MXPA06010412A - Profarmacos de piperazina y agentes antivirales de piperidina sustituidos - Google Patents

Abstract

Esta invención proporciona Compuestos (I) de profármaco, composiciones farmacéuticas de los mismos, y su uso en el tratamiento de una infección por VIH (ver fórmulas). También, esta invención proporciona Compuestos (II) intermediariosútiles para elaborar Compuestos (I) profármacos.

Description

PROFAEMACOS DE PIPERAZINA Y AGENTES ANTIVIRAES DE PIPERIDINA SUSTITUIDOS Campo de la Invención Esta invención proporciona compuestos que tienen propiedades de fármacos y bioafectadoras, sus composiciones farmacéuticas y métodos de uso. En particular, la invención se refiere a nuevos derivados de diazaindol que poseen una actividad antiviral única. Más particularmente, la presente invención se refiere a compuestos útiles para el tratamiento del VIH y SIDA.

Antecedentes de la Invención La infección por VIH-1 (virus de inmunodeficiencia humana-1) sigue siedo un problema médico mayor, con un estimado de 42 millones de personas infectadas en todo el mundo al final del 2002. El número de casos de VIH y SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) se ha elevado rápidamente. -En 2002, alrededor de 5.0 millones de nuevos infectados se reportaron, y 3.1 millones de personas murieron de SIDA. Los fármacos actualmente disponibles para el tratamiento del VIH incluyen diez inhibidores de la transcriptasa inversa de nucleósido (RT) o combinaciones aprobadas de pildora sencilla (zidovudina o AZT (o Retrovir®) , didanosina (o Videx®) , estavudina (o Zerit®) , REF. : 175622 lamivudina (o 3TC o Epivir®) , zalcitabina (o DDC o Hivid®) , succinato de abacavir (o Ziagen®) , sal de disoproxil fumarato de Tenofovir (o Viread®) , Combivir® (contiene -3TC más AZT) , Trizivir® (contiene abacavir, lamivudina, y zidovudina) y Emtriva® (emtricatibina) ; tres inhibidores de transcriptasa inversa no nucleósidos: nevirapina (o Viramune®) , delavirdina (o Rescriptor®) y efavirenz (o Sustiva®) , y ocho inhibidores de la proteasa péptido miméticos o formulaciones aprobados: saquinavir, indinavir, ritonavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir, Kaletra® (lopinavir y Ritonavir) , Atazanavir (Reyataz®) , Fosamprenavir® y un inhibidor de fusión que ataca el gp41 viral, T-20 (FUZEON®) . Cada uno de estos fármacos únicamente pueden detener transitoriamente la replicación si se usan solos. Sin embargo, cuando se usan en combinación, estos fármacos tienen un efecto profundo en la viremia y el progreso de la enfermedad. De hecho, las reducciones importantes en las tasas de mortalidad entre los pacientes con SIDA se han documentado recientemente como una consecuencia de una aplicación ampliada de terapia de combinación. Sin embargo, a pesar de estos resultados impresionantes, del 30 hasta el 50% de los pacientes fallan de último momento a las terapias de fármaco de combinación. La potencia del fármaco insuficiente, el no cumplimiento o apego, la penetración de tejidos restringida y limitaciones especificas del fármaco dentro de ciertos tipos de células (por ejemplo, la mayoría de los análogos de nucleósido no se pueden fosforilar en las células en reposo) , pueden significar la supresión incompleta de los virus sensibles. Adicionalmente, la alta tasa de replicación y la rápida conversión del VIH-1 en combinación con la incorporación frecuente de mutaciones, lleva a la aparición de variantes resistentes al fármaco y fallas en el tratamiento cuando se presentan concentraciones de fármacos sub-óptimas (Larder y Kemp; Gulick; Kuritzkes; Morris-Jones et al; Schinazi et al; Va.cca y Condra; Flexner; Berkhout y Ren et al; (Ref. 6-14)). Por lo tanto, se necesitan agentes anti-VIH novedosos que exhiban patrones de resistencia distintos, y farmacocinéticos favorables así como perfiles de seguridad para proporcionar más opciones de tratamiento. Los fármacos de VIH-1 actualmente comercializados están dominados por los inhibidores de la transcriptasa inversa de nucleósido o inhibidores de la proteasa péptido miméticos. Los inhibidores de la transcriptasa inversa no de nucleósido (NNRTI) actualmente han ganado un papel incrementadamente importante en la terapia de infecciones por VIH (Pedersen & Pedersen, Ref 15) . Al menos 30 diferentes casos de NNRTI se han descrito en la literatura (De Clercq, Ref. 16) y varios NNRTI se han evaluado en ensayos clínicos. La dipiridodiazepinona (nevirapina) , benzoxazinona (efavirenz) y derivados de bis (heteroaril) piperazina (delavirdina) se han aprobado para su uso clínico. Sin embargo, la mayor desventaja para el desarrollo y aplicación de los NNRTI es la tendencia para una emergencia rápida de cepas resistentes al fármaco, tanto en el cultivo celular de tejido y en individuos en tratamiento, particularmente aquellos sometidos a una monoterapia. Como consecuencia, hay considerable interés en la identificación de NNRTI menos propensos al desarrollo de resistencia (Pedersen & Pedersen, Ref 15) . Una revisión reciente los inhibidores de transcriptasa inversa no de nucleosido: "Perspective on novel therapeutic compounds and strategies for the treatment of HIV infection" ha aparecido (Buckheit, referencia 99) . Una revisión que cubre tanto NRTI como NNRTI ha aparecido (De Clercq, referencia 100). Una introducción del estado actual de los fármacos VIH se ha publicado (De Clercq, referencia 101) . Varios derivados de indol, que incluyen indol 3 sulfonas, piperazino Índoles, pirazino índoles, y derivados de 5H-indolo [3, 2-b] [1, 5]benzotiazepina se han reportado como inhibidores de la transcriptasa inversa del VIH-1 (Greenlee et al, Ref. 1; Williams et al, Ref. 2; Romero et al, Ref. 3; Font et al, Ref. 17; Romero et al, Ref 18; Young et al, Ref. 19; Genin et al, Ref 20; Silvestri et al, Ref. 21) . Las indol-2-carboxamidas también se han descrito como inhibidores de la adhesión celular e infección por VIH (Boschelli et al, US 5,424,329, Ref. 4). Finalmente, los productos naturales de indol 3 substituidos (semicocliodinol A y B, didemetilasterriquinona e isococliodinol) se han descrito como inhibidores de la proteasa del VIH-1 (Fredenhagen et al, Ref. 22) . Los derivados de amida azaindol estructuralmente relacionados se han descrito previamente (Kato et al, Ref. 23 (a); Levacher et al, Ref. 23 (b) ; Dompe Spa, WO-09504742, Ref. 5 (a); SmithKline Beecham PLC, WO-09611929, Ref. 5 (b) ; Schering Corp., US-05023265, Ref. 5 (c) ) . Sin embargo, estas estructuras difieren de aquellas reivindicadas en la presente, en que estas son monoazaindol monoamida en vez de derivados de oxoacetamida, y no se hace mención del uso de estos compuestos para tratar infecciones virales, particularmente VIH. Los nuevos fármacos para el tratamiento del VIH se necesitan para el tratamiento de pacientes que se vuelven resistentes a los fármacos actualmente aprobados antes descritos que atacan a la transcriptasa reversa o a la proteasa. Un método de obtención de estos fármacos es encontrar moléculas que inhiban objetivos nuevos y diferentes del virus. Una clase general de inhibidores que están bajo estudio activo son los inhibidores de la entrada del VIH. Esta clasificación general incluyen fármacos dirigidos a diversos objetivos que incluyen los inhibidores del receptor de quimiocinas (CCR5 o CXCR4), inhibidores de fusión que dirigen el gp41 viral e inhibidores que evitan la colocación de la envolvente viral, gpl20, su objetivo celular humano es CD4. Han aparecido recientemente diversas apariciones o documentos generales sobre los inhibidores de la entrada viral algunas referencias seleccionadas son: Chemokine receptor antagonists as HIV entry inhibitors . Expert Opinión on Therapeutic Patents (2004), 14(2), 251-255.

Inhibitors of the entry of HIV into host cells . Meanwell, Nicholas A. ; Kadow, John F. Current Opinión in Drug Discovery & Development (2003), 6(4), 451-461. Virus entry as a target for anti-HIV intervention . Este, José A. Retrovirology Laboratory irsiCaixa Hospital Univesitari Germans Trias i Pujol, Universitat Autónoma de Barcelona, Badalona, Spain. Curret Medicinal Chemistry (2003), 10(17), 1617-1632. New antiretroviral agents . Rachline, A.; Joly, V. Service de Maladies Infectieuses et Tropicales A, Hopital Bichat-Claude Bernard, París, Fr. Antibiotiques (2003), 5(2), 77-82. New antiretroviral drugs . Gulick, R.M. Cornell HIV Clinical Triáis Unit, División of International Medicine and Infectous Diseases, Weil Medical College of Cornell University, ?e York, ?Y, USA. Clinical Microbiology and Infection (2003), 9(3), 186-193. Sensitivy of HIV-1 to entry inhibitors correlates with envelope/coreceptor affinity, receptor density , and fusión kinetics . Reeves, Jacqueline D.; Gallo, Stephen A.: Ahmad, Navid; Miamidian, John L.; Hervey, Phoebe E.; Sharron, Matthew; Pohlmann, Stefan; Sfakianos, Jeffrey N.; Derdeyn, Cynthia A. ; Blumenthal, Robert; Hunter, Eric; Doms, Robert W. Departament of Microbiology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2002), 99(25), 16249-16254. CODEN: PNASA6 ISSN: 0027-8424. Opportuníties and challenges in targeting HIV entry. Biscone, Mark J. ; Pierson, Theodore C; Doms, Robert W. Departament of Microbiology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA. Curret Opinión in Pharmacology (2002) , 2(5), 529-533. HIV entry inhibitors in clinical development . O'Hara, Bryan M. ; Olson, William C. Progenies Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY, USA. Current Opinión in Pharmacology (2002) , 2(5), 523-528. Resistance mutation in HIV entry inhibitors . Hanna, S eri L.; Yang, Chunfu; Owen, Sherry M.; Lal, Renu B. HIV Immunology and Diagnostics Branch, División of AIDS, STD, Atlanta, GA, USA. AIDS (London, United, Kingdom) (2002), 16(12), 1603-1608. HIV entry: are all receptors created equal ? Goldsmith, Mark A.; Doms, Robert W. Genecor International, Inc., Palo Alto, CA, USA. Nature Immunology (2002), 3(8), 709-710. CODEN: NIAMCZ ISSN: 1529-2908. Peptide and non-peptide HIV fusión inhibitors . Jiang, Shibo; Zhao, Qian; Debnath, Asim K. The New York Blood Center, Lindsley F. Kimball Research Institute, New York, NY, USA. Current Pharmaceutical Desig (2002), 8(8), 563-580. Existen dos métodos generales para evitar la colocación inicial de membrana viral gpl20, al CD4 celular que son a) inhibidores que se enlazan al CD4 humano y la colocación de envolvente viral (gpl20) y b) inhibidores que se enlazan a gpl20 viral y evitan el enlace del CD4 celular. El segundo método tiene la ventaja de que inhibe un objetivo viral y si es selectivo minimiza las posibilidades de perturbar la fisiología humana normal o provocar efectos laterales. Con este método con objeto de superar un espectro en su susceptibilidad al fármaco provocado por la variación en las secuencias de la envolvente viral y para suprimir el desarrollo de la resistencia, es importante alcanzar niveles del plasma al fármaco que se ha tantos como muchos múltiplos posibles sobre el EC50 u otra medida de la concentración del fármaco necesaria para experimentar el virus. Como se discute posteriormente, estos inhibidores parecen ser seguros como para ser de amplia utilidad en el hombre y por lo tanto deben poder lograr niveles de exposición suficientes para permitir la supresión del virus. Entre mayor sea el múltiplo de niveles de fármacos sobre el nivel necesario para inhibir el crecimiento viral, más eficiente y completamente será la supresión de la replicación viral y menor la posibilidad de mutación viral y el desarrollo posterior de resistencia al tratamiento. Así, los aspectos importantes que contribuyen a la eficacia de los inhibidores de la colocación viral incluyen no solamente la potencia y seguridad intrínsecas sino también la farmacocinética y las propiedades farmacéuticas que permiten la colocación de una exposición elevada de plasma a una dosis físicamente factible y un programa aceptable de administración -preferiblemente conveniente. Esta invención describe un método de profármaco que mejora ampliamente la exposición máxima y la capacidad de incrementar exposiciones múltiples (esto es múltiplos de la exposición a fármacos mayores que EC50 o EC90) con un escalamiento de la dosis de los miembros eficaces de la clase previamente descrita de inhibidores de la colocación del VIH.

Una serie de publicaciones y divulgaciones recientes caracterizan y describen un compuesto etiquetado como BMS-806, un miembro inicial de un tipo de inhibidores de la entrada viral que atacan el gp-120 viral y evitan la colocación del virus con el DC4 hospedador. A small molecule HIV-1 inhibitor that targets the HIV-1 envelope and inhibíts CD4 receptor binding. Lin, Pin-Fang; Blair, Wade; Wang, Tao; Spicer, Tomothy; Guo, Qi; Zhou, Nannan; Gong, Yi-Fei; Wang, H.-G. Heidi; Rose, Ronald; Yamanaka, Gregory; Robinson, Brett; Li, Chang-Ben; Fridell, Robert; Deminie, Carol; Demers, Gwendeline; Yang, Zheng; Zadjura, Lisa; Meanwell, Nicholas; Colonno, Richard. Proceedings of the National Academyc of Sciences of the United States of America (2003), 100(19), 11013-11018. Biochemical and genetic characterizations of a novel human inmmunodeficiency virus type 1 inhibitor that blocks gpl20 CD40 interactions . Guo, Qi; Ho, Hsu-Tso; Dicker, Ira; Fan, Li; Zhou, Nannan; Friborg, Jacques; Wang, Tao; McAuliffe, Brian V.; Wang, Hwei-gene Heidi; Rose, Ronald E.; Fang, Hua; Scarnati, Helen T.; Langley, David R. ; Meanwell, Nicholas A. ; Abraham, Ralph; Colonno, Richard J. ; Lin, Pin-fang. Journal of Virology (2003), 77(19), 10528-10536. Method using small heterocyclic compounds for treating HIV infection by preventing interaction of CD4 and gpl20. Ho, Hsu-Tso; Dalterio, Richard A.; Guo, Qi; Lin, Pin-Fang. PCT Int. Appl. (2003), WO 2003072028 A2. Discorevy of 4-benzoyl-l- [ (4-methoxy-lH-pyrrolo [2 , 3-b]pyridin-3-yl) oxoacetyl] -2- (R) -methylpiperazine (BMS- 378806) : A Novel HIV-1 Attachment Inhibitor That Inferieres with CD4-gpl20 Interactions . Wang, Tao; Zhang, Zhongxing; Wallace, Owen B.; Deshpande, Milind; Fang, Haiquan; Yang, Zheng; Zadjura, Lisa M.; Tweedie, Donald L. ; Huang, Stella; Zhao, Fang; Ranadive, Sunanda; Robinson, Brett S.; Gong, Yi- Fei; Ricarrdi, Keith; Spicer, Timothy P.; Deminie, Carol; Rose, Ronald; Wang, Hwei-Gene Heidi; Blair, Wade S.; Shi, Pei-Yong; Lin, Pin-fang; Colonno, Richard J. ; Meanwell, Nicholas A. Journal of Medicinal Chemistry (2003), 46(20), 4236-4239.

BMS-806 Los derivados que contienen Indol, azaindol y otros oxo amidas de esta clase se han descrito en diversas solicitudes de patente de E.U. concebidas y PCT diferentes (referencia 93-95, 106, 108, 109, 110, 111, y 112 y estas referencias se relacionan directamente a los compuestos en esta solicitud de patente. Ninguno de los compuestos de estas referencias del arte previo contiene un grupo fosfato diácido de metilo (o sal o mono o diéster del grupo fosfato) colocado al nitrógeno N-l, de esta manera, los compuestos de la invención actual representan nuevas composiciones de materia. Esta porción incrementa dramáticamente la utilidad de los compuestos precursores al fusionar como una modificación de profármacos que incrementan dramáticamente la exposición sistémica máxima de las moléculas precursoras en modelos preclínicos de exposición humana. Se cree que nada en las referencias del arte previo se puede constituir como que describa o sugiera los compuestos novedosos de esta invención y su uso para inhibir la infección por VIH. Esta invención describe profármacos de indol o azaindol cetopiperazina amidas específicas que son extremadamente efectivos de mejorar la utilidad de las moléculas precursoras como agentes antivirales particularmente como fármacos VIH. Las moléculas precursoras son relativamente insolubles y padecen de absorción limitada en la disolución lo cual significa que cuando la dosis se incrementa arriba de un nivel máximo menos y menos del fármaco se disuelve en el tiempo para absorberse en la circulación y en su lugar pasan a través del cuerpo para eliminarse como desechos. Son necesarias las mejoras ofrecidas por el profármaco, ya que permiten niveles de fármaco en el cuerpo que se incrementen significativamente, lo cual proporciona una mayor eficacia contra el virus del VIH y en particular contra cepas más resistentes o menos sensibles. Los profármacos son especialmente importantes para esta clase de fármacos ya que los fármacos dirigen la envolvente del virus del VIH, un objetivo que varia de cepa a cepa y así en el cual se desean múltiplos de exposición máximo. Debido a que con un profármaco, se absorberá más del profármaco y alcanzará el objetivo, la carga de pastillas el costo del paciente y los intervalos de dosificación se pueden reducir. La identificación de los profármacos con estas propiedades es difícil y no es tan directa, ni es una trayectoria clara para un diseño de profármacos exitoso descrito en la literatura. No hay una enseñanza previa del arte previo de cual química de profármacos emplear ni cual será más efectiva. La siguiente discusión y datos mostrarán que los profármacos descritos en esta invención trabajan sorprendentemente bien. Liberan extremadamente rápida y eficientemente el fármaco precursor y mejoran la exposición a niveles que son superiores a los reportados por muchos profármacos. El uso de estrategias o metologias de profármacos para mejorar notablemente las propiedades de un fármacos o para superar una deficiencia inherente en las propiedades farmacéuticas o farmacocinéticas de un fármaco se pueden usar en ciertas circunstancias para mejorar notablemente la utilidad de un fármaco. Los profármacos difieren de las formulaciones en que las modificaciones químicas conducen a una entidad química completamente nueva que con la administración al paciente, regenera la molécula precursora dentro del cuerpo. Existe una gran cantidad de estrategias de profármacos que proporcionan elecciones en la modulación de las condiciones para la regeneración del fármaco precursor, las propiedades físicas farmacéuticas o farmacocinéticas del profármaco, y la funcionalidad a la cual se pueden colocar las modificaciones del profármaco. Sin embargo, ninguna de estas publicaciones enseña que método usar que resulte en los profármacos específicos aquí inventados. Se han publicado diversas revisiones o discusiones en las estrategias de profármacos y se suministra a continuación una lista no exhaustiva. Hydrolysis in Drug and prodrug Metabolism . Richard Testa and Jachmin Myer, 2003 Wiley-VCH publisheer, ISBN 3-906390-25x. Desing of Prodrugs, Bundgard, H. Editor, Elsevier, Amsterdam, 1985. Pharmacokinetics of drug targeting: specific implications for targeting via prodrugs . Stella, V. J. ; Kearney, A.S. Dep. Pharm. Chem., Univ. Kansas, Lawrence, KS, USA. Handbook of Experimental Pharmacology (1991) , 100 (Targeted Drug Delivery) , 71-103. CODEN: HEPHD2 ISSN: 0171-2004. Journal; Revisión General escrita en inglés. CAN 116:158649 AN 1992: 158649 CAPLUS (Copyright 2004 ACS on SciFinder (R) ) . Prodrugs, Do they have advantages in clinical practice ? Stella, V.J.; Charman, W.N.A.; Naringrekar, V.H. Dep. Pharm. Chem., Univ. Kansas, Lawrence, KS, USA. Drugs (1985), 29(5), 455-73. CODEN: DRUGAY ISSN: 0012-6667. Journal; Revisión General escrita en inglés. CAN 103:115407 AN 1985:515407 CAPLUS (Copyright 2004 ACS on SciFinder (R) ) . Trends in prodrug research . Stella, V.J.; Naringrekar, V.H.; Charman, W.N.A. Dep. Pharm. Chem., Univ. Kansas, Lawrence, KS, USA. Pharmacy International (1984), 5(11), 276- 9. CODEN: PHINDQ ISSn: 0167-3157. Journal; Revisión General escrita en inglés. CAN 102:72143 AN 1985:72143 CAPLUS (Copyright 2004 ACS on SciFinder (R) ) . Aunque algunas tecnologías se sabe que tiene aplicaciones específicas, esto es, mejorar la solubilidad o absorción por ejemplo, el desarrollo de profármacos permanece en un amplio grado como un ejercicio empírico. Así, se deben usualmente averiguar diversas estrategias o modificaciones químicas, y los compuestos resultantes evaluados en modelos biológicos con objeto de determinar y calibrar el éxito de las estrategias de profármacos. Una estrategia exitosa de profármaco requiere que un sitio químicamente reactivo de una molécula se modifique por medio de la adición de la porción de profármaco y que posteriormente bajo las condiciones deseadas en los pacientes, la porción de profármaco liberará y desmascarará el fármaco precursor. La molécula de profármaco debe tener una estabilidad adecuada en una forma aceptable de dosis previo a la dosificación. Además el mecanismo de liberación debe permitir que el profármaco regenere de manera eficiente el fármaco precursor y con la cinética que proporcionen niveles terapéuticos del fármaco precursor en el objetivo deseado. En estas moléculas, el nitrógeno del indol o el azaindol representan un punto aceptable de colocación para una porción de profármaco. La sugerencia de que un grupo fosfato unido por una química o enlazador adecuado puede mejorar la exposición oral de un fármaco precursor es un concepto conocido en el arte. Sin embargo como se discutirá a continuación, es impredecible saber sin con el uso de un grupo fosfato para crear un profármaco trabajará con una substancia de fármaco dada. El grupo fosfato altera temporalmente las propiedades físicas del profármaco y es así un profármaco que incrementa la solubilidad acuosa de la molécula resultante, hasta que se desdobla por fosfatasa alcalina en el cuerpo u otra reacción química de un ligador diseñado racionalmente. Por ejemplo en la siguiente referencia, los autores concluyen que los fosfatos pueden mejorar la eficacia oral. En esta referencia un derivado de fosfato de un grupo alcohol en un fármaco lipofílico pobremente soluble en agua despliega una mejor biodisponibilidad oral que los otros profármacos y parece ofrecer una ventaja sobre la molécula precursora que posee una baja biodisponibilidad oral. Evaluation of a targeted prodrug strategy to enhace oral absorption of poorly wa ter-soluble compounds . Chan, 0. Helen; Schmid, Heidi L. ; Stilgenbauer, Linda A.; Howson, William; Horwell, David C; Stewart Barbra H. Pharmaceutical Research (1998), 15(7), 1012-1018.

Se han publicado dos documentos muy pertinentes y recientes que discuten las dificultades en identificar profármacos de fosfato con ventajas importantes sobre la molécula precursora para uso oral. Un documento titulado "Absorption Rate Limit Considerations for Oral Phosphate Prodrugs" by Tycho Heimbach et . al. in Pharmaceutical Research 2003, Vol 20, No. 6 paginas 848-856 establece La incapacidad sorprendente de usar profármacos de fosfato por la vía oral acelera un estudio en un sistema que se usa para separar por exclusión candidatos de fármacos para un potencial de absorción". Este documento también reciba las razones por las que muchos profármacos- de fosfato fueron inadecuados para uso oral y discute diversos factores limitantes de la relación de potencial en el proceso de absorción de fármacos. El documento también identifica las pocas aplicaciones exitosas. El documento intenta identificar propiedades que pueden hacer a algunos fármacos adecuados para la administración oral como profármacos de fosfato pero el mensaje está claro de que hay todavía una ciencia empírica. Esto se enfatiza por las conclusiones de un segundo documento por los mismo autores titulado "Precipitación mediada por enzimas de fármacos precursores a partir de sus profármacos de fosfato" por Tycho Heimbach et . al en International Journal of Pharmaceutics 2003, 261, 81-92. Los autores declaran en el resumen que muchos profármacos de fosfato orales han fracasado al mejorar la velocidad o grado de absorción en comparación con sus fármacos precursores insolubles. La generación rápida de un fármaco precursor por medio de la fosfatasa alcalina intestinal puede resultar en soluciones sobresaturadas, lo que conduce a una precipitación del fármaco precursor. Esto limitaría la utilidad de los fosfatos orales. Las conclusiones de este documento declaran (citada) "En resumen la precipitación de los fármacos precursores de los profármacos de fosfato puede estar mediada por enzimas. La precipitación de ciertos fármacos también se puede observar para ciertos fármacos en el modelo Caco-2. Ya que los tiempos de inducción disminuyen y los tiempos de nucleación se incrementan con alta relaciones de sobresaturación, los fármacos precursores pueden precipitarse cuando la concentración de los profármacos dirigidos es mucho mayor que la solubilidad del fármaco precursor para los fármacos precursores con altas relaciones de sobresaturación. El grado al cual se precipita un fármaco precursor durante la conversión del profármaco, depende de las relaciones de conversión de profármaco precursor, el efecto del profármaco en la precipitación del fármaco precursor y la solubilización del fármaco precursor". Como se puede observar por la conclusión del autor el proceso es complejo y depende de muchos factores que son imposibles de predecir por adelantado tales como las relaciones de sobresaturación, las relaciones de conversiones de profármacos in vivo y la capacidad del lugar intestinal para solubilizar mezclas de profármaco y precursor. Las dos referencias de Heimbach describen la situación clínica de los profármacos de fosfato y discuten las diversas características y unos cuantos ejemplos exitosos. Un ejemplo de un fracaso clínico y un ejemplo de un éxito se suministran a continuación. El Etoposide es un fármaco anticáncer que se administra ya sea por vías orales o intravenosas. Los profármacos de fosfato de etopósido se usan clínicamente pero estas estructuras difieren de los derivados de la solicitud actual ya que este profármaco contiene un fosfato formado por la colocación directa a una porción de fenol del fármaco precursor. Las principales razones para la preparación de un profármaco de fosfato del etopósido del fármaco fueron para mejorar el uso intravenoso por medio de la solubilidad aumentada y la relación de excipiente. Aunque se evaluó oralmente el profármaco de fosfato tanto clínicamente como preclínicamente, solamente se usa clínicamente para administración intravenosa. Synthesis of etoposide phosphate, BMY-40481 : a water-soluble clinically active prodrug of etoposide. Saulnier, Mark G.; Langley, David R. ; Kadow, John F. ; Senter, Peter D.; Knipe, Jay O.; Tun, Min Min; Vyas, Dolatrai M. ; Doyle, Terrence W. Bristol-Myers Squibb Co . , Wallingford, CT, USA.

Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (1994), 4(21), 2567- 72 y referencias en ella. Como se puede observar de las siguientes dos referencias, los beneficios de la porción de fosfato para dosificación oral no están claros. Randomized comparison of etoposide pharmacokinetics after oral etoposide phosphate and oral etoposide. De Jong, R. S.; Mulder, N.H. Uges, D.R.A.; Kaul, S.; Winograd, B.; Sleijfere, D.Th.; Groen, H.J.M.; Willemse, P.H.B.; van der Graaf, W.T.A.; de Vries, E.G.E. Departament of Medical Oncology, University Hospital Groningen, Groningen, Neth.

British Journal of Cáncer (1997), 75(11), 1660-1666. Este documento compara el precursor y profármaco directamente y concluye que el fosfato de etopósido oral no ofrece un beneficio clínico relevante sobre el etopósido oral. Etoposide bioavailability after oral administration of the prodrug etoposide phosphate in cáncer patients during a phase I study. Chabot, G.G.; Armand, J.-P.; Terref, C; De Forni, M. ; Abigerges, D. ; Winograd, B.; Igwemezie, L.; Schacter, L.; Kaul, S.; et al. Department Medicine, Gustave- Roussy Institute, Villejuif, Fr. Journal of Clinical Oncology (1996), 14(7), 2020-2030. Este documento previo encontró que los datos comparados con la literatura, el EP oral tuvo un valor superior F de 19% en comparación con el E oral ya sea a dosis altas o bajas. Concluyeron que este F elevado en el EP profármaco oral de E parece ser una ventaja farmacológica que puede ser de importancia farmacodinámica potencial para este fármaco. Sin embargo el estudio previamente seleccionado que alcanzó conclusiones opuestas se hizo después y parece que fueron más válidos los datos de comparación directos. Así al agregar un grupo fosfato para mejorar la solubilidad no es una garantía de una eficacia oral mejorada. Un profármaco de fosfato del inhibidor de proteasa del VIH Amprenavir se preparó y es el ingrediente activo de lo que se ha vuelto ahora un fármaco mejorado para uso oral. Este es un ejemplo de un suceso raro de este método. El fosfato se coloca directamente a una porción hidroxi y sirve para mejorar la solubilidad. El Fosamprenavir solo en combinación con otro inhibidor de proteasa ritonavir que sirve para inhibir la desactivación metabólica mediada por el citocromo P450 3A4, permite que los pacientes reciban menos pastillas, pastillas más pequeñas debido a la necesidad de menos excipientes y emplear un programa de dosificación menos frecuente. Claramente la estructura del Amprenavir es significativamente diferente de las moléculas de la presente invención y no predice el éxito con otros tipos de fármacos o química de ligadores de fosfato. Se incluyen a continuación dos referencias del Fosamprenavir pero los datos más recientes se pueden encontrar al buscar en una base de datos bien conocida en el arte tal como IDDB (Una base datos comercial denominada Investigational Drugs Datábase producida por Current Drugs Ltd.).

Fosamprenavir vértex Pharmaceuticals /GlaxoSmithKline . [Erratum to document cited in CA 138 : 130388] . Corbett, Amanda H.; Kashuba, Angela D.M. School opf Pharmacy, The University of North Carolina Hospitals, Chapel Hill, NC, USA. Current Opinión in Investigational Drugs (PharmaPress Ltd.) (2002), 3(5), 824. Fosamprenavir Vértex Pharmaceuticals / Glaxo SmithKl ine . Corbett, Amanda H.; Kashuba, Angela D.M. School of Pharmacy, The University of North Carolina Hospitals, Chapel Hill, NC, USA. Current Opinión in Investigational Drugs (PharmaPress Ltd.) (2002), 3(3), 384-390. La búsqueda de ejemplos en la literatura que se pueden encontrar enlistados bajo las palabras clave "profármaco de índoles" o "profármacos de azaindoles", identifican diversas referencias que han sido descritas. No estamos al tanto de alguna referencia en las cuales se preparen profármacos de azaindol mediante el uso de un fosfato diácido de metilo (o sal o mono o diéster del grupo fosfato) en la porción colocada a N-l. Con referencia a los profármacos de indol fosfato la publicación de Zhu et. al. describe un estudio para encontrar un profármaco de fosfato efectivo de PD 154075. En esta molécula, el fosfato de indol directo o un fosfato diácido de metilo o un profármaco de la sal del nitrógeno indol son profármacos inadecuados debido a una baja velocidad de regeneración de la molécula precursora. Así el ligador complejo y novedoso detallado a continuación se desarrolló para incorporar un fosfato en solubilización. Phosphate prodrugs of PD 154075. Zhu, Zhijian; Chen, Huai-Gu; Goel, Om P.; Chan, 0. Helen; Stilgenbauer, Linda A.; Stewart, Barbra H. División of Warner-Lambert Company, Chemical Development, Parke-Davis Pharmaceutical Research, Ann Arbor, MI, USA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2000), 10(10), 1121-1124.

Muchas de las referencias describen el diseño de profármacos para propósitos diferentes a superar la absorción limitada por la disolución . Diversos profármacos no se colocan al nitrógeno del indol o el azaindol o se diseñan para liberar intermediarios radicales más que el fármaco precursor . Los fármacos descritos en este arte y sus propiedades , no proporcionan soluciones obvias para mej orar las propiedades de los inhibidores colocados en el VIH precursor . Se ha encontrado recientemente que nuevos profármacos de fosfato diácido de metilo y sales farmacéuticamente aceptables de la estructura general mostrados abajo, son útiles como agentes anti VIH con un nuevo mecanismo que no se emplea actualmente por los fármacos existentes . La necesidad de fármacos con nuevos mecanismos es grande ya que no se les dejan opciones a los pacientes si se vuelven resistentes a las clases actuales de fármacos . Además, ' se pueden usar fármacos con nuevos mecanismos en combinaciones con clases conocidas de inhibidores para cubrir la aparición de resistencia a estos fármacos ya que las cepas de virus resistentes es probable que sean todavía susceptibles a fármacos con un mecanismo alternativo.

