; 캅셀 잔류물은 단지 2 마리의 개 (1차 투약-후의 3101M 및 2차 투약-후의 4201F)의 구토물에서만 관찰되었다. 1 일-2 회 투약은 1 일 1 회 투약보다 개에서 IVb에 대한 더 큰 노출을 제공하였다.
구토 이외의 임상적 징후는 관찰되지 않았으며, 체중 및 식품 소비에 대한 영향은 없었다.
개에게서 관찰된 구토에도 불구하고, IVb를 투여한 개에서 보다는 Ibb를 투여한 개에게서 더 큰 IVb AUC가 관찰된다. Ibb 또는 IVb (2)를 투여한 개에서 수득된 IVb AUC의 비교는 도 13에 나타내었다.
포스페이트 프로드럭인 Ibb-03의 수용액을 투여한 후에 모화합물인 IVb의 절대적 경구 생체이용율은 랫트, 개 및 원숭이에게서 50% 내지 310%의 범위였다. 이들 계산은 히스토리칼 IV 데이타를 기초로 하였다. IVb 등가물의 190 ㎎/㎏ 이하의 용량으로 프로드럭 Ibb-03의 수용액을 경구 투여한 후에 IVb의 노출은 랫트 경구 용량 증가시험에서 IVb에 의한 히스토리칼 데이타에 비해서 3-10 배 더 크다. Ibb-03을 개에게서 캅셀제 형태의 약물로 BID로 투약한 경우에는 현탁액으로서 IVb를 BID 투약하는 전-ECN 독성시험으로부터의 히스토리칼 데이타에 비해서 노출에서 2-3 배의 개선이 수득된다. 캅셀제제 형태의 약물로부터의 생체내 노출 데이타는 인간에게서 IVb의 경구적 노출은 Ibb의 전통적인 고체 경구 투약형의 투여에 의해서 유의적으로 개선될 수 있었음을 시사한다.
Ibb는 IVb의 N-하이드록시메틸 부가물의 포스페이트 프로드럭이며, 알칼리성 포스파타제 (ALP)에 의해서 가수분해되어 IVb를 형성한다. 따라서, Ibb를 동물에게 투여한 후에 혈장 샘플은 공지의 ALP 억제제인 EDTA의 존재 하에서 수거된 혈액으로부터 제조되었다. Ibb의 IVb로의 전환은 EDTA를 함유하는 혈액 (랫트, 개, 원숭이 및 인간)에서 최소 (<2%)였다. 샘플 저장 (-20℃) 및 Ibb의 분석 중에 Ibb의 유의적인 생체외 전환은 예상되지 않는다.
Ibb의 가수분해는 동물 및 인체 시험관내 시험에서 시험하였다. 다수의 ALP 이소형태는 다양한 조직 내에 광범하게 분포되어 있기 때문에, 정량적인 시험관내에 대한 생체내의 상관관계는 시도되지 않았다 (Fishman et al., 1968; Komoda et al., 1981; Moss 1983; Yora and Sakagishi, 1986; Sumikawa et al., 1990). 따라서, 시험은 다양한 조직에서의 ALP-의존성 가수분해의 정성적 평가로 제한되었다. Ibb는 랫트, 혈청 (랫트, 개, 원숭이 및 인간), 간세포 (랫트, 개 및 인간), 및 인간 태반 ALP의 존재 하에서 가수분해되었다. 원숭이 간세포에서는 턴오버가 관찰되지 않았다. Ibb의 IVb로의 전환은 거의 화학량론적이었다. 혈청 내에서의 가수분해로 인하여, Ibb의 단백질 결합은 측정될 수 없었다.
Ibb는 Caco-2 세포에서 완전히 가수분해되어 IVb를 형성하며, 예상된 바와 같이 Ibb의 경구 투여 후에 랫트, 개 및 원숭이 혈장에서 Ibb는 매우 낮은 레벨로 검출되었다. 이들 데이타는 장에서의 높은 레벨의 ALP 발현을 기술하는 보고서와 일치한다 (McComb et al., 1979a; Butterworth, 1983). 막-결합된 ALP는 대부분 소장강을 라이닝하는 미소융모의 쇄자연막 내에 국재화된다 (Butterworth, 1983; Testa and Mayer, 2003). Ibb의 경구 투여 후에, Ibb는 소장강의 쇄자연막에 존재하는 ALP에 의해서 가수분해되어 IVa를 형성하고, 이것은 그의 높은 투과성으로 인하여 빠르게 흡수되는 것으로 보인다.
ALP의 다양한 이소형태가 다양한 조직 및 종에 존재하지만, ALP에 대한 기질 특이성은 비교적 광범하고 (Heimbach et al., 2003), 이것은 Ibb에 대한 상기의 결과와 일치한다.
IVb는 랫트, 개 및 원숭이에게서 Ibb의 IV 투여 후에 빠르게 형성되었다. IV AUC 전환비는 랫트에서는 0.62, 개에서는 1.6 및 원숭이에서는 1.7이었으며, 이것은 Ibb로부터 IVb로의 만족스러운 전환 내지는 우수한 전환을 시사하는 것이다.
IVb의 우수한 경구적 생체이용율 (50-310%; IVb의 히스토리칼 IV AUC를 사용하여 계산됨)은 랫트, 개 및 원숭이에게서 Ibb를 투여한 후에 관찰되었다. 더욱 유의적으로, Ibb의 더 큰 수용성은 IVb의 용해-속도 제한된 흡수를 감소시켰으며, 이에 의해서 히스토리칼 IVb 시험으로부터의 노출에 비해서 경구적 용량 증가 및 독력학적 시험에서 IVb의 노출을 증가시켰다 (발견 독물학 항목 표 28-29 및 도 12-13).
방법
여기에 기술된 시험은 Ibb의 모노-라이신 염을 사용하였다.
LC / MS / MS 에 의한 Ibb 및 IVb 의 정량화
LC/MS/MS 방법은 동물 약력학적 시험으로부터의 혈장 샘플 내에서 및 시험관내 배양시험으로부터의 아세토니트릴 상등액 내에서 Ibb 및 IVb를 분석하기 위해서 개발되었다. 혈장 내에서의 분석을 위해서는 패카드 멀티프로브 장치를 사용하여 표준품, QC 및 혈장 샘플 각각의 50 ㎕씩을 단백질 침전 추출을 위해서 깨끗한 96-웰 플레이트에 옮겼다. 내부 표준물 IVc를 함유하는 200 ㎕의 아세토니트릴을 첨가한 후에, 샘플을 소용돌이시켜 혼합시키고, 생성된 상등액을 10 분 동안 원심분리시킴으로써 침전된 단백질로부터 분리시켰다. 시험관내 시험으로부터 생성된 상등액에서의 분석을 위해서는, 동등한 용적의 상등액 및 내부 표준물을 함유하는 아세토니트릴을 혼합시켰다. 상기 상등액의 분취액을 톰테크 자동화 액체 핸들러를 사용하여 두번째의 깨끗한 96-웰 플레이트에 옮겼다. 동등한 용적의 물을 첨가하고, 플레이트를 마개를 하고 소용돌이를 일으켜 혼합시켰다.
HPLC 시스템은 페노메넥스 시너지 퓨존-RP 분석용 칼럼 (2.0×50 ㎜, 5 μ; Torrance, CA)에 연결된 시마주 LC10ADvp 펌프 (Columbia, MD) 및 HTC PAL 오토샘플러 (Leap Technologies, Cary, NC)로 구성되었다. 이동상 A는 물 중의 5 mM 암모늄 포르메이트로 구성되었으며; 이동상 B는 100% 아세토니트릴이다. LC 유속은 0.38 ㎖/분이었다. 초기 이동상 조성물은 2% B였으며, 1.8 분에 걸쳐서 50% B로 증가되었으며, 0.5 분 동안 유지시키고, 0.1 분에 걸쳐서 100% B로 증가시키고, 0.5 분 동안 유지시키고, 다음 0.1 분에 걸쳐서 초기 상태로 복귀시킨 다음에, 재-평형화시켰다. 총분석시간은 4.0 분이었다. Ibb, IVb 및 IVc에 대한 체류시간은 각각 1.42, 2.21 및 1.73 분이었다.
HPLC 시스템은 550℃로 설정된 터보이온스프레이 공급원 및 4.5 kV로 설정된 이온스프레이 전압이 장치된 시엑스 API4000 삼중 사극자 질량분광계 (Toronto, Canada)에 연결시켰다. UHP 질소가 분무화 및 보조 가스로서 각각 80 psi 및 7 L/분의 압력으로 사용되었다. Ibb, IVb 및 IVc에 대한 충돌 에너지는 각각 19, 25 및 29 볼트였다. 데이타 획득은 선택된 반응 모니터링 (SRM)을 이용하였다. Ibb, IVb 및 내부 표준물을 위한 양이온 모드 (M+H)+ 종을 나타내는 이온은 MS1에서 선택되었으며, 질소 및 최적화된 충돌 에너지에 의해서 충돌적으로 해리시켜 특정한 생성물 이온을 형성시키고, 이어서 이것을 MS2에 의해서 모니터하였다. Ibb, IVb 및 IVc에 대한 SRM 전이는 각각 m/z 558 → 432, 448 → 202 및 474 →256이었다.
5 nM 내지 10 μM 범위의 표준곡선은 Ibb 및 IVb 둘 다에 대해 저장용액으로부터 매트릭스 내에서 계열희석하여 제조되었다. 표준곡선은 이중으로 분취하여, 샘플로 추출하고, 분석절차의 초기, 중기 및 말기에 주입하였다. 분석곡선은 역수 농도 1/x2에 의해서 가중된 선형회귀에 적합하였다. 데이타 및 크로마토그라피 피크를 처리하고, 표준물 및 미지물질의 농도는 피이바이오시스템 아날리스트 1.1을 사용하여 정량화되었다.
시험관내 방법
(1) EDTA 혈액, 혈청 및 트리스 - HCl 완충액 중에서 Ibb 의 안정성
Ibb의 안정성은 랫트, 개, 원숭이 및 인간 (n=2)으로부터의 신선한 혈액 및 혈청에서 시험하였다. 혈액을 K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 함유하는 배큐테이너 내에 수거하였다. 혈청을 항응고제를 함유하지 않는 배큐테이너 내에 수거하였다. Ibb를 약 15 μM의 출발농도로 37℃에서 90 분 동안 배양하였다. 일련의 샘플을 예정된 시간에 취하였다. 혈액 샘플의 분취물 (200 ㎕)을 우선 100 ㎕의 물과 혼합시키고, 이어서 400 ㎕의 아세토니트릴과 혼합시켰다. 혈청 샘플 (50 ㎕)을 K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 함유하는 마이크로테이너 내에 첨가하고, 이어서 100 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하였다. 상등액을 LC/MS/MS에 의해서 Ibb 및 IVb 둘 다에 대해서 분석하였다.
Ibb의 안정성은 또한, 트리스-HCl 완충액 (0.1 M, pH 7.5) 내에서 상술한 바와 같이 평가되었다.
