CN101941990A - 哌嗪和取代的哌啶抗病毒药物的前药 - Google Patents

哌嗪和取代的哌啶抗病毒药物的前药 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于制备前药化合物(I)的中间体化合物Ic和Icb。
Figure 201010166950.3_AB_0

Description

哌嗪和取代的哌啶抗病毒药物的前药 
本申请是以下申请的分案申请：申请日2005年3月3日，申请号200580015263.9(PCT/US2005/006980)，标题“哌嗪和取代的哌啶抗病毒药物的前药”。 
本申请要求2004年12月10日提交的美国临时申请序列号60/635,231和2004年3月15日提交的60/553,320的权益。 
技术领域
本发明提供具有药物和生物作用(bio-affecting)性质的化合物、它们的药用组合物和用法。具体地说，本发明涉及具有抗病毒活性的新前药衍生物。更具体地说，本发明涉及可用于治疗HIV和AIDS的化合物。 
背景技术
HIV-1(人免疫缺陷性病毒-1)感染仍是主要的医学问题，估计在2002年末全世界有4千2百万人感染。HIV和AIDS(获得性免疫缺陷综合征)的病例数迅速上升。在2002年，报道有新感染～5.0百万，且3.1百万人死于AIDS。治疗HIV的现有药物包括10种核苷逆转录酶(RT)抑制剂或获得批准的单一丸剂组合(齐多夫定或AZT(或立妥 
Figure GSA00000095036600011
Figure GSA00000095036600012
)、去羟肌苷(或惠妥 
Figure GSA00000095036600013
)、司他夫定(或Zerit泽瑞 
Figure GSA00000095036600014
)、拉米夫定(或3TC或 
Figure GSA00000095036600015
)、扎西他滨(或DDC或 
Figure GSA00000095036600016
)、琥珀酸阿巴卡韦(或 
Figure GSA00000095036600017
)、替诺福韦disoproxil富马酸盐(或 
Figure GSA00000095036600018
)、可比 
Figure GSA00000095036600019
(含-3TC和AZT)、 
Figure GSA000000950366000110
(含阿巴卡韦、拉米夫定和齐多夫定)和 
Figure GSA000000950366000111
(emtricitabine)；3种非核苷逆转录酶抑制剂：奈韦拉平(或 
Figure GSA000000950366000112
)、 地位韦啶(或甲磺酸地位韦 
Figure GSA00000095036600021
)和伊法韦仑(或 
Figure GSA00000095036600022
)、9种拟肽蛋白酶抑制剂或获得批准的制剂：沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦、奈非那韦、氨普奈韦、洛匹那韦、 
Figure GSA00000095036600023
(洛匹那韦和利托那韦)、Atazanavir 
Figure GSA00000095036600024
福沙那 
Figure GSA00000095036600025
和靶向病毒gp41T-20 
Figure GSA00000095036600026
的融合抑制剂。如果单独使用，这些药物中的每个药物只能短暂抑制病毒复制。但是，当联合使用时，这些药物对病毒血症和疾病递进具有长久作用。事实上，近来报道称由于广泛应用联合疗法的原因，AIDS患者死亡率减少。但是，尽管这些结果印象显著，但最终，联合药物疗法对30-50％患者无效。药物效力不足，缺乏依从性、限制性组织渗透和某些细胞种类中药物特异性限制(例如在休眠细胞中大多数核苷类似物不能被磷酸化)可以解释不完全抑制敏感病毒的原因。另外，在亚最佳浓度下，高复制速度和与经常加入突变结合的快速HIV-1反转导致耐药变体出现和治疗失败(Larder和Kemp；Gulick；Kuritzkes；Morris-Jones等；Schinazi等；Vacca和Condra；Flexner；Berkhout和Ren等；(参考文献6-14))。因此，需要新的具有独特抗性模式和有效药物动力学以及安全性能的抗-HIV药物提供更多治疗选择。 
目前上市的HIV-1药物主要是核苷逆转录酶抑制剂或拟肽蛋白酶抑制剂。近来，非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)在治疗HIV感染中所起的重要作用日益增加(Pedersen&Pedersen，参考文献15)。在文献中阐述过至少30种不同种类的NNRTI(De Clercq，参考文献16)和在临床实验中评价过几种NNRTIs。二吡啶并二氮杂 
Figure GSA00000095036600027
酮(Dipyridodiazepinone)(奈韦拉平)、苯并噁嗪酮(benzoxazinone)(依法韦仑)和二(杂芳基)哌嗪衍生物(地拉韦啶)已被批准在临床上使用。但是，开发和应用NNRTIs所面临的主要缺点是在组织细胞培养和在接受治疗的个体，尤其是接受单一疗法的那些患者中迅速出现耐药株的倾向。因而，鉴定具有较少产生耐性倾向的NNRTIs有相当大的意义(Pedersen&Pedersen，参考文献15)。近来，出现关于非核苷逆转录酶抑制剂的概述：″Perspectives on novel therapeuticcompounds and strategies for the treatment of HIV infection″(治疗HIV感染的新化合物和策略的前景)(Buckheit，参考文献99)。发表包括NRTI和NNRTIs的综述(De Clercq，参考文献100)。已发表有关HIV药物目前状态的概述(De Clercq，参考文献101)。 
据报道，包括吲哚-3-砜、哌嗪并吲哚(piperazino indoles)、吡嗪并吲哚(pyrazino indoles)和5H-吲哚并[3，2-b][1，5]苯并硫氮杂 
Figure GSA00000095036600031
(benzothiazepine)衍生物在内的几种吲哚衍生物是HIV-1逆转录酶抑制剂(Greenlee等，参考1；Williams等，参考2；Romero等，参考3；Font等，参考17；Romero等，参考18；Young等，参考19；Genin等，参考20；Silvestri等，参考21)。还有将吲哚2-甲酰胺描述为细胞附着和HIV感染的抑制剂(Boschelli等，美国专利5,424,329，参考4)。3-取代的吲哚天然产物(Semicochliodinol A和B，didemethylasterriquinone和isocochliodino1)公布为HIV-1蛋白酶抑制剂(Fredenhagen等，参考22)。 
先前公布过结构相关的氮杂-吲哚酰胺衍生物(Kato等，参考文献23(a)；Levacher等，文献23(b)；Dompe Spa，WO-09504742，参考文献5(a)；SmithKline Beecham PLC，WO-09611929，参考文献5(b)；ScheringCorp.，美国专利-05023265，参考文献5(c))。但这些结构不同于本文中要求保护的那些，因为它们是单氮杂-吲哚单酰胺而非氧代乙酰胺衍生物，且没有提及这些化合物治疗病毒，尤其HIV感染的用途。 
需要治疗HIV的新药，治疗对目前已批准的靶向逆转录酶或蛋白酶的上述药物耐药的患者。获得这些药物的一个方法是寻找抑制病毒的新的和不同靶标的分子。正在进行活性研究的一大类抑制剂是HIV进入(entry)抑制剂。该总分类包括针对几种靶标的药物，它们包括趋化因子受体(CCR5或CXCR4)抑制剂、靶向病毒gp41融合抑制剂和防止gp120病毒外膜及其人细胞靶CD4附着的抑制剂。近来发表了有关病毒进入抑制剂的许多综述或综合性论文，挑选一些作为参考： 
Chemokine receptor antagonists as HIV entry inhibitors(用作HIV抑制剂的趋化因子受体拮抗剂).Expert Opinion on Therapeutic Patents(2004)，14(2)，251-255. 
Inhibitors of the entry of HIV into host cells.(HIV进入宿主细胞的抑制剂)Meanwell，Nicholas A.；Kadow，John F.Current Opinion in DrugDiscovery&Development(2003)，6(4)，451-461. 
Virus entry as a rget for anti-HIV intervention(用作抗HIV干预靶标的病毒入口).Este，Jose A.Retrovirology Laboratory irsiCaixa，Hospital Universitari Germans Trias i Pujol，Universitat Autonoma deBarcelona，Badalona，Spain.Current Medicinal Chemistry(2003)，10(17)，1617-1632. 
New antiretroviral agents(新的抗逆转录酶病毒药物).Rachline，A.；JoIy，V.Service  de Maladies Infectieuses et Tropicales A，HopitalBichat-Claude Bernard，Paris，Fr.Antibiotiques(2003)，5(2)，77-82. 
New antiretroviral drugs(新的抗逆转录酶病毒药物).Gulick，R.M.Cornell HIV Clinical Trials Unit，Division of International Medicine andInfectious Diseases，Weill Medical College of Cornell University，NewYork，NY，USA.Clinical Microbiology and Infection(2003)，9(3)，186-193. 
Sensitiviry of HIV-1 to entry inhibitors correlates withenvelope/coreceptor affinity，receptor density，and fusion kinetics(HIV-1进入的抑制剂敏感性与外膜/共同受体亲和力、受体密度和融合动力学相关).Reeves，Jacqueline D.；Gallo，Stephen A.；Ahmad，Navid；Miamidian，John L.；Harvey，Phoebe E.；Sharron，Matthew；Pohlmann，Stefan；Sfakianos，Jeffrey N.；Derdeyn，Cynthia A.；Blumentlial，Robert；Hunter，Eric；Doms，Robert W.Department of Microbiology，Universityof Pennsylvania，Philadelphia，PA，USA.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America(2002)，99(25)，16249-16254.CODFN：PNASA6ISSN：0027-8424. 
Opportunities and challenges in targeting HIV entry(靶向HIV进入的机会和挑战).Biscone，MarkJ.；Pierson，Theodore C；Doms，Robert W.Department of Microbiology，University of PennSylvania，Philadelphia，PA，USA.Current Opinion in Pharmacology(2002)，2(5)，529-533. 
HIV entry inhibitors in clinical development(临床开发中的HIV进入抑制剂).O’Hara，Bryan M.；Olson，William C.ProgeniesPharmaceuticals，Inc.，Tarrytown，NY，USA.Current Opinion inPharmacology(2002)，2(5)，523-528. 
Resistance mutation in HIV entry inhibitors(HIV进入抑制剂中的耐药突变).Hanna，Sheri L.；Yang，Chunfu；Owen，Sherry M.；Lal，RenuB.HIV Immunology and Diagnostics Branch，Division of AIDS，STD，Atlanta，GA，USA.AIDS(London，United Kingdom)(2002)，16(12)，1603-1608. 
HIV entry：are all receptors created equal？(HIV入口：所有受体生来相同？)Goldsmith，Mark A.；Doms，Robert W.Genencor Intemational，Inc.，Palo Alto，CA，USA.Nature Immunology(2002)，3(8)，709-710.CODEN：NIAMCZ ISSN：1529-2908. 
Peptide and non-peptide HIV fusion inhibitors(肽和非肽HIV融合抑制剂).Jiang，Shibo；Zhao，Qian；Debnath，Asim K.The New YorkBlood Center，Lindsley F.Kimball Research Institute，New York，NY，USA.Current Pharmaceutical Design(2002)，8(8)，563-580. 
有两种防止gp120病毒膜与细胞CD4开始附着的普通方法，它们是a)与人CD4结合和抑制病毒外膜(gp120)附着的抑制剂，和b)与病毒gp120结合和阻止与细胞CD4结合的抑制剂。第二种方法具有抑制病毒靶标的优势，如果选择，它使扰乱正常人生理或产生副作用的机会最小。用该方法，为克服由病毒外膜序列变异性导致发生药物敏感谱和抑制耐药性，达到超过EC50或其它杀灭病毒需要的药物浓度量尽可能多倍的血浆药物水平是重要的。在下文会论述到，这些抑制剂似乎是安全的，因而在人体中有广泛功用，因此，它们必须能够达 到足以使病毒抑制的暴露水平。超过抑制病毒生长所需药物水平的倍数越大，抑制病毒复制越有效和完全，病毒突变和随后发生抵抗治疗的机会越小。因此，对病毒附着抑制剂功效有贡献的重要方面不仅包括内在潜力和安全，而且还包括按物理可行的剂量和可接受的，优选方便的给药方案所允许获得高血浆暴露的药物动力学和药物性质。本发明阐述当加大给予前文公开的HIV附着类抑制剂的有效成员时，极大促进最大暴露和增加暴露倍数(即大于EC50或EC90的药物暴露倍数)能力的前药方法。 
一系列近来出版物和公开内容表征和描述了标记为BMS-806的化合物，它是靶向病毒gp-120和阻止病毒附着到宿主CD4的病毒进入类抑制剂的原始成员。 
A small molecule HIV-1 inhibitor that targets the HIV-1 envelopeand inhibits CD4 receptor binding(靶向HIV-1外膜和抑制CD4受体结合的小分子HIV-1抑制剂)。Lin，Pin-Fang；Blair，Wade；Wang，Tao；Spicer，Timothy；Guo，Qi；Zhou，Nannan；Gong，Yi-Fei；Wang，H.-G.Heidi；Rose，Ronald；Yamanaka，Gregory；Robinson，Brett；Li，Chang-Ben；Fridell，Robert；Deminie，Carol；Demers，Gwendeline；Yang，Zheng；Zadjura，Lisa；Meanwell，Nicholas；Colonno，Richard.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica(2003)，100(19)，11013-11018. 
Biochemical and genetic characterizations of a novel humanimmunodeficiency virus type 1 inhibitor that blocks gp120-CD4interactions(生物化学和遗传表征新的阻止gp120-CD4相互作用的1型人免疫缺陷病毒抑制剂).Guo，Qi；Ho，Hsu-Tso；Dicker，Ira；Fan，Li；Zhou，Nannan；Friborg，Jacques；Wang，Tao；McAuliffe，Brian V.；Wang，Hwei-gene Heidi；Rose，Ronald E.；Fang，Hua；Scarnati，Helen T.；Langley，David R.；Meanwell，Nicholas A.；Abraham，Ralph；Colonno，Richard  J.；Lin，Pin-fang.Journal of Virology(2003)，77(19)，10528-10536. 
Method using small heterocycliccompounds for treating HIVinfection by preventing interaction of CD4 and gp120(用通过阻止CD4与gp120相互作用的化合物治疗HIV感染的方法).Ho，Hsu-Tso；Dalterio，Richard A.；Guo，Qi；Lin，Pin-Fang.PCT Int.Appl.(2003)，WO2003072028A2. 
Discovery of4-benzoyl-l-[(4-methoxy-1H-pyrrolo[2，3-b]pyridin-3-yl)oxoacetyl]-2-(R)-methylpiperazine(BMS-378806)：A Novel HIV-1 Attachment InhibitorThat Interferes with CD4-gp120 Interactions.(发现4-苯甲酰基-1-[(4-甲氧基-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基)氧代乙酰基]-2-(R)-甲基哌嗪(BMS-378806)：新的干扰CD4-gp120相互作用的HIV-1附着抑制剂)Wang，Tao；Zhang，Zhongxing；Wallace，Owen B.；Deshpande，Milind；Fang，Haiquan；Yang，Zheng；Zadjura，Lisa M.；Tweedie，Donald L.；Huang，Stella；Zhao，Fang；Ranadive，Sunanda；Robinson，Brett S.；Gong，Yi-Fei；Ricarrdi，Keith；Spicer，Timothy P.；Deminie，Carol；Rose，Ronald；Wang，Hwei-Gene Heidi；Blair，Wade S.；Shi，Pei-Yong；Lin，Pin-fang；Colonno，Richard J.；Meanwell，Nicholas A.Journal of MedicinalChemistry(2003)，46(20)，4236-4239. 
Figure GSA00000095036600071
该类吲哚、氮杂吲哚和其它含酮基酰胺(oxo amide)的衍生物已在多个不同PCT和批准的美国专利申请(参考文献93-95、106、108、109、110、111和112)中公开，这些参考文献直接涉及该专利申请中的化合物。这些参考文献中的现有技术化合物没有含与N-1氮连接的磷酸二氢甲酯(或磷酸盐或单酯或二酯基团)基团，因此，本发明化合物代表新物质成分。该部分通过前药修饰功能急剧增加母体化合物的功用，该修饰在临床前人暴露模型急剧加大母体分子的最大全身暴露。本发 明人确信，在现有技术参考文献中不存在可视为公开或提示本发明的新化合物及其抑制HIV感染的用途的任何物质。 
本发明阐述具体的吲哚和氮杂吲哚酮基哌嗪酰胺的前药，它们在改善用作抗病毒药物，尤其是抗HIV药物的母体分子的口服功效方面非常有效。母体分子相对不溶，并受溶出度限制或溶解度吸收限制，它表示剂量增加超过最高水平时，越来越少的药物能准时溶解而被吸收进入循环，代之，它们通过身体，当作废物被消除。必须通过前药提供改进，因为它们使体内药物水平明显增加，这样对HIV病毒，尤其对较不敏感和更耐药的毒株提供更大的效能。前药对这类药物尤其重要，因为这些药物靶向HIV病毒的外膜，不同的毒株靶标不同，因此需要其中暴露倍数最大的。因为使用前药，将会吸收更多的药物到达靶标，可减少药物负担、患者开支和给药间隔。难以鉴定具有这些性质的前药，在文献中公开的成功前药设计，既不直截了当，也没有清析路径可行。没有明确讲授使用何物是最有效的前药化学的现有技术。以下论述和数据将表明本发明中所述前药作用出乎意料地好。它们非常快和有效地释放母体药物，增加比报道的许多前药更高的暴露水平。 
在某些情况下，可使用显著加强药物的特性或克服药物固有的药剂学或药物动力学性质缺陷的前药策略或方法，以显著加强药物的功效。前药不同于制剂，因为化学修饰导致整个新的化学实体，当该化学实体给予患者时，它在体内重新产生母体分子。存在提供无数调节重新产生母体药物的条件、前药的物理，药剂或药物动力学性质和可与前药修饰连接的官能团的前药策略。但是，这些出版物中没有一篇讲授使用何种方法产生本文中发明的具体前药。已有许多关于前药策略的综述或论述发表，以下提供不完全的列表： 
Hydrolysis in Drug and prodrug Metabolism.Richard Testa andJoachim Mayer，2003 Wiley-VCH publisher，ISBN 3-906390-25-x. 
Design of Prodrugs，Bundgard，H.Editor，Elsevier，Amsterdam，1985. 
Pharmacokinetics of drug targeting：specific implications fortargeting via prodrugs(靶向药物的药物动力学；通过前药靶向的具体暗示).Stella，V.J.；Kearney，A.S.Dep.Pliarm.Chem.，Univ.Kansas，Lawrence，KS，USA.Handbook of Experimental Pharmacology(1991)，100(Targeted  Drug Delivery)，71-103.CODEN：HEPHD2ISSN：0171-2004.Journal；General Review written in English.CAN 116：158649AN 1992：158649CAPLUS(Copyright 2004ACS on SciFinder(R)). 
Prodrugs.Do they have advantages in clinical practice？(前药。它们在临床实践有优势吗？)Stella，V.J.；Charman，W.N.A.；Naringrekar，V.H.Dep.Pharm.Chem.，Univ.Kansas，Lawrence，KS，USA.Drugs(1985)，29(5)，455-73.CODEN：DRUGAY ISSN：0012-6667.Journal；General Review written in English.CAN 103：115407AN 1985：515407CAPLUS(Copyright 2004 ACS on SciFinder(R)). 
Trends in prodrug research(前药研究趋势).Stella，V.J.；Naringrekar，V.H.；Charman，W.N.A.Dep.Pharm.Chem.，Univ.Kansas，Lawrence，KS，USA.Pharmacy International(1984)，5(11)，276-9.CODEN：PHINDQ ISSN：0167-3157.Journal；General Review written inEnglish.CAN 102：72143AN 1985：72143CAPLUS(Copyright 2004ACS on SciFinder(R)). 
虽然已知某些技术有具体应用价值，即改善溶解性或吸收，但例如开发前药在很大程度上仍停留在靠经验操作。因此，通常必须研究众多的策略或化学修饰，在生物模型中评价得到的化合物，以便确定和测量前药策略的成功性。 
成功的前药策略需要通过加入前药部分修饰分子中的化学活性部位；需要随后在需要的条件下，在患者中前药部分脱去保护(unmask)，释放母体药物。在给药前，前药分子在可接受的剂型中必须具有适宜的稳定性。此外，释放机理必须允许前药有效地重新生成母体分子和具有在疾病靶标上提供治疗水平的母体药物的动力学。在本发明人的分子中，吲哚或氮杂吲哚的氮代表前药部分的可接受的连接点。 
通过适当化学或连键连接的可促进经口服母体药物暴露的建议是本领域中已知的概念。但是，如以下论述的那样，无法预知用产生前药的磷酸根基团是否与特定的药物物质发生作用。磷酸根基团暂时改变药物的物理性质，因此，它是增加得到的分子水溶性的前药直至被体内碱性磷酸酯酶或合理设计的连键(linker)的其它化学反应解离。例如，在以下参考文献中，作者断定磷酸酯(盐)可提高口服功效。在该参考文献中，醇基磷酸酯(盐)衍生物在水溶性差的亲酯性药物中表现出比其它两种前药更好的口服生物利用度，似乎有超过具有低口服生物利用度的母体分子的优势。 
Evaluation of a targeted prodrug strategy to enhance oralabsorption of poorly water-soluble compounds(评价促经口服吸收水溶性差的化合物的靶向前药策略).Chan，O.Helen；Schmid，Heidi L.；Stilgenbauer，Linda A.；Howson，William；Horwell，David C；Stewart，Barbra H.Pharmaceutical Research(1998)，15(7)，1012-1018. 
已发表两篇极其相关的新近论文，它们论述了鉴定口服使用的比母体分子具有明显优势的磷酸酯(盐)前药的困难。 
Tycho Heimbach等在Pharmaceutical Research 2003，第20卷，第6期第848-856页发表的标题为“限制口服磷酸酯(盐)前药吸收速度的因素”的论文称“通过口服途径使用的磷酸酯(盐)前药出乎意料的无效促使在用于筛选具有吸收潜力的侯选药物系统中的研究”。该论文还回顾了众多磷酸酯(盐)前药不适宜口服使用的理由，并论述了药物吸收过程中的几个潜在限制速度因素。该论文还鉴定了几个成功的应用。该论文试图鉴定可使某些药物的磷酸酯(盐)适宜口服递药的性质，但该信息明确表明这仍是经验科学。由同一作者Tycho Heimbach等在International Journal of Pharmaceutics 2003，261，81-92中发表的标题为“酶介导的从其磷酸酯(盐)前药沉淀母体药物”的第二篇论文的结论强调这一点。该作者在摘要中称，与它们的不溶性母体药物相比，许多磷酸酯(盐)前药未提高吸收速度或程度。通过肠碱性磷酸酯酶快速生成母体药物可产生超饱和溶液，导致母体药物沉淀。这将限制口 服磷酸酯(盐)的功用。该论文的结论称(引用)，“总之，由磷酸酯(盐)前药沉淀的母体药物可由酶介导。在Caco-2模型中，某些药物也可出现某些药物沉淀。因为诱导次数减少，具有高超饱和比例的成核次数增加，当靶向前药浓度比母体药物溶解度高得多时，即为具有高超饱和比例母体药物时，母体药物可沉淀。在转化为前药期间，母体药物沉淀的程度取决于前药变为母体药物的转化率、前药对母体药物沉淀的影响和母体药物的增溶作用”。通过上述作者的结论可以看出，该过程是复杂过程。取决于多种不能预测的因素，例如超饱和率、前药在体内的转化率和肠环境溶解母体药物和前药的混合物的能力。 
Heimbach的两篇参考文献阐述磷酸酯(盐)前药的临床状况，论述多个无效和少数几个成功的实例。以下提供一个临床无效的实例和一个成功的实例： 
依托泊 
Figure GSA00000095036600111
是通过静脉或口服途径给予的抗癌药。临床上使用磷酸依托泊苷前药，但这些结构不同于目前应用的衍生物，因为该前药含有通过直接连接母体药物的苯酚部分形成的磷酸酯(盐)。制备依托泊苷药物的磷酸酯前药的主要原因是通过增加溶解度和减少赋形剂改善静脉应用。尽管临床前和临床中评价了口服磷酸酯(盐)前药，但它在临床上只能用于静脉给药。 
Synthesis of etoposide phosphate，BMY-40481：a water-solubleclinically active prodrug of etoposide(合成磷酸依托泊苷，BMY-40481：水溶性有临床活性的依托泊苷).Saulnier，Mark G.；Langley，David R.；Kadow，John F.；Senter，Peter D.；Knipe，Jay O.；Tun，Min Min；Vyas，Dolatrai M.；Doyle，Terrence W.Bristol-Myers Squibb Co.，Wallingford，CT，USA.Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters(1994)，4(21)，2567-72及其参考文献。 
可以从以下两篇参考文献中看到，口服给药的磷酸酯(盐)部分的利益不明确。 
Randomized comparison of etoposide pharmacokinetics after oraletoposide phosphate and oral etoposide (随机对比口服磷酸依托泊苷和 口服依托泊苷后的依托泊苷药物动力学).De Jong，R.S.；Mulder，N.H.；Uges，D.R.A.；Kaul，S.；Winograd，B.；Sleijfer，D.Th.；Groen，H.J.M.；Willemse，P.H.B.；van der Graaf，W.T.A.；de Vries，E.G.E.Department of Medical Oncology，University Hospital Groningen，Groningen，Neth.British Journal of Cancer(1997)，75(11)，1660-1666.该论文直接对比了母体药物和前药，结论是口服磷酸依托泊苷未提供比口服依托泊苷更大的临床相关利益。 
Etoposide bioavailability after oral administration of the prodrugetoposide phosphate in cancer patients during a phaseI study(在I期研究期间，癌症患者口服前药磷酸依托泊苷后依托泊苷生物利用度).Chabot，G.G.；Armand，J.-P.；Terref，C；De Forni，M.；Abigerges，D.；Winograd，B.；Igwemezie，L.；Schacter，L.；Kaul，S.；et al.DepartmentMedicine，Gustave-Roussy Institute，Villejuif，Fr.Journal of ClinicalOncology(1996)，14(7)，2020-2030. 
前一篇论文发现，与文献数据对比，在低剂量或高剂量下，口服EP的F值比口服E高19％。他们得出结论，由口服前药EP中的E中的较高F似乎是该药物可能具有潜在药效重要性的药理学优势。但是，随后进行了得出相反结论的前述研究，似乎直接对比的数据更可靠。因此，增加磷酸盐(酯)基团改善溶解性不能确保改善口服功效。 
制备HIV蛋白酶磷酸盐(酯)前药抑制剂氨普奈韦，它是现已成为口服用药物改善的活性成分。这是通过该方法得到的罕见的成功案例。该磷酸盐(酯)直接与羟基部分连接，用于增加溶解度。单独福沙那韦或与用于抑制细胞色素P4503A4-介导的代谢失活的另一种蛋白酶抑制剂利托那韦联合使用可减少患者用药数量和体积(由于需要的赋形剂较少)，和使用频次较少的给药方案。很明显，氨普奈韦的结构与本发明分子明显不同，用其它种类药物或磷酸盐(酯)联系物化学不能预测成功。以下包含关于福沙那韦的两篇参考文献，但可通过搜索本领域熟知的数据库，例如IDDB(由Current Drugs Ltd.制作的称为Investigational Drugs Database的商用数据库)找到最新数据。 
Figure GSA00000095036600131
Fosamprenavir vertex Pharmaceuticals/GlaxoSmithKline.[对引用的CA138：130388文献的勘误].Corbett，Amanda H.；Kashuba，Angela D.M.School of Pharmacy，The University of North Carolina Hospitals，Chapel Hill，NC，USA.Current Opinion in Investigational Drugs(PharmaPress Ltd.)(2002)，3(5)，824. 
Fosamprenavir Vertex Pharmaceuticals/GlaxoSmithKline.Corbett，Amanda H.；Kashuba，Angela D.M.School of Pharmacy，The Universityof North Carolina Hospitals，Chapel Hill，NC，USA.Current Opinion inInvestigational Drugs(PharmaPress Ltd.)(2002)，3(3)，384-390. 
检索例如可在关键词“吲哚前药”或“氮杂吲哚前药”下找到的文献证明有众多已阐述过的参考文献。本发明人没有看到其中通过用与N-1连接的磷酸二氢甲酯(或磷酸盐或单酯或二酯类)部分制备氮杂吲哚前药的任何参考文献。 
关于磷酸吲哚前药，Zhu等在刊物中发表的论文描述了寻找PD154075的有效磷酸盐(酯)前药的研究。在该分子中，由于再生母体分子的速度缓慢，直接的磷酸吲哚或磷酸二氢甲酯或吲哚氮的盐前药均不是合适的前药。因此，开发以下描述的新的和复杂的连键以组成增溶性磷酸盐(酯)。 
Phosphate prodrugs of PD 154075(PD 154075的磷酸盐(酯)前药).Zhu，Zhijian；Chen，Huai-Gu；Goel，Om P.；Chan，O.Helen；Stilgenbauer，Linda A.；Stewart，Barbra H.Division of Warner-Lambert Company，Chemical Development，Parke-Davis Pharmaceutical Research，Ann Arb或，MI，USA.Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters(2000)，10(10)，1121-1124. 
Figure GSA00000095036600141
众多参考文献阐述不是为克服溶出度限制吸收的目的进行的前药设计。多种前药不与吲哚或氮杂吲哚氮连接，或设计为释放基团中间体而非母体药物。在本领域中所述前药及其性质不提供改善母体HIV附着抑制剂性质的明显的解决方案。 
现发现，以下所示通式结构的新的磷酸二氢甲酯前药和药学上可接受的盐可用作具有现有药物所不具备新机理的抗HIV药物。非常需要具有新机理的药物，因为如果患者对目前药物种类耐药，他们就没有别的选择。此外，具有新机理的药物可与已知种类的抑制剂联合使用，防止对这些药物耐药出现，因为耐药病毒毒株很可能仍对具有备选机理的药物敏感。 
Figure GSA00000095036600142
本发明人发现，经口给予啮齿动物药物后或用人酶或组织体外测定，这些前药比母体分子的水溶性更强，并迅速转化为母体药物。此外，在一个口服给药扩大研究中，当剂量增加时，前药提供出乎意料的药物暴露(AUC)和最大浓度(Cmax)增加。这些前瞻性研究提示这些前药应该能为犬和人提供利益。 
母体化合物IVa已在人临床试验中进行了研究。该化合物给予健康人志愿者。图1中所示为暴露与剂量关系的图。 
可以看到，胶囊制剂(红三角)的单剂量范围大小为200-2400mg，递增量为200mg。由口服AUCs也明显发现，药物暴露增加与剂量比例增加相比慢得多并小于剂量比例增加。事实上，800mg以上的暴露差异或增加微小。在禁食条件下，用1∶2∶4∶6∶9∶12剂量比例的胶囊治疗，平均Cmax和AUC值的比例分别为1∶1.3∶2.4∶2.3∶2.1∶2.7和1∶1.5∶2.3∶2.0∶1.9∶2.4。在200-800mg剂量范围内，全身暴露增加尽管小于剂量比例，但与剂量有关，而这种暴露是独立于以上剂量800mg的剂量。该现象表明所用的胶囊制剂中的化合物IVa吸收在禁食条件下可饱和。 
在进食(高脂肪餐)条件下，当Cmax和AUC比例分别是1.6和1.5；剂量比例是1∶2.3(800mg比1800mg)时，全身暴露中的剂量比例性似乎要好得多。如通过将单次200mg剂量IVa(深红色方块)溶液与200mg胶囊剂量比较所发现的，溶液暴露更大。用溶液给药增加化合物IVa暴露。溶液的Cmax和AUC分别约是胶囊(200mg)的8倍和3倍。相对于溶液制剂的胶囊相对生物利用度(32％)提示吸收受溶出速度限制，提示通过改善制剂可增加全身暴露。 
高脂肪餐对化合物具有正面食物影响。对于800和1800mg剂量，进食治疗后的Cmax分别是禁食治疗的约2.6倍和4.6倍。对于800和1800mg剂量，进食治疗后的AUCs分别是禁食治疗的约2.5倍和4.7倍。对于800和1800mg剂量，相对生物利用度(进食对禁食)值分 别是293％和509％。Tmax中值从1.25或2小时(禁食)到4小时(进食)不等。 
对于伴随进食的800mg胶囊，在给药8小时、12小时后，平均血浆浓度分别是1001和218ng/mL。结果支持提供多次给药后，至少200ng/mL靶向Cmin值的q12h或q8h给药方案。根据临床前数据选择该值。以柱状图表示的这些数据中的某些的总结见图2B中第二柱状图。 
在健康人中进行的多剂量研究 
进行有安慰剂对照的剂量递增型多剂量研究，以评价化合物IVa在健康人受试者中的安全性、耐受性和药物动力学。在12h间隔中，连续给药14天。总之，初步PK结果表明单次和多次Q12H给予化合物IVa后，在400-1200mg和在分别含高脂肪餐和低脂肪餐餐(lightmeal)的400-800mg剂量范围以上，暴露通常与剂量成比例，该暴露似乎是独立于具有以上不同餐饮类型的这些剂量水平的剂量，蓄积从低到中等(高达～1.5倍)，暴露存在昼间差异，因为傍晚给药后比早晨给药后，暴露更大。因此，当与高脂肪餐联合给药时，暴露更好，并且随剂量增加的暴露大于含高脂肪餐的暴露。 
这与以上单剂量研究中得到的结果相似。 
在HIV患者中进行的多剂量研究 
根据从以上正常志愿者中得到的暴露数据，在HIV患者中进行疗效研究。该数据起初在演讲和文摘中公布。″Antiviral Activity，Safety，and Tolerability of a Novel，Oral Small-Molecule HIV-l AttachmentInhibitor，IVa，in HIV-1-Infected Subjects″(新的口服小分子HIV-1附着抑制剂IVa在HIV-1感染受试者中的抗病毒活性、安全性和耐受性)G.Hanna，J.Lalezari，J.Hellinger，D.Wohl，T.Masterson，W.Fiske，J.Kadow，P-F.Lin，M.Giordano，R.Colonno，D.Grasela.Abstract J-32，02/11/2004，11th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (CROI)，San Francisco，CA。该研究设计包括首次接触抗逆转录病毒疗法或脱离抗逆转录病毒疗法≥16周的HIV+成人。需要它们的CD4计数≥250细胞)mm3，且需要血浆HIV-1RNA在5,000-500,000c/mL范围。每个剂量组有15名受试者，接受药物：安慰剂患者的比例为4∶1。 
以安慰剂为对照的Iva的序贯研究使用初始剂量组，每12h口服800mg，随后使用第二给药剂量组，每12h口服1800mg。注意，以胶囊形式和与高脂肪餐联合给药以增加暴露和血浆水平很重要。给予研究药物7天，并在第8天的早晨给药。观察受试者14天。 
研究结果(24名患者中的18名接受药物IVa) 
Figure GSA00000095036600171
研究结果(24名患者中的18名接受药物IVa) 
Figure GSA00000095036600172
1.通过从与高脂肪餐联合的800mg给药水平数据可以看到，抗病毒活性明显。但是，仅有58％患者具有＞1.0log病毒负荷下降。在含高脂肪餐的1800mg给药方案中，其中平均反应为-.96log10病毒负荷下 降，看到更强抗病毒反应。当每12小时联合给予800mg和1800mg(和之间)剂量和高脂肪餐时，该数据表明该药物具有明显的抗病毒活性，因此它可在联合疗法中起显著作用。可通过看摘要或从口头报告幻灯片(slides from the oral presentation)得到人用BMS-043最新结果总结：″Antiviral Activity，Safety，and Tolerability of a Novel，OralSmall-Molecule HIV-I Attachment Inhibitor，BMS-488043，inHIV-1-Infected Subjects″(新的口服小分子HIV-1附着抑制剂BMS-488043在HIV-1感染受试者中的抗病毒活性、安全性和耐受性抗病毒)G.Hanna，J.Lalezari，J.Hellinger，D.Wohl，T.Masterson，W.Fiske，J.Kadow，P-F.Lin，M.Giordano，R.Colonno，D.Grasela.AbstractJ-32，02/11/2004，11th Conference on Retroviruses and OpportunisticInfections(CROI)，San Francisco，CA。 
遗憾的是，出于明显的健康原因考虑，每次给予总数9粒200mg胶囊，每天两次并与高脂肪餐联合给予，长期数月给予该药不可行，所以需要在较低剂量下提供增加暴露和消除需要高脂肪餐的新制剂。 
因此，临床数据表明需要在较低剂量下增加该药物的暴露，但不需要高脂肪餐。 
因此，本发明前药的初步数据出乎意料地预示，当不给予高脂肪餐时，在允许药物使用的浓度下，在较低胶囊负担和长期用作抗逆转录病毒疗法成分存在下，它们可增加分子，例如IVa暴露和递送母体药物。 
在给予犬前药Iab(赖氨酸盐)或固体母体分子(IVa)的固体胶囊得到的初步数据归纳在图2的第一个柱状图图2A中。可以看到，给予禁食犬或进食高脂肪餐的犬前药Iab(单赖氨酸盐)后，当与给予母体分子对比，暴露出乎意料地高。如果给予固体母体分子后，任何前药对暴露有明显作用，进食与禁食状态的作用也最小。因此，令人吃惊地，给予前药后，母体分子的暴露表现为不依赖高脂肪餐，它预示给药后暴露水平比母体分子的暴露水平更连贯。图2B中的柱状图总结了前述母体分子IVa在人中的数据，表明分子对高脂肪餐的暴露的依赖性， 在暴露与剂量关系中不按比例增加，并且溶液给药比固体制剂给药的暴露更好。如下所述，这表明在临床前模型中，通过使用磷酸盐(酯)似乎出乎意料地改善的暴露受到溶出速度和吸收速度限制。对于两种其它前药而言，与母体药物相比，使用磷酸盐(酯)前药也在禁食犬中增加暴露。这些实验的细节包含在实验部分。此外，两种其它前药实例在大鼠、犬和猴中的各种研究细节和另两种前药在大鼠中的研究细节证明这些前药在与很可能是治疗和抑制HIV病毒复制功用有关的剂量下，具有增加比母体分子获得的暴露更高的出乎意料的功用。 
引用的参考文献 
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110.Wang，Tao；Wallace，Owen B.；Meanwell，Nicholas A.；Kadow，JohnF.；Zhang，Zhongxing；Yang，Zhong.Bicyclo 4.4.0antiviral derivatives(双环4.4.0抗病毒衍生物)PCT Int.Appl.(2003)，WO 2003092695A1. 