Se ha encontrado que estos profármacos con más solubles en agua que las moléculas precursoras y se convierten rápidamente a los precursores después de una dosificación oral en roedores o en ensayos in vitro con enzimas o tejidos humanos. Además, en un estudio de escalación de dosis oral, un profármaco suministró mejoras sorprendentes en la exposición a fármacos (AUC) y una concentración máxima (Cmax) cuando se incrementó la dosis. Estos estudios predictivos sugieren que estos profármacos deben suministrar ventajas en perro y en humanos .

El compuesto precursor IVa se ha estudiado en ensayos químicos humanos. El compuesto se dosificó en voluntarios humanos saludables. Se muestra a continuación en la figura 1 una gráfica de exposición contra dosis. Como se puede observar, las dosis sencillas de una formulación de cápsulas (triángulos rojos) esta el intervalo de tamaño desde 200-2400 mgs en incrementos de 200 mg. También es fácilmente evidente de los AUCs orales que los incrementos de la exposición a fármacos se incrementan mucho más lentamente y menos que proporcionalmente que la dosis. De hecho las diferencias o incremento en la posición arriba de 800 mgs es mínimo. Con la relaciones de dosis de 1:2:4:6:9:12 para un tratamiento con cápsulas bajo las condiciones de ayuno, las relaciones de los valores medios de Cmax y AUC son de 1:1.3:2.4:2.3:1:2.7 y 1:1.5:2.3:2.0:1.9:2.4, respectivamente. Entre un intervalo de dosis de 200-800 mg, los incrementos en la exposición sistemica se relacionan con la dosis aunque menos proporcionales a la dosis mientras que tal exposición es independiente de la dosis arriba de una dosis de 800 mg. Este fenómeno indica que la absorción del compuesto IVa con la formulación de cápsula usada se satura bajo condiciones de ayuno. La proporcionalidad de la dosis en una exposición sistémica parece presentarse mucho mejor bajo la condición alimentada (alimento de alta grasa) con relaciones de Cmax y AUC son 1.6 y 1.5, respectivamente cuando la relación de dosis es 1:2.3 (800 mg vs . 1800 mg) . Como se puede observar al comparar una dosis sencilla de 200 mg de una solución de IVa (cuadro rojo obscuro) con aquella de una dosis de cápsula de 200 mg, fue mayor la exposición de la solución. La dosificación con una solución incrementa la exposición del compuesto IVa. El Cmax y AUC de la solución fueron aproximadamente 8 y 3 veces respectivamente de aquel de la cápsula (200 mg) . La biodisponibilidad relativa (32%) de la cápsula a la formulación en solución, sugiere que la absorción está limitada por la velocidad de disolución sugiriendo un potencial para mejorar la exposición sistemica al mejorar la formulación. Un alimento con alta grasa tuvo efecto de alimento positivo en el compuesto. El Cmax después de tratamiento de alimentación puede aproximadamente 2.6 y 4.6 veces para dosis de 800 y 1800 mg respectivamente de aquella del tratamiento en ayuno. Los AUCs después de un tratamiento de alimentación fueron de aproximadamente 2.5 y 4.7 veces para dosis 800 y 1800 mg respectivamente de aquellos del tratamiento en ayuno. Los valores de biodisponibilidad relativa (alimentada contra ayuno) fueron de 293% y 509% para dosis 800 mg y 1800 mg respectivamente. La Tmax mediana cambió de 1.25 o 2 (ayuno) a 4 (alimentación) horas. Para una cápsula de 800 mg con alimentación, la concentración promedio en el plasma es de 1001 y 218 ng/ml a 8 y 12 horas después de la dosis respectivamente. Los resultados apoyan un régimen de dosificación de cada 12 horas o cada 8 horas para un valor objetivo Cmin de al menos 200 ng/ml después de dosis múltiple. Este valor se seleccionó con base en datos preclínicos. Un resumen adicional de algunos de estos datos presentados como una gráfica de barras se muestra en la segunda gráfica de barras en la figura 2B.

ESTUDIO DE DOSIS MÚLTIPLE EN HUMANOS SALUDABLES Un estudio de dosis múltiple ascendente controlado por placebo para evaluar la seguridad tolerancia y fármacocinética del compuesto IVa en sujetos humanos saludables se llevó a cabo. Se continuó la dosificación de intervalos de 12 horas por 14 días. En resumen los resultados preliminares PK indican que después de dosis sencillas y múltiples de Q12H del compuesto IVa, la exposición es generalmente proporcional a la dosis sobre los rangos de dosis de 400 a 1200 mg y 400 a 800 mg con alimento de alta grasa y alimento ligero respectivamente, la exposición parece ser independiente de la dosis arriba de estos niveles de dosis con los diferentes tipos de alimentos, la acumulación es de baja moderada (hasta ~1.5 veces), y hay una variación diurna en la exposición en que la exposición es mayor después de una dosis por la noche que después que una dosis por la mañana. Así, la exposición fue mejor cuando la dosificación se combina con un alimento con alta grasa y la exposición se incrementa con dosis que fueron mayores con un alimento de alta grasa. Esto es similar a los resultados obtenidos en el estudio anterior de dosis sencilla.

ESTUDIO DE DOSIS MÚLTIPLE EN PACIENTES CON VIH. Con base a los datos de exposición a partir de los estudios en voluntarios normales, se efectúo un estudio de eficacia en pacientes con VIH. Se ha hecho una divulgación inicial de estos datos en una plática y en el resumen publicado "Antiviral Activity, Safety, and Tolerability of a Novel, Oral Small-Molecule HIV-1 Attachment Inhibitor, IVa, en "HIV-1-Infected Subjects" G. Hanna, J. Lalezari, J. Hellingeer, D. Wohl, T. Masterson, W. Fiske, J. Kadow, P-F. Lin, M. Giordano, R. Colonno, DF. Grasela. Abstract J-32, 02/11/2004, llth Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA. El diseño del estudio incluyo adultos con VIH positivo que estaba en novatos en terapia antiretroviral o fuera de terapia antiviral por > 16 semanas. Se requirió que sus cuentas CD4 estuvieran > 250 células/mm3 y el ARN de VIH 1 en plasma necesitaba estar en el rango de 5,000-500,000 c/ml. Hubieron 15 sujetos en cada extremo de dosis y la relación de pacientes que recibían el fármaco con el placebo fue de 4:1. El estudio secuencial controlado por placebo de IVa utilizo un extremo de dosis inicial de 800 mg PO cada 12 horas seguido por un segundo extremo de dosificación de 1800 mg PO administrado cada 12 horas. Es importante señalar que el profármaco se administró en una cápsula y en combinación con un alimento de alta grasa para incrementar la exposición y los niveles en plasma. El fármaco de estudio se administró por 7 días y la mañana del día 8. Se siguieron los sujetos por 14 días, Resultados del Estudio (para 18 de los 24 pacientes que reciben el fármaco IVa) Resultados del estudio (para 18 de los 24 pacientes que reciben el fármaco IVa) 1. Como se puede observar para los datos en el nivel de dosificación de 800mg en combinación en un alimento de lata grasa, se observo una actividad antiviral importante. Sin embargo, solamente el 58% de los pacientes tuvieron un registro de caída >1.0 log en la carga viral. Se observó una mejor respuesta con el régimen de dosificación de 1800 mg con un alimento alto en grasas en donde la respuesta del alimento tuvo un registro de caída de -.96 log 10 en la carga viral. Estos datos muestran que este fármaco tuvo una actividad antiviral importante a dosis de 800 mg y 1800 mg (y así en intermedia) cada 12 horas en combinación con un alimento de alta grasa y por lo tanto puede jugar un papel importante en la terapia de combinación. Un resumen actualizado de los resultados con BMS-043 en el hombre pueden obtenerse revisando el resúmenes o diapositivas de la presentación oral "Antiviral Activity, Safety, and Tolerability of a Novel, Oral Small-Molecule HIV-1 Attachment Inhibitor, BMS-488043, in HIV-1-Infected Subjects" G. Hanna, J. Lalezari, J. Hellingeer, D. Wohl, T. Masterson, W. Fiske, J. Kadow, P-F. Lin, M. Giordano, R. Colonno, D. Grasela. Resumen J-32, 02/11/2004, llth Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (CROI) , San Francisco, CA. Desafortunadamente no fue factible suministrar este fármaco crónicamente durante muchos meses que involucraran la administración de un total de 9 cápsulas de 200 mg cada una dos veces al día, en combinación con un alimento de alta grasa, por razones obvias de salud de manera que se necesitará una nueva formulación que suministre una exposición mejorada a partir de una dosis inferior y que elimine la necesidad de un alimento de alta grasa. Así los datos clínicos muestran que un método para mejorar la exposición de este fármaco a partir de dosis inferiores y en ausencia de un alimento de alta grasa es necesario . Así, los datos iniciales en los profármacos de esta invención sorprendentemente predicen que mejorarán la exposición de moléculas tales como IVa y suministrarán los fármacos precursores en concentraciones que permitirán usarse a los fármacos en ausencia de alimentos de alta grasa, con una carga inferior de cápsulas y crónicamente como un componente de la terapia antiretroviral. Los datos iniciales obtenidos a partir de la dosificación de cápsulas sólidas tanto de profármacos lab (sal de lisina) o moléculas precursoras sólidas (IVa) para perros se resumen en la primer gráfica de barras de la figura 2A de la figura 2. Como se observa, después de la dosificación de profármacos lab (sal de monolisina) tanto en perros en ayuno como en perros alimentados con alimentos altos en grasas, la exposición es sorprendentemente alta cuando se compara con la molécula precursora de dosificación.

También, el efecto del estado alimento vs ayuno es mínimo si cualquiera de los profármacos tienen aún un efecto obvio al exponerse después de la dosificación de la molécula precursora sólida. De esta manera, se encuentra sorprendentemente que la exposición de la molécula precursora después de la dosificación del profármaco, no muestra una dependencia en un alimento alto en grasas que pronostica niveles de exposición consistentes después de la dosificación de la molécula precursora. La gráfica de barras en la figura 2B resume los datos humanos descutidos previamente para la molécula precursora IVa y muestra la dependencia de exposición para la molécula en alimentos altos en grasas, el incremento no proporcional en la exposición vs dosis y exponer mejor la dosificación a una solución en lugar de la formulación sólida. Como se discutió anteriormente, esto muestra una disolución o relación de absorción de la exposición limitada que en modelos preclínicos se presentan sorprendentemente mejorados, vía el uso de los profármacos de fosfato. El uso de profármacos de fosfato también tienen una exposición incrementada en perros en ayunas vs los precursores para otros profármacos. Detalles de estos experimentos se encuentran en la sección experimental. Además, los detalles de varios estudios en ratas, perros, y monos para dos ejemplos de profármacos adicionales y en ratas para otros dos profármacos demuestran la sorprendente utilidad de estos profármacos para incrementar la exposición sobre la molécula precursora obtenida en dosis que correlacionan aquellos que probablemente pueden ser de utilidad para el tratamiento e inhibición de la replicación viral del VIH.

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SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención comprende compuestos de la fórmula 1, sus formulaciones farmacéuticas, y su uso en pacientes que padecen o susceptible a un virus tal como VIH. Los compuestos de la fórmula I, el cual incluye sales farmacéuticamente aceptables no tóxicas del mismo, tiene la fórmula y mecanismo como se describe arriba. La presente invención comprende un compuesto de la Fórmula I, I en donde : X es C o N con la condición de que cuando X es N, V es C y R1 no existe; W es C o N con la condición de que cuando W es N, R2 no existe; V es C; R1 es hidrógeno, metoxi o halógeno; R2 es hidrógeno; R3 es metoxi o heteroarilo, cada uno de los cuales puede ser opcionalmente independientemente sustituido con un substituyente seleccionado de G; en donde heteroarilo es triazolilo, pirazolilo o oxadiazolilo; E es hidrógeno o un mono farmacéuticamente aceptable o bis sal del mismo: Y se selecciona del grupo que consiste de R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, cada uno independientemente H o metilo con la condición de que no más de dos de R10-R17 son metilo; R18 se selecciona del grupo que consiste de C (O) -fenilo, C (O) -piridinilo, piridinilo, pirimidinilo, quinolilo, isoquinolilo, quinazolilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, ptalazinilo, azabenzofurilo, y azaindolilo, cada uno del cual puede opcionalmente independientemente sustituido de uno o dos miembros seleccionado del grupo que consiste de metilo, -amino, -NHMe, -NMe2, metoxi, hidroximetilo y halógeno; D se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, ciano, S(0)2R24, halógeno, C(0)NR21R22, fenilo y heteroarilo; en donde el fenilo o heteroarilo es opcionalmente independientemente sustituido con uno a tres iguales o diferentes halógenos o de uno a tres iguales o diferentes substituyentes seleccionados de G; en donde el heteroarilo se selecciona del grupo que consiste de piridilo y oxadiazolilo; A se selecciona del grupo que consiste de fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo en donde el fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo son opcionalmente independientemente sustituido con uno a tres iguales o diferentes halógenos o de uno a tres iguales o diferentes substituyentes seleccionados de G; G se selecciona del grupo que consiste de { ?-6) alquilo, (Ci-ß) alquenilo, fenilo hidroxi, metoxi, halógeno, -NR23C(0)- (Ci-e) alquilo, -NR2R25, -S (0) 2NR24R25, COOR26 y -CONR24R25, en donde el (C?_6) alquilo es opcionalmente sustituido con hidroxi, dimetilamino, o uno a tres iguales o diferentes halógenos; R26 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y (Ci-e) alquilo; R20, R21, R22, R23, R24, R25, son independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, (C?_ 6) alquilo y - (CH2) nNR27R28; y n es 0-6 R27 y R28 son cada uno independientemente H o metilo. Una modalidad más preferida son compuestos arriba en donde: X y W son cada uno N, o compuestos arriba en donde: X es C; y W es N. Otra modalidad preferida son compuestos como se describen arriba en donde: R18 es -C(0)-Ph; y Y es Otra modalidad preferida son compuestos como se describe arriba en donde: R3 es metoxi o triazolilo, en donde el triazolilo es opcionalmente sustituido con un susbtituyente seleccionado de G; R10 -R17 son cada uno H; y G es metilo. Otra modalidad preferida de los compuestos son como se describen arriba en donde: R1 es F, y R3 es 1, 2, 3-triazolilo se enlazaron en la posición N-l. Otra modalidad preferida son los compuestos como se describe arriba en donde: R1 es OMe, y R3 es 3-metil-l, 2, 4-triazolilo enlazados en la posición N-l. Otra modalidad preferida son compuestos como se describen arriba en donde: R1 y R3 son cada uno OMe. Otra modalidad preferida con compuestos como se describen arriba en donde la sal es sodio, lisina o trometamina.

Otra modalidad preferida de la invención es una composición farmacéutica que comprende un cantidad efectiva antiviral o un compuesto de la Fórmula I, que incluyen sales farmacéuticamente aceptables del mismo, y uno o más portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptable . Otra modalidad preferida es la composición farmacéuticamente aceptable de arriba, usado para el tratamiento de infección por VIH, que comprende adicionalmente una cantidad efectiva antiviral de un agente de tratamiento SIDA seleccionado del grupo que consiste de: (a) un agente antiviral para el SIDA (b) un agente anti-infeccioso (c) un inmunomodulador; y (d) inibidores entre VIH. También se abarcan por las modalidades un método para tratar un mamífero infectado con el virus del VIH que comprende administrar al mamífero una cantidad antiviral efectiva el compuesto de la fórmula I, que incluye sales farmacéuticamente aceptables del mismo, y uno o más portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables . Otra modalidad es el método descrito arriba, que comprende administrar al mamífero una cantidad antiviral efectiva del compuesto de la fórmula I, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables del mismo, en combinación con una cantidad antiviral efectiva de un agente para el tratamiento del SIDA el grupo que consiste de un agente antiviral del SIDA; un agente anti-infeccioso; un inmunomodulador; y un inhibidor de la entrada del VIH. Otra modalidad son los compuestos intermediarios de la fórmula II, usando en mecanismo los compuestos I, en donde : X es C o N con la condición de que cuando X es N, R1 no existe; W es C o N con la condición de que cuando W es N, R2 no existe; V es C; R1 es hidrógeno, metoxi o halógeno; R2 es hidrógeno; R3 es metoxi o heteroarilo, cada uno de los cuales puede ser opcionalmente independientemente sustituido con un substituyente seleccionado de G; en donde heteroarilo es triazolilo, pirazolilo o oxadiazolilo; L y M son independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, Ci-Ce alquilo, fenilo, bencilo, trialquilsilo, -2, 2, 2-tricloroetoxi y 2-trimetilsililetoxi con la condición que no más de uno de L y M pueden ser hidrógeno; Y se selecciona del grupo que consiste de R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, son cada uno independientemente H o metilo con la condición de que no más de dos de R10-R17 son metilo; R18 se selecciona del grupo que consiste de C (O) -fenilo, C (O) -piridinilo, piridinilo, pirimidinilo, quinolilo, isoquinolilo, quinazolilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, ptalazinilo, azabenzofurilo, y azaindolilo, cada uno del cual puede opcionalmente independientemente sustituido de uno o dos miembros seleccionado del grupo que consiste de metilo, -amino, -NHMe, -NMe2, metoxi, hidroximetilo y halógeno; D se selecciona del grupo que consiste de ciano, S(0)2R24, halógeno, C(0)NR21R22, fenilo y heteroarilo; en donde el fenilo o heteroarilo es opcionalmente independientemente sustituido con uno a tres iguales o diferentes halógenos o de uno a tres iguales o diferentes substituyentes seleccionados de G; en donde heteroarilo se selecciona del grupo que consiste de piridinilo y oxadiazolilo; A se selecciona del grupo que consiste de fenilo, piridinílo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo en donde el fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo son opcionalmente independientemente sustituido con uno a tres iguales o diferentes halógenos o de uno a tres iguales o diferentes susbtituyentse seleccionados de G; G se selecciona del grupo que consiste de ( ?-6) alquilo, (C?_6) alquenilo, fenilo hidroxi, metoxi, halógeno, -NR23C (OJ(C?_6) alquilo, -NR24R25, -S (0) 2NR24R25, COOR26 y -C0NR24R25, en donde el (C!_6) alquilo es opcionalmente sustituido con hidroxi, dimetilamino, o uno a tres iguales o diferentes halógenos; R26 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y (C?_6) alquilo; R20, R21, R22, R23, R24, R25, son independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, (C?_ 6) alquilo y - (CH2) nNR27R28; y R27 y R28 son cada uno independientemente H o metilo; y n es 0-6.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 ilustra el AUC (Área bajo la Curva) contra la dosificación en los ensayos clínicos humanos para el compuesto IVa.

Las figuras 2A-2B ilustran el AUC para el compuesto IVa y los profármacos etiquetados bajo condiciones de ayuno y alimentación en estudios de humanos y perros. La figura 3 ilustra IVc del AUC oral en ratas contra el diagrama de la dosis. La figura 4 ilustra IVc Cmáx Oral en ratas contra el diagrama de la dosis. La figura 5 ilustra los perfiles del plasma de IVc en ratas después de la dosificación oral de le La figura 6 ilustra la comparación de IVa Cmáx y AUC en ratas machos administrados tanto con IVa como lab. La figura 7 ilustra la comparación de IVa Cmáx y el AUC en perros administrados tanto con IVa como lab. La figura 8 ilustra la hidrólisis de la etiqueta en soluciones ALP de placenta de humanos y al formación de IVa.

La figura 9 ilustra la concentración de plasma contra los perfiles del tiempo de lab y IVa siguiendo IV y la administración oral de lab en ratas a partir de los datos históricos de IVa en ratas. La figura 10 ilustra la concentración de plasma contra los perfiles del tiempo de lab y IVa siguiendo IV y la administración oral de lab en perros a partir de los datos históricos de IVa en perros. La figura 11 ilustra la concentración de plasma contra los perfiles de tiempo de lab y IVa siguiendo IV y la administración oral de lab en monos a partir de los datos históricos de IVa en monos. La figura 12 ilustra la comparación de IVb Cmáx y la AUC en ratas machos administrados tanto con IVb como IBB. La figura 13 ilustra la comparación de IVb Cmáx y AUC en perros administrados tanto con IVb o Ibb. La figura 14 ilustra la hidrólisis de Lbb en soluciones ALP de placenta humana y la formación de IVb. La figura 15 ilustra la concentración de plasma contra los perfiles del tiempo de Ibb y de IVb siguiendo IV y la administración oral de Ibb en ratas y los datos históricos de Ivb en las ratas. La figura 16 ilustra la concentración de plasma contra los perfiles del tiempo de Ibb y IVb siguiendo IV y la administración oral de Ibb en los perros y los datos históricos de IVb en los perros. La figura 17 ilustra la concentración de plasma contra los perfiles del tiempo de Ibb y IVb siguiendo IV y la administración oral de Ibb en el mono y los datos históricos de IVb en los monos. La figura 18 ilustra la comparación de IVc Cmáx y la AUC en ratas machos administrados tanto con IVc como Icb. La figura 19 ilustra la comparación de IVc Cmáx y la AUC en perros administrados tanto con IVc como Icb. La figura 20 ilustra la hidrólisis de Icb en soluciones ALP de placenta humana y la formación de IVc. La figura 21 ilustra la concentración de plasma contra los perfiles del tiempo de Icb y IVc siguiendo IV y la administración oral de Icb en ratas y los datos históricos de IVc en las ratas. La figura 22 ilustra la concentración del plasma contra los perfiles del tiempo de Icb y IVc siguiendo IV y la administración oral de Icb en los perros y los datos históricos de IVc en los perros. La figura 23 ilustra la concentración del plasma contra los perfiles del tiempo de Icb y IVc siguiendo IV y la administración oral de Icb en el mono y los datos históricos de IVc en el mono. Descripción Detallada de la Invención Ya que los compuestos de la presente invención pueden presentar centros asimétricos, y por lo tanto pueden presentarse como mezclas de diastereómeros y enantiómeros, la presente invención incluye los diastereoisómericos individuales y formas enantioméricas de los compuestos de la fórmula I en adición a las mezclas de los mismos.

Definiciones El término "alquilo C?-ß" como se usa en la presente y en las reivindicaciones (salvo que se especifique de otra manera) significa grupos alquilo de cadena recta o ramificada tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, t-butilo, amilo, hexilo y similares. "Halógeno" se refiere a cloro, bromo, yodo o flúor. Un grupo "arilo" se refiere a todos los grupos policíclicos de anillo fusionado o monocíclico de carbono (esto es, anillos que portan pares adyacentes de átomos de carbono) que tienen un sistema de electrones "pi" completamente conjugado. Los ejemplos, sin limitación, de grupos arilo son fenilo, naftalenilo y antracenilo. El grupo arilo puede estar substituido o no substituido. Cuando se substituyen, los grupos substituyentes son preferiblemente uno o más seleccionados de alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, heteroalicicloxi, tiohidroxi, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheteroalicicloxi, ciano, halógeno, nitro, carbonilo, O-carbamilo, N-carbamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfinilo, sulfonilo, sulfonamido, trihalometilo, ureido, amino y -NRxRy, en donde Rx y Ry se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, carbonilo, C-carboxi, sulfonilo, trihalometilo, y, combinados, un anillo heteroalicíclico de cinco o seis miembros. Como se usa en la presente, un grupo "heteroarilo" se refiere a un grupo anillo monocíclico o fusionado (esto es, anillos que portan un par de átomos adyacentes) que tienen en los anillos uno o más átomos seleccionados del grupo que consiste de nitrógeno, oxígeno y azufre y, además, tienen un sistema de electrón "pi" completamente conjugado. Salvo que se indique de otra manera, el grupo heteroarilo puede enlazarse ya sea al átomo de carbono o nitrógeno dentro del grupo heteroarilo. Se notará que el término heteroarilo se pretende que abarque un N-óxido del heteroarilo precursor si tal N-óxido es químicamente posible como se conoce en el arte. Los ejemplos, sin limitación, de grupos heteroarilo son furilo, tienilo, benzotienilo, tiazolilo, imidazolilo, oxazolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, benzotiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, piranilo, tetrahidropiranilo, pirazolilo, piridilo, pirimidinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, purinilo, carbazolilo, benzoxazolilo, benzimidazolilo, indolilo, isoindolilo, pirazinilo, diazinilo, pirazina, triaziniltriazina, tetrazinilo, y tetrazolilo. Cuando se substituyen, los grupos substituidos son preferiblemente uno o más seleccionado de alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, heteroalicicloxi, tioalcoxi, tiohidroxi, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheteroalicicloxi, ciano, halógeno, nitro, carbonilo, O-carbamilo, N-carbamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, 0 carboxi, sulfinilo, sulfonilo, sulfonamido, trihalometilo, ureido, amino, y -NRxRy, en donde Rx y Ry son como se define anteriormente. Como se usa en la presente, un grupo "heteroalicíclico" se refiere a un grupo de anillo monocíclico o fusionado que tiene en los anillos uno o más átomos seleccionados del grupo que consiste de nitrógeno, oxígeno y azufre. Los anillos también pueden tener uno o más enlaces dobles. Sin embargo, los anillos no tienen un sistema de electrón "pi" completamente conjugado. Los ejemplos, sin limitación, de grupos heteroalicíclico son azetidinilo, piperidilo, piperazinilo, imidazolinilo, tiazolidinilo, 3-pirrolidin-l-ilo, morfolinilo, tiomorfolinilo y tetrahidropiranilo. Cuando se substituyen, los grupos substituidos preferiblemente es uno o más seleccionado de alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, heteroalicicloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheteroalicicloxi, ciano, halógeno, nitro, carbonilo, tiocarbonilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C~amido, C-tioamido, N-amido, C-carboxi, 0-carboxi, sulfinilo, sulfonilo, sulfonamido, trihalometansulfonamido, trihalometansulfonilo, sililo, guanilo, guanidino, ureido, fosfonilo, amino y -NRxRy, en donde Rx y Ry son como se define anteriormente . Un grupo "alquilo" se refiere a un hidrocarburo alifático saturado que incluye grupos de cadena recta o ramificada. Preferiblemente, el grupo alquilo tiene 1 hasta 20 átomos de carbono (cada vez que un rango numérico; por ejemplo, "1-20", se establece en la presente, significa que el grupo, en este caso el grupo alquilo puede contener 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc. hasta e incluyendo 20 átomos de carbono) . Más preferiblemente, es un alquilo de tamaño medio que tiene 1 a 10 átomos de carbono. Más preferiblemente, es un alquilo inferior que tiene 1 a 4 átomos de carbono. El grupo alquilo puede estar substituido o no substituido. Cuando se substituye, los grupos substituyentes son preferiblemente uno o más individualmente seleccionados de trihaloalquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, heteroalicicloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheteroalicicloxi, ciano, halo, nitro, carbonilo, tiocarbonilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, C-tioamido, N-amido, C-carboxi, 0-carboxi, sulfinilo, sulfonilo, sulfonamido, trihalometansulfonamido, trihalometansulfonilo, y combinados, un anillo heteroalicíclico de cinco o seis miembros. Un grupo "cicloalquilo" se refiere a todos los grupos de anillo monocíclico o fusionado de carbono (esto es, anillos que portan un par adyacente de átomos de carbono) en donde uno o más anillos no tienen un sistema de electrón pi completamente conjugado. Los ejemplos, sin limitación, de grupos cicloalquilo son . ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexadieno, cicloheptano, cicloheptatrieno y adamantano. Un grupo cicloalquilo puede estar substituido o no substituido. Cuando se substituye, los grupos substituyentes preferiblemente son uno o más individualmente seleccionados de alquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, heteroalicicloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheteroalicicloxi, ciano, halo, nitro, carbonilo, tiocarbonilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, C-tioamido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfinilo, sulfonilo, sulfonamido, trihalo- metansulfonamido, trihalometansulfonilo, sililo, guanilo, guanidino, ureido, fosfonilo, amino y -NRxRy con Rx y Ry como se define anteriormente . Un grupo "alquenilo" se refiere a un grupo alquilo, como se define en la presente, que consiste de al menos dos átomos de carbono y al menos un enlace doble carbono-carbono. Un grupo "alquinilo" se refiere a un grupo alquilo, como se define en la presente, que consiste de al menos dos átomos de carbono y al menos un enlace triple carbono-carbono. Un grupo "hidroxi" se refiere a un grupo -OH. Un grupo "alcoxi" se refiere a tanto un grupo -0-alquilo y -O-cicloalquilo como se define en la presente. Un grupo "ariloxi" se refiere a tanto un grupo -O-arilo y -O-heteroarilo, como se define en la presente. Un grupo "heteroariloxi" se refiere a un grupo heteroaril-O- con heteroarilo como se define en la presente.

Un grupo "heteroalicicloxi" se refiere a un grupo heteroalicíclico-O- con heteroalicíclico como se define en la presente. Un grupo "tiohidroxi" se refiere a un grupo -SH. Un grupo "tioalcoxi" se refiere a un grupo S-alquilo y -S-cicloalquilo, como se define en la presente. Un grupo "tioariloxi" se refiere a un grupo -S-arilo y -S-heteroarilo, como se define en la presente. Un grupo "tioheteroariloxi" se refiere a un grupo heteroaril-S- con heteroarilo como se define en la presente.

Un grupo "tioheteroalicicloxi" se refiere a un grupo heteroalicíclico-S- con heteroalicíclico como se define en la presente . Un grupo "carbonilo" se refiere a un grupo -C(=0)-R", donde R" se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo (enlazado a través de un anillo de carbono) y heteroalicíclico (enlazado a través de un anillo de carbono) , como cada uno se define en la presente. Un grupo "aldehido" se refiere a un grupo carbonilo donde R" es hidrógeno. Un grupo "tiocarbonilo" se refiere a un grupo -C(=S)-R", con R" como se define en la presente. Un grupo "ceto" se refiere a un grupo -CC(=0)C-, en donde el carbono en cualesquiera o ambos lados del C=0 puede ser alquilo, cicloalquilo, arilo o un carbono de un grupo heteroarilo o heteroaliacíclico. Un grupo "trihalometancarbonilo" se refiere a un grupo Z3CC(=0)~ con el Z siendo un halógeno. Un grupo "C-carboxi" se refiere a grupos -C(=0)0-R", con R" como se define en la presente. Un grupo "O-carboxi" se refiere a un grupo R"C(-0)0-, con R" como se define en la presente. Un grupo "ácido carboxílico" se refiere a un grupo C-carboxi en el cual R" es hidrógeno. Un grupo "trihalometilo" se refiere a un grupo -CZ3, en donde Z es un grupo halógeno como se define en la presente. Un grupo "trihalometansulfonilo" se refiere a grupos Z3CS(=0)2- con Z como se define arriba. Un grupo "trihalometansulfonamido" se refiere a un grupo Z3CS (=0) 2NRX- con Z y Rx como se define en la presente. Un grupo "sulfinilo" se refiere a un grupo -S(=0)-R", con R" como se define en la presente y, además, sólo como un enlace; esto es, -S(0)-. Un grupo "sulfonilo" se refiere a un grupo -S(=0)2R" con R" como se define en la presente y, además sólo como un enlace; esto es, -S(0)2-. Un grupo "S-sulfonamido" se refiere a un -S (=0) 2NRXRY, con Rx y Ry como se define en la presente. Un grupo "N-Sulfonamido" se refiere a un grupo R"S(=0)2NRx- con Rx como se define en la presente. Un grupo "O-carbamilo" se refiere a -0C(=0)NRxRy como se define en la presente. Un grupo "N-carbamilo" se refiere a un grupo Rx0C(=0)NRy, con Rx y Ry como se define en la presente. Un grupo "O-tiocarbamilo" se refiere a un grupo -0C(=S)NRxRy con Rx y Ry como se define en la presente. Un grupo "N-tiocarbamilo" se refiere a un grupo Rx0C(=S)NRy- con Rx y Ry como se define en la presente. Un grupo "amino" se refiere a un grupo -NH2. Un grupo "C-amido" se refiere a un grupo -C(=0)NRxRy con Rx y Ry como se define en la presente. Un grupo "C-tioamido" se refiere a un grupo -C(=S)NRxRy, con Rx y Ry como se define en la presente. Un grupo "N-amido" se refiere a un grupo RxC(=0)NRy-, con Rx y Ry como se define en la presente. Un grupo "ureido" se refiere a un grupo -NRXC (=0) NRyRy2 con RX y Ry como se define en la presente y Ry2 define el mismo como Rx y Ry. Un grupo "tioureido" se refiere a un grupo -NRxC(=S)NRyRy2 con Rx y Ry como se defiene en la presente y Ry2 se define igual como Rx y Ry. Un grupo "guanidino" se refiere a un grupo -RxNC(=N)NRyRy2, con Rx, Ry y Ry2 como se define en la presente. Un grupo "guanilo" se refiere a un grupo RxRyNC(=N)~, con Rx y Ry como se define en la presente. Un grupo "ciano" se refiere a un grupo -CN. Un grupo "sililo" se refiere a -Si(R")3, con R" como se define en la presente. Un grupo "fosfonilo" se refiere a P(=0) (ORx)2 con Rx como se define en la presente. Un grupo "hidrazino" se refiere a un grupo -NRxNRyRy2 con Rx, Ry y Ry2 como se define en la presente. Cualesquiera de dos grupos R adyacentes pueden combinarse para formar un anillo arilo, cicloalquilo, heteroarilo o heterociclico adicional fusionado al anillo que porta inicialmente aquellos grupos R. Se conoce en el arte que los átomos de nitrógeno en los sistemas de heteroarilo pueden "participar en el enlace doble del anillo heteroarilo", y se refiere a la forma de enlaces dobles en las dos estructuras tautoméricas que comprenden grupos heteroarilo de anillo de cinco miembros. Esto dictamina si los nitrógenos pueden substituirse como se entienden por los químicos en la técnica. La descripción y reivindicaciones de la presente invención se basan en el principio general conocido del enlace químico. Se entenderá que las reivindicaciones no abarcan estructuras conocidas por ser inestables o no capaces de existir con base en la literatura. Las sales fisiológicamente aceptables y profármacos de los compuestos descritos en la presente, están dentro del alcance de esta invención. El término "sal farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente y en las reivindicaciones, se pretende que incluya sales de adición base no tóxicas. El término "sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en la presente, también se pretende que incluya sales de grupos ácidos, tal como un carboxilato, o fosfato o monoéster ed fosfato con contraiones tales como amonio, sales de metal alcalino, particularmente sodio o potasio, sales de metal alcalinotérreo, particularmente calcio o magnesio, sales de metales de transición tal como zinc y sales con bases orgánicas apropiadas, tales como alquilaminas inferiores (metilamina, etilamina, ciclohexilamina, y similares) o con alquilaminas inferiores substituidas (por ejemplo, alquilamina substituidas con hidroxilo tales como dietanolamina, trietanolamina o monotrometamina (llamadas también TRIS o 2-amino-2- (hidroximetil) ropano-1, 3-diol) tris (hidroximetil-aminometa-no) , lisina, arginina, histidina, N-metilglucamina, o con bases tales como piperidina o morfolina. Se entenderá que tanto las sales farmacéuticamente aceptables, cuando se aislan en forma sólida o cristalina, también incluyen hidratos o moléculas de agua atrapadas dentro de la substancia del compuesto I resultante. Las posibilidades estequiométricas son bien conocidas por aquellas en la técnica. Las discusiones de sales y de sales farmacéuticamente aceptables y listas de posibles sales están contenidas en las siguientes referencias: Preparation of water-soluble compounds through salt formation . Stahl, P. Heinrich. Cosmas Consult, Freiburg im Breisgau, Germany. Editor(s); Wermuth, Camille Georges. Practice of Medicinal Chemistry (2nd Edition) (2003) , 601--615. Publisher: Elsevier, London, UK CODEN: 69EOEZ. Handbook of pharmaceutical salts: properties, selection, and use by Stahl, P. Heinrich, Wermuth, Camille G.; Inernational Unión of Puré and Applied Chemistry. Weinheim; New York: VHCA; Wiley-VCH, 2002. En otro aspecto de la invención, se describen los compuestos II intermediarios éster de fosfato novedosos.