(2) 인간 태반 ALP 의 존재 하에서 Ibb 의 가수분해
고체 인간 태반 ALP를 시그마 (Sigma, P-3895, St. Louis, MO)로부터 수득하였다. 1000 유니트/L의 용액을 트리스-HCl 완충액 (0.1 M, pH 7.5) 중에서 제조하였다. 100 및 10 유니트/L의 용액은 계열 희석함으로써 수득되었다. Ibb를 10, 100 및 1000 유니트/L 용액 (n=2) 중에서 37℃로 2 시간 동안 배양하였다. 배양시에 Iab의 출발농도는 10 μM이었다. 100 ㎕ 샘플의 분취물을 예정된 시간에 취하고, K2EDTA 마이크로테이너 내에 첨가하고, 이어서 200 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하였다. 상등액을 LC/MS/MS에 의해서 Ibb 및 IVb 둘 다에 대해서 분석하였다.
생체내 시험
모든 혈액 샘플 (0.3 ㎖)을 K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 함유하는 마이크로테이너 내에 수거하고, 분쇄된 얼음 상에 놓았다. 원심분리한 후에, 혈장을 분리하여 분석할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 약력학적 시험을 위해서는 Ibb의 모노-라이신 염 (형태 3)을 사용하였다. Ibb의 투약용액은 멸균수 (개 및 원숭이에게서 IV 투여를 위함) 또는 증류수 (모든 다른 용량 투여를 위함) 중에서 제조하였다.
(1) 랫트에서의 생체내 시험
경정맥에 카눌라를 이식한 수컷 스프라그-도울리 랫트 (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottsdale, PA)가 사용되었다. 랫트를 PO 약력학적 시험에서는 밤새 단식시켰다. 혈액 샘플은 경정맥으로부터 수거되었다.
IV 시험에서, Ibb는 볼루스로 0.5 분에 걸쳐서 1.3 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVb 등가물로서 1.0 ㎎/㎏)으로 송달하였다 (n=3). 투약용액의 농도는 1.3 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 1 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 2, 10, 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 수거하였다.
PO 시험에서, Ibb는 경구 가바즈에 의해서 6.6 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVa 등가물로서 5.2 ㎎/㎏)으로 투여하였다 (n=3). 투약용액의 농도는 1.3 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 5 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 수거하였다.
(2) 개에서의 생체내 시험
Ibb의 IV 및 PO 시험은 수컷 비글 개 (10±0.78 ㎏, Marshall Farms USA Inc., North Rose, NY)에게서 수행되었다. 각각의 시험에서 3 마리의 개가 사용되었다. 3 마리의 개 중에서 2 마리의 같은 개를 IV 및 PO시험에 사용하였다. IV 및 PO 시험 사이에는 2-주일 세척기간을 두었다.
IV 시험에서, Ibb는 0.1 ㎖/㎏/분의 일정속도로 5 분에 걸쳐서 1.3 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVb 등가물로서 1.0 ㎎/㎏)으로 요측피정맥을 통해서 주입하였다. 투약용액의 농도는 2.6 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 0.5 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 5, 10, 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 대퇴동맥으로부터 수거하였다.
PO 시험에서, 개는 투약하기 전에 밤새 단식시켰다. Ibb는 경구 가바즈에 의해서 7.0 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVb 등가물로서 5.6 ㎎/㎏)로 투여하였다. 투약용액의 농도는 7.0 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 1 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 수거하였다.
(3) 원숭이에서의 생체내 시험
Ibb의 IV 및 PO 시험은 3 마리의 수컷 사이노몰구스 원숭이 (9.9±2.4 ㎏, Charles River Biochemical Research Foundation, Houston, TX)에게서 크로스오버 방식으로 수행되었다. IV 및 PO 시험 사이에는 2-주일 세척기간을 두었다.
IV 시험에서, Ibb는 0.1 ㎖/㎏/분의 일정속도로 5 분에 걸쳐서 1.3 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVb 등가물로서 1.1 ㎎/㎏)으로 대퇴정맥을 통해서 주입하였다. 투약용액의 농도는 2.7 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 0.5 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 5, 10, 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 대퇴동맥으로부터 수거하였다.
PO 시험에서, 원숭이는 투약하기 전에 밤새 단식시켰다. Ibb는 경구 가바즈에 의해서 5.8 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVb 등가물로서 4.7 ㎎/㎏)로 투여하였다. 투약용액의 농도는 5.8 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 1 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 수거하였다.
(4) 데이타 분석
모든 결과는 다른 식으로 규정되지 않는 한은 평균±SD로 표현된다.
Ibb 및 IVb의 약력학적 파라메터는 키네티가 소프트웨어 프로그램 (버젼 4.0.2, InnaPhase Co., Philadelphia, PA)을 사용하여 비-구획화 분석에 의해서 계산되었다. Cmax 및 Tmax 값은 실험적 관찰로부터 직접적으로 기록되었다. AUC0 -n 및 AUCtot 값은 혼합된 로그-선형 사다리꼴 가중법을 사용하여 계산되었다. 전체 체소실율 (C1), 평균 체류시간 (MRT), 및 분포의 정상상태 용적 (Vss)도 또한 정맥내 투여한 후에 계산되었다. 절대적 경구 생체이용율 (%로 표현됨)은 정맥내 투여한 후의 용량-표준화된 AUC 값에 대한 정맥내 투여한 후의 값의 비를 구함으로써 추정되었다.
간세포에서의 Ibb의 시험관내 내인성 청소율 (Clint)은 다음과 같이 계산되었다:
Clint (㎕/분/백만 세포) = 속도 /CE
여기에서 속도는 간세포에서의 대사속도 (pmol/분/백만 세포)이며, CE는 배양시의 Ibb의 농도이다.
Ibb의 생체내 내인성 간청소율 (Clint , in vivo)은 다음과 같이 계산되었다:
Figure 112006074171808-pct00108
여기에서 χ는 랫트, 개, 원숭이 및 인간에 대해서 각각 40, 32, 30 및 26 g 간/체중 ㎏이다 (Davis and Morris, 1993).
간청소율 ClH는 잘-섞여진 모델을 사용하여 다음 수학식으로부터 계산되었다:
Figure 112006074171808-pct00109
여기에서 Qh는 랫트, 개, 원숭이 및 인간에 대해서 각각 55, 31, 44 및 21 ㎖/분/㎏의 간 혈류이다 (Davis and Morris, 1993).
간추출 레이션 (ER)은 다음과 같이 계산되었다:
ER = ClH / Qh
통계학적 분석을 위해서는 스투던츠 t-시험이 사용되었다 (Microsoft™ Excel, Redmond, WA). 차이는 P<0.05의 레벨에서 통계학적으로 유의적인 것으로 생각되었다.
시험관내 시험
EDTA 혈액, 혈청 및 트리스 - HCl 완충액 중에서 Ibb 의 안정성
분석시험 타당성의 일부로서, Ibb의 안정성은 ALP의 억제제인 것으로 알려진 EDTA를 함유하는 혈액에서 시험하였다 (Bowers, Jr. and McComb, 1966; Yora and Sakagishi, 1986). 37℃에서 90분 동안 배양한 후에, EDTA를 함유하는 혈액 중에서 및 트리스-HCl 완충액의 존재 하에서 2% 미만의 Ibb의 IVb로의 전환이 일어났다 (표 30 및 31). 37℃에서 관찰된 상기한 작은 백분율의 전환은 샘플 저장조건 (-20℃) 하에서의 전환은 있을 수 없는 것임을 나타낸다. 따라서, Ibb의 분석 중에는 IVb로의 비교적 최소의 생체외 전환이 예상된다.
랫트, 개 및 원숭이로부터의 신선한 EDTA 혈액 내에서 Ibb의 안정성

시간
(분)		 랫트 혈액 (n=2) 개 혈액 (n=2) 원숭이 혈액 (n=2)
Ibb
(μM)		 형성된 IVb
(μM)		 형성된 IVb %* Ibb
(μM)		 형성된 IVb
(μM)		 형성된 IVb %* Ibb
(μM)		 형성된 IVb
(μM)		 형성된 IVb %*
0 15 0.23 1.6 13 0.089 0.68 16 0.075 0.47
15 15 0.22 1.5 12 0.079 0.60 19 0.12 0.76
30 18 0.26 1.7 15 0.085 0.65 18 0.12 0.80
45 15 0.29 1.9 16 0.095 0.73 18 0.13 0.82
60 16 0.31 2.0 13 0.088 0.67 19 0.14 0.86
90 17 0.32 2.1 16 0.11 0.82 17 0.14 0.89
* Ibb의 출발 농도로서 형성된 백분율
인간으로부터의 신선한 EDTA 혈액 및 트리스-HCl 완충액 내에서 Ibb의 안정성

시간
(분)		 인간 혈액 (n=2) 트리스-HCl 완충액 (n=2)
Ibb
(μM)		 형성된 IVb
(μM)		 형성된 IVb %* Ibb
(μM)		 형성된 IVb
(μM)		 형성된 IVb %*
0 16 0.099 0.62 14 0.30 2.2
15 15 0.093 0.58 12 0.30 2.1
30 16 0.097 0.60 13 0.33 2.3
45 16 0.11 0.67 12 0.41 2.9
60 16 0.10 0.65 13 0.51 3.7
90 18 0.12 0.73 12 0.51 3.6
* Ibb의 출발 농도로서 형성된 백분율
전신적 순환에서 Ibb의 가수분해를 조사하기 위해서, Ibb는 신선한 혈청 (랫트, 개, 원숭이 및 인간) 내에서 90 분 동안, 37℃에서 배양하였다. 가수분해의 속도는 원숭이 혈청에서 가장 빨랐으며, 그 다음에 인간, 개 및 랫트 혈청 순서였다 (표 3). Ibb의 IVb로의 전환은 거의 화학량론적이었다.
혈청은 조직에 비해서 더 낮은 ALP 활성을 함유한다 (MaComb et al., 1979a). 또한, 혈청은 또한 혈관을 통한 효소 누출의 결과로 뼈, 간 및 장과 같은 조직 공급원으로부터의 ALP 이소형태를 함유한다 (Moss, 1983). 따라서, 혈청 내에서의 Ibb의 가수분해는 아마도 ALP의 다수의 이소형태에 의해서 매개될 것이다.
랫트, 개, 원숭이 및 인간으로부터의 신선한 혈청 내에서 Ibb의 안정성

시간
(분)		 랫트 혈청 (n=2) 개 혈청 (n=2) 원숭이 혈청 (n=2) 인간 혈청 (n=2)
Ibb
(μM)		 형성된 IVb
(μM)		 Ibb
(μM)		 형성된 IVb
(μM)		 Ibb
(μM)		 형성된 IVb
(μM)		 Ibb
(μM)		 형성된 IVb
(μM)
0 12 0.095 13 0.13 14 0.34 13 0.14
15 9.4 0.33 12 0.66 6.6 6.5 9.0 0.96
30 9.2 0.60 11 1.2 3.1 8.5 10 2.0
45 9.4 0.92 10 1.7 1.7 10 10 3.1
60 9.3 1.3 10 2.4 0.85 11 8.0 3.6
90 9.0 2.2 8.9 3.6 0.22 13 6.5 5.0
t1 /2(분)* 704** 167** 15 75
* Ibb의 소실로서 계산됨. ** 반감기는 배양기간보다 더 길다.