111.Preparation of indolyl-，azaindolyl-，and related heterocyclicsulfonylureido piperazines for treatment of HIV and ADDS(制备治疗HIV和AIDS的吲哚基、氮杂吲哚基和有关杂环磺酰脲基哌嗪).Kadow，John F.；Regueiro-Ren，Alicia；Xue，Qiufen May.PCT Int.Appl.(2003)，WO2004000210A2. 
112.Composition and antiviral activity of substituted azaindolesoxoacetic piperazine derivatives(取代的氮杂吲哚氧代乙酰基哌嗪衍生物组合物及其抗病毒活性).Wang，Tao；Zhang，Zhongxing；Meanwell，Nicholas  A.；Kadow，John F.；Yin，Zhiwei；Xue，Qiufen May；Regueiro-Ren，Alicia；Matiskella，John D.；Ueda，Yasutsugu.U.S.Pat.Appl.Publ.(2004)，US 2004110785A1. 
发明内容
本发明包括式I化合物、它们的药用制剂及其在患有或对病毒例如HIV易感的患者中的用途。式I化合物，包括其药学上可接受的无毒盐具有下式和下述的含义。 
本发明包括式I化合物， 
Figure GSA00000095036600331
其中： 
X是C或N，前提是当X是N时，R1不存在； 
W是C或N，前提是当W是N时，R2不存在； 
V是C； 
R1是氢、甲氧基或卤素； 
R2是氢； 
R3是甲氧基或杂芳基，它们各自可独立任选地被选自G的一个取代基取代；其中杂芳基是三唑基、吡唑基或噁二唑基； 
E是氢或其药学上可接受的单或双盐； 
Y选自 
Figure GSA00000095036600332
R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17各自独立是H或甲基、前提是R10-R17中不超过两个是甲基； 
R18选自C(O)-苯基、C(O)-吡啶基、吡啶基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、1，5-二氮杂萘基(napthyridinyl)、pthalazinyl、氮杂苯并呋喃基和氮杂吲哚基，它们各自可独立任选地被选自以下的1-2个基团取代：甲基、-氨基、-NHMe、-NMe2、甲氧基、羟甲基和卤素； 
D选自氰基、S(O)2R24、卤素、C(O)NR21R22、苯基和杂芳基；其中所述苯基或杂芳基独立任选地被1-3个相同或不同的卤素或选自G的1-3个相同或不同的取代基取代；其中杂芳基选自吡啶基和噁二唑基； A选自苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基和噁唑基，其中所述苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基和噁唑基独立任选地被1-3个相同或不同的卤素或选自G的1-3个相同或不同的取代基取代；G选自(C1-6)烷基、(C1-6)链烯基、苯基、羟基、甲氧基、卤素、-NR23C(O)-(C1-6)烷基、-NR24R25、-S(O)2NR24R25、COOR26和-CONR24R25；其中所述(C1-6)烷基任选被以下基团取代：羟基、二甲氨基或1-3个相同或不同的卤素； 
R26选自氢和(C1-6)烷基； 
R20、R21、R22、R23、R24、R25独立选自氢、(C1-6)烷基和-(CH2)nNR27R28；n是0-6；和 
R27和R28各自独立是H或甲基。 
更优选的实施方案是以上化合物，其中： 
X和W各自是N； 
或以上化合物，其中： 
X是C；和 
W是N。 
另一个优选的实施方案是上述化合物，其中： 
R18是-C(O)-Ph；和 
Y是 
另一个优选的实施方案是上述化合物，其中： 
R3是甲氧基或三唑基；其中所述三唑基任选被一个选自G的取代基取代； 
R10-R17各自是H；和 
G是甲基。 
另一个优选的实施方案是上述化合物，其中：R1是F，和R3是连接在N-1位的1，2，3-三唑基。 
另一个优选的实施方案是上述化合物，其中：R1是OMe，R3是连接在N-1位的3-甲基-1，2，4-三唑基。 
另一个优选的实施方案是上述化合物，其中：R1和R3各自是甲氧基。 
另一个优选的实施方案是上述化合物，其中盐是钠、赖氨酸或氨丁三醇。 
另一个优选的本发明实施方案是药用组合物，它包含抗病毒有效量的式I化合物，包括其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。 
另一个优选的实施方案是可用于治疗HIV感染的以上药用组合物，它还包含选自以下的抗病毒有效量的AIDS治疗药物： 
(a)AIDS抗病毒药物； 
(b)抗感染药物； 
(c)免疫调节剂；和 
(d)HIV进入抑制剂。 
实施方案还包括治疗感染HIV病毒的哺乳动物的方法，包括给予所述哺乳动物抗病毒有效量的式I化合物，包括其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。 
另一个实施方案是上述方法，包括联合给予所述哺乳动物抗病毒有效量的式I化合物(包括其药学上可接受的盐)与抗病毒有效量的AIDS治疗药物，所述AIDS治疗药物选自：AIDS抗病毒药物；抗感染药物；免疫调节剂；和HIV进入抑制剂。 
另一个实施方案是用于制备化合物I的式II中间体化合物， 
Figure GSA00000095036600361
其中： 
X是C或N，前提是当X是N时，R1不存在； 
W是C或N，前提是当W是N时，R2不存在； 
V是C； 
R1是氢、甲氧基或卤素； 
R2是氢； 
R3是甲氧基或杂芳基，它们各自可独立任选地被一个选自G的取代基取代；其中杂芳基是三唑基、吡唑基或噁二唑基； 
L和M独立选自氢、C1-C6烷基、苯基、苄基、三烷基甲硅烷基、-2，2，2-三氯乙氧基和2-三甲基甲硅烷基乙氧基，前提是可为氢的L和M不超过一个； 
Y选自 
Figure GSA00000095036600362
R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17各自独立是H或甲基，前提是R10-R17中不超过2个是甲基； 
R18选自C(O)-苯基、C(O)-吡啶基、吡啶基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、1，5-二氮杂萘基、pthalazinyl、氮杂苯并呋喃基和氮杂吲哚基，它们各自可独立任选地被1-2个选自以下的基团取代：甲基、-氨基、-NHMe、-NMe2、甲氧基、羟甲基和卤素； D选自氰基、S(O)2R24、卤素、C(O)NR21R22、苯基和杂芳基；其中所述苯基或杂芳基独立任选地被1-3个相同或不同的卤素或选自G的1-3个相同或不同的取代基取代；其中杂芳基选自吡啶基和噁二唑基；A选自苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基和噁唑基，其中所述苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基和噁唑基独立任选地被1-3个相同或不同的卤素或选自G的1-3个相同或不同的取代基取代；G选自(C1-6)烷基、(C1-6)链烯基、苯基、羟基、甲氧基、卤素、-NR23C(O)-(C1-6)烷基、-NR24R25、-S(O)2NR24R25、COOR26和-CONR24R25；其中所述(C1-6)烷基任选被羟基、二甲氨基或1-3个相同或不同的卤素取代； 
R26选自氢和(C1-6)烷基； 
R20、R21、R22、R23、R24、R25独立选自氢、(C1-6)烷基和-(CH2)nNR27R28； 
R27和R28各自独立是H或甲基；和 
n是0-6。 
附图说明
图1说明在人临床试验中，化合物IVa的AUC(曲线下面积)与剂量之间的关系。 
图2说明在禁食和进食条件下，化合物IVa和前药Iab在犬和人中的AUC研究。其中图2A说明的是化合物IVa和前药Iab在犬中的AUC研究；图2B说明的是化合物IVa和前药Iab在人中的AUC研究。 
图3说明经口给予大鼠IVc后的AUC与剂量的关系图 
图4说明经口给予大鼠IVc后的Cmax与剂量的关系图 
图5说明经口给予大鼠Ic后，血浆IVc分布图 
图6说明给予雄性大鼠IVa或Iab后，IVa的Cmax与AUC的比较。其中Iab的数据来自单剂量毒理动力学研究，而Iva数据来自2-周探察性口服剂量毒性研究的第一天的结果。Iab的剂量表示为Iva摩尔当量。 
图7说明给予犬IVa或Iab后，IVa的Cmax与AUC的比较。其中Iab的数据来自单剂量毒理动力学和耐受性研究，而Iva数据来自10-天探察性口服剂量毒性研究(剂量20和100mg/kg)或2-周口服剂量毒性研究(剂量200mg/kg)的第一天的结果。Iab的剂量表示为Iva摩尔当量。 
图8说明Iab在人胎盘ALP溶液中水解并形成IVa 
图9说明静脉内和经口给予大鼠Iab后Iab和IVa的血浆浓度与时间关系的分布图，以及来自大鼠的IVa历史数据的血浆浓度与时间关系的分布图 
图10说明静脉内和经口给予犬Iab后的血浆浓度与时间关系的分布图，以及来自犬的IVa历史数据的血浆浓度与时间关系的分布图 
图11说明静脉内和经口给予猴Iab后的血浆浓度与时间关系的分布图，以及来自猴的IVa历史数据的血浆浓度与时间关系的分布图 
图12说明给予雄性大鼠IVb或Ibb后，IVb的Cmax与AUC的比较。其中Ibb和Ivb两者的数据来自单剂量毒理动力学研究。Ibb的剂量表示为IVb摩尔当量。 
图13说明给予犬IVb或Ibb后，IVb的Cmax与AUC的比较。其中Ibb的数据来自单剂量毒理动力学和耐受性研究，而Ivb(BID给药)的数据来自毒理动力学和耐受性研究。Ibb的剂量表示为IVb摩尔当量。 
图14说明Ibb在人胎盘ALP溶液中水解并形成IVb 
图15说明静脉内和经口给予大鼠Ibb后Ibb和IVb的血浆浓度与时间关系的分布图和IVb在大鼠中的历史数据 
图16说明静脉内和经口给予犬Ibb后Ibb和IVb的血浆浓度与时间关系的分布图和IVb在犬中的历史数据 
图17说明静脉内和经口给予猴Ibb后Ibb和IVb的血浆浓度与时间关系的分布图和IVb在猴中的历史数据 
图18说明给予雄性大鼠IVc或Icb后，IVc的Cmax与AUC的比较。其中Icb的数据来自单剂量毒理动力学研究，而Ivc数据来自2-周毒性研究的一日结果。Icb的剂量表示为Ivc摩尔当量。 
图19说明给予犬IVc或Icb后，IVc的Cmax与AUC的比较。其中Icb的数据来自单剂量毒理动力学和耐受性研究，而Ivc数据来自单剂量毒理动力学和耐受性研究。Icb的剂量表示为Ivc摩尔当量。 
图20说明Icb在人胎盘ALP溶液中水解并形成IVc 
图21说明静脉内和经口给予大鼠Icb后，Icb和IVc的血浆浓度与时间关系的分布图和IVc在大鼠中的历史数据 
图22说明静脉内和经口给予犬Icb后，Icb和IVc的血浆浓度与时间关系的分布图和IVc在犬中的历史数据 
图23说明静脉内和经口给予猴Icb后，Icb和IVc的血浆浓度与时间关系的分布图和IVc在猴中的历史数据 
具体实施方式
因为本发明化合物可具有不对称中心，因而出现非对映体和对映体的混合物，本发明包括包括式I化合物的单一非对映体和对映体形式及其混合物。 
定义 
本文和权利要求书中使用的术语“C1-6烷基”(除另有说明外)表示直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。 
“卤素”是指氯、溴、碘或氟。 
“芳基”是指具有完全共轭的pi-电子系统的全碳单环或稠合多环(即共用相邻碳原子对)基团。非限制性芳基的实例是苯基、萘基和蒽基。芳基可被取代或未被取代。当被取代时，优选取代的基团是一个或多个选自以下的基团：烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂脂环氧基、巯基、芳硫基、杂芳硫基、杂脂环硫基(thioheteroalicycloxy)、氰基、卤素、硝基、羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、C-羧基、O-羧基、亚硫酰基、磺酰基、亚磺酰氨基、三卤甲基、脲基、氨基和-NRxRy，其中Rx和Ry独立选自氢、烷基、环烷基、芳基、羰基、C-羧基、磺酰基、三卤甲基和结合的(combined)5元或6元杂脂环。 
本文中使用的“杂芳基”是指环中具有一个或多个选自氮、氧和硫的原子以及具有完全共轭电子系统的单环或稠合环(即共用相邻原子对)基团。除另有所指外，可在杂芳基内的碳或氮原子上连接杂芳基。应注意术语杂芳基意欲包括母核杂芳基的N-氧化物，前提是如同本领域已知的那样，这种N-氧化物是化学上可行的。杂芳基的非限制性实例是呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、噻唑基、咪唑基、噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、苯并噻唑基、三唑基、四唑基、异噁唑基、异噻唑基、吡咯基、吡喃基、四氢吡喃基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、喹啉 基、异喹啉基、嘌呤基、咔唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、吲哚基、异吲哚基、吡嗪基、二嗪基、吡嗪、三嗪基三嗪、四嗪基和四唑基。当被取代时，优选被取代的基团是一个或多个选自以下的基团：烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂脂环氧基、巯基、芳硫基、杂芳硫基、杂脂环硫基、氰基、卤素、硝基、羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、C-羧基、O-羧基、亚硫酰基、磺酰基、亚磺酰氨基、三卤甲基、脲基、氨基和-NRxRy，其中Rx和Ry定义同上。 
本文中使用的“杂脂环”基是指环中具有一个或多个选自氮、氧和硫的原子的单环或稠合环基团。环选自提供稳定键排列且不应存在不可能完成(encomplish)的系统的那些环。这些环也可具有一个或多个双键。但是，这些环没有完全共轭的pi-电子系统。杂脂环基的非限制性实例是氮杂环丁烷基、哌啶基、哌嗪基、咪唑啉基、噻唑烷基、3-吡咯烷-1-基、吗啉基、硫代吗啉基和四氢吡喃基。当被取代时，优选取代的基团是一个或多个选自以下的基团：烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂脂环氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、杂脂环硫基、氰基、卤素、硝基、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰胺基、C-硫代酰胺基、N-酰胺基、C-羧基、O-羧基、亚硫酰基、磺酰基、亚磺酰氨基、三卤甲基亚磺酰氨基、三卤甲磺酰基、甲硅烷基、脒基、胍基、脲基、膦酰基、氨基和-NRxRy，其中Rx和Ry定义同上。 
“烷基”是指包括直链和支链基团的饱和脂烃。优选烷基具有1-20个碳原子(当数目范围；例如在本文中称为″1-20″时，表示在该情形中，烷基可以含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等至最高达20(含20)个碳原子)。更优选，它是具有1-10个碳原子的中等大小的烷基。最优选，它是具有1-4个碳原子的低级烷基。烷基可被取代或未被取代。当被取代时，优选取代基为一个或多个独自选自以下的基 团：三卤烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂脂环氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、杂脂环硫基、氰基、卤素、硝基、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰胺基、C-硫代酰胺基、N-酰胺基、C-羧基、O-羧基、亚硫酰基、磺酰基、亚磺酰氨基、三卤甲基亚磺酰氨基、三卤甲磺酰基和结合的5元或6元杂脂环。 
“环烷基”是指全碳单环或稠合环(即共用相邻碳原子对的环)基团，其中一个或多个环不具有完全共轭的pi电子系统。环烷基的非限制性实例是环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己烷、环己二烯、环庚烷、环庚三烯和金刚烷。环烷基可被取代或未被取代。当取代时，优选取代基是独自选自以下的一个或多个基团：烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂脂环氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、杂脂环硫基、氰基、卤素、硝基、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰胺基、C-硫代酰胺基、N-酰胺基、C-羧基、O-羧基、亚硫酰基、磺酰基、亚磺酰氨基、三卤甲基亚磺酰氨基、三卤甲磺酰基、甲硅烷基、脒基、胍基、脲基、膦酰基、氨基和-NRxRy，Rx和Ry定义同上。 
“链烯基”是指由至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键组成的定义同本文的烷基。 
“炔基”是指由至少两个碳原子和至少一个碳-碳三键组成的定义同本文的烷基。 
“羟基”是指-OH基团。 
“烷氧基”是指-O-烷基和-O-环烷基，烷基和环烷基定义同本文。 
“芳氧基”是指-O-芳基和-O-杂芳基，芳基和杂芳基定义同本文。 
“杂芳氧基”是指杂芳基-O-基，杂芳基定义同本文。 
“杂脂环氧基”是指杂脂环-O-基，杂脂环基定义同本文。 
“巯基”是指-SH基团。 
“烷硫基”是指S-烷基和-S-环烷基，烷基和环烷基定义同本文。 
“芳硫基”是指-S-芳基和-S-杂芳基，芳基和杂芳基定义同本文。 
“杂芳硫基”是指杂芳基-S-基团，杂芳基定义同本文。 
“杂脂环硫基”是指杂脂环-S-基团，杂脂环基定义同本文。 
“羰基”是指-C(＝O)-R″基团，其中R″选自氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基(通过环碳连接)和杂脂环基(通过环碳连接)，各自定义同本文。 
“醛”基团是指羰基，其中R″是氢。 
“硫代羰基”是指-C(＝S)-R″基团，R″定义同本文。 
“酮基”是指-CC(＝O)C-基团，其中在C＝O的任一一端或两端上的碳可以是烷基、环烷基、芳基或杂芳基或杂脂环基的碳。 
“三卤甲基羰基”是指Z3CC(＝O)-基团，所述Z是卤素。 
“C-羧基”是指-C(＝O)O-R″基团，R″定义同本文。 
“O-羧基”是指R″C(＝O)O-基团，R″定义同本文。 
“羧酸”基团是C-羧基，其中R″是氢。 
“三卤甲基”是指-CZ3基团，其中Z是定义同本文的卤素。 
“三卤甲磺酰基”是指Z3CS(＝O)2-基团，Z定义同本文。 
“三卤甲基亚磺酰氨基”是指Z3CS(＝O)2NRx-基团，Z和Rx定义同本文。 
“亚硫酰基”是指-S(＝O)-R″基团，R″定义同本文，此外，R″仅为键；即-S(O)-。 
“磺酰基”是指-S(＝O)2R″基团，R″定义同本文，此外，R″仅为键；即-S(O)2-。 
“S-亚磺酰氨基”是指-S(＝O)2NRxRy，Rx和Ry定义同本文。 
“N-亚磺酰氨基”是指R″S(＝O)2NRx-基团，Rx定义同本文。 
“O-氨基甲酰基”是指定义同本文的-OC(＝O)NRxRy。 
“N-氨基甲酰基”是指RxOC(＝O)NRy基团，Rx和Ry定义同本文。 
“O-硫代氨基甲酰基”是指-OC(＝S)NRxRy，Rx和Ry定义同本文。 
“N-硫代氨基甲酰基”是指RxOC(＝S)NRy-基团，Rx和Ry定义同本文。 
“氨基”是指-NH2基团。 
“C-酰胺基”是指-C(＝O)NRxRy基团，Rx和Ry定义同本文。 
“C-硫代酰胺基”是指-C(＝S)NRxRy基团，Rx和Ry定义同本文。 
“N-酰胺基”是指RxC(＝O)NRy-基团，Rx和Ry定义同本文。 
“脲基”是指-NRxC(＝O)NRyRy2基团，Rx和Ry定义同本文，Ry2定义同Rx和Ry。 
“硫脲基”是指-NRxC(＝S)NRyRy2基团，Rx和Ry定义同本文，Ry2定义同Rx和Ry。 
“胍基”是指-RxNC(＝)NRyRy2基团，Rx、Ry和Ry2定义同本文。 
“脒基”是指RxRyNC(＝N)-基团，Rx和Ry定义同本文。 
“氰基”是指-CN基团。 
“甲硅烷基”是指-Si(R″)3，R″定义同本文。 
“膦酰基”是指P(＝O)(ORx)2，Rx定义同本文。 
“肼基”是指-NRxNRyRy2基团，Rx、Ry和Ry2定义同本文。 
任何两相邻R基团可结合形成新的芳基、环烷基、杂芳基或与初始具有那些R基团的环稠合的杂环。 
在本领域中已知杂芳基系统中的氮原子可以“参与杂芳环双键”，这是指包含5元环杂芳基的两种互变异构结构中的双键形式。如本领域化学技术人员所理解的那样，这决定氮是否可被取代。本发明说明书和权利要求书根据已知化学键合的普通原则。应理解，按照文献权利要求不包括已知不稳定或不能够存在的结构。 
本文中公开的前药化合物的生理上可接受的盐在本发明范围内。本文和权利要求书中使用的术语“药学上可接受的盐”意欲包括无毒碱加成盐。本文中使用的术语“药学上可接受的盐”还意欲包括酸基盐，例如羧酸盐或磷酸盐或含此类相反离子如铵的磷酸单酯；碱金属 盐，尤其钠或钾盐；碱土金属盐，尤其钙或镁盐；过渡金属盐，例如锌盐和含适宜有机碱，例如低级烷基胺(甲胺、乙胺、环己胺等)或与取代的低级烷基胺(例如羟基-取代的烷基胺，例如二乙醇胺、三乙醇胺或单氨丁三醇(又称为TRIS或2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1，3-二醇)三(羟甲基)-氨基甲烷)、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、N-甲基葡糖胺所成的盐或与碱，例如哌啶或吗啉所成的盐。应理解，当分离为固体或结晶形式时，药学上可接受的盐还包括捕获在生成的化合物I物质中的水合物或水分子。本领域技术人员熟知化学计量可能性。有关药学上可接受的盐和可能的盐的目录的论述包含在以下参考文献中：Preparation of water-soluble compounds through salt formation(通过形成盐制备水溶性化合物).Stahl，P.Heinrich.Cosmas Consult，Freiburgim Breisgau，Germany.Editor(s)：Wermuth，Camille Georges.Practice ofMedicinal Chemistry(2nd Edition)(2003)，601-615.Publisher：Elsevier，London，UK CODEN：69EOEZ. 
Handbook of pharmaceutical salts：properties，selection，and use by Stahl，P.Heinrich，Wermuth，Camille G.，International Union of Pure andApplied Chemistry.Weinheim；New York：VHCA；Wiley-VCH，2002. 