En el caso de los esteres de fosfato, la posibilidad existente de mono o bis y ambos se cubre por esta invención.

En el método de la presente invención, el término "cantidad efectiva antiviral" significa la cantidad total de cada componente activo del método que es suficiente para mostrar un significativo beneficio del paciente, esto es, sanar las condiciones agudas caracterizadas por la inhibición de la infección del VIH. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, el término se refiere al ingrediente solamente. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que resultan en un efecto terapéutico, si se administran en combinación, en serie o simultáneamente. Los términos "tratar, tratado, tratamientos" como se usa en la presente y en las reivindicaciones, significa prevenir o aliviar enfermedades asociadas con la infección del VIH. La presente invención también se dirige a combinaciones de los compuestos con uno o más agentes útiles en el tratamiento del SIDA. Por ejemplo, los compuestos de esta invención pueden administrarse efectivamente, a periodos de pre-exposición y/o post-exposición, en combinación con cantidades efectivas de antivirales de SIDA, inmunomoduladores, antiinfecciones o vacunas, tales como aquellas en la siguiente tabla.

ANTGVIRALES Nombre del Fármaco Fabricante Indicación 097 Hoechst/Bayer infección por VIH, SIDA, ARC (inhibidor de la transcriptasa inversa (RT) no de nucleósido) Amprenavir Glaxo Wellcome Infección por VIH SIDA, 141 W94 ARC (inhibidor de la GW 141 proteasa) Abacavir (1592U89) Glaxo Wellcome Infección por VIH, GW 1592 SIDA, ARC (inhibidor de RT) Nombre del Fármaco Fabricante Indicación Acemannan Carrington Labs ARC (Irving, TX) Acylo ir Burroughs Wellcome Infección por VIH, SIDA, ARC, en combinación con AZT AD-439 Tanox Biosystems Infección por VIH, SIDA, ARC AD-519 Tanox Biosystems Infección por VIH, SIDA, ARC Adefovir dipivoxil Gilead Sciences Infección por VIH, Al-721 Ethigen ARC, PGL, VIH (Los Angeles, CA) positivo, SIDA Alfa inferieron Glaxo Wellcome Sarcoma de Kaposi, VIH en combinación c/Retrovir Ansamicin Adria Laboratories ARC LM 427 (Dublin, OH) Erbamont (Stamford, CT) Anticuerpo que Advance Biotherapy SIDA, ARC neutraliza el pH Concepts Alfa inferieron (Rockville, MD) inestable aberrante Nombre del Fármaco Fabricante Indicación AR177 Aronex Pharm Infección por VIH, SIDA, ARC Beta-fluoro-ddA Nat'l Cáncer Enfermedades asociadas Institute con el SIDA BMS-232623 Bristol-Myers Infección por VIH, (CGP-73547) Sguibb/Novartis SIDA, ARC (inhibidor de la proteasa) BMS-234475 Bristol-Myers Infección por VIH, (CGP-61755) Squibb/Novartis SIDA, ARC (inhibidor de la proteasa) CI-1012 Warner-Lambert Infección por VIH-1 Cidofovir Gílead Science CMV retinitis, herpes, papilomavirus Sulfato de curdlan AJÍ Pharma USA Infección por VIH Citomegalovirus Medlmmune Retinitis CMV inmuno globina Cytovene Syntex Amenaza a la visión Ganciclovir CMV Retinitis CMV periférica Nombre del Fármaco Fabricante Indicación Delaviridina Pharmacia-Upj ohn Infección por VIH, SIDA, ARC (inhibidor RT) Sulfato de dextrano Ueno Fine Chem. SIDA, ARC, VIH Ind. Ltd (Osaka, asintomático Japón) positivo ddC Hoffman-La Roche Infección por VIH, Didesoxicitidina SIDA, ARC ddl Bristol-Myers Infección por VIH, Didesoxiinosina Squibb SIDA, ARC; combinación con AZT/d4T DMP-450 AVID Infección por VIH, (Camden, NJ) SIDA, ARC (inhibidor de la proteasa) Efavirenz DuPont Merck Infección por VIH, (DMP 266) SIDA, ARC (-) 6-cloro-4-(S)- (inhibidor RT no ciclopropiletinil- de nucleósido) 4 (S) -trifluoro-metil-1 , 4 , -dihidro-2H-3, 1-benzoxazin-2-ona, STOCRINE Nombre del Fármaco Fabricante Indicación EL10 Elan Corp, PLC Infección por VIH (Gainesville, GA) Famciclovir Smith Kline Herpes zoster, Herpes simplex FTC Emory University Infección por VIH, SIDA, ARC (inhibidor de la transcriptasa inversa) GS 840 Gilead Infección por VIH, SIDA, ARC (inhibidor de la transcriptasa inversa) HBY097 Hoechst Marión Infección por VIH, Roussel SIDA, ARC (inhibidor de la transcriptasa inversa no de nucleósido) Hypericin VIMRx Pharm. Infección por VIH, SIDA, ARC Nombre del Fármaco Fabricante Indicación Beta Inferieron Tritón Biosciences SIDA, sarcoma de Humano Recombinante (Al eda, CA) Kaposi, ARC Inferieron alfa-n3 Inferieron Sciences ARC, SIDA Indinavir Merck Iníección por VIH, SIDA, ARC, VIH positivo asintomático, también en combinación con AZT/ddI/ddC ISIS 2922 ISIS Pharmaceuticals Retinitis CMV KNI-272 Nati Cáncer Eníermedades Institute asociadas con VIH Lamivudina, 3TC Glaxo Wellcome Iníección por VIH, SIDA, ARC (inhibidor de la transcriptasa inversa) ; también con AZT Lobucavir Bristol-Myers Squibb Iníección CMV Nombre del Fármaco Fabricante Indicación Nelfinavir Agouron Infección por VIH, Pharmaceuticals SIDA, ARC (inhibidor de la proteasa) Nevirapina Boeheringer Infección VIH, SIDA, Ingleheim ARC (inhibidor RT) Novapren Novaferon Labs, Inhibidor del VIH Inc. (Akron, OH) Secuencia del Peninsula Labs SIDA octapéptido del (Belmont, CA) péptido T Fosfonofor iato de Astra Pharm. Retinitis CMV, trisodio Products, Inc. infección por VIH, otras infecciones de CMV PNU-140690 Pharmacia-Upj ohn Iniección por VIH, SIDA, ARC (inhibidor de la proteasa) Probucol Vyrex Iníección por VIH, SIDA RBC-CD4 Sheííield Med Tech Infección por VIH, (Houston, TX) SIDA, ARC Nombre del Fármaco Fabricante Indicación Ritonavir Abbott Infección por VIH, SIDA, ARC (inhibidor de la proteasa) Saquinavir Hoffman-La Roche Infección por VIH, SIDA, ARC (inhibidor de la proteasa) Estavudina, d4T Bristol-Myers Infección por VIH, dideshidrodesoxi Squibb SIDA, ARC timidina Valaciclovir Glaxo Wellcome Infecciones HSV y CMV genital Virazol Viratek/ICN VIH positivo Ribavirin (Costa Mesa, CA) asintomático, LAS, ARC VX-478 Vértex Infección por VIH, SIDA, ARC Zalcitabina Hoffman-La Roche Infección por VIH, SIDA, ARC, con AZT Nombre del Fármaco Fabricante Indicación Zidovudina; AZT Glaxo Wellcome Infección por VIH, SIDA, ARC, sarcoma de Kaposi, en combinación con otras terapias Sal de fumarato Gilead Infección por VIH, Tenofovir disoproxil SIDA, (inhibidor (Viread®) transcriptasa reversa) Emtriva® Gilead Infección por VIH, (E tricitabina) SIDA, (inhibidor transcriptasa reversa) Combivirs GSK Infección por VIH, SIDA, (inhibidor transcriptasa reversa) Succinato abacavir (o GSK Infección por VIH, Ziagen®) SIDA, (inhibidor transcriptasa reversa) Reyataz® Infección por VIH, (o atazanavir) SIDA, (inhibidor transcriptasa reversa) Fuzeon* Roche/Trimeris Infección por VIH, (o T-20] SIDA, (inhibidor transcriptasa reversa) Lexiva® (o calcio GSK/Vertex Infección por VIH, Fosamprenavir) SIDA, (inhibidor transcriptasa reversa) Nombre del Fármaco Fabricante Indicación AS-101 Wyeth-Ayerst SIDA Bropirimina Pharmacia-Up j ohn SIDA avanzado, Acemannan Carrington Labs, SIDA, ARC Inc. (Irving, TX) CL246,738 American Cyanamid SIDA, sarcoma de Lederle Labs Kaposi FP-21399 Fuki Immuno Pharm Bloqueo de fusión del VIH con células CD4+ Gamma Inferieron Genentech ARC, en combinación con w/TNF (factor de necrosis de tumor) Granulocito Genetics Institute SIDA Factor estimulante Sandoz de la colonia de macrófagos Nombre del Fármaco Fabricante Indicación Granulocito Hoechst-Roussel SIDA Factor estimulante de Immunex la colonia de macrófagos Granulocito Schering-Plough SIDA, combinación Factor estimulante de con w/AZT la colonia de macrófago Inmunoestimulante de Rorer VIH seropositivo la partícula de núcleo de VIH IL-2 Cetus SIDA, en combinación Interleucina-2 con AZT IL-2 Hoffman-La Roche SIDA, ARC, VIH, en Interleucina-2 Immunex combinación con AZT IL-2 Chiron SIDA, incremento en Interleucina-2 cuentas de células (aldeslucina) CD4 Inmuno globulina Cutter SIDA pediátrico, en intravenosa (humana) Biological combinación con AZT (Berkeley, CA) IMREG-1 Imreg SIDA, sarcoma de (New Orleans, Kaposi, ARC. PGL LA) Nombre del Fármaco Fabricante Indicación IMREG-2 Imreg SIDA, sarcoma de (New Orleans, LA) Kaposi, ARC. PGL Inmutiol dietil ditio Merieux Institute SIDA, ARC carbamato Alfa-2 Schering Plough Sarcoma de Kaposi Inferieron con AZT, SIDA Metionina-encefali a TNI Pharmaceutical SIDA, ARC (Chicago, IL) MTP-PE Ciba-Geigy Corp. Sarcoma de Kaposi Muramil-tripéptido Amgen SIDA, en combinación Factor estimulante de con AZT la colonia de granulocitos Remune Immune Response Inmunoterapéutico Corp. rCD4 Genentech SIDA, ARC CD4 humano soluble recombinante Híbridos rCD4-IgG SIDA, ARC CD4 humano soluble Biogen SIDA, ARC recombinante Inferieron Hoffman-La Roche Sarcoma de Kaposi, alfa 2a SIDA, ARC, en combinación con AZT Nombre del Fármaco Fabricante Indicación SK&F106528 T4 Smith Kline Infección por VIH soluble Timopentina Immunobiology Infección por VIH Research Institute (Annandale, NJ) Factor de Necrosis Genentech ARC, en combinación de Tumor; TNF con gamma inferieron ANTI-INFECCIOSOS Nombre del Fármaco Fabricante Indicación Clindamicina con Pharmacia-Upjohn PCP Primaquina Fluconazol Pfizer Meningitis criptococal, candidiasis Pastille, Pastille Squibb Corp. Prevención de Nystatin candidiasis oral Ornidil Merrell Dow PCP eflornitina Nombre del Fármaco Fabricante Indicación Pentamidina LyphoMed (Rosemont, Tratamiento del PCP Isetionato (IM y IV) IL Trimetoprim Antibacterial Trimetoprim/sulfa Antibacterial Piritrexim Burroughs Wellcome Tratamiento del PCP Pentamidina Fisons Corporation Profilaxis de PCP Isetionato para Inhalación Espiramicina Rhone-Poulenc Criptosporidial diarrea Intraconazol-R51211 Janssen-Pharm. Histoplasmosis ; meningitis criptococal Tri etrexato Warner-Lambert PCP Daunorrubicina NeXstar, Sequus Sarcoma de Kaposi Eritropoyetina humana Ortho Pharm. Corp. Anemia severa recombinante asociada con terapia de AZT Hormona de Serono Desgaste crecimiento humana relacionado con el recombinante SIDA, caquexia Nombre del Fármaco Fabricante Indicación Acetato de Megestrol Bristol-Myers Squibb Tratamiento de anorexia asociada con SIDA Testosterona Alza, Smith Kline Desgaste relacionado con el SIDA Nutrición Enteral Norwich Eaton Diarrea y mala Total Pharmaceuticals absorción relacionada con SIDA Adicionalmente, los compuestos de la invención en la presente pueden usarse en combinación con otra clase de agentes para el tratamiento del SIDA, que se llaman inhibidores de la entrada del VIH. Los Ejemplos de tales inhibidores de la entrada del VIH se discuten en DRUGS OF THE FUTURE 1999, 24(12), pp. 1355-1362; CELL, Vol. 9, pp. 243-246, Oct. 29, 1999; y DRUG DISCOVERY TODAY, Vol. 5, No. 5, Mayo 2000, pp. 183-194 y Inhibitors of the entry of HIV into host cells . Meanwell, Nicholas A.; Kadow, John F. Curret Opinión in Drug Discovery & Development (2003), 6(4), 451-461. Específicamente los compuestos pueden utilizarse en combinación con otros inhibidores del enlace, inhibidores déla fusión, y antagonistas del receptor de quimiocina ayudando al ya sea al contra receptor CCR5 o CXCR4. Se entenderá que el alcance de las combinaciones de los compuestos de esta invención con antivirales del SIDA, inmunomoduladores, anti-infecciosos, inhibidores de la entrada del VIH o vacunas, no se limita a la lista en la Tabla anterior, pero incluye en principio cualquier combinación con cualesquiera de las composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento del SIDA. Las combinaciones preferidas son tratamientos simultáneos o alternativos de los cuales el compuesto de la presente invención y un inhibidor de la proteasa del VIH y/o un inhibidor no de nucleósido de la transcriptasa inversa del VIH. Un cuarto componente opcional en la combinación es un inhibidor de nucleósido de la transcriptasa inversa del VIH, tal como AZT, <3TC, ddC o ddl . Un inhibidor preferido de la proteasa del VIH es Reyataz® (ingrediente activo Atazanavir) . Típicamente uan dosis de 300 a 600 mg se administran una vez al día. Esto se puede co-administrar con una dosis baja de Ritonavir (50 a 500 mgs) . Otro inhibidor preferido de la proteasa del VIH es Kaletra®. Un inhibidor preferido de la proteasa del VIH es indinavir, que es la sal de sulfato de N- (2 (R) -hidroxi-1- (S) -indanil) -2 (R) -fenilometil-4- (S) -hidroxi-5- (1- (4- (3-piridil-metil) -2 (S) -N' - (t-butilcarboxamido) -piperazinil) ) -pentanamida etanolato, y se sintetiza de conformidad con la E.U.A. 5,413,999. El indinavir generalmente se administra a una dosis de 800 mg tres veces al día. Otros inhibidores de proteasa preferidos son nelfinavir y ritonavir. Otro inhibidor preferido de la proteasa del VIH es saquinavir que se administra en una dosis de 600 o 1200 mg tid. Los inhibidores no de nucleósido preferidos de la transcriptasa inversa del VIH incluyen efavirenz. La preparación de ddC, ddl y AZT también se describe en EPO 0,484,071. Estas combinaciones pueden tener efectos inesperados en la limitación del espectro y grado de infección del VIH. Las combinaciones preferidas incluyen aquellas con las siguientes (1) indinavir con efavirenz, y opcionalmente, AZT y/o 3TC y/o ddl y/o ddC; (2) indinavir, y cualesquiera de AZT y/o ddl y/o ddC y/o 3TC, en particular, indinavir y AZT y 3TC; (3) estavudina y 3TC y/o zidovudina; (4) zidovudina y lamivudina y 141W94 y 1592U89; (5) zidovudina y lamivudina. En tales combinaciones, los compuestos de la presente invención y otros agentes activos pueden administrarse separadamente o en conjunto. Además, la administración de un elemento puede ser antes de, junto con, o posterior a la administración de otro(s) agente (s) . Jñbreviaturas Las siguientes abreviaturas, la mayoría de las cuales son abreviaturas convencionales bien conocidas por aquellos expertos en la técnica, se usan a través de la descripción de la invención y los ejemplos. Algunas de estas abreviaturas usadas son como siguen: h hora(s) ta temperatura ambiente mol = mol (es) mmol = milimol (es) g gramo (s) mg = miligramo (s) ml = mililitro (s) TFA = ácido trifluoroacético DCE = 1,2-Dicloroetano CH2C12= Diclorometano TPAP = tetrapropilamonio perrutenato THF = Tetrahidrofurano DEPBT= 3- (Dietoxifosforiloxi) -1, 2, 3-benzotriazin-4 (3H) -ona DMAP = 4-dimetilaminopiridina P-EDC= polímero soportado en 1- (3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida EDC = 1- (3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida DMF = N,N-dimetilformamida Base Hunig=N,N-Diisopropiletilamina mCPBA = ácido meta-cloroperbenzoico azaindol = iH-Pirrolo-piridina 4-azaindol= lH-pirrolo [3, 2-b]piridina 5-azaindol= 1H-Pirrólo [3, 2-c] piridina 6-azaindol= IH-pirrolo[2, 3-c]piridina 7-azaindol= 1H-Pirrólo [2, 3-b]piridina , 6-diazaindol= 5H-Pirrolo [3, 2-d]pirimidina 5, 6-diazaindol= ÍH-Pirrolo [2, 3-d]piridazina 5, 7-diazaindol= 7H-Pirrólo [2, 3-d]pirimidina PMB = 4-Metoxibencilo DDQ = 2, 3-Dicloro-5, 6-diciano-l, 4-benzoquinona OTf = Trifluorometansulfonoxi NMM = 4-Metilmorfolina PIP-COPh= 1-Benzoilpiperazina NaHMDS= hexametildisilazida de sodio EDAC = 1- (3-Dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida TMS = Trimetilsililo DCM = Diclorometano DCE = Dicloroetano MeOH = Metanol THF = Tetrahidrofurano EtOAc= Acetato de etilo LDA = Diisopropilamida de litio TMP-Li= 2,2,6, 6-tetrametilpiperidinil litio DME = Dimetoxietano DIBALH= hidruro de diisobutilaluminio HOBT = 1-hidroxibenzotriazol CBZ = Benciloxicarbonilo PCC = clorocromato de piridinio TRIS = Tro etamina o 2-amino-2- (hidroximetil)propano- 1/3- diol Química La presente invención comprende compuestos de la Fórmula I, sus formulaciones farmacéuticas, y su uso en pacientes que padecen de, o son susceptibles a, una infección por VIH. El esquema A detalla una introducción del proceso para preparar los profármacos I de la invención a partir de moléculas precursoras IV.

Esquema de Reacción A Compuestos de la reivindicación 1 Es = hidrógeno, o como se define para forma una sal mono o bis farmacéuticamente aceptable Esquema de Reacción B 1) Aislación del cido libre Compuestos de la reivindicación 1 E ss hidrógeno, o como se define para forma una sal mono o bis farmacéuticamente aceptable Para trabajar en el método como se muestra en el esquema de reacción A, el compuesto precursor antiviral de interés IV, se convierte al intermediario de fosfato II por una 0-alquilación con un intermediario de cloruro III en presencia de una base adecuada tal como hidruro de potasio hidruro de sodio, amida de sodio, t-butóxido de sodio, amida de bis trimetilsil sodio, amida de bis trimetil silil potasio o combinaciones de los mismos tal como hidruro de sodio más amida de bistrimetil sodio. La preparación del reactivo III la metodología para el uso en la preparación de los profármacos por la alquilación de grupos hidroxi se ha descrito en Y. Ueda et . al. patente de E.U.A 6,362,172B2 que se incorpora como referencia en su totalidad. Las condiciones de alquilación, grupos protectores eliminación del grupo protector y condiciones para la formación de sal aplican en general a esta solicitud a pesar del hecho de que se alquila un azaindol en el anillo de indol más que un grupo hidroxi. En la solicitud actual, a partir de 1.1 a 5.0 equivalentes de la base se pueden utilizar con entre 2 y 4 equivalentes que se prefieren. Desde 1.1 a 12 equivalentes del reactivo III se pueden usar con 5 a 10 preferidos dependiendo del substrato El reactivo se puede agregar en una porción o incrementar en varias porciones durante el tiempo. Una fuente de ion yoduro se agrega usualmente a la reacción para suministrar rendimientos crecientes. Se prefiere actualmente el yodo elemental como la fuente de yoduro. Se agregan usualmente 0.1 a 1.5 equivalentes de yodo por NH de azaindol /indol que se alquila con 1.0 a 1.2 equivalentes del yodo que se prefieren ya que los rendimientos son mayores. Las fuentes alternas de yoduro incluyen por ejemplo, yoduro de sodio, yoduro de litio, yoduro de cesio, yoduro de cobre, yoduro de tetrabutil amonio. La función del yodo presumiblemente genera el reactivo correspondiente de yodo metilo Illa in situ a partir del reactivo de cloro metilo III. Los reactivos de yodo o cromo que corresponden a III pueden probablemente usarse de manera directa y la reacción en lugar del cloruro III. La reacción de alquilación de la etapa A se efectúa en un solvente orgánico inerte tal como tetrahidrofurano a una temperatura desde alrededor de 0°C a 50 °C, más preferiblemente entre 20° y 40 °C. Otros solventes orgánicos anhidros tales como metiltetrahidrofurano, éter de etil t-butilo, dioxano, dimetil éter de etilen glicol, dimetil acetamida, o N,N-dimetilformamida también pueden encontrar utilidad. El intermediario del éster II luego se somete a una etapa de desprotección convencional para retirar los grupos protectores Pr. Los reactivos usados en tal etapa dependerán del grupo protector utilizado pero serán bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. El grupo protector más preferido es el grupo t-butilo que se puede eliminar con ácido trifluoroacetico ácido clorhídrico o ácido fórmico en un solvente orgánico inerte adecuado. El solvente inerte puede ser diclorometano o posiblemente por ejemplo, dicloroetano tolueno o trifluorometil benceno. En cloruro de metileno, la desprotección con ácido trifluoro acético puede efectuarse usando de 1 a 15 equivalentes de ácido (o el ácido se puede medir de forma diferente como por ejemplo, una solución al 5% en solvente por volumen) y temperatura de entre 0 o y 4°. En general, entre mayor el exceso de TFA empleado menor la temperatura utilizada. Las condiciones exactas varían con el substrato. La etapa 3 describe el aislamiento del ácido libre o sales que se pueden formar por medio de muchas vías estándar que son bien conocidas en el arte. Generalmente después de la desprotección con TFA, se emplea una preparación acuosa en la cual se neutraliza el ácido en exceso con una base y se retiran las impurezas orgánicas por medio de extracción con un solvente orgánico tal como acetato de etilo o diclorometano. Por ejemplo el NaOH acuoso en exceso se puede usar para basificar la mezcla de reacción. Es bien conocido para cualquier químico experto en la técnica. La reacidificación de la fase acuosa hasta pH 2.5 con HCL 1N acuoso y luego la extracción con un solvente orgánico suministrará después de la eliminación del solvente in vacuo el ácido libre. El ácido libre se puede convertir a sales inorgánicas por la adición de bases adecuadas en solventes tales como agua, metanol, etanol etc. Por ejemplo la adición de carbonato de sodio a una solución acuosa del profármaco de fosfato y el ajuste del pH hasta aproximadamente 7.6 proporciona una solución la cual al eliminar el agua por medio de liofilización deja a la sal de disodio de profármaco. Se puede usar similarmente el carbonato de potasio. Se pueden usar similarmente soluciones acuosas de bicarbonato de sodio o bicarbonato de potasio. Las sales de monosodio o monopotasio se pueden generar por medio de una titulación cuidadosa de soluciones de ácido fosfato con 2-etil hexanoato de potasio o de sodio. Las sales de amina se pueden generar al disolver el ácido libre en solventes orgánicos tales como acetato de etilo o acetronitrilo o alcoholes o mezclas de bajo peso molecular de estos solventes que contiene opcionalmente agua. Algunas aminas potencialmente útiles para la formación de sales incluyen alquilaminas inferiores (metilamina, etilamina, ciclohexilamina, y similares) o alquilaminas inferiores substituidas (por ejemplo, alquilaminas substituidas con hidroxido tales como dietanolamina, trietanilamina o tris (hidroximetil) -aminometano) , lisina, arginina, histidina, N-metilglucamina o bases tales como piperidina o morfolina. La adición lenta de una amina a una solución con agitación a una temperatura baja puede suministrar la mono de la sal de bis amina dependiendo de la estequiometría. Las sales de amina también se pueden obtener al agitar la solución y eliminar el solvente in vacuo más que por la cristalización o precipitación. Los procedimientos de recristalización variarán por el compuesto y la sal pero están disponibles para alguien experto en la técnica. El esquema de reacción B detalla una secuencia preferida y un conjunto de reactivos y condiciones para llevar a cabo la secuencia general que se muestra en el esquema de reacción A. Puede utilizarse un método alternativo y en muchos casos el método preferido para realizar la secuencia en la etapa C, que incluye la desprotección del diéster para proporcionar el ácido intermediario in situ seguido por la formación de la sal en el medio de reacción. Por ejemplo, el calentamiento de un diéster II en una mezcla de agua y un cosolvente miscible en agua tales como por ejemplo, acetona, metanol, etanol o isopropanol pueden producir el alcohol libre de I en el medio de reacción { insitu) . Un solvente preferido es acetona e isopropanol. Podrían utilizarse temperaturas entre los puntos de ambiente y de ebullición de los solventes. Típicamente, 40° y 60° C es el rango preferido. La adición de una base o más preferiblemente, una amina como se describe en la mezcla de reacción que contiene el ácido libre en el agua y el cosolvente puede producir la sal directamente. Si se seleccionan las condiciones apropiadas, la sal puede cristalizar o precipitar directamente a partir del medio de reacción y puede aislarse mediante la filtración y el secado. Ejemplos específicos se encuentran contenidos en la sección experimental . El método preferido de preparación de los intermediarios lia, Ilb y lie y de los ácidos lac, Ibc y le ofrecen un número de ventajas significativas sobre los procedimientos usados inicialmente para la preparación de lia, Ilb y lie durante los esfuerzos de búsqueda exploratoria. Las rutas de descubrimiento inicial para la preparación de todos los tres intermediarios II usaban una preparación de di-terbutil clorometil fosfato que requiere el uso relativamente costoso del fosfato de di ter-butil tetrabutilamonio que reaccionó con un exceso de 10 veces de cloroyodometano, potencialmente peligroso y costoso. El exceso de volátiles y yodometano se removieron in vacuo para proporcionar el reactivo crudo que se usó sin purificación adicional. Al menos un exceso de 5 veces de este reactivo se usó para reaccionar con los compuestos IV, esto significa que al menos 5 equivalentes de fosfato de tetrabutilamonio y 50 equivalentes de diclorometano se usaron en comparación con las cantidades de IVa, b o c. Además, la alquilación de compuestos IV con este reactivo se logró usando NaH usando una base y yodo como un aditivo para promover la alquilación. Estas condiciones producen una mezcla de reacción que contienen el compuesto II deseada como el principal producto, y productos laterales que se eliminaron usando cromatografía de gel de síclice, un tiempo de consumo tedioso, y especialmente la operación costosa en reacciones de escala incrementada. La omisión para remover los productos secundarios resultó en productos I a partir de la siguiente etapa, la eliminación de los grupos protectores que contuvieron impurezas que fueron difíciles de eliminar de manera satisfactoria tanto en un rendimiento razonable como en la organización del tiempo. La preparación mejorada de fosfato de di-terbutil clorometilo utiliza menos fosfato de potasio diterbutilo costoso, y sólo un exceso aproximado de 2 veces este reactivo comparado con otro reactivo de cloruro de clorometil sulfonilo. El di-terbutil clorometil fosfato preparado mediante este método se aisla en forma pura vía la destilación conveniente. Para la conversión de IVa a IIA, sólo 1.2 equivalentes de este reactivo se usaron para alquilar los compuestos IV. Además, un base económica y menos reactiva, carbonato de potasio, se usó junto con DMSO para obtener la alquilación en la que los compuestos II producidos están suficientemente libres de productos secundarios que pueden usarse sin purificación de cromatografía como suministro para la reacción de desprotección. El ácido libre lac o sales tales como lab por ejemplo, pueden obtenerse en forma pura a partir del lia preparado de esta manera sin cromatografía. Para la síntesis de los compuestos Ilb y IIC que son más lentos para reaccionar con IVa, se emplearon de 2 a 2.5 equivalentes de di-terbutil clorometil fosfato y condiciones modificadas (carbonato de cesio como base con KI en el solvente, NMP) se usaron para alquilar tanto IVb como IVc y realizar la conversión superior de Ilb y IIC respectivamente. Nuevamente las nuevas condiciones proporcionaron compuestos II con suficiente pureza que les permite usar para producir compuestos I sin la necesidad de una purificación cromatográfica . En consecuencia, las nuevas condiciones reducen las cantidades y la estequiometría de los reactivos necesarios para preparar el compuesto I de esta invención y evitar la necesidad de una purificación cromatográfica de los intermediarios II. Los materiales de partida empleados para preparar el fosfato de di-terbutil clorometilo son más económicos y menos peligrosos y el producto final se produce con alta pureza. Finalmente, las condiciones desarrolladas por la alquilación IVa, IVb e Ivc eliminan la necesidad del reactivo base de hidruro de sodio flamable que ha sido usado en exceso y empleado ya sea con potasio o carbonato de cesio.