인간 태반 ALP 의 존재 하에서 Ibb 의 가수분해
인간 ALP의 정제된 형태 중에서 Ibb의 가수분해를 시험하기 위해서는, Ibb를 인간 태반 ALP를 함유하는 용액 (10, 100, 1000 유니트/L)과 함께 37℃ (2 시간)에서 배양하였다. Ibb의 소실 t1 /2를 측정하였다 (표 4). 예상한 바와 같이, 가수분해의 속도는 더 높은 ALP 활성을 갖는 용액에서 더 빨랐다. IVb도 또한 이에 상응하게 형성되었다 (도 14). 이것은 Ibb가 인간으로부터 유도된 ALP에 의해서 가수분해되어 IVb를 형성함을 시사하는 것이다.
인간 태반 ALP 용액 중에서 Ibb의 가수분해
ALP 활성 (유니트/L) (n=2)
10 100 1000
t1 /2 (분) 198 16 2.0
주: Ibb는 37℃에서 10 μM의 출발 농도로 120 분 동안 배양하였다.
생체내 시험
랫트에서의 생체내 시험
Ibb의 IV 및 경구 투여 후에 랫트에서 Ibb 및 IVb의 약력학적 파라메터는 표 34에 요약하였다. 혈장 농도 대비 시간 프로필은 도 15에 나타내었다. 비교를 위해서, 랫트에서 IVb의 약력학적 시험으로부터의 히스토리칼 데이타를 또한 나타낸다.
IV 투여한 후의 Ibb의 전체 체소실율 (C1)은 19 ㎖/분/㎏이었으며, 이것은 Ibb가 랫트에서 저 내지 중등도의 청소율 화합물임을 시사하는 것이다. IV 투여한 후의 제거 반감기 (t1 /2) 및 평균 체류시간 (MRT)은 각각 0.18 시간 및 0.79 시간이었다. Ibb는 2 시간이 지나서는 검출되지 않았다. 정상상태에서 Ibb의 분포 용적 (Vss)은 0.10 L/㎏이었으며, 이것은 매우 제한된 조직분포를 시사하는 것이다. IV 투여한 후에 Ibb로부터의 IVb의 형성은 빨랐으며; IVb는 2 분의 최초 샘플링 시점에서 검출되었다 (데이타는 나타내지 않음). Ibb로부터 형성된 IVb 대비 히스토리칼 IVb 시험으로부터 형성된 IVb의 IV AUC 비는 0.62 (완전한 전환에 대한 이론적 값= 1)였으며, 이것은 IV 투약한 후에 랫트에서 Ibb의 IVb로의 만족스러운 전환을 시사한다.
Ibb는 경구 투여한 후에 혈장 (0.25 및 0.5 시간)에서 검출되었다 (< 10 nM). Ibb를 경구 투여한 후에 IVb의 Tmax는 4.7 시간인 IVb의 히스토리칼 Tmax 보다 더 짧은 0.83 시간이었으며, 이것은 프로드럭의 경구 투여 후의 IVb의 더 빠른 흡수를 시사하는 것이다. 프로드럭으로부터 IVb의 더 빠른 흡수는 Ibb의 더 우수한 수용성뿐만 아니라, 장에서 IVb를 형성시키는 Ibb의 빠른 가수분해의 결과인 것으로 보인다. Ibb로부터의 IVb의 절대적 경구 생체이용율은 60%의 히스토리칼 IVa 값과 유사한 50%였다 (표 34). 또한, Ibb 랫트 경구적 용량 증가시험으로부터의 IVb의 노출은 IVb에 의한 히스토리칼 데이타에 비해서 더 탁월하였다 (표 31 및 도 14).
랫트에서 Ibb의 IV 및 경구 투여 후에 Ibb 및 IVb의 약력학적 파라메터 (평균±SD, n=3)
PK 파라메터 Ibb
(03-002)		 Ibb를 투약한 후에
형성된 IVb		 히스토리칼 IVb
IV
용량 (㎎/㎏) 1.3 유리산, 또는
1.0 IVb 등가물		 1
AUCtot (μMㆍhr) 2.5±1.4 15±5.4 24±3.2
CLtot (㎖/분/㎏) 19±8.9 NA 1.6±0.20
t1 /2 (hr) 0.18±0.050 3.0±1.8 5.9±4.9
MRT (hr) 0.079±0.041 NA 5.6±3.6
Vdss (L/㎏) 0.10±0.093 NA 0.49±0.26
IVb의 IV AUC 비 NA 0.62* NA
PO
용량 (㎎/㎏) 6.6 유리산, 또는
5.2 IVb 등가물		 5
Tmax (hr) 0.25 0.83±0.14 4.7±1.20
Cmax (μM) 0.008±0.003 19±1.8 9.5±2.8
C-24 hr (μM) ND 0.009±0.004 0.16 (n=2)
AUCtot (μMㆍhr) ND 62±3.3 86±33
t1 /2 (hr) ND 2.2±0.11 3.7±0.86
생체이용율 (%) ND 50** 60
PO IVb AUC 비 NA 0.69* NA
NA - 적용할 수 없음; ND - 검출되지 않음 (< 5 nM)
* 비는 IV 및 PO에 대해서 각각, 프로드럭 투약한 후의 IVb AUC/IVb 투약한 후의 IVb AUC로부터 계산되었다.
** IVb의 히스토리칼 IV 데이타로부터 계산됨.
개에서의 생체내 시험
Ibb의 IV 및 경구 투여 후에 개에서 Ibb 및 IVb의 약력학적 파라메터는 표 35에 요약하였다. 혈장 농도 대비 시간 프로필은 도 16에 나타내었다. 비교를 위해서, 개에서 IVb의 약력학적 시험으로부터의 히스토리칼 데이타를 또한 나타낸다.
IV 투여한 후의 Ibb의 C1은 개에서의 31 ㎖/분/㎏의 간 혈류와 유사한 27 ㎖/분/㎏이었으며, 이것은 Ibb가 개에서의 높은 청소율 화합물임을 시사하는 것이다. IV 투여한 후의 t1 /2 및 MRT는 각각 0.83 시간 및 0.21 시간이었다. 말기상에서 Ibb의 혈장 농도는 낮았기 때문에, MRT가 혈장 내에서의 Ibb의 지속시간의 더 현실적인 추정치를 반영하였다 (도 3). Ibb는 4 시간이 지나서는 검출되지 않았다. Ibb의 Vss는 0.35 L/㎏이었으며, 이것은 제한된 조직분포를 시사하는 것이다. IV 투여한 후에 Ibb로부터의 IVb의 형성은 빨랐으며; IVb는 5 분의 최초 샘플링 시점에서 검출되었다 (데이타는 나타내지 않음). Ibb로부터 형성된 IVb 대비 히스토리칼 IVb 시험으로부터 형성된 IVb의 IV AUC 비는 1.6이었으며, 이것은 IV 투여한 후에 개에서의 Ibb의 IVb로의 완전한 전환을 시사한다.
Ibb는 경구 투여한 후에 이른 시점 (한마리의 개에서 2 시간 이하)에 혈장 샘플에서 검출되었다 (Cmax= 0.034 nM). Ibb를 경구 투여한 후에 IVb의 Tmax는 0.50 시간인 IVb의 히스토리칼 Tmax와 유사한 0.40 시간이었다. Ibb로부터의 IVb의 절대적 경구 생체이용율은 179%의 히스토리칼 IVb 데이타와 유사한 310%였다. 또한, Ibb 개 내약성 시험 (용량 증가)으로부터의 IVb의 노출은 IVb에 의한 히스토리칼 데이타와 비교하는 경우에 더 컸다 (표 31 및 도 15).
Ibb로부터 형성된 IVb의 말기 혈장 농도 대비 시간 프로필은 히스토리칼 IVb 프로필과 유사하다 (도 16).
개에서 Ibb의 IV 및 경구 투여 후에 Ibb 및 IVb의 약력학적 파라메터 (평균±SD, n=3)
PK 파라메터 Ibb Ibb를 투약한 후에
형성된 IVb		 히스토리칼 IVb
IV
용량 (㎎/㎏) 1.3 유리산 (03-001), 또는
1.0 IVa 등가물		 1 (n=2)
AUCtot (μMㆍhr) 1.4±0.18 6.2±0.80 3.8
CLtot (㎖/분/㎏) 27±3.2 NA 9.8
t1 /2 (hr) 0.83±0.58 2.0±0.21 1.6
MRT (hr) 0.21±0.043 NA 1.8
Vdss (L/㎏) 0.35±0.091 NA 1.1
IV IVb AUC 비 NA 1.6* NA
PO
용량 (㎎/㎏) 7.0 유리산 (03-002), 또는
5.6 IVa 등가물		 5 (n=3)
Tmax (hr) 0.33±0.14 0.40±0.13 0.50±0.25
Cmax (μM) 0.034±0.018 20±2.4 7.7±0.71
C-24 hr (μM) ND 0.037±0.026 0.034 (n=2)
AUCtot (μMㆍhr) 0.059 (n=1) 66±17 30±11
t1 /2 (hr) NA 2.6±0.21 2.7±0.40
생체이용율 (%) NA 310** 179±56
PO IVb AUC 비 NA 2.2* NA
* 비는 IV 및 PO 각각에 대하여 프로드럭 투약 후의 IVb AUC/IVb 투약 후의 IVb로부터 계산되었다.
* IVb의 히스토리칼 IV 데이타로부터 계산됨.
원숭이에서의 생체내 시험
Ibb의 IV 및 경구 투여 후에 원숭이에서 Ibb 및 IVb의 약력학적 파라메터는 표 36에 요약하였다. 혈장 농도 대비 시간 프로필은 도 17에 나타내었다. 비교를 위해서, 원숭이에서 IVb의 약력학적 시험으로부터의 히스토리칼 데이타를 또한 나타낸다.
IV 투여한 후의 Ibb의 C1은 28 ㎖/분/㎏이었으며, 이것은 Ibb가 원숭이에서 중등도 내지 높은 청소율 화합물임을 시사하는 것이다. IV 투여한 후의 t1/2 및 MRT는 각각 0.10 시간 및 0.093 시간이었다. Ibb의 Vss는 0.15 L/㎏이었으며, 이것은 매우 제한된 조직분포를 시사하는 것이다. IV 투여한 후에 Ibb로부터의 IVb의 형성은 빨랐으며; IVb는 5 분의 최초 샘플링 시점에서 검출되었다 (데이타는 나타내지 않음). Ibb로부터 형성된 IVb 대비 히스토리칼 IVb 시험으로부터 형성된 IVb의 IV AUC 비는 1.7이었으며, 이것은 IV 투약한 후에 원숭이에서 Ibb의 IVb로의 완전한 전환을 시사한다.
Ibb는 경구 투여한 후에 어떤 혈장 샘플에서도 검출되지 않았다 (LLQ= 5 nM). Ibb를 경구 투여한 후에 IVb의 Tmax는 2.5 시간인 IVb의 히스토리칼 Tmax와 유사한 1.5 시간이었다. Ibb로부터의 IVb의 절대적 경구 생체이용율은 187%로 49%의 히스토리칼 IVb 데이타보다 더 컸다 (표 36).
Ibb로부터 형성된 IVb의 말기 혈장 농도 대비 시간 프로필은 히스토리칼 IVb 프로필과 유사하다 (도 17).