在本发明的另一方面，公开新的磷酸酯中间体化合物II 
Figure GSA00000095036600451
在磷酸酯的情形中，可能存在单酯和双酯，两者均包括在本发明内。 
在本发明的方法中，术语“抗病毒有效量”表示足以出现有意义的患者利益，即特征在于抑制HIV感染的急性病症治愈的该方法中各活性成分的总量。当使用单一活性成分，单独给药时，该术语指单独的该成分。当联合使用时，该术语是指无论以复方制剂、序贯或同时给药，均能产生疗效的活性成分的加和量。在说明书和权利要求书中使用的术语“治疗、医治、处理”表示预防或缓解与HIV感染有关的疾病。 
本发明还涉及所述化合物与一种或多种可用于治疗AIDS的药物联合。例如，无论在暴露前和/或暴露后期间，可有效给予与本发明化合物联合使用的有效量的AIDS抗病毒药物、免疫调节剂、抗感染药物或疫苗，例如在下表中的那些。 
抗病毒药物 
Figure GSA00000095036600461
Figure GSA00000095036600471
Figure GSA00000095036600481
Figure GSA00000095036600491
免疫调节剂 
  药物名称   生成厂家   适应证
  AS-101   Wyeth-Ayerst   AIDS
  溴匹立明   Pharmacia Upjohn   晚期AIDS
  醋孟南   Carrington Labs，Inc.  (Irving，TX)   AIDS、ARC
  CL246，738   American Cyanamid  Lederle Labs   AIDS、卡波济氏肉瘤
  FP-21399   Fuki ImmunoPharm   阻滞HIV与CD4+细胞  融合
  γ干扰素   Genentech   ARC，与w/TNF(肿瘤坏  死因子)联用
  粒细胞巨噬细胞集落刺  激因子   Genetics Institute Sandoz   AIDS
  粒细胞巨噬细胞集落刺  激因子   Hoechst-Roussel Immunex   AIDS
  粒细胞巨噬细胞集落刺  激因子   Schering-Plough   AIDS，与w/AZT联合
  HIV核心颗粒免疫刺激  剂   Rorer   血清反应阳性HIV
  IL-2  白介素-2   Cetus   AIDS，与w/AZT联合
  IL-2  白介素-2   Hoffman-LaRoche  Immunex   AIDS、ARC、HIV，与  w/AZT联合
  IL-2  白介素-2(阿地白介素)   Chiron   AIDS，增加CD4细胞计  数
  免疫球蛋白  静脉内(人)   Cutter Biological  (Berkeley，CA)   儿科AIDS，与w/AZT联  合
  IMREG-1   Imreg  (New Orleans，LA)   AIDS、卡波济氏肉瘤、  ARC、PGL
  IMREG-2   Imreg  (New Orleans，LA)   AIDS、卡波济氏肉瘤、  ARC、PGL
  依木巯；二乙基二巯基氨  基甲酸酯   Merieux Institute   AIDS、ARC
  α-2干扰素   Schering Plough   卡波济氏肉瘤、w/AZT、  AIDS
  Methionine-Enkephalin   TNI Pharmaceutical  (Chicago，IL)   AIDS、ARC
  MTP-PE胞壁酰三肽   Ciba-Geigy Corp.   卡波济氏肉瘤
  粒细胞集落刺激因子   Amgen   AIDS，与w/AZT联用
  Remune   Immune Response Corp.   免疫治疗
  rCD4重组可溶人CD4   Genentech   AIDS、ARC
  rCD4-IgG杂交   AIDS、ARC
  重组可溶性人CD4   Biogen   AIDS、ARC
  α-2a干扰素   Hoffman-La Roche   卡波济氏肉瘤AIDS、  ARC，与w/AZT联合
  SK&Fl06528  可溶性T4   Smith Kline   HIV感染
  胸腺喷丁   Immunobiology  Research  Institute(Annandale，NJ)   HIV感染
  肿瘤坏死因子；TNF   Genentech   ARC；与w/γ干扰素联用
抗感染药 
  药物名称   生成厂家   适应证
  克林霉素加伯氨奎   Pharmacia Upjohn   PCP
  氟康唑   Pfizer   隐球菌脑膜炎、念珠菌病
  锭剂/制菌锭剂   Squibb Corp.   预防口念珠菌病
  盐酸依氟鸟氨酸注射剂/  依氟鸟氨酸   Merrell Dow   PCP
  喷他脒/依西酸盐(酯)(IM  &IV)   LyphoMed  (Rosemont，IL)   PCP治疗
  甲氧苄啶   抗菌剂
  甲氧苄啶/磺胺药   抗菌剂
  吡屈克辛   Burroughs Wellcome   PCP治疗
  吸入用喷他脒/依西酸盐  (酯)   Fisons Corporation   PCP预防
  螺旋霉素   Rhone-Poulenc  diarrhea   隐胞子菌腹泻  (cryptosporidial)
  Intraconazole-R51211   Janssen-Pharm.   网状内皮细胞真菌病；隐  球菌脑膜炎
  三甲屈沙   Warner-Lambert   PCP
  柔红霉素   NeXstar，Sequus   卡波济氏肉瘤
  重组人红细胞生成素   Ortho Pharm.Corp.   与AZT疗法有关的严重  贫血
  重组人生长激素   Serono   与AIDS有关的消瘦，恶  病质
  醋酸甲地孕酮   Bristol-Myers Squibb   治疗与W/AIDS有关的  厌食
  睾酮   Alza，Smith Kline   与AIDS有关的消瘦
  总肠营养   Norwich Eaton  Pharmaceuticals   与AIDS有关的腹泻和吸  收不良
另外，本发明化合物可与其它类治疗AIDS的称为HIV进入抑制剂的药物联用。此类HIV进入抑制剂的实例在DRUGS OF THE FUTURE 1999，24(12)，第1355-1362页；CELL，第9卷，第243-246页，10月29日，1999；和DRUG DISCOVERY TODAY，第5卷，第5期，2000年5月，第183-194页和Inhibitors of the entry of HIV into host cells(进入宿主细胞的HIV进入抑制剂).Meanwell，Nicholas A.；Kadow，John F.Current Opinion in Drug Discovery&Development(2003)，6(4)，451-461中有论述。尤其是，这些化合物可与其它针对CCR5或CXCR4辅受体(coreceptor)的附着抑制剂、融合抑制剂和趋化因子受体拮抗剂联合使用。 
可以理解本发明化合物与抗AIDS病毒药物、免疫调节剂、抗感染药物、HIV进入抑制剂或疫苗联合的范围不限于上表目录，但原则上包括与任何用于治疗AIDS的药用组合物的任何联合。 
优选的组合是用本发明化合物和HIV蛋白酶抑制剂和/或HIV逆转录酶的非核苷抑制剂同时或交替治疗。任选的组合中的第四种成分是HIV逆转录酶的核苷抑制剂，例如AZT、3TC、ddC或ddl。优选的HIV蛋白酶抑制剂是 (活性成分是Atazanavir)。通常，给予300-600mg，每天一次。它可与低剂量的利脱那韦(50-500mg)联合给予。另一个优选的HIV蛋白酶抑制剂是 
Figure GSA00000095036600522
另一个有效的HIV蛋白酶抑制剂是茚地那韦，它是N-(2(R)-羟基-1-(S)-茚基)-2(R)-苯甲基-4-(S)-羟基-5-(1-(4-(3-吡啶基-甲基)-2(S)-N′-(叔丁基甲酰氨基)-哌嗪基))-戊酰胺乙醇盐的硫酸盐，根据美国专利5,413,999合成。通常给予茚地那韦的剂量是800mg，每天三次。其它优选的蛋白酶抑制剂是奈非那韦和利托那韦。另一个优选的HIV蛋白酶抑制剂是沙奎那韦，它的给药剂量是600或1200mg tid。优选的HIV逆转录酶的非核苷抑制剂包括依法韦仑。制备ddC、ddl和AZT的方法还在EPO0,484,071中有阐述。这些联合可能对限制HIV感染程度和传播具有意料之外的效果。优选的组合包括以下那些组合：(1)茚地那韦和依法韦仑和任选AZT和/或3TC和/或ddl和/或ddC；(2)茚地那韦和任一AZT和/或ddl和/或ddC和/或3TC，尤其，茚地那韦和AZT和3TC； (3)司他夫定和3TC和/或齐多夫定；(4)齐多夫定和拉米夫定和141W94和1592U89；(5)齐多夫定和拉米夫定。 
在此类联合中，可分别或联合给予本发明化合物和其它活性药物。此外，可在给予其它药物之前、同时或随后给予一种成分。 
缩写 
以下缩写的大多数是本领域技术人员熟知的常用缩写，其用于本发明说明书和实施例中。某些使用的缩写如下： 
h＝小时 
r.t.＝室温 
mol＝摩尔 
mmol＝毫摩尔 
g＝克 
mg＝毫克 
mL＝毫升 
TFA＝三氟乙酸 
DCE＝1，2-二氯乙烷 
CH2Cl2＝二氯甲烷 
TPAP＝过钌酸四丙基铵 
THF＝四氢呋喃 
DEPBT＝3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮 
DMAP＝4-二甲基氨基吡啶 
P-EDC＝聚合物荷载的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 
EDC＝1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 
DMF＝N，N-二甲基甲酰胺 
Hunig′s碱＝N，N-二异丙基乙胺 
MCPBA＝间-氯过苯甲酸 
氮杂吲哚＝1H-吡咯并吡啶 
4-氮杂吲哚＝1H-吡咯并[3，2-b]吡啶 
5-氮杂吲哚＝1H-吡咯并[3，2-c]吡啶 
6-氮杂吲哚＝1H-吡咯并[2，3-c]吡啶 
7-氮杂吲哚＝1H-吡咯并[2，3-b]吡啶 
4，6-二氮杂吲哚＝5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶 
5，6-二氮杂吲哚＝1H-吡咯并[2，3-d]哒嗪 
5，7-二氮杂吲哚＝7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 
PMB＝4-甲氧基苄基 
DDQ＝2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌 
OTf＝三氟甲sulfonoxy 
NMM＝4-甲基吗啉 
PIP-COPh＝1-苯甲酰基哌嗪 
NaHMDS＝六甲基二硅烷叠氮化钠(hexamethyldisilazide) 
EDAC＝1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 
TMS＝三甲基甲硅烷基 
DCM＝二氯甲烷 
DCE＝二氯乙烷 
MeOH＝甲醇 
THF＝四氢呋喃 
EtOAc＝乙酸乙酯 
LDA＝二异丙氨基化锂 
TMP-Li＝2，2，6，6-四甲基哌啶基锂 
DME＝二甲氧基乙烷 
DIBALH＝氢化二异丁基铝 
HOBT＝1-羟基苯并三唑 
CBZ＝苄氧基羰基 
PCC＝氯甲酸吡啶鎓 
TRIS＝氨丁三醇或2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1，3-二醇 
化学 
本发明包括式I化合物，它们的药用制剂及其在患有或对HIV感染易感的患者中的用途。 
流程A描述由母体分子IV制备本发明前药I的方法的总览。 
流程A 
Figure GSA00000095036600551
流程B 
为详细描述流程A所示方法，在适宜的碱，例如氢化钠、氢化钾、氨基化钠、叔丁醇钠、(二(三甲基)甲硅烷基)氨基化钠、(二(三甲基)甲硅烷基)氨基化钾或其组合，例如氢化钠和二(三甲基甲硅烷基)氨基化钠的存在下，通过用氯化物中间体III进行N-烷基化，将目的抗病毒母体化合物IV转化为磷酸酯中间体II。制备试剂III和用于通过使羟基烷基化制备前药的方法在Y.Ueda等的美国专利6,362,172B2中有阐述，通过引用全文结合道本文中。尽管本发明人在吲哚环而非羟基上使氮杂吲哚烷基化，但烷基化条件、保护基团、除去保护基团和形成盐的条件一般而言适用于本发明申请。在本申请中，可使用1.1-5.0当量碱，优选2-4当量。根据底物，可使用1.1至最高达12当量试剂III，优选5-10当量。可一次性加入该试剂，或在一定时间内分次逐步加入。通常，将碘化物源加入反应物，以提高收率。优选元素碘为碘化物源。通常，每当量烷基化的氮杂吲哚/吲哚NH加入0.1-1.5当量碘，优选1.0-1.2当量碘，因为收率最高。其它碘化物源包括例如碘化钠、碘化锂、碘化铯、碘化亚铜或碘化四丁铵。碘的功能可能是由氯甲基试剂III原位产生相应的碘甲基试剂IIIa。对应于III的碘或溴试 剂可直接用于代替氯化物III的反应。烷基化反应步骤A通常在惰性有机溶剂，例如四氢呋喃中，在约0℃-50℃，更优选20°-40℃下进行。也可使用其它无水有机溶剂，例如甲基四氢呋喃、甲基叔丁基醚、二噁烷、乙二醇二甲醚、二甲基乙酰胺或N，N-二甲基甲酰胺。然后使酯中间体II经过常规脱保护步骤，除去保护基团Pr。用于该步骤的试剂取决于使用的保护基团，但本领域技术人员是熟知的。最优选的保护基团是可在适当的惰性有机溶剂中，用三氟乙酸、盐酸或甲酸除去的叔丁基。惰性溶剂可以是二氯甲烷，或可以是例如二氯乙烷、甲苯或三氟甲苯。在二氯甲烷、三氟乙酸中，在0°-40°温度下，可用1-15当量酸(或该酸在溶剂中可另测为例如5％(体积)溶液)酸完成脱保护。一般而言，使用的过量TFA越多，加热的温度越低。具体条件根据底物而定。步骤3阐述分离游离酸或可通过多种本领域中熟知的标准方法形成的盐。通常，TFA脱保护后，使用水溶液后处理，其中过量酸用碱中和，通过用有机溶剂，例如乙酸乙酯或二氯甲烷萃取除去有机杂质。例如，可用过量NaOH水溶液碱化反应混合物。本领域技术人员熟知此。用1N HCl水溶液将水相再酸化至pH 2.5，然后用有机溶剂提取，真空除去溶剂后，可得到游离酸。通过加入适当的碱溶液可将游离酸转化为无机盐，碱溶液中的溶剂例如是水、甲醇、乙醇等。例如，将碳酸钠加入磷酸盐(酯)前药水溶液中，将pH调至约7.6，得到溶液，通过冷冻将其中的水除去，得到前药的二钠盐。可同样使用碳酸钾。可同样使用碳酸氢钠或碳酸氢钾水溶液。可通过用2-乙基己酸钾或钠小心滴定磷酸溶液得到单钾或单钠盐。可通过将游离酸溶于有机溶剂，例如乙酸乙酯或乙腈，或低分子量醇或这些任选含水的溶剂的混合物中得到胺盐。潜在可用于形成盐的某些胺包括：低级烷基胺(甲胺、乙胺、环己胺等)或取代的低级烷基胺(例如羟基-取代的烷基胺，例如二乙醇胺、三乙醇胺或三(羟甲基)-氨基甲烷)、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、N-甲基葡糖胺；或碱，例如哌啶或吗啉。在低温下，将胺缓慢加入搅拌的溶液中，可得到二胺盐的任一单盐，这取决于化学计量。 也可通过搅拌溶液，真空除去溶剂而非结晶或沉淀得到胺盐。重结晶方法根据化合物和盐而定，但都是本领域技术人员可利用的方法。流程B描述实施流程A中所示总顺序而优选的试剂和条件的顺序和设置。可使用实施步骤C的顺序的备选方法和在多种情形中优选的方法，它们包括使双酯脱保护，原位得到中间体酸，随后在反应溶媒中形成盐。例如，将双酯II在水和水可溶混的助溶剂，例如丙酮、甲醇、乙醇或异丙醇的混合物中加热，可得到在反应溶媒中(原位)的I的游离酸。优选的溶剂是丙酮和异丙醇。可使用环境至溶剂沸点的温度。通常，40°-60℃是优选的范围。将碱或更优选上述胺加入含在水和助溶剂中的游离酸的反应混合物中，可直接得到盐。如果选择适当的条件，可直接从反应溶媒中结晶或沉淀盐，通过过滤和干燥分离。具体的实例包含在实验部分。 
优选的制备中间体IIa、IIb和IIc和酸Iac、Ibc和Ic的方法提供多种明显的优势，它们优于探索研究早期使用的制备IIa、IIb和IIc的方法。开始发现的制备所有三种中间体II的路线要制备磷酸二叔丁酯氯甲酯，它需要使用相对昂贵的磷酸四丁铵二叔丁酯，它与10倍过量的昂贵和潜在危险的氯碘代甲烷反应。真空除去过量的挥发物和碘代甲烷，得到使用时无须进一步纯化的粗试剂。用至少5倍过量的该试剂与化合物IV反应，意味着与IVa、b或c的量相比，使用至少5当量磷酸四丁铵和50当量氯碘代甲烷。此外，用该试剂完成化合物IV的烷基化，用NaH碱和碘添加物促进烷基化。这些条件产生含主要产物为需要的化合物II和可用硅胶层析除去的副产物的反应混合物，硅胶层析是冗长的费时的昂贵操作，在大规模反应中尤其如此。不除去副产物会在除去保护基团的下一步中产生产物I，该产物含有非常难以用具有合理的收率或时间框架的满意的方法除去的杂质。 
与其它反应剂氯甲基磺酰氯相比，改进的制备磷酸二叔丁酯氯甲酯的方法使用较便宜的二叔丁基磷酸钾和仅约2倍过量的该试剂。通 过便利的蒸馏，将通过该方法制备的磷酸二叔丁基酯氯甲酯分离为纯净形式。 
为将IVa转化为IIa，仅用1.2当量该试剂使化合物IV烷基化。此外，与DMSO联合使用活性较小的廉价碱碳酸钾完成烷基化，其中得到的化合物II基本上不含副产物，它们可不经层析纯化用于脱保护反应。例如，可由按该方法制备的无须层析的纯净形式的IIa得到游离酸Iac或盐，例如Iab。 
为合成比IVa反应慢的化合物IIb和IIc，使用2-2.5当量磷酸二叔丁酯氯甲酯和修饰条件(在溶剂中的碳酸铯作为碱和KI、NMP)使IVb和IVc中的任一烷基化，分别实现高度转化为IIb和IIc。 
新条件还提供足够纯度的化合物II，使它们无须层析纯化即可用于产生化合物I。因此，新条件减少制备本发明化合物I所需的试剂量和化学计量并避免需要层析纯化中间体II的步骤。制备磷酸二叔丁酯氯甲酯所用的原料更廉价且危害较小，得到的终产物纯度更高。最后，开发烷基化IVa、IVb和IVc的条件省去需要活性的易燃的一直过量使用的氢化钠碱和使用碳酸钾或碳酸铯。 
在烷基化的步骤中，可使用适宜的碱，例如M2CO3(M是锂、钠、钾、铷或铯)。为使IVa转化为IIa，优选K2CO3(1-5摩尔当量，优选2摩尔当量/1mol IVa)。为使IVb转化为IIb或使IVc转化为IIc，优选碳酸铯。 
还需要适宜的溶剂，例如二甲基亚砜、N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、N-甲基吡咯烷酮、甲酰胺、四氢呋喃等(2-50ml/g IV，优选5ml/g)；在IVa转化为IIa时，优选二甲基亚砜；在IVb转化为IIb或IVc转化为IIc时，优选N-甲基吡咯烷酮。 
适宜的溶剂碘源包括但不限于MI(M是例如锂、钠、钾、碘、四丁铵等)；优选碘化钾(0.1-5摩尔当量/1mol化合物IV；优选2当量)。 
磷酸二叔丁酯氯甲酯烷化剂可按1-10摩尔当量/1mol IV使用；但优选约1.2mol当量。 
反应温度可以是10-60℃(优选30℃)。 
在脱保护的步骤中，当从IIa中除去两个叔丁基形成Iac时，该步骤在适宜的溶剂，例如二氯甲烷(优选)、二氯乙烷、氯仿、四氯化碳、甲苯、苯等(2-50ml/1g IV，优选10ml/g)存在下进行。 
为使IIb和IIc脱去保护，分别得到Ibc和Ic，在约40℃温度下，在丙酮/水中完成该过程。 
此外，在IIa脱保护期间，优选在酸，例如三氟盐酸(优选)，盐酸、硫酸、硝酸等(基于IVa，2-100mol当量，优选15mol当量)的存在下。 
化学 
总则： 
其它制备原料和前体的方法包含在2002年11月5日授予Wang等的美国专利6,476,034中，通过引用全文结合到本文中。 
在Shimadzu LC-10AS液体色谱仪上，用SPD-10AV UV-Vis检测器记录所有液体色谱(LC)数据，用LC Micromass Platform，按电喷雾模式测定质谱(MS)数据。 
LC/MS方法(即化合物鉴定) 
柱A：YMC ODS-A S7 3.0×50mm柱 
柱B：PHX-LUNA C18 4.6×30mm柱 
柱C：XTERRA ms C18 4.6×30mm柱 
柱D：YMC ODS-A C18 4.6×30mm柱 
柱E：YMC ODS-A C18 4.6×33mm柱 
柱F：YMC C18S54.6×50mm柱 
柱G：XTERRA C18S7 3.0×50mm柱 
柱H：YMC C18S54.6×33mm柱 
柱I：YMC ODS-A C18S73.0×50mm柱 
柱J：XTERRA C-18S54.6×50mm柱 
柱K：YMC ODS-A C184.6×33mm柱 
柱L：Xterra MS C185μM 4.6×30mm柱 
柱M：YMC ODS-A C18S34.6×33mm柱 
标准LC运行条件(使用，除另有说明外)： 
梯度：100％溶剂A/0％溶剂B-0％溶剂A/100％溶剂B 
溶剂A＝10％MeOH-90％H2O-0.1％TFA，溶剂B＝90％MeOH- 
10％H2O-0.1％TFA；Rt以min计。 
梯度时间：2分钟 
持续时间：1分钟 
流速：5mL/min 
检测器波长：220nm 
溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％三氟乙酸 
溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％三氟乙酸 
备选LC运行条件B： 
梯度：100％溶剂A/0％溶剂B-0％溶剂A/100％溶剂B 
溶剂A＝10％MeOH-90％H2O-0.1％TFA，溶剂B＝90％MeOH- 
10％H2O-0.1％TFA；Rt以min计。 
梯度时间：4分钟 
持续时间1分钟 
流速：4mL/min 
检测器波长：220nm 
溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％三氟乙酸 
溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％三氟乙酸 
将制备型HPLC纯化的化合物在MeOH(1.2mL)中稀释，用以下方法，用检测器(SPD-10AV UV-VIS)波长和同上溶剂系统(A和B)，在Shimadzu LC-10A自动制备型HPLC系统或在Shimadzu LC-8A自动制备型HPLC系统上纯化。 
制备型HPLC方法(即纯化化合物) 
制备方法：20分钟内，初始梯度(40％B，60％A)泵至最终梯度(100％B，0％A)，保持3分钟(100％B，0％A) 
溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％三氟乙酸 
溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％三氟乙酸 
柱：YMC C18S520×100mm柱 
检测波长：220nm 
对于以下实验方法，使用以下标准方法的HPLC条件或改进：常用LC纯化的HPLC条件： 
在254nm处检测；梯度0-100％B/A；A 10％CH3CN-90％H2O-0.1％TFA，B 90％CH3CN-10％H2O-0.1％TFA；梯度时间4min；柱YMCODS-AQ或ORD-A 4.6×50mm 3微米。 
用于LC/MS分析的HPLC条件： 
柱J：XTERRAC-18S54.6x50mm柱，梯度：100％溶剂A/0％溶剂B-0％溶剂A/100％溶剂B 
溶剂A＝10％MeOH-90％H2O-0.1％TFA，溶剂B＝90％MeOH-10％H2O-0.1％TFA；Rt以min计；梯度时间：3分钟；流速：4mL/min；检测波长：220nm 
原料可从市场上购买或用文献方法制备。 
制备母体化合物IV： 
以前制备母体化合物IV的方法在下文中阐述，通过引用如下全文结合到本文中： 
2002年10月22日授予W.S.Blair等的美国专利6,469,006； 
2002年11月5日授予Wang等的美国专利6,476,034； 
2003年6月3日授予Meanwell等的美国专利6,573,262； 
J.Kadow等2003年7月30日提交的美国专利序列号10/630,278；它是2002年8月7日提交的美国专利序列号10/214,982的部分继续申 请，美国专利序列号10/214,982是2002年1月2日提交的美国专利序列号10/038,306的部分继续申请，它对应于2002年8月15日公布的2002年1月2日提交的PCT WO 02/062423； 
Yeung等2004年6月18日提交的美国专利序列号10/871,931； 
Wang等2004年1月21日提交的美国专利序列号10/762,108； 
对应于2004年5月27日公布的PCT WO 2004/043337。 
以下提供选择的详细方法： 
制备用于制备母体化合物IV的中间体的典型方法 
1)制备氮杂吲哚1 
Figure GSA00000095036600631
制备氮杂吲哚，方法A：制备7-氯-6-氮杂吲哚1e：将2-氯-3-硝基吡啶22e(5.0g)溶于无水THF(200ml)。溶液冷却至-78℃后，加入过量乙烯基镁化溴(1.0M的THF溶液，100ml)。然后，将反应物在-20℃下保持8小时，然后用20％NH4Cl(150ml)猝灭。用EtOAc(3x 150ml)萃取水相。合并的有机层经MgSO4干燥。过滤和浓缩后，粗产物经硅胶柱层析纯化，得到1.5g 7-氯-6-氮杂吲哚Ie，收率31％。以下阐述化合物5an、IVa和5ap。 
Figure GSA00000095036600632
化合物1am，通过使用与氮杂吲哚Ie相同的方法制备4-溴-7-氯-6-氮杂吲哚(黄色固体)，但使用的原料是5-溴-2-氯-3-硝基吡啶 (Aldrich，Co.有售)。MS m/z：(M+H)+C7H5BrClN2的理论值：230.93；实测值231.15。HPLC保留时间：1.62分钟(柱B)。 
Figure GSA00000095036600641
化合物1an(4-甲氧基-7-氯-6-氮杂吲哚)和化合物1ao(4，7-二甲氧基-6-氮杂吲哚)：在密封管中，将4-溴-7-氯-6-氮杂吲哚(1g)、CuI(0.65g)和NaOMe(4ml，25％)在MeOH(16ml)中的混合物在110-120℃下加热16小时。冷却至环境温度后，用1N HCl将反应混合物中和至pH 7。用EtOAc(3×30ml)萃取水溶液。然后合并的有机层经MgSO4干燥，真空浓缩，得到残留物，经硅胶(50g)层析纯化，用1∶7的EtOAc∶己烷作洗脱液。(柱体积：20mm×30cm)，得到0.3g 4-甲氧基-7-氯-6-氮杂吲哚(白色固体)和0.1g 4，7-二甲氧基-6-氮杂吲哚(白色固体)。 
化合物1an(4-甲氧基-7-氯-6-氮杂吲哚)。MS m/z：(M+H)+C8H8ClN2O的理论值：183.03；实测值183.09.HPLC保留时间：1.02分钟(柱B)。 
化合物1ao(4，7-二甲氧基-6-氮杂吲哚)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.28(m，2H)，6.63(m，1H)，4.14(s，3H)，3.95(s，3H)。MS m/z：(M+H)+C9H11N2O2的理论值：179.08；实测值179.05。HPLC保留时间：1.36分钟(柱B)。 
Figure GSA00000095036600642
氮杂吲哚的酰化，方法B：制备(5-氮杂吲哚-3-基)-氧代乙酸甲酯2b：将5-氮杂吲哚(1b)(0.5g，4.2mmol)加入AlCl3(2.8g，21.0mmol)的CH2Cl2(100ml)悬浮液中。在室温下连续搅拌1小时，然后滴加氯代氧代乙酸甲酯(2.5g，21.0mmol)。将反应物搅拌8小时。小心加入 20ml MeOH猝灭反应后，真空除去溶剂。固体残留物经硅胶柱层析(EtOAc/MeOH＝10∶1)纯化，得到0.6g(70％)酰化产物2b。 
表征化合物2： 
化合物2b{(5-氮杂吲哚-3-基)-氧代乙酸甲酯}： 
1HNMR(500MHz，CD3OD)δ9.61(s，1H)，9.02(s，1H)，8.59(d，1H，J＝6.63Hz)，8.15(d，1H，J＝6.60Hz)，4.00(s，3H)；13C NMR(125MHz，CD3OD)δ178.9，163.0，145.6，144.2，138.3，135.0，124.7，116.3，112.1，53.8. 
MS m/z：(M+H)+C10H9N2O3的理论值：205.06；实测值205.04。HPLC保留时间：0.32分钟(柱A)。 
通过使用与化合物2b相同的方法制备化合物2ao((4，7-二甲氧基-6-氮杂吲哚-3-基)-氧代乙酸乙酯)，但使用的原料是4，7-二甲氧基-6-氮杂吲哚。化合物经硅胶层析纯化，用2∶3的EtOAc∶己烷作洗脱液，得到黄色油状物： 
1HNMR(500MHz，CDCl3)δ9.50(s，1H)，8.21(s，1H)，7.47(s，1H)，4.39(q，2H，d＝7.05Hz)，4.13(s，3H)，3.93(s，3H)，1.40(t，3H，d＝7.2Hz). 
MS m/z：(M+H)+C13H15N2O5的理论值：279.10；实测值279.16。HPLC保留时间：1.28分钟(柱B)。 
Figure GSA00000095036600661
2)制备氮杂吲哚3-乙醛酸钾3 
Figure GSA00000095036600662
制备(7-氮杂吲哚-3-基)-氧代乙酸钾3a：将化合物2a(43g，0.21mol)和K2CO3(56.9g，0.41mol)溶于MeOH(200ml)和H2O(200ml)中。8小时后，产物3a在溶液中沉淀出。过滤，得到43g化合物3a，为白色固体，收率90.4％。 
表征化合物3： 
化合物3a，(7-氮杂吲哚-3-基)-氧代乙酸钾： 
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.42(d，1H，J＝7.86Hz)，8.26(d，1H，J＝4.71Hz)，8.14(s，1H)，7.18(dd，1H，J＝7.86，4.71Hz)；13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ169.4，148.9，143.6，135.1，129.3，118.2，117.5，112.9. 
MS m/z：(M+H)+化合物3a(3a-K+H)的相应酸C9H7N2O3的理论值：191.05；实测值190.97。HPLC保留时间：0.48分钟(柱A)。 
通过与制备化合物3a的相同方法制备化合物3ao((4，7-二甲氧基-6-氮杂吲哚-3-基)-氧代乙酸钾)(为黄色固体)，但用(4，7-二甲氧基-6-氮杂吲哚-3-基)-氧代乙酸乙酯作原料。化合物3ao(M-K+H)+的相应酸的MS m/z：(M+H)+C11H11N2O5的理论值：251.07；实测值251.09。HPLC保留时间：0.69分钟(柱B)。 
制备5a的方法实例 
Figure GSA00000095036600671
制备(R)-N-(苯甲酰基)-3-甲基-N′-[(7-氮杂吲哚-3-基)-氧代乙酰基]-哌嗪5a：将7-氮杂吲哚3-乙醛酸钾3a(25.4g，0.111mol)、(R)-3-甲基-N-苯甲酰基哌嗪4a(22.7g，0.111mol)、3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT)(33.3g，0.111mol)和Hunig’s碱(28.6g，0.222mol)在500ml DMF中混合。将混合物在室温下搅拌8小时。 
通过减压蒸发除去DMF，将残留物在乙酸乙酯(2000ml)和5％Na2CO3水溶液(2×400ml)之间分配。用乙酸乙酯(3×300ml)萃取水层。合并有机相，经无水MgSO4干燥。真空浓缩，得到粗产物，经硅胶柱层析纯化，用EtOAc/MeOH(50∶1)洗脱，得到33g产物5a，收率81％。 
表征具有以下亚结构的化合物5： 
Figure GSA00000095036600672
化合物5a，n＝2，R7-13＝H，R14＝(R)-Me，(R)-N(苯甲酰基)-3-甲基-N′-[(7-氮杂吲哚-3-基)-氧代乙酰基]-哌嗪： 
1H NMR(300MHz，CD3OD) 
Figure GSA00000095036600673
8.57(d，1H，J＝5.97Hz)，8.38(d，1H，J＝4.20Hz)，8.27(m，1H)，7.47(s，5H)，7.35(t，1H，J＝5.13Hz)，4.75-2.87(m，7H)，1.31(b，3H)；13C NMR(75MHz，CD3OD)δ185.6，172.0，166.3，148.9，144.6，137.0，134.8，130.2，129.9，128.4，126.6，118.6，118.0，112.2，61.3，50.3，45.1，35.5，14.9，13.7. 
MS m/z：(M+H)+C21H21N4O3理论值：377.16；实测值377.18。HPLC保留时间：1.21分钟(柱A)。元素分析：C21H20N4O3的理论值：C，67.01；H，5.36；N，14.88。实测值：C，66.01；H，5.35；N，14.61。 
Figure GSA00000095036600681
通过使用与制备化合物5a相同的方法制备化合物IVa，N-(苯甲酰基)-N′-[(4，7-二甲氧基-6-氮杂吲哚-3-基)-氧代乙酰基]哌嗪，但原料是(4，7-二甲氧基-6-氮杂吲哚-3-基)-氧代乙酸钾。该化合物经硅胶层析纯化，用EtOAc作洗脱溶剂，得到白色固体。 
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.0(s，1H)，8.15(s，1H)，7.40(m，6H)，4.00(s，3H)，3.83(s，3H)，3.63-3.34(m，8H)；13CNMR(125MHz，DMSO-d6)δ185.5，169.3，166.5，146.2，145.7，136.6，135.3，129.6，128.4，126.9，122.2，122.1，119.2，114.4，56.8，52.9，45.5，39.9. 
MS m/z：(M+H)+C22H23N4O5的理论值：423.17；实测值423.19。HPLC保留时间：1.33分钟(柱B)。元素分析：C22H21N4O5的理论值：C，62.7；H，5.02；N，13.29。实测值：C，61.92；H，5.41；13.01。熔点：229.5-232℃。 
制备母体化合物IVc的方法 
制备3-甲基-1，2，4-三唑(2-81) 
Figure GSA00000095036600682
方法：将在500mL圆底烧瓶中的甲酸酰肼固体(68g，1.13mol)和硫代乙酰胺(85g，1.13mol)加热，在150℃(油浴温度)下，在和缓的氮气流中搅拌1.5h，除去在反应期间形成的H2S和水(收集约18mL液体)。 减压蒸馏反应混合物，在102℃/0.35-1mmHg下，除去前馏出液体后，收集60.3g(0.726mol，Y.63.3％)标题化合物，为白色固体：1H NMR(CDCl3)δppm 2.51(3H，s，3-Me)，8.03(1H，s，5-H)，9.5(1H，br，NH)；TLC Rf(10％MeOH/CH2Cl2)＝0.3(磷钼酸盐-碳化，白色斑点)。参考：Vanek，T.；Velkova，V.；Gut，Jiri Coll.Czech.Chem.Comm.1985，49，2492。 
制备3-81 
Figure GSA00000095036600691
方法：向500mL圆底烧瓶中加入4-甲氧基-7-氯-6-氮杂吲哚2e(9.1g，50mmol；真空干燥)、碳酸钾(13.8g，100mmol，2当量)、铜粉(6.35g，100mmol，2当量)和3-甲基-1，2，4-三唑(83g，1.0mol，20当量)。在170-175℃(外部油浴温度)下，在和缓的干燥氮气流中，将固体混合物加热至熔融，保持12h，此时，HPLC分析表明原料峰量变为5-30％，而需要的产物峰变为约45％，异构体副产物峰变为15％。当反应混合物冷却后，搅拌下，将MeOH(150mL)缓慢加入温热混合物中。冷却后，通过Celite垫过滤不溶物(铜粉)，用甲醇冲洗。将滤液真空浓缩至稠糊状，用水(1L)稀释，用EtOAc(3×150mL)萃取。将EtOAc萃取液干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到约8g粗残留物，通过溶于热CH3CN(50mL)，随后用水(100mL)稀释，冷却至0℃结晶，收集1.45g(12.7％)标题化合物，为白色固体。滤液经C-18反相硅胶(YMC ODS-A 75μm)纯化，用15-30％CH3CN/H2O洗脱。合并合适的组分，通过旋转蒸发仪除去CH3CN后，冷冻水溶液，得到另外1.15g标题化合物3-81。用EtOAc再萃取粗水层几次。将乙酸乙酯萃取液干燥(MgSO4)，过滤， 浓缩，在MeOH中结晶，得到另外200mg标题化合物3-81。总收率：2.8g(12.2mmol，Y.24.5％)；MS m/z 230(MH)，HRMS(ESI)m/zC11H12N5O(M+H)理论值，230.1042，实测值230.1038(Δ-1.7ppm)；1HNMR(CDCl3)δppm 2.54(3H，s，CH3)，4.05(3H，s，OCH3)，6.73(1H，s，H-3)，7.40(1H，s，H-2)，7.56(1H，s，H-5)，9.15(1H，s，三唑-H-5)；13CNMR(CDCl3，125.7MHz)δppm 14.2(三唑-Me)，56.3(OMe)，100.5(C-3)，116.9(C-5)，123.5，127.2，127.5(C-2)，129.5(C-7)，141.2(C-5′)，149.5(C-4)，161.8(C-3′)；元素分析：C11H11N5O理论值：C 57.63，H 4.83，N 30.55，实测值C 57.37，H 4.64，N 30.68。 
用从C-18柱流分中得到的结晶，通过single X射线晶体分析确证结构。含需要的3-甲基-1，2，4-三唑基类似物3-81和异构体5-甲基-1，2，4-三唑基类似物4-81的混合物的C-18柱流分部分再通过C-18反相柱纯化，用8-10％CH3CN/H2O洗脱。用CH2Cl2萃取合适的流分，缓慢蒸发溶剂，得到异构体7-(5-甲基-1，2，4-三唑基)-4-甲氧基-6-氮杂吲哚(4-81)的结晶物： 
MS m/z 230(MH)，1H NMR(CDCl3)δppm 3.05(3H，s，CH3)，4，07(3H，s，OCH3)，6.74(1H，q，J＝2.4，H-2)，7.37(1H，t，J＝2.4，H-3)，7.65(1H，s，H-5)， 
8.07(1H，s，三唑-H-3)。通过single X射线晶体分析确证结构。 
制备5-81 
Figure GSA00000095036600701
方法：在干燥氮气下，将AlCl3(40g，0.3mol，15当量)溶于CH2Cl2(100mL)和硝基甲烷(20mL)的溶液。在N2、搅拌下，向该溶液加入化合物3-81(4.58g，0.02mol)，随后加入氯代氧代乙酸甲酯(9.8g，0.08mol，4当量)。在N2下，将混合物在室温下搅拌1.5h。搅拌下，将混合物滴 加至冷的20％乙酸铵水溶液(750mL)。将混合物搅拌20min，将产生的沉淀过滤，用水彻底洗涤，真空干燥，得到4.7g(0.015mol，Y.75％)标题化合物5-81，为白色固体：MS m/z 316(MH)；HRMS(ESI)m/zC14H14N5O4(M+H)理论值，316.1046；实测值316.1041(Δ-1.6ppm)；1HNMR(CDCl3，500MHz)δppm 2.58(3H，s，CH3)，3.96(3H，s，OCH3)，4.05(3H，s，OCH3)，7.76(1H，s，H-5)，8.34(1H，d，J＝3Hz，H-2)，9.15(1H，s，三唑-H-5)，11.0(1H，brs，NH)。可通过用EtOAc酸-碱萃取滤液，可得到更多标题化合物5-81和水解后的酸6-81。 
制备6-81 
Figure GSA00000095036600711
方法：在室温下，向甲酯5-81(2.2g，7.0mmol)的MeOH(50mL)悬浮液中加入0.25M NaOH水溶液(56mL，14mmol，2当量)，将混合物搅拌15min，此时HPLC表明水解完全。快速真空浓缩混合物，除去MeOH，搅拌下，向残余溶液中加入水(100mL)和1N HCl(14mL)，以中和混合物。过滤产生的微细沉淀，用水洗涤，真空干燥，得到1.98g(6.58mmol，Y.94％)标题化合物6-81，为灰白色固体：MS m/z 302(MH)；1H NMR(DMSO-d6，500MHz)δppm 2.50(3H，s，被DMSO峰覆盖)，3.98(3H，s，CH3O)，7.87(1H，s，H-5)，8.29(1H，d，J＝3.5Hz，H-2)，9.25(1H，s，三唑-H-5)，12.37(1H，s，NH)。 
备选方法：在室温下，向甲酯5-81(10.7g，34mmol)的MeOH(150mL)悬浮液中加入0.25M NaOH水溶液(272mL，68mmol，2当量)，搅拌混合物20min，此时，HPLC表明水解完全。将混合物快速真空浓缩，除去MeOH，用EtOAc萃取残余溶液，除去任何中性杂质。向水相中加入1N HCl(68mL，68mmol)，以中和产物。将得到的混合物冷冻， 冻干，得到14.1g(33.7mmol，Y.99.2％)标题化合物6-81，含2mol当量NaCl，为灰白色固体。该物质用于随后反应时，无须进一步纯化。用碳酸氢钠处理后，通过C-18反相柱层析得到标题化合物6-81的二钠盐：HPLC＞97％(AP，uv 254nm)；HRMS(Na盐，ESI-)m/z C13H10N5O4(M-H)理论值，300.0733；实测值300.0724(Δ-3ppm)；1H NMR(Na盐，DMSO-d6，500MHz)δppm 2.37(3H，s，Me)，3.83(3H，s，CH3O)，7.56(1H，s，H-5)，8.03(1H，s，H-2)，9.32(1H，s，三唑-H-5)；13C NMR(Na盐，DMSO-d6，125.7MHz)δppm 13.8(三唑-Me)，57.2(OMe)，114.8(C-3)，120.0(C-5)，125.1，143.5(C-5′)，149.8(C-4)，160.0(C-3′)，171.7，191.3。 
制备化合物IVc 
Figure GSA00000095036600721
方法：在N2下，向酸6-81(3.01g，10mmol)和苯甲酰基哌嗪盐酸盐(3.39g，15mmol)的DMF(50mL)溶液中加入三乙胺(10.1g，100mmol，10当量)，随后加入1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC；5.75g，30mmol)，超声和在40℃下保持2h后，在室温下，搅拌混合物22h。真空浓缩混合物，除去DMF和TEA，在搅拌和超声下，向残余溶液中加入水(200mL)。收集形成的沉淀，用水洗涤，真空干燥，得到2.8g(5.9mmol，Y.59％)标题化合物IVc，为灰白色固体。用CH2Cl2(×2)萃取滤液。将CH2Cl2萃取液干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩至胶质，用Et2O研磨，得到固体。将该固体悬浮在MeOH中研磨，得到400mg标题化合物IVc，为灰白色固体。总收率：3.2g(6.8mmol，Y.68％)：MS m/z 474(MH)；HRMS(ESI)m/z C24H24N7O4(M+H)理论值474.1890，实测值474.1884(Δ-1.2ppm)；1H NMR(DMSO-d6)δppm2.50(3H，s，被DMSO峰覆盖)，3.43(4H，br，CH2N)，3.68(4H，br， CH2N)，3.99(3H，s，CH3O)，7.46(5H，br.s，Ar-Hs)，7.88(1H，s，吲哚-H-5)，8.25(1H，s，吲哚-H-2)，9.25(1H，s，三唑-H-5)，12.40(1H，s，NH)； 
13C-NMR(DMSO-d6)δppm 13.78，40.58，45.11，56.78，114.11，120.95，122.71，123.60，126.98，128.34，129.6，135.43，138.52，142.10，149.15，161.29，166.17，169.22，185.42；UV(MeOH)λmax 233.6nm(ε3.43x104)，314.9nm(ε1.73x104)； 
元素分析：C24H24N7O4.1/5H2O理论值；C 60.42，H 4.94，N 20.55，实测值；C 60.42，H 5.03，N 20.65；KF(H2O)0.75％。 
通过使用HATU和DMAP也可实施该反应，得到收率更一致的标题化合物：在室温下，向酸6-81(15.6mmol)和HATU[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐](8.90g，23.4mmol；1.5当量)的DMF(60mL)和CH2Cl2(60mL)悬浮液中加入DMAP(5.72g，46.8mmol，3当量)和苯甲酰基哌嗪盐酸盐(5.30g，23.4mmol；1.5当量)在DMF(60mL)中的混合物，在氮气氛下，搅拌混合物4h。真空浓缩混合物，除去CH2Cl2和大部分DMF，在搅拌和超声下，向残余溶液中加入水。收集形成的沉淀，用水洗涤，真空干燥，得到5.38g(11.4mmol，Y.72.8％)标题化合物IVc，为灰白色固体：HPLC＞95％(AP，uv254nm)。 
Figure GSA00000095036600731
化合物IVb 
制备化合物IVb的最佳合成实验方法 
搅拌下，向5-氨基-2-甲氧基吡啶(50g，0.4mol)加入无水乙醇(280ml)和HBF4(48％的水溶液，172ml)的混合物，冷却至0℃。将亚硝酸钠(129g)溶于水(52ml)，在1h内分批加入)。在0℃下连续搅拌2h。用乙醚(1L)稀释反应混合物。过滤收集固体产物，用500ml 50∶50的EtOH/乙醚洗涤。然后用乙醚洗涤几次直至产物颜色略带粉红色。将该浅粉红色固体90g(～100％收率)保存在带P2O5的干燥器中。 
按相同方法实施更大规模的反应： 
(1)(200g，1.6mol)；HBF4(688ml)；NaNO2(116g)；EtOH(1.12L)；H2O(208ml) 
反应进行4次(共计800克(1-80))。产物经P2O5干燥48h。(第一批仅干燥24h)。 
共计得到1，293g(2-80)，(91％收率)。 
参考：J.Heterocyclic Chem.，10，779，1973(用于以上反应，包括分析数据) 
Figure GSA00000095036600742
分3批分解重氮盐： 
分别用1.3L、1.4L和1.6L无水甲苯，得到206g、219g和231g。 
在氮气下，将在配备机械搅拌棒的2L 3颈圆底烧瓶中的甲苯预热至100℃(内部温度)。用勺将固体通过粉末漏斗分次加入固体，粉 末漏斗与略微向外的正压氮气流的接管连接。加入期间，将温度保持在99-102℃(设定在100℃)，剧烈搅拌。对于较少的两批，总加入时间为60min，对于最后一批，时间为70min。加入结束后，搅拌下，将各批在110℃下加热1h。除去加热罩，停止搅拌。将反应物静置2h(达到环境温度)。安全须知：反应物含BF3，所以工作时接触对某些人造成皮肤刺激的反应热蒸汽。在环境温度下没有发生事故(6个不同的人)。将反应物中的热甲苯倾入4L Erlenmeyer(深棕色油状物，残留物保留在烧瓶中)。用50ml甲苯洗涤残留物，倾入起初的甲苯萃取液中。 
将1.5L 1N NaOH加入甲苯层，用～100ml饱和NaCl水溶液萃取，洗涤。 
将NaCl与NaOH层合并，用150ml甲苯再萃取，用50ml饱和NaCl洗涤。 
合并甲苯层。 
将1L 1N NaOH加入在反应烧瓶中的残留物中，旋转溶解尽可能多的残留物，然后加入500ml Et2O，倾入Erlenmeyer中。 
再将～500ml 1N NaOH加入反应烧瓶，旋转～500ml Et2O。 
在erlenmyer烧瓶中，合并深色Et2O和NaOH洗涤液。 
通过含玻璃棉塞的粉末漏斗倾入Et2O/NaOH混合物，收集深色粘性固体。(向洗涤液中再加入～500ml乙醚)加入6L分液漏斗中。 
萃取。用～200ml H2O洗涤乙醚层，然后用100ml饱和NaCl洗涤。 
将所有洗涤液与起初NaOH水溶液层合并，用500ml乙醚再萃取。用100ml H2O和100ml NaCl洗涤。 
合并乙醚萃取液。通过LC/MS净化产物检查甲苯和乙醚萃取物。 
在旋转蒸发仪上浓缩乙醚萃取液，将残留物与甲苯萃取物合并，制备均一溶液，将该溶液原样带入下一步反应。 
合并另外两份流分，按同样方法进行后处理。 
所有水层试样均通过LC/MS检查＝无产物。 
参考：J.Heterocyclic Chem.，10，779，1973(用于以上反应，包括分析数据) 
将含3-80的共计4.6L甲苯溶液放入几个密封管中，在145℃下，用900ml 35％HCl处理2h。LC/MS表明无原料，只有4。轻轻倒出甲苯溶液，弃去。用EtOAc洗涤水相，浓缩，除去挥发物，得到含需要的氟-羟基吡啶4-80的棕色固体。 
收集共计244g该固体，原样(不很干燥)带入下一步反应。注意：申请人随后通过先轻轻倒出甲苯层，然后加热减少体积实施该过程。在100℃下，用HBr(48％的H2O溶液)进行相同反应6h，结果与文献方法相似，收率49％。 
参考：J.Heterocyclic Chem.，10，779，1973(用于以上反应，包括分析数据) 
将含(4-80)的以上固体分为4批，按以下所示，用H2SO4和发烟HNO3处理。用量为： 
  第1批   第2批   第3批   第4批
  (1)   25g   54g   75g   90g
  发烟HNO3   20.8ml   45ml   62.4ml   75ml
  H2SO4(加入用)   5.6ml+   12ml+   16.8ml+   20ml+
  (对于溶液)   56ml   120ml   168ml   200ml
在室温下，将化合物4-80溶于硫酸(以上列出的较大量)，然后加热至65℃。滴加预制备的发烟硝酸和硫酸溶液(以上列出的较小量)。将温度保持在65℃-80℃(rxn是放热，尽管浴温为65℃，温度超过，通常75，有时80℃)。加入结束后，在65℃下，将反应混合物再加热1h。然后将反应混合物冷却至室温，倾入含冰的烧瓶中)(20g冰/1g化合物，产生气体)。出现固体沉淀，通过过滤收集(1HNM″表明为4-80和其它物质(弃去))。 
用AcOEt萃取水层几次(3-5)，在旋转蒸发仪上真空浓缩，得到固体，用乙醚研磨，得到5-80，为亮黄色固体。在第一批收获中，收集共计117g需要的产物(27％收率重氮盐)。一部分没有结晶：该油状物用MeOH和Et2O研磨，得到3.6g 5-80；由母液中的另外沉淀得到另外6.23g需要的产物5-80。 
共计：117.0+3.6+6.23＝126.83.30.4％)。3步收率(重氮盐分解；脱保护和硝化)。 
记录本上的分析数据：53877-115：1HNMR(δ，MeOD)：8.56-8.27(dd，J＝7.5，3.3Hz，lH)，8.01(d，J＝3.3Hz，1H)；LC/MS(M+1)+＝158.9；保留时间＝0.15min. 