En la etapa de la alquilación, puede usarse una base adecuada tal como M2C03 (M es litio, sodio, potasio, rubidio o cesio) . Para convertir IVa a lia, K2C03 se prefiere (equivalentes 1-5 molar, preferiblemente 2 equivalentes molares por mol de IVa) . Para convertir IVb a Iib o IV a lie, se prefiere carbonato de cesio. También, se necesita un solvente adecuado tal como dimetilsulfóxido, N-dimetilformamida, acetona, acetonitrilo, N-metilpirrolidina, formamida, tetrahidrofurano, etc. (2-50 ml/gramo de IV, se prefiere con 5 ml/gramo) ; se prefiere dimetilsulfóxido al convertir Iva a lia; N-metilpirrolidinona se prefiere al convertir Ivb a Ilb o IVc a lie. Una fuente de yodo en el solvente adecuado incluye pero no se limita a, MI (M es por ejemplo, litio, sodio, potasio, yodo, tetrabutilamonio, etc) ; se prefiere con yoduro de potasio (0.1 - 5 equivalentes molar/mol del compuesto IV; se prefieren 2 equivalentes). El agente de alquilación, di-tert-butil clorometil fosfato, puede usarse en 1 a 10 equivalentes molar por mol de IV; pero se prefiere alrededor de 1.2 equivalentes molares. La temperatura de reacción puede ser de 10-60 °C (se prefiere 30°C) . En la etapa de desprotección, cuando dos grupos ter-butilo se remueven de IIA para formar lac, esto se lleva a cabo en presencia de un solvente adecuado tal como diclorometano (preferido) , dicloroetano, cloroformo, tetracloruro de carbono, tolueno, benceno, etc. (2-50 ml/gramo de Iv, preferiblemente de 10 ml/gramo) . Para la desprotección de Ilb y lie para obtener Ibc e IC, respectivamente, esto se realiza en acetona/agua a temperaturas de aproximadamente 40 °C. Además, durante la desprotección de IIA, se prefiere que tenga un ácido presente como el ácido trifluoroacético (preferido), clorhídrico, sulfúrico, nítrico, etc. (2-100 equivalentes molares en base a IVa, se prefiere con 15 equivalentes molares).

Quimica General : Las preparaciones adicionales de los materiales de partida y precursores están contenidas es Wang et. al. Patente de E.U.A 6,476,034 consedida el 5 de Noviembre 2002 que se incorpora en la presente en su totalidad. Todos los datos de cromatografía liquida (LC) se registraron en un cromatógrafo liquido Shimadzu LC-10AS usando un detector SPD-10AV UV-Vis con los datos de espectrometría de masas (MS) determinados usando una plataforma de micromasa para LC en el modo de electrorocío.

Método CL/EM (esto es identificación del compuesto) Columna A: columna YMC ODS-A S7 3.0x50 mm Columna B: columna PHX-LUNA C18 4.6x30 mm Columna C: columna XTERRA ms C18 4.6x30 mm Columna D: columna YMC ODS-A C18 4.6x30 mm Columna E: columna YMC ODS-A C18 4.6x33 mm Columna F: columna YMC C18 S5 4.6x50 mm Columna G: columna XTERRA C18 S7 3.0x50 mm Columna H: columna YMC C18 S5 4.6x33 mm Columna I: columna YMC ODS-A C18 3.0x50 mm Columna J: columna XTERRA C18 S5 4.6x50 mm Columna K: columna YMC ODS-A C18 4.6x33 mm Columna L: columna Xterra MS C18 5uM 4.6x30 mm Columna M: columna YMC ODS-A C18 4.6x33 mm CONDICIONES DE CORRIDA ESTÁNDAR DE CL (SE USA A MENOS QUE SE SEÑALE DE OTRA MANERA) Gradiente: 100% solvente A /0% solvente B a 0% solvente A/100% solvente B Solvente A = 10% MeOH -90% H20 -0.1% TFA, solvente B= 90% MeOH -10% H20 -0.1% TFA; y Rt en min. Tiempo de gradiente: 2 minutos Tiempo de retención 1 minuto Relación de flujo 5 ml/min Longitud de onda del detector: 220 nm Solvente A 10% MeOH/90% H2O/0.1% ácido trifluoracético Solvente B 10% MeOH/90% H2O/0.1% ácido trifluoracético CONDICIONES ALTERNAS DE LA CORRIDA DE CL B : Gradiente: 100% solvente A /0% solvente B a 0% solvente A/100% solvente B Solvente A = 10% MeOH -90% H20 -0.1% TFA, solvente B= 90% MeOH -10% H20 -0.1% TFA; y Rt en min. Tiempo de gradiente 4 minutos Tiempo de retención 1 minuto Relación de flujo 4ml/min Longitud de onda del detector: 220nm Solvente A 10% MeOH/90% H2O/0.1% ácido trifluoracético Solvente B 10% MeOH/90% H2O/0.1% ácido trifluoracético Los compuestos purificados por CLAR preparativa se diluyeron en MeOH (1.2 ml) y se purificaron usando los siguientes métodos en un sistemas CLAR preparativo automatizado Shimadzu LC-10A o un sistema CLAR preparativo automatizado Shimadzu LC-8A con una longitud de onda de detector (SPD-10AV UV-VIS) y sistemas de solventes (A y B) iguales que los anteriores.

MÉTODO CLAR PREPARATIVO (ESTO ES PURIFICACIÓN DEL COMPUESTO) Método de purificación: Gradiente inicial (40% B, 60% A) se lleva hasta un gradiente final (100% B, 100% A) durante 20 minutos, se mantiene por 3 minutos (100% B, 0% A) Solvente A 10% MeOH/90% H2O/0.1% ácido trifluoracético Solvente B 10% H2O/90% MeOH/0.1% ácido trifluoracético Columna columna YMC C18 S5 20x100 mm Longitud de onda del detector: 220nm Para los procedimientos experimentales de abajo, se emplean las siguientes condiciones CLAR o modificaciones de los procedimientos estándar. Condiciones CLAR para la rutina de puresa CL: Detección a 254 nm; gradiente 0-100% B/A; A 10% CH3CN- 90% H2O-0.1% TFA, B 90% CH3CN-10% H2?-0.1% TFA, tiempo de gradiente 4 min.; columna YMC ODS-AQ o ORD-A 4.6x50 mm, 3 icrones. Condiciones CLAR para análisis CL/EM: Columna J: columna XTERRA C-18 S5 4.6x50 mm, Gradiente: Solvente A al 100%/Solvente B 0% hasta solvente A al 0%/solvente B al 100% Solvente A = MeOH al 10% - H20 al 90% -TFA al 0.1%, sovlente B = MeOH al 90% - H20 al 10% - TFA al 0.1%; y temperatura ambiente en min.; tiempo de gradiente: 3 minutos; relación de flujo: 4 ml/min.; longitud de onda del detector: 220 nm. Los materiales de partida pueden adquirirse de fuentes comerciales o prepararse usando procedimientos de la literatura. PREPARACIÓN DEL COMPUESTO PRECURSOR IV: La preparación del compuesto precursor IV se describe previamente en los siguientes, todos los cuales se incorporan en la presente como referencie en su totalidad como sigue: Patente E.U.A. 6,469,006 concedida el 22 de Octubre del 2002 a W. S. Blair et al; Patente E.U.A. 6,476,034 concedida el 5 de Noviembre del 2002 a Wang et al; Patente E.U.A. 6,573,262 concedida el 3 de Junio del 2003 a Meanwell et al; Número de serie E.U.A. 10/630,278 presentada el 30 de Julio del 2003 a J. Kadow et al; la cual es una continuación en parte del número de serie E.U.A. 10/214,982 presentada el 7 de Agosto del 2002, la cual es una continuación en parte del número de serie E.U.A. 10/038,306 presentada el 2 Enero del 2002, la cual corresponde al PCT WO 02/062423, presentada el 2 de Enero del 2002, publicada el 15 de Agosto del 2002; Número de serie 10/871,931 presentada el 18 de Junio del 2004 a Yeung et al; Número de serie E.U.A. 10/762,108 presentada el 21 de Enero del 2004 a Wang et al, correspondiente al PCT WO 2004/043337 presentada el 27 de Mayo del 2004. Los procedimientos detallados selectos, se proporcionan a continuación: PROCEDIMIENTO TÍPICO PARA LA PREPARACIÓN DE INTERMEDIARIOS PARA LA PREPARACIÓN DEL COMPUESTO PRECURSOR IV 1) Preparación del Azaindol 1 Preparación de azaindol, Método A: Preparación de 7-Cloro-6-azaindol le: La 2-Cloro-3-nitropiridina 22e (5.0 g) se disolvió en THF seco (200 ml) . Después de que la solución se enfrió bajo -78°C, se agregó un exceso de bromuro de vinil magnesio (1.0 M en THF, 100 ml) . Luego, la reacción se dejó a -20°C durante 8 horas antes de apagarse con NH4C1 al 20% (150 mi) . La fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 150 ml) . La capa orgánica combinada se secó sobre MgS04. Después se filtró y se concentró, el producto crudo se purificó por cromatografía de columnaa de gel de sílice para proporcionar 1.5 g de 7-cloro-6-azaindol le en 31 % de rendimiento. Los compuestos 5an, IVa y 5ap se describen a continuación. 1am El compuesto lam, el 4-bromo-7-cloro-6-azaindol (sólido amarillo) se preparó por el mismo método usado por el azaindol le pero el material de partida empleado fue 5-bromo-2-cloro-3-nitropiridina. (disponible de Aldrich, Co.). EM m/z: (M+H)+ calculado para C7H5BrCIN2: 230.93; encontrado 231.15. Tiempo de retención CLAR: 1.62 minutos (columna B) .

El compuesto lan (4-metoxi-7-cloro-6-azaindol) y el compuesto lao (4, 7-dimetoxi-6-azaindol) : Una mezcla de 4-bromo-7-cloro-6-azaindol (1 g) , Cul (0.65 g) y NaOMe (4 mi, 25%) en MeOH (16 ml) se calentó a 110-120 °C durante 16 horas en un tubo sellado. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se neutralizó con HCl 1N para obtener un pH 7. La solución acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 30 ml) . Luego la capa orgánica combinada se secó sobre MgS04 y se concentró in vacuo para proporcionar un residuo, el cual se purificó por cromatografía de gel de sílice (50 g) usando 1:7 EtOAc: hexano como eluyente. (dimensión de columna: 20mm x 30 cm) para dar 0.3 g de 4-metoxi-7-cloro-6-azaindol (sólido blanco) y 0.1 g de 4, 7-dimetoxi-6-azaindol (sólido blanco). El compuesto lan (4-metoxi-7-cloro-6-azaindol) . EM m/z: (M+H)+ calculado para C8H9C1N20: 183.03; encontrado 183.09. Tiempo de retención CLAR: 1.02 minutos (columna B) . El compuesto lao (4, 7-dimetoxi-6-azaindol) . 1H RMN (500 MHz, CDC13) d 7.28 ( , 2H) , 6.63 (m, 1H) , 4.14 (s, 3H) , 3.95 (s, 3H) . EM m/z: (M+H)+ calculado para C9HnN202 : 179.08; encontrado 179.05. Tiempo de retención CLAR: 1.36 minutos (columna B) .

La acilación de azaindol, método B: Preparación de Metil (5- azaindol-3-il)-oxoacetato 2b: El 5-Azaindol (Ib) (0.5 g, 4.2 mmol) se agregó a una suspensión de A1C13 (2.8 g, 21.0 mmol) en CH2C12 (100 ml) . se agitó cotinuamente a temperatura ambiente durante 1 hora antes se agregó metil clorooxoacetato (2.5 g, 21.0 mmol) gota a gota. La reacción se agitó durante 8 horas. Después se agregó 20 ml de MeOH cuidadosamente para apagar la reacción, los solventes se removieron bajo vacío. El residuo sólido se purificó por cromatografía de columna de gel de sílice columna (EtOAc/MeOH = 10:1) para proporcionar 0.6 g (70%) del producto acilado 2b. Caracterización del compuesto 2: El Compuesto 2b (Metil (5-azaindol-3-il) -oxoacetato) : aH RMN (500 MHz, CD3OD) d 9. 61 (s, 1H) , 9. 02 (s, 1H) , 8 . 59 (d, 1H, J = 6. 63 Hz) , 8 .15 (d, 1H, J = 6. 60 Hz) , 4 .00 (s, 3H) ; 1 C RMN (125 MHz, CD3OD) d 178. 9, 163.0, 145. 6, 144.2, 138.3, 135. 0, 124.7, 116.3, 112.1, 53. 8. EM m/z : (M+H) + calculado para C?fl.9N2?3: 205. 06; encontrado 205. 04. Tiempo de retención 1ao 2ao El Compuesto 2ao (Etil (4 , 7-dimetoxi-6~azaindol-3-il) - oxoacetato) se preparó por el mismo método como se uso por el compuesto 2b pero el material de partida empleado fue 4,7- dimetoxi-6-azaindol . El compuesto se purificó por cromatografía de gel de sílice usando 2:3 EtOAc : Hexano como eluyente para dar un aceite amarillo: ""? RMN (500 MHz, CDC13) d 9.50 (s, 1H) , 8.21 (s, 1H) , 7.47 (s, 1H) , 4.39 (q, 2H, d = 7.05 Hz), 4.13 (s, 3H) , 3.93 (s, 3H) , 1.40 (t, 3H, d = 7.2 Hz) . EM m/z: (M+H)+ calculado para C?3H?5N205 : 279.10; encontrado 279.16. Tiempo de retención CLAR: 1.28 minutos (columna B) . 2ao 3ao 2) Preparación de azaindol 3-glioxilato de potasio 3 Preparación de (7-azaindol-3-il) -oxoacetato de potasio 3a: El Compuesto 2a (43 g, 0.21 mol) y K2C03 (56.9g, 0.41 mol) se disolvieron en MeOH (200 ml) y H20 (200 ml) . Después de 8 horas, el producto 3a se precipito afuera de la solución. La filtración proporciono 43 g del compuesto 3a como un sólido blanco en 90.4% de rendimiento.

Caracterización de los compuestos 3: El compuesto 3a, (7-azaindol-3-il) -oxoacetato de potasio: ""? RMN (300 MHz, DMSO-de) d 8.42 (d, 1H, J = 7.86 Hz) , 8.26 (d, 1H, J = 4.71 Hz), 8.14 (s, 1H), 7.18 (dd, 1H, J = 7.86, 4.71 Hz) ; 13C RMN (75 MHz, EMSO-d6) d 169.4, 148.9, 143.6, 135.1, 129.3, 118.2, 117.5, 112.9. EM m/z: (M+H)+ del ácido correspondiente del compuesto 3a (3a-K+H) calculado para C9H7N203: 191.05; encontrado 190.97. Tiempo de retención CLAR: 0.48 minutos (columna A) . El compuesto 3ao ( (4, 7-dimetoxi-6-azaindol-3-il) -oxoacetato de potasio) se preparató (como un sólido amarillo) , por el mismo método usado para preparar el compuesto 3a excepto que el (4,7-dimetoxi-6-azaindol-3-il) -oxoacetato de etilo se empleó como el material de partida. EM m/z: (M+H)+ del ácido correspondiente del compuesto 3ao (M-K+H)+ calculado para CnH??N205: 251.07; encontrado 251.09. Tiempo de retención CLAR: 0.69 minutos (columna B) .

Ejemplo de procedimiento preparación de 5a Preparación de la (R) -N- (benzoil) -3-metil-N - [ (7-azaindol-3-il) -oxoacetil] -piperazina 5a: El 7-azaindol 3-glioxilato de potasio 3a (25.4 g, 0.111 mol), (R) -3-metil-?-benzoilpiperazina 4a (22.7 g, 0.111 mol), 3- (dietoxifosforiloxi) -1, 2, 3-benzotriazin-4 (3H) -ona (DEPBT) (33.3 g, 0.111 mol) y base de Hunig (28.6 g, 0.222 mol) se combinaron en 500 ml de DMF. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas. El DMF se removió por medio de evaporación a presión reducida y el residuo se dividió entre acetato de etilo (2000' ml) y una solución de ?a2C03 acuoso al 5% (2 x 400 ml) . La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 300 ml) . La fase orgánica se combino y se secó sobre MgS04 anhidro. Se concentró in vacuo para proporcionar un producto crudo, el cual se purificó por cromatografía de columna de gel de sílice con EtOAc/MeOH (50:1) para dar 33 g del producto 5a en 81 % de rendimiento. Caracterización de los compuestos 5 con la siguiente sub-estructura : El compuesto 5a, n = 2, R7_?3 = H, R14 = (R)-Me, (R) -N- (benzoil }-3-metil-N' - [ (7-azaindol-3-il) -oxoacetil] -piperazina: aH RMN (300 MHz, CD3OD) d 8.57 (d, 1H, J = 5.97 Hz), 8.38 (d, 1H, J = 4.20 Hz) , 8.27 (m, 1H) , 7.47 (s, 5H) , 7.35 (t, 1H, J = 5.13 Hz) , 4.75-2.87 (m, 7H) , 1.31 (b, 3H) ; 13C RMN (75 MHz, CD3OD) d 185.6, 172.0, 166.3, 148.9, 144.6, 137.0, 134.8, 130.2, 129.9, 128.4, 126.6, 118.6, 118.0, 112.2, 61.3, 50.3, 45.1, 35.5, 14.9, 13.7. EM m/z: (M+H)+ calculado para C2?H2?N403: 377.16; encontrado 377.18. Tiempo de retención CLAR: 1.21 minutos (columna A). Análisis calculado para C2?H20N4O3: C, 67.01; H, 5.36; N, 14.88. Encontrado: C, 66.01; H, 5.35; N, 14.61.

El compuesto IVa, N- (benzoil) -N' -[ (4, 7-dimetoxi-6-azaindol-3-il) -oxoacetil] piperazina, se preparó por el mismo método usado para preparar el compuesto 5a pero el material de partida fue (4, 7-dimetoxi-6-azaindol-3-il) -oxoacetato de potasio. El compuesto se purificó por cromatografía de gel de sílice usando EtOAc como el solvente eluyente para dar un sólido blanco. ?ñ RMN (500 MHz, DMSO-d6) d 13.0 (s, 1H) , 8.15 (s, 1H) , 7.40 ( , 6H) , 4.00 (s, 3H) , 3.83 (s, 3H) , 3.63-3.34 (m, 8H) ; 13C RMN (125 MHz, DMSO-d6) d 185.5, 169.3, 166.5, 146.2, 145.7, 136.6, 135.3, 129.6, 128.4, 126.9, 122.2, 122.1, 119.2, 114.4, 56.8, 52.9, 45.5, 39.9. EM m/z: (M+H) calculado para C22H23N405: 423.17; encontrado 423.19. Tiempo de retención CLAR: 1.33 minutos (columna B) . Análisis calculado para C22H2?N4?5: C, 62.7; H, 5.02; N, 13.29. Encontrado: C, 61.92; H, 5.41; 13.01. Punto de fusión: 229.5-232°C.

PROCEDIMIENTOS PARA LA PREPARACIÓN DEL COMPUESTO PRECURSOR IVC Preparación del 3-metil-l ,2 , 4-triazol (2-81) CH4N20 C2H5NS 2-81 peso Mol.: 60.06 peso Mol. : 76» 13 C3H5N3 peso Mol.: 83.09 Procedimiento : Una mezcla sólida de hidrazida fórmica (68 g, 1.13 mol) y tioacetamida (85 g, 1.13 mol) en un matraz de fondo redondo de 500ml se calentó con agitación a 150 °C (temperatura del baño de aceite) durante 1.5 hrs con una corriente suave de nitrógeno, se removió en H2S y agua (alrededor de 18 ml de líquido colectado) formado durante la reación. La mezcla de reacción se destilo bajo presión reducida, colectando 60.3 g (0.726 mol, Y. 63.3%) del compuesto del título a 102 °C/0.35-1 mmHg como un sólido blanco después de remover un líquido precedente: """H RMN (CDC13) d ppm 2.51 (3H, s, 3-Me) , 8.03 (1H, s, 5-H) , 9.5 (1H, br, NH) ; CCD Rf (MeOH al 10%/CH2C12) = 0.3 (fosfomolibdato- carbonización, mancha blanca). Referencia: Vanek, T.; Velkova, V.; Gut, Jiri Coll. Czech. Chern. Comm. 1985,49, 2492.

Preparación del 3-81 pe Procedimiento : Un matraz de fondo de 500 ml se cargó con 4-metoxi-7-cloro-6-azaindol 2e (9.1 g, 50 mmol; se secó in vacuo), carbonato de potasio (13.8 g, 100 mmol, 2 eq.), polvo de cobre (6.35 g, 100 mmol, 2 eq. ) , y 3-metil-l, 2, 4-triazol (83 g, 1.0 mol, 20 eq. ) . La mezcla sólida se calentó hasta fundirse a 170-175 °C (temperatura del baño de aceite externa) bajo una corriente suave de nitrógeno anhidro durante 12 h, por tiempo al cual el análisis CLAR indicó que la cantidad del pico del material de partida puede llegar a ser de 5-30% y el pico del producto deseado puede llegar a se alrededor de 45% por un pico del producto isomérico llega a 15%. Como la mezcla de reacción se enfrió, se agregó MeOH (150 ml) lentamente para calentarla, se agitó la mezcla. Durante el enfriamiento el material insoluble (polvo de cobre) se filtró a través de una almohadilla de celite, y se enjuagó con metanol. El filtrado se concentró in vacuo para dar una pasta espesa la cual se diluyó con agua (1 L) y se extrajo con EtOAc (3xl50ml) . Los extractos EtOAc se secaron (MgS04) , se filtraron y se concentraron para obtener alrededor de 8 g del residuo crudo el cual se cristalizó por disolver en CH3CN caliente (50 ml) , seguido por diluir con agua (100 ml) y enfriar a 0°C para colectar 1.45 g (12.7%) del compuesto del título como sólido blanco. El filtrado se purificó por fase inversa C-18 de gel de sílice (YMC ODS-A 75 µm) se eluyó con 15-30% CH3CN/H20. La fracciones apropiadas se combinaron y la solución acuosa después se removió en CH3CN por evaporador rotatorio, se liofilizó para dar 1.15 g adicionales del compuesto del título 3-81. La capa acuosa cruda se extajo además con EtOAc varias veces. Los extractos de acetato de etilo se secaron (MgS04) , se filtraron, se cocnentraron, y se cristalizaron de MeOH para dar 200 mg adicionales del compuesto del título 3-81. El rendimiento total: 2.8 g (12.2 mmol, Y. 24.5%); EM m/z 230 (MH) , HRMS (ESI) m/z calculado para CnH?2N50 (M+H), 230.1042, encontrado 230.1038 (? 1.7 ppm); XH RMN (CDC13) d ppm 2.54 (3H, s, CH3) , 4.05 (3H, s, OCH3) , 6.73 (1H, s, H-3), 7.40 (1H, s, H-2), 7.56 (1H, s, H-5), 9.15 (1H, s, triazol-H-5) ; 13C RMN (CDC13, 125.7 MHz) d ppm 14.2 (triazol-Me) , 56.3 (OMe), 100.5 (C-3), 116.9 (C-5) , 123.5, 127.2, 127.5 (C-2), 129.5 (C-7), 141.2 (C-5'), 149.5 (C-4), 161.8 (C-3'); Análisis calculado para C??HuN50: C 57.63, H 4.83, N 30.55, encontrado C 57.37, H 4.64, N 30.68. La estructura se confirmó por un análisis cristalográfico de rayos X simple usando cristales obtenidos de las fracciones de la columna C-18. Una porción de las fracciones de la columna C-18 contiene una mezcla del análogo 3-81 de 3-metil-l, 2, 4-triazolilo deseado y el análogo 4-81 5-metil-1, 2, 4-triazolilo isomérico se purificaron además por columna de fase inversa C-18 con CH3CN/H20 al 8-10%. Las fracciones apropiadas se extrajeron con CH2C12, y la evaporación baja del solvente da el material cristalino del 7- (5-metil-l, 2, 4-triazolil) -4-metoxi-6-azaindol isomérico (4-81): EM m/z 230 (MH) , 2H RMN (CDCI3) d ppm 3.05 (3H, s, CH3) , 4.07 (3H, s, OCH3), 6.74 (1H, q, J=2.4, H-2) , 7.37 (1H, t, J=2.4, H-3), 7.65 (1H, s, H-5) , 8.07 (1H, s, triazol-H-3) . La estructura se confirmó por un análisis cristalográfico de rayos X simple.

Preparación de 5-81 Procedimiento : El A1C13 (40 g, 0.3 mol, 15 eq. ) se disolvió en una solución de CH2C12 (100 ml) y nitrometano (20 ml) bajo nitrógeno seco. A esta solución se agregó el compuesto 3-81 (4.58 g, 0.02 mol) bajo agitación y bajo N2, seguido por clorooxoacetato de metilo (9.8 g, 0.08 mol, 4 eq. ) . La mezcla se agitó bajo N2 a temperatura ambiente durante 1.5 h. La mezcla se agregó gota a gota a una solución fría y agitada de una solución de acetato de amonio acuoso al 20% (750 ml) . La mezcla se agitó durante 20 min. y el precipitado resultante se filtró, se lavó a completamente con agua y se secó in vacuo para obtener 4.7 g (0.015 mol, Y. 75%) del compuesto del título 5-81 como un sólido blanco: EM m/z 316 (MH) ; HRMS (ESI) m/z calculado para C?4H?4N504 (M+H), 316.1046; encontrado 316.1041 (? -1.6 ppm); 1H RMN (CDC13, 500 MHz) d ppm 2.58 (3H, s, CH3) , 3.96 (3H, s, OCH3) , 4.05 (3H, s, 0CH3) , 7.76 (1H, s, H-5), 8.34 (1H, d, J=3Hz, H-2) , 9.15 (1H, s, triazol-H-5) , 11.0 (1H, brs, NH) . Más el compuesto del título 5-81 y el ácido hidrolizado 6-81 puede obtenerse del filtrado por extracción de base acida con EtOAc.

Preparación del 6-81 Procedimiento : a una suspensión de metil éster 5-81 (2.2 g, 7.0 mmol) en MeOH (50 ml) se agregó una solución de NaOH 0.25M en agua (56 ml, 14 mmol, 2 eq. ) a temperatura ambiente y la mezcla se agitó durante 15 min., por tiempo al cual CLAR indico que la hidrólisis se completó. La mezcla se concentró in vacuo rápidamente para remover MeOH, y a el residuo de la solución se agregó agua (100 ml) y HCl 1N (14 ml) con agitación para neutralizar la mezcla. El precipitado fino resultante se filtró, se lavó con agua y se secó in vacuo para obtener 1.98 g (6.58 mmol, Y. 94%) del compuesto del título 6-81 como un sólido blanco opaco: EM m/z 302 (MH) ; 1H RMN (DMSO-d6, 500 MHz) d ppm 2.50 (3H, s, traslapado con picos DMSO), 3.98 (3H, s, CH30) , 7.87 (1H, s, H-5) , 8.29 (1H, d, J=3.5Hz, H-2), 9.25 (1H, s, triazol-H-5) , 12.37 (1H, s, NH) . Procedimiento alternativo: A una suspensión del metil éster 5-81 (10.7 g, 34 mmol) en MeOH (150 ml) se agregó una solución NaOH 0.25M en agua (272 ml, 68 mmol, 2 eq. ) a temperatura ambiente y la mezcla se agitó durante 20 min., por tiempo al cual CLAR indica que la hidrólisis se completo. La mezcla se concentró in vacuo rápidamente para remover el MeOH, y el residuo de la solución se extrajo con EtOAc para remover cualquier impureza neutral. A la fase acuosa se agregó HCl 1N (68 ml, 68 mmol) para neutralizar el producto. La mezcla resultante se congeló y se liofilizó para obtener 14.1 g (33.7 mmol, Y. 99.2%) del compuesto del título 6-81, que contiene 2 mol equivalentes de NaCl como un sólido blanco. Este material se usó en la reacción subsecuente sin purificación adicional. La sal de disodio del compuesto del título 6-81 se obtuvo por cromatografía de columna de fase inversa C-18 después del tratamiento con bicarbonato de sodio: CLAR >97% (AP, uv a 254nm) ; HRMS (sal Na, ESI") m/z calculado para C13H?0N5O4 (M-H) , 300.0733; encontrado 300.0724 (? -3 ppm); XH RMN (sal Na, DMSO-d5, 500 MHz) d ppm 2.37 (3H, s, Me), 3.83 (3H, S, CH30) , 7.56 (1H, s, H-5) , 8.03 (1H, s, H-2), 9.32 (1H, s, triazol-H-5) ; 13C RMN (sal Na, DMS0-d6, 125.7 MHz) d ppm 13.8 (triazol-Me) , 57.2 (OMe), 114.8 (C-3), 120.0 (C-5), 125.1, 143.5 (C-5' ) , 149.8 (C-4), 160.0 (C-3'), 171.7, 191.3.

Preparación del Compuesto IVc Procedimiento : A una solución del ácido 6-81 (3.01 g, 10 mmol) y clorohidrato de benzoilpiperazina (3.39 g, 15 mmol) en DMF (50 nIL) se agregó trietilamina (10.1 g, 100 mmol, 10 eq. ) , seguido por clorohidrato de 1- [3- (dimetilamino) propil] -3-etilcarbodiimida (EDC; 5.75 g, 30 mmol) bajo N2 y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 22 h después de la sonicación y a 40 °C durante 2 h. La mezcla se concentró in vacuo para remover DMF y TEA, y a el residuo de la solución se agregó agua (200 ml) bajo agitación y sonicación. Los precipitados formados se colectaron, se lavaron con agua y se secaron in vacuo para obtener 2.8 g (5.9 mmol, Y. 59%) del compuesto del título IVc como un sólido blanco opaco. El filtrado se extrajo con CH2C12 (x2) . Los extractos CH2C12 se secaron (Na2S04) , se filtraron y se concentraron para dar una goma la cual se trituro con Et20 para obtener un sólido. Este sólido se suspendió y se trituró con MeOH para obtener 400 mg del compuesto del título IVc como un sólido blanco opaco.

Rendimiento total: 3.2 g (6.8 mmol, Y. 68%): EM m/z 474 (MH) ; HRMS (ESI) m/z calculado para C24H24N704 (M+H) 474.1890, encontrado 474.1884 (? -1.2 ppm); 1H RMN (DMSO-d6) d ppm 2.50 (3H, s, traslapado con picos DMSO), 3.43 (4H, br, CH2N) , '3.68 (4H, br, CH2N) , 3.99 (3H, S, CH30) , 7.46 (5H, br.s, Ar-Hs) , 7.88 (1H, s, indol-H-5), 8.25 (1H, s, indol-H-2), 9.25 (1H, s, triazol-H-5) , 12.40 (1H, s, NH) ; 13C-RMN (DMSO-d6) d ppm 13.78, 40.58, 45.11, 56.78, 114.11, 120.95, 122.71, 123.60, 126.98, 128.34, 129.6, 135.43, 138.52, 142.10, 149.15, 161.29, 166.17, 169.22, 185.42; UV (MeOH) ?max 233.6 nm (e 3.43xl04), 314.9 nm (e 1.73xl04); análisis calculado para C24H24N704.1/5H20; C 60.42, H 4.94, N 20.55. Encontrado; C 60.42, H 5.03, N 20.65; KF (H20) 0.75%. Esta reacción también se llevó a cabo por el uso de HATU y DMAP para proporcionar más rendimiento consistente del rendimiento del compuesto del título: A una suspensión del ácido 6-81 (15.6 mmol) y HATU [O- (7-azabenzotriazol-l-il) -N,N,N' ,N' -tetrametiluronio hexafluorofosfonato] (8.90 g. 23.4 mmol; 1.5 eq. ) en DMF (60 ml) y CH2C12 (60 ml) se agregó una mezcla de DMAP (5.72 g, 46.8 mmol, 3 eq. ) y clorohidrato benzoilpiperazina (5.30 g, 23.4 mmol; 1.5 eq.) en DMF (60 ml) a temperatura ambiente y la mezcla se agitó bajo una atmósfera de nitrógeno durante 4 hrs. La mezcla se concentró in vacuo para remover CH2C12 y más de DMF, y el residuo de la solución se agregó agua bajo agitación y sonicación. Los precipitados formados se colectaron, se lavaron con agua y se secaron in vacuo para obtener 5.38 g (11.4 mmol. Y. 72.8%) del compuesto del título IVc como un sólido blanco opaco: CLAR >95% (AP, uv a 254nm) . ompuesto IVb Procedimiento experimental sintético para la mejor preparación del compuesto IVb FW = 223 La 5-Amino 2 metoxipiridina (50g, 0.4 mol) se agregó a una mezcla agitada de etanol absoluto (280 ml) y HBF4 (48% en agua, 172 ml) y se enfrió a 0°c. El nitrito de sodio (129g) se disolvió en agua (52 ml) y se agregó en porciones durante lh) . La agitación continuó a 0°C durante 2hr. La mezcla de reacción se diluyó con éter (1 L) . El producto sólido se colectó por filtración y se lavó con 500 ml de 50:50 EtOH/éter y subsecuentemente varias veces con éter hasta que el producto fue ligeramente rosado en color. El sólido rosa pálido 90g (~100% de rendimiento) se mantuvo en un disecador sobre P2Os. El mismo procedimiento seguido para performar la reacción en escala grande: (1) (200g, 1 . 6 mol) ; HBF4 (688 ml) , NaN02 (116 g) ; EtOH (1 . 12 L) ; H20 (208 ml) La reacción se corrió 4 veces (total de 800 gramos (1-80)) . El producto se secó sobre P205 durante 48 hr. (solamente 24hr durante el primer lote) . Un total de 1,293 g de (2-80) se obtuvieron, (91 % de rendimiento) .