원숭이에서 Ibb의 IV 및 경구 투여 후에 Ibb 및 IVb의 약력학적 파라메터 (평균±SD, n=3)
PK 파라메터 Ibb Ibb를 투약한 후에
형성된 IVb		 히스토리칼 IVb
IV
용량 (㎎/㎏) 1.3 유리산, 또는
1.1 IVb 등가물		 1 (n=3)
AUCtot (μMㆍhr) 1.5±0.40 19±1.8 10±1.2
CLtot (㎖/분/㎏) 28±6.8 NA 3.7±0.43
t1 /2 (hr) 0.10±0.042 6.5±2.4 19±20
MRT (hr) 0.093±0.00076 NA 5.6±6.3
Vdss (L/㎏) 0.15±0.039 NA 1.2±1.4
IVb의 IV AUC 비 NA 1.7* NA
PO
용량 (㎎/㎏) 5.8 유리산, 또는
4.7 IVb 등가물		 5 (n=2)
Tmax (hr) NA 1.5±0.87 2.5
Cmax (μM) ND 31±11 4.2
C-24 hr (μM) ND 0.11±0.075 0.24
AUCtot (μMㆍhr) ND 88±4.6 24
t1 /2 (hr) NA 4.1±1.1 11
생체이용율 (%) NA 187** 49
IVb의 PO AUC 비 NA 3.4* NA
* 비는 IV 및 PO 각각에 대하여 프로드럭 투약 후의 IVb AUC/IVb 투약 후의 IVb AUC로부터 계산되었다.
* IVb의 히스토리칼 IV 데이타로부터 계산됨.
추가의 프로파일링 항목 3
프로드럭 Icb 를 사용한 추가의 시험:
CD 랫트에서 단일-용량 독력학적 내약성
랫트에서의 1-일 경구 독력학적 시험은 프로드럭 Icb (디나트륨 염)를 사용하여 수행되었다. Icb는 5, 25 및 200 ㎎/㎏ (유리산)의 투약량으로 경구 가바즈에 의해서 비히클로 물을 사용하여 (용액 제제) 군당, 3 마리의 수컷 랫트에게 투여하였다. 프로드럭 유리산의 투약량은 각각 4.5, 21 및 163 ㎎/㎏의 IVc (모화합물) 몰 동가의 투약량에 상응한다. 평가된 종말점은 개개 랫트에서 Icb 및 IVc의 혈장 독력학이었다.
평균 독력학적 값은 표 37에 제시되어 있다.
단일 경구용량으로 ≤200 ㎎/㎏의 Icb를 투여한 수컷 랫트에서 Icb 및 IVc에 대한 평균 독력학적 값
투약량 (㎎/㎏)
Icb 5
IVc 몰당량 4.5		 25
21		 200
163
IVc IVc IVc
Cmax (μM) 29 98 281
C24 (μM) 0.029 0.35 58
AUC (μMㆍh) 1091 5861 29252
T1/2 (h) 3.2 2.3 3.4
값들은 Icb 데이타에 대해서는 3 랫트/군, IVc 데이타에 대해서는 3 랫트/군으로부터의 평균을 나타낸다.
1 0부터 ∞까지의 AUC
2 0부터 24 시간까지의 AUC
IVc (모화합물)의 평균 최대 혈장농도 (Cmax)는 투약-후 약 1.7 시간 이내에 달성되었다. ≤267 ㎎/㎏의 Icb를 투여한 랫트에서 IVc의 AUC에서의 증가는 Icb 투약량과 거의 비례하였으며, Cmax는 25 및 200 ㎎/㎏의 Icb 사이에서 덜 용량-비례적인 방식으로 증가하였다. Icb는 ≤25 ㎎/㎏의 Icb를 투여한 랫트의 혈장에서 검출되지 않았지만, 200 ㎎/㎏의 Icb를 투여한 랫트의 혈장에서는 몇개의 시점에서 매우 낮은 농도 (약 0.02-0.04 μM)에서 검출되었다.
IVc (1) 또는 Icb를 투여한 랫트에서 수득된 IVc AUC의 비교는 도 18에 나타내었다.
IVc의 AUC는 저용량 (예를 들어, ≤25 ㎎/㎏)에서는 모화합물이나 프로드럭의 투여 후에 유사하며, 이는 둘 다가 용액 (모화합물에 대해서는 PEG-400/에탄올/0.1 N NaOH이고, 프로드럭에 대해서는 물)으로 제제화되지만, 고용량 (예를 들어, 200 ㎎/㎏)에소는 중성 모화합물은 단지 현탁액으로 제제화될 수 있는 반면에 프로드럭 염은 IVc의 탁월한 노출을 제공하는 수용액으로 제조될 수 있기 때문이다.
개에서 단일-용량 독력학 및 내약성 시험
25, 92 또는 250 ㎎/㎏의 투약량의 프로드럭 Icb (모노트로메타민 염) (유리산, 각각 모 IVc의 20, 75 또는 203 ㎎/㎏와 동등한 몰량)의 내약성, 및 Icb 및 IVc의 독력학을 평가하기 위해서 2-상 시험을 수행하였다 (1). 1 일에, Icb는 1 마리의 개/성별/군에게 상기 투약량으로 매일 한번씩 건식-충진된 캅셀제로 투여되었다. 시험에서 투약 사이에는 1-주일의 세척기간을 사용하였다. 8 일째에 Icb는 1 마리의 개/성별/군에게 25 ㎎/㎏의 수용액으로 매일 한번씩, 또는 46 또는 125 ㎎/㎏ BID의 건식-충진된 캅셀제로 매일 2 회씩 투여되었다. 종말점은 다음과 같았다: 임상적 징후, 체중, 식품 소비, 혈청 화학, 혈액학, 및 Ibb 및 IVb의 혈장 독력학.
각각의 개로부터의 혈장 독력학 값은 표 38에 나타내었다.
≤250 ㎎/㎏의 Icb를 투여한 개에서 IVc에 대한 독력학적 값
투약량 (㎎/㎏)
Icb 251
IVc 몰등가물 20		 922
75		 2503
203
동물 2101M 2201F 3101M 3201F 4101M 4201F
Cmax (μM)
1 일 65.1 24.6
8 일 59.4 46.8
1174 157
121 104
92.64 88.94
2665 96.94
C24h (μM)
1 일 0.008 0.688
8 일 0.547 0.107
1.90 0.202
10.6 0.307
2.61 0.704
54.2 1.96
AUC0 -∞ (μMㆍh)
1 일 365 122
8 일 362 173
8204 730
1137 490
7394 5234
37835 5964,5
T1/2 (h)
1 일 1.5 4.5
8 일 3.3 3.4
3.6 2.3
5.2 2.4
4.1 3.2
8.0 3.3
1 1 일에는 건식-충진된 캅셀로서 제제화되고, 8 일에는 수용액으로 제제화된다 (양일에 모두 QD 투약).
2 1 일에는 92 ㎎/㎏ QD, 8 일에는 46 ㎎/㎏ BID; 양일에 모두 건식-충진된 캅셀제로 제제화됨.
3 1 일에는 250 ㎎/㎏ QD, 8 일에는 125 ㎎/㎏ BID; 양일에 모두 건식-충진된 캅셀제로 제제화됨.
4 구토가 투약한 지 2 시간 이내에 관찰되며, 캅셀 잔류물이 존재함.
5 구토가 투약한 지 2 시간 이내에 관찰되나, 캅셀 잔류물은 없음.
낮은 레벨 (≤0.1 μM)의 Icb는 1 및 8 일에 일부의 혈장 샘플에서 검출되었다. IVc의 평균 최대 혈장농도 (Cmax)는 QD 투약의 경우에는 투여-후 1-2 시간 사이에 달성되었으며, BID 투약의 경우에는 이차 투여-후 1-2 시간에 달성되었다. 25 ㎎/㎏ QD에서는 Icb가 건식-충진된 캅셀제로 또는 수용액으로 투여된 경우에 IVc의 동등한 Cmax 및 AUC가 관찰되었다. 1 일에 ≥92 ㎎/㎏ QD를 투여한 모든 개 (3101M, 4101M 및 4201F)에게서 투약한 지 약 1-1.25 시간 후에 구토 (흰색이거나 갈색이며, 캅셀 잔류물을 함유하는 붉은 색의 줄무늬가 있음)가 관찰되었으며, 이것은 92 및 250 ㎎/㎏ 사이에서의 단조로운 노출에 기인하는 것으로 보인다. 8 일에는 125 ㎎/㎏ BID로 투여한 개 둘 다에게서 투약한 지 2 시간 이내에 상이한 결과를 가지면서 구토가 관찰되었다. 동물 4101M은 구토에도 불구하고 구토물 내의 캅셀 잔류물의 부재와 일치하는 실질적인 노출을 가졌다.
1 및 8 일에 일부의 혈장 샘플에서는 단지 낮은 레벨 (≤0.1 μM)의 Icb 만이 검출되었다.
구토 이외의 임상적 징후는 관찰되지 않았으며, 체중 및 식품 섭취에 대한 영향도 없었다.
개에게서 관찰된 구토에도 불구하고, IVc를 투여한 개에서 보다는 Icb를 투여한 개에게서 더 큰 IVc AUC가 관찰된다. Icb 또는 IVc (3,4)를 투여한 개에서 수득된 IVc AUC의 비교는 도 19에 나타내었다.
비히클 및 제제
키 PK 및 안전성 시험을 위해서 사용된 제제의 요약
랫트, 개 및 원숭이에게서의 모든 생체내 PK 시험은 PO 및 IV 투약을 위한 수용액을 사용하여 수행되었다. 개에게서 전-ECN 독물학 시험은 20 ㎎/㎏IVc 등가물 용량으로 제조된 수용액, 및 20, 75 및 203 ㎎/㎏의 IVc 등가물의 용량의 캅셀 제제 중의 약물을 사용하여 수행되었다.
랫트 경구 용량 증가시험에서, Icb-03은 4.5, 21 및 163 ㎎/㎏의 IVc 등가물의 용량으로 수용액으로 투약되었다. IVc 경구 투여 후의 히스토리칼 데이타에 비해서, Icb 프로드럭을 경구 투약한 후에 IVc 모화합물의 AUC 및 Cmax의 상당한 개선이 관찰되었다.
대사 및 약력학 요약
결과의 요약 및 해석
Icb는 IVc의 N-하이드록시메틸 부가물의 포스페이트 프로드럭이며, 알칼리성 포스파타제 (ALP)에 의해서 가수분해되어 IVc를 형성한다. 따라서, Icb를 동물에게 투여한 후에 혈장 샘플은 공지의 ALP 억제제인 EDTA의 존재 하에서 수거된 혈액으로부터 제조되었다. Icb의 IVc로의 전환은 EDTA를 함유하는 혈액 (랫트, 개, 원숭이 및 인간)에서 최소 (<2%)였다. 샘플 저장 (-20℃) 및 Icb의 분석 중에 Icb의 유의적인 생체외 전환은 예상되지 않는다.
Icb의 가수분해는 동물 및 인체 시험관내 시험에서 시험하였다. 다수의 ALP 이소형태는 다양한 조직 내에 광범하게 분포되어 있기 때문에, 정량적인 시험관내에 대한 생체내의 상관관계는 시도되지 않았다 (Fishman et al., 1968; Komoda et al., 1981; Moss 1983; Yora and Sakagishi, 1986; Sumikawa et al., 1990). 따라서, 시험은 다양한 조직에서의 ALP-의존성 가수분해의 정성적 평가로 제한되었다. Icb는 혈청 (랫트, 개, 원숭이 및 인간), 간세포 (랫트, 개 및 인간), 및 인간 태반 ALP의 존재 하에서 가수분해되었다. Icb의 IVc로의 전환은 거의 화학량론적이었다. 혈청 내에서의 가수분해로 인하여, Icb의 단백질 결합은 측정될 수 없었다.