注意：取一部分酸水溶液，用Na2CO3中和直至泡腾停止，然后用AcOEt萃取＝＞得到不同的产物。在这些萃取液中无需要的产物。 
Figure GSA00000095036600771
将总量117g 5-80分为4批：30g×3和27g×1，在室温下，用POBr3(3当量；163g×3和155g×1)和催化量DMF(15ml)处理(小心加入DMF＝＞产生气体)。在室温下5min后，将溶液在110℃下加热3h。LC/MS表明原料已耗竭。让反应混合物冷却至室温。就反应烧瓶置于冰浴中；然后将冰极缓慢的小心分批加入烧瓶，因形成HBr而产 生气体；将形成的液体和黑色固体倾入盛有冰的烧杯中。加入EtOAc，然后用EtOAc萃取混合物几次。用饱和NaHCO3水溶液；H2O和盐水洗涤有机层；经Na2SO4干燥，过滤。将产物在真空中干燥过夜，得到123g 6-80，为棕色固体(77％收率)。 
注意：反应在1h内完成。 
1HNMR(δ，CDCl3)：8.52(m，1H)，7.93(m，1H)。 
Figure GSA00000095036600781
在N2、剧烈搅拌下，将800ml乙烯基溴化镁(1M的THF溶液，Aldrich)冷却至-60℃以下。通过加料漏斗滴加2-溴-5-氟-3-硝基吡啶(43.3g，0.196mol)的200ml THF溶液，控制滴加速度以使温度保持在-60℃以下。该过程持续～1.25h。使反应混合物升温至-40至-50℃，再搅拌1h。然后缓慢和小心加入1L饱和NH4Cl水溶液。起初，产生泡沫并有相当多的固体存在，但当加入结束，物质温度升至室温时，固体基本上溶解。分离液层，用乙酸乙酯萃取水层3次。用盐水洗涤有机萃取液，经Na2SO4干燥，过滤，浓缩，得到～50g黑色胶质固体。HPLC表明有57-58％产物。向该产物加入CH2Cl2，过滤收集固体，用CH2Cl2洗涤，得到12.5g产物，为棕色固体。按完全相同规模重复反应，按相同方式进行后处理。用CH2Cl2研磨，得到12.4g前体2i(HPLC～97％纯度)。回收粗产物，置于二氯甲烷中。静置后又有3.6g产物分离出，通过过滤回收。 
总收率＝29.5g(35％) 
1HNMR(δ，CDCl3)：8.69(bs，1H)，7.92(d，J＝1.8Hz，1H)，7.41(m，1H)，6.77(m，1H)； 
LC/MS(M+1)+＝216.-217.9；rt＝1.43min。 
反应在250ml烧瓶中进行(加热时产生泡沫，采用大号烧瓶更方便)。在160℃、N2下，将前体2i(3g，13.95mmol)、1，2，3-三唑(15g，217.6mmol，15当量)、K2CO3(1.9g，13.95mmol，1当量)和Cu(0)(0.9g，13.9mmol，1当量)的混合物加热7h(室温至160℃，共7h)(根据Cu(O)批次，反应时间可为2h-7h)。用MeOH稀释得到的混合物，通过滤纸过滤(除去铜)。用MeOH(20ml)和水(30ml)洗涤。 
浓缩滤液(在旋转蒸发仪中除去溶剂)，用乙酸乙酯稀释。用乙酸乙酯萃取水层。合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤，浓缩。将残留物溶于MeOH(20ml)，在甲醇中结晶7-80(750mg)，为白色固体，过滤收集。(缓慢变换梯度体积，硅胶hex/AcOEt(0→18％)母液通常再提供5-10％7-80。 
1HNMR(δ，CDCl3)：10.47(bs，1H)，8.76(s，1H)，7.94(s，1H)，7.89(s，1H)，7.53(m，1H)，6.78(m，1H)；LCMS(M+1)+＝204；rt＝1.29min。 
将氯化乙基甲基咪唑鎓(4.3g，29.6mmol，3当量)放入250ml烧瓶中。将AlCl3(11.8g，88.6mmol，9当量)一次性加入烧瓶。形成液体悬浮液(有些AlCl3仍为固体)。搅拌5-10min后，一次性加入化合物(1)(2.0g， 9.85mmol)，随后缓慢加入(通过注射器)氯草酰乙酸乙酯(3.3ml，29.6mmol，3当量)。将反应物在室温下搅拌20h。LCMS表明化合物8-80：化合物7-80＝6∶2。(化合物I具有强烈的UV吸收)。在0℃下，小心加入冰水(～75ml)猝灭反应。在该点黄色固体沉淀。过滤得到的悬浮液，用水洗涤固体。晾干固体中的MeOH和乙酸乙酯(除去未反应的SM)。得到(LCMS纯度70％～80％)2g含8-80的固体，无须进一步纯化而进行下一步。LCMS(M+1)+＝276；保留时间＝0.97min。 
Figure GSA00000095036600801
在室温下，将化合物8-80(4.9g，17.8mmol)&N-苯甲酰基哌嗪盐酸盐8a-80(HCl盐；6.0g，26.7mmol，1.5当量)在DMF(30ml)中的混合物搅拌过夜(16h)。形成浆状物。向浆状物再加入20ml DMF。然后加入HATU(12.2g，26.7mmol，1.5当量)，随后加入DMAP(4.3g，35.6mmol，2当量)。搅拌反应混合物30min。LCMS表明原料8-80完全转化为产物(实施例216)。过滤得到的混合物，用水洗涤固体。真空浓缩滤液。将水加入残留物中，过滤收集固体。合并固体，用水、MeOH和EtOAc洗涤。然后将固体晾干。LCMS&HPLC表明IVb＞99％纯度。通过在5～10％CH3OH/CHCl3中沉淀和结晶进一步纯化固体产物。 
纯化IVb 
将以上得到的粗化合物IVb(15.3g)溶于10％MeOH/CHCl3(600ml)。形成浅棕色悬浮液，通过滤纸过滤，用MeOH洗涤两次。弃去带棕色固体(～1.2g)。化合物IVb在滤液中结晶，过滤收集固体，将白色固体晾干。用滤液重复结晶几次。通过HPLC分析从各滤液中得到的固体。合并所有纯部分。用MeOH&CHCl3使不很纯的部分重结晶。 由重结晶和沉淀得到总计12.7g化合物IVb。浓缩母液，在硅胶柱上纯化(EtOAc，然后CHCl3/MeOH(0-2％))，得到506mg产物)，为白色固体。 
1HNMR(d，DMSO)13.1(bs，1H)，9.0(s，1H)，8.4(s，lH)，8.3(s，1H)，8.2(s，1H)，7.4(bs，5H)，3.7(bs，4H)，3.5(bs，4H)；MS m/z 448(MH)。元素分析：C22H18FN7O3理论值；C 59.05，H 4.05，N 21.91，F 4.24。实测值；C 57.28，H 4.14，N 21.22；F 4.07％。 
实施例1-4： 
由母体化合物IV制备前药I 
实施例1-4的合成流程 
Figure GSA00000095036600821
实施例1 
制备Ia 
Figure GSA00000095036600831
方法：在干燥N2气氛下，用NaH(86mg，2.2mmol；4.4当量；60％油分散液)处理IVa(211mg，0.5mmol)的THF(2mL；Sure Seal)悬浮液。在室温下搅拌几分钟后，加入磷酸二叔丁基酯氯甲基酯(782mg，3.0mmol；制备方法参见美国专利6,362,172)，搅拌混合物1-5天，通过HPLC监测反应完成(可能还需要NaH和磷酸酯各1-2当量使反应接近完成)。原料耗竭后，将混合物真空浓缩至干，在室温下，将似乎是N-烷基化的吲哚单和二叔丁基磷酸酯的混合物的残留物溶于CH2Cl2(5mL)，用TFA(5mL)处理2h。真空浓缩混合物，使残留物通过C-18反相硅胶纯化，用5-10％CH3CN/含NaHCO3的水洗脱，得到75mg(0.13mmol；Y.26％)标题化合物Ia，为灰白色粉末(二钠盐)：HPLC＞99％(AP在254nm)；LC/MS(ESI+)m/z 533(M+H-2Na)+；HRMS(ESI)m/z C23H26N4O9P(M+H-2Na)+理论值533.1437，实测值533.1426(Δ-2.1ppm)； 
1H NMR(D2O，500MHz)δppm 3.51(2H，m)，3.67(2H，m)，3.73-3.79(2H，m)，3.89-3.95(2H，m)，3.94，3.95(3H，2s)，4.05，4.07(3H，2s)，6.02-6.04-6.05-6.07(2H，ABq.)，7.43，7.44(1H，2s)，7.45-7.56(5H，m)，8.49，8.52(1H，2s). 
通过使用类似方法和条件，由IVb制备Ib。分别由IVc和IVd制备Ic和Id，但在纯化时使用水而非碳酸氢钠溶液。 
实施例2 
Figure GSA00000095036600841
Ib：收率13％(二钠盐)；HPLC＞96％(AP在254运行)；LC/MS(ESI+)m/z 558(M+H-2Na)+； 
1H NMR(D2O，500MHz)δppm 3.59(2H，m)，3.70-3.84(4H，m)，3.93-3.95(2H，m)，5.28-5.29-5.30-5.32(2H，ABq.)，7.4-7.6(5H，m)，8.09，8.10(1H，2s)，8.34，8.36(1H，2s)，8.59，8.61(1H，2s)，8.72，8.75(1H，2s). 
实施例3 
Figure GSA00000095036600842
Ic：收率37％(酸形式。纯化期间用水代替碳酸氢钠水溶液；HPLC＞98％(AP在254运行)； 
LC/MS(ESI+)m/z 584(M+H)；1H NMR(DMSO-d6，500MHz)δppm 2.40(3H，s)，3.44(4H，br.s)，3.66(4H，brs)，4.04(3H，s)，5.79(1H，s)，5.82(1H，s)，7.46(5H，brs)，8.07(1H，s)，8.41(1H，s)，8.88(1H，s). 
实施例4 
Figure GSA00000095036600851
Id：收率7％(酸形式)。纯化期间用水代替碳酸氢钠水溶液； 
LC/MS(ESI+)m/z 597(M+H)；1H NMR(DMSO-d6，500MHz)δppm 1.16，1.21(3H，2d，J＝6.5Hz)，2.29(3H，s)，2.3-4.5(7H，m)，4.00，4.01(3H，2s)，5.79-5.85(2H，m)，6.36(1H，t，J＝2Hz)，7.42-7.47(5H，m)，7.99(1H，s)，8.08，8.09(1H，2s)，8.34，8.44(1H，2s). 
实施例5 
制备Ica，(二钠盐) 
Figure GSA00000095036600852
通用方法：在氮气氛下，用氢化钠(60％油分散液，0.08g，2.0mmol)处理IVc(0.24g，0.5mmol)的无水THF(4mL)悬浮液，搅拌直至气体生成停止(约5分钟)。用碘(0.13g，0.5mmol)处理反应混合物，搅拌2-3分钟，随后加入磷酸二叔丁酯氯甲酯(1.6g，6.0mmol，粗品)。使氮气流通过反应物上方，促使除去大量或所有THF。搅拌反应混合物过夜。HPLC分析粗产物，表明开始出现IVc(约56％)和需要的加成物(约32％)。 
将几种粗反应混合物(以原料IVc计，共6.7mmol)再溶于二氯甲烷，混合，真空浓缩，除去任何残存THF。将残留物悬浮于二氯甲烷 和TFA(1∶1，约40mL总体积)。搅拌混合物1.5-2小时，然后真空除去溶剂。将残留物悬浮于二氯甲烷中，萃取到水中(约60mL)，用固体或碳酸氢钠水溶液变为弱碱性。酌情通过旋转蒸发将水层体积减少，将溶液加载到C-18反相柱上(约80g C-18，YMC ODS-Aq，50微米)，依次用水、含2.5％乙腈的水洗脱。合并含纯产物的组分，通过旋转蒸发仪除去有机溶剂。冷冻后，回收纯产物，得到1.00g(1.30mmol，19％2步合计)标题化合物Ica(二钠盐)，为灰白色粉末：HPLC纯度＞99％AP在254nm(梯度0-100％B/A；A 10％CH3CN-90％H2O-0.1％TFA，B 90％CH3CN-10％H2O-0.1％TFA，梯度时间4min，柱YMC ODS-Aq 4.6×50mm 3微米)；MS-ESI-m/z 482(M-H-2Na)+；HRMS(ESI)m/z C25H27N7O8P(M+H-2Na)+理论值584.1659，实测值584.1651(Δ-1.3ppm)；1H NMR(D2O，500MHz)δppm 2.53，2.54(3H，2s)，3.56(2H，s，CH2N)，3.72(2H，br.s，CH2N)，3.78，3.83(2H，2br.s，CH2N)，3.94，3.96(2H，2br.s，CH2N)，4.14(3H，s，CH3O)，5.38，5.40(2H，2d，J＝11Hz)，7.45-7.59(5H，m，Ar-Hs)，8.07，8.09(1H，2s，吲哚-H-5)，8.64，8.67(1H，2s，吲哚-H-2)，8.87，8.89(1H，2s，三唑-H-5)； 
13C-NMR(125.7MHz，D2O)δppm 15.43(N-Me)，44.03，44.47，44.66，45.05，48.20，48.82，49.60，50.23，59.78(OMe)，75.81(NCH2O)，115.6，126.0，127.2，129.6，131.0，131.7，132.1，133.5，136.8，147.6，150.1，154.2，164.8，170.4，175.8，189.2；UV(H2O)λmax 220nm(ε3.91x104)，249nm(ε2.00x104)，303nm(ε1.60x104)；元素分析：C25H24N7O8PNa2.8H2O.0.2NaHCO3理论值；C 38.39，H 5.14，N 12.44，P 3.93，Na 6.42。实测值；C 38.16，H 4.81，N 12.43，P 3.72，Na6.05；KF(H2O)17.3％。 
收集不很纯的组分，得到0.22g(0.29mmol，Y.4％)标题化合物Ica(二钠盐)：HPLC纯度＞95％(AP在254nm)。 
实施例6 
制备Iab(水合赖氨酸盐) 
步骤1 
Figure GSA00000095036600871
将磷酸酯A(45.1g，0.1mol)和氯碘代甲烷B(200g，1.14mol)在100ml苯中混合，将混合物在室温下搅拌4小时，然后真空除去苯。然后，将500ml乙醚加入残留物中，滤除不溶固体。浓缩滤液，得到磷酸二叔丁酯氯甲酯，用于下一步时无须任何纯化。 
步骤2 
Figure GSA00000095036600872
将NaH(2.4g，60％在油中)缓慢加入IVa的无水THF(120ml)悬浮液中，将混合物在室温下搅拌1小时。搅拌下，将溶于无水THF(10ml)的碘(5g)缓慢加入溶液中。加入结束后，将得到的混合物在环境温度下再搅拌15分钟，然后加入由步骤1得到的化合物磷酸二叔丁酯氯甲酯。搅拌16小时后，将反应混合物倾入冰水(120ml)中，随后用EtOAc(3×300ml)萃取。依次用水(100ml)和盐水(100ml)洗涤合并的有机萃取液，经Na2SO4干燥，真空浓缩，得到残留物，通过硅胶层析纯化(依次用EtOAc/Et3N(100/1)、EtOAc/MeOH(100/1)洗脱)，得到二酯IIa，收率70-80％。 
步骤3 
Figure GSA00000095036600881
将TFA(50ml)和二氯甲烷(450ml)混合溶液加入盛有43.3g二酯IIa的圆底烧瓶中。在室温下搅拌16小时后，真空浓缩反应混合物，得到残留物Iac，进一步使用时无须纯化。 
步骤4 
Figure GSA00000095036600882
在室温下，将以上55g粗产物Iac加入L-赖氨酸水溶液(1.36M，70mL)。将得到的悬浮液(pH＝1.83)加入赖氨酸溶液(1.36M，～40mL)至pH 4.88。通过Celite垫过滤得到的悬浮液。将澄清浅黄色滤液(～200mL)与丙酮(200mL)混合，加热至45℃。在45℃下，在2h内，加入丙酮(1400mL)。向澄清溶液中放入晶种，在45℃下搅拌2h，缓慢冷却至室温(5h)，搅拌悬浮液过夜。过滤收集白色固体，在50℃下，在常压(house vac.)下干燥24h，得到41.2g Iab，为灰白色固体。 
在45℃下，将以上固体溶于1∶1的水-丙酮(560mL)中。在45℃下，在1h内，加入丙酮(700mL)。向澄清溶液中放入晶种，在45℃下搅拌2h。缓慢冷却至室温(5h)，将悬浮液在室温下搅拌过夜。过滤收集白色固体，在50℃下，在常压下干燥36h，得到33g Iab，为灰白色固体。经HPLC测定AP＞99％。 
1H NMR(500MHz，D2O)δ8.42(s，1/2H)，8.39(s，1/2H)，7.52(m，6H)，6.12(m，2H)，4.07(s，3H)，3.93(m，5H)，3.72(m，3H)，3.67(m，2H)，3.52(m，2H)，3.05(m，2H)，1.93(m，2H)，1.74(m，2H)，1.50(m，2H)； 
MS m/z：(M+H-赖氨酸)+C23H26N4O9P理论值533.14，实测值533.03.M.P.166.7-172.2度。用几个不同峰的对比性1H NMR积分，计算赖氨酸与IVa的比例，赖氨酸与母体前药的比例范围为1.05∶1-1.2∶1当量。测得盐形式是水合物。根据DSC(衍射扫描量热法)和TGA(热重分析)，测得水含量为2.80％。一水合物的理论计算值为2.58％。因此，水与水合物中的母体分子的比例范围可为1∶1至～1.5∶1。 
实施例7 
制备晶体Ic(游离酸一水合物) 
Figure GSA00000095036600891
在氮气、室温下，向在烘箱中干燥过的圆底烧瓶中的IVc(600mg，1.27mmol)和无水THF(10ml)的混合物中加入NaH(153mg，6.38mmol，干粉，95％)，搅拌白色悬浮液直至看不倒气体产生为止。然后向混合物中加入I2(375mg，1.48mmol)，在室温下搅拌3h。向反应混合物中加入NaH(153mg，6.38mmol，干粉，95％)，搅拌混合物约5-10min。将粗磷酸氯甲基酯二叔丁基酯(2.0g，约1.6ml，7.79mmol)加入混合物中，然后在室温下搅拌15h。反应物的LCMS分析表明原料转化＞97％。蒸发挥发物后，将残留物加入CH2Cl2(10ml)，在冰-水浴中冷却，缓慢加入TFA(10ml)，在室温下搅拌3h。然后蒸发反应混合物，使残留物在CH2Cl2(50ml)和H2O(50ml)之间分配。将CH2Cl2层倾入含有未溶解的带棕色固体的反应烧瓶中，用稀NaHCO3水溶液(50ml)萃取该混合物。混合物水溶液经反相制备型HPLC(溶剂A：10％ MeOH-90％H2O-0.1％TFA；溶剂B：90％MeOH-10％H2O-0.1％TFA；开始％B＝0，结束％B＝100；梯度时间＝6min；流速＝45ml/min；柱：phenomenex-Luna 30×50mm，S5；流分收集范围：3.65-4.05min)纯化。将流分蒸发至干，高真空干燥残留物，得到酸Ic，为浅黄色固体(356.6mg)； 
1H NMR：(500MHz，CD3OD)δ9.05(s，1H)，8.46(s，1H，)，8.04(s，1H)，7.47(b s，5H)，5.93(d，J＝12，2H)，4.10(s，3H)，4.00-3.40(bs，8H)，2.53(s，3H)； 
19F NMR分析表明物质中含有残余TFA(未定量百分率)；分析HPLC法：开始％B＝0，结束％B＝100，梯度时间＝2min，流速＝5mL/min，柱：Xterra MS C 187μ3.0×50mm，LC/MS：(ES+)m/z(M+H)+＝584，HPLC Rt＝0.983。 
将172.2mg纯酸Ic溶于1ml H2O，然后加入约0.3ml无水EtOH(200标准强度(proof))。将混合物置于冰箱(温度约3℃)过夜，此后出现结晶物质。然后使混合物升温至环境温度，用H2O稀释至3mL体积，然后缓慢加入20mL MeCN。加入结束后，将混合物在室温下搅拌2h，然后过滤。将收集到的固体(90mg)真空干燥，然后在高真空下干燥。通过粉末x射线研究表明该物质是晶体；元素分析 
C25H26N7O8P·H2O：C 49.92；H 4.69；N 16.30；测定值：C 49.66；H 4.62；N15.99；mp＝205℃(通过示差扫描量热法测量)。将结晶物质的1H NMR类型与纯酸对比，两者的结构一致。 
实施例8 
制备Iab(单L赖氨酸盐)：磷酸二氢{3-[(4-苯甲酰基哌嗪-1-基)(氧代)乙酰基]-4，7-二甲氧基-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基}甲酯，L-赖氨酸盐(1∶1)。在实施例8的流程中阐述反应顺序。 
实施例8流程 
Figure GSA00000095036600911
制备磷酸二叔丁基酯氯甲基酯 
Figure GSA00000095036600912
将磷酸二叔丁酯的四丁铵盐(45.1g，0.1mol)和氯碘代甲烷(200g，1.14mol)在100ml苯中混合，将混合物在室温下搅拌4小时，然后真空下除去苯。将一份500ml乙醚加入残留物，滤除不溶固体。真空浓 缩滤液，用真空泵除去挥发物，得到磷酸二叔丁酯氯甲酯，为浅黄色或浅棕色油状物，用于下一步时无须进一步纯化。 
制备IIa：磷酸(3-(2-(4-苯甲酰基哌嗪-1-基)-2-氧代乙酰基)-4，7-二甲氧基-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基)甲基酯二叔丁基酯 
Figure GSA00000095036600921
将NaH(2.4g，60mmol，60％在油中)缓慢加入(8.4g，20mmol)IVa的无水THF(120ml)悬浮液中，将混合物在室温下搅拌1小时。按泡沫生成受控的速度，将碘(5g，20mmol)的无水THF(10ml)溶液缓慢小心加入搅拌的溶液中。加入结束后，在环境温度下，再搅拌得到的混合物15分钟，然后加入按步骤1所述得到的～0.1mol磷酸二叔丁酯氯甲酯。搅拌16小时后，将反应混合物倾入冰NH4OAc(30％)(120ml)中，随后用EtOAc(3×300ml)萃取。依次用水(100ml)和盐水(100ml)洗涤合并的有机萃取液，经Na2SO4干燥，真空浓缩，得到残留物，通过硅胶层析纯化(依次用EtOAc/Et3N(100/1)和EtOAc/MeOH(100/1)洗脱，得到二酯IIa(9.0-10.3g，AP～75％)，为浅黄色固体，运行几次后，收率70-80％。 
1H NMR(500MHz，CDCl3).09(s，1H)，7.48(s，1H)，7.40(b，5H)，6.15(d，2H，J＝11.5Hz)，4.05(s，3H)，3.90(s，3H)，3.90-3.30(b，8H)，1.39(s，18H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ185.5，170.7，166.5，146.9，146.2，139.6，135.3，130.2，128.7，128.4，127.2，124.5，122.0，120.8，115.8，83.8，73.2，57.3，53.5，46.1，41.7，29.8；MS m/z：(M+H)+C31H42N4O9P理论值645.27，实测值645.10。 
制备Iab：磷酸二氢{3-[(4-苯甲酰基哌嗪-1-基)(氧代)乙酰基]-4，7-二甲氧基-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基}甲酯，L-赖氨酸盐(1∶1) 
Figure GSA00000095036600931
将500mg二酯IIa溶于水(3ml)和丙酮(3ml)的混合物中。将得到的混合物在40℃下搅拌16小时，使溶剂解达到完全。向该反应混合物(～69AP)中加入4M赖氨酸水溶液，调节pH至4.83。在45-50℃下，在30min内，将丙酮(35ml)缓慢加入反应混合物中。在45℃下，将Iab晶种加入澄清溶液中，在该温度下，连续搅拌45min。加入丙酮结束后，在4小时内，使溶液冷却至室温，过夜后，Iab结晶完全。通过过滤，在氮气下抽真空2小时收集固体。在50-55℃下，在常压下，将白色结晶固体干燥24h，得到343mg Iab。 
在以上操作得到的Iab： 
1H NMR(500MHz，CD3OD)δ8.38(s，1H)，7.49(m，6H)，6.13(d，2H，J＝10.5Hz)，4.06(s，3H)，3.92(s，3H)，4.00-3.40(m，8H)，3.58(t，1H，J＝6Hz)，2.92(t，2H，J＝7.5Hz)，1.90-1.40(m，6H)；13C NMR(125MHz，CD3OD)δ186.1，173.2，171.8，167.8，147.4，146.4，141.0，135.4，130.4，128.8，127.2，124.6，122.3，120.2，114.6，73.2，56.6，54.7，53.1，46.0，41.6，39.2，30.5，27.0，22.0. 
HRMSm/z：(M-赖氨酸+H)+C23H26N4O9P理论值533.1437，实测值533.1437。元素分析：C，51.32；H，5.79；N，12.38；P，4.56；实测值：C，48.54；H，5.32；N，11.76；P，4.04。熔点170℃。 
通过其它方法(TFA的二氯甲烷溶液水解)得到的Iab为1.70mol水合物和1.14mol赖氨酸盐。 
1H NMR(500MHz，D2O，60℃)δ8.72(s，1H)，7.84(m，6H)，6.44(d，2H，J＝10Hz)，4.41(s，3H)，4.27(s，3H)，4.3-3.7(m，8H)，4.10(t，1H，J＝5Hz)，3.39(t，2H，J＝5Hz)，2.30-1.80(m，6H)；13CNMR(125MHz，D2O，27℃)δ186.7，174.9，173.2，167.9，147.7，145.7，142.6，134.3，131.1，129.2，127.1，124.3，122.4，120.1，113.8，73.5，57.1，54.9，54.4，47.7，47.1，46.3，45.7，42.6，42.1，42.0，41.5，39.5，30.2，26.8，21.8. 
HRMSm/z：(M-赖氨酸+H)+C23H26N4O9P理论值533.1437，实测值533.1425。元素分析：C，49.11；H 6.13；N，12.05；实测值：C，48.93；H6.26；N 12.07.M.P.168-172℃。 
实施例9 
制备Ibb(单L赖氨酸盐)：磷酸二氢[3-[(4-苯甲酰基哌嗪-1-基)(氧代)乙酰基]-4-氟-7-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基]甲酯，L-赖氨酸盐(1∶1)。在实施例9流程中阐述反应顺序。 
实施例9流程 
Figure GSA00000095036600951
制备磷酸二叔丁酯氯甲酯 
Figure GSA00000095036600952
将磷酸二叔丁酯的四丁铵盐(57g，0.126mol，Digital SpecialtyChemicals)和氯碘代甲烷(221g，1.26mol)在室温下搅拌4小时，然后真空除去挥发物。将500ml乙醚加入残留物中，滤除不溶固体。用真空泵浓缩滤液，最后除去挥发物，得到磷酸二叔丁酯氯甲酯(112g)，典型的是浅黄色或棕色油状物，用于下一步时无须进一步纯化。 
制备IIb：磷酸(3-(2-(4-苯甲酰基哌嗪-1-基)-2-氧代乙酰基)-4-氟-7-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基)甲基酯二叔丁基酯 
Figure GSA00000095036600961
将NaH(5.65g，95％矿物油分散液，0.224mol)缓慢加入IVb(20g，44.7mmol)的无水THF (400ml)悬浮液中，在室温下，搅拌混合物0.5小时。将碘(11.3g，44.5mmol)的无水THF(20ml)溶液缓慢加入搅拌的溶液中，加入速度保持在不出现剧烈反应为宜。将得到的反应混合物再搅拌3小时，然后加入第二部分95％NaH(5.65g，0.224mol)。在环境温度下15分钟后，一次性加入由步骤1得到的磷酸二叔丁酯氯甲酯(112g)。在环境温度下搅拌16小时后，将反应混合物倾入冰NH4OAc(30％)(200ml)，然后用EtOAc(3×500ml)萃取。依次用水(200ml)和盐水(200ml)洗涤合并的有机萃取液，经Na2SO4干燥，真空浓缩，得到残留物，通过硅胶层析(用EtOAc/MeOH/Et3N(100/1/1洗脱)纯化，得到15.0g(43％收率，校正为85％AP)二酯IIb，为浅黄色固体。 
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.36(s，1H)，8.25(s，1H)，8.21(s，1H)，7.88(s，1H)，7.41(b，5H) 5.90(d，2H，J＝14.5Hz)，3.90-3.40(b，8H)，1.23(s，18H)；13C NMR(125MHz，，CDCl3)δ182.9，170.7，165.1，154.6，152.5，144.1，135.1，134.0，131.9，130.3，128.7，128.3，127.2，125.9，124.3，114.0，84.1，74.1，46.2，41.9，29.6；HRMS m/z：(M+H)+C31H38FN7O7P理论值670.26，实测值670.34。 
制备Ibb(单L赖氨酸盐)：磷酸二氢[3-[(4-苯甲酰基哌嗪-1-基)(氧代)乙酰基]-4-氟-7-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基]甲酯，L-赖氨酸盐(1∶1) 
Figure GSA00000095036600971
将二酯IIb(27g)溶于水(55ml)和丙酮(55ml)的混合物。将得到的混合物(pH：未测定)在40℃下搅拌16小时，完成溶剂解。向该反应混合物中加入4M赖氨酸水溶液，调节pH至3.51。将EtOH(500ml)加入溶液中，过夜后，烧瓶壁上附着一些产物。将该澄清溶液移至另一个烧瓶中，在～3h内，向反应混合物中缓慢加入EtOH(1500ml)。加入乙醇结束后，将溶液在室温下搅拌48小时，过滤收集得到的固体(Ibb)，用乙醇冲洗。在55℃下，在常压下，将白色结晶固体干燥24h，得到10.92g Ibb(98AP)。 
将该固体再与由其它操作得到的12.5g盐的水70ml溶液混合。然后加入EtOH(1000ml)，将得到的溶液在室温下搅拌20小时。过滤收集固体，用EtOH(2×80ml)冲洗，在50℃、氮气氛下，在常压下干燥44小时，得到21.5g Ibb，AP 98.7。 
以上过程中得到的为～1mol赖氨酸盐，含1.12％水，0.8％TFA和0.05％乙醇。 
1H NMR(500MHz，CD3OD，50℃)δ8.94(s，1H)，8.87(s，1H)，8.69(s，1H)，8.42(s，1H)，7.83(m，5H)，5.81(d，2H，J＝12.5Hz)，4.30-3.70(m，8H)，4.08(t，1H，J＝6.5Hz)，3.67(t，2H，J＝10Hz)，2.26(m，2H)，2.07(m，2H)，1.88(m，2H)；13C NMR(125MHz，D2O，30℃)δ185.2，174.9，173.3，166.8，153.1，146.8，134.8，134.3，131.3，131.1，130.3，129.3，128.9，128.7，128.5，127.2，124.2，112.6，74.0，54.9，47.9，47.2，46.4，45.9，42.7，42.2，42.0，41.7，39.5，30.3，26.8，21.8. 