Ref: J. Heterocyclic Chem . , 10, 779, 1973 (para la reacción de arriba , incluyendo datos analí ticos) Tolueno 3-80 La descomposición de la sal de diazonio se corrió en 3 lotes de 206g, 219g y 231g usando 1.3L, 1.4L y 1.6L de tolueno anhidro respectivamente. El tolueno se precalentó bajo nitrógeno a 100 °C (temperatura interna) en un matraz de 2L fondo redondo de 3 cuellos proporcionado con un agitador mecánico. El sólido se agregó en porciones sólidas por medio de una cuchara a través de un embudo de polvo el cual se coloca a un adaptador con una entrada pequeña de flujo de nitrógeno positivo. Durante la adición, la temperatura se mantuvo entre 99-102 °C (se puso a 100 °C) y se agitó vigorosamente. La adición total fue de 60 min. para los dos lotes más pequeños y 70 min. para al menos uno. Después de que la adición se terminó, cada una de las reacciones agitadas se calentaron a 110 °C durante 1 hr. La manta de calentamiento se removió y se agitó hasta detenerse. Las reacciones se permitieron mantener durante 2hr (hasta obtner temperatura ambiente) . Nota de seguridad: La reacción contiene BF3 para trabajar con la reacción caliente que expone vapores los cuales causan irritación en la piel con algunas persona. No se notaron incidentes a temperatura ambiente (6 personas diferentes). El tolueno caliente de la reacción se vació en un 4L Erlenmeyer (un aceite café oscuro y el residuo se mantuvo en el matraz) . El residuo se lavó con 50 ml de tolueno y se vació en los extractos de tolueno originales . Se agregó 1.5L de NaOH 1N a la capa de tolueno, se extrajo y se lavó con ~100 ml de NaCl acuoso saturado. Se combinó NaCl con la capa de NaOH, se reextrajo con 150 ml de tolueno, se lavó con 50 ml de NaCl saturado. Las capa de tolueno combinadas. Se agregó 1L de NaOH 1N a el residuo en el matraz de reacción y se giró para disolver lo más que se pueda el residuo luego se agregó 500ml de Et20 y se vació en Erlenmeyer . Se agregó ~500ml más de NaOH 1N a el meztra de reacción y se giró -500 ml de Et20. Se combinó el Et20 oscuro y NaOH, se lavaron en un matraz erlenmyer. La mezcla Et20/NaOH se vació a través de un embudo de polvo que contiene un tapón de lana de vidrio para colectar el sólido viscoso oscuro, (se agregó ~500 ml más de éter para lavar) en 6L del embudo sep. Extracto. Se lavó la capa de éter con ~200 ml de H20 y luego 100 ml de NaCl saturado. Se combinaron todos los lavados con la capa original de NaOH acuoso y se reextrajo con 500ml de éter. Se lavó con 100 ml de H20 y 100 ml de NaCl. Extractos de éter combinados. Los extractos de tolueno y éter se detuvieron por un producto limpio de CL/EM. El éter se concentró en un rotoevaporador y el residuo se combino con los extractos de tolueno para hacer una solución homogénea la cual se tomó para la siguiente etapa como es. Otras dos corridas se combinaron y se prepararon en la misma manera. Todas las capas acuosas se detuvieron por CL/EM = sin producto. Ref: J. Heterocyclic Chem. , 10, 779, 1973 (para la reacciones de arriba, se incluyen datos analíticos) 3-80 Un total de 4.6L de una solución de tolueno que contiene 3-80 se colocó en varios tubos sellados y se trató con 900ml de HCl al 35% a 145 °C durante 2hr. El CL/EM no mostró material de partida, solamente el 4. La solución de tolueno se decantó y se descartó. La fase acuosa se lavó con EtOAc y se concentró para remover los volátiles para proporcionar un sólido café que contiene la fluoro-hidroxipiridina 4-80 deseada. Un total de 244g de este sólido se colectó y se tomó para la siguiente etapa como es (esto no se secó completamente) . Nota: Se ha corrido subsecuentemente esto para decantar la capa de tollueno primera previa hasta calentar para reducir los volúmenes . La misma reacción se llevó a cabo usando HBr (48% en H20) a 100°C durante 6h con un resultado similar a el procedimiento de literatura 49% de rendimiento. Ref: J. Heterocyclic Chem . , 10, 779, 1973 (para las reacciones de arriba, incluyendo datos analíticos) o (usualmente) 2. Extraído con EtOAc, triturado con éter El sólido de arriba contiene (4-80) se dividió en 4 lotes y se trató con H2S0 y el HN03 fumante se mostró abajo. Las cantidades usadas fueron: El compuesto 4-80 se disolvió en ácido sulfúrico (las cantidades grandes se indican arriba) a temperatura ambiente y luego se calentó a 65 °C. Una solución preformada de ácido nítrico humeante y se agregó ácido sulfúrico (la cantidad pequeña se indicó arriba) gota a gota. La temperatura se mantuvo entre 65 °C y 80 °C (la corrida es exotérmica y no obstante que el baño está a 65 °C, la temperatura es alta, usualmente 75, algunas veces 80°C) . después de que la adición se completo, la mezcla de reacción se calentó a 65 °C durante 1 hr adicional. La mezcla de reacción luego se enfrió a temperatura ambiente y se vació en un matraz que contenía hielo) (20g de hielo/gr compuesto, la evolución del gas ocurrió) . Un sólido precipitado y esto se colectó por filtración (1HNM" mostró 4-80 y algunas veces también (se descarto) ) . La capa acuosa se extrajo con AcOEt varias veces (3-5) y se concentró en un evaporador rotatorio bajo vacío para proporcionar un sólido que se trituró con éter para proporcionar 5-80 como un sólido amarillo ligero. Un total de 117g del producto deseado se colectó en la primera recolección (27% de rendimiento de sal de diazonio) . No cristalizo una porción: este aceite se trituró con MeOH y Et20 para proporcionar 3.6g de 5-80; otra precipitación del licor madre proporcionó 6.23g adicionales del producto deseado 5-80. Total: 117.0+3.6+6.23 = 126.83. 30.4%). De rendimiento durante 3 etepa (decomposición de sal de diazonio; deprotección y nitración) . Datos analíticos de cuaderno: 53877-115: -"? RMN(d, MeOD) : 8.56-8.27 (dd, J= 7.5,3.3 Hz, 1H) , 8.01 (d, J=3.3 Hz, 1H) ; CL/EM (M+l)+ = 158.9; temperatura ambiente = 0.15 min. Nota: una porción de la solución ácidca acuosa se tomó y se neutralizó con Na2C03 hasta detener la efervescencia y luego esto se extrajo con AcOEt = un producto diferente se obtuvo. No hay producto deseado en estos extractos.

POBr3 ??WO' 1,°^ F??M?2 yy>H 77-97% y^* 5-80 I U,sa ,d.o s -in purificación 6-80 Un total de 117 g de 5-80 se dividió en 4 lotes de 30g x 3 y 27 g x 1 y se trató con POBr3 (3 equiv. ; 163g x 3 y 155 g x 1) y una cantidad catalítica de DMF (15 ml) a temperatura ambiente (DMF se agregó cuidadosamente => evolución del gas) . Después de 5 min. a temperatura ambiente, la soluciones se calentaron a 110 °C durante 3hr. El CL/EM mostró el material de partida que se consumió. La mezcla de reacción se permitió enfriar a temperatura ambiente. Las mezclas de reacción se colocaron en un baño de hielo; y luego se agregó hielo muy lentamente y cuidadosamente en porciones en el matraz, la evolución del gas fue debido a la formación de HBr; el líquido y el sólido oscuro que se formaron se vaciaron en una copoa con hielo. Se agregó EtOAc y la mezcla luego se extrajo varias veces con EtOAc. La capa orgánica se lavó con NaHC03 acuoso saturado; H20 y salmuera; se seo sobre Na2S04 y se filtró. El producto se secó en la bomba durante la noche para proporcionar 123g de 6-80 como un sólido café (77% de rendimiento) . Nota: La reacción se completó dentro de Ih. 2H RMN(d, CDC1) : 8.52 (m, 1H) , 7.93 (m, 1H) .

Bromuro de vinil magnesio en THF( Alfa, 0.8 hasta 1.0 M) 6; 800 ml de bromuro de vinil magnesio (1M en THF, Aldrich) se enfrió bajo -60°C con agitación vigorosa bajo N2. La 2-bromo-5-fluoro-3-nitro piridina (43.3g, 0.196 mol) en 200ml THF se agregó gota a gota por medio de una embudo de adición tal como una porción que se mantuvo debajo de -60°C. Esto tomó ~ 1.25 hr. La mezcla de reacción se calentó a -40 hasta -50 °C y se agitó durante 1 hr más. Luego 1L de NHC1 acuoso saturado se agregó lentamente y cautelosamente. Primero, ocurrió un espumado y luego se presenta un sólido considerable, pero esto se disolvió esencialmente cuando la adición se completó y el material se calentó a temperatura ambiente. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo 3 veces con acetato de etilo. Los extractos orgánicos se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2S0 , se filtraron y se concentraron para proporcionar ~ 50g de un sólido gomoso negro. CLAR indicó 57 -58% del producto. A esto se agregó CH2C12 y el sólido se colectó por filtración y se lavó con CH2C12 para proporcionar 12.5g del producto como un sólido café. La reacción se repitió exactamente en la misma escala y se preparó de la misma manera. De la trituración del CH2C12 se obtuvo 12.4g del Precursor 2i (CLAR - 97% puro) . El crudo se recuperó y se permitió mantener en diclorometano. Durante el reposo 3.6 g del producto adicional se separó y se recuperó por filtración. Rendimiento total = 29.5g (35%). XH RMN (d, CDC13) : 8.69 (bs, 1H) , 7.92 (d, J= 1.8 Hz, 1H) , 7.41 (m, 1H) , 6.77 (m, 1H) ; CL/EM (M+l)+ = 216.-217.9; temperatura ambiente = 1.43 min.

Cromatograf iado, relación de isómero -1:1 La reacción se llevó a cabo en un matraz de 250ml (el espumado ocurrió durante el calentamiento y el matraz de tamaño grande es más conveniente) . Una mezcla del precursor 2i (3g, 13.95mmol), 1,2,3-triazol (15g, 217.6 mmol, 15eq) , K2C03 (1.9g, 13.95mmol, leq) y Cu(0) (0.9g, 13.9mmol, leg) se calentó a 160°C durante 7 hr (de temperatura ambiente a 160°C total 7 hr) bajo N2 (dependiendo en el lote Cu (O) , el tiempo de reacción puede variar desde 2hr hasta 7hr) . La mezcla resultante se diluyó con MeOH, se filtró a través de un papel filtro (para remover el cobre) . Se lavó con MeOH (20 ml) y agua (30 ml) . El filtrado se concentró (remover el solvente en un rotoevaporador) y se diluyó con acetato de etilo. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El residuo se disolvió en MeOH (20 ml) , 7-80 (750 mg) se cristalizo del metanol como un sólido blanco y se colectó por filtración, (volumen de gradiente bajo, gel de sílice hex/AcOEt (0 —> 18%) de licores madre usualmente proporcionar de 5-10% más de 7-80. XR RMN (d, CDC1) : 10.47 (bs, 1H) , 8.76 (s, 1H) , 7.94 (s, 1H) , 7.89 (s, 1H), 7.53 (m, 1H) , 6.78 (m, 1H) ; CLEM (M+l)+ = 204; temperatura ambiente = 1.29 min.

Cromatografiado, relación de isómero -1:1 El cloruro de etil metilimidazolio (4.3g, 29.6 mmol, 3eq) se colocó en un matraz de 250ml. Se agregó AICI3 (11.8g, 88.6mmol, 9 eq.) en el matraz en una porción. Una suspensión líquida se formó (algo de A1C13 s quedó como sólido) . Después de agitarse durante 5-10 min. El compuesto (1) (2.0g, 9.85mmol) se agregó en una porción seguida por una adición baja (por medio de una jeringa) de clorooxalacetato de etilo (3.3 ml, 29.6 mmol, 3eq) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 hr. El CLEM indicó el compuesto 8-80: compuesto 7-80 = 6:2. (El Compuesto I tiene una absorción UV) La reacción se apagó por adición cuidadosa de agua con hielo (~75 ml) a 0°C. Un sólido amarillo se precipitó a este punto. La suspensión resultante se filtró y el sólido se lavó con agua. El MeOH y acetato de etilo (para remover el SM que no reacciona) y el sólido se secó al aire. (CLEM pureza 70% -80%) 2g del sólido contiene 8-80 se obtuvo y se tomó para la siguiente etapa sin purificación adicional. CLEM (M+l)+ = 276; temperatura ambiente = 0.97 min.

Una mezcla del compuesto 8-80 (4.9g, 17.8 mmol) y clorohidrato de N-benzoilpiperazina 8a-80 (sal HCl; 6.0g, 26.7mmol, 1.5eq) en DMF (30 ml) se agitó a temperatura ambiente durante la noche (16 hr) . Una pasta espesa se formó, se agregó 20ml de DMF adicional en la pasta espesa. Luego se agregó HATU (12.2g, 26.7mmo, 1.5eq) seguido por DMAP (4.3g, 35.6 mmo, 2eq) . La mezcla de reacción se agitó durante 30 min. El CLEM indicó que el material de partida 8-80 se completo para convertir a el producto (EJEMPLO 216) . La mezcla resultante se filtró y el sólido se lavó con agua. El filtrado se concentró in vacuo. Se agregó agua a el residuo y el sólido se colectó por filtración. Los sólidos se combinaron y se lavaron con agua, MeOH y EtOAc. Luego el sólido se secó al aire. CLEM y CLAR mostró BMS-585248, >99% puro. El producto sólido se purificó además por precipitación y cristalización en 5-10% de CH30H/CHC13.

Purificación de IVb El compuesto crudo IVb obtenido como arriba (15.3g) se disolvió en 10% de MeOH/CHCl3 (600 ml) . Una suspensión café ligera se formó, se filtró a través de un papel filtro y se lavó con MeOH dos veces. El sólido café se descartó (~1.2g). El compuesto IVb se cristalizó en el filtrado, el sólido se colectó por filtración y el sólido blanco se secó al aire. El filtrado se usó para repetir la cristalización varias veces. El sólido obtenido de cada filtración se analizó por CLAR.

Todas las fracciones puras se combinaron. Las fracciones que no son puras fueron sujetas a cristalización con MeOH & CHCI3. Un total de 12.7g del compuesto IVb se obtuvo de la recristalización y la precipitación. El licor madre se concentró y se purificó en columna de gel de sílice (EtOAc, luego CHCl3/MeOH (0-2%) ) para proporcionar 506 mg del producto) como un sólido blanco. XH RMN (d, DMSO) 13.1 (bs, 1H) , 9.0 (s, 1H) , 8.4 (s, 1H) , 8.3 (s, 1H), 8.2 (s, 1H) , 7.4 (bs, 5H) , 3.7 (bs, 4H) , 3.5 (bs, 4H) ; EM m/z 448 (MH) . Análisis calculado para C22H?8FN703; C 59.05, H 4.05, N 21.91, F 4.24. Encontrado; C 57.28, H 4.14, N 21.22; F 4.07%.

Ejemplos 1-4: preparación de los profármacos I de los compuestos precursores IV Esquema de Reacción sintético para los Ejemplos 1-4 IVa 3) agua,NaHC03, la cromatografía IVd Id Ejemplo I Preparación de la IVa la Procedimiento : Una suspensión de IVa (211 mg, 0.5 mmol) en THF (2 ml; Sure Seal) bajo una atmósfera de N2 anhidro, se trató con NaH (86 mg, 2.2 mmol; 4.4 eq.; 60% aceite de dispersión) . Después de algunos minutos de agitación a temperatura ambiente, se agregó bis-t-butil clorometil fosfato (782 mg, 3.0 mmol; preparación, ver patente de E.U.A. 6,362,172) y la mezcla se agitó durante 1-5 días, se monitoreó que se completó la reacción por CLAR (puede requerirse 1-2 eq. adicionales de cada NaH y el fosfato que pueden requerirse para llevar la reacción a casi completar) . Después de que el material de partida se consumió, la mezcla se concentró in vacuo hasta secarse y el residuo, el cual se apareció para ser una mezcla de índole mono- y bis-t-butil fosfato N alquilado, se disolvió en CH2C12 (5 ml) se trató con TFA (5 ml) a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla se concentró in vacuo y el residuo se purificó por fase inversa de gel de sílice C-18, se eluyó con CH3CN al 5-10% en agua contiene NaHCÜ3, para obtener 75 mg (0.13 mmol; Y. 26 %) del compuesto del título la como un polvo blanco opaco (sal de disodio) : CLAR >99% (AP a 254 nm) ; CL/EM (ESI+) m/z 533 (M+H minus 2Na)+; HRMS (ESI) m/z calculado para C23H26N409P (M+H minus 2Na)+ 533.1437, encontrado 533.1426 (?-2.1 ppm); XH RMN (D20, 500 MHz) d ppm 3.51 (2H, m) , 3.67 (2H, m) , 3.73-3.79 (2H, m) , 3.89-3.95 (2H, m) , 3.94, 3.95 (3H, 2s), 4.05, 4.07 (3H, 2s), 6.02-6.04-6.05-6.07 (2H, ABq. ) , 7.43, 7.44 (1H, 2s), 7.45-7.56 (5H, m) , 8.49, 8.52 (1H, 2s) . Usando un procedimiento y condiciones similares, Ib, se preparó a partir de IVb. Ic e Id se prepararon a partir de IVc, y IVd, respectivamente, pero en lugar de la solución de bicarbonato de sodio se utilizó en al purificación.

Ej empl o 2 Ib Ib: De rendimiento 13% (sal de disodio); CLAR >96% (AP a 254 nm) ; LC/EM (ESI+) m/z 558 (M+H minus 2Nat)+; 1H RMN (D20, 500 MHz) d ppm 3.59 (2H, m) , 3.70-3.84 (4H, m) , 3.93-3.95 (2H, m) , 5.28-5.29-5.30-5.32 (2H, ABq.), 7.4-7.6 (5H, ) , 8.09, 8.10 (1H, 2s) , 8.34, 8.36 (1H, 2s) , 8.59, 8.61 (1H, 2s) , 8.72, 8.75 (1H, 2s) . Ej empl o 3 le le: De rendimiento 37% (forma acida. El agua se usó en lugar de bicarbonato de sodio acuoso durante la purificación; CLAR >98% (AP a 254 nm) ; LC/EM (ESI+) m/z 584 (M+H); XH RMN (DMS0-d6, 500 MHz) d ppm 2.40 (3H, g) , 3.44 (4H, br.s), 3.66 (4H, brs), 4.04 (3H, g) , 5.79 (1H, g) , 5.82 (1H, g) , 7.46 (5H, brs), 8.07 (1H, g) , 8.41 (1H, s) , 8.88 (1H, s) . Ejemplo 4 Id Id: De rendimiento 7% (forma acida) . El agua se uso en lugar de bicarbonato de sodio acuoso durante la purificación; LC/EM (ESI+) m/z 597 (M+H); XH RMN (DMS0-d6, 500 MHz) d ppm 1.16, 1.21 (3R, 2d, J = 6.5 Hz) , 2.29 (3H, s) , 2.3-4.5 (7H, m) , 4.00, 4.01 (3H, 2s) , 5.79-5.85 (2H, m) , 6.36 (1H, t, J = 2 Hz), 7.42-7.47 (5H, m) , 7.99 (1H, s) , 8.08, 8.09 (1H, 2s) , 8.34, 8.44 (1H, 2s) .

Ejemplo 5 Preparación de lea , (sal de disodio) Procedimiento general : Una suspensión de IVc (0.24 g, 0.5 mmol) en THF anhidro (4 ml) bajo una atmósfera de nitrógeno se trató con hidruro de sodio (60% de aceite de dispersión, 0.08 g, 2.0 mmol), y se agitó hasta que se detuvo la evolución del gas (aproximadamente 5 minutos) . La mezcla de reacción se trató con yoduro (0.13 g, 0.5 mmol) y se agitó durante 2-3 minutos seguido por la adición de di-tert-butil clorometil fosfato (1.6 g, 6.0 mmol, crudo) . Una corriente de nitrógeno se permitió pasar durante la reacción para facilitar el remover mucho o todo el THF. La mezcla de reacción se agitó durante la noche. El análisis CLAR del crudo indicado de partida IVc (ca. 56%) y el producto deseado (ca. 32%) . Varias mezclas de reacción crudas (un total de 6.7 mmol basados en el material de partida IVc) se redisolvieron en diclorometano, se combinaron, se concentraron in vacuo para remover cualquier THF remanente. El residuo se suspendió en diclorometano y TFA (1:1, aproximadamente 40 ml de volumen total) . La mezcla se agitó durante 1.5 - 2 horas y luego el solvente se removió in vacuo. El residuo se suspendió en diclorometano y se extrajo en agua (aproximadamente 60 ml) se hizo básico semanalmente con bicarbonato de sodio acuoso o sólido. La capa acuosa se redujo en un volumen por evaporador rotatorio si se requiere y la solución se cargó en una columna de fase inversa C-18 (aproximadamente 80 g de C-18, YMC ODS-Aq, 50 mieras) y se eluyó con agua, seguido por agua que contiene acetonitrilo al 2.5%. Las fracciones que contienen el producto puro se vaciaron y el solvente orgánico se removió por evaporador rotatorio. El producto purificado se recupero después de la liofilización para dar 1.00 g (1.30 mmol, 19% durante 2 etapas) del compuesto del título lea (sal de disodio) como un polvo blanco opaco: puresa CLAR >99% AP a 254 nm (gradiente 0-100% B/A; A 10% CH3CN-90% H2O-0.1 % TFA, B 90% CH3CN-10% H2O-0.1 % TFA, tiempo de gradiente 4 min, columna YMC ODS-Aq 4.6x50mm 3 micron) ; EM-ESI- m/z 482 (M-H minus 2Na)~; HRMS (ESI) m/z calculado para C25H27N708P (M+H minus 2Na)+ 584.1659, encontrado 584.1651 (? -1.3 ppm); XH RMN (D20, 500 MHz) d ppm 2.53, 2.54 (3H, 2s) , 3.56 (2H, s, CH2N) , 3.72 (2H, br.s, CH2N) , 3.78, 3.83 (2H, 2br.s, CH2N) , 3.94, 3.96 (2H, 2br.s, CH2N) , 4.14 (3H, s, CH30) , 5.38, 5.40 (2H, 2d, J=llHz), 7.45-7.59 (5H, m, Ar-Hs) , 8.07, 8.09 (1H, 2s, indol-H-5), 8.64, 8.67 (1H, 2s, indol-H-2), 8.87, 8.89 (1H, 2s, triazol-H-5) ; 13C-RMN (125.7 MHz, D20) d ppm 15.43 (N-Me) , 44.03, 44.47, 44.66, 45.05, 48.20, 48.82, 49.60, 50.23, 59.78 (OMe), 75.81 (NCH20) , 115.6, 126.0, 127.2, 129.6, 131.0, 131.7, 132.1, 133.5, 136.8, 147.6, 150.1, 154.2, 164.8, 170.4, 175.8, 189.2; UV (H20) ?max 220 nm (e 3.91xl04), 249 nm (e 2.00xl04) , 303 nm (e 1.60xl04); análisis calculado para C25H2 N708PNa2. 8H20. 0.2NaHCO3; C 38.39, H 5.14, N-12.44, P 3.93, Na 6.42 Encontrado; C 38.16, H 4.81, N 12.43, P 3.72, Na 6.05; KF (H20) 17.3%. Se colectaron fracciones menos puras para obtener 0.22 g (0.29 mmol, Y. 4%) del compuesto del título lea (sal de disodio) : puresa CLAR >95% (AP a 254nm) .

Ejemplo 6 Preparación de lab (sal de lisina hidratada) Etapa uno peso Mol.: 28T.68 2ßJ>, 100% rendimiento bis-t-butil clorometil fosfato 111, Z»tBU El éster de fosfato A (45. lg, O.lmol) y cloroyodometano B (200g, 1.14mol) se combinaron en lOOml de benceno y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas antes el benceno se removió bajo vacío. Luego, se agregó 500ml de etil éter a el residuo y el sólido insoluble se filtró continuamente. La concentración del filtrado proporciono bis-t-butil clorometil fosfato, el cual se utilizó en la siguiente etapa sin cualquier purificación. Etapa dos Se agregó NaH (2.4g, 60% en aceite) lentamente en una suspensión de IVa en THF seco (120ml) y la mezcla se permitió agitar durante 1 hora a temperatura ambiente. El yoduro (5g) se disolvió en THF seco (lOml) se agregó lentamente en la solución agitada. Después de completar la adición, la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos adicionales y luego el compuesto bis-t-butil clorometil fosfato, se obtuvo de la etapa uno, se agregó. Después de agitarse durante 16 horas, la mezcla de reacción se vació en agua con hielo (120ml) , seguido por extracción con EtOAc (3 x 300ml) . Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (100 ml) y luego salmuera (lOOml) , se secaron sobre Na2S04, y se concentraron bajo vacío para proporcionar un residuo, el cual se purificó por cromatografía de gel de sílice (elución con EtOAc/Et3N (100/1) y luego EtOAc/MeOH (100/1)) para dar diéster lia en rendimientos de 70 - 80%. Etapa tres Una solución mezclada de TFA (50ml) y diclorometano (450ml) se agregó en un matraz de fondo redondo que contiene 43.3g de diéster lia. Después de agitarse a temperatura ambiente durante 16 horas, la mezcla de reacción se concentró bajo vacío para presentar un residuo de lac el cual se usó en etapas adicionales sin cualquier purificación.

Etapa cuatro Los 55g del producto crudo lac se agregaron a una solución acuosa de L-lisina (1.36M, 70 ml) a temperatura ambiente. La suspensión resultante (pH=1.83) se agregó a una solución de lisina (1.36 M, ~40 ml) a un pH 4.88. La suspensión resultante se filtró a través de una almohadilla de Celite. El filtrado amarillo ligero claro (~200 ml) se mezcló con acetona (200 ml) y se calentó a 45°C. Se agregó acetona (1400 ml) durante 2h a 45°C. La solución clara se sembró y se agitó a 45 °C durante 2h, y se enfrió lentamente a temperatura ambiente (5h) y la suspensión se agitó durante la noche. El sólido blanco se colectó por filtración y se secó bajo alojamiento al vacío a 50°C durante 24 h para proporcionar 41.2 g de lab como un sólido blanco opaco. El sólido de arriba se disolvió en 1:1 agua-acetona (560 ml) a 45°C. Se agregó acetona (700 ml) durante un periodo de lh a 45°C. La solución clara se selló y se agitó a 45°C durante 2h. Se enfrió lentamente a temperatura ambiente (5h) y la suspensión se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El sólido blanco se colectó por filtración y se secó bajo alojamiento al vacío a 50°C durante 36 h para proporcionar 33 g de G como un sólido blanco opaco. El AP fue >99% por CLAR. XH RMN (500 MHz, D20) d 8.42 (s, 1/2H) , 8.39 (s, 1/2H) , 7.52 (m, 6H) , 6.12 (m, 2H) , 4.07 (s, 3H) , 3.93 (m, 5H) , 3.72 (m, 3H) , 3.67 (m, 2H) , 3.52 (m, 2H) , 3.05 (m, 2H) , 1.93 (m, 2H) , 1.74 (m, 2H) , 1.50 (m, 2H) ; EM m/z: (M+H-lisina) + calculado para C23H26N409P 533.14, encontrado 533.03. M.P. 166.7 hasta 172.2 grados. Usando -"? RMN comparativa, integración de varios picos diferentes, el rango de lisina a IVa se calculó en rangos desde 1.05:1 hasta 1.2:1 equivalentes de lisina para un profármaco precursor. La forma de sal se determina para ser un hidrato. Con base en DSC (calorimetría de exploración de difracción) y TGA (análisis de gravedad térmico), el agua se observó que contiene 2.80%. El calculo teórico para un monohidrato es 2.58%. Así, la relación de agua para la molécula precursora en el hidrato puede ser en el ragno de 1:1 hasta ~ 1.5:1.

Ej empl o 7 Preparación del cristalino le (mono-hidrato del ácido libre) ñ ->ßu — , I TFA/CH,C% Ift R . H — * i cristalización monohidrato le cristalino A una mezcla de IVc (600 mg, 1.27 mmol) en THF anhidro (10 ml) en un enfriamiento sobre un matraz de fondo redondo bajo un nitrógeno a temperatura ambiente. Se agregó NaH (153 mg, 6.38 mmol, polvo seco, 95%), y la suspensión blanca se agitó hasta que no se observó la evolución del gas. La mezcla luego se agregó I2 (375 mg, 1.48 mmol), y se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. A la mezcla de reacción se agregó NaH (153 mg, 6.38 mmol, polvo seco, 95%), y la mezcla se agitó durante alrededor de 5 hasta 10 min. El clorometil di-tert-butil fosfato crudo (2.0 g, alrededor de 1.6 ml, 7.79 mmol) se agregó a la mezcla, la cual luego se agitó a temperatura ambiente durante 15 h. El análisis CLEM de la reacción se mostró a >97% de la conversión del material de partida. Después de la evaporación de los volátiles, el residuo se agregó CH2C12 (10 ml) , se enfrió en un baño de agua con hielo, se agregó lentamente TFA (10 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. La mezcla de reacción luego se evaporó, y el residuo se dividió entre CH2C12 (50 ml) y H20 (50 ml) . La capa CH2C12 se vació en el matraz de reacción que continuo sin disolver el sólido café, y esta mezcla se extrajo con una solución de NaHC03 acuosa diluida (50 ml) . La mezcla acuosa se purificó por CLAR preparativa de fase inversa (solvente A: 10% MeOH-90% H2O-0.1 %TFA; solvente B: 90% MeOH-10% H2O-00.1 %TFA; comienzo %B = 0, final %B = 100; tiempo de gradiente = 6 min; relación de flujo = 45 ml/min; columna: phenomenex-Luna 30 x 50 mm, S5; fracción colectada: 3.65 hasta 4.05 min). Las fracciones colectadas se evaporaron hasta secarse, y el residuo se secó bajo alto vacío para obtener el ácido le como un sólido amarillo pálido (356.6 mg) ; 1H RMN: (500 MHz, CD3OD) d 9.05 (s, 1H) , 8.46 (s, 1H, ) , 8.04 (s, 1H) , 7.47 (b s, 5H) , 5.93 (d, J = 12, 2H) , 4.10 (s, 3H) , 4.00-3.40 (b s, 8H) , 2.53 (s, 3H) ; 1F RMN el análisis mostró que el material contenido residual es TFA, (el porcentaje no se cuantificó) ; Método CLAR analítico: Comienzo %B = 0, Final %B = 100, tiempo de gradiente = 2min, Relación de flujo = 5 ml/min, Columna: Xterra EM C18 7u 3.0x50mm, CL/EM: (ES+) Jz (M+H)+ = 584, CLAR Rt = 0.983. 172.2 mg del ácido purificado le se disolvió en 1 ml de H20 y se agregó luego alrededor de 0.3 ml de EtOH absoluto (200 proof) . La mezcla se dejó en reposo en un refrigerador (temperatura alrededor de 3°C) durante la noche, después de este tiempo, el material cristalino se observó. La mezcla luego se calentó a temperatura ambiente, se diluyó con H20 a un volumen de 3 ml, y luego se agregó 20 ml de MeCN lentamente. Después de que la adición se completó, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h y luego se filtró. El sólido colectado (90 mg) se secó in vacuo, y luego bajo alto vació. Este material se mostró por estudios de rayos X en polvo para hacerce cristalino; Análisis elemental calculado para C25H26N708P»H20: C 49.92; H 4.69; N 16.30; se observo: C 49.66; H 4.62; N 15.99; pf = 205°C (medido por calorimetría de barrido diferencial) . El patrón 1H RMN para material cristalino se compara con el del ácido purificado y ambos son consistentes con la estructura.

Ejemplo 8 Preparación de lab (sal de mono L lisina) : fosfato diácido de (3- [ (4-benzopiperazin-l-il) (oxo) acetil] -4 , 7-dimetoxi-lH-pirrolo [2 , 3-c]piridin-l-il}metilo, sal de L lisina (1 : 1) . La secuencia de reacción se describe en el esquema del ejemplo 8.

Esquema del ejemplo 8 lab Preparación del di-tert-butil clorometil fosfato La sal de tetrabutilamonio de bis-tert butil fosfato (45.1, g, 0.1 mol) y cloroyodometano (200 g, 1.14 mol) se combinaron en 100 ml de benceno y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas y luego se removió el benceno bajo vacío. Una porción de 500 ml de etil éter se agregó a el residuo y el sólido insoluble se filtró continuamente. La concentración del filtrado in vacuo y el removido de los volátiles en una bomba al vacío proporcionó di-tert-butil clorometil fosfato, como un aceite amarillo ligero o café ligero el cual se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional.