IVc는 랫트, 개 및 원숭이에게서 Icb의 IV 투여 후에 빠르게 형성되었다. IV AUC 전환비는 랫트에서는 1.0, 개에서는 0.67 및 원숭이에서는 0.90이었으며, 이것은 Icb로부터 IVc로의 우수한 전환을 시사하는 것이다.
IVc의 우수한 경구적 생체이용율 (80-122%)은 랫트, 개 및 원숭이에게서 Icb를 투여한 후에 관찰되었다. 더욱 유의적으로, Icb의 더 큰 수용성은 특정한 용량 이하에서 IVc의 용해-속도 제한된 흡수를 감소시켰으며, 이에 의해 히스토리칼 IVc 시험으로부터의 노출에 비해서 경구적 용량 증가 및 독력학적 시험에서 IVc의 노출을 증가시켰다.
방법
여기에 기술된 시험은 다른 식으로 언급되지 않는 한은 Icb의 모노트로메타민 염을 사용하였다.
LC / MS / MS 에 의한 Icb 및 IVc 의 정량화
LC/MS/MS 방법은 동물 약력학적 시험으로부터의 혈장 샘플 내에서 및 시험관내 배양시험으로부터의 아세토니트릴 상등액 내에서 Icb 및 IVc를 분석하기 위해서 개발되었다. 혈장 내에서의 분석을 위해서는 패카드 멀티프로브 장치를 사용하여 표준품, QC 및 혈장 샘플 각각의 50 ㎕씩을 단백질 침전 추출을 위해서 깨끗한 96-웰 플레이트에 옮겼다. 내부 표준물인 이하의 화합물 X를 함유하는 200 ㎕의 아세토니트릴을 첨가한 후에, 샘플을 소용돌이시켜 혼합시키고, 생성된 상등액을 10 분 동안 원심분리시킴으로써 침전된 단백질로부터 분리시켰다. 시험관내 시험으로부터 생성된 상등액에서의 분석을 위해서는, 동등한 용적의 상등액 및 내부 표준물을 함유하는 아세토니트릴을 혼합시켰다. 상기 상등액의 분취액을 톰테크 자동화 액체 핸들러를 사용하여 두번째의 깨끗한 96-웰 플레이트에 옮겼다. 동등한 용적의 물을 첨가하고, 플레이트를 마개를 하고 소용돌이를 일으켜 혼합시켰다.
화합물 X
Figure 112006074171808-pct00110
4-메톡시-3-(2-옥소-2-(4-퀴나졸린-4-일)피페라진-1-일)아세틸)-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-7-카복스아미드
HPLC 시스템은 페노메넥스 시너지 퓨존-RP 분석용 칼럼 (2.0×50 ㎜, 5 μ; Torrance, CA)에 연결된 시마주 LC10ADvp 펌프 (Columbia, MD) 및 HTC PAL 오토샘플러 (Leap Technologies, Cary, NC)로 구성되었다. 이동상 A는 물 중의 5 mM 암모늄 포르메이트로 구성되었으며; 이동상 B는 100% 아세토니트릴이다. LC 유속은 0.4 ㎖/분이었다. 초기 이동상 조성물은 3% B였으며, 1.75 분에 걸쳐서 60% B로 증가되었으며, 0.5 분 동안 유지시키고, 0.1 분에 걸쳐서 100% B로 증가시키고, 0.5 분 동안 유지시키고, 다음 0.1 분에 걸쳐서 초기 상태로 복귀시킨 다음에, 재-평형화시켰다. 총분석시간은 4.0 분이었다. Icb, IVc 및 화합물 X에 대한 체류시간은 각각 1.2, 1.7 및 1.6 분이었다.
HPLC 시스템은 550℃로 설정된 터보이온스프레이 공급원 및 4.5 kV로 설정된 이온스프레이 전압이 장치된 시엑스 API4000 삼중 사극자 질량분광계 (Toronto, Canada)에 연결시켰다. UHP 질소가 분무화 및 보조 가스로서 각각 80 psi 및 7 L/분의 압력으로 사용되었다. Icb, IVc 및 화합물 X에 대한 충돌 에너지는 각각 23, 29 및 37 볼트였다. 데이타 획득은 선택된 반응 모니터링 (SRM)을 이용하였다. Icb, IVc 및 내부 표준물을 위한 양이온 모드 (M+H)+ 종을 나타내는 이온은 MS1에서 선택되었으며, 질소 및 최적화된 충돌 에너지에 의해서 충돌적으로 해리시켜 특정한 생성물 이온을 형성시키고, 이어서 이것을 MS2에 의해서 모니터하였다. Icb, IVc 및 화합물 X에 대한 SRM 전이는 각각 m/z 584 → 486, 474 → 256 및 460 →218이었다.
5 nM 내지 10 μM 범위의 표준곡선은 Icb 및 IVc 둘 다에 대해 저장용액으로부터 매트릭스 내에서 계열희석하여 제조되었다. 표준곡선은 이중으로 분취하여, 샘플로 추출하고, 분석절차의 초기, 중기 및 말기에 주입하였다. 분석곡선은 역수 농도 1/x2에 의해서 가중된 선형회귀에 적합하였다. 데이타 및 크로마토그라피 피크를 처리하고, 표준물 및 미지물질의 농도는 피이바이오시스템 아날리스트 1.1을 사용하여 정량화되었다.
시험관내 방법
(1) EDTA 혈액, 혈청 및 트리스 - HCl 완충액 중에서 Icb 의 안정성
Icb의 안정성은 랫트, 개, 원숭이 및 인간 (n=2)으로부터의 신선한 혈액 및 혈청에서 시험하였다. 혈액을 K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 함유하는 배큐테이너 내에 수거하였다. 혈청을 항응고제를 함유하지 않는 배큐테이너 내에 수거하였다. Icb를 약 10 μM의 출발농도로 37℃에서 90 분 동안 배양하였다. 일련의 샘플을 예정된 시간에 취하였다. 혈액 샘플의 분취물 (200 ㎕)을 우선 100 ㎕의 물과 혼합시키고, 이어서 400 ㎕의 아세토니트릴과 혼합시켰다. 혈청 샘플 (50 ㎕)을 K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 함유하는 마이크로테이너 내에 첨가하고, 이어서 100 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하였다. 상등액을 LC/MS/MS에 의해서 Icb 및 IVc 둘 다에 대해서 분석하였다.
Icb의 안정성은 또한, 트리스-HCl 완충액 (0.1 M, pH 7.5) 내에서 상술한 바와 같이 평가되었다.
(2) 인간 태반 ALP 의 존재 하에서 Icb 의 가수분해
고체 인간 태반 ALP를 시그마 (Sigma, P-3895, St. Louis, MO)로부터 수득하였다. 1000 유니트/L의 용액을 트리스-HCl 완충액 (0.1 M, pH 7.5) 중에서 제조하였다. 100 및 10 유니트/L의 용액은 계열 희석함으로써 수득되었다. Icb를 10, 100 및 1000 유니트/L 용액 (n=2) 중에서 37℃로 2 시간 동안 배양하였다. 배양시에 Icb의 출발농도는 10 μM이었다. 100 ㎕ 샘플의 분취물을 예정된 시간에 취하고, K2EDTA 마이크로테이너 내에 첨가하고, 이어서 200 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하였다. 상등액을 LC/MS/MS에 의해서 Icb 및 IVc 둘 다에 대해서 분석하였다.
(1) 랫트에서의 생체내 시험
경정맥에 카눌라를 이식한 수컷 스프라그-도울리 랫트 (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottsdale, PA)가 사용되었다. 랫트를 PO 약력학적 시험에서는 밤새 단식시켰다. 혈액 샘플은 경정맥으로부터 수거되었다.
IV 시험에서, Icb는 볼루스로 0.5 분에 걸쳐서 1.4 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVc 등가물로서 1.1 ㎎/㎏)으로 송달하였다 (n=3). 투약용액의 농도는 1.4 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 1 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 2, 10, 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 수거하였다.
PO 시험에서, Icb는 경구 가바즈에 의해서 6.9 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVa 등가물로서 5.6 ㎎/㎏)으로 투여하였다 (n=3). 투약용액의 농도는 1.4 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 5 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 수거하였다.
(2) 개에서의 생체내 시험
Icb의 IV 및 PO 시험은 3 마리의 수컷 비글 개 (12±2.8 ㎏, Marshall Farms USA Inc., North Rose, NY)에게서 크로스오버 방식으로 수행되었다. IV 및 PO 시험 사이에는 2-주일 세척기간을 두었다.
IV 시험에서, Icb는 0.1 ㎖/㎏/분의 일정속도로 5 분에 걸쳐서 1.3 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVc 등가물로서 1.0 ㎎/㎏)으로 요측피정맥을 통해서 주입하였다. 투약용액의 농도는 2.6 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 0.5 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 5, 10, 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 대퇴동맥으로부터 수거하였다.
PO 시험에서, 개는 투약하기 전에 밤새 단식시켰다. Icb는 경구 가바즈에 의해서 6.0 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVb 등가물로서 4.9 ㎎/㎏)로 투여하였다. 투약용액의 농도는 12 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 0.5 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 수거하였다.
(3) 원숭이에서의 생체내 시험
Icb의 IV 및 PO 시험은 3 마리의 수컷 사이노몰구스 원숭이 (10±1.6 ㎏, Charles River Biochemical Research Foundation, Houston, TX)에게서 크로스오버 방식으로 수행되었다. IV 및 PO 시험 사이에는 2-주일 세척기간을 두었다.
IV 시험에서, Icb는 0.1 ㎖/㎏/분의 일정속도로 5 분에 걸쳐서 1.4 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVc 등가물로서 1.1 ㎎/㎏)으로 대퇴정맥을 통해서 주입하였다. 투약용액의 농도는 2.8 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 0.5 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 5, 10, 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 대퇴동맥으로부터 수거하였다.
PO 시험에서, 원숭이는 투약하기 전에 밤새 단식시켰다. Icb는 경구 가바즈에 의해서 4.9 ㎎/㎏ (유리산, 또는 IVc 등가물로서 4.0 ㎎/㎏)로 투여하였다. 투약용액의 농도는 9.8 ㎎/㎖였으며, 투약 용적은 0.5 ㎖/㎏이었다. 계열 혈액 샘플은 투약하기 전, 및 투약한 지 15, 30, 45 분, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 수거하였다.
(4) 데이타 분석
모든 결과는 다른 식으로 규정되지 않는 한은 평균±SD로 표현된다.
Icb 및 IVc의 약력학적 파라메터는 키네티가 소프트웨어 프로그램 (버젼 4.0.2, InnaPhase Co., Philadelphia, PA)을 사용하여 비-구획화 분석에 의해서 계산되었다. Cmax 및 Tmax 값은 실험적 관찰로부터 직접적으로 기록되었다. AUC0 -n 및 AUCtot 값은 혼합된 로그-선형 사다리꼴 가중법을 사용하여 계산되었다. 전체 체소실율 (C1), 평균 체류시간 (MRT), 및 분포의 정상상태 용적 (Vss)도 또한 정맥내 투여한 후에 계산되었다. 절대적 경구 생체이용율 (%로 표현됨)은 정맥내 투여한 후의 용량-표준화된 AUC 값에 대한 정맥내 투여한 후의 값의 비를 구함으로써 추정되었다.