MS m/z：(M-赖氨酸+H)+C23H22FN7O7P理论值558.1302，实测值558.1293。元素分析：C，48.75；H，5.07；N，17.63；P，4.33；实测值：C，49.02；H 4.90；N，17.90；P，4.37.M.P.193℃。pKa(电位)6.1，9.1。 
实施例10 
制备Icb(单氨丁三醇盐)：磷酸二氢[3-[(4-苯甲酰基哌嗪-1-基)(氧代)乙酰基]-4-甲氧基-7-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基]甲酯，2-氨基-2-(羟甲基)丙-1，3-二醇盐(1∶1)。在实施例10流程中阐述反应顺序。 
实施例10流程 
Figure GSA00000095036600991
制备磷酸二叔丁酯氯甲酯 
Figure GSA00000095036600992
将磷酸二叔丁酯四丁铵(57g，0.126mol，Digital SpecialtyChemicals)和氯碘代甲烷(221g，1.26mol)的混合物在室温下搅拌4小时，然后真空除去挥发物。将500ml乙醚加入残留物，滤除不溶固体。 
用真空泵真空浓缩滤液，除去残余挥发物，得到磷酸二叔丁酯氯甲酯，为浅棕色或黄色油状物，用于下一步时无须进一步纯化。 
制备IIc：磷酸(3-(2-(4-苯甲酰基哌嗪-1-基)-2-氧代乙酰基)-4-甲氧基-7-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基)甲基酯二叔丁基酯 
Figure GSA00000095036601001
在室温下，将NaH(2.6g，10.3mmol，在油中95％，5当量)缓慢加入IVc(10.0g，21.1mmol)的无水THF(100ml)悬浮液中，搅拌混合物0.5小时。搅拌下，将碘(5.27g，20.8mmol)的无水THF(10ml)溶液缓慢加入溶液，加入速度以不产生泡沫或剧烈反应为宜。再搅拌得到的混合物3小时，然后加入2.6g NaH。将磷酸二叔丁酯氯甲酯在环境温度下保持15分钟后，加入由步骤1得到的全部批次的磷酸二叔丁酯氯甲酯。搅拌16小时后，将反应混合物倾入冰NH4OAc(30％)(120ml)中，随后用EtOAc(3×300ml)萃取。依次用水(100ml)和盐水(100ml)洗涤合并的有机萃取液，经Na2SO4干燥，真空浓缩，得到残留物，通过硅胶层析(依次用EtOAc/Et3N(50/1洗脱)，EtOAc/MeOH (100/1)纯化)，得到8.0g(～75％AP，～41％收率)二酯IIc，为浅黄色固体。 
1H NMR(500MHz，CD3OD)δ8.82(s，1H)，8.41(s，1H)，8.04(s，1H)，7.47(b，5H)，6.00(d，2H，J＝14.5Hz)，4.10(s，3H)，4.00-3.40(b，8H)，2.49(s，3H)，1.28(s，18H)； 13C NMR(125MHz，CD3OD)δ18.6，176.4，172.9，168.0，162.6，152.6，147.5，144.0，136.5，131.5，130.8，129.9，129.1，128.3，126.1，124.0，116.2，85.8，75.4，61.6，57.7，30.1，22.2，13.7； 
HRMS m/z：(M+H)+C33H43N7O8P理论值696.29，实测值696.34。 
制备Icb(单L氨丁三醇盐)：磷酸二氢[3-[(4-苯甲酰基哌嗪-1-基)(氧代)乙酰基]-4-甲氧基-7-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基]甲酯，2-氨基-2-(羟甲基)丙-1，3-二醇盐(1∶1) 
Figure GSA00000095036601011
将500mg(～75AP，0.54mmol)二酯IIc溶于水(2.5ml)和丙酮(2.5ml)的混合物中。在40℃下，搅拌得到的混合物16小时，完成溶剂解。向该反应混合物中加入3.0M TRIS(单氨丁三醇)水溶液，使pH调节至3.32。在1小时内*，将丙酮(30ml)缓慢加入反应混合物中。加入丙酮结束后，搅拌溶液过夜，使Icb结晶完全。过滤收集固体，用20∶1的丙酮-水(2×5mL)冲洗。在氮气氛下，在50℃下，将白色结晶固体在常压下干燥24h，得到290mg Icb(＞98.5AP)。 
*加入约15和20ml丙酮后，向反应混合物中加入Icb晶种。 
在以上操作中得到Icb： 
1H NMR(500MHz，CD3OD)δ8.83(s，1H)，8.52(s，1H)，8.02(s，1H)7.49(b，5H)，5.469(d，2H，J＝13Hz)，4.11(s，3H)，4.00-3.40(m，8H)，3.66(s，6H)，2.50(s，3H)；13C NMR(125MHz，CD3OD)δ185.6，171.9，167.4，161.4，151.7，146.9，143.8，135.4，130.3，129.7，128.8，127.2，124.9，122.6，114.3，73.5，61.8，59.9，56，5，46.0，41.7，12.6. 
HRMS m/z：(M-三胺+H)+C25H27N7O8P理论值584.1659，实测值584.1664。元素分析：C，49.43；H，5.29；N，15.90；P，4.39；实测值：C，49.18；H，5.38；N，15.59；P，4.26。熔点203℃。 
通过其它方法(用TFA的二氯甲烷溶液水解)得到的盐Icb为～1mol单氨丁三醇盐，含0.47％水，0.1％丙酮和0.05％甲醇。 
1H NMR(500Mz，d6-DMSO，30℃)δ8.77(s，1H)，8.48(s，1H)，8.00(s，1H)7.44(b，5H)，5.42(d，2H，J＝15Hz)，4.02(s，3H)，3.70-3.30(m，8H)，3.41(s，6H)，2.38(s，3H)；13C NMR(125MHz，CDCl3，30℃)δ184.8，169.0，165.8，160.3，150.4，146.2，143.2，135.4，129.4，128.9，128.2，127.7，126.9，123.2，122.2，112.9，72.3，60.7，59.0，56.7，13.4. 
MS m/z：(M-三胺+H)+C25H27N7O8P理论值584.2，实测值584.0。元素分析：理论值C，49.11；H，5.37；N，15.76；P，4.32；实测值：C，48.88；H5.28；N，15.71；P，4.16.M.P.201-205℃。 
形成另一种Iac盐的通用方法 
Figure GSA00000095036601021
方法A： 
将1.2当量金属醇盐加入磷酸的THF溶液中，收集沉淀，为盐形式。 
方法B： 
将2.2当量(对于Na，K)或1.2当量(对于Mg)金属醇盐加入磷酸的THF溶液中。2小时后，蒸发溶剂，加入MeOH，得到澄清溶液。然后将EtOH或iPrOH加入溶液中直至溶液变混浊。然后小心加入MeOH，让溶液恰好再变澄清。让混合溶液向空气开放16小时，收集得到的沉淀，为盐形式。 
方法C： 
将2.2当量胺加入磷酸的THF溶液中。2小时后，蒸发溶剂，加入MeOH，得到澄清溶液。然后将EtOH或iPrOH加入溶液直至变混 浊。然后，小心加入MeOH，让溶液恰好又变澄清。让混合溶液向空气开放16小时，收集得到的沉淀，为盐形式。 
Figure GSA00000095036601031
实施例11 
由IIa制备化合物II′ 
Figure GSA00000095036601042
将磷酸二酯IIa(500mg)溶于5ml 10％TFA的THF溶液。将反应混合物在室温下搅拌4小时，然后通过10％Na2CO3水溶液(30ml)猝灭。用EtOAc(50ml)洗涤后，真空浓缩水相，得到残留物，用Shimadzu自动制备型HPLC系统，得到需要的单磷酸酯II′a(26.5mg))。 
1H NMR(500MHz，CDCl3)d8.13(s，1H)，7.40(b，6H)，6.13(d，2H，J＝11.5Hz)，4.05(s，3H)，3.88(s，3H)，3.90-3.40(m，8H)，1.39(s，9H)； 
MS m/z：(M+H)+C27H34N4O9P理论值589.21，实测值589.13；LC保留时间1.32min(柱：Xterra 4.6×50mm C 185μm)。 
制备磷酸二叔丁酯氯甲酯的备选方法 
Figure GSA00000095036601051
反应 
通过入孔向惰性反应器中加入二叔丁基磷酸钾(1.69kg)、4.0当量碳酸钠和0.05当量硫酸氢四丁铵。然后通过喷雾球泵入二氯甲烷(7.7L/kg)洗涤反应器壁。套层温度低于10℃，在10分钟内，加入热水(exothermic water)(7.6L/kg)。加入期间，因稍微放热，物料温度由11.1升至16.2℃。当套层和物料温度分别接近7和15℃时，通过加料漏斗加入2.0当量氯甲基磺酰氯(CMCS)。加入持续2小时，同时在加入期间，套层温度缓慢升至20℃。在加入CMCS期间，物料最高温度为25.3℃。在加入期间，使套层温度缓慢上升，确保放热按初步实验数据所示开始，可使放热在较低物料温度下减缓。搅拌反应混合物，3.5小时后，NMR样品表明反应进行72％。让反应继续过夜，物料温度为19.7-23.6℃(δV纪录(historian))。16小时后，采集样品，NMR分析表明反应物转化76％。实验批次转化范围为60-80％。 
后处理 
认为反应完成后，按9.3L/kg，向该批物料中再加入水，实现相分层。将富集产物的下相移入细口玻璃瓶，弃去上层水相。将少量乳化层与富集产物的有机层合并。将有机相倒回R-1A，按5.1L/kg再加入水用于洗涤。各相分层，将约18.5kg富集产物的有机相到入细口玻璃瓶，而弃去上层水相。在第二次分层中未见乳化层或固体。但是，建议过滤富集产物的有机层以除去沉淀的盐。 
蒸馏二氯甲烷 
将富集产物的有机层移至旋转蒸发仪的EVAPO-1A转筒中。在套层温度约22℃下，启动二氯甲烷蒸馏。4.5小时后，减缓蒸馏速度，采集批样品，分析二氯甲烷含量。NMR分析表明磷酸二叔丁酯氯甲酯与二氯甲烷的比例为4∶1。典型的该蒸汽实验结果表明10∶1比例，所以通过增加旋转蒸发仪套层温度继续蒸馏。又过2.5小时后，停止蒸馏。批样品NMR分析表明磷酸二叔丁酯氯甲酯与二氯甲烷的比例增加至5∶1。最高旋转蒸发仪的套层温度是28.4℃。 
磷酸二叔丁酯氯甲酯油的纯度 
磷酸二叔丁酯氯甲酯油的NMR分析表明效力(potency)大于100％。开发工作通常产生效力为100±10％的物质。Karl-Fischer分析测量的水含量为0.02％重量，GC分析测量的二氯甲烷为10.69％重量。因此，报道的效力为89.29％重量，解释了二氯甲烷和水在油中的分布。储存磷酸二叔丁酯氯甲酯 
将磷酸二叔丁酯氯甲酯置于冷库，纸带制图记录仪监测温度。通常将实验批保持在0-5℃。在冷库中保存104小时后，产物NMR表明物质未失去效力。 
(在操作期间进行的安全测试表明，在保存期间，油通过随后的压力聚集自动加热)。 
NMR标准制备和样品制备 
制备磷酸三甲酯(TMPO4)标准溶液： 
应按100M％理论收率制备TMPO4标准溶液。例如：输入10g二叔丁基磷酸钾盐应得到10.41g(0.402mol)磷酸二叔丁酯氯甲酯。反应混合物中的二氯甲烷体积应为75mL。溶液的体积摩尔浓度为0.536。按该体积摩尔浓度制备TMPO4溶液，应将0.5mL该溶液与0.5mL反应物中的二氯甲烷层混合。可直接对比31P NMR积分，可得到磷酸二叔丁酯氯甲酯的转化％。 
测定反应物水相中未反应原料％： 
记录反应物水相体积后，精确将0.500mL转移至含已知内标TMPO4重量的1-英钱瓶中。加入约0.24mL D2O。振摇充分混合。得到31P-定量光谱。 
计算％未反应原料： 
Figure GSA00000095036601071
实例： 
Figure GSA00000095036601072
测定产物油的效力％： 
记录蒸馏产物油的净重后，称量1-英钱带旋盖的瓶中含有已知重量内标TMPO4的皮重。将约0.02mL产物油转移到瓶中，记录产物油的净重。加入约0.7mL CDCl3。振摇充分混合。得到31P-定量光谱。 检查存在残余相转移催化剂(硫酸氢四正丁铵)和二氯甲烷的1H NMR谱。按相对于产物的mo1％报道这些。 
计算效力％： 
Figure GSA00000095036601081
实例： 
磷酸二叔丁酯氯甲酯的NMR数据 
1H NMR(300.13MHz，CDCl3)：δ1.52(s，18H)，δ5.67(d，J＝15.5，2H) 
13C NMR(75.47MHz，CDCl3)：δ29.77(d，J＝4.5，6C)，δ73.34(d，J＝7.5，1C)，δ84.16(d，J＝1.5，2C) 
31P NMR(121.49MHz，CDCl3)：δ-10.51(s，1P) 
实施例12：制备Iab(IVa的前药)的备选方法 
Figure GSA00000095036601083
向配备瓶顶搅拌器、热电偶、加料漏斗、氮气接口和橡皮塞的500ml 4颈圆底烧瓶加入IVa(20.01g，47.37mmol)、K2CO3(13.13g，95.00mmol)和DMSO(100ml，1.41mol)，在室温下搅拌反应物，产生浅棕色多相悬浮液。通过加料漏斗加入磷酸二叔丁酯氯甲酯(14.83g，57.32 mmol)，加热反应物至30℃，保持16-24小时，之后将反应物冷却至10℃。向反应物中加入DCM(200ml)，然后用水(200ml)缓慢猝灭，保持反应温度低于20℃，得到两相混合物。分离富集产物的底层，用水(200ml)洗涤，然后转移至配备瓶顶搅拌器、热电偶、加料漏斗、氮气接口的500ml 4颈圆底烧瓶中。通过加料漏斗加入三氟乙酸(53.0ml，700.94mmol)，产生略微放热。搅拌反应物1-3小时，然后冷却至0℃。加入甲醇(300ml)，保持反应温度低于20℃，然后冷却至0℃。给反应烧瓶安装蒸馏器，真空浓缩至200ml体积(200托，＜30℃)。在室温下，向反应物中加入Iac晶种(0.200g)，然后搅拌过夜，产生浆状物。然后过滤浆状物，用THF(300ml)洗涤湿滤饼，然后在50℃下，在真空箱中干燥过夜，得到浅黄色至白色粉末(23.94g，95％)。 
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.30(s，1H)，7.55(s，1H)，7.44(s，5H)，6.12(d，J＝10.6Hz，2H)，3.97(s，3H)，3.85(s，3H)，3.80-3.22(m，8H)； 13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ185.49，169.26，166.06，146.20，145.60，140.64，135.50，129.68，128.41，127.04，123.46，121.17，120.08，114.32，72.43，56.92，53.32，45.22，40.50； 
ES+MS m/z(相对强度)533(MH+，100)，453(MH+-H3PO4，15)。 
Figure GSA00000095036601091
向配备热电偶、塔顶搅拌器、冷凝管、氮气接口的10L 4颈反应器中加入Iac(611g，1.15mol)和水(3875ml)。向得到的悬浮液加入赖氨酸(168g，1.15mol)。在室温下搅拌反应物，加热至50℃，然后保持在50℃，再搅拌1小时。将得到的混浊溶液(pH＝4.55)通过10微米cuno滤器过滤到配备热电偶、塔顶搅拌器、冷凝管、氮气接口的20L4颈反应器中。加热反应物至50℃，然后迅速加入丙酮(8L)。使反应物升温至50℃，然后加入丙酮(4L)，以保持反应温度高于45℃的中 等速度加入为宜。向反应物中加入Iab晶种(0.200g)，然后在5小时内，冷却至室温，得到浆状物。在室温下，搅拌浆状物过夜，然后过滤。用丙酮(4L)洗涤湿滤饼，然后在25℃下，在真空箱中干燥过夜，抽去湿空气流，得到蓬松状白色粉末(751g，96％)。 
实施例13：制备Icb(IVc的前药)的备选方法 
Figure GSA00000095036601101
向配备塔顶搅拌器、热电偶、蒸馏仪、氮气接口的10L反应器中加入IVc(200.00g，422.39mmol)、Cs2CO3(344.06g，1.06mol)、KI(140.24g，844.81mmol)和NMP(1.00L，10.38mol)。在室温下搅拌反应物，得到浅棕色多相悬浮液。通过加料漏斗加入磷酸二叔丁酯氯甲酯(273.16g，1.06mol)，搅拌下，加热反应混合物至30℃，保持16-24小时，之后将反应物冷却至5℃。向反应物中加入DCM(1.5L)，然后用水(3.5L)缓慢猝灭反应，保持反应温度低于20℃，得到双相混合物。分离富集产物的底层，用水(3.5L×3)洗涤，然后转移回到反应器。真空浓缩溶液至1L体积，保持温度低于25℃。加入EPA(2L)，然后真空浓缩反应物至2L体积，保持温度低于25℃。然后向反应物中加入IIc晶种(0.200g)，在室温下搅拌过夜，得到浆状物。过滤浆状物，用MTBE(1L)洗涤湿滤饼，在50℃下，在真空箱中干燥过夜，得到黄色/白色粉末(207.1g，70％)。 
1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.54(s，1H)，8.18(s，1H)，7.91(s，1H)，7.42(s，5H)，5.95(d，J＝14.2Hz，2H)，4.06(s，3H)，3.97-3.36(m，8H)，2.50(s，3H)，1.27(s，18H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ184.64，170.65，165.91，161.60，150.82，145.38，141.89，134.96，130.20，129.59，128.68，127.58，127.10，124.77，122.64，115.22，83.90，83.83，73.69，73.63，56.95，46.04，41.66，29.61，29.56，13.90； 
ES+MS m/z(洗涤强度)696(MH+，10)，640(MH+-异丁烯，30)，584(MH+-2异丁烯，100)。 
向配备塔顶搅拌器、热电偶、蒸馏仪、氮气接口的10L 4颈反应器中加入IIc(200.24g，287.82mrnol)、丙酮(800.00ml，10.88mol)和水(800.00ml，44.41mol)。加热反应物至40℃，搅拌18-24小时。冷却反应物至20℃，然后加入氨丁三醇(33.62g，277.54mmol)。加热反应物至40℃，然后再搅拌1小时直至所有固体溶解。冷却反应物至20℃，然后通过10微米cuno滤器过滤到配备塔顶搅拌器、热电偶、氮气接口的10L 4颈反应器中。迅速加入丙酮(3L)，随后加入Icb晶种(0.500g)，然后再加入丙酮(3L)。在室温下搅拌反应物过夜，得到浆状物，然后过滤。用丙酮(800ml)洗涤湿滤饼，然后在50℃下，在真空箱中干燥过夜，得到蓬松状白色粉末(165.91g，82％)。 
补充信息： 
分离游离酸中间体Ic： 
Figure GSA00000095036601121
在配备塔顶搅拌器、热电偶、冷凝管、氮气接口的250mL 3颈反应器中加入IIc(10.0g，14.37mmol)、丙酮(40.00ml，544.15mmol)和水(40.00ml，2.22mol)。加热反应物至40℃，搅拌14-24小时。冷却反应物至20℃，然后搅拌3小时，得到浆状物。过滤浆状物，然后用丙酮(40.00ml)洗涤，然后在50℃下，在真空箱中干燥过夜，得到得到蓬松状白色粉末(7.00g，83％)。 
NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.84(s，1)，8.47(s，1H)，8.06(s，1H)，7.45(s，5H)，5.81(d，J＝12.3Hz，2H)，4.03(s，3H)，3.91-3.19(m，8H)，2.39(s，3H)；13C NMR(500MHz，DMSO-d6)δ185.20，169.32，165.85，160.75，150.51，146.30，143.24，135.53，129.74，129.22，128.46，127.34，127.09，123.67，122.73，113.94，72.90(d，2JC-P＝5Hz)，57.01，45.2(bs)，40.8(bs)，13.66.ES+MSm/z(相对强度)486(MH+-H3PO4，100)。 
实施例14：制备Ibb(IVb的前药)的备选方法 
Figure GSA00000095036601122
向配备塔顶搅拌器、热电偶和氮气接口的10L反应器中加入IVb(400.00g，894.73mmol)、Cs2CO3(873.70g，2.68mol)、KI(297.70g，1.79 mol)和NMP(1.00L，10.38mol)。在室温下搅拌反应混合物，得到浅棕色多相悬浮液。通过加料漏斗加入磷酸二叔丁酯氯甲酯(460.50g，1.78mol)，加热反应物至30℃，保持16-24小时，此时，冷却反应物至5℃。向反应物中加入n-BuOAc(2.4L)，然后用水(4L)缓慢猝灭反应，保持反应温度低于20℃，得到双相混合物。除去反应器底水层，然后向富集产物的上层加入IIc晶种(0.40g)，然后在室温下搅拌3小时，得到浆状物。过滤浆状物，然后用MTBE(1.6L)洗涤湿滤饼，在50℃下，在真空箱中干燥过夜，得到黄色/白色粉末(483.2g，81％)。 
1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.35(s，1H)，8.27(s，1H)，8.22(s，1H)，7.90(s，1H)，7.42；(s，5H)，5.92，(d，J＝14.9Hz，2H)，4.02-3.40(m，8H)，1.24(s，18H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ182.75，170.64，152.07，144.03，134.91，133.96，131.82，130.21，128.68，128.27，128.00，127.07，125.81，124.01，113.82，84.00，83.93，73.97，46.12，41.90，29.57，29.53； 
ES+MS m/z(相对强度)558(MH+，100)。 
Figure GSA00000095036601131
向配备热电偶、塔顶搅拌器、冷凝管和氮气接口的300ml 4颈反应器中加入IIb(18.0g，26.87mmol)、EPA(36.00ml，470.92mol)和水(36.00ml，2.0mol)。加热反应物至40℃，搅拌18-24小时。冷却反应物至20℃，然后加入赖氨酸(3.73，25.54mmol)。搅拌反应物1小时直至所有固体溶解。在30分钟内加入IPA(54ml)，随后加入Ibb晶种(0.180g)，再搅拌30分钟。在1小时内，加入IPA(18ml)，然后加热反应物至50℃，得到稀浆状物。向反应物中加入晶种Ibb(0.180g)，然后在2小时内加入IPA(36ml)，然后搅拌12小时，得到浆状物。加热反应物至70-80℃，保持2-3小时，然后冷却至50℃。在1小时内， 加入IPA(59ml)，在1小时内，再加入EPA(121ml)。在2小时内，冷却反应物至20℃，再搅拌2小时，然后过滤。用IPA(180ml)洗涤湿滤饼，在50℃下，在真空箱中干燥过夜，得到白色粉末(15.43g，82％). 
补充信息： 
分离游离酸中间体Ibc的方法： 
Figure GSA00000095036601141
向配备热电偶、塔顶搅拌器、冷凝管和氮气接口的500ml 3颈烧瓶中加入IIb(50.00g，74.76mmol)、丙酮(100.00ml，1.36mol)和水(100.00ml，5.55mol)。加热反应物至40℃，搅拌18-24小时。 
向配备pH探针、磁搅拌棒和氮气接口的250ml 3颈烧瓶中加入以上150ml Ibc溶液，然后用10N NaOH将pH调至pH＝6.2。将溶液转移到分液漏斗中，然后依次用EtOAc(100ml)、DCM(100ml)洗涤，然后倒回250ml 3颈烧瓶。用2N HCl调节pH至pH＝1.3，随后搅拌3小时，得到浆状物，过滤。将湿滤饼在MTBE(150ml)中再制浆，过滤，随后在THF/水(100∶1，130ml)中再制浆45分钟，然后过滤，在50℃下，在真空箱中干燥过夜，得到白色粉末(10.0g，33％)。 
NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.69(s，1H)，8.62(s，1H)，8.42(s，1H)，7.98(s，1H)，7.41(s，5H)，5.47(d，J＝13.3Hz，2)，3.99-3.18(m，8H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ183.97，169.23，165.20，151.69，145.91，135.48，133.83，131.59，129.65，129.11，129.03，128.42，127.77，127.49，127.03，122.62，112.08，72.57. 
ES+MS m/z(相对强度)558(MH+，100)。 
实施例15：制备前药Ie 
步骤1 
Figure GSA00000095036601151
制备2-(1-(2-(4-甲氧基-7-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-3-基)-2-氧代乙酰基)亚哌啶-4-基)-2-(吡啶-2-基)乙腈(IVe)：将2-(4-甲氧基-7-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-3-基)-2-氧代乙酸(1.5g)、2-(亚哌啶-4-基)-2-(吡啶-2-基)乙腈盐酸盐(1.5g)、3-(二乙氧基磷酰基氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT)(2.1g)和Hunig’s碱(2ml)在20ml DMF中混合。将混合物在室温下搅拌16小时。减压蒸发除去DMF，用MeOH(80ml)分配残留物。过滤收集沉淀，得到0.85g产物，2-(1-(2-(4-甲氧基-7-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-3-基)-2-氧代乙酰基)亚哌啶-4-基)-2-(吡啶-2-基)乙腈(IVe)。 
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ12.42(s，1H)，9.23(m，1H)，8.69(m，1H)，8.27(m，1H)，7.89(m，2H)，7.58(m，1H)，7.52(m，1H)，3.98(s，3H)，3.99-2.70(m，8H)，2.60(m，3H). 
MSm/z：(M+H)+C25H23N8O3理论值483.19，实测值483.18。 
步骤2 
Figure GSA00000095036601152
将磷酸酯(45.1g，0.1mol)和氯碘代甲烷(200g，1.14mol)在100ml苯中混合，将混合物在室温下搅拌4小时，然后真空除去苯。然后，将 500ml乙醚加入残留物，滤除不溶性固体。浓缩滤液，得到磷酸二叔丁酯氯甲酯，用于下一步时无须进一步纯化。 
步骤3 
Figure GSA00000095036601161
将NaH(0.2g，95％)缓慢加入2-(1-(2-(4-甲氧基-7-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-3-基)-2-氧代乙酰基)亚哌啶-4-基)-2-(吡啶-2-基)乙腈(IVe)的无水THF(20ml)悬浮液中，将混合物在室温下搅拌1小时。将碘(0.4g)的无水THF(2ml)溶液缓慢加入搅拌的溶液中。再搅拌混合物3小时，然后加入0.2g NaH。加入结束后，将得到的混合物在环境温度下再搅拌15分钟，然后加入由步骤2得到的磷酸二叔丁酯氯甲酯。搅拌16小时后，将反应混合物倾入冰NH4OAc(30％)(50ml)，随后用EtOAc(3×100ml)萃取。依次用水(50ml)和盐水(50ml)洗涤合并的有机萃取液，经Na2SO4干燥，真空浓缩，得到残留物，经硅胶层析(用EtOAc/Et3N(100/1)洗脱)纯化，得到330mg二叔丁基磷酸(3-(2-(4-(氰基(吡啶-2-基)亚甲基)哌啶-1-基)-2-氧代乙酰基)-4-甲氧基-7-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基)甲基酯(IIe)。 
1H NMR(500MHz，CD3OD)δ8.85(m，1H)，8.66(m，1H)，8.45(m，1H)，8.06(m，1H)，7.92(m，1H)，7.60(m，1H)，7.43(m，1H)，6.05(m，2H)，4.11(s，3H)，4.00(m，1H)，3.82(m，1H)，3.76(m，1H)，3.60(m，1H)，3.04(m，1H)，2.95(m，1H)，2.85(m，1H)，2.80(m，1H)，2.52(s，3H)，1.30(m，18H). 
MSm/z：(M+H)+C34H42N8O7P理论值705.29，实测值605.30。 
步骤4 
Figure GSA00000095036601171
将二叔丁基磷酸(3-(2-(4-(氰基(吡啶-2-基)亚甲基)哌啶-1-基)-2-氧代乙酰基)-4-甲氧基-7-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基)甲基酯(IIe)溶于8ml TFA和二氯甲烷(10％TFA/CH2C12)的混合溶液中，搅拌混合物3小时。真空除去所有溶剂，用Shimadzu自动制备型HPLC纯化残留物，得到25mg磷酸氢叔丁酯(3-(2-(4-(氰基(吡啶-2-基)亚甲基)哌啶-1-基)-2-氧代乙酰基)-4-甲氧基-7-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基)甲酯(II’e)和33mg磷酸二氢(3-(2-(4-(氰基(吡啶-2-基)亚甲基)哌啶-1-基)-2-氧代乙酰基)-4-甲氧基-7-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基)甲基酯(Ie)。 
磷酸氢叔丁酯(3-(2-(4-(氰基(吡啶-2-基)亚甲基)哌啶-1-基)-2-氧代乙酰基)-4-甲氧基-7-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基)甲酯(II′e)： 
1H NMR(500MHz，CD3OD)δ8.83(m，1)，8.55(m，1H)，8.35(m，1H)，7.92(m，2H)，7.54(m，1H)，7.41(m，1H)，5.86(m，2H)，3.98(s，3H)，3.96(m，1H)，3.72(m，1H)，3.65(m，1H)，3.47(m，1H)，2.92(m，1H)，2.85(m，1H)，2.71(m，1H)，2.65(m，1H)，2.40(s，3H)，1.15(m，9H). 