Preparación de lia : (3- (2- (4-benzoilpiperazin-l-il) -2-oxoacetil) -4 , 7-dimetoxi-lH-pirrolo [2 , 3-c]piridin-l-íl) metil di-tert-butil fosfato Se agregó NaH (2.4 g, 60 mmol, 60% en aceite) lentamente a una suspensión de (8.4 g, 20 mmol), IV en THF seco (120 ml) y la mezcla se permitió agitar 1 horas a temperatura ambiente. El yodo (5 g, 20 mmol) se disolvió en THF seco (10 ml) se agregó lentamente y cuidadosamente a la solución agitada a un rango para mantener el espumado bajo control. Siguiendo con el término de la adición, la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos adicionales y luego el ~0.1 mol de di-tert-butil clorometil fosfato, se obtiene como se describe en la etapa uno, se agregó. Después de agitarse durante 16 horas, la mezcla de reacción se vació en hielo NHOAc (30%) (120 ml) , seguido por la extracción con EtOAc (3 x 300 ml) . Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (100 ml) y luego salmuera (100 ml) , se secaron sobre Na2S04, y se concentraron in vacuo para proporcionar un residuo, el cual se purifico por cromatografía de . gel de sílice (elución con EtOAc/EtN (100/1) y luego EtOAc/MeOH (100/1) para dar el diéster lia (9.0-10.3 gs, AP ~ 75%) como un sólido amarillo ligero en rendimiento de 70-80% durante varias corridas. XH RMN (500 MHz, CDC13) d 8.09 (s, 1H) , 7.48 (s, 1H) , 7.40 (b, 5H) , 6.15 (d, 2H, J = 11.5 Hz) , 4.05 (s, 3H) , 3.90 (s, 3H) , 3.90-3.30 (b, 8H) , 1.39 (s, 18H) ; 13C RMN (125 MHz, CDCI3) d 185.5, 170.7, 166.5, 146.9, 146.2, 139.6, 135.3, 130.2, 128.7, 128.4, 127.2, 124.5, 122.0, 120.8, 115.8, 83.8, 73.2, 57.3, 53.5, 46.1, 41.7, 29.8; EM m/z (M+H)+ calculado para C3?H42N409P 645.27, encontrado 645.10.

Preparación de lab: fosfato diácido de {3- [ (4- benzoilpiperazin-1-il) (oxo) acetil] -4 , 7-dimetoxi-lH~ pirrólo [2, 3-c]piridin-l-il}metilo, sal de L lisina (1 : 1) 500 mg de diéster lia se disolvieron en una mezcla de agua (3 ml) y acetona (3 ml) . La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 16 horas para permitir que la solvólisis se alcance a completar. A esta mezcla de reacción (~69 AP) se agregó una solución de lisina acuosa 4M para ajusfar el pH a 4.83. Se agregó acetona (35 ml) lentamente en la mezcla de reacción en 30 min., a 45-50°C. A 45°C, la solución clara se sembró con lab cristalino y se mantuvo agitando a esta temperatura durante 45 min. Después de que se completó la adición de acetona, la solución se enfrió a temperatura ambiente en 4horas y la cristalización de lab se completó durante la noche. El sólido se colectó por filtración y succión bajo nitrógeno durante 2 horas. El sólido cristalino blanco se secó bajo vacío local a 50-55 °C durante 24 h para proporcionar 343 mg del lab. El lab obtenido en la operación de arriba: XH RMN (500 MHz, CD3OD) d 8.38 (s, 1H), 7.49 (m, 6H) , 6.13 (d, 2H, J=10.5 Hz) , 4.06 (s, 3H) , 3.92 (s, 3H), 4.00-3.40 (m, 8H) , 3.58 (t, 1H, J=6 Hz) , 2.92 (t, 2H, J=7.5 Hz), 1.90-1.40 (m, 6H) ; 13C RMN (125 MHz, CD30D) d 186.1, 173.2, 171.8, 167.8, 147.4, 146.4, 141.0, 135.4, 130.4, 128.8, 127.2, 124.6, 122.3, 120.2, 114.6, 73.2, 56.6, 54.7, 53.1, 46.0, 41.6, 39.2, 30.5, 27.0, 22.0. HREM m/z (M-lisina+H) + calculado para C23H26N409P 533.1437, encontrado 533.1437. análisis calculado C, 51.32; H, 5.79; N, 12.38; P, 4.56; encontrado: C, 48.54; H, 5.32; N, 11.76; P, 4.04. Punto de ebullición 170 °C. Obtenido por medio de otro proceso (hidrólisis con TFA en cloruro de metileno), lab es un hidrato 1.70 molar y sal de lisina 1.14 molar. XH RMN (500 MHz, D20, 60°C) d 8.72 (s, 1H) , 7.84 (m, 6H) , 6.44 (d, 2H, J=10 Hz), 4.41 (s, 3H), 4.27 (s, 3H) , 4.3-3.7 (m, 8H) , 4.10 (t, 1H, J=5 Hz), 3.39 (t, 2H, J=5 Hz) , 2.30-1.80 (m, 6H) ; 13C RMN (125 MHz, L^O, 27°C) d 186.7, 174.9, 173.2, 167.9, 147.7, 145.7, 142.6, 134.3, 131.1, 129.2, 127.1, 124.3, 122.4, 120.1, 113.8, 73.5, 57.1, 54.9, 54.4, 47.7, 47.1, 46.3, 45.7, 42.6, 42.1, 42.0, 41.5, 39.5, 30.2, 26.8, 21.8. HREM m/z: (M-lisina+H) + calculado para C23H26N409P 533.1437, encontrado 533.1425. análisis calculado para C, 49.11; H, 6.13; N, 12.05; encontrado: C, 48.93; H, 6.26; N 12.07. P. F. 168-172°C. Ejemplo 9 Preparación de Ibb (sal de mono L lisina) : fosfato diácido de [3-[ (4-benzopiperazin-1-il) (oxo) acetil] -4-fluoro-7- (1H-1 ,2 ,3-triazol-l-il) -1H-pirrolo[ 2, 3-c]piridin-l-il] metilo, sal de L lisina (1 :1) . La secuencia de reacción se describe en el esquema del ejemplo 9. Esquema del ejemplo 9 a Iba Preparación de di-tert-butil clorometil fosfato La sal de tetrabutilamino de bis-tert butil fosfato (57 g, 0.126 mol, Digital Specialty Chemicals) y cloroyodometano (221 g, 1.26 mol) se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas y luego los volátiles se removieron in vacuo. 500 ml de etil éter se agregó a el residuo y el sólido insoluble se filtró continuamente. La concentración del filtrado y el removido final de los volátiles usando una bomba al vacío proporcionó di-tert-butil clorometil fosfato (112 g) , típicamente como un aceite amarillo ligero o café, el cual se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Preparación de Ilb: (3- (2- (4-benzoilpiperazin-l-il) -2-oxoacetil) -4-fluoro-7- (1H-1 ,2 , 3-triazol-l-il) -lH-pirrolo [2 ,3-c]piridin-l~il) metil di-tert-butil fosfato llb Se agregó NaH (5.65 g, 95% de dispersión en un aceite mineral, 0.224 mol) lentamente en una suspensión de IVb (20 g, 44.7 mmol) en THF seco (400 ml) y la mezcla se permitió agitar durante 0.5 horas a temperatura ambiente. Una solución de yoduro (11.3 g, 44.5 mmol) se disolvió en THF seco (20 ml) se agregó lentamente en la solución agitada a un rango para cuidar la reacción para que no se violente. La mezcla resultante se agitó durante 3 horas adicionales antes de que se introduzca una segunda porción de NaH al 95% (5.65 g, 0.224 mol) . Después de 15 minutos a temperatura ambiente, el di-tert-butil clorometil fosfato, (112 g) , obtenido en la etapa uno, se agregó en una porción. Después de agitarse durante 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se vació en hielo NH4OAc (30%) (200 ml) y luego se extrajo con EtOAc (3 x 500 ml) . Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (200 ml) y luego salmuera (200 ml) , se secaron sobre Na2S04, y se concentraron bajo vacío para proporcionar un residuo, el cual se purificó por cromatografía de gel de sílice (elución con EtOAc/MeOH/Et3N (100/1/1) para dar 15.0 gs (43% de rendimiento corregido por AP al 85%) de diéster Ilb como un sólido amarillo ligero. 1H RMN (500 MHz, CDC13) d 8.36 (s, 1H) , 8.25 (s, 1H) , 8.21 (s, 1H) , 7.88 (s, 1H) , 7.41 (b, 5H) , 5.90 (d, 2H, J=14.5 Hz), 3.90-3.40 (b, 8H) , 1.23 (s, 18H) ; 13C RMN (125 MHz, CDC13) d 182.9, 170.7, 165.1, 154.6, 152.5, 144.1, 135.1, 134.0, 131.9, 130.3, 128.7, 128.3, 127.2, 125.9, 124.3, 114.0, 84.1, 74.1, 46.2, 41.9, 29.6; HREM m/z (M+H)+ calculado para C3?H38FN707P 670.26, encontrado 670.34.

Preparación de Ibb (sal de mono L lisina) : fosfato diácido de [3- [ (4-benzoilpiperazin-l-il) (oxo) acetil] -4-f luoro-7- (1H- 1 ,2 ,3-triazol-l-il) -IH-pirrolo [2 ,3-c]piridin-l-íl]metilo, sal de L lisina (1:1) Ibb El diéster Ilb (27 g) se disolvió en una mezcla de agua (55 ml) y acetona (55 ml) . La mezcla resultante (pH: no se determino) se agitó a 40 °C durante 16 horas hasta completar la solvolisis. A esta mezcla de reacción se agregó una solución de lisina acuosa 4M para ajusfar el pH a 3.51. Se agregó EtOH (500 ml) en la solución y el matraz se recubrió con algún producto después de la noche. La solución clara luego se transfirió a otro matraz y se agregó EtOH (1500 ml) lentamente a la mezcla de reacción en ~ 3h. Después de completar la adición de etanol, la solución se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas y el sólido resultante (Ibb) se colectó por filtración y se enjuagó con etanol. El sólido cristalino blanco se secó bajo vacío local a 55°C durante 24 horas para proporcionar 10.92 g de Ibb (98 AP) . Este sólido se mezcló además con 12.5 g de la sal obtenida de otras operaciones en 70 ml de agua. El EtOH (1000 ml) se agregó luego y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. El sólido se colectó por filtración, se enjuagó con EtOH (2 x 80 ml) y se secó bajo vacío local a 50 °C bajo una atmósfera de nitrógeno durante 44 horas para proporcionar 21.5 g de Ibb en AP de 98.7. El Ibb obtenido en el procedimiento de arriba fue sal de lisina ~1 molar con 1.12% de agua, 0.8% de TFA y 0.05% de etanol. ?H. RMN (500 MHz, CD3OD, 50°C) d 8.94 (s, 1H) , 8.87 (s, 1H) , 8.69 (s, 1H) , 8.42 (s, 1H) , 7.83 (m, 5H) , 5.81 (d, 2H, J=12.5 Hz), 4.30-3.70 (m, 8H) , 4.08 (t, 1H, J=6.5 Hz) , 3.67 (t, 2H, J=10 Hz), 2.26 (m, 2H) , 2.07 (m, 2H) , 1.88 (m, 2H) ; 13C RMN (125 MHz, D20, 30°C) d 185.2, 174.9, 173.3, 166.8, 153.1, 146.8, 134.8, 134.3, 131.3, 131.1, 130.3, 129.3, 128.9, 128.7, 128.5, 127.2, 124.2, 112.6, 74.0, 54.9, 47.9, 47.2, 46.4, 45.9, 42.7, 42.2, 42.0, 41.7, 39.5, 30.3, 26.8, 21.8. EM m/z (M-lisina+H) + calculado para C23H22FN707P 558.1302, encontrado 558.1293. análisis calculado C, 48.75; H, 5.07; N, 17.63; P, 4.33; encontrado: C, 49.02; H, 4.90; N, 17.90; P, 4.37. P.F. 193°C. pKa (potenciométrico) 6.1, 9.1.

Ejemplo 10 Preparación de Icb (sal mono trometamina) : fosfato diácido [3- [ (4-benzoilpiperazin-l-il) (oxo) acetil] -4-metoxi-7- (3-metil-lH-1 , 2 , 4-triazol-l-il) -IH-pirrolo [2 , 3-c] piridin-1-il] metilo , sal 2-amino-2- (hidroximetil) propano-1 ,3-díol (1 : 1) . La secuencia de reacción se describe en el esquema del ejemplo 10.

Esquema del ejemplo 10 leb Preparación del di-tert-butil clorometil fosfato Una mezcla de tetrabutilamonio di-tert-butil fosfato (57 g, 0.126 mol, Digital Specialty Chemicals) y cloroyodometano (221 g, 1.26 mol) se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas antes de que los volátiles se removieran bajo vacío. 500 ml de etil éter se agregaron al residuo y el sólido insoluble se filtró continuamente. La concentración del filtrado in vacuo y el removido de los volátiles en una bomba al vacío proporciono di-tert-butil clorometil fosfato como un aceite café ligero o amarillo, el cual se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional . Preparación de lie: (3- (2- (5-benzoilpiperazin-l-il) -2-oxoacetil) -4-metoxi-7- (3-metil-lH-l ,2 , 4-triazol-l-il) -1H-pirrolo [2 , 3-c]piperidin-l-il) metil di-tert-butil fosfato Se agregó NaH (2.6 g, 10.3 mmol, 95% en aceite, 5 eq. ) lentamente en una suspensión de Ivc (10.0 g, 21.1 mmol) en THF seco (100 ml) y la mezcla se permitió agitar durante 0.5 horas a temperatura ambiente. Una solución de yoduro (5.27 g, 20.8 mmol) se disolvió en THF seco (10 ml) se agregó lentamente en una solución agitada a un rango para mantener el espumado bajo control o una reacción violenta. La mezcla resultante se agitó durante 3 horas adicionales a temperatura ambiente di-tert-butil clorometil fosfato, el lote entero de di-tert-butil clorometil fosfato, obtenido de la etapa uno, se agregó. Después de agitarse durante 16 horas, la mezcla de reacción se vació en hielo NH4OAc (30%) (120 ml) , seguido por extracción con EtOAc (3 x 300 ml) . Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (100 ml) y luego salmuera (100 ml) , se secó sobre Na2S04, y se concentró bajo vacío para proporcionar un residuo, el cual se purificó por cromatografía de gel de sílice (se eluyo con EtOAc/Et3N (50/1) y luego EtOAc/MeOH (100/1) para dar 8.0 g (-75% AP, ~41% de rendimiento) de diéster lie como un sólido amarillo ligero . 1H RMN (500 MHz, CD3OD) d 8.82 (s, 1H) , 8.41 (s, 1H) , 8.04 (s, 1H) , 7.47 (b, 5H) , 6.00 (d, 2H, J=14.5 Hz) , 4.10 (s, 3H) , 4.00-3.40 (b, 8H) , 2.49 (s, 3H) , 1.28 (s, 18H) ; 13C RMN (125 MHz, CD3OD) d 18.6, 176.4, 172.9, 168.0, 162.6, 152.6, 147.5, 144.0, 136.5, 131.5, 130.8, 129.9, 129.1, 128.3, 126.1, 124.0, 116.2, 85.8, 75.4, 61.6, 57.7, 30.1, 22.2, 13.7; HREM m/z (M+H)+ calculado para C33H43N708P 696.29, encontrado 696.34. Preparación de Icb (sal de mono L trometamina) : fosfato diácido de [3- [ (4-benzoilpiperazin-l-il) (oxo) acetil] -4-metoxi-7- (3-metil-lH-l ,2 ,4-triazol-l-il) -lH-pirrolo [2 ,3- c]píridin-l-il]metilo, sal de 2-amino-2- (hidroximetil) propano-1 , 3-diol (1 : 1) Icb leb 500 mg (~75 AP, 0.54 mmol) de diéster lie se disolvió en una mezcla de agua (2.5 ml) y acetona (2.5 ml) . La mezcla resultante se agitó a 40 °C durante 16 horas para completar la solvólisis. A esta mezcla de reacción se agregó una solución (mono trometamina) TRIS acuoso 3.0 M para ajusfar el pH a 3.32. La acetona (30 ml) se agregó lentamente a la mezcla de reacción en 1 hora. Después de completar la adición de acetona, la solución se agitó durante la noche para completar la cristalización de Icb. EL sólido se colectó por filtración y se enjuagó con 20:1 acetona-agua (2 x 5 ml) . El sólido cristalino blanco se secó bajo vacío local bajo una atmósfera de nitrógeno a 50 °C durante 24 h para proporcionar 290 gm de Icb (>98.5 AP) . *Después de agregarse alrededor de 15 y 20 ml de acetona, la mezcla resultante se sembró con Icb cristalino.

El Icb obtenido en la operación de arriba: 1H RMN (500 MHz, CD3OD) d 8.83 (s, 1H) , 8.52 (s, 1H) , 8.02 (s, 1H) , 7.49 (b, 5H) , 5.469 (d, 2H, J=13 Hz) , 4.11 (s, 3H) , 4.00-3.40 (m, 8H) , 3.66 (s, 6H) , 2.50 (s, 3H) ; 13C RMN (125 MHz, CD3OD) d 185.6, 171.9, 167.4, 161.4, 151.7, 146.9, 143.8, 135.4, 130.3, 129.7, 128.8, 127.2, 124.9, 122.6, 114.3, 73.5, 61.8, 59.9, 56.5, 46.0, 41.7, 12.6 HREM m/z: (M-trisamina+H) + calculado para C25H27N708P 584.1659, encontrado 584.1664. análisis calculado. C, 49.43; H, 5.29; N, 15.90; P, 4.39; encontrado: C, 49.18; H, 5.38; N, 15.59; P, 4.26. punto de fusión 203°C.

Obtenido por medio de otro proceso (hidrólisis con TFA en cloruro de metileno) , sal Icb es sal mono trometamina ~1 molar con 0.47% de agua, 0.1% de acetona y 0.05% de metanol. XH RMN (500 MHz, d6-DMSO, 30°C) d 8.77 (s, 1H) , 8.48 (s, 1H) , 8.00 (s, 1H) , 7.44 (b, 5H) ; 5.42 (d, 2H, J=15 Hz) , 4.02 (s, 3H) , 3.70-3.30 ( , 8H) , 3.41 (s, 6H) , 2.38 (s, 3H) ; 13C RMN (125 MHz, CDC13, 30°C) d 184.8, 169.0, 165.8, 160.3, 150.4, 146.2, 143.2, 135.4, 129.4, 128.9, 128.2, 127.7, 126.9, 123.2, 122.2, 112.9, 72.3, 60.7, 59.0, 56.7, 13.3 EM m/z (M- trisamina+H) + calculado para C25H27N708P 584.2, encontrado 584.0. análisis calculado. C, 49.11; H, 5.37; N, 15.76; P, 4.32; encontrado: C, 48.88; H, 5.28; N, 15.71; P, 4.16. P.F. 201-205°C.

Procedimiento general para formar sales de adición de lac Procedimiento A: 1.2 eq. de metal alcóxido se agregó en una solución de ácido fosfórico en THF y el precipitado se colectó como forma de sal.

Procedimiento B : 2.2 eq. (de Na, K) , o 1.2 eq. (de Mg) de metal alcóxido se agregó en una solución de ácido fosfórico en THF. Después de 2 horas, el solvente se evaporó y se agregó MeOH para proporcionar una solución clara. El EtOH o iPrOH luego se agregó en la solución hasta que se volvió turbia. Luego, se agregó MeOH cautelosamente a la solución para volver a aclararse nuevamente. La solución mezclada se dejó abierta al aire durante 16 horas y el precipitado resultante se colectó como la sal formada.

Procedimiento C: 2.2 eq. de amina se agregaron en una solución de ácidos fosfórico en THF. Después de 2 horas, el solvente se evaporó y se agregó MeOH para proporcionar una solución clara. El EtOH o iPrOh luego se agregó en la solución hasta que se volvió turbia. Luego, se agregó MeOH cautelosamente a la solución para volver a aclararse nuevamente. La solución mezclada se dejó abierta al aire durante 16 horas y el precipitado resultante se colectó como la sal formada.

Ejemplo 11 Preparación del compuesto II' a de lia El Di-fosfato éster lia (500 mg) se disolvió en 5 ml de TFA al 10% en THF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas antes de empezar a pagarse por una solución de Na2C03 acuosa al 10% (30 ml) . Después de lavarse con EtOAc (50 ml) , la fase acuosa se concentró bajo vacío para proporcionar un residuo el cual se purificó usando Sistema CLAR preparativa automatizada Shimadzu para proporcionar el mono-fosfato II' a deseado (26.5 mg) . XH RMN (500 MHz, CDC13) d 8.13 (s, 1H) , 7.40 (b, 6H) , 6.13 (d, 2H, J=11.5 Hz) , 4.05 (s, 3H) , 3.88 (s, 3H) , 3.90-3.40 (m, 8H) , 1.39 (s, 9H) ; EM m/z: (M+H)+ calculado para C27H34N409P 589.21, encontrado 589.13; tiempo de retención CL 1.32 min., (columna: Xterra 4.6x50mmC18 5um) .

Preparación alternativa de di-tert-butil clorometil fosfato +1.0 eq. KCI +1.0 eq. SO3 Reacción Al reactor inerte, se agregaron di-tert-butil potasio fosfato (1.69 kg) , 4.0 eq. de carbonato de sodio y 0.05 eq. de sulfato ácido de tetrabutil amino de modo manual. El cloruro de metileno (7.7 L/kg) luego se bombeó a través del rociador para lavar la pared del reactor. Con la temperatura de la cubierta debajo de 10°C, el agua exotérmica cargada se agregó durante el curso de 10 minutos (7.6 L/kg). La exotermia asociada es menor con un lote de temperatura en el rango desde 11.1 hasta 16.2 °C durante el curso de la adición. Con la temperatura de la cubierta y el lote cerca de 7 y 15°C, respectivamente, 20.2 eq. de clorometilsulfonilcloruro (CMCS) se cargaron por medio de un embudo de adición. La carga continuó durante 2 horas mientras la temperatura de la cubierta se elevó lentamente hasta 20 °C durante la carga. La temperatura máxima del lote durante la carga de CMCS fue de 25.3°C. La temperatura de la cubierta se elevó lentamente durante la carga para asegurar que la exotermia empieza cuando los datos preliminares del laboratorio indican que la exotermia puede hacerse más lenta a temperaturas inferiores del lote. La mezcla de reacción se agitó y después de 3.5 horas, una muestra de RMN indicó que la reacción tiene un avance de 72%. La reacción se permitió procesar durante la noche con una temperatura de lote entre 19.7 y 23.6°C (Delta V historian). Una muestra de RMN se tomó después de 16 horas que indicó una conversión de reacción de 76%. Los lotes de laboratorio en el rango en conversión de 60 hasta 80%. Preparación Después de que la reacción se juzgó completa, se agregó agua adicional a 9.3 L/kg al lote para afectar una fase dividida. La fase inferior rica en producto se transfirió a un carbono y la fase acuosa superior se envió a desecho. Una capa de paño pequeña se mantuvo con el producto orgánico rico. La fase orgánica se retorno a R-1A y se agregó agua adicional a 5.1 L/kg como un lavado. Las fases se dividieron con el producto orgánico rico, aproximadamente 18.5 kg, empezó a enviarse a un carboy mientras la fase acuosa superior se envió a desecho. No se observaron capa de paño o sólidos en la segunda división. Sin embargo, se recomienda filtrar el pulido del producto orgánico rico para remover las sales precipitadas. Destilación de cloruro de metileno El producto orgánico rico se transfirió al depósito del rotoevaporador de EVAPO-1A. La destilación del cloruro de metileno se inició con una temperatura de cubierta de aproximadamente 22 °C. El velocidad de destilación se hizo más lenta después de 4.5 horas y una muestra del lote se tomó para analizar el contenido del cloruro de metileno. El análisis RMN indicó una relación 4:1 de di-tert-butil clorometil fosfato a cloruro de metileno. Los resultados de laboratorio típicos de esta corriente indicarían una relación de 10:1 de manera que la destilación se continuó con un incremento en la temperatura de cubierta en el rotoevaporador. Después de 2.5 horas adicionales, la velocidad de destilación se detuvo. Una muestra RMN del lote indicó que la relación se había incrementado a 5:1 di-tert- butil clorometil fosfato a cloruro de metileno. La temperatura máxima de la cubierta del rotoevaporador fue 28.4°C.

Pureza del aceite de di-tert-butil clorometil fosfato El análisis RMN del aceite de di-tert-butil clorometilo fosfato indicó que la potencia puede ser más grande que 100%. El trabajo de desarrollo típicamente produjo material con una potencia de 100±10%. El análisis Karl-Fischer midió el contenido de agua a 0.02% en peso y el análisis GC midió con cloruro de metileno al 10.69% en peso. Así, la potencia reportada es 89.29% en peso que cuenta por el cloruro de metileno y la contribución del agua en el aceite.

Almacenaje de di-tert-butil clorometil fosfato El aceite de di-tert-butil clorometil fosfato se colocó en un cuarto frío y la temperatura se monitoreó con un registrador de diagrama de bandas. Los lotes de laboratorio se mantienen típicamente entre 0 hasta 5°C. Un RMN del producto después de 104 horas se tiene en el cuarto frío que indica que el material no había perdido potencia. (La prueba de seguridad conducida durante la campaña indica que al retener, el aceite se auto-calienta con una acumulación de presión subsecuente) .

RMN estándar Prep y muestra Prep Preparación de la solución estándar de trimetil fosfato (TMP04) Una solución estándar de TMP04 mostró que se preparó basada en un rendimiento teórico al 100M%. Por ejemplo: una alimentación de 10 g de sal de di-tert-butil fosfato de potasio mostró el rendimiento 10.41 g (0.402 moles) de di-tert-butil clorometil fosfato. El volumen de diclorometano en la mezcla de reacción será 75 ml . La molaridad de la solución es 0.536. Una solución de TMPO4 se debe preparar en una molaridad y 0.5 ml de la solución debe combinarse con 0.5 ml de la capa de diclorometano de la reacción. Las integrales encontradas en el 31P RMN puede directamente compararse y puede dar el % de conversión de di-tert-butil clorometil fosfato.

Determinación del % del material de partida no reactivo en la fase acuosa de la reacción : Después de registrar el volumen de la fase acuosa de la reacción, se transfirió exactamente a 0.500 ml en vial de 1-dram que contenía un peso conocido del TMP04 estándar interno. Se agregó aproximadamente 0.24 ml de D20. Se agitó hasta mezclarse completamente. Para obtener un espectro 31P-cuant .

Calculo del % del material de partida no reactivo: sp. mg 248.30 31P RMN aq. St. PM st. integración 10 % de material vol. TMPO4 mat. mat. 0 de partida sin reaccionar en G vol. x- 140.08 rxn. acuoso 31P RMN lo" act. muestra PM integración 00 inpt. (0.5 mL) TMPO4 TMPO4 Ejemplo: 212 13.4 mg 248.30 St. PM mL TMPO4 9.617 10 3.26% de mat. 0 material de patida sin 11.0 140.08 ' 10 reaccionar g 0.500 mL 270.392 00 act. TMPO4 Determinación del % de potencia del aceite producido: Después de registrar el peso puro del aceite producido destilado, se tara un vial de 1-dram, con cierre de rosca que contiene un peso conocido del TMP04 estándar interno. La transferencia aproximadamente de 0.02 ml del aceite producido en el vial y el registro del peso puro del aceite producido. Se agregó aproximadamente 0.7 ml de CDC13. Se agitó hasta mezclarse completamente. Para obtener unos espectros 31P-cuant. Se inspeccionan los espectros 1H RMN por la presencia de catalizador de transferencia de fase residual (bisulfato de tetra-n-butil-amonio) y cloruro de metileno. Se reportaron estos como mol% relativo al producto.

Calculo del % de potencia: Ej emplo : 13.7 mg 258.68 PM 744 91.9% de potencia TMP04 producto 44. del aceite x 100 = producto (p/p) 22.3 mg 140.08 PM 55.256 muestra TMP04 Datos RMN para el di-tert-butil clorometil fosfato XH RMN (300.13 MHz, CDC13) d 1.52 (s, 18H) , d 5.67 (d, J=15.5, 2H) 13C RMN (75.47 MHz, CDC13) : d 29.77 (d, J=4.5, 6C) , d 73.34 (d, J=7.5, 1C) , d 84.16 (d, J=1.5, 2C) 31P RMN (121.49 MHz, CDC13) : d -10.51 (s, 1P) .

Ejemplo 12: Preparación alternativa de lab (pro-fármaco de IVa) 2. TFA, CHZCI2, t.a.

Un matraz de 500ml de 4 cuellos de fondo redondo equipado con un agitador superior, termopar, embudo de adición, una entrada de nitrógeno y unos septos se cargó IVa (20.01 g, 47.37 mmol), K2C03 (13.13 g, 95.00 mmol) y DMSO (100 ml, 1.41 moles) y la reacción se agitó a temperatura ambiente resultando en una suspensión heterogénea café ligera. Se agregó di-tert-butil clorometil fosfato (14.83 g, 57.32 mmol) por medio de un embudo de adición y la reacción se calentó a 30 °C durante 16-24 horas después del tiempo al cual la reacción se enfrió a 10°C. A la reacción se agregó DCM (200 ml) luego se apagó lentamente con agua (200 ml) se mantuvo la temperatura de la reacción bajo 20 °C resultando en una mezcla bifásica. La capa del fondo rica en producto se separó, se lavó con agua (200 ml) , luego se transfirió a un matraz de 500 ml de 4 cuellos de fondo redondo equipado con un agitador superior, termopar, embudo de adición, y una entrada de nitrógeno. Se agregó ácido trifluoroacético (53.0 ml, 700.94 mmol) por medio de un embudo de adición resultando en una exotermia ligera. La reacción se agitó durante 1-3 horas, luego se enfrió a 0°C. Se agregó metanol (300 ml) y se mantuvo la temperatura de la reacción bajo 20 °C, y luego se enfrió a 0°C. El matraz de reacción se acopló con un aparato de destilación y se concentró bajo vacío hasta un volumen de 200 ml (200 torr, <30°C) . La reacción se sembró con lac (0.200 g) luego se agitó durante la noche a temperatura ambiente resultando en una mezcla espesa. La mezcla espesa se filtró luego la torta húmeda se lavó con THF (300 ml) luego se secó en un horno a vacío a 50 °C durante la noche resultando en un polvo amarillo pálido a blanco (23.94 g, 95%). aH RMN (400 MHz, DMSO-d6) d 8.30 (s, 1H) , 7.55 (s, 1H) , 7.44 (s, 5H), 6.12 (d, J=10.6 Hz, 2H) , 3.97 (s, 3H) , 3.85 (s, 3H) , 3.80-3.22 (m, 8H) ; 13C RMN (100 MHz, DMSO-d6) d 185.49, 169.26, 166.06, 146.20, 145.60, 140.64, 135.50, 129.68, 128.41, 127.04, 123.46, 121.17, 120.08, 114.32, 72.43, 56.92, 53.32, 45.22, 40.50; ES+ EM m/z (intensidad relativa) 533 (MH+, 100), 453 (MH+ - H3P04, 15). lac lab Pes. Mol. = 532.44 Pes. Mol. = 678.64 A un reactor de 10 L de 4 cuellos equipado con un termopar, agitador superior, condensador y una entrada de nitrógeno se agregó lac (611 g, 1.15 mol) y agua (3875 ml) . A la suspensión resultante se agregó lisina (168 g, 1.15 mol). La reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente, se calentó a 50 °C luego se mantuvo a 50 °C con agitación durante 1 hora adicional. La solución nebulosa resultante (pH = 4.55) se filtró a través de un cunofiltro de 10 mieras, se filtró en un reactor de 20 L de 4 cuellos equipado con un termopar, agitador superior, condensador y una entrada de nitrógeno. La reacción se calentó a 50 °C luego se agregó acetona (8 L) rápidamente. La reacción se permitió calentar a 50 °C luego se agregó acetona (4 L) a un rango moderado que mantuvo la temperatura de reacción arriba de 45 °C. la reacción se selló con lab (0.200 g) luego se enfrió a temperatura ambiente durante 5 horas resultando en una mezcla espesa. La mezcla espesa se agitó durante la noche a temperatura ambiente luego se filtró. La torta húmeda se lavó con acetona (4 L) luego se secó un vacuo a 25°C durante la noche con una extracción de aire húmedo resultando en un polvo blanco esponjoso (751 g, 96%).