간세포에서의 Icb의 시험관내 내인성 청소율 (Clint)은 다음과 같이 계산되었다:
Clint (㎕/분/백만 세포) = 속도 /CE
여기에서 속도는 간세포에서의 대사속도 (pmol/분/백만 세포)이며, CE는 배양시의 Icb의 농도이다.
Icb의 생체내 내인성 간청소율 (Clint , in vivo)은 다음과 같이 계산되었다:
Figure 112006074171808-pct00111
여기에서 χ는 랫트, 개, 원숭이 및 인간에 대해서 각각 40, 32, 30 및 26 g 간/체중 ㎏이다 (Davis and Morris, 1993).
간청소율 ClH는 잘-섞여진 모델을 사용하여 다음 수학식으로부터 계산되었다:
Figure 112006074171808-pct00112
여기에서 Qh는 랫트, 개, 원숭이 및 인간에 대해서 각각 55, 31, 44 및 21 ㎖/분/㎏의 간 혈류이다 (Davis and Morris, 1993).
간추출 레이션 (ER)은 다음과 같이 계산되었다:
ER = ClH / Qh
통계학적 분석을 위해서는 스투던츠 t-시험이 사용되었다 (Microsoft™ Excel, Redmond, WA). 차이는 P<0.05의 레벨에서 통계학적으로 유의적인 것으로 생각되었다.
시험관내 시험
EDTA 혈액, 혈청 및 트리스 - HCl 완충액 중에서 Ibb 의 안정성
분석시험 타당성의 일부로서, Icb의 안정성은 알칼리성 포스파타제의 억제제인 것으로 알려진 EDTA를 함유하는 혈액에서 시험하였다 (Bowers, Jr. and McComb, 1966; Yora and Sakagishi, 1986). 37℃에서 90분 동안 배양한 후에, EDTA를 함유하는 혈액 중에서 및 트리스-HCl 완충액의 존재 하에서 2% 미만의 Icb의 IVc로의 전환이 일어났다 (표 39 및 40). -20℃의 샘플 저장조건 하에서는, 37℃에서 관찰된 상기한 작은 백분율의 전환이 Icb의 분석 중에 유의적인 생체외 전환을 유도하는 것으로 예상되지 않는다.
랫트, 개 및 원숭이로부터의 신선한 EDTA 혈액 내에서 Icb의 안정성

시간
(분)		 랫트 혈액 (n=2) 개 혈액 (n=2) 원숭이 혈액 (n=2)
Icb
(μM)		 형성된 IVc
(μM)		 형성된 IVc %* Icb
(μM)		 형성된 IVc
(μM)		 형성된 IVc %* Icb
(μM)		 형성된 IVc
(μM)		 형성된 IVc %*
0 12 0.21 1.7 10 0.087 0.72 12 0.26 2.2
15 11 0.26 2.2 10 0.087 0.72 12 0.17 1.4
30 15 0.37 3.1 9.4 0.087 0.72 11 0.16 1.4
45 14 0,38 3.2 11 0.10 0.86 12 0.19 1.6
60 14 0.41 3.4 11 0.10 0.84 11 0.19 1.6
90 12 0.39 3.3 11 0.11 0.91 11 0.19 1.5
* Icb의 출발 농도로서 형성된 백분율
인간으로부터의 신선한 EDTA 혈액 및 트리스-HCl 완충액 내에서 Icb의 안정성

시간
(분)		 인간 혈액 (n=2) 트리스-HCl 완충액 (n=2)
Icb
(μM)		 형성된 IVc
(μM)		 형성된 IVc %* Icb
(μM)		 형성된 IVc
(μM)		 형성된 IVc %*
0 11 0.083 0.69 11 0.17 1.5
15 11 0.088 0.74 11 0.18 1.5
30 13 0.091 0.76 11 0.23 1.9
45 12 0.10 0.80 11 0.24 2.0
60 11 0.092 0.76 10 0.26 2.2
90 11 0.091 0.76 11 0.30 2.5
* Icb의 출발 농도로서 형성된 백분율
전신적 순환에서 Icb의 가수분해를 조사하기 위해서, Icb는 신선한 혈청 (랫트, 개, 원숭이 및 인간) 내에서 90 분 동안, 37℃에서 배양하였다. 가수분해의 속도는 원숭이 혈청에서 가장 빨랐으며, 그 다음에 랫트, 인간 및 개 혈청 순서였다 (표 41). Icb의 IVc로의 전환은 거의 화학량론적이었다.
혈청은 조직에 비해서 더 낮은 ALP 활성을 함유한다 (MaComb et al., 1979a). 또한, 혈청은 또한 혈관을 통한 효소 누출의 결과로 뼈, 간 및 장과 같은 조직 공급원으로부터의 ALP 이소형태를 함유한다 (Moss, 1983). 따라서, 혈청 내에서의 Icb의 가수분해는 아마도 ALP의 다수의 이소형태에 의해서 매개되었다.
랫트, 개, 원숭이 및 인간으로부터의 신선한 혈청 내에서 Icb의 안정성

시간
(분)		 랫트 혈청 (n=2) 개 혈청 (n=2) 원숭이 혈청 (n=2) 인간 혈청 (n=2)
Icb
(μM)		 형성된 IVc
(μM)		 Icb
(μM)		 형성된 IVc
(μM)		 Icb
(μM)		 형성된 IVc
(μM)		 Icb
(μM)		 형성된 IVc
(μM)
0 7.6 0.23 10 0.046 9.3 0.15 10 0.087
15 6.5 1.4 9.7 0.52 7.1 2.4 8.8 1.2
30 4.9 3.4 9.1 1.5 4.5 4.8 7.7 2.7
45 4.4 5.6 8.5 2.3 3.3 7.2 6.6 3.9
60 3.4 7.1 8.1 3.0 2.3 8.4 5.9 4.6
90 2.1 8.7 6.9 4.0 1.1 9.6 4.7 6.1
t1 /2(분)* 42 156** 30 89
* Icb의 소실로서 계산됨. ** 반감기는 배양기간보다 더 길다.
인간 태반 ALP 의 존재 하에서 Icb 의 가수분해
인간 ALP의 정제된 형태 중에서 Icb의 가수분해를 시험하기 위해서는, Icb를 인간 태반 ALP를 함유하는 용액 (10, 100, 1000 유니트/L)과 함께 37℃ (2 시간)에서 배양하였다. Icb의 소실 t1 /2를 측정하였다 (표 42). 예상한 바와 같이, 가수분해의 속도는 더 높은 ALP 활성을 갖는 용액에서 더 빨랐다. IVc도 또한 이에 상응하게 형성되었다 (도 20). 이것은 Icb가 인간으로부터 유도된 ALP에 의해서 가수분해되어 IVc를 형성함을 시사하는 것이다.
인간 태반 ALP 용액 중에서 Icb의 가수분해
ALP 활성 (유니트/L) (n=2)
10 100 1000
t1 /2 (분) 250 29 2.4
주: Icb는 37℃에서 10 μM의 출발 농도로 120 분 동안 배양하였다.
생체내 시험
랫트에서의 생체내 시험
Icb의 IV 및 경구 투여 후에 랫트에서 Icb 및 IVc의 약력학적 파라메터는 표 43에 요약하였다. 혈장 농도 대비 시간 프로필은 도 21에 나타내었다. 비교를 위해서, 랫트에서 IVc의 약력학적 시험으로부터의 히스토리칼 데이타를 또한 나타낸다.
IV 투여한 후의 Icb의 전체 체소실율 (C1)은 49 ㎖/분/㎏이었으며, 이것은 Icb가 랫트에서 고청소율 화합물임을 시사하는 것이다. IV 투여한 후의 제거 반감기 (t1 /2) 및 평균 체류시간 (MRT)은 각각 0.084 시간 및 0.072 시간이었다. 정상상태에서 Icb의 분포 용적 (Vss)은 0.21 L/㎏이었으며, 이것은 매우 제한된 조직분포를 시사하는 것이다. IV 투여한 후에 Icb로부터의 IVc의 형성은 빨랐으며; IVc는 2 분의 최초 샘플링 시점에서 검출되었다 (데이타는 나타내지 않음). Icb로부터 형성된 IVc 대비 히스토리칼 IVc 시험으로부터 형성된 IVc의 IV AUC 비는 1.0 (완전한 전환에 대한 이론적 값= 1)이었으며, 이것은 Icb의 IVc로의 완전한 전환을 시사한다.
Icb는 경구 투여한 후에 어떤 혈장 샘플에서도 검출되지 않았다 (LLQ= 5 nM). Icb를 경구 투여한 후에 IVc의 Tmax는 4.0 시간인 IVc의 히스토리칼 Tmax 보다 더 짧은 0.80 시간이었으며, 이것은 프로드럭의 경구 투여 후의 IVc의 더 빠른 흡수를 시사하는 것이다. 프로드럭으로부터 IVc의 더 빠른 흡수는 Icb의 더 우수한 수용성뿐만 아니라, 장에서 IVc를 형성시키는 Icb의 빠른 가수분해의 결과인 것으로 보인다. Icb로부터의 IVc의 절대적 경구 생체이용율은 82%의 히스토리칼 IVc 값과 유사한 80%였다 (표 43). 또한, Icb 랫트 경구적 용량 증가시험으로부터의 IVc의 노출은 IVc에 의한 히스토리칼 데이타에 비해서 더 탁월하였다 (표 37 및 도 18).
Icb로부터 형성된 IVc의 말기 혈장농도 대비 시간 프로필은 히스토리칼 IVc 프로필과 유사하다 (도 21).
랫트에서 Icb의 IV 및 경구 투여 후에 Icb 및 IVc의 약력학적 파라메터 (평균±SD, n=3)
PK 파라메터 Icb
(03-002)		 Icb를 투약한 후에
형성된 IVc		 히스토리칼 IVc
IV
용량 (㎎/㎏) 1.4 유리산, 또는
1.1 IVc 등가물		 1
AUCtot (μMㆍhr) 0.84±0.24 30±4.1 27±4.0
CLtot (㎖/분/㎏) 49±12 NA 1.3±0.19
t1 /2 (hr) 0.084±0.012 2.9±0.14 4.3±1.1
MRT (hr) 0.072±0.008 NA 4.5±0.77
Vdss (L/㎏) 0.21±0.033 NA 0.36±0.098
IVa의 IV AUC 비 NA 1.0* NA
PO
용량 (㎎/㎏) 6.9 유리산, 또는
5.6 IVc 등가물		 5
Tmax (hr) ND 0.80±0.30 4.0
Cmax (μM) ND 23±0.60 13±3.6
C-24 hr (μM) ND 0.14±0.063 0.19±0.048
AUCtot (μMㆍhr) ND 122±17 111±25
t1 /2 (hr) ND 3.1±0.42 3.0±0.28
생체이용율 (%) ND 80** 82
IVa의 PO AUC 비 NA 0.98* NA
NA - 적용할 수 없음; ND - 검출되지 않음 (< 5 nM)
* 비는 IV 및 PO에 대해서 각각, 프로드럭 투약한 후의 IVc AUC/IVc 투약한 후의 IVc AUC로부터 계산되었다.