MSm/z：(M+H)+C30H34N8O7P理论值649.23，实测值649.22。 
磷酸二氢(3-(2-(4-(氰基(吡啶-2-基)亚甲基)哌啶-1-基)-2-氧代乙酰基)-4-甲氧基-7-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基)甲基酯(Ie)： 
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ8.88(m，1H)，8.65(m，1H)，8.50(m，1H)，8.06(m，1H)，7.90(m，1H)，7.49(m，2H)，5.82(m，2H)，4.04(s，3H)，3.96(m，1H)，3.88(m，1H)，3.72(m，1H)，3.46(m，1H)，2.94(m，1H)，2.82(m，2H)，2.73(m，1H)，2.40(m，3H)；13C NMR(125MHz，DMSO-d6)δ185.2，165.6，160.6，159.1，151.0，150.4，149.5，146.2，143.1，137.4，129.1，127.2，124.4，123.6，122.6，117.4，116.3，113.9，110.0，72.8，56.9，48.4，44.4，36.4，34.0，13.6.MS m/z：(M+H)+C26H26N8O7P理论值593.17，实测值593.14。 
实施例16：制备前药If 
Figure GSA00000095036601181
在室温下，向在带盖瓶中的IVf(99.5mg，0.21mmol)和1-甲基-2-吡咯烷酮(1.0ml)的混合物加入KI(144mg，0.87mmol)和Cs2CO3(416mg，1.28mmol))，搅拌混合物约5min。然后滴加磷酸二叔丁酯氯甲酯试剂(218mg，0.84mmol)。然后在35-40℃下，搅拌得到的混合物20小时。然后用H2O(约8ml)稀释混合物，用EtOAc(约8ml)萃取。将有机萃取液分离，蒸发，得到磷酸二叔丁酯氯甲酯； 
分析HPLC方法：溶剂A 10％MeOH-90％H2O-0.1％TFA；溶剂B 90％MeOH-10％H2O-0.1％TFA；开始％B＝0，结束％B＝100，梯度时间＝ 2min，流速＝5mL/min，柱：Xterra MS C18S73.0×50mm；LC/MS：(ES)m/z(M+H)+＝694.22，HPLC Rt＝1.243。 
在40℃下，搅拌在闭塞的圆底烧瓶中的中间体IIf和H2O/异丙醇(1.0ml/1.0ml)的混合物9.5小时。然后冷却混合物至室温，用移液管将溶液移入瓶中。将MeCN(1.0ml)加入该溶液中，然后缓慢加入异丙醇，用刮铲间歇搅拌。然后过滤灰白色沉淀，用异丙醇(2×1.0ml)洗涤，然后在高真空下干燥，得到前药If； 
1H NMR(500MHz)：(DMSO-d6)δ8.76(s，1H)，8.71(s，1H)，8.69(s，1H)，8.49(s，1H)，8.09(d，J＝8，1H)，8.06(s，1H)，7.89(d，J＝7，1H)，7.85(app t，1H)，7.59(app t，1H)，5.68(d，J＝13，2H)，4.00(b m，2H)，3.90(b m，2H)，3.85(bm，2H)，3.65(bm，2H)； 
分析HPLC方法：溶剂A 10％MeOH-90％H2O-0.1％TFA；溶剂B 90％MeOH-10％H2O-0.1％TFA；开始％B＝0，结束％B＝100，梯度时间＝2min，流速＝5mL/min，柱：Xterra MS C18S73.0×50mm；LC/MS：(ES)m/z(M+H)+＝582.00，HPLC Rt＝1.797。 
如欲获成功，必须通过人体内碱性磷酸酯酶启动将前药转化为母体药物。用人肽盘碱性磷酸酯酶进行的体外定量研究和大鼠体内研究表明，前药在体外人酶和大鼠体内快速转化。很理想，转化速度很快，以致仅有限暴露前药，就会导致活性母体抗病毒药物的最大暴露。(以下)研究数据表明，在大鼠中评价所有三种前药的实施例中，前药迅速转化为活性母体药物，在所有数据点上，与母体药物相比血浆前药水平极低。这些研究按剂量进行，其中母体药物剂量和相当于磷酸酯(盐)前药的剂量较小并约相等～5mg/kg。因为前药的优势是克服溶出度限制的吸收，在患者临床使用低剂量时，前药比难溶母体分子强的优势不明显。低剂量体内研究用于测定前药是否产生母体分子。母体分子IV的溶解性取决于结晶型式。优选用于药物开发的结晶型式。可通过假定所有母体分子IV的结晶物质的水溶性＜50μg/mL和在某些情形中更小来综合所有母体分子的数据。因此，较高剂量下，母体分子的固有水溶性低，在造成溶出度限制吸收中起主要作用。 
表1-磷酸二氢N-甲基酯(或盐)氮杂吲哚氧代乙酰哌嗪衍生物的生物学和药学性质 
  化合物Ia  (二钠盐)   化合物Ib  (二钠盐)   化合物Ic  (酸形式)
  溶解度(mg/mL)，pH  6.5   ＞18   ＞8   1
  在碱性磷酸酯(盐)  酶中的体外转化(注  释1)   完全和快速转化  为母体化合物，  不形成任何中间  体   完全和快速转化为  母体化合物，不形  成任何中间体   完全和快速转化  为母体化合物，不  形成任何中间体
  大鼠口服(注释2)  MAP研究体内转化   血浆中快速产生  母体化合物   血浆中快速产生母  体化合物   血浆中快速产生  母体化合物
  大鼠进食(注释2)  MAP研究体内转化   血浆中快速产生  母体化合物   血浆中快速产生母  体化合物   血浆中快速产生  母体化合物
注释1：将前药衍生物(浓度～0.2mM)与碱性磷酸酯酶(人胎盘，Sigma，～1.4单位)在pH 8Tris缓冲液(浓度～0.03M，1mL)中温育，通过HPLC和LC/MS监测前药消失和母体药物形成。在大多数情形中，前药完全消失。在1或2小时内，相应形成母体药物，未检出其它中间体。注释2：通过口服(相当于母体药物5mg/Kg剂量)或静脉内途径(相对于母体药物1mg/Kg剂量)给予大鼠前药。血浆水平表明快速转化为母体药物，不存在可检出量的前药(po)。 
在下表中，术语″LLQ″表示定量下限(即不能检出)。 
表2：MAP研究A：PO和IV给予大鼠前药Ia后的PK总结。与历史PO给予大鼠化合物IVa的对比 
表3：MAP研究B：PO和IV给予大鼠前药Ib后的PK总结。与历史PO给予化合物IVb的大鼠对比 
Figure GSA00000095036601221
表4：MAP研究C：PO和IV给予大鼠前药Ic后，PK总结。与历史PO给予大鼠化合物IVc的对比 
Figure GSA00000095036601231
所有三个表-2、3和4的解答： 
＊AUCtot比率：——IV给予前药后母体药物的总AUC 
                 IV给予母体药物后母体药物的总AUC(历史数据) 
＊＊AUCtot比率＝——PO给予前药后母体药物的总AUC 
                    PO给予母体药物后母体药物的总AUC(历史数据) 
在大鼠中进行前药(Ica)研究之一的剂量递增研究D，以证明给药后，在治疗HIV-1患者的潜在用途中，前药比母体药物具有明显优势。 将前药剂量递增研究中的暴露数据和测量参数与用母体分子进行的历史研究中的类似数据相比较。 
图3和4比较了经口给予前药Ica后IVc的AUC(曲线下面积，在大鼠中测量药物暴露的指标)(研究D)与给予母体分子IVc得到的IVc的AUC(研究E)的对比，和大鼠毒性动力学研究(TK)。历史IVc剂量递增(研究E)和大鼠TK研究(F)的细节示于这些图中。 
由图3和4可以看到，经口给予前药(三角形)后母体分子的AUC和Cmax比在两个单独的研究中给予母体药物后得到的数据大。数据清楚表明为使药物在血浆中的暴露倍数最大，前药提供出乎意料的优势。因为该类分子的化学结构相似，预计给予前药而非母体药物后，这类前药增加暴露。由于磷酸酯(盐)前药提高口服暴露的不确定性和新化合物的新颍性，该结果不明显，其幅度出乎意料。 
表5.大鼠TK研究；研究F；在三种剂量下，PO给予大鼠IVc的历史研究 
Figure GSA00000095036601241
研究A、B和C的IV和经口给予大鼠磷酸酯(盐)前药PK研究方案 
通过IV大剂量(1mg/kg；本文件中列出的所有剂量均相当于母体化合物的量)或喂饲(5mg/kg)，分别给予三只雄Sprague-Dawley大鼠/组化合物Ic(IVc的磷酸酯(盐)前药)、Ib(IVb的磷酸酯(盐)前药)和Ia(IVa的磷酸酯(盐)前药)、经口给药的大鼠禁食过夜。给予化合物Ic 游离酸，而其它两种为钠盐。用100％正常盐水，按1mg/mL(给药溶液浓度相当于母体化合物浓度)配制用于IV和经口给药的所有三种前药溶液。将血浆样品收集在EDTA真空容器中，保存24h，通过LC/MS/MS分析前药和母体分子。在KineticaTM上进行药物动力学分析。 
LC/MS/MS分析方法见以下方案。 
该研究结果见表2-4，中间两列。 
大鼠口服Ica剂量递增研究方案(研究D) 
按4.5、21和163mg/kg(相当于IVc的剂量)，经口给予三只禁食雄性Sprague-Dawley大鼠/组化合物Ica(二钠盐)。按1、5和20mg(相当于化合物Ic(游离酸))/mL，用水分别制备4.5、21和163mg(相当于化合物IVc)/kg剂量给药溶液。将血样收集在EDTA真空容器中，保存24h，通过LC/MS/MS分析Ic和IVc。在KineticaTM上进行药物动力学分析。 
该研究结果见表46和图3-5。 
Figure GSA00000095036601261
1.*AUC从0-24小时，因为AUC(24小时-无穷大)至少大于35％总AUC(0-无穷大)。该部分太大以致无法准确测量总AUC。 
2.由IVc至Ica，AUC转化率按5mg/kg进行，计算给予Ica后IVc的AUC除以直接给予IVc后IVc的AUC的比例，为0.99。 
3.在200mg/kg剂量组，在每只大鼠的1-2个样品中仅检测到～20-40nM前药Ica。 
体内方法 
研究A1方法：PO和IV给予大鼠IVa；PO剂量为5mg/kg 
除另有说明外，给予化合物IVa的聚乙二醇400(PEG400)/乙醇(EtOH)溶液(90/10，v/v)。采集血浆和组织样品，在-20℃下保存待分析。导管插入颈静脉和/或胆道的雄性Sprague-Dawley大鼠(300-350g，Hilltop Lab Animals，Inc.，Scottdale，PA 15683)用于化合物IVa的药物动力学研究。在PO研究中的大鼠禁食过夜。将从颈静脉采集的血样(0.3mL)保存在含EDTA的microtainer试管中(Becton Dickinson， Franklin Lakes，NJ 07147)，得到血浆。在IV研究中，在0.5min内，给予3只大鼠1mg/kg剂量，在给药前给药后2、10、15、30、45、60、120、240、360、480和1440min时采集系列血样。在PO研究中，大鼠(n＝3)接受5和100mg/kg PO剂量。在给药前和给药后15、30、45、60、120、240、360、480和1440min采集系列血样。 
该研究的口服(PO)结果示于表2最右列。 
母体药物研究B1 
为进行IV和PO给予大鼠化合物IVb的药物动力学研究，将化合物IVb溶于PEG-400/乙醇(90/10)作为溶液。为进行IV和PO给予犬化合物IVB的药物动力学研究，将化合物IVb溶于PEG-400/乙醇(90/10)，用0.1N NaOH调节pH。在表6中提供处方细节。 
大鼠.使用导管插入颈静脉和/或胆道的雄性Sprague-Dawley大鼠(300-350g，Hilltop Lab Animals，Inc.，Scottdale，PA)。使PO药物动力学研究中的大鼠禁食过夜。将从颈静脉采集血样0.3mL保存在含EDTA的microtainer试管中(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)，离心以分离血浆。 
在IV研究中，在0.5min内，按1mg/kg，大剂量递送化合物IVb(n＝3)。在给药前和给药后2、10、15、30、45、60、120、240、360、480和1440min采集系列血样。 
在PO给予化合物IVb研究中，给予大鼠(n＝3)口服剂量5mg/kg化合物IVB。在给药前和给药后15、30、45、60、120、240、360、480和1440min采集系列血样。 
该口服(PO)研究结果见表3，最右列。 
表6：用于体内研究的IVb制剂 
 化合物IVb研究   形式   溶媒   浓度(mg/ml)   粒径
 大鼠PK (研究B1)   无定形   90∶10，PEG400/EtOH  调节至pH 8.6-9.0   3   NA(溶液)
用于分析IVb的体内研究的生物分析方法 
这是指分析大鼠血浆样品中IVb浓度水平的方法(用于研究B和B1)。 
通过LC/MS/MS定量血浆中的化合物IVb。通过用含内标化合物IVa的2体积乙腈沉淀血浆蛋白，制备取自大鼠、犬、猴或黑猩猩研究的血样中的等份试样进行分析。通过离心10分钟使生成的上清液与沉淀蛋白分离，转移至自动进样瓶中。用人工或Tomtec自动液体处理器制备样品。注射5μL试样进行分析。 
HPLC系统由双Shimadzu LC 10AD泵(Columbia，MD)，ShimadzuSIL-HTC自动进样器(Columbia，MD)和Hewlett Packard Series1100柱箱(Palo Alto，CA)组成。柱为YMC Pro C18(2.0×50mm，3μm粒径，Waters Co.，Milford，MA)，保持60℃，流速0.3ml/min。流动相由10mM甲酸铵和0.1％甲酸水溶液(A)和100％10mM甲酸铵和0.1％甲酸/甲醇(B)组成。初始流动相组分是95％A。进样后，在2分钟内，流动相变为15％A/85％B，将该组成再保持1分钟。然后将流动相返回初始条件，将柱重新平衡1分钟。总分析时间4分钟。 
HPLC与Micromass Quattro LC界面连接。用超高纯氮气，按100L/小时流速雾化并脱去溶剂气体；按1100L/小时脱溶剂。脱溶剂温度为300℃，源温度为150℃。数据采集方式采用选择反应监测(SRM)。在MS 1中选择代表IVb和内标的(M+H)+离子，在2×10-3托压力下，与氩气碰撞解离，形成特殊产物离子，随后通过MS2监测。过渡离子、电压和保留时间概括在表7中。 
表7：化合物IVB和化合物TVa(IS)的MS/MS分析参数 
Figure GSA00000095036601291
血浆标准曲线范围为4-8000ng/ml，脑曲线范围为1-1000ng/ml。用以浓度的倒数(1/x)为权重的二次回归拟合曲线。按一式两份分析标准。在空白血浆中制备质量控制(QC)样品，还按每份血浆分析设置，分析校正曲线范围内的三个浓度，一式三份。对于该化合物，预计的90％血浆QCs浓度在20％额定浓度内，证明可接受的测定性能。溶媒和处方 
对于表8，当使用的溶媒含NaOH时，用NaOH调节化合物IVc溶液处方的pH，得到pH 8.6-9.0，其中根据其pKa为8.4，化合物部分离子化。 
表8：化合物IVc制剂的体外研究 
  化合物IVc  研究   形成-  批号   状态   溶媒   浓度  (mg/ml)  粒径
  大鼠PK  (研究Cl)   02-001  02-003   未知   90∶10，PEG400/EtOH调  节至pH 8.6-9.0   3  NA
  Pre-Tox递  增剂量(研   究E)   02-004   晶体   80∶10∶10  PEG400/EtOH/0.1N  NaOH   2.5  7.5  20  NA 平均＝27.22μm (95％＜84.4μm)多态  分布，3峰 总平均＝31.07μ m(95％＜157.7μm)
  Pre-ECN  大鼠Tox  (大鼠TK)     (研究F)   02-005   未知   80∶10∶10  PEG400/EtOH/0.1N  NaOH   3  15     40  NA 多态分布，2峰 总平均＝19.25  μm(95％＜52.3 μm)多态分布，2峰 总平均＝21.78μm (95％＜57.5μm)
通过LC/MS/MS定量血浆中的化合物IVc(用于研究C、Cl和D)。通过用含内标化合物IVa的2体积乙腈沉淀血浆蛋白，制备取自大鼠、犬、猴或黑猩猩研究的血样中的等份试样进行分析。通过离心10分钟使生成的上清液与沉淀蛋白分离，转移至自动进样瓶中。用人工或Tomtec自动液体处理器制备样品。HPLC系统由双ShimadzuLC 10AD泵(Columbia，MD)，Shimadzu SIL-HTC自动进样器(Columbia，MD)和Hewlett Packard Series 1100柱箱(Palo Alto，CA)组成。柱为YMC Pro C18(2.0×50mm，3μm粒径，Waters Co.，Milford，MA)，保持60℃，流速0.3ml/min。流动相由10mM甲酸铵和0.1％甲酸水溶液(A)和100％10mM甲酸铵和0.1％甲酸/甲醇(B)组成。初始流动相组分是95％A。进样后，在2分钟内，流动相变为15％A/85％B，将该组成再保持1分钟。然后将流动相返回初始条件，将柱重新平衡1分钟。总分析时间4分钟。 
HPLC与Micromass Quattro LC界面连接。用超高纯氮气，按100L/小时流速雾化并脱去溶剂气体；按1100L/小时脱溶剂。脱溶剂温度为300℃，源温度为150℃。数据采集方式采用选择反应监测(SRM)。在MS 1中选择代表IVc和内标的(M+H)+离子，在2×10-3托压力下，与氩气碰撞解离，形成特殊产物离子，随后通过MS2监测。过渡离子、电压和保留时间概括在表9中。 
表9：化合物IVc和化合物TVa(IS)的MS/MS分析参数 
  IVc   IVa
  SRM过渡离子   M/z 474＞256   m/z 423＞205
  锥电压(V)   22   30
  碰撞能(V)   22   30
  保留时间(分钟)   2.5   2.4
血浆标准曲线范围为4-8000ng/ml，脑曲线范围为1-1000ng/ml。用以浓度的倒数(1/x)为权重的二次回归拟合曲线。按一式两份分析标准。在空白血浆中制备质量控制(QC)样品，还按每份血浆分析设置，分析校正曲线范围内的三个浓度，一式三份。对于该化合物，预计的90％血浆QCs浓度在20％额定浓度内，证明可接受的测定性能。通过LC/MS/MS，在生物基质中定量三种前药及其母体化合物 
开发该LC/MS/MS测定用于研究在生物基质中的三种前药化合物及其相应的母体分子。这三种前药化合物是：化合物Ia、Ic和Ib及其相应的盐或游离酸。注意该测定用于三种前药的游离酸和盐形式，因为检测的分子离子独立于盐相反离子。它们的相应的母体化合物是：IVa、IVc和IVb。 
HPLC系统由Shimadzu LC 10ADvp泵(Columbia，MD)和与Synergi Hydro-RP analytical柱(2.0×50mm，Phenomenex，Torrance，CA)连接的HTC PAL自动进样器(Leap Technologies，Gary，NC)组成。流动 相A由0.1％甲酸/水组成；流动相B是0.1％甲酸/乙腈。由LC进入质谱仪的流速是0.4mL/min。初始流动相组成是在1.75min内，10％B变为75％B，保持该组成0.25min，在0.1min内变为100％B，保持0.6min，在随后0.1分钟内，返回初始条件，然后重新平衡。总分析时间是4min。所有分析物的保留时间在1.5-2.6min范围内。 
HPLC系统与配备设置在450℃的Turbo离子源和离子喷雾电压设为4.5kV的Sciex API3000三重四极质谱仪(Toronto，Canada)界面连接。用UHP氮气作雾化器和辅助气，压力分别为80psi和7L/min。按正离子模式进行分析。监测所有化合物的过渡离子，它们的碰撞能(CE)为：对于Ia(CE＝19)m/z 533.41＞435.24；对于Ic(CE＝23)m/z584.46＞486.29；对于Ib(CE＝19)m/z 558.31＞432.13；对于IVa(CE＝31)423.39＞204.96；对于IVc(CE＝29)474.36＞255.97；对于IVb(CE＝35)448.35＞105.20。 
为适应多种生物样品基质，将乙腈沉淀用于样品沉淀。用PackardMultiprobe II(Packard Instruments，Downers Grove，IL)将测试样品和标准品移入96孔板。用Tomtec Quadra 96将200μL含内标的乙腈(BMS-647257，500nM)加入96孔板中的100μL测试样品和标准品等份试样中。然后将板旋转约3分钟，在3000rpm下离心15分钟。用TomtecQuadra 96将150μL上清液从板中转移至清洁96深孔板。然后用Tomtec Quadra 96向各孔中加入150μL0.2％甲酸/水，旋转板，然后分析。 
在5nM-10μM 8个浓度点，由储备乙腈溶液制备标准曲线，在用于前药和母体化合物的基质中进行系列稀释。按双份100μL试样，将标准曲线移至含测试样品的96孔板中，用上述测试样品萃取，在分析顺序开始、中间和结束时注射。标准曲线用权重1/x2线性回归拟合。用PEBiosystems AnalystTM 1.1处理数据和色谱峰，定量标准和未知浓度。 
体内方法 
研究Cl、E和F(大鼠PK、MAP和TK研究)的条件 
为进行IV和PO给予大鼠化合物IV的药物动力学研究，将化合物IVc溶于PEG-400/乙醇(90/10)，用作溶液。请参考表8。大鼠：使用导管插入颈静脉和/或胆道的雄性Sprague-Dawley大鼠(300-350g，Hilltop Lab Animals，Inc.，Scottdale，PA)。在PO药物动力学研究中，使大鼠禁食过夜。从颈静脉采集0.3ml血样，置于含EDTA的microtainer管(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中，离心分离血浆。 
在IV研究中，在0.5min内，按1mg/kg的大剂量递送化合物IVc(n＝3)。在给药前和给药后2、10、15、30、45、60、120、240、360、480和1440min采集系列血样。 
PO单剂量研究Cl 
在PO给予化合物IVc的Cl研究中，经口给予大鼠(n＝3)5mg/kg剂量的化合物IVc。在给药前和给药后15、30、45、60、120、240、360、480和1440min采集系列血样。由研究Cl获得的经口(PO)给药的结果见表4，最右列。 
口服(PO)剂量递增研究E 
在经口给予化合物IVc剂量递增研究E中，大鼠组(n＝2/组)接受口服剂量25、75和200mg/kg。在25mg/kg剂量下，给药溶液是溶液；在更高剂量下，给药溶液是悬浮液。在给药前和给药后15、30、45、60、120、240、360、480和1440min采集系列血样。在1440min采集脑样，以评价脑渗透。将脑样染色，记录干重和湿重。研究E的口服(PO)结果见表46。 
给予大鼠2-周口服剂量的毒理学研究F 
在大鼠的2周口服研究F(n＝6/性别/组)中，给予化合物IVc日剂量15、75或200mg/kg。在第1和第14天评价毒理动力学，表明全身暴露化合物IVc(AUC0-24h)通常与剂量相关，但不与剂量成比例(见表5)，没有自体诱导或蓄积的证据。在第14天，在＜200mg/kg/天剂量下，雌性AUC0-24h值(＜644μg*小时/ml)比雄性(＜526.88μg*小时/ml)稍高。研究F的口服(PO)结果见表5。 
Map研究G：PO和IV给予大鼠IIa二酯的研究 
化合物IIa的结构 
Figure GSA00000095036601341
按经口给予MAP的leg研究A1的方法进行，但用IIa二酯代替化合物IVa。化合物IVa分析表明经口途径给予IIa二酯产生的基本上是IVa。数据列于下表10中： 
表10Map研究G 
  经口给予IIa二酯(Iva的二叔丁酯前药)  后测量的IVa的数据
  剂量和途径：PO 5mg/kg
  Cmax p.o.(nM)   1123±270(‘IVa浓度)
  Tmax p.o.(小时)   2.7±1.2(IVa)
  F(％)   33(IVa)
  AUC p.o.(μM*小时)   4.0±1.0(IVa)
  Cp@24小时p.o.(nM)   未检出
  T1/2p.o.(小时)   1.3±0.26(IVa)
Map研究H：PO和IV给予大鼠II’a单酯研究 
化合物II′a结构 
Figure GSA00000095036601351
按经口给予MAP的leg研究A1的方法进行，但用II’a单酯代替化合物IVa。化合物IVa分析表明经口途径给予II’a单酯产生的基本上是IVa。数据列于下表： 
表11Map研究H 
经口给予II’a单酯(IVa一叔丁酯前药)后测量的IVa的数据
  剂量和途径：PO 5mg/kg
  Cmax p.o.(nM)   1586±615(IVa浓度)
  Tmax p.o.(小时)   2.0±1.7(IVa)
  F(％)   44(IVa)
  AUC p.o(μM*小时)   5.9±2.2(IVa)
  Cp@24小时p.o.(nM)   3.61(n＝2/3)
  T1/2p.o(小时)   2.8±1.6(IVa)
进行过大量的研究，以证明和表征前药I出乎意料的功效。在给予大鼠和犬前药和母体药物后进行对比母体分子暴露的剂量递增暴露实验，前药是母体分子IVa、IVb和IVc的前药I。在给予犬前药Iab或母体药物IVa后，比较食物和剂量对IVa暴露的影响。表明与母体药物相比，前药具有提高暴露和避免食物作用出乎意料的能力。在大鼠、犬和猴中进行低剂量前药Iab、Ibb和Icb全面药物动力学研究(口服和IV给药)，以证实分别转化为母体化合物IVa、IVb和IVc。进行经口给予大鼠前药Ie(游离酸)和母体化合物IVf研究，以证明分别转化为母体化合物IVe和IVf及其全身暴露。 
数据见本申请上下文。 
另外的简介部分1 
另外的Iab研究： 
Iac是游离酸IVa的N-羟甲基加成物的磷酸酯(盐)前药，通过碱性磷酸酯酶(ALP)水解形成IVa。Iac的单赖氨酸盐Iab用于所有以下研究。 
IV和PO给予大鼠、犬和猴Iab，进行药物动力学研究。在所有情形中，在EDTA存在下采集血样。在处理样品期间，存在的已知ALP抑制剂的EDTA显著使体外Iab转化最少。IV给予Iab后，迅速形成IVa。给予大鼠、犬和猴Iab后，观察到IVa良好的口服生物利用度(62-94％)，血浆中极少或不存在Iab。因为在肠中表达ALP水平高，所以很可能经口给予Iab后，Iab被存在于肠腔刷边缘膜的ALP水解，形成IVa，由于其高渗透性，它被迅速吸收。 
进行体外温育研究，定量评价在不同组织中依赖ALP的Iab水解。Iab在大鼠、犬、猴和人血清和肝细胞和人胎盘ALP的存在下水解。当有时测量到Iab和IVa时，Iab转化为IVa接近化学计量。由于在血清中水解时，无法测定蛋白结合的Iab。根据体外数据，人受试者口服Iab后，估计Iab被人ALP水解，会形成IVa。 
当pH 1.4增至pH 5.4和pH 8.9时，Iab在室温下的结晶溶解度由0.22mg/ml增加至＞12mg/ml；已制备用于体内毒理研究的含＞100mg/mL的水溶液。在对比中，测得母体化合物IVa结晶物质在室温下的水溶解度为0.04-0.9mg/mL(pH范围1.5-10)。Iab是可接受的溶液和具有固体稳定性。 
Iab的高水溶性提供克服溶出度速度限制的以下某些剂量的IVa吸收的方法，因而在口服剂量递增和毒理动力学研究中增加IVa暴露。当经口给予大鼠和犬相当于～200mg/kg的IVa剂量的Iab时，与相似剂量下历史IVa混悬液的AUC研究相比，得到2倍以上IVa的AUC， 血浆未明显暴露于前药。另外，在接受Iab干燥填充胶囊(相当于200mg/犬IVa)的禁食犬中，IVa的AUC和Cmax值分别是38和58倍；在给予IVa临床用胶囊制剂的禁食犬和进食犬中得到的那些分别是4倍和6倍。 
在接受Iab的禁食和进食犬中没有发现IVa的AUC和Cmax存在明显差异，但与接受IVa的禁食犬相比，发现进食犬提高9倍。这些数据提示在感染HIV患者中可达到有效IVa血水平，无须高脂肪餐。IVa的干燥喷雾形式引起与在犬中发现的Iab相似的IVa暴露水平。CD大鼠单剂量毒理动力学耐受性研究 
用前药Iab(单赖氨酸盐)在大鼠中进行1-天口服毒理动力学研究。通过灌饲，给予3只雄性大鼠/组Iab，剂量为16、72和267mg/kg(游离酸)，用水作溶媒(溶液制剂)。前药游离酸的剂量分别相当于IVa(母体分子)摩尔当量剂量13、57和211mg/kg。评价终点是在各大鼠中的Iab和IVa血浆毒理动力学。 
毒理动力学平均值列于表12 
表12：给予雄性大鼠≤267mg/kg Iab单次口服剂量后，Iab和IVa的平均毒理动力学值 
Figure GSA00000095036601371
数值代表1-3只大鼠/组Iab数据和3只大鼠/组IVa数据的平均值。 
1低于定量下限。 
20-最后可定量样品时间的AUC 
30-∞的AUC 
在给药后1.1小时内达到Iab(前药)和IVa(母体药物)的平均最大血浆浓度(Cmax)。前药的血浆浓度-时间曲线下的血浆面积(AUC)≤0.03％母体药物的AUC。(在给予大鼠≤267mg/kg Iab时，IVa的AUC增加与Iab剂量成比例，在72-267mg/kg Iab范围中，Cmax增加小于与剂量成比例的模式。 
在给予大鼠IVa(2)或Iab后得到的IVa AUC对比见图6。 
临床前制剂的溶解性是个问题。在母体药物和前药小剂量(例如≤50mg/kg)下，IVa的AUC相等，因为两者均配制为溶液(母体用PEG-400，前药用水)，但在大剂量(例如200mg/kg)下，中性母体药物配制为混悬液，而前药盐配制为水溶液。 
用5、50或500mg/kg剂量BID给予大鼠2-周毒性研究以支持IND正在进行(3)。已完成in-life期研究，没有显著的in-life发现。 
犬单剂量毒理动力学和耐受性研究 
进行多期研究，在剂量24、90或240mg/kg(游离酸，分别相当于母体药物IVa 19、71或190mg/kg摩尔量)下，评价前药Iab(单赖氨酸盐)耐受性以及Iab和IVa的毒理动力学(4)。每日一次给予2只雌性犬/组Iab水溶液(24或90mg/kg)或干燥填充的胶囊(24、90[每日一次和每日两次]或240mg/kg)。终点是：临床体征、体重、食物消耗量和Iab和IVa的血浆毒理动力学。在所有情形中，在所有期剂量研究之间使用1-周清洗期。 
来自研究初期的血浆毒理动力学值见表13。 
表13：在给予雌性犬≤90mg/kg单次口服剂量Iab后的IVa毒理动力学值 
Figure GSA00000095036601391
血浆样品中未检出Iab。在给药1-2小时后，达到IVa的平均最大血浆浓度(Cmax)。当给予Iab溶液时，在24-90mg/kg范围中，Cmax和AUC增加小于与剂量成比例模式。在给予两只犬90mg/kg约30分钟后出现呕吐。给予24mg/kg Iab干燥填充胶囊或水溶液后，IVa的Cmax和AUC相等。 
除了呕吐外，没有出现其它临床体征，对体重和食物消耗没有影响。 
为测定通过给予干燥填充的Iab胶囊可否消除/减少呕吐，用剂量90或240mg/kg和给予90mg/kg，两次(相隔4h)(BID)进行下期研究。毒理动力学值见表14。 
表14：按单次口服剂量或每日两次(BID)给予雌性犬≤240mg/kg Iab后IVa毒理动力学值 
Figure GSA00000095036601401
1AUC0-24h
给予犬90或240mg/kg Iab干燥填充的胶囊后，Cmax或AUC之间无差异。给药后约1小时后，发现犬#1201、#2201和#2202呕吐。收集呕吐物，分析Iab含量，估计总剂量的丢失量；估计丢失的总剂量％对#1201为＜1％，对#2201为≈90％、对#2202为≈9％。尽管“丢失的剂量”估值似乎与血浆AUC数据量化不一致，但它确实表明在给药后短时间内，可在呕吐物中找到测试物。在犬血浆中测到Iab，在给药1小时后测得0.005-0.049μM，在给药2小时后测得0.005-0.006μM；在随后时间点未检出前药。 
给予犬IVa(5，6)或Iab后得到的IVa AUC对比见图7。 
溶媒和制剂 
用于关键PK和安全研究的制剂概述 
用PO和IV水溶液给予所有大鼠、犬和猴进行体内PK研究。在24和90mg/kg剂量下，用水溶液；在24、90和240mg/kg剂量下，用Iab单赖氨酸盐药物胶囊制剂在犬中进行毒理学和暴露研究。 
在大鼠口服剂量递增研究中，在4.5、20.0和73.5mg/mL(前药的单赖氨酸盐形式)浓度下给予Iab水溶液。发现与经口给予IVa的历史 数据相比，经口给予Iab前药后，IVa母体药物的AUC和Cmax明显提高。 
在相当于IVa 20mg/kg剂量下，用Iab药物胶囊制剂进行食物对犬影响的研究。将前药与临床用20mg/kg母体化合物IVa胶囊制剂对比。当给予IVa临床用胶囊时，发现与禁食犬相比，进食高脂肪餐的犬暴露增加到9倍。给予前药Iab后，IVa暴露显著较高，正如所料，禁食和进食犬之间暴露无显著差异。 
代谢和药物动力学概述 
结果和解释概述 
Iab是IVa的N-羟甲基加成物的磷酸酯(盐)前药，通过碱性磷酸酯酶(ALP)水解形成IVa。因此给予动物Iab后，在已知ALP抑制剂EDTA存在下，由采集的血样制备血浆样品。在含EDTA的大鼠、猴和人血中，Iab转化为IVa最少(＜2％)，在含EDTA的犬血中约为6％。在样品储存(-20℃)和分析Iab期间，预计无显著体外Iab转化。 
在动物和人体外系统中研究Iab水解。因为多种ALP同工型广泛分布在各种组织中，未探索体外与体内数量的相关性(Fishman等，1968；Komoda等，1981；Moss，1983；Yora and Sakagishi，1986；Sumikawa等，1990)。因此，研究限于定量评价在不同组织中依赖ALP的水解。Iab在大鼠、犬、猴和人血清和肝细胞以及人胎盘ALP的存在下水解。当有时测量到Iab和IVa时，Iab转化为IVa接近化学计量。由于在血清中水解时，蛋白结合Iab，无法测定Iab。 
经口给予Iab后，在大鼠、犬和猴血浆中未检出或测到极低水平Iab。IV给予大鼠、犬和猴Iab后，快速形成IVa。在大鼠、犬和猴中，IV AUC转化率分别是1.5、0.80和0.70，提示Iab转化为IVa良好。 
发现给予大鼠、犬和猴Iab后，Iva的口服生物利用度(62-94％)良好。更明显，Iab水溶性越高，在低于某些剂量时，溶出度限制吸收IVa减弱，因而在口服剂量递增和毒理动力学研究中，IVa暴露增 加(表12-14和图6-7)。在接受Iab的禁食犬中Iva的AUC水平是给予禁食犬IVa临床用胶囊的约40倍。尽管40倍差异很可能高估临床情形，根据IVa开发经验，Iab明确显示出具有改善使用母体Iva时看到的溶出度速度限制吸收的能力。 
为研究食物对经口给予犬IVa的吸收的影响，在禁食和进食条件下，给予Iab和IVa胶囊。未发现Iab的AUC和Cmax有明显差异，而发现进食后提高IVa 9倍。这些数据提示对于感染HIV的患者具有潜在临床利益，其中可达到有效IVa血水平，而无需高脂肪餐。方法 
除另有所指外，本报道中所述研究使用Iab单赖氨酸盐。通过LC/MS/MS定量Iab和IVa 
开发出LC/MS/MS法用于分析的动物血样中Iab和IVa的药物动力学研究和分析体外温育乙腈上清液的研究。为分析血浆，用PackardMultiprobe仪将50μL各标准液、QC和血样转移至清洁96孔板，进行蛋白质沉淀提取。加入含内标IVc的200μL乙腈后，将样品涡流混合，离心10min，将沉淀蛋白与液体分离，得到上清液。为分析体外研究产生的上清液，将等体积的上清液和含内标的乙腈混合。用Tomtec自动液体处理仪将以上上清液的等分试样转移至第二个清洁96孔板上。加入等体积水，封闭板，旋转混合。 
HPLC系统由Shimadzu LC 10ADvp泵(Columbia，MD)和连接Phenomenex Synergi Fusion-RP分析柱(2.0×50mm，5μ；Torrance，CA)的HTC PAL自动进样器(Leap Technologies，Cary，NC)组成。流动相A由5mM甲酸铵水溶液组成；流动相B是100％乙腈。LC流速为0.38mL/min。初始流动相组分是3％B，在1.75min内，变为60％B，保持0.25min，在0.1min内变为100％B，保持0.8min，在后0.1min内返回初始条件，再平衡。总分析时间为4.0min。Iab、IVa和IVc的保留时间分别是1.50、1.67和1.73min。 
HPLC系统与配备设置在550℃的Turbo离子源和离子喷雾电压设为4.5kV的Sciex API4000三重四极质谱仪(Toronto，Canada)界面连接。用UHP氮气作雾化剂和辅助气，压力分别为80psi和7L/min。Iab、IVa和IVc的碰撞能分别是21、29和31伏。数据采集使用选择反应监测(SRM)。在MS1中选择代表Iab、IVa和内标的正离子模式(M+H)+离子，与氮气碰撞解离，使碰撞能最优化，形成具体产物离子，随后通过MS2监测。Iab、IVa和IVc的SRM过渡分别是m/z 533→435，423→205和474→256。 
由储备液制备范围为5nM-10μM的标准曲线，在用于Iab和IVa的基质中进行系列稀释。标准曲线溶液按一式两份取样，提取样品，在分析顺序开始、中间和结束时注射进样。用权重为浓度的倒数1/x2的线性回归拟合标准曲线。用PEBiosystems AnalystTM 1.1处理数据和色谱峰，定量标准和未知的浓度。 
体外方法 
(1)Iab在EDTA血、血清和Tris-HCl缓冲液中的稳定性 