Ejemplo 13: Preparación alernativa de Icb (Pro-fármaco de Ivc) A un reactor de 10 L equipado con un agitador superior, termopar, aparato de destilación, y una entrada de nitrógeno se cargó IVc (200.00 g, 422.39 mmol), Cs2C03 (344.06 g, 1.06 mol), KI (140.24 g, 844.81 mmol) y NMP (1.00 L, 10.38 mol). La reacción se agitó a temperatura ambiente resultando en una suspensión heterogénea café ligera. Se agregó di-tert-butil clorometil fosfato (273.16 g, 1.06 ml) por medio de un embudo de adición y la mezcla de reacción se calentó a 30 °C durante 16-24 horas con agitación después del tiempo al cual la reacción se enfrió a 5°C. A la reacción se agregó DCM (1.5 L) luego la reacción se apagó lentamente con agua (3.5 L) se mantuvo la temperatura de reacción bajo 20 °C resultando en una mezcla bifásica. La capa del fondo del producto rico se separó, se lavó con agua (3.5 L x 3) , luego se volvió a transferir al reactor. La solución se concentró bajo vacío a un volumen de 1 L se mantuvo la temperatura de bajo de 25 °C. Se agregó IPA (2 L) luego la reacción se concentró bajo vacío a un volumen de 2L manteniendo la temperatura debajo de 25 °C. La reacción luego se selló con líe (0.200 g) , se agitó durante la noche a temperatura ambiente resultando en una mezcla espesa. La mezcla espesa se filtró y la torta húmeda se lavó con MTBE (1 L) , se secó en un horno al vacío a 50°C durante la noche resultando en un polvo amarillo/blanco (207.1 g, 70%). 1H RMN (400 MHz, CDC13) d 8.54 (s, 1H) , 8.18 (s, 1H) , 7.91 (s, 1H) , 7.42 (s, 5H) , 5.95 (d, J=14.2 Hz, 2H) , 4.06 (s, 3H) , 3.97-3.36 (m, 8H) , 2.50 (s, 3H) , 1.27 (s, 18H) ; 13C RMN (100 MHz, CDC13) d 184.64, 170.65, 165.91, 161.60, 150.82, 145.38, 141.89, 134.96, 130.20, 129.59, 128.68, 127.58, 127.10, 124.77, 122.64, 115.22, 83.90, 83.83, 73.69, 73.63, 56.95, 46.04, 41.66, 29.61, 29.56, 13.90; ES+ EM m/z (intensidad relativa) 696 (MH+, 10), 640 (MH+ - isobutileno, 30), 584 (MH+ - 2 isobutileno, 100).

A un reactor de 10 L de 4 cuellos equipado con un termopar, agitador superior, condensador y una entrada de nitrógeno se agregó lie (200.24 g, 287.82 mmol), acetona (800.00 ml, 10.88 mol) y agua (800.00 ml, 44.41 mol). La reacción se calentó a 40 °C y se agitó durante 18-24 horas. La reacción se enfrió a 20 °C luego se agregó trometamina (33.62 g, 277.54 mmol) . La reacción se calentó a 40°C luego se agitó durante 1 hora adicional hasta que todos los sólidos se disolvieron. La reacción se enfrió a 20°C luego se filtró a través de un cunofiltro de 10 mieras en un reactor de 10 L de 4 cuellos equipado con un termopar, agitador superior y una entrada de nitrógeno. Se agregó (3 L) rápidamente, seguido por sembrarse con Icb (0.500 g) , luego se agregó acetona adicional (3 L) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche resultando en una mezcla espesa luego se filtró. La torta húmeda se lavó con acetona (800 ml) luego se secó en un horno al vacío a 50 °C durante la noche resultando en un polvo blanco esponjoso (165.91 g, 82%).

Información suplementaria : Aislamiento del ácido libre del intermediario le: llc le Pes. Mol. = 695.70 Pes. Mol. =583.49 En un reactor de 250 ml de 3 cuellos equipado con un termocouple, agitador superior, condensador y una entrada de nitrógeno se agregó lie (10.0 g, 14.37 mmol), acetona (40.00 ml, 544.15 mmol) y agua (40.00 ml, 2.22 mol). La reacción se calentó a 40 °C y se agitó durante 14-24 horas. La reacción se enfrió a 20 °C, luego se agitó durante 3 horas resultando en una mezcla espesa. La mezcla espesa se filtró, luego la torta húmeda se lavó con acetona (40.00 ml) luego se secó en un horno al vacío a 50 °C durante la noche resultando en un polvo blanco esponjoso (7.00 g, 83%). RMN (400 MHz, DMSO-d6) d 8.84 (s, 1H) , 8.47 (s, 1H) , 8.06 (s, 1H) , 7.45 (s, 5H) , 5.81 (d, J=12.3 Hz, 2H) , 4.03 (s, 3H) , 3.91-3.19 (m, 8H) , 2.39 (s, 3H) ; 13C RMN (500 MHz, DMSO-d6) d 185.20, 169.32, 165.85, 160.75, 150.51, 146.30, 143.24, 135.53, 129.74, 129.22, 128.46, 127.34, 127.09, 123.67, 122.73, 113.94, 72.90 (d, 2JC-P = 5 Hz), 57.01, 45.2 (bs) , 40.8 (bs) , 13.66. ES+ EM m/z (intensidad relativa) 486 (MH+ - H3P04, 100) . Ejemplo 14: Preperación alternativa de Ibb (Pro-fármaco de IVb) A un reactor de 10 L equipado con un agitador superior, termopar, y una entrada de nitrógeno se cargó IVb (400.00 g, 894.73 mmol), Cs2C03 (873.70 g, 2.68 mol), KI (297.70 g, 1.79 mol) y NMP (1.00 L, 10.38 mol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente resultando en una suspensión heterogénea café ligera. Se agregó di-tert-butil clorometil fosfato (460.50 g, 1.78 mol) por medio de un embudo de adición y la reacción se calentó a 30 °C durante 16-24 horas tiempo al cual la reacción se enfrió a 5°C. A la reacción se agregó n-BuOAc (2.4 L) luego la reacción se apagó lentamente con agua (4 L) manteniendo la temperatura de la reacción bajo 20 °C resultando en una mezcla bifásica. La capa acuosa del fondo se removió del reactor, luego la capa de arriba del producto rico se sembró con lie, (0.40 g) luego se agitó 3 horas a temperatura ambiente resultando en una mezcla espesa. La mezcla espesa se filtró luego la torta húmeda se lavó con MTBE (1.6 L) luego se secó horno al vacío a 50 °C durante la noche resultando en un polvo amarillo/blanco (483.2 g, 81%). 1H RMN (400 MHz, CDC13) d 8.35 (s, 1H) , 8.27 (s, 1H) , 8.22 (s, 1H) , 7.90 (s, 1H) , 7.42, (s, 5H) , 5.92, (d, J=14.9 Hz, 2H) , 4.02-3.40 (m, 8H) , 1.24 (s, 18H) ; 13C RMN (100 MHz, CDC13) d 182.75, 170.64, 152.07, 144.03, 134.91, 133.96, 131.82, 130.21, 128.68, 128.27, 128.00, 127.07, 125.81, 124.01, 113.82, 84.00, 83.93, 73.97, 46.12, 41.90, 29.57, 29.53; ES+ EM m/z (intensidad relativa) 558 (MH+, 100) . llb Ibb Pes. Mol. = 669.64 Pes. Mol. =703.62 A una reactor de 300 ml de 4 cuellos equipado con un termopar, agitador superior, condensador, y una entrada de nitrógeno se agregó 11b (18.0 g, 26.87 mmol), IPA (36.00 ml, 470.92 mol) y agua (36.00 ml, 2.0 mol). La reacción se calentó a 40 °C y se agitó durante 18-24 horas. La reacción se enfrió a 20°C luego se agregó lisina (3.73, 25.54 mmol). La reacción se agitó durante 1 hora hasta que todos los sólidos se disolvieron. Se agregó IPA (54 ml) durante 30 minutos seguido por sembrarse con Ibb (0.180 g) y se agitó durante 30 minutos adicionales. Se agregó IPA (18 ml) durante 1 hora luego la reacción se calentó a 50 °C en una mezcla espesa delgada. La reacción se sembró con Ibb (0.180 g) luego se agregó IPA (36 ml) durante 2 horas luego se agitó durante 12 horas resultando en una mezcla espesa. La reacción se calentó a 70-80°C durante 2 hasta 3 horas luego se enfrió a 50°C. Se agregó IPA (59 ml) durante 1 hora luego se agregó IPA adicional (121 ml) durante 1 hora. La reacción se enfrió a 20 °C durante 2 horas, luego se agitó durante 2 horas adicionales, luego se filtró. La torta húmeda se lavó con IPA (180 ml) luego se secó horno al vacío a 50°C durante la noche resultando en un polvo blanco (15.43 g, 82%). Información suplementaria : Procedimiento para el aislamiento del ácido libre intermediario Ibc: llb Ibc Pes. Mol. = 669.64 Pes. Mol. =557.43 En un matraz de 500 ml de 3 cuellos equipado con un termopar, agitador superior, condensador, y una entrada de nitrógeno se agregó Ilb (50.00 g, 74.76 mmol), acetona (100.00 ml, 1.36 mol) y agua (100.00 ml, 5.55 mol). La reacción se calentó a 40 °C y se agitó durante 18-24 horas. En un matraz de 250 ml de 3 cuellos equipado con registrador de pH, una barra de agitación magnética, y una entrada de nitrógeno se agregó 150 ml de la solución de arriba Ibc luego el pH se ajustó a un pH = 6.2 con NaOH 10 N. La solución se transfirió a un embudo separador, luego se lavó con EtOAc (100 ml) luego DCM (100 ml) , luego se volvió a transferir el matraz de 250 ml de 3 cuellos. El pH se ajustó a un pH = 1.3 con HCl 2N seguido por agitación durante 3 horas, resultando en una mezcla espesa la cual se filtró. La torta húmeda se re-agitó en MTBE (150 ml) luego se filtró, seguido por re-agitación en THF/agua (100:1, 130 ml) durante 45 minutos, luego se filtró y se secó en un horno al vacío a 50 °C durante la noche resultando en un polvo blanco (10.0 g, 33%). RMN (400 MHz, DMSO-d6) d 8.69 (s, 1H) , 8.62 (s, 1H) , 8.42 (s, 1H) , 7.98 (s, 1H) , 7.41 (s, 5H) , 5.47 (d, J=13.3 Hz, 2H) , 3.99-3.18 (m, 8H) ; 13C RMN (100 MHz, DMSO-d6) d 183.97, 169.23, 165.20, 151.69, 145.91, 135.48, 133.83, 131.59, 129.65, 129.11, 129.03, 128.42, 127.77, 127.49, 127.03, 122.62, 112.08, 72.57. ES+ EM m/z (intensidad relativa) 558 (MH+, 100) .

Ejemplo 15 : Preparación del profármaco le Etapa uno Preparación de 2- (1- (2- (4-metoxi-7- (3-metil-lH-l ,2 , 4- triazol-1-il) -IH-pirrolo [2 , 3-c]piridin-3-il) -2-oxoacetil) piperidin- 4- iliden) -2- (piridin-2-il) acetonitrilo (IVe) : Se combinaron el ácido 2- (4-metoxi-7- (3-metil-lH-1, 2, 4-triazol-l-il) -IH-pirrolo [2, 3-c] piridin-3-il) -2-oxoacético (1.5 g) , clorohidrato de 2- (piperidin-4-iliden) -2- (piridin-2-il) acetonitrilo (1.5 g) , 3- (dietoxifosforiloxi) -l,2,3-benzotriazin-4 (3H)-ona (DEPBT) (2.1 g) y base Hunig (2 ml) en 20 ml de DMF. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El DMF se removió por medio de evaporación a presión reducida y el residuo se dividió con MeOH (80 ml) . El precipitado se colectó por filtración para proporcionar 0.85 g del producto, 2- (1- (2- (4-metoxi-7- (3-metil-lH-1, 2, 4-triazol-l-il) -lH-pirrolo [2, 3-c] piridin-3-il) -2-oxoacetil) piperidin-4-iliden) -2- (piridin-2-il) acetonitrilo (IVe). XH RMN (500 MHz, DMSO-d6) d 12.42 (s, 1H) , 9.23 ( , 1H) , 8.69 (m, 1H) , 8.27 (m, 1H) , 7.89 (m, 2H) , 7.58 (m, 1H) , 7.52 (m, 1H) , 3.998 (s, 3H) , 3.99-2.70 (m, 8H) , 2.60 (m, 3H) .

EM m/z : (M+H) + calculado para C25H23N803 483 . 19 , encontrado 483 . 18 . Etapa dos Se combinaron el fosfato de éster (45.1 g, 0.1 mol) y cloroyodometano (200 g, 1.14 mol) en 100 ml de benceno y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas antes se removió con benceno bajo vacío. Luego, se agregó 500 ml de etil éter a el residuo y el sólido insoluble se filtró continuamente. La concentración del filtrado proporciono di-tert-butil clorometil fosfato, el cual se utilizó en la siguiente etapa sin cualquier purificación adicional. Etapa tres Se agregó NaH (0.2 g, 95%) lentamente en una suspensión de 2-(l-(2-(4-metoxi-7-(3-metil-lH-l,2,4-triazol-l-il)-lH-pirrólo [2, 3-c]piridin-3-il) -2-oxoacetil) piperidin-4-iliden) -2- (piridin-2-il) acetonitrilo (IVe) en THF seco (20 ml) y la mezcla se permitió agitar durante 1 hora a temperatura ambiente. El yoduro (0.4 g) se disolvió en THF seco (2 ml) se agregó lentamente en una solución agitada. La mezcla se agitó durante 3 horas adicionales antes de cargarse con 0.2 g de NaH. Al finalizar la adición, la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos adicionales y luego se agregó di-tert-butil clorometil fosfato para obtener la etapa dos. Después de agitarse durante 16 horas, la mezcla de reacción se vació en hielo NH4OAc (30%) (50 ml) , seguido por extracción con EtOAc (3 x 100 ml) . Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (50 ml) y luego salmuera (50 ml) , se secaron sobre Na2S04, y se concentraron bajo vacío para proporcionar un residuo, el cual se purificó por cromatografía de gel de sílice (elución con EtOAc/Et3N (100/1)) para dar 330 mg de di-tert-butil (3- (2- (4-ciano (piridin-2-il)metilen) piperidin-1-il) -2-oxoacetil) -4-metoxi-7- (3-metil-lH-l, 2, 4-triazol-l-il) -lH-pirrolo [2, 3-c]piridin-l-il) metil fosfato (He). 2H RMN (500 MHz, CD3OD) d 8.85 (m, 1H) , 8.66 (m, 1H) , 8.45 ( , 1H) , 8.06 (m, 1H) , 7.92 (m, 1H) , 7.60 (m, 1H) , 7.43 (m, 1H) , 6.05 (m, 2H) , 4.11 (s, 3H) , 4.00 (m, 1H) , 3.82 (m, 1H) , 3.76 (m, 1H) , 3.60 ( , 1H) , 3.04 ( , 1H) , 2.95 (m, 1H) , 2.85 (m, 1H) , 2.80 (m, 1H) , 2.52 (s, 3H) , 1.30 (m, 18H) . EM m/z: (M+H)+ calculado para C3 H42N807P 705 . 29 , encontrado 605 . 30 Etapa cuatro El di-tert-butil (3-2- (4- (ciano (piridin-2-il) metileno) piperidin-1-il) -2-oxoacetil) -4-metoxi-7- (3-metil-1H-1, 2, 4-triazol-l-il) -lH-pi rolo [2, 3-c] piridin-1-il) metil fosfato (He) se disolvió en 8 ml de una solución mezclada de TFA y diclorometano (10% TFA/CH2C12) y la mezcla se agitó durante 3 horas. Todos los solvente se removieron bajo vacío y el residuo se purificó usando un sistema CLAR preparativo automatizado Shimadzu para dar 25 mg de fosfato ácido de tert-butil (3- (2- (4- (ciano (piridin-2-il) metileno) piperidin-1-il) -2-oxoacetil) -4-metoxi-7- (3-metil-lH-l, 2, 4-triazol-l-il) -lH-pirrolo [2, 3-c]piriridin-l-il) metil (H'e) y 33 mg de fosfato diácido de (3- (2- (4- (ciano (piridin-2-il) metilen) piperidin-1-il) -2-oxoacetil) -4-metoxi-7- (3-metil-1H-1, 2, 4-triazol-l-il) -IH-pirrolo [2, 3-c] piperidin-1-il) metilo (le) . Fosfato ácido de tert-butil (3- (2- (4- (ciano (piridin-2-il)metillen)piperidin-l-il)-2-oxoacetil) -4-metoxi-7- (3-metil-1H-1, 2, 4-triazol-l-il) -IH-pirrolo [2, 3-c] piridin-1-il) etilo (H'e) : 1H RMN (500 MHz, CD3OD) d 8.83 (m, 1H) , 8.55 (m, 1H) , 8.35 (m, 1H) , 7.92 (m, 2H) , 7.54 (m, 1H) , 7.41 (m, 1H) , 5.86 (m, 2H), 3.98 (s, 3H) , 3.96 (m, 1H) , 3.72 (m, 1H) , 3.65 (m, 1H), 3.47 (m, 1H) , 2.92 (m, 1H) , 2.85 (m, 1H) , 2.71 (m, 1H) , 2.65 (m, 1H), 2.40 (s, 3H) , 1.15 (m, 9H) . EM m/z (M+H) + calculado para C30H34N8O7P 649.23, encontrado 649.22. Fosfato diácido de (3- (2- (4- (ciano (piridin-2-il)metilen)piperidin-l-il) -2-oxoacetil) -4-metoxi-7- (3-metil-1H-1, 2, 4-triazol-l-il) -lH-pirrolo [2, 3-c] piridin-1-il) metilo (le) : XH RMN (500 MHz, DMS0-d6) d 8.88 (m, 1H) , 8.65 (m, 1H) , 8.50 (m, 1H) , 8.06 (m, 1H) , 7.90 (m, 1H) , 7.49 ( , 2H) , 5.82 (m, 2H) , 4.04 (s, 3H) , 3.96 (m, 1H) , 3.88 (m, 1H) , 3.72 (m 1H) , 3.46 (m, 1H) , 2.94 (m, 1H) , 2.82 (m, 2H) , 2.73 (m, 1H) 2.40 (m, 3H) ; 13C RMN (125 MHz, DMS0-d6) d 185.2, 165.6 160.6, 159.1, 151.0, 150.4, 149.5, 146.2, 143.1, 137.4. 129.1, 127.2, 124.4, 123.6, 122.6, 117.4, 116.3, 113.9 110.0, 72.8, 56.9, 48.4, 44.4, 36.4, 34.0, 13.63 EM m/z (M+H)+ calculado para C26H26N807P 593.17, encontrado 593.14.

Ej emplo 16: Preparación del profármaco If H,0/ A to°c A una mezcla de IVf (99.5 mg, 0.21 mmol) en l-metil-2-pirrolidinona (1.0 ml) a temperatura ambiente en una vial cubierto, se agregó KI (144 mg, 0.87 mmol) y Cs2C03 (416 mg, 1.28 mmol), y la mezcla se agitó durante alrededor de 5 minutos. Se agregó el reactivo de di-tert-butil clorometil fosfato (218 mg, 0.84 mmol) gota a gota. La mezcla resultante luego se agitó a 35 hasta 40 °C durante 20 horas. La mezcla luego se diluyó con H20 (alrededor de 8 ml) y se extrajo con EtOAc (alrededor de 8 ml) . El extracto orgánico se separó y se evaporó para dar el di-t-butil clorometil fosfato: método CLAR analítico: Solvente A 10% de MeOH-90% H20 - 0.1% de TFA; solvente B 90% de MeOH - 10% de H20 - 0.1% de TFA; Comienzo %B = 0, Final %B = 100, tiempo de gradiente = 2 min, relación de flujo = 5 ml/min., columna; Xterra EM C18 S7 3.0 x 50 mm; CL/EM: (ES) m/z (M+H)+ = 694.22, CLAR Rt = 1.243.

Una mezcla del intermediario Ilf en H20/isopropanol (1.0 ml/1.0 ml) en un matraz de fondo redondo con tapón se agitó a 40 °C durante 9.5 horas. La mezcla luego se enfrió a temperatura ambiente y la solución se transfirió a un vial por medio de una pipeta. Se agregó MeCN (1.0 ml) a esta solución, a la cual luego se agregó isopropanol lentamente y con una agitación intermitente usando una espátula. Los precipitados blancos opacos luego se filtraron, se lavaron con isopropanol (2 x 1.0 mol) y luego se secó bajo alto vacío para dar el profármaco If; xñ RMN (500 MHz): (DMS0-d6) d 8.76 (s, 1H) ,- 8.71 (s, 1H) , 8.69 (s, 1H) , 8.49 (s, 1H) , 8.09 (d, J=8, 1H) , 8.06 (s, 1H) , 7.89 (d, J=7, 1H) , 7.85 (app t, 1H) , 7.59 (app t, 1H) , 5.68 (d, J= 13, 2H) , 4.00 (b m, 2H) , 3.90 (b m, 2H) , 3.85 (b m, 2H) , 3.65 (b m, 2H) ; Método CLAR analítico: Solvente A 10% de MeOH - 90% de H20 - 0.1% de TFA; Solvente B 90% de MeOH - 10% de H20 - 0.1% de TFA; Comienzo %B = 0, Final %B = 100, Tiempo de gradiente = 2 min., Relación de flujo = 5 ml/min., Columna: Xterra EM C18 S7 3.0 x 50 mm; CL/EM: (ES) m/z (M+H)+ = 582.00, CLAR Rt = 1.797. Para ser exitosa la conversión del profármaco el precuersor deberá inciarse por fosfatasas alcalinas en el hombre. Los estudios in vitro cualitativos usando fosfatasa alcalina de placenta humana y estudios in vivo en ratas muestra que la conversión del profármaco fue rápida tanto in vitro con enzimas humanas como in vivo en ratas. Idealmente la relación de conversión será rápida de manera que solo una exposición limitada al profármaco se presenta y la exposición máxima para el agente antiviral precursor activo resultará. Los datos de los estudios (abajo) muestra que en todos los tres ejemplos de profármaco evaluados en ratas, el profármaco se convierte rápidamente al fármaco precursor activo y que los niveles de plasma profármacos son muy bajos en comparación con el fármaco precursor en todos los puntos de datos. Estos estudios se dan a dosis en la cuales las dosis de fármaco precursor y la dosis equivalente del profármaco de fosfato son bajas y aproximadamente iguales, -5mg/kg. Ya que las ventajas de los profármacos son para vencer la absorción limitada en disolución, a dosis bajas las ventajas de los profármacos sobre moléculas precursoras menos solubles para uso clínico en pacientes, no será obvio. Los estudios in vivo de dosis baja se usan para determinar si los profármacos se generan moléculas precursora. La solubilidad de las moléculas precursoras IV, depende de la forma cristalina. La forma cristalina se prefiere para el desarrollo del fármaco. Los datos para todas las moléculas precursoras puede resumirse al decir que la solubilidad acuosa del material cristalino para todas las moléculas precursoras IV es <50µg/ml y en algunos casos mucho menor. De esta manera, la solubilidad acuosa intriseca de las moléculas precursoras es baja y juega papel principal para causar la absorción limitada por la disolución a dosis mayores Tabla 1 Propiedades biológicas y farmacéuticas del fosfato de N-metilodihidrógeno (o sales) , derivados de azaindoloxoacético piperazina Compuesto Ia Compuesto Ib Compuesto le (sal de (sal de (forma acida) disodio) disodio) Solubilidad >18 >8 1 (mg/ml) , pH 6.5 Conversión Conversión Conversión Conversión in vitro en completa y completa y completa y fosfatasa rápida al rápida al rápida al alcalina precursor sin precursor sin precursor sin (nota 1) ninguna ninguna ninguna formación de formación de formación de intermediario intermediario intermediario Conversión Generación Generación Generación in vivo en rápida en el rápida en el rápida en el estudio de precursor del precursor del precursor del ratas-MAP plasma plasma plasma oral (nota 2) Conversión Generación Generación Generación in vivo en rápida en el rápida en el rápida en el estudio de precursor del precursor del precursor del ratas-MAP plasma plasma plasma iv (nota 2) Nota 1 : El derivado de profármaco (conc. ~0.2 mM) se incuba con fosfatasa alcalina (placenta humana, Sigma ~1.4 unidad) en solución amortiguadora de Tris pH 8 (conc. ~0.03 M, Iml) , y desaparece del profármaco y la formación del precursor se monitorea por CLAR y CL/EM. En la mayoría de los casos el profármaco desaparece completamente, lo que corresponde a la formación del precursor dentro de 1 hora o 2, y no se detecta otro intermediario.

Nota 2 : El fármaco se administra en ratas por la ruta oral (a la dosis equivalente a 5 mg/kg del precursor) o intravenoso (una dosis equivalente a 1 mg/kg del precursor) . Los niveles de plasma indican la conversión rápida al precursor sin una cantidad detectable del profármaco (po) .

En las tablas de abajo el término ?LLQ" significa inferior de cuantificación (esto es, no detectado) .

Tabla 2: Resumen de PK después de administración PO y IV de profármaco la de ratas. Comparación con PO histórica del compuesto IVa en ratas.

Tabla 3: Resumen de PK después de administración PO y IV de profármaco la de ratas. Comparación con PO histórica del compuesto IVb en ratas.

Tabla 4 : Estudio C MAP: Resumen de PK después de administración PO y IV de profármaco la de ratas . Comparación con PO histórica del compuesto IVe en ratas .

Claves para todas las tres tablas 2, 3 y AUCtot relación = AUC total del precursor después de la administración IV del profármaco AUC total del precursor después de la administración Iv del precursor (datos históricos) ** AUCtot relación = AUC total del precursor después de la administración PO del profármaco AUC total del precursor después de la administración PO del precursor (datos históricos) . El estudio D de escalación de dosis de uno de los profármacos (lea) se lleva a cabo en ratas con objeto de demostrar las ventajas importantes de los profármacos sobre el precursor para el uso potencial para el tratamiento del pacientes con VIH 1 después de la dosificación oral. Los datos expuestos y los parámetros medidos del estudio de escalación de dosis de profármacos se comparan con datos similares de estudios históricos conducidos con moléculas precursoras . Las figuras 3 y 4 de abajo comparan el AUC (el área bajo la curva, una medición de la exposición al fármaco en la rata) de IVe de una dosificación oral del profármaco ICa (estudio D) para obtenerse de la molécula IVe dosificada (estudio E) y un estudio tóxico sinético de rata (TK) . Los detalles de la escalación de dosis IVe histórico (estudio E) y el estudio TK de rata (F) están abajo. Como puede observarse de las figuras 3 y 4, el AUC y Cmax de la molécula precursora después de la administración oral del profármaco (triángulos) es mayor que el que resulta de la administración del fármaco precursor en dos estudios separados. Claramente, los datos muestran que con objeto de maximizar las múltiples exposiciones del fármaco con el plasma, el profármaco ofrece una ventaja sorprendente. Ya que las estructuras químicas de esta clase de moléculas son similares, los profármacos de la clase se espera que muestren un aumento en la exposición de la administración profármacos en vez del precursor. Dado lo incierto de mejorar la exposición oral entre fármacos de fosfato y la novedad de los compuestos nuevos, este resultado no es obvio y es sorprendente en su magnitud.

Protocolo del estudio PK en rata IV y oral de estudios A, B, y C profármacos de fosfato : Los compuestos le (profármaco de fosfato de IVe) , Ib ( profármaco de fosfato de IVb) , u la (profármaco de fosfato de IVa) se admistraron separadamente a grupos de tres ratas Sprague-Dawley machos por bolo IV (1 mg/kg; todas las dosis en listado en este documento fueron equivalentes del compuesto precursor) o dosificación oral (5 mg/kg) . Las ratas para estudio de dosificación oral ayunaron durante la noche. El compuesto le se administra como ácido libre, mientras que los otros dos fueron como sales de sodio. Las soluciones de dosificación para los tres profármacos tanto para administración IV oral se prepararon en una solución salina normal al 100% a 1 mg/kg (concentraciones de solución de dosificación fueron equivalentes con el compuesto precursor) . Las muestras de plasma se colectan en vacunadores EDTA durante 24 horas, y se analizan por CL/EM/EM tanto para los profármacos como para las moléculas precursoras. El análisis farmacosinético se realizó en Kinetica™. Los procedimientos para el análisis CL/EM/EM se muestran en los protocolos de abajo. Los resultados de este estudio se muestran en las Tablas A-C, a la mitad de dos columnas.

Protocolo de estudio de escalación de dosis oral en lea en ratas (estudio D) Grupos de tres ratas Sprague-Dawley macho ayunadas se les administra oralmente el compuesto lea (sal de disodio) a 4.5, 2.1 y 163 mg/kg (las dosis fueron equivalentes IVe) . Las soluciones de dosificación se prepararon en agua a 1.5, y 20 mg (compuesto le (ácido libre) equivalente) /ml para las dosis de 4.5, 21, y 163 mg (compuesto IVe equivalente) /kg, respectivamente. Las muestras de plasma se colectaron en vacunadores EDTA durante 24 horas, y se analiza por CL/EM/EM tanto para le y IVc. El análsis farmacosinetico en realizo en Kmetica .

Los resultados de este estudio se muestra en la tabla 46 y las figuras 3-5.

* El AUC fue desde 0-24 horas, ya que el AUC (24 horas- infinito) fue al menos mayor que el 35% del AUC total (0-infinito) . Esta porción fue muy grande para tener una medición exacta del AUC total. La relación de conversión AUC a 5 mg/kg de IVe del lea, calculado como la relación de IVe AUC después de dosificación lea dividido por IVe AUC después de dosificación directa de IVe, fue 0.99. El profármaco lea sólo se detecta a ~20-40 nM en una a dos muestras en cada rata en el grupo de dosis 200 mg/kg.

Métodos In vivo Procedimiento para el estudio Al : Administración PO y IV de IVa a ratas; la dosis PO fue 5mg/kg. El compuesto IVa se administra eñ una solución de polietilen glico 400 (PEG400) /etanol (EtOH) (90/10/, v/v) salvo que se note de otra manera. Las 'muestras de plasma en tejido se colectaron y almacenaron a -20°C hasta el análisis. Las ratas Sprague-Dawley macho (300 - 350 g, Hilltop Lab Animáis, Inc., Scottdale, PA 15683) con cánulas implantadas en la vena yugular y/o el ducto viliar se usaron en los estudios farmacosineticos del compuesto IVa. Las ratas se ayunaron durante la noche en estudios PO. Las muestras se sangre (0.3 ml) se colectaron de la vena yugular en tubos de microalmacenado que contienen EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07147) para obtener el plasma. En los estudios IV, una dosis de 1 mg/kg se administra a 3 ratas durante 0.5 min, y las muestras de plasma en seres se colecta antes de la dosificación a 2, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480, y 1440 minutos después de la dosificaicón. En los estudios PO, las ratas (n=3) reciben dosis PO de 5 y 100 mg/kg. Las muestras de plasma en serie se toman antes de la dosificación y 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 y 1440 minutos después de la dosificación. Los resultados orales (PO) de este estudio se muestran en la columna de la extrema derecha de la Tabla 2.

Estudio Bl de fármaco precursor. Para los estudios farmacosineticos IV y PO del compuesto Ivb en ratas, el compuesto IVb se disuleve en PEG-400/etanol (90/10) como una solución. Para los estudios farmacosinéticos IV y PO del compuestp IVB en perros, el compuesto IVb se disuelve en PEG-400/etanol (90/10) con pH ajustado con NaOH al 0.1 N. Los detalles de las formulaciones se proporcionan en la Tabla 6. Ratas . Ratas Sprague-Dawley machos (300-350 g, Hilltop Lab Animáis, Inc., Scottdale PA) con cánulas implatadas en la vena yugular y/o el ducto viliar se usaron. Las ratas se ayunan durantes la noche en los estudios farmacosineticos PO.

Las muestras de sangre de 0.3 ml se colectaron de la vena yugujar en tubos de microalmacenamiento que contienen EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) , y se centrifuga para separar en plasma. En el estudio IV, compuesto IVb se entrega a 1 mg/kg como un bolo durante 0.5 min (n=3) . Se colectan muestra se sangre en serie antes de la dosificación y 2, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 y 1440 minutos después de la dosificación.

En el estudio PO del compuesto IVb las ratas (n=3) recibieron una dosis oral de 5 mg/kg del compuesto IVB. Se colectan muestras sanguíneas en serie antes de dosificar y 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 y 1440 minutos después de dosificar. Los resultados de este estudio (PO) oral se muestran en la tabla 3, columna de la extrema derecha. Tabla 6: Formulaciones de IVb para estudios ín vivo .