** IVc의 히스토리칼 IV 데이타로부터 계산됨.
개에서의 생체내 시험
Icb의 IV 및 경구 투여 후에 개에서 Icb 및 IVc의 약력학적 파라메터는 표 44에 요약하였다. 혈장 농도 대비 시간 프로필은 도 22에 나타내었다. 비교를 위해서, 개에서 IVc의 약력학적 시험으로부터의 히스토리칼 데이타를 또한 나타낸다.
IV 투여한 후의 Icb의 C1은 개에서의 31 ㎖/분/㎏의 간 혈류보다 유의적으로 더 큰 64 ㎖/분/㎏이었으며, 이것은 간외 가수분해 및/또는 제거의 다른 경로(들) (예를 들어, 신성 배설)의 연관성을 시사하는 것이다. IV 투여한 후의 t1 /2 및 MRT는 각각 0.25 시간 및 0.14 시간이었다. Icb는 2 시간이 지나서는 검출되지 않았다. Icb의 Vss는 0.50 L/㎏이었으며, 이것은 조직분포의 낮은 가능성을 시사하는 것이다. IV 투여한 후에 Icb로부터의 IVc의 형성은 빨랐으며; IVc는 5 분의 최초 샘플링 시점에서 검출되었다 (데이타는 나타내지 않음). Icb로부터 형성된 IVc 대비 히스토리칼 IVc 시험으로부터 형성된 IVc의 IV AUC 비는 0.67이었으며, 이것은 IV 투여한 후에 개에서의 Icb의 IVc로의 중등도의 전환을 시사한다.
Icb는 경구 투여한 후에 어떤 혈장 샘플에서도 검출되지 않았다 (LLQ= 5 nM). Icb를 경구 투여한 후에 IVc의 Tmax는 1.3 시간인 IVc의 히스토리칼 Tmax보다 짧은 0.58 시간이었으며, 이것은 프로드럭의 경구 투여 후에 IVc의 더 빠른 흡수를 나타내는 것이다. Icb로부터의 IVc의 절대적 경구 생체이용율은 89%의 히스토리칼 IVc 데이타와 유사한 104%였다. 또한, Icb 개 내약성 시험 (용량 증가)으로부터의 IVc의 노출은 IVc에 의한 히스토리칼 데이타와 비교하는 경우에 더 우수하였다 (표 41 및 도 21).
Icb로부터 형성된 IVc의 말기 혈장 농도 대비 시간 프로필은 히스토리칼 IVc 프로필과 유사하다 (도 22).
개에서 Icb의 IV 및 경구 투여 후에 Icb 및 IVc의 약력학적 파라메터 (평균±SD, n=3)
PK 파라메터 Icb Icb를 투약한 후에
형성된 IVc		 히스토리칼 IVc
IV
용량 (㎎/㎏) 1.28 유리산, 또는
1.04 IVc 등가물		 1
AUCtot (μMㆍhr) 0.61±0.20 9.8±3.6 14±2.5
CLtot (㎖/분/㎏) 64±18 NA 2.6±0.46
t1 /2 (hr) 0.25±0.10 4.1±0.54 4.6±1.7
MRT (hr) 0.14±0.021 NA 6.3±1.9
Vdss (L/㎏) 0.50±0.088 NA 0.93±0.14
IV IVcAUC 비 NA 0.67* NA
PO
용량 (㎎/㎏) 6.05 유리산, 또는
4.92 IVb 등가물		 5
Tmax (hr) ND 0.58±0.38 1.3±0.58
Cmax (μM) ND 16±3.9 9.6±0.87
C-24 hr (μM) ND 0.22±0.16 0.15±0.027
AUCtot (μMㆍhr) ND 72±27 63±2.4
t1 /2 (hr) ND 4.2±0.58 3.6±0.042
생체이용율 (%) ND 104** 89±12
PO IVc AUC 비 NA 1.2* NA
* 비는 IV 및 PO 각각에 대하여 프로드럭 투약 후의 IVc AUC/IVc 투약 후의 IVc AUC로부터 계산되었다.
* IVc의 히스토리칼 IV 데이타로부터 계산됨.
원숭이에서의 생체내 시험
Icb의 IV 및 경구 투여 후에 원숭이에서 Icb 및 IVc의 약력학적 파라메터는 표 45에 요약하였다. 혈장 농도 대비 시간 프로필은 도 23에 나타내었다. 비교를 위해서, 원숭이에서 IVc의 약력학적 시험으로부터의 히스토리칼 데이타를 또한 나타낸다.
IV 투여한 후의 Icb의 C1은 원숭이에서의 44 ㎖/분/㎏의 간 혈류와 유사한 47 ㎖/분/㎏이었으며, 이것은 Icb가 원숭이에서 고청소율 화합물임을 시사하는 것이다. IV 투여한 후의 t1 /2 및 MRT는 각각 0.089 시간 및 0.097 시간이었다. Icb의 Vss는 0.27 L/㎏이었으며, 이것은 제한된 조직분포를 시사하는 것이다. IV 투여한 후에 Icb로부터의 IVc의 형성은 빨랐으며; IVc는 5 분의 최초 샘플링 시점에서 검출되었다 (데이타는 나타내지 않음). Icb로부터 형성된 IVc 대비 히스토리칼 IVc 시험으로부터 형성된 IVc의 IV AUC 비는 0.90이었으며, 이것은 Icb의 IVc로의 우수한 전환을 시사한다.
Icb는 경구 투여한 후에 어떤 혈장 샘플에서도 검출되지 않았다 (LLQ= 5 nM). Icb를 경구 투여한 후에 IVc의 Tmax는 2.3 시간인 IVc의 히스토리칼 Tmax보다 더 짧은 0.92 시간이었으며, 이것은 프로드럭의 경구 투여 후에 IVc의 더 빠른 흡수를 나타내는 것이다. Icb로부터의 IVc의 절대적 경구 생체이용율은 122%로 64%의 히스토리칼 IVc 데이타보다 더 컸다 (표 45).
Icb로부터 형성된 IVc의 말기 혈장 농도 대비 시간 프로필은 히스토리칼 IVc 프로필과 유사하다 (도 23).
원숭이에서 Icb의 IV 및 경구 투여 후에 Icb 및 IVc의 약력학적 파라메터 (평균±SD, n=3)
PK 파라메터 Icb Icb를 투약한 후에
형성된 IVc		 히스토리칼 IVc
IV
용량 (㎎/㎏) 1.4 유리산, 또는
1.1 IVc 등가물		 1
AUCtot (μMㆍhr) 0.87±0.14 5.0±0.57 5.0±1.0
CLtot (㎖/분/㎏) 47±8.1 NA 7.5±1.5
t1 /2 (hr) 0.089±0.031 1.2±0.063 0.92±0.30
MRT (hr) 0.097±0.003 NA 0.87±0.085
Vdss (L/㎏) 0.27±0.043 NA 0.40±0.097
IVb의 IV AUC 비 NA 0.90* NA
PO
용량 (㎎/㎏) 4.9 유리산, 또는
4.0 IVc 등가물		 5
Tmax (hr) ND 0.92±0.14 2.3±1.5
Cmax (μM) ND 9.5±1.2 4.2±2.6
C-24 hr (μM) ND 0.007±0.002 0.017±0.011
AUCtot (μMㆍhr) ND 24±4.6 14±4.0
t1 /2 (hr) ND 3.2±0.37 3.3±0.53
생체이용율 (%) ND 122** 64±29
IVb의 PO AUC 비 NA 2.1* NA
* 비는 IV 및 PO 각각에 대하여 프로드럭 투약 후의 IVc AUC/IVc 투약 후의 IVc AUC로부터 계산되었다.
* IVc의 히스토리칼 IV 데이타로부터 계산됨.
추가의 프로파일링 항목 4
프로드럭 Ie 를 사용한 추가의 시험:
다른 프로드럭에 대하여 상술한 것과 유사한 방법을 사용하여 프로드럭 Ie를 랫트에게 경구적으로 투약하였다. PO 투약한 후에, 모분자 IVe가 혈장에서 검출되었다.
추가의 프로파일링 항목 5
프로드럭 If 를 사용한 추가의 시험:
다른 프로드럭에 대하여 상술한 것과 유사한 방법을 사용하여 프로드럭 If를 랫트에게 경구적으로 투약하였다. PO 투약한 후에, 모분자 IVf가 혈장에서 검출되었다.
이하의 표 47은 추가의 프로파일링 항목 4 및 5에 기술된 바와 같이 랫트에게서 경구 투약시험으로부터 수득된 데이타를 나타낸다.
Figure 112006074171808-pct00113
혈장 및 다른 조직에서의 프로드럭의 검출에 대해 언급한다. 일단 프로드럭의 염 형태가 투여되면, 체내에서는 염의 스크램블링 (scrambling)이 일어날 수 있는 것으로 이해된다. 그러나, 피검 동물모델에서 프로드럭에 대해 정량화하기 위하여 사용된 시험방법은 포스페이트의 유리산을 분석함으로써 검출한다. 이와 같이 예를 들어, 라이신 염 Iab 또는 유리산 Iac를 분석하는 것은 동일한 종에 대해 분석하는 것으로 추정되며, 검출된 종이 실제로 라이신 염이었음을 의미하고자 하는 것은 아니다. 본 출원에서, 이러한 규칙은 단지 생체내 시험 및 샘플으로부터 수득된 샘플에 적용한다.
생물학
● "μM"은 마이크로몰을 의미하고;
● "㎖"는 밀리리터를 의미하며;
● "㎕"는 마이크로리터를 의미하고;
● "㎎"은 밀리그램을 의미하고;
● "DMSO"는 디메틸설폭사이드를 의미한다.
생체내에서 프로드럭으로부터 생성된 모화합물의 항-HIV 활성을 평가하기 위해서 사용된 물질 및 실험방법은 이하에 기술하는 바와 같다:
세포
● 인간 T 세포주 MT-2 및 PM1 (AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institute of Health)를 10% 태자소혈청 (FBS, Sigma, St. Louis, MO)을 함유하는 배지 RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 내에서 유지시키고, 증식시켰다.
바이러스
● HIV-1의 실험실 균주인 T-지향성 (tropic) 균주 LA1은 AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institute of Health를 통해서 수득하였다. 이것을 MT-2 세포에서 증폭시키고, 바이러스 항복시험 (virus yield assay) (2)을 사용하여 적정하였다. 검출은 섬광근접검출 프로토콜 (Scintillation Proximity detection protocol) (1)(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)에 의해서 사용하기에 적합한 역전사효소 시험 (3)을 사용함으로써 달성되었다.
실험
1. 화합물 원액은 DMSO 중에 30 mM로 용해시킴으로써 제조되었다. 희석 플레이트를 위해서, 화합물은 96-웰 폴리프로필렌 플레이트를 사용하여, 농도가 최종 시험농도의 100-배 더 크게 되도록 DMSO로 3-배 계열희석하였다. 항바이러스 및 세포독성 시험을 위해서는 웰당, 2 ㎕를 첨가하였다 (1% 최종 DMSO 농도).
2. 화합물은 희석 플레이트로부터 <20 μM의 농도로 10% 태자소혈청을 함유하는 100 ㎕ 배지 RPMI-1640을 함유하는 96 웰 조직배양 플레이트에 첨가하였다.