在大鼠、犬、猴和人(n＝2)的鲜血和血清中研究Iab的稳定性。将采集的血置于含K2EDTA的真空容器(Becton Dickinson，FranklinLakes，NJ)中。将采集的血清置于不含抗凝剂的真空容器中。在37℃下，在起始浓度约10μM下，温育Iab 60-90min。在各预定时间点取样。先将血样品的等分液(200μL)与100μL水混合，然后与400μL乙腈混合。将血清试样(50μL)加入含K2EDTA的微量容器(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)中，随后加入100μL乙腈。通过LC/MS/MS分析上清液中的Iab和IVa。 
按上述方法，还在Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH 7.5)中评价了Iab的稳定性。 
(2)在人胎盘ALP存在下水解Iab 
固体人胎盘ALP得自Sigma(P-3895，St.Louis，MO)。在Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH 7.5)中制备1000单位/L溶液。通过系列稀释得到100和10单位/L溶液。在37℃下，将Iab在10、100和1000单位/L溶液(n＝2)中温育2h。在温育中的Iab初始浓度为10μM。在各预定时间点取100μL样品的等分液，加入K2EDTA微量容器中，随后加入200μL乙腈。通过LC/MS/MS分析上清液中的Iab和IVa。 
体内研究 
将采集的所有血样(0.3mL)置于含K2EDTA的微量容器(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)中，置于碎冰上。离心后，分离血浆，在-20℃下储存直至分析。Iab单赖氨酸盐(形式3，批号1)用于药物动力学研究。在无菌水(用于IV给予犬和猴)或蒸馏水(用于所有其它给药)中制备Iab给药溶液。 
(1)大鼠体内研究 
使用导管插入颈静脉的雄性Sprague-Dawley大鼠(300-350g，Hilltop Lab Animals，Inc.，Scottsdale，PA)。在PO药物动力学研究中，将大鼠禁食过夜。从颈静脉采集血样。 
在IV研究中，在0.5min内，将1.4mg/kg Iab(游离酸或1.1mg/kgIVa当量)以大剂量递送(n＝3)。给药溶液浓度为1.4mg/mL，给药体积为1mL/kg。在给药前和给药后2、10、15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时采集系列血样。 
在PO研究中，通过灌饲给予Iab 7.9mg/kg(游离酸或6.3mg/kgIVa当量)(n＝3)。给药溶液的浓度为4.0mg/mL，给药体积为2mL/kg。在给药前和给药后15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时采集系列血样。 
(2)犬体内研究 
以交叉方式，在三只雄性beagle犬(11±1.1kg，Marshall FarmsUSA Inc.，North Rose，NY)中进行IV和PO给予Iab研究。在IV和PO研究之间有2周清洗期。 
在IV研究中，通过头静脉，在5min内，以恒速0.1mL/kg/min，输注1.2mg/kg Iab(游离酸或0.95mg/kg IVa当量)。给药溶液的浓度为2.4mg/mL，给药体积为0.5mL/kg。在给药前和给药后5、10、15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时从股动脉采集系列血样。 
在PO研究中，给药前使犬禁食过夜，通过灌饲给予Iab 6.6mg/kg(游离酸或5.2mg/kg IVa当量)。给药溶液浓度为13.2mg/mL，给药体积为0.5mL/kg。在给药前和给药后15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时采集系列血样。 
为研究经口给予Iab和IVa后食物对口服IVa吸收的影响，按交叉方式，给予在过夜禁食和进食条件下的三只犬组这两种化合物的胶囊固体。在每个研究之间有1周清洗期。给予每只犬200mg Iab，相当于(约20mg/kg)IVa；给予每只犬临床用200mg(约20mg/kg)IVa胶囊制剂。在进食犬研究中，制备以下餐：2片熏肉，2个鸡蛋，2片带黄油和果酱的面包，4oz.混合棕色脂肪(hash browns)和8oz.全牛奶。用实验搅拌机均化后，将餐平均分为5份，保持冷冻。研究前，将餐解冻，给每只犬喂1份。 
在禁食犬中进行其它IVa制剂研究(n＝2/每剂量组)。给予犬IVa的临床用形式或喷雾干燥胶囊。按单剂量20mg/kg，给予IVa临床用胶囊形式。按20、75和200mg/kg，给予喷雾干燥形式的IVa。 
(3)猴体内研究 
按交叉方式，在三只雄性猕猴(11±1.2kg，Charles RiverBiomedical Research Foundation，Houston，TX)中进行IV和PO给予Iab的研究。在IV和PO研究之间，有2周清洗期。在IV研究中，在5min 内，通过股静脉，以恒速0.1mL/kg/min，输注1.3mg/kg Iab(游离酸或1.1mg/kg IVa当量)。给药溶液的浓度为2.6mg/mL，给药体积为0.5mL/kg。在给药前和给药后5、10、15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时从股动脉采集系列血样。 
在PO研究中，给药前将猴禁食过夜，通过灌饲给予Iab 7.1mg/kg(游离酸或5.6mg/kg IVa当量)。给药溶液的浓度为14.2mg/mL，给药体积为0.5mL/kg。在给药前和给药后15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时采集系列血样。 
(4)数据分析 
除另有说明外，所有结果均按平均值±SD表示。 
通过无房室分析，用KINETICATM软件程序(4.0.2版本，InnaPhaseCo.，Philadelphia，PA)计算Iab和IVa的药物动力学参数。直接由实验观察记录Cmax和Tmax值。用混合型log-线性梯形总和计算AUC0-n和AUCtot值。静脉内给药后，还计算总体内清除(C1)、平均驻留时间(MRT)和稳态分布体积(Vss)。通计算经口给药后与静脉内给药后剂量-归一化的AUC值的比例，估计绝对口服生物利用度(以％表示)。 
由以下方程，用广泛流行的模型计算肝脏清除ClH： 
Figure GSA00000095036601461
其中Qh是大鼠、犬、猴和人的肝血流，分别为55、31、44和21mL/min/kg(Davis and Morris，1993)。 
肝提取限量(ER)计算如下： 
ER＝ClH/Qh 
用Student′s t-检验进行统计分析(Microsoft Excel，Redmond，WA)。当P＜0.05水平时，认为有统计学显著性差异。 
体外研究 
Iab在EDTA血、血清和Tris-HCl缓冲液中的稳定性 
作为分析测定验证的一部分，在含已知碱性磷酸酯酶抑制剂EDTA的血中进行Iab的稳定性研究(Bowers，Jr.and McComb，1966；Yora and Sakagishi，1986)。在37℃下温育60min后，大鼠血中有1.2％初始浓度的Iab转化为IVa(表15)，在猴和人血中转化率小于1％(表15和16)。在犬血中的转化率为约6％，在两只不同的犬中的百分转化率相似，在两种不同的测试场合中相同犬中的百分转化率相似(表15和16)。在-20℃的样品储存条件下，预计在分析Iab期间，以上小转化百分率在37℃下不会引起任何显著体外转化。 
在37℃下，在60-min研究期间，Iab在Tris-HCl缓冲液中是稳定的(表17)。 
表15：在采自大鼠、犬和猴的新鲜EDTA血中的Iab的稳定性 
*以Iab初始浓度计形成的百分率。 
表16：采自犬(重复)和人的新鲜EDTA血中的Iab的稳定性 
*以Iab初始浓度计形成的百分率。 
表17：Iab在Tris-HCl缓冲液中的稳定性 
Figure GSA00000095036601481
*以Iab初始浓度计形成的百分率。 
为了解Iab在全身循环中的水解，在37℃下，将Iab在(大鼠、犬、猴和人)新鲜血清中温育90min。水解速度在大鼠血清中最快，随后是犬、猴和人血清(表18)。Iab转化为IVa接近化学计量。 
与组织相比，血清含有较低的ALP活性(McComb等1979a)。此外，由于酶通过血管渗漏，血清还含有源自组织源例如骨、肝和肠的ALP同工型(Moss，1983)。因此，多种ALP同工型很可能介导Iab在血中的水解。 
表18：大鼠、犬、猴和人新鲜血清中的Iab的稳定性 
Figure GSA00000095036601482
*以Iab衰减计算。**半衰期大于温育期。 
在人胎盘ALP存在下Iab的水解 
为研究Iab在纯化形式的人ALP中的水解，在37℃下，在10、100和1000单位/L人胎盘ALP液中温育2h。测定Iab的t1/2衰减，列于表19。正如所料，由于较高的ALP活性，水解速度较快。因此，还形成IVa(图8)。这表明Iab被源自人的ALP水解，形成IVa。 
表19：Iab在人胎盘ALP液中的水解 
Figure GSA00000095036601491
注释：在37℃下，在～10μM初始浓度下温育Iab 120min。 
体内研究 
大鼠体内研究 
IV和经口给予Iab后，Iab和IVa在大鼠中的药物动力学参数归纳在表20中。血浆浓度对时间的分布图见图9。为进行对比，还列出IVa在大鼠中药物动力学研究的历史数据。 
IV给药后，Iab的总体内清除(Cl)为14mL/min/kg，提示Iab在大鼠体内是低清除化合物。IV给药后，消除半衰期(t1/2)和平均驻留时间(MRT)分别是0.16h和0.14h。2h后，未检出Iab。Iab稳态分布体积(Vss)是0.12L/kg，提示组织分布极为有限。IV给药后，迅速由Iab形成IVa；在第一取样时间点2min(数据未列出)检出IVa。由Iab形成的IVa的IV AUC与历史IVa的AUC研究之比为1.5(完全转化的理论值＝1)，提示Iab完全转化为IVa。 
除一个样品(5nM；表20)外，口服给药后，在任何样品中未检出Iab。经口给予Iab后，IVa的Tmax为0.83h，它比历史IVa的Tmax 2.0h短，证明经口给予前药后，IVa吸收更快。更快吸收由前药转化的IVa很可能是在肠中的Iab水溶性较好和Iab快速水解而形成IVa的结果。尽管由Iab转化为IVa的绝对口服生物利用度是62％，比历史IVa 数据小，但与历史IVa数据(表16和图8)相比，大鼠口服递增剂量研究表明由Iab转化为Iva的暴露较优。 
由Iab形成的IVa最终血浆浓度与时间的关系与历史IVa行为一致。 
表20：IV和经口给予Iab后，Iab和IVa在大鼠中的药物动力学参数(平均值±SD，n＝3) 
NA-不适用的；ND-未检出(＜5nM)。 
                    给予前药后′043AUC 
IV和PO比率分别由                             计算 
                    给予′043后′043AUC 
**在15min时，仅在1只大鼠中检出Iab(5nM) 
***由IVa的历史IV数据计算 
31.犬体内研究 
IV和经口给予Iab后，Iab和IVa在犬中的药物动力学参数归纳于表21中。血浆浓度对时间的分布关系见图10。为了对比，还列出IVa在犬中的药物动力学研究的历史数据。 
IV给药后，Iab的Cl是70mL/min/kg，明显高于犬肝血流的31mL/min/kg，提示潜在涉及肝外水解和/或其它消除途径(例如肾排泄)。IV给药后，t1/2和MRT分别为0.15hr和0.07hr。45min后，未检出Iab。Iab的Vss是0.30L/kg，提示组织分布潜力小。IV给药后，由Iab快速形成IVa；在第一取样时间点5min(未列出数据)检出IVa。由Iab形成的IVa的IV AUC与历史IVa研究的AUC之比为0.80，提示Iab良好转化为IVa。 
在15min和30min时，仅在经口给予1只犬后，检出Iab 5nM(LLQ)。经口给予Iab后，IVa的Tmax是0.25hr，比历史IVa的Tmax2.9hr短，表明口服给予前药后，吸收IVa更快。由Iab形成的IVa的绝对口服生物利用度为94％，比历史IVa数据57％高。由Iab形成的IVa的终血浆浓度对时间的分布关系与历史Iva的分布相似。 
表21：IV和经口给予Iab后，Iab和IVa在犬中的药物动力学参数(平均值±SD，n＝3) 
*在15min和30min时，仅在1只犬中，在5nM(LLQ)测得Iab。 
为研究经口给予Iab和IVa后食物对口服吸收IVa的影响，在禁食和进食条件下，给予犬Iab或IVa胶囊。按交叉方式进行研究，在各个研究之间有1周清洗期。禁食和进食条件下给予Iab后，未发现之间存在AUC和Cmax的显著差异(表22)，而发现进食条件下给予IVa后，AUC和Cmax提高至9倍(表23)。大体而言，食物对接受IVa的犬(表23)的影响比接受IVa的人受试者(表24)更显著。提示在许多不同物种之间食物对口服吸收IVa存在差异。 
口服吸收IVa表明在人和动物物种中受溶出度速度的限制。估计在进食高脂肪餐的人中IVa暴露增加是因为胆汁盐分泌增加，促使IVa溶出。在犬中，对给予Iab后，缺乏食物对口服吸收IVa的影响提示对人的潜在利益，对于人而言可能不需要改变膳食。 
表22：经口给予Iab的干燥填充胶囊(相当于20mg/kg IVa)(平均值±SD，n＝3)后，食物对犬口服IVa暴露的影响 
 参数   禁食   进食
 AUCtot(μM·hr)   414±70   422±57
 Cmax(μM)   70±12   130±102
 Tmax(hr)   2.0   1.5±0.87
 t1/2(hr)   4.2±0.42   3.2±1.0
注释：在几个样品中，在初始时间点检出的Iab＜200nM。 
表23：经口给予IVa的临床形式胶囊(20mg/kg)(平均值±SD，n＝3)后，食物对犬口服IVa暴露的影响 
 参数   禁食   进食   进食/禁食比
 AUCtot(μM·hr)   11±1.4   96±10*   9.0±2.2
 Cmax(μM)   1.2±0.22   11±0.99*   9.1±0.92
 Tmax(hr)   3.3±1.2   4.0
 t1/2(hr)   5.3±2.7   8.0±3.1
*在禁食条件下，数值显著不同。 
表24：在人1期研究中食物对口服IVa暴露的影响(平均值±SD，n＝6) 
Figure GSA00000095036601531
在相同的禁食犬中，进行用临床和喷雾干燥形式的IVa与Iab的胶囊制剂的对比研究。如表25所示，在相当于20mg/kg IVa下，给予Iab和喷雾干燥形式的IVa后，发现相似的IVa暴露。但是，Iab比临床形式的IVa提供显著更大的IVa暴露。由前药转化的IVa的AUC和Cmax比临床形式Iva的值分别大37倍和45倍。根据开发中的IVa经验(未列出数据)，在犬中增加的倍数很可能超过临床情形的预期。 
在喷雾干燥形式IVa在犬中的剂量递增研究中，AUC和Cmax从20mg/kg增加至75mg/kg，小于剂量增加比例(表26)。在75mg/kg-200mg/kg中，未发现暴露进一步显著增加。 
表25：经口给予Iab和不同IVa胶囊制剂后，在犬中的口服IVa暴露(交叉研究) 
  参数   犬#4201   犬#4202   犬#4201   犬#4202   犬#4201   犬#4202
  制剂   Iab   Iab   IVa  喷雾干燥   IVa  喷雾干燥   IVa  临床形式   ′IVa  临床形式
  剂量  (mg/kg；  ′IVa eq.)   19   19   20   20   20   20
  AUCiot  (μM·hr)   486   514   303*   338   11   16
  Cmax(μM)   80   86   46   81   1.3   2.4
  Tmax(ht)   1.0   1.0   2.0   1.0   1.0   4.0
  t1/2(hr)   4.2   3.4   57   4.2   7.1   4.5
*AUC为0-24小时。 
表26：经口给予喷雾干燥形式的Iab胶囊后，在犬中的口服IVa暴露 
Figure GSA00000095036601551
*同表25。**AUC为0-24小时。 
猴体内研究 
IV和经口给予Iab后，Iab和IVa在猴中的药物动力学参数归纳在表27中。血浆浓度对时间的分布关系见图11。为作对比，还列出猴中IVa的药物动力学研究的历史数据。 
IV给药后，Iab的Cl是4.4mL/min/kg，提示Iab在猴中化合物的清除小。IV给药后，T1/2和MRT分别是1.0hr和0.18hr。MRT反映在血浆Iab的持续期间在更接近实际估计，因为在末期，Iab的血浆浓度低(图11)。6hr后，未检出Iab。Iab的Vss为0.048L/kg，提示组织分布极有限。IV给药后，Iab迅速形成IVa；在第一取样时间点5min测定IVa(未列出数据)。由Iab形成的IVa的IV AUC与历史IVa的研究的AUC之比为0.70，提示Iab良好转化为IVa。 
经口给药后，在15min时，仅在1只猴中测得浓度18nM的Iab。经口给予Iab后，IVa的Tmax为0.83hr，比历史IVa的Tmax的2.7hr短，表明经口给予前药后，IVa吸收更快。由Iab转化为IVa的绝对口服生物利用度为66％，类似于历史Iva的数据60％。 
由Iab形成的IVa终血浆浓度对时间的分布关系类似于历史Iva的分布。 
表27：IV和经口给予Iab后，Iab和IVa在猴中的药物动力学参数(平均值+SD，n＝3) 
Figure GSA00000095036601561
**在15min时，仅在1只猴中测得18nM Iab。 
另外的简介部分2 
前药Ibb的另外的研究 
IV和PO给予大鼠、犬和猴Ibb，进行药物动力学研究。在所有情形中，在EDTA存在下采集血样。在处理样品期间，存在的已知ALP抑制剂EDTA显著使体外Ibb的转化最少。IV给予Ibb后，迅速形成IVb。给予大鼠、犬和猴Ibb后，观察到IVb良好的口服生物利 用度(50-310％；用IVb的历史IV AUC计算)，血浆中存在极低水平的Ibb。因为在肠中表达的ALP水平高，所以很可能经口给予Ibb后，Ibb被存在于肠腔刷状缘膜ALP水解而形成IVb，由于其高渗透性，它被迅速吸收。 
进行体外温育研究，定量评价在不同组织中依赖ALP的Ibb水解。Ibb在大鼠、犬、猴和人血清和肝细胞的存在下以及在人胎盘ALP中水解。当有时测量到Ibb和IVb时，Ibb转化为IVb接近化学计量。由于在血清中水解时，无法测定蛋白结合的Ibb。根据体外数据，人受试者口服Ibb后，估计Ibb被人ALP水解而形成IVb。 
当pH 1.5至pH 8.7范围中，Ibb-03在室温下的结晶溶解度＞11mg/ml；已制备用于体内毒理学研究的含＞75mg/mL的水溶液。在对比中，测得母体化合物IVb结晶物质在室温下的水溶解度为0.007-0.19mg/mL(pH范围1.0-9.6)。Ibb-03是可接受的溶液和具有固体稳定性。 
Ibb的高水溶性提供克服溶出度速度限制以下某些剂量的IVb吸收的方法，因而在口服剂量递增和毒理动力学研究中增加Ivb的暴露。与相同剂量下的历史IVb混悬液研究的AUC相比，当给予大鼠和犬口服剂量最高达200mg/kg IVb bmsequivalent的Ibb时，分别提供11倍和2.6倍以上的IVb AUC，相对较少血浆明显暴露于前药(＜0.9μM)。Sprague Dawley大鼠中的单剂量毒理动力学研究 
用前药Ibb(单赖氨酸盐)在大鼠中进行1-天口服毒理动力学研究。通过灌饲给予3只雄性大鼠/组Ibb，剂量为19、64和236mg/kg(游离酸)，用水作溶媒(溶液制剂)。前药游离酸的剂量分别相当于IVb(母体分子)摩尔当量剂量15、51和190mg/kg。评价终点是在各大鼠中的Ibb和IVb血浆毒理动力学。 
平均毒理动力学值列于表28 
表28：给予雄性大鼠≤200mg/kg Ibb的单次口服剂量后，Ibb和IVb平均毒理动力学值 
Figure GSA00000095036601581
数值代表1-3只大鼠/组Ibb数据和3只大鼠/组IVb数据的平均值。LLQ是定量下限 
1AUC从0-最后时间点 
3AUC从0-∞ 
在给药后≈1-3小时内达到IVb(母体药物)的平均最大血浆浓度(Cmax)。在给予大鼠≤267mg/kg Ibb时，IVb的AUC增加与Ibb剂量接近成比例，在19-236mg/kg Ibb范围之间，Cmax增加小于与剂量成比例模式。在给予≥19mg/kg Ibb的大鼠中测得Ibb，但相对于lVb的那些，浓度极低。 
在给予大鼠IVb或Ibb后得到的IVb Cmax和AUC对比见图12。 
与给予IVb后达到的暴露相比，给予Ibb后IVb的暴露明显增加。 
犬单剂量毒理动力学和耐受性研究 
进行两期研究，在剂量25、92或250mg/kg(游离酸，分别相当于母体药物Ivb的20、74或201mg/kg摩尔量)下，评价前药Ibb(单赖氨酸盐)耐受性以及Ibb和IVb的毒理动力学(1)。第一天，每日一次给予1只犬/性别/组以上剂量的Ibb干燥填充胶囊。在各研究剂量之间使用1周清洗期。第8天，每日一次给予1只犬/性别/组25mg/kgIbb水溶液或每日两次BID给予46或125mg/kg干燥填充胶囊。终点是： 临床体征、体重、食物消耗量、Ibb和IVb的血清化学、血液学和血浆毒理动力学。 
各犬的血浆毒理动力学值见表29。 
表29：给予犬≤250mg/kg Ibb后IVb的毒理动力学值 
Figure GSA00000095036601591
1第一天配制为干燥填充胶囊，第8天配制成水溶液(两天均QD给药) 
2第一天给予92mg/kg QD，第8天给予46mg/kg BID；两天均配制成干燥填充胶囊 
3第一天给予250mg/kg QD，第8天给予125mg/kg BID；两天均配制成干燥填充胶囊 
4给药2小时内，存在胶囊残余物，观察到呕吐 
5给药2小时内，无胶囊残余物，观察到呕吐 
在第1和8天，在某些血样中测得低水平(≤0.9μM)Ibb。按QD给药，给药1-4小时后达到Ivb的平均最大血浆浓度(Cmax)，按BID给药，第二次给药1-2小时后达到Ivb的平均最大血浆浓度(Cmax)。 在25mg/kg QD中，当给予Ibb干燥填充胶囊或水溶液时，发现相同IVb的Cmax和AUC。第1天，在给药约0.5-1.25小时后，在给予≥92mg/kg QD(3101M、3201F、4101M和4201F)的所有犬中发现呕吐物(白色，带含胶囊残余物的红色条纹物)，它很可能是造成92-250mg/kg完全暴露的原因。第8天，在给药2小时内，在BID给予≥46mg/kg的所有犬中发现呕吐物(白色或棕色)；仅在两只呕吐犬中发现胶囊残余(3101M第一次给药后，4201F第二次给药后)。在犬中，每日两次给药比每日一次给药提供更大IVb暴露。 
除呕吐之外，未发现其它临床体征，对体重和食物消费无影响。 
尽管在犬中发现呕吐，但发现给予Ibb的犬比给予IVb的犬的IVbAUC高。在给予犬Ibb或IVb中得到的IVb AUC对比(2)见图13。 
经口给予磷酸酯(盐)前药Ibb-03水溶液后，在大鼠、犬和猴中的母体化合物IVb的绝对口服生物利用度在50％-310％范围内。这些计算根据历史IV数据。经口给予Ibb-03前药水溶液后，与IVb历史数据相比，给予最高达190mg/kg IVb当量的IVb暴露为大鼠口服剂量递增研究的3-10倍。当BID给予犬Ibb-03药物胶囊时，与BID给予IVb混悬液的ECN前毒理学研究的历史数据相比，暴露增加至2-3倍。胶囊制剂的体内暴露数据提示人口服IVb暴露可通过给予Ibb的传统固体口服剂型显著提高。 
Ibb是IVb的N-羟甲基加戍物的磷酸酯(盐)前药，通过碱性磷酸酯酶(ALP)水解形成IVb。因此给予动物Ibb后，在已知ALP抑制剂EDTA存在下，由采集的血制备血浆样品。Ibb在含EDTA的(大鼠、犬、猴和人)血中转化为Ivb最少(＜2％)，在样品储存(-20℃)和分析Ibb期间，预计无显著体外Ibb转化。 
在动物和人体外系统中研究Ibb水解。因为多种ALP同工型广泛分布在各种组织中，未探索体外与体内数量关联(Fishman等，1968；Komoda等，1981；Moss，1983；Yora and Sakagishi，1986；Sumikawa等，1990)。因此，研究限于定量评价在不同组织中依赖ALP的水解。Ibb 在(大鼠、犬、猴和人)血清、(大鼠、犬和人)肝细胞的存在下以及在人胎盘ALP中水解。未在猴肝细胞中发现反转。Ibb转化为IVb接近化学计量。由于在血清中水解，无法测定与蛋白结合的Ibb。 
Ibb在Caco-2细胞中完全水解，形成IVb，正如所料，经口给予Ibb后，在大鼠、犬和猴血浆中测得极低水平的Ibb。这些数据与描述肠中高水平的ALP表达的报道一致(McComb等1979a；Butterworth，1983)。膜结合的ALP大多数位于肠腔微绒毛衬里的膜缘状刷中(Butterworth，1983；Testa和Mayer，2003)。经口给予Ibb后，很可能Ibb被存在于肠腔的膜缘状刷上的ALP水解，形成IVb，由于其高渗透性，被迅速吸收。 
尽管不同同工型的ALP存在于不同组织和物种中，ALP的底物特异性相对较广(Heimbach等，2003)，它与以上Ibb的发现一致。 
IV给予大鼠、犬和猴Ibb后，迅速形成IVb。在大鼠、犬和猴中，IV AUC转化率分别为0.62、1.6和1.7，提示由Ibb良好转化为IVb。 
给予大鼠、犬和猴Ibb后，发现良好的IVb口服生物利用度(50-310％；用IVb的历史IV AUC计算)。更明显，Ibb的水溶性越高，溶出度速度限制的IVb吸收越弱，因而与历史IVb暴露研究(DiscoveryToxicology章表28-29和图12-13)相比，口服剂量递增和毒理动力学研究中的IVb暴露增加。 
方法 
本报道中所述研究使用Ibb的单赖氨酸盐。 
通过LC/MS/MS定量Ibb和IVb 
开发出LC/MS/MS方法用于动物血样中Ibb和IVb的药物动力学研究和体外温育的乙腈上清液研究分析。为在血浆中分析，用PackardMultiprobe仪将50μL各标准液、QC和血样转移至清洁96孔板，进行蛋白质沉淀提取。加入含内标IVc的200μL乙腈后，将样品涡流混合，离心10min，将沉淀蛋白与液体分离，得到上清液。为分析体外研究产生的上清液，将等体积的上清液和含内标的乙腈混合。用Tomtec自动液体处理仪将以上上清液的等分试样转移至第二个清洁96孔板。加入等体积水，密封板并涡流混合。 
HPLC系统由Shimadzu LC 10ADvp泵(Columbia，MD)和连接Phenomenex Synergi Fusion-RP分析柱(2.0×50mm，5μ；Torrance，CA)的HTC PAL自动进样器(Leap Technologies，Cary，NC)组成。流动相A由5mM甲酸铵水溶液组成；流动相B是100％乙腈。LC流速为0.38mL/min。初始流动相组分是2％B，在1.8min内，变为50％B，保持0.5min，在0.1min内变为100％B，保持0.5min，在后0.1min内返回初始条件，再平衡。总分析时间为4.0min。Ibb、IVb和IVc的保留时间分别是1.42、2.21和1.73min。 
HPLC系统与配备设置在550℃的Turbo离子源和离子喷雾电压设为4.5kV的Sciex API4000三重四极质谱仪(Toronto，Canada)界面连接。用UHP氮气作雾化器和辅助气，压力分别为80psi和7L/min。Ibb、IVb和IVc的碰撞能分别是19、25和29伏。数据采集使用选择反应监测(SRM)。在MS 1中选择代表Ibb、IVb和内标的正离子模式(M+H)+离子，与氮气碰撞解离，使碰撞能最优化，形成具体产物离子，随后通过MS2监测。Ibb、IVb和IVc的SRM过渡分别是m/z 558→432，448→202和474→256。 
由储备液制备范围为5nM-10μM的标准曲线，在用于Ibb和IVb的基质中进行系列稀释。标准曲线溶液按一式两份取样，提取样品，在分析顺序开始、中间和结束时注射进样。用权重为浓度的倒数 1/x2的线性回归拟合标准曲线。用PEBiosystems AnalystTM 1.1处理数据和色谱峰，定量标准和未知的浓度。 
体外方法 
(1)Ibb在EDTA血、血清和Tris-HCl缓冲液中的稳定性 
在采自大鼠、犬、猴和人(n＝2)的新鲜血和血清中研究Ibb的稳定性。将采集的血置于含K2EDTA的真空容器(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中。将采集的血清置于不含抗凝剂的真空容器中。在37℃下，在约15μM起始浓度下，温育Ibb 90min。在各预定时间点取系列样品。先将血样的等分液(200μL)与100μL水混合，然后与400μL乙腈混合。将血清试样(50μL)加入含K2EDTA的微量容器(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中，随后加入100μL乙腈。通过LC/MS/MS分析上清液中的Ibb和IVb。 
按上述方法，还在Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH 7.5)中评价了Ibb的稳定性。 
(2)在人胎盘ALP存在下水解Ibb 
固体人胎盘ALP得自Sigma(P-3895，St.Louis，MO)。在Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH 7.5)中制备1000单位/L溶液。通过系列稀释得到100和10单位/L溶液。在37℃下，将Ibb在10、100和1000单位/L溶液(n＝2)中温育2h。在温育中的Ibb初始浓度为10μM。在各预定时间点取100μL样品的等分液，加入K2EDTA微量容器中，随后加入200μL乙腈。通过LC/MS/MS分析上清液中的Ibb和IVb。 
体内研究 
将采集的所有血样(0.3mL)置于含K2EDTA的微量容器(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)中，置于碎冰上。离心后，分离血浆，在-20℃下储存直至分析。Ibb单赖氨酸盐(形式3)用于药物动力学研 究。在无菌水(用于IV给予犬和猴)或蒸馏水(用于所有其它给药)中制备Ibb给药溶液。 
(1)大鼠体内研究 
使用导管插入颈静脉的雄性Sprague-Dawley大鼠(300-350g，Hilltop Lab Animals，Inc.，Scottsdale，PA)。在PO药物动力学研究中，将大鼠禁食过夜。从颈静脉采集血样。 
在IV研究中，在0.5min内，将1.3mg/kg Ibb(游离酸或1.0mg/kgIVb当量)以大剂量递送(n＝3)。给药溶液浓度为1.3mg/mL，给药体积为1mL/kg。在给药前和给药后2、10、15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时采集系列血样。 
在PO研究中，通过灌饲给予Ibb 6.6mg/kg(游离酸或5.2mg/kgIVb当量)(n＝3)。给药溶液的浓度为1.3mg/mL，给药体积为5mL/kg。在给药前和给药后15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时采集系列血样。 
(2)犬体内研究 
在三只雄性beagle犬(10±0.78kg，Marshall Farms USA Inc.，North Rose，NY)中进行IV和PO给予Ibb研究。每个研究使用3只犬。在3只犬中，2只既用于IV又用于PO研究。在IV和PO研究之间有2周清洗期。 
在IV研究中，通过头静脉，在5min内，以恒速0.1mL/kg/min，输注1.3mg/kg Iab(游离酸或1.0mg/kg IVb当量)。给药溶液的浓度为2.6mg/mL，给药体积为0.5mL/kg。在给药前和给药后5、10、15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时从股动脉采集系列血样。 
在PO研究中，给药前，使犬禁食过夜，通过灌饲给予Ibb 7.0mg/kg(游离酸或5.6mg/kg IVb当量)。给药溶液浓度为7.0mg/mL，给药体积为1mL/kg。在给药前和给药后15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时采集系列血样。 
(3)猴体内研究 
按交叉方式，在三只雄性猕猴(cynomolgus monkeys)(9.9±2.4kg，Charles River Biomedical Research Foundation，Houston，TX)中进行IV和PO给予Ibb研究。在IV和PO研究之间，有2周清洗期。 
在IV研究中，在5min内，通过股静脉，以恒速0.1mL/kg/min，输注1.3mg/kg Ibb(游离酸或1.1mg/kg IVb当量)。给药溶液的浓度为2.7mg/mL，给药体积为0.5mL/kg。在给药前和给药后5、10、15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时从股动脉采集系列血样。 
在PO研究中，给药前，将猴禁食过夜，通过灌饲给予Ibb 5.8mg/kg(游离酸或5.6mg/kg IVb当量)。给药溶液的浓度为5.8mg/mL，给药体积为1mL/kg。在给药前和给药后15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时采集系列血样。 
(4)数据分析 
除另有说明外，所有结果均按平均值±SD表示。 
通过无房室分析，用KINETICATM软件程序(4.0.2版本，InnaPhaseCo.，Philadelphia，PA)计算Ibb和IVb的药物动力学参数。直接由实验观察记录Cmax和Tmax值。用混合型log-线性梯形总和计算AUC0-n和AUCtot值。静脉内给药后，还计算总体内清除(Cl)、平均驻留时间(MRT)和稳态体积分布(Vss)。通过计算经口给药后与静脉内给药后剂量-归一化的AUC值的比例，估计绝对口服生物利用度(以％表示)。 
Ibb在体外肝细胞中的内在清除(Clint)计算如下： 
Clint(μL/min/百万细胞)＝速度/CE
其中速度是在肝细胞中的代谢速度(μL/min/百万细胞)，CE是在温育中的Ibb浓度。 
Ibb体内肝内在清除(Clint.体内)计算如下： 
Figure GSA00000095036601651
其中大鼠、犬、猴和人的χ分别是40、32、30和26g肝/kg体重(Davis和Morris，1993)。 
按照以下方程，用广泛流行的模型计算肝脏清除ClH： 
Figure GSA00000095036601661
其中大鼠、犬、猴和人的肝血流Qh分别为55、31、44和21mL/min/kg(Davis和Morris，1993)。 
肝提取限量(ER)计算如下： 
ER＝ClH/Qh 
用Student′s t-检验进行统计分析(Microsoft Excel，Redmond，WA)。当P＜0.05水平时，认为有统计学显著性差异。 
体外研究 
Ibb在EDTA血、血清和Tris-HCl缓冲液中的稳定性 
作为分析测定验证的一部分，在含已知ALP抑制剂EDTA的血中进行Ibb的稳定性研究(Bowers，Jr.和McComb，1966；Yora和Sakagishi，1986)。在37℃下温育90min后，在含EDTA的血中和在Tris-HCl缓冲液中转化为IVb的Ibb小于2％(表30和31)。在37℃下，发现引起以上小转化百分率，表明在样品储存条件(-20℃)下，不可能发生转化。因此，预计在分析Ibb期间，体外转化为IVb相对最少。 
表30：Ibb在采自大鼠、犬和猴的新鲜EDTA血中的稳定性 
             大鼠血(n＝2)               犬A血(n＝2)             猴血(n＝2) 
时间    Ibb    形成的  形成的％   Ibb    形成的   形成的％   Ibb    形戍的  形成的％ 
(min)   (μM)  IVb     IVb*       (μM)  IVb      IVb*       (μM)  IVb     IVb*
               (μM)                     (μM)                      (μM) 
0       15     0.23    1.6        13     0.089    0.68       16     0.075    0.47 
15      15     0.22    1.5        12     0.079    0.60       19     0.12     0.76 
30      18     0.26    1.7        15     0.085    0.65       18     0.13     0.80 
45      15     0.29    1.9        16     0.095    0.73       18     0.13     0.82 
60      16     0.31    2.0        13     0.088    0.67       19     0.14     0.86 
90      17     0.32    2.1        16     0.11     0.82       17     0.14     0.89 
*以Ibb初始浓度计形成的百分率。 
表31：Ibb在采自人新鲜EDTA血和Tris-HCl缓冲液中的稳定性 
           人血(n＝2)                 Tris-HCI缓冲液(n＝2) 
时间   Ibb(μN)  形成的   形成的％  Ibb(μM)  形成的  形成的％ 
(min)            IVb      IVb*                IVb     IVb*
                 (μM)                        (μM) 
0      16        0.099    0.62      14        0.30    2.2 
15     15        0.093    0.58      12        0.30    2.1 
30     16        0.097    0.60      13        0.33    2.3 
45     16        0.11     0.67      12        0.41    2.9 
60     16        0.10     0.65      13        0.51    3.7 
90     18        0.12     0.73      12        0.51    3.6 
*以Ibb初始浓度计形成的百分率。 
为了解Ibb在全身循环中水解，在37℃下，将Ibb在(大鼠、犬、猴和人)新鲜血清中温育90min。水解速度在猴血清中最快，随后是人、犬和大鼠血清(表3)。Ibb转化为IVb接近化学计量。 
与组织相比，血清含ALP活性较小(McComb等1979a)。此外，由于酶通过血管渗漏，血清还含有源自组织源例如骨、肝和肠的ALP同工型(Moss，1983)。因此，血清中的Ibb可能由多种ALP同工型介导水解。 
表32：Ibb在采自大鼠、犬、猴和人的新鲜血清中的稳定性 
时间      大鼠血清          犬血清          猴血清         人血清 
(min)      (n＝2)           (n＝2)          (n＝2)         (n＝2) 
         Ibb    形成的   Ibb    形成的   Ibb     形成的  Ibb    形成的 
         (μM)  IVb      (μM)  IVb      (μM)   IVb     (μM)  IVb 
                (μM)           (μM)            (μM)          (μM) 
0        12     0.095    13     0.13     14      0.34    13     0.14 
15       9.4    0.33     12     0.66     6.6     6.5     9.0    0.96 
30       9.2    0.60     11     1.2      3.1     8.5     10     2.0 
45       9.4    0.92     10     1.7      1.7     10      10     3.1 
60       9.3    1.3      10     2.4      0.85    11      8.0    3.6 
90       9.0    2.2      8.9    3.6      0.22    13      6.5    5.0 
t1/2   704**          167**             15             75 
(min)*
*以Ibb衰减计算。**半衰期大于温育期。 
Ibb在人胎盘ALP存在下的水解 
为研究Ibb在纯化形式的人ALP中的水解，在37℃下，使Ibb与含人胎盘ALP(10、100和1000单位/L)的溶液一起温育(2hr)。测定Ibb的t1/2衰减(表4)。正如所料，在ALP活性较高的溶液中，水解速度较快。因此，还形成IVb(图14)。这表明Ibb被人ALP水解，形成IVb。 
表33：Ibb在人胎盘ALP液中的水解 
              ALP活性(单位/L)(n＝2) 
                   10    100      1000 
t1/2(min)     198     16     2.0 
注释：在37℃下，在10μM初始浓度下温育Ibb 120min。 
体内研究 
大鼠体内研究 
IV和经口给予Ibb后，Ibb和IVb在大鼠中的药物动力学参数归纳在表34中。血浆浓度对时间的分布关系见图15。为进行对比，还列出IVb在大鼠中的药物动力学研究的历史数据。 
IV给药后，Ibb的总体内清除(Cl)为19mL/min/kg，提示Ibb在大鼠中是低至中等清除化合物。IV给药后，消除半衰期(t1/2)和平均驻留时间(MRT)分别是0.18hr和0.079hr。2h后，未检出Iab。Ibb稳态分布体积(Vss)为0.10L/kg，提示组织分布极为有限。IV给药后，Ibb迅速形成IVb；在第一取样时间点2min检出IVb(数据未列出)。由Ibb形成的IVb的IV AUC与历史IVb研究的IV AUC之比为0.62(完全转化的理论值＝1)，表明在IV给药后，大鼠中Ibb转化为IVb令人满意。 
经口给予(0.25和0.5hr)后，在血浆中测得Ibb(＜10nM)。口服给予IVb的Tmax为0.83hr，它比IVb的历史Tmax 4.7hr短，表明经口给予前药后，IVb吸收更快。更快吸收由前药转化的Ivb很可能是在肠中的Ibb水溶性较好和Ibb快速水解，形成IVb的结果。由Ibb转化为IVb的绝对口服生物利用度是50％，与历史IVb值60％(表34)相似。另外，与IVb历史数据相比，由大鼠口服递增剂量研究Ibb转化为IVb表明暴露较优(表31和图14)。 
表34：IV和经口给予Ibb后，Ibb和IVb在大鼠中的药物动力学参数(平均值±SD，n＝3) 
NA-不适用的；ND-未检出(＜5nM)。 
*由IV和PO分别给予前药后IVb的AUC/给予Ivb后的Ivb AUC计算比率 
**由IV IVb历史数据计算 
犬体内研究 
IV和经口给予Ibb后，Ibb和IVb在犬中的药物动力学参数归纳于表35。血浆浓度对时间的分布关系见图16。为了对比，还列出IVb在犬中药物动力学研究的历史数据。 
IV给药后，Ibb的Cl是27mL/min/kg，与犬肝血流31mL/min/kg相似，提示Ibb在犬中是高清除化合物。IV给药后，t1/2和MRT分别为0.83hr和0.21hr。MRT反映Ibb存在血浆期间的更真实估计，因为终期Ibb血浆浓度低(图3)。4h后，未检出Ibb。Ibb的Vss是0.35L/kg，提示有限的组织分布。IV给药后，Ibb快速形成IVb；在5min的第一取样时间点检出Ivb(未列出数据)。由Ibb形成的IVb的IV AUC与历史研究IVb的AUC之比为1.6，提示IV给药后，在犬中Ibb完全转化为IVb。 
经口给药后，在早期时间点(在1只犬至多2小时)，在血浆样品中测得Ibb(Cmax＝0.034nM)。口服给予IVb的Tmax为0.40hr，类似于IVb的历史Tmax 0.50hr。由Ibb转化为IVb的绝对口服生物利用度是310％，与历史Ivb数据179％相似。另外，当与IVb历史数据相比时，由犬Ibb转化为IVb的暴露的耐受性研究(剂量递增)更大(表31和图15)。 
由Ibb形成的IVb最终血浆浓度与时间的分布关系与历史IVb分布相似(图16)。 
表35：IV和经口给予Ibb后，Ibb和IVb在犬中的药物动力学参数(平均值±SD，n＝3) 
*由IV和PO分别给予前药后IVb的AUC/给予IVb后的IVb AUC计算比率 
**由IV IVb历史数据计算 
猴体内研究 
IV和经口给予Ibb后，Ibb和IVb在猴中的药物动力学参数归纳在表36中。血浆浓度与时间的分布关系见图17。为作对比，还列出IVb在猴中的药物动力学研究的历史数据。 
IV给药后，Ibb的Cl是28mL/min/kg，提示Ibb在猴中是中等至高度清除化合物。IV给药后，T1/2和MRT分别是0.1hr和0.093hr。Ibb的Vss为0.15L/kg，提示组织分布极有限。IV给药后，Ibb迅速 形成IVb；在5min第一取样时间点测得IVb(未列出数据)。由Ibb形成的IVb的IV AUC与历史研究IVb的AUC之比为1.7，提示IV给予猴后，Ibb完全转化为IVb。 
经口给药后，在任何血样中均未检出Ibb(LLQ＝5nM)。经口给予Ibb后，IVb的Tmax为1.5hr，与历史IVb的Tmax 2.5hr相似，由Ibb转化为IVb的绝对口服生物利用度为187％，比历史IVb数据49％高(表36)。 
由Ibb形成的IVb终血浆浓度与时间的分布关系类似于历史IVb分布(图17)。 
表36：IV和经口给予Ibb后，Ibb和IVb在猴中的药物动力学参数(平均值±SD，n＝3) 
Figure GSA00000095036601741
*由IV和PO分别给予前药后IVb的AUC/给予IVb的IVb AUC计算比率 
**由IV IVb历史数据计算 
简介部分3 
另外的前药Icb研究 
CD大鼠单剂量毒理动力学耐受性研究 
用前药Icb(二钠盐)在大鼠中进行1-天口服毒理动力学研究。通过灌饲给予3只雄性大鼠/组Icb，剂量为5、25和200mg/kg(游离酸)，用水作溶媒(溶液制剂)。前药游离酸的剂量分别相当于IVc(母体分子) 摩尔当量剂量4.5、21和163mg/kg。评价终点是在各大鼠中的Icb和IVc血浆毒理动力学。 
毒理动力学平均值列于表37 
表37：给予雄性大鼠≤200mg/kg Icb单次口服剂量后，Icb和IVc的平均毒理动力学值 
Figure GSA00000095036601751
数值代表3只大鼠/组Icb平均数据和3只大鼠/组IVc数据。 
10-∞的AUC 
20-24的AUC 
在给药后≈1.7小时内达到IVc(母体药物)的平均最大血浆浓度(Cmax)。在给予≤267mg/kg Icb的大鼠中，IVc的AUC增加与Icb剂量接近成比例，在25-200mg/kg Icb范围中，Cmax增加小于与剂量成比例模式。在给予≤25mg/kg Icb的大鼠血浆中未检出Icb，在几个时间点，在给予200mg/kg Icb的大鼠血浆中测得极低浓度(≈0.02-0.04μM)。 
在给予大鼠IVc(1)或Icb后得到的IVc AUC对比见图18。 
给予小剂量(例如≤25mg/kg)的母体药物和前药后，IVc的AUC相似，因为两者均配制为溶液(母体用PEG-400/0.1N NaOH，前药用水)，但在大剂量(例如200mg/kg)下，中性母体药物只能配制为混悬液，而前药盐可配制为水溶液，它提供较优的IVc暴露。 
犬单剂量毒理动力学和耐受性研究 
进行两期研究，在剂量25、92或250mg/kg(游离酸，分别相当于母体药物Ivc的20、75或203mg/kg摩尔量)下，评价前药Icb(单氨丁三醇盐)耐受性以及Icb和IVc的毒理动力学(2)。第一天，每日一次给予1只犬/性别/组干燥填充的以上剂量的Icb胶囊。在研究中，在剂量之间，使用1周清洗期。在第8天，每日一次给予1只犬/性别/组25mg/kg Icb水溶液，或每日两次BID给予干燥填充的46或125mg/kg Icb胶囊。终点是：临床体征、体重、食物消耗量和Icb和IVc的血清化学、血液学、血浆毒理动力学。 
各犬的血浆毒理动力学值见表38。 
表38：在给予犬≤250mg/kg Icb后的IVc毒理动力学值 
Figure GSA00000095036601761
1第1日配制成干燥填充的胶囊，第8日配制成水溶液(这两日均按QD给药) 
2第1日，按92mg/kg QD给药，第8日，按46mg/kg BID给药；这两日均配制成干燥填充的胶囊 
3第1日，按250mg/kg QD给药，第8日，按125mg/kg BID给药；这两日均配制成干燥填充的胶囊 
4给药后2小时内，存在胶囊残余物，发现呕吐 
5给药后2小时内，无胶囊残余物，发现呕吐 
在第1和8天，在某些血样中测得低水平(≤0.1μM)Icb。按QD给药，给药1-2小时内达到IVc平均最大血浆浓度(Cmax)，按BID给药，第二次给药1-2小时后达到IVc平均最大血浆浓度(Cmax)。按25mg/kg QD给药，当给予Icb干燥填充胶囊或水溶液时，发现相同IVc的Cmax和AUC。第1天，在给药约0.5-1.25小时后，在给予≥92mg/kg QD(3101M、4101M和4201F)的犬中发现呕吐物(白色或褐色，带含胶囊残余物的红色条痕)，它很可能是造成92-250mg/kg完全暴露的原因。第8天，在给药2小时内，在BID给予≥125mg/kg的两只犬中发现呕吐物，但结果不同。动物4101M尽管呕吐，但基本上暴露，与呕吐物中不存在胶囊残余物一致。 
在第1天和第8天，在某些血浆样品中仅检出低水平(≤0.1μM)Icb。 
除呕吐之外，未发现其它临床体征，对体重和食物消费无影响。 
尽管在犬中发现呕吐，但发现给予Icb的犬比给予IVc的犬的IVcAUC高。在给予犬Icb或IVc中得到的IVc AUC对比(3，4)见图19。 
溶媒和制剂 
用于关键PK和安全研究的制剂概述 
用水溶液PO和IV给予所有大鼠、犬和猴进行体内PK研究。用在20mg/kg IVc当量剂量下制备的水溶液和在20、75和203mg/kgIVc当量剂量的药物胶囊制剂在犬中进行pre-ECN毒理学研究。 
在大鼠口服剂量递增研究中，在4.5、21和163mg/kg IVc当量剂量下给予Icb-03水溶液。发现与经口给予IVc的历史数据相比，经口给予Icb后，母体化合物IVc的AUC和Cmax显著提高。 
代谢和药物动力学概述 
结果和解释概述 
Icb是IVc的N-羟甲基加戍物的磷酸酯(盐)前药，通过碱性磷酸酯酶(ALP)水解形成IVc。因此给予动物Icb后，在已知ALP抑制剂EDTA存在下，由采集的血样制备血浆样品。在含EDTA的(大鼠、犬、猴和人)血中，转化为IVc的Icb最少(＜2％)。在样品储存(-20℃)和分析Icb期间，预计无显著体外Icb转化。 
在动物和人体外系统中研究Icb水解。因为多种ALP同工型广泛分布在各种组织中，未探索体外与体内数量的关系(Fishman等，1968；Komoda等，1981；Moss，1983；Yora and Sakagishi，1986；Sumikawa等，1990)。因此，研究限于定量评价在不同组织中依赖ALP的水解。Icb在(大鼠、犬、猴和人)血清、(大鼠、犬和人)肝细胞以及人胎盘ALP的存在下水解。未在猴肝细胞中发现反转。Icb转化为IVc接近化学计量。由于在血清中水解，无法测定与蛋白结合的Icb。 
IV给予大鼠、犬和猴Icb后，快速形成IVc。在大鼠、犬和猴中，IV AUC转化率分别是1.0、0.67和0.90，提示Icb转化为IVc良好。 
发现给予大鼠、犬和猴Icb后，IVc口服生物利用度(80-122％)良好。更明显地，Icb水溶性越高，在低于某些剂量时，溶出度限制吸收IVc减弱，因而在口服剂量递增和毒理动力学研究中，与历史IVc研究的暴露比较，IVc暴露增加。 
方法 
除另有说明外，本报道中所述研究使用Icb的单氨丁三醇盐。 
通过LC/MS/MS定量Icb和IVc 
开发出LC/MS/MS方法用于动物血样中Icb和IVc的药物动力学研究和体外温育乙腈上清液研究分析。为在血浆中分析，用PackardMultiprobe仪将50μL各标准液、QC和血样转移至清洁96孔板，进 行蛋白质沉淀提取。加入含以下内标化合物X的200μL乙腈后，将样品涡流混合，离心10min，将沉淀蛋白与液体分离，得到上清液。为分析体外研究产生的上清液，将等体积的上清液和含内标的乙腈混合。用Tomtec自动液体处理仪将以上上清液的等分试样转移至第二个清洁96孔板。加入等体积水，密封板并涡流混合。 
化合物X 
4-甲氧基-3-(2-氧代-2-(4-(喹唑啉-4-基)哌嗪-1-基)乙酰基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-7-甲酰胺 
HPLC系统由Shimadzu LC10ADvp泵(Columbia，MD)和连接Phenomenex Synergi Fusion-RP分析柱(2.0×50mm，5μ；Torrance，CA)的PAL自动进样器(Leap Technologies，Cary，NC)组成。流动相A由5mM甲酸铵水溶液组成；流动相B是100％乙腈。LC流速为0.4mL/min。初始流动相组分是3％B，在1.75min内，变为60％B，保持0.5min，在0.1min内变为100％B，保持0.5min，在随后0.1min内返回初始条件，再平衡。总分析时间为4.0min。Icb、IVc和化合物X的保留时间分别是1.2、1.7和1.6min。 
HPLC系统与配备设置在550℃的Turbo离子源和离子喷雾电压设为4.5kV的Sciex API4000三重四极质谱仪(Toronto，Canada)界面连接。用UHP氮气作雾化器和辅助气，压力分别为80psi和7L/min。Icb、IVc和化合物X的碰撞能分别是23、29和37伏。数据采集使用选择 反应监测(SRM)。在MS1中选择代表Icb、IVc和内标的正离子模式(M+H)+离子，与氮气碰撞解离，优化碰撞能，以形成具体产物离子，随后通过MS2监测。Icb、IVc和化合物X的SRM过渡分别是m/z 584→486，474→256和460→218。 
由储备液制备范围为5nM-10μM的标准曲线，在用于Icb和IVc的基质中进行系列稀释。标准曲线溶液按一式两份取样，提取样品，在分析顺序开始、中间和结束时注射进样。用权重为浓度的倒数1/x2的线性回归拟合标准曲线。用PEBiosystems AnalystTM 1.1处理数据和色谱峰，定量标准和未知的浓度。 
体外方法 
(1)Icb在EDTA血、血清和Tris-HCl缓冲液中的稳定性 
在大鼠、犬、猴和人(n＝2)的鲜血和血清中研究Icb的稳定性。将采集的血置于含K2EDTA的真空容器(Becton Dickinson，FranklinLakes，NJ)中。将采集的血清置于不含抗凝剂的真空容器中。在37℃下，在约10μM起始浓度下，温育Icb 90min。在各预定时间点取系列样品。先将血样的等分液(200μL)与100μL水混合，然后与400μL乙腈混合。将血清试样(50μL)加入含K2EDTA的微量容器(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)中，随后加入100μL乙腈。通过LC/MS/MS分析上清液中的Icb和IVc。 
按上述方法，还在Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH 7.5)中评价了Icb的稳定性。 
(2)在人胎盘ALP存在下水解Icb 
固体人胎盘ALP得自Sigma(P-3895，St.Louis，MO)。在Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH 7.5)中制备1000单位/L溶液。通过系列稀释得到100和10单位/L溶液。在37℃下，将Icb在10、100和1000单位/L溶液(n＝2)中温育2h。在温育中的Icb初始浓度为10μM。在各预定 时间点取100μL样品，加入K2EDTA微量容器中，随后加入200μL乙腈。通过LC/MS/MS分析上清液中的Icb和IVc。 
(1)大鼠体内研究 
使用导管插入颈静脉的雄性Sprague-Dawley大鼠(300-350g，Hilltop Lab Animals，Inc.，Scottsdale，PA)。在PO药物动力学研究中，将大鼠禁食过夜。从颈静脉采集血样。 
在IV研究中，在0.5min内，将1.4mg/kg Icb(游离酸或1.1mg/kgIVc当量)以大剂量递送(n＝3)。给药溶液浓度为1.4mg/mL，给药体积为1mL/kg。在给药前和给药后2、10、15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时采集系列血样。 
在PO研究，通过灌饲给予Icb 6.9mg/kg(游离酸或5.6mg/kg IVc当量)(n＝3)。给药溶液的浓度为1.4mg/mL，给药体积为5mL/kg。在给药前和给药后15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时采集系列血样。 
(2)犬体内研究 
按交叉方式，在三只雄性beagle犬(12±2.8kg，Marshall FarmsUSA Inc.，North Rose，NY)中进行IV和PO给予Ibb研究。在IV和PO研究之间有2周清洗期。 
在IV研究中，通过头静脉，在5min内，以恒速0.1mL/kg/min，输注1.3mg/kg Icb(游离酸或1.0mg/kg IVc当量)。给药溶液的浓度为2.6mg/mL，给药体积为0.5mL/kg。在给药前和给药后5、10、15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时从股动脉采集系列血样。 
在PO研究中，给药前使犬禁食过夜，通过灌饲给予Icb 6.0mg/kg(游离酸或4.9mg/kg IVc当量)。给药溶液浓度为12mg/mL，给药体积为0.5mL/kg。在给药前和给药后15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时采集系列血样。 
(3)猴体内研究 
按交叉方式，在三只雄性猕猴(10±1.6kg，Charles RiverBiomedical Research Foundation，Houston，TX)中进行IV和PO给予Icb的研究。在IV和PO研究之间，有2周清洗期。 
在IV研究中，在5min内，通过股静脉，以恒速0.1mL/kg/min，输注1.4mg/kg Icb(游离酸或1.1mg/kg IVc当量)。给药溶液的浓度为2.8mg/mL，给药体积为0.5mL/kg。在给药前和给药后5、10、15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时从股动脉采集系列血样。 
在PO研究中，给药前将猴禁食过夜，通过灌饲给予Icb 4.9mg/kg(游离酸或4.0mg/kg IVc当量)。给药溶液的浓度为9.8mg/mL，给药体积为0.5mL/kg。在给药前和给药后15、30、45min、1、2、4、6、8和24h时采集系列血样。 
(4)数据分析 
除另有说明外，所有结果均按平均值±SD表示。 
通过无房室分析，用KINETICATM软件程序(4.0.2版本，InnaPhaseCo.，Philadelphia，PA)计算Icb和IVc的药物动力学参数。直接由实验观察记录Cmax和Tmax值。用混合型log-线性梯形总和计算AUC0-n和AUCtot值。静脉内给药后，还计算总体内清除(Cl)、平均驻留时间(MRT)和稳态分布体积(Vss)。通过计算经口给药后与静脉内给药后剂量-归一化的AUC值的比例，估计绝对口服生物利用度(以％表示)。 
Icb在体外肝细胞中的内在清除(Clint)计算如下： 
Glint(μL/min/百万细胞)＝速度/CE
其中速度是在肝细胞中的代谢速度(pmol/min/百万细胞)，CE是在温育中的Icb浓度。 
Icb体内肝内在清除(Clint，体内)计算如下： 
Figure GSA00000095036601821
其中大鼠、犬、猴和人的χ分别是40、32、30和26g肝/kg体重(Davis和Morris，1993)。 
按照以下方程，用广泛流行的模型计算肝脏清除ClH： 
Figure GSA00000095036601831
其中大鼠、犬、猴和人的肝血流Qh分别为55、31、44和21mL/min/kg(Davis和Morris，1993)。 
肝提取限量(ER)计算如下： 
ER＝ClH/Qh 
用Student′s t-检验进行统计分析(Microsoft Excel，Redmond，WA)。当P＜0.05水平时，认为有统计学显著性差异。 
体外研究 
Icb在EDTA血、血清和Tris-HCl缓冲液中的稳定性 
作为分析测定验证的一部分，在含已知为碱性磷酸酯酶抑制剂的EDTA的血中进行Icb的稳定性研究(Bowers，Jr.和McComb，1966；Yora和Sakagishi，1986)。在37℃下温育90min后，在含EDTA的血中和在Tris-HCl缓冲液存在下转化为IVc的Icb小于2％(表39和40)。在样品储存条件(-20℃)下，在37℃观察到的以上小的转化百分率未预测到在分析Icb期间会引起任何明显体外转化。 
表39：Icb在大鼠、犬和猴新鲜EDTA血中的稳定性 
Figure GSA00000095036601841
*以Icb的初始浓度计形成的百分率。 
表40：Icb在人鲜EDTA血和Tris-HCl缓冲液中的稳定性 
Figure GSA00000095036601842
*以Icb初始浓度计形成的百分率。 
为了解Icb在全身循环中的水解，在37℃下，将Icb在(大鼠、犬、猴和人)新鲜血清中温育90min。水解速度在猴血清中最快，随后是大鼠、人和犬血清(表41)。Icb转化为IVc接近化学计量。 
与组织相比，血清含ALP活性较小(McComb等1979a)。此外，由于酶通过血管渗漏，血清还含有源自组织源例如骨、肝和肠的ALP同工型(Moss，1983)。因此，血清中Icb可能由多种ALP同工型介导水解。 
表41：Icb在大鼠、犬、猴和人新鲜血清中的稳定性 
Figure GSA00000095036601851
*以Icb衰减计算。**半衰期大于温育期。 
在人胎盘ALP存在下水解 
为研究Icb在纯化形式的人ALP中水解，在37℃下，使Icb与含人胎盘ALP(10、100和1000单位/L)的溶液一起温育(2h)。测定Icb的t1/2衰减(表42)。正如所料，在ALP活性较高的溶液，水解速度较快。因此，还形成IVc(图20)。这表明Icb被源自人的ALP水解，形成IVc。 
表42：Icb在人胎盘ALP溶液中的水解 
Figure GSA00000095036601852
注释：在37℃下，在10μM初始浓度下温育Icb 120min。 
体内研究 
大鼠体内研究 
IV和经口给予Icb后，Icb和IVc在大鼠中的药物动力学参数归纳在表43中。血浆浓度与时间的分别关系见图21。为进行对比，还列出IVc在大鼠中药物动力学研究的历史数据。 
IV给药后，Icb的总体内清除(Cl)为49mL/min/kg，提示Icb在大鼠中是高清除化合物。IV给药后，消除半衰期(t1/2)和平均驻留时间(MRT)分别是0.084hr和0.072hr。Icb稳态分布体积(Vss)为0.21L/kg，提示组织分布极为有限。IV给药后，Icb迅速形成IVc；在第一取样时间点2min检出IVc(数据未列出)。由Icb形成的IVc的IV AUC与历史IVc研究的IV AUC之比为1.0(完全转化的理论值＝1)，提示Icb完全转化为IVc。 
经口给药后，未在任何血浆样品中测得Icb(LLQ＝5nM)。口服给予IVc后的Tmax为0.80hr，它比历史IVc的Tmax 4.0hr短，表明经口给予前药后，IVc吸收更快。更快吸收前药转化的IVc很可能是在肠中的Icb水溶性较好和Icb快速水解而形成IVc的结果。由Icb转化为IVc的绝对口服生物利用度是80％，与历史IVc值82％(表43)相似。另外，与IVc历史数据相比，由大鼠口服递增剂量研究Icb转化为IVc的暴露较优(表37和图18)。 
由Icb形成IVc的最终血浆浓度与时间的分别关系与历史IVc分别相似(图21)。 
表43：IV和经口给予Icb后，Icb和IVc在大鼠中的药物动力学参数(平均值±SD，n＝3) 
Figure GSA00000095036601871
NA-不适用的；ND-未检出(＜5nM) 
*由分别IV和PO给予前药后IVc的AUC/给予IVc的AUC计算比率 
**由历史IV IVc数据计算 
犬体内研究 
IV和经口给予Icb后，Icb和IVc在犬中的药物动力学参数归纳于表44。血浆浓度与时间的分别关系见图22。为了对比，还列出IVc在犬中药物动力学研究的历史数据。 
IV给药后，Icb的Cl是64mL/min/kg，比犬肝血流31mL/min/kg明显要高，提示涉及肝外水解和/或其它消除途径(例如肾排泄)。IV给药后，t1/2和MRT分别为0.25hr和0.14hr。2hr后，未检出Icb。Icb的Vss是0.50L/kg，提示具有组织分布的低潜力。IV给药后，Icb快速形成IVc；在5min第一取样时间点检出IVc(未列出数据)。由Icb形成的IVc的IV AUC与历史研究IVc的AUC之比为0.67，提示IV给药后，在犬中Icb中等转化为IVc。 
经口给药后，未在任何血浆样品中测得Icb(LLQ＝5nM)。经口给予IVc后的Tmax为0.58hr，它比历史IVc的Tmax 1.3hr短，表明经口给予前药后，IVc吸收更快。由Icb转化为IVc的绝对口服生物利用度是104％，与历史IVc数据89％相似。另外，与IVc历史数据相比，由犬口服耐受性研究(递增剂量)Icb转化为IVc暴露更好(表41和图21)。 
由Icb形成的IVc最终血浆浓度与时间的分别关系与历史IVc的分别相似(图22)。 
表44：IV和经口给予Icb后，Icb和IVc在犬中的药物动力学参数(平均值±SD，n＝3) 
Figure GSA00000095036601891
*由IV和PO分别给予前药后IVc的AUC/给予IVc的IVc AUC计算比率 
**由历史IV IVc数据计算 
猴体内研究 
IV和经口给予Icb后，Icb和IVc在猴中的药物动力学参数归纳在表45中。血浆浓度与时间的分别关系见图23。为作对比，还列出IVc在猴中的药物动力学研究的历史数据。 
IV给药后，Icb的Cl是47mL/min/kg，与猴肝血流44mL/min/kg相似，提示Icb在猴中是高清除化合物。IV给药后，T1/2和MRT分别 是0.089hr和0.097hr。Icb的Vss为0.27L/kg，提示组织分布有限。IV给药后，Icb迅速形成IVc；在5min第一取样时间点测得IVc(未列出数据)。由Icb形成的IVc的IV AUC与历史研究IVc的AUC之比为0.9，提示Icb良好转化为IVc。 
经口给药后，在任何血样中均未检出Icb(LLQ＝5nM)。经口给予Icb后，IVc的Tmax为0.92hr，比历史IVc的Tmax 2.3hr短，表明经口给予前药后，IVc吸收更快。由Icb转化为IVc的口服绝对生物利用度为122％，比历史IVc数据64％高(表45)。 
由Icb形成的IVc终血浆浓度与时间的分别关系类似于历史IVc分别(图23)。 
表45：IV和经口给予Icb后，Icb和IVc在猴中的药物动力学参数(平均值±SD，n＝3) 
Figure GSA00000095036601911
*由IV和PO分别给予前药后IVc的AUC/口服给予IVc的AUC计算比率 
**由历史IV IVc数据计算 
另外的简介部分4： 
另外的前药Ie研究 
用类似于上述其它前药的方法，经口给予大鼠前药Ie。PO给药后，在血浆中测得母体分子IVe。 
另外的简介部分5： 
另外的前药If研究 
用类似于上述其它前药的方法，经口给予大鼠前药If。PO给药后，在血浆中测得母体分子IVf。 
按另外的简介部分4和5中所述，下表47列出包含在经口给予大鼠药物研究中的数据。 
Figure GSA00000095036601921
对于在血浆和其它组织中检测前药的注释。一但给予前药的盐形式，应理解在体内可能出现不规则的盐形式。但是，在受试动物模型中，用于定量前药的测定通过分析磷酸盐的游离酸进行检测。例如，假设 
该分析对于赖氨酸盐Iab或游离酸Iac而言属于分析同一物质，不应理解为暗示的含义为检测的物质实际上是赖氨酸盐。在本说明书中，该规定适用于体内研究得到的样品并且仅适用于样品。 
生物 
·″μM″表示微摩尔； 
·″mL″表示毫升； 
·″μl″表示微升； 
·″mg″表示毫克； 
·″DMSO″表示二甲基亚砜 
用于评价由体内前药生成的母体化合物的抗HIV活性的材料和实验方法阐述如下： 
细胞： 
·将人T细胞系MT-2和PM 1(AIDS Research and Reference ReagentProgram，National Institutes of Health)在含10％胎牛血清(FBS，Sigma，St.Louis，MO)的培养基RPMI-1640(Invitrogen，Carlsbad，CA)中维持和增殖。 
病毒： 
·通过AIDS Research and Reference Reagent Program，NationalInstitutes of Health得到HIV-1实验株-T-向性株(tropic strain)LAI。使其在MT-2细胞中增殖，用病毒产率测定(2)滴定。利用适用于闪烁亲近检测方案(1)(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)的逆转录酶测定(3)完成检测。 
实验 
1.通过溶于DMSO，稀释至30mM制备化合物储备液。对于稀释浓度板，用96孔聚丙烯板，将化合物在DMSO中以3倍系列稀释，以 便浓度比终测定浓度大100倍。对于抗病毒和细胞毒性测定，向每个孔中加入2μl(1％终DMSO浓度)。 
2.在浓度＜20μM下，将稀释板中的化合物加入含100μl培养基RPMI-1640、含10％胎牛血清的96孔组织培养板中。 
3.对于抗病毒测定，在O.005感染复数下感染细胞。在37℃下保持1h后，在含10％胎牛血清的培养基RPMI-1640中，将感染细胞稀释至200，000细胞/ml。向每个孔中加入100μl该溶液，得到200μl终体积。 
4.在37℃下，在湿CO2培养箱中温育板，5天后收获。 
5.通过测量上述感染孔的上清液中的逆转录酶活性监测病毒感染。通过定量在化合物存在下的感染细胞的显示水平/不存在各化合物时测得的感染细胞百分比，用100减去这个测得值计算各个化合物的抑制百分率 
6.EC50提供比较本发明化合物的抗病毒效力的方法。用MicrosoftExcel Xlfit曲线拟合软件计算半数抑制有效浓度(EC50)。对于每种化合物，通过使用4参数对数模型(模型205)，由在8种不同浓度下计算的抑制百分率生成曲线。化合物的EC50数据列于表48。 
结果 
EC50的生物数据解答 
EC50＞5μM的化合物 EC50＞1μM但＜5μM的化合物  EC50＞50nM，但未  在更高浓度测定的  化合物   EC50＜1μM的  化合物
C组 B组   A′组   A组
表48.化合物IV(母体分子)的抗病毒活性 
 化合物IVa   化合物Ivb  (钠盐)   化合物IVc  (酸形式)  化合物 IVd(酸形式)
  EC50-LAI  A   A   A  A
前药本身与抗HIV活性无关，因为以下研究所示的母体分子在体内由前药产生，为活性成分，也是血浆中的主要种类。此外，前药在体外测定中可缓慢转化为母体药物，至少在有限程度上转化，因此使抗病毒数据解释复杂化。 
细胞毒性 
1.用本领域熟知的方法，在相同MT-2细胞上进行细胞毒性测定。该方法在文献(4)中有记载。简单地说，在药物存在下，将细胞温育6天，随后用氧化还原活性染料还原测定测量细胞生存力。将50μl XTT试剂(1mg/ml 2，3-二[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-2H-四唑鎓-5-碳酰苯胺(carboxanilide)，10μg/ml吩嗪硫酸二甲酯(methosulfate)溶于磷酸盐缓冲盐水溶液)加入各孔中，温育3小时。在板读出器上，在450nm处定量通过主动呼吸细胞形成的颜色，并用于测定CC50。用该方法测量时，IVa、IVb、IVc和IVd母体分子的CC50大于10μM。细胞毒性数据为次级筛选，表明化合物为非特异性杀灭用于抗病毒测定的细胞，为这些化合物具有抗病毒活性的论点提供进一步支持。 
因此，根据本发明，还提供治疗病毒感染，例如HIV感染和AIDS的治疗方法和药用组合物。该治疗涉及给予需要这种治疗的患者含药用载体和治疗有效量的本发明化合物的药用组合物。 
药用组合物可以是可口服给予的混悬液和片剂形式；鼻喷雾剂、无菌注射制剂，例如无菌注释水溶液或油性混悬液或栓剂形式。 
口服给予混悬液时，按照药剂领域中熟知的技术制备这些组合物，它们可含有本领域熟知的构筑大体积(imparting bulk)的微晶纤维素、用作悬浮剂的藻酸或藻酸钠，用作粘性增稠剂的甲基纤维素和甜味剂/矫味剂。作为速释片，这些组合物可含有微晶纤维素、磷酸二钙、淀粉、硬脂酸镁和乳糖和/或本领域中已知的其它赋形剂、粘合剂、填充剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂。 
可按照已知技术，用适宜的无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，例如甘露醇、1，3-丁二醇、水、林格氏液或等渗氯化钠溶液或适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂，例如包括合成甘油单酯或二酯和包括油酸的脂肪酸在内的无菌、刺激性小的固定油配制注射溶液或混悬液。 
可在1-100mg/kg体重剂量范围内，分次经口给予人本发明化合物。一个优选的口服剂量范围是1-10mg/kg体重，分次给药。其它优选的口服剂量范围是1-20mg/kg和1-30mg/kg体重，分次给药。应该理解，对于任何具体的患者，具体的剂量水平和剂量频次可以不同，取决于多种因素，它们包括使用的具体化合物的活性、化合物的代谢稳定性和作用时间的长度、宿主的年龄、体重、一般健康状况、性别、食物、给药的模式和时间、排泄速度、联合药物、具体病症的严重程度和宿主经历的疗法。 

Claims (2)

1.一种下式Ic的化合物：
Figure FSA00000095036500011
2.一种下式Icb的化合物：
Figure FSA00000095036500012
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