3. 항바이러스 시험을 위해서는, 세포를 0.005의 감염다중성으로 감염시켰다. 37℃에서 1 시간 후에, 감염된 세포를 10% 태자소혈청을 함유하는 배지 RPMI-1640 내에 ㎖당, 200,000 세포로 희석하였다. 100 ㎕의 이 용액을 웰당, 200 ㎕의 최종 용적을 제공하도록 첨가하였다.
4. 플레이트를 가습된 CO2 배양기 내에서 37℃로 배양하고, 5 일 후에 수확하였다.
5. 바이러스 감염은 상술한 바와 같이 감염된 웰의 상등액 내의 역전사효소 활성을 측정함으로써 모니터하였다. 각각의 화합물에 대한 억제율 %는 각각의 화합물의 존재 하에서 감염된 세포 내의 리드아웃 (readout) 레벨을 화합물의 부재 하에서 감염된 세포에 대해서 관찰된 것의 백분율로서 정량화하고, 이렇게 측정된 값을 100으로부터 공제함으로써 계산되었다.
6. EC50은 본 발명의 화합물의 항바이러스 혀능을 비교하는 방법을 제공한다. 50% 억제를 위한 유효농도 (EC50)는 마이크로소프트 엑셀 엑스1피트 (Microsoft Excel X1fit) 곡선맞춤 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 각각의 화합물에 대하여, 곡선은 4 가지 파라메터 로지스틱 모델 (four parameter logistic model; 모델 205)을 사용하여 8 가지 상이한 농도에서 계산된 억제율 %로부터 생성되었다. 화합물에 대한 EC50 데이타는 표 48에 나타내었다.
결과
EC 50 을 위한 생물학적 데이타 키
EC50> 5 μM을 갖는 화합물 1 μM< EC50< 5 μM - > 1 μM을 갖는 화합물 EC50> 50 nM을 갖지만, 더 고농도에서는 아직 시험하지 않은 화합물 EC50< 1 μM을 갖는 화합물
C 군 B 군 A' 군 A 군
화합물 IV (모분자)의 항바이러스 활성
화합물 IVa 화합물 IVb
(나트륨 염)		 화합물 IVc
(산 형태)		 화합물 IVd
(산 형태)
EC50-LAI A A A A
이하의 시험에 의해서 나타나는 바와 같이 모분자가 생체내에서 프로드럭으로부터 생성되며, 혈장 내에서의 활성성분이고 또한 주된 종이기 때문에 프로드럭 그 자체의 항-HIV 활성은 적절하지 않다. 또한, 프로드럭은 시험관내 시험에서 적어도 제한된 정도로 느리게 모분자로 전환함으로써 항바이러스 데이타의 해석을 복잡하게 한다.
세포독성
1. 세포독성 시험은 본 기술분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 동일한 MT-2 새포로 수행하였다. 이 방법은 문헌 (4)에 기술되어 있다. 간략하면, 세포를 6 일 동안, 약물의 존재 하에서 배양하고, 그 후에 세포 생존도를 산화환원-활성 염료 환원시험을 사용하여 측정하였다. 50 ㎕의 XTT 시약 (포스페이트 완충된 식염수에 용해된 1 ㎎/㎖의 2,3-비스[2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐]-2H-테트라졸륨-5-카복스아닐리드, 10 ㎍/㎖의 페나진 메토설페이트)를 각각의 웰에 첨가하고, 3 시간 동안 배양하였다. 활발하게 호흡하는 세포에 의한 발색을 플레이트 판독기에서 450 nm로 정량화하였으며, CC50을 측정하는데 사용하였다. IVa, IVb, IVc 및 IVd 모분자에 대한 CC50은 이 방법에 의해서 측정하는 경우에 10 μM보다 컸다. 세포독성 데이타는 화합물이 항바이러스 시험에 사용된 세포를 비특이적으로 사멸시키지 않음을 나타내는 이차적인 스크린 (screen)이며, 화합물이 항바이러스 활성을 갖는다는 주장을 추가로 지지하는 것이다.
따라서, 본 발명에 따라 추가로, HIV 감염 및 AIDS와 같은 바이러스 감염을 치료하는 방법 및 치료용 약제학적 조성물이 제공된다. 치료방법에는 이러한 치료가 필요한 환자에게 약제학적 담체 및 치료학적-유효량의 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것이 포함된다.
약제학적 조성물은 경구적으로-투여가능한 현탁제 또는 정제; 비내 스프레이, 멸균 주사용 제제, 예를 들어, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁제 또는 좌제의 형태일 수 있다.
현탁제로 경구적으로 투여되는 경우에, 이들 조성물은 약제학적 제제의 기술분야에서 잘 알려진 기술에 따라 제조되며, 부피를 주기 위한 미세결정성 셀룰로즈, 현탁화제로서 알긴산 또는 나트륨 알기네이트, 점도 증진제로서 메틸셀룰로즈, 및 본 기술분야에서 잘 알려진 감미제/방향제를 함유할 수 있다. 즉시방출형 정제로서 이들 조성물은 미세결정성 셀룰로즈, 디칼슘 포스페이트, 전분, 마그네슘 스테아레이트 및 락토즈 및/또는 본 기술분야에서 공지된 그 밖의 다른 부형제, 결합제, 증량제, 붕해제, 희석제 및 윤활제를 함유할 수 있다.
주사용 용액 또는 현탁제는 공지된 기술에 따라서 만니톨, 1,3-부탄디올, 물, 링거용액 또는 등장성 염화나트륨 용액과 같은 적합한 비-독성의 비경구적으로-허용되는 희석제 또는 용매, 또는 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함하는 멸균, 블랜드 (bland), 고정오일, 및 올레산을 포함하는 지방산과 같은 적합한 분산 또는 습윤 및 현탁화제을 사용하여 제제화될 수 있다.
본 발명의 화합물은 분할된 용량으로 1 내지 100 ㎎/체중 ㎏의 투약량 범위로 인간에게 경구적으로 투여될 수 있다. 바람직한 투약량 범위는 분할된 용량으로 경구적으로 1 내지 10 ㎎/체중 ㎏이다. 다른 바람직한 투약량 범위는 분할된 용량으로 경구적으로 1 내지 20 ㎎/㎏ 및 1 내지 30 ㎎/체중 ㎏이다. 그러나, 특정한 환자를 위한 특정한 용량 레벨 및 투약 빈도는 달라질 수 있으며, 사용된 측정 화합물의 활성, 그 화합물의 대사 안정성 및 작용 지속시간, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 다이어트, 투여의 모드 및 시간, 배설율, 약물 배합, 특정 상태의 중증도, 및 치료를 받는 숙주를 포함하는 다양한 인자에 따라서 좌우될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.

Claims (31)

  1. 화학식 I의 화합물.
    [화학식 I]
    Figure 112011083826676-pct00166
    상기 식에서,
    X는 C이고;
    W는 N이며, 단 W가 N인 경우에 R2는 존재하지 않고;
    V는 C이며;
    R1은 할로겐이고;
    R3는 N-1 위치에서 부착된 1,2,3-트리아졸릴이며;
    E는 수소 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 모노 또는 비스 염이고;
    Y는 화학식
    Figure 112011083826676-pct00167
    이며;
    R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17은 각각 H이고;
    R18은 C(O)-페닐 및 퀴나졸리닐로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 F인 화합물.
  3. 화학식 I의 화합물.
    [화학식 I]
    Figure 112011083826676-pct00168
    상기 식에서,
    X는 C이고;
    W는 N이며, 단 W가 N인 경우에 R2는 존재하지 않고;
    V는 C이며;
    R1은 메톡시이고;
    E는 수소 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 모노 또는 비스 염이며;
    Y는 화학식
    Figure 112011083826676-pct00169
    이고;
    R3는 C1-6 알킬로 독립적으로 임의로 치환될 수 있는 트리아졸릴이며;
    R18은 퀴나졸리닐이고, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17은 각각 H이다.
  4. (a) 화학식 IVa의 화합물을, 화학식 IVa의 화합물의 몰당 염기로서 2 몰당량의 K2CO3 및 화학식 IVa의 화합물의 그램당 용매로서 5-10 ㎖의 N-메틸피롤리디논의 존재 하에서, 30℃의 반응온도에서 화학식 IVa의 화합물의 몰당 1.2 몰당량의 화학식 Z의 구조를 갖는 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트로 알킬화시켜 화학식 R의 화합물을 형성시키고;
    (b) 단계 (a)의 생성된 반응혼합물에 화학식 IVa의 그램당 10 ㎖의 디클로로메탄 용매 및 화학식 IVa의 몰당 15 몰당량의 트리플루오로아세트산을 첨가함으로써 실온에서 화학식 R의 화합물의 tert-부틸기 두 개를 모두 탈보호시키고;
    (c) 화학식 Iac의 화합물을 회수하는 단계를 포함하는, 화학식 Iac의 구조를 갖는 화합물의 제조 방법.
    Figure 112011083826676-pct00170
    Figure 112011083826676-pct00171
    Figure 112011083826676-pct00172
    Figure 112011083826676-pct00173
  5. (a) 화학식 IVc의 화합물을, 화학식 IVc의 화합물의 몰당 염기로서 2.5 몰당량의 Cs2CO3, 화학식 IVc의 화합물의 몰당 2 몰당량의 KI, 및 화학식 IVc의 화합물의 그램당 5-10 ㎖의 N-메틸피롤리디논의 존재 하에서, 25-30℃의 반응온도에서 화학식 IVc의 화합물의 몰당 2.5 몰당량의 화학식 Z의 구조를 갖는 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트로 알킬화시켜 화학식 IIc의 화합물을 형성시키고;
    (b) 과량의 아세톤 및 물 중에서 40℃의 온도에서 화학식 IIc의 화합물의 tert-부틸기 두 개를 모두 탈보호시키고;
    (c) 화학식 Ic의 화합물을 회수하는 단계를 포함하는, 화학식 Ic의 구조를 갖는 화합물의 제조 방법.
    Figure 112011083826676-pct00174
    Figure 112011083826676-pct00175
    [화학식 Z]
    Figure 112011083826676-pct00176
    Figure 112011083826676-pct00177
  6. (a) 화학식 IVb의 화합물을, 화학식 IVb의 화합물의 몰당 염기로서 2 몰당량의 Cs2CO3, 화학식 IVb의 화합물의 몰당 2 몰당량의 KI, 및 화학식 IVb의 화합물의 그램당 2.5 ㎖의 N-메틸피롤리디논의 존재 하에서, 30℃의 반응온도에서 화학식 IVb의 화합물의 몰당 2 몰당량의 화학식 Z의 구조를 갖는 디-tert-부틸 클로로메틸 포스페이트로 알킬화시켜 화학식 IIb의 화합물을 형성시키고;
    (b) 과량의 아세톤 및 물 중에서 40℃의 온도에서 화학식 IIb의 화합물의 tert-부틸기 두 개를 모두 탈보호시키고;
    (c) 화학식 Ibc의 화합물을 회수하는 단계를 포함하는, 화학식 Ibc의 구조를 갖는 화합물의 제조 방법.
    Figure 112011083826676-pct00178
    Figure 112011083826676-pct00179
    [화학식 Z]
    Figure 112011083826676-pct00180
    Figure 112011083826676-pct00181
  7. 하기 화학식의 구조를 갖는 화합물 1-벤조일-4-[2-[4-메톡시-7-(3-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-1-[(포스포노옥시)메틸]-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-3-일]-1,2-디옥소에틸]-피페라진.
    Figure 112011083826676-pct00182
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