Métodos bioanaliticos para estudios in vivo analizando para IVb Esto refiere a un método para analizar niveles de concentración de IVb en muestras de plasma de rata (usados para estudios B y Bl) . Cuantif icación del compuesto IVb por CL/EM/EM en plasma . Se preparar estudios alicuotas de muestras de plasma de rata, perro, mono o chinpance para análisis por precipitación de proteínas del plasma con dos volúmenes de acetonitrilo que contiene el estándar enfermo, compuesto IVA. Los sobrenadantes resultantes se separan de las proteínas precipitadas por centrifugación durante 10 minutos y se transfieren variables de alto muestreo. Las muestras se preparan ya sea manualmente, o con el uso del manejador liquido automatizado Tomtec. Una alícuota de 5 µL de inyecta para análisis. El sistema CLAR consiste de dos bombas Shimadzu LC10AD (Columbia MD) , un automuestreador Shimadzu SIL-HTC (Columbia- MD) , y un comportamiento de columna Hewlett Packard Series 1100 (Palo Alto, CA) . La columna fue YMC Pro C18 (2.0 x 50 mm, 3 µm partículas, Waters Co . , Milford, MA) , manteniendo a 60°C y a relación de flujo 0.3 ml/min. La fase móvil consiste de formiato de amonio 10 mM y ácido fórmico al 0.1% en agua (A) y 100% de formiato de amonio lOmM y 0.1% de ácido fórmico en metanol (B) . La composición de la fase móvil inicial fue 95% A. Después de la inyección de la muestra la fase móvil se cambia a 15%, A/85% B durante 2 minutos y se mantiene tal composición por 1 minuto adicional. La fase móvil se regresa entonces a las condiciones iniciales y la columna se vuelve a equilibrar durante 1 minuto. El tiempo de análisis total fue de 4 minutos. La CLAR se puso inferíase con una CL Micromass Quattro. Se uso nitrógeno de ultra pureza como el nebulizante y de gas de desolvatación a relaciones de flujo de 100 L/hr para nebulización y 1100 L/hr para desolvatación. La temperatura de desolvatación fue 300 °C y la temperatura fuente fue 150 °C. Los datos de adquisición utilizan el monitoreo de acción seleccionado (SRM) . Los inones que representan las especies (M+H)+ para IVb y el estándar interno se seleccionaron en MSI y se disasociaron de forma de colisión con argón a una presión de 2 x 10"3 para formar los iones de producto específico que posteriormente se monitorearon por MS2. Las transiciones, voltajes y tiempos de retención se resumen en la Tabla 7.

Tabla 7 : Parámetros para análisis EM/EM del compuesto IVB y el compuesto IVA (IS) .

La curva estándar de plasma colocada en el rango desde 4 hasta 8000 ng/ml, la curva de cerebro desde 1-100 ng/ml. Las curvas se establece con un regresión cuadrática pesada por concentración risoproca (1/x) . Los estándar se analizaron por duplicado. Las muestras de control de calidad (QC) preparadas en plasma en blanco a las tres concentraciones dentro del rango de la curva de calibración, también se analizaron por triplicado con cada conjunto analítico de plasma. Para este compuesto las concentraciones predichas de 90% del plasma QCs están dentro del 20% de concentración nominal, lo que indica un desempecho de análisis aceptable. Vehículos y Formulaciones . Con referencia a la Tabla 7.2, cuando el vehículo usado contiene NaOH, las formulaciones de solución de compuesto Ivc se ajusta en pH usando NaOh para obtener un pH de 8.6-9.0, donde el compuesto de ioniza parcialmente, con base en su pK a 8.4.

Tabla Formulaciones del compuesto IVe para estudios In Vivo .

Compuesto Forma- Estado vehículo Conc . Tamaño de IVe lote (mg/kg) partícula estudios Rata PK 02-001 Desconocido 90: 10, NA (estudio 02-003 PEG400/EtOH Cl) ad . hasta 8.6-9.0 Dosis 02-004 Cristalino 80:10:10 2.5 NA escalada PEG400/EtOH/0. 7.5 Distribución de pre tóxica 1N 20 múltiples modos, (estudio NaOH 3 picos E) Media=27.22 µm (95% <84.4 µm) Media general= 31.07 µm (95%<157.7 µm) Pre-ECN 02-005 Desconocido 80:10:10 3 NA Rata Tox PEG400/EtOH/ 15 Distribución de (rata TK) 0.1N 40 múltiples modos, (estudio NaOH 2 picos F) Media general =19.25 µm (95% <52.3 µm) Distribución de múltiples modos, 2 picos Media general= 21.78 µm (95%<57.5 µm) Cuantif icación del compuesto IVe por CL/EM/EM en plasma (usados en los estudios C, Cl y D) . Se prepararon estudios de alícuotas de muestras de plasma de rata, perro, mono y chimpancé para análisis para precipitar las proteínas de plasma de dos volúmenes de acetonitrilo que contiene en estándar interno, compuesto IVa. Los sobrenadantes resultantes se separaron de las proteínas precipitadas por centrifugación durante 10 minutos y se transfieren a viales automuestreadores . Las muestras se preparan ya sea manualmente o con el uso del manej ador líquido automatizado Tomtec. El sistema CLAR consiste de dos bombas Shimadzu LAC10AD (Columbia, MD) , un automuestreador Shimadzu SIL-HTC (Columbia, MD) , y un compartimiento de columna Hewlett Packard Series 1100 (Palo Alto, CA) . La columna fue YMC Pro C18 (2.0 x 50 mm, 3 µm partículas, Waters Co . , Milford, MA) , manteniendo a 60 °C la relación de flujo de 0.3 ml/min. La fase móvil consiste de formiato de amonio 10 mM y 0.1% de ácido fórmico en agua (A) y 100% de formiato de amonio 10 mM y 0.1% de ácido fórmico en metanol (B) . La composición de fase móvil inicial fue 95% A. Después de la inyección de muestra la fase móvil se cambio a 15% A/85% B durante 2 minutos y se mantiene a tal composición por 1 minuto adicional. La fase móvil se regresa entonces a las condiciones iniciales y la columna se vuelve a equilibrar por 1 minuto. El tiempo de análisis total fue de 4 minutos.

La CLAR se colocó en inferíase a una CL Micromass Quattro. Se uso nitrógeno de ultra alta pureza como nebulizante y el gas de desolvatación a relaciones de flujo de 100 L/h de nebulización y 1100 L/h de desolvatación. La temperatura de desolvatación fue 300 °C y la temperatura fuente fue 150 °C. Los datos de adquisisón utilizan el monitoreo de reacción seleccionado (SRM) . Los iones representan las especies (M+H)+ para IVe y el estándar interno se selecciona en MSI y se disocia de forma de colisión con argón a una presión de 2 x 10~3 para formar los iones de productos específico que posteriormente se monitorean por MS2. Las transiciones, voltajes y tiempo de retención se resumen en la Tabla 9.

Tabla 9 : Parámetros para análisis EM/EM de IVe y IVa (IS) La curva estándar de plasma colocada en el rango desde 4 hasta 800 ng/ml, la curva de cerebro desde 1-1000 ng/ml. Las curvas se colocan con una regresión cuadrática pesada por concentración recíproca (1/x) . Los estándar se analizan por duplicado. Las muestras de control de calidad, preparadas en plasma blanco, a las tres concentraciones dentro del rango de la curva de calibración, también se analizan por triplicado con cada conjunto analítico de plasma. Para este compuesto las concentraciones predichas de 90% del plasma QCs están dentro del 20% de la concentración nominal, lo que indica un ensayo de desempeño aceptable.

Cuantif icación de los tres profármacos y sus compuestos precursores por CL/EM/EM en matrices biológicas Este ensayo CL/EM/EM se desarrolla para investigar tres compuestos de profármaco y sus respectivas moléculas precursoras en matrices biológicas en soporte del programa de enlace VIH. Los tres compuestos de profármacos fueron compuesto la, le y Ib y sus otras sales respectivas o sus ácidos libres . Notar que este ensayo se usó para el ácido libre y las formas de sal de los tres profármacos como ion molecular detectado es independiente del contra ion de sal. Sus compuesto precursores respectivos fueron IVa, IVe y IVb.

El sistema CLAR consiste de Shimadzu LC10AD bombas (Columbia, MD) y automuestreador HTC PAL (Leap Technologies, Cary, NC) enlazado a una columna analítica Synergi Hydro-RP (2.0 x 50 mm, Phenomenex, Torrancem, CA) . La fase A móvil consistente 0.1% de ácido fórmico en agua; la fase móvil B 0.1% de ácido fórmico acetonitrilo. La relación del flujo CL fue 0.4 ml/min en el espectrómetro de masas. La composición de la fase móvil inicial fue 10% B elevando hasta 75% B durante 1.75 minutos, manteniendo a tal composición al 0.25 minuots elevando hasta 100% B sobre 0.1 minutos manteniendo por 0.6 minutos regresando a las condiciones iniciales durante el siguiente 0.1 minuto y luego re-equilibrándose. El tiempo de análisis total fue 4 minutos. Los tiempos de retención para los todos los analitos están en el rango entre 1.5 y 2.6 minutos. El sistema CLAR se coloca interface a un espectrómetro de cuatro polos triple Sciex API3000 (Toronto, Canadá) equipado con una fuente de turboionrocio colocada a 450 °C y un conjunto de voltaje de rocío de iones colocada a 4.5 kV. Se usp nitrógeno UHP como nebulizador y gases especiales con presión de 80 psi y 7L/min, respectivamente. El análisis se realizó en un modo de ion positivo. Las transiciones monitoreadas para todos sus compuestos y energías de colisión (CE) fueron: m/z 533.41 > 435.24 para la (CE= 19); m/z 584.46 > 486.29 para le (CE=23) ; m/z 558.31 > 432.13 para Ib (CE=19); 423.39 > 204.96 para IVa (CE=31) ; 474.36 > 255.97 para IVe (CE=29) ; 448.35 > 105.20 para IVb (CE=35) . Para acomodar una amplia variedad de matrices de muestra biológica se uso precipitaciones se acetonitrilo en la preparación de muestra. Las muestras de prueba y los estándares se transfirieron a una placa de 96 pozos usando el Packard Multiprobe II (Packard Instruments, Downers Grive, IL) . Se agregó 200 µL de acetonitrilo que contiene el estándar interno (BMS-647257, 200 nM) se agregó a 100 µL alícuotas de tanto muestras de prueba y estándares en la placa de 96 pozos usando el Tomtec Quadra 96. La placa se coloca en vórtice entonces por aproximadamente 3 minutos y se centrifuga a 3000 rpm por 15 minutos. Usando el Tomtec Quadra 96, se transfiere 150 µL del sobrenadante de una placa a una placa de 96 pozos profundos limpia. Se agrega entonces 150 µL de ácido fórmico al 0.2% y luego se agrega a cada pozo usando el Tomtec Quadra 96 y la placa se coloca el vórtice antes del análisis . Las curvas estándar en los 8 puntos de concentración desde 5 nM hasta 10 µM se preparan a soluciones de almacenamiento en acetonitrilo y se diluyen en serie para una matriz para ambos compuestos profármaco y precursor. Las curvas estándar se transfieren en alicuotas de 100 uL por duplicado a una placa de 96 pozos que contiene las muestras de prueba se extrae con las muestras de prueba como se describe arriba, y se inyecta al inicio, a la mitad, al final de la secuencia analítica. Las curvas estándar se colocan con una regresión lineal pesando 1/x2. Los datos y picos cro atograficos se procesan en las concentraciones de los estándar y desconocidos se cuantifican usando PEBiosystems Analyst™ 1.1.

Métodos In Vivo Condiciones para el estudio Cl , E y F (Estudios de rata PK, MAP y TK) . Para los estudios farmacocinéticos IV y PO del compuesto IVe en ratas, el compuesto IVe se disuelve en PEG-400/etanol (90/10) como una solución. Favor de referirse a la Tabla 8. Rata . Se usan ratas macho Sprague-Dawley (300-350 g, Hilltop Lab Animáis, Inc., Scottdale, FA) con cánulas implantadas en la vena yugular y/o el ducto biliar. Las ratas ayunan durante la noche en los estudios farmacosineticos PO. Se colectan muestras sanguíneas de 0.3 ml de la vena yugular en tubos de microtainer que contiene EDTA (Bectron Dickinson, Franklin Lakes, NJ) , y se centrifuga para separar el plasma.

En un estudio IV el compuesto IVe se administra a 1 mg/kg como un bolo durante 0.5 minutos (n = 3) . Se colectan muestras sanguíneas en serie antes de dosificar y 2, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 y 1440 minutos después de dosificar.

Estudio Cl de dosis sencilla PO En el estudio Cl PO del compuesto IVe las ratas ( n = 3) reciben una dosis oral de 5 mg/kg del compuesto IVc. Se colectan muestras sanguíneas en serie antes de dosificar y 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 y 1440 minutos después de dosificar. Los resultados orales (PO) del estudio Cl están en la tabla C columna del extremo derecho. Estudio E de escalación de dosis oral (PO) En el estudio E de escalación de dosis oral del compuesto IVe, grupos de ratas ( n = 2 por grupo) . reciben dosis orales de 25, 75 y 200 mg/kg. A 25 mg/kg la solución de dosificación esta en solución; a dosis mayores la soluciones de dosificación fueron suspenciones . Las muestras sanguíneas en serie se colectan antes de dosificar y 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 y 1440 minutos "después de dosificar. Se colectan muestras se cerebro a 1440 minutos para evaluar la penetración cerebral. Las muestras de cerebro se colocan secas y los pesos húmedos se registraron. Los resultados orales (PO) del estudio E están en la Tabla 46.

Estudio F de Toxicología de rata de dosis oral de 2 semanas En el estudio F de rata oral de dos semanas (n = seis /sexo/grupo) , el compuesto IVe se administra a dosis diarias de 15, 75 o 200 mg/kg. Las evaluaciones toxicocinéticas los 1 y 14 indican que las posiciones sistemicas (AUCo-2 h) del compuesto IVe generalmente están en dosis relacionadas, pero en dosis proporcionales (ver Tabla 5) , sin evidencia de autoinducción o acumulación. El día 14, los valores AUCo-2 h son ligeramente mayores en hembras (< 644 µg* hr/ml) incomparación con machos (< 526.88 µg* hr/ml) a dosis de < 200 mg/kg/día. Los resultados orales (PO) del estudio F están en la Tabla 5.

Estudio G de Mapa : Estudio de Dosificación PO e IV de diéster lia en Ratas Estructura del compuesto lia Se siguió el procedimiento para la rama de dosificación oral del estudio MAP Al, excepto que se utilizó el diéster lia en lugar del compuesto IVa. El análisis para el compuesto IVa mostró que la dosificación del diéster lia por vía oral produjo un sustancial IVa. Los datos se describen en la tabla 10 a continuación: Tabla 10 para el Estudio de Mapa G Estudio H de Mapa : Estudio de Dosificación PO e IV de monoéster IIra en Ra tas Estructura del compuesto II' a Se siguió el procedimiento para la rama de dosificación oral del estudio MAP Al, excepto que se utilizó el monoéster Il'a en lugar del compuesto Iva.

El análisis para el compuesto IVa mostró que la dosificación del monoéster II' a por vía oral produjo un sustancial IVa. Los datos se describen en la tabla a continuación: Tabla 11 para el Estudio de Mapa H Se hicieron un número importante de estudios para demostrar y caracterizar la utilidad sorprendente de los profármacos I. Los experimentos de exposición de escalación de dosis comparan la exposición de moléculas precursoras después de llevar a cabo la dosificación del profármaco y precursor en ratas y perros para los profármacos I de moléculas precursoras IVa, IVb y IVc. El efecto del alimento y la dosis en la exposición de IVa después de dosificar el profármaco lab o el precursor IVa se compara en perros. El profármaco muestra una capacidad sorprendente para mejorar la exposición y evitar efectos de alimento en comparación con el precursor. Los estudios farmacocinéticos completos de dosis baja (dosificación oral y IV) se llevan a cabo en ratas, perros, y monos para profármacos lab, Ibb y Icb, para mostrar la conversión a los compuestos, precursores IVa, IVb y IVe, respectivamente. Los estudios de dosificación oral en ratas se llevan a cabo para el profármaco le (ácido libre) , y para el compuesto precursor IVf para demostrar la conversión y exposición sistémica de los precursores IVe y IVf respectivamente. Los datos se muestran arriba o a continuación en esta solicitud.

Sección 1 Perfil Adicional Estudios Adicionales con lab : El lac es el profármaco de fosfato de ácido libre del aducto de N-hidroximetil de IVa y se hidroliza por fosfatasa alcalina (ALP) para formar IVa. El lab, una sal de monolisina de lac se usa para todos los siguientes estudios. Los estudios farmacocinéticos IV y PO de lab se conducen en ratas, perros y monos. En todos los casos se colectan muestras sanguíneas en presencia de EDTA. La presencia de EDTA, un inhibidor ALP conocido minimiza de manera importante la conversión ex vivo de lab durante el procesamiento de la muestra. El IVa se forma rápidamente después de la administración IV de lab. Se observan buenas biodisponibilidades orales (62-94%) de IVa después de administración de lab en ratas, perros y monos, o muy poco o nada de lab presente en el plasma. Ya que hay altos niveles de expresión de ALP en los intestinos, es posible que después de la administración oral de lab, el lab se hidrolice por ALP presente en las membranas del extremo del cepillo del lumen intestinal para formar IVa, que se absorbe rápidamente debido a su alta permeabilidad. Los estudios de incubación in vitro se conducen para evaluaciones cualitativas de la hidrólisis dependiente de ALP de lab en diferentes tejidos. lab se hidroliza en presencia de suero y hepatocitos de rata, perro, mono y humano, así como ALP de placenta humana. En las ocasiones en donde lab y IVa se miden, la conversión de lab a IVa fue casi estequiométrica. Debido a la hidrólisis en el suero, el enlace de la proteína de lab no deberá determinarse. Con base en los datos in vitro, se anticipa que lab se hidroliza por ALP humana y que IVa se forma después de la administración oral de lab a sujetos humanos. La solubilidad cristalina de lab a temperatura ambiente incrementa desde 0.22 mg/ml a un pH de 1.4 a > 12 mg/ml a pH 5.4 y pH 8.9; soluciones acuosas que contienen >100 mg/ml se han preparado para estudios de toxicología in vivo. En comparación, la solubilidad acuosa del compuesto precursor, IVa a temperatura ambiente como material cristalino se determina para hacer 0.04 - 0.9 mg/ml (rango de pH de 1.5-1.0). El lab exhibe una solución aceptable y estabilidades sólidas . La mayor solubilidad acuosa de lab proporciona un medio para vencer la absorción limitada por la relación de disolución de IVa debajo de ciertas dosis y por ello incrementa la exposición de IVa en estudio toxicocinéticos y de escalación de dosis oral. lab, cuando se dosifica oralmente a ~200 mg/kg de IVa equivalente, proporciona un AUC dos veces mayor de IVa en ratas y perros, sin una exposición de plasma importante de profármaco, comparada con el AUC de los estudios de suspensión IVa históricos a dosis similar. Por otro lado los valores AUC y Cmax de IVa en perros ayunados que reciben cápsulas rellenas secas de lab (200 mg/perro de equivalente IVa) fueron 38 y 58 veces, respectivamente, aquellos conseguidos en perros ayunados que se les da la formulación de cápsula clínica IVa, y 4 y 6 veces respectivamente, aquellos alcanzados en perros alimentados que se les da la formulación de cápsula clínica IVa.

No hay diferencias importantes en AUC y Cmax de IVa que se observen entre perros ayunados y alimentados que reciben lab, mientras que se observa una mejora de 9 veces en perros alimentados en comparación con perros ayunados que reciben IVa. Estos datos sugieren que los niveles sanguíneos eficaces de IVa pueden alcanzarse en pacientes infectados con VIH sin el requerimiento de un alimento alto en grasa. La forma secada por rocío de IVa se da para niveles de exposición de IVa como los que se observan de lab en perros. Estudio de tolerancia toxicocinética de dosis sencilla en ratas CD. Se efectúo un estudio toxicocinético oral de un día en ratas usando el profármaco lab (sal de monolisina) . lab se administró en dosis de 16, 72, y 267 mg/kg (ácido libre) por cebadura oral a tres ratas macho/grupo usando agua como el vehículo (formulación en solución) . Las dosis del ácido libre del profármaco corresponden a IVa (precursor) en dosis equivalente molar de 13, 57 y 211 mg/kg respectivamente. El punto final evaluado fue la toxicocinética del plasma de lab y IVa en las ratas individuales. Los valores toxicocinéticos medios se suministran en la Tabla 12.

Tabla 12; Valores toxicocinéticos medios para lab y IVa en ratas macho dado < 267 mg/kg de lab como una dosis oral sencilla Dosis (mg/kg) lab 16 72 267 Iva equiv. molar 13 57 211 lab Iva lab IVa lab IVa Cmax (µM) 0.068 26 0.095 104 0.11 214 C24h (µM) <LLQ2 0.090 <LLQ 0.027 <LLQ 1.9 0.0492 2613 0.0572 11613 AUC (µM*h) 0.02 O2 673 0.37 2.3 0.045 3.4 Tl/2 (h) 0.64 3.2 Los valores representan medios de 1-3 ratas/grupo para los datos lab y 3 ratas /grupo para los datos IVa 1 Debajo del limite inferior de cuantificación 2 AUC de cero hasta el tiempo de la última muestra cuantificable . 3 AUC desde cero hasta infinito. La concentración media del plasma máxima (Cmax) de lab (profármaco) y IVa (precursor) se logró dentro de 1.1 horas después de la dosis. El área de plasma bajo la curva del tiempo y concentración de plasma (AUC) del profármaco fue de < 0.03% aquella del precursor. (En ratas dadas con < 267 mg/kg de lab, el AUC de IVa aumentó la proporcionalidad con la dosis de lab y Cmax se incrementó en una forma proporcional menor que la dosis entre 72 y 267 mg/kg de lab.

Una comparación de IVa AUC obtenida en ratas dadas con ya sea IVa (2) o lab se muestra en la figura 6. La solubilidad en las formulaciones preclínicas ha sido una cuestión. El AUC de IVa' es equivalente para el precursor y el profármaco a dosis inferiores (por ejemplo, < 50 mg/kg) debido a que se formulan ambos como soluciones (para el precursor y agua para el profármaco PEG-400) pero a una dosis elevada (por ejemplo, 200 mg/kg) el precursor neutral se formuló como una suspensión mientras que la sal de profármaco se formuló como una solución acuosa. Un estudio de toxicidad de ratas en dos semanas usando dosis de 5, 50 o 500 mg/kg BID para soportar el IND está en seguimiento (3) . La fase en vida del estudio se ha finalizado y no hubieron observaciones en vida que valieran la pena. Estudio de Tolerancia y toxicinético de dosis sencilla en perros . Un estudio multifase se efectuó para evaluar la tolerancia del profármaco (sal de monolisina) a dosis de 24, 90 o 240 mg/kg (ácido libre, equivalente molar para 19, 71 o 190 mg/kg de precursor IVa respectivamente) y la toxicocinética de lab y IVa (4) . lab se administró a dos perros hembra por grupo una vez al día ya sea como una solución acuosa (24 ó 90 mg/kg) o cápsulas llenadas en seco (24, 90 [una o dos veces al día] o 240 mg/kg) . Los puntos finales: signos clínicos, peso corporal, consumo de alimento y toxicocinética de plasma de lab y IVa. En todos los casos se utilizó un periodo de fracaso de una semana entre dosis para todas las fases del estudio. Los valores toxicocinéticos de plasma a partir de la fase inicial del estudio se muestran en la Tabla 13. Tabla 13: Valores toxicocinéticos para IVa en perros hembra dados < 90 mg/kg de lab como una dosis oral sencilla Dosis (mg/kg) Ibb 24 90 24 Iva Molar 19 71 19 Equiv. Formulación Solución solución cápsula llenada en seco perro perro perro perro perro perro # 1201 #1202 # 3201 #3202 # 4201 #4202 Cmax (µM) 72.3 66.5 124 125 79.7 85.6 C24h (µM) 0.61 0.33 3.2 2.2 1.4 0.87 844 838 486 514 AUC (µM«h) 465 330 4.4 3.9 4.2 3.4 Tl/2 (h) 3.2 3.1 lab no se detectó en las muestras de plasma. La concentración media máxima de plasma (Cmax) de IVa se logró entre 1-2 horas después de la dosis. Cuando se da lab como una solución, tanto Cmax como AUC se incrementan en una forma menos que proporcional a la dosis entre 24 y 90 mg/kg. Se observa emesis alrededor de 30 minutos después de dosificar ambos perros que se les dan 90 mg/kg. El Cmax y AUC de IVa fue equivalente después de la administración de lab a 24 mg/kg t usando cápsulas llenadas en seco o una solución acuosa. Aparte de la emesis, no existieron signos clin-icos observados y no hubieron efectos en el peso corporal y el consumo de alimentos. Para determinar si la emesis se puede eliminar/reducir por administración de lab como cápsulas llenadas en seco, se efectúo la fase siguiente del estudio usando dosis de 90 o 240 mg/kg y 90 mg/kg que se dan dos veces al día con una separación de 4 horas (BID) . Los valores toxicocinéticos se muestran en la Tabla 14.

Tabla 14; Valores toxicocinéticos para IVa en perros hembra dados con < 240mg/kg de lab como una dosis oral sencilla o con dosificación de dos veces al día (BID) Dosis (mg/kg) Ibb 90 240 180 (90 BID) IVa equiv. olar 71 190 142 (71 BID) Formulación So lución selución cápsulai llenada en seco perro perro perro perro perro perro # 1201 #1202 # 2201 #2202 # 3201 #3202 Cmax (µM) 214 152 172 189 311 248 C24h (µM) 4.6 0.89 2.8 6.6 34 50 1186 1584 33051 2485 AUC (µM»h) 1740 960 3.7 4.5 6.1 13 Tl/2 (h) 3.6 2.9 •'"AUC a partir de cero a 24 horas No hubo diferencia en Cmax o AUC entre los perros que se les dan 90 o 240 mg/kg de lab administrado por cápsulas llenadas en seco. Se observó la emesis en perros # 1201, # 2201 y # 2202 alrededor de 1 hora después de la dosificación. Se recolectó el vómito y se ensayó por el contenido de lab para estimar la cantidad de dosis total que se perdió, el porcentaje de dosis total estimada perdida fue < 1% # 1201, aprox. 90% por #2201, aprox. 9% por #2202. Aunque las estimaciones de la "pérdida de dosis" no parecen ser cuantitativamente consistentes con los datos de plasma AUC, indica que el artículo de prueba se puede encontrar en vómito dentro de un tiempo corto después de la dosificación. Se detectó el lab del plasma de los perros 0.005-0.0049 µM a 1 hora después de la dosis y 0.005-0.006 µM 2 horas después de la dosis; el profármaco no se detectó en los puntos de tiempo posteriores . Una comparación de IVa AUC obtenido en perros dado IVa (5,6) o lab, se muestra en la figura 7.

Vehículos y Formulaciones Resumen de las formulaciones usadas para los estudios de seguridad PK clave . Todos los estudios PK in vivo en ratas, perros y monos se efectuaron usando soluciones acuosas para dosificación PO y IV. Los estudios de toxicología y exposición en perros se efectuaron con soluciones acuosas a dosis de 24 y 90 mg/kg y fármaco en formulaciones de cápsulas en dosis de la sal de monolisina de 24, 90 y 240 mg/kg de lab. En el estudio de escalación de dosis oral en ratas, el lab se dosificó como soluciones acuosas a concentraciones de 4.5, 20.0, y 73.5 mg/ml (forma de sal de monolisina del profármaco) . Una mejora importante en AUC y Cmax de IVa precursor después de la dosificación oral del lab profármaco se observó en comparación con los datos históricos de la dosificación oral de IVa. El fármaco en las formulaciones de cápsulas de lab a dosis de 20 mg/kg de un equivalente de IVa se usaron para los estudios de efecto de alimentación en perros. El profármaco se comparó con la formulación de cápsula clínica del compuesto precursor IVa a 20 mg/kg. Cuando se dosificó la cápsula clínica IVa, se observó un incremento de nueve veces en la exposición en perros alimentados con un alimento de alta grasa en comparación con perros en ayuno. Al dosificar el profármaco, lab la exposición de IVa fue significativamente mayor y como se esperaba la exposición no fue significativamente diferente entre los perros alimentados y en ayuno.

Resumen de la farmacocinética y el metabolismo . Resumen de los hallazgos e interpretación . lab es el profármaco de fosfato del aducto de N-hidroximetil de IVa y se hidroliza por la fosfatasa alcalina (ALP) para formar IVa. Después de la administración de lab a los animales por lo tanto, se prepararon muestras en plasma a partir de la sangre recolectada en presencia de EDTA, un inhibidor conocido de ALP. La conversión de lab a IVa fue mínima (< 2%) sangre de rata, mono y humano que contiene EDTA, y aproximadamente 6% en sangre de perro que contiene EDTA. No se espero ninguna conversión importante ex vivo de lab durante el almacenamiento de muestras (-20°C) y el análisis de lab. La hidrólisis de lab se estudió en sistemas animales y humanos in vitro. Ya que se que distribuyen ampliamente isoformas múltiples ALP en diversos tejidos, no se intentaron correlaciones cuantitativas in vitro a in vivo (Fishman et al., 1968; Komoda et al., 1981, Moss, 1983; Yora and Sakagishi, 1986; Sumikawa et al., 1990) . Por lo tanto los estudios se limitaron a la evaluación cualitativa de la hidrólisis dependiente de ALP en tejidos diferentes. lab se hidrolizó en presencia de suero y hepatocitos a partir de rata, perro, mono y humano así como en el ALP de placenta humana. En ocasiones en donde se midieron lab y IVa la conversión de lab a Iva fue cerca de la estequiométrica. Debido a la hidrólisis en suero, el enlace de proteínas de lab no se pudo determinar. Ninguno de los niveles muy bajos de lab se detectaron en plasma de ratas, perros y monos después de la administración oral de lab. IVa se formó rápidamente después de la administración IV de lab en ratas, perros y monos. Las relaciones de conversión de IV AUC fueron de 1.5 en ratas, 0.80 en perros y 0.70 en monos sugiriendo una buena conversión de lab a IVa.

Se observaron buenas biodisponibilidades orales (62-94%) de IVa después de la administración de lab en ratas, monos y perros. De manera más importante, la mayor solubilidad acuosa de lab disminuyó la absorción limitada por la tasa de disolución de IVa debajo de ciertas dosis y con ello se incrementaron las exposiciones de IVa en estudios tóxicos cinéticos y de escalamiento de dosis oral (Tablas 12-14 y figura 6-7) . Los niveles AUC de IVa en perros en ayuno que reciben las cápsulas lab fue alrededor de 40 veces los niveles en perros en ayuno que se le dieron cápsulas en forma clínica de IVa. Aunque es probable que una diferencia de 40 veces sea una sobrepredicción de la situación clínica con base en la experiencia de desarrollo con IVa, lab demuestra claramente el potencial para mejorar la absorción limitada por la tasa de disolución que se observa por el precursor IVa. Para investigar el efecto del alimento en la absorción oral de IVa en perros, se administraron lab y IVa en cápsulas bajo condiciones de ayuno y alimentación. No se observaron diferencias importantes en AUC y Cmax con lab mientras que se observó una mejora de 9 veces con IVa al alimentarse. Estos datos sugieren beneficios clínicos potenciales para pacientes infectados con VIH en quienes los niveles eficaces de sangre de IVa se pueden lograr sin el requerimiento de un alimento de alta grasa.

Métodos Los estudios descritos en este informe usaron la sal de mono-lisina de lab a menos que se establezca de otra manera. Cuantif icación de lab IVa por CL/EM/EM Se desarrollo un método de CL/EM/EM para el análisis de lab y IVa en muestras de plasma a partir de estudios animales farmacocinéticos así como en el sobrenadante de acetonitrilo a partir de estudios de incubación in vitro . Para el análisis en plasma, se usó un instrumento Packard Multiprobe para transferir 50 µL de cada estándar, QC y muestra de plasma para limpiar una placa de 96 pozos para extracción de precipitación de proteínas. Después de la adición de 200µL de acetonitrilo que contiene el estándar interno IVe, se mezclaron las muestras con vórtice y se separó el sobrenadante resultante a partir de las proteínas precipitadas por centrifugación durante 10 minutos. Para el análisis del sobrenadante generado a partir de los estudios in vitro, se mezcló un volumen igual al sobrenadante y acetonitrilo que contiene el estándar interno. Se transfirió una alícuota del sobrenadante anterior usando un manej ador líquido automatizado Tomtec a una segunda placa limpia de 96 pozos. Se agregó un volumen igual de agua y se cerró la placa y se mezclaron los vórtices. El sistema CLAR consiste de bombas Shimadzu LClOADvp (Columbia MD) y una automuestreador HTC PAL (Leap Technologies, Cary, NC) ligado a una columna analítica Phenomenex Synergi Fusion-RP (2.0 x 50 mm, 5 µ; Torrance, CA) . La fase móvil A consistió de formiato de amonio 5 mM en agua, la fase móvil B fue 100% acetonitrilo. La relación de flujo LC fue de 0.38 ml/min. La composición inicial de la fase móvil fue 3% B, inclinada a 60% B durante 1.75 min y se mantuvo por 0.25 min, inclinada hasta 100% B durante 0.1 min y se mantuvo por 0.8 min., regresó a las condiciones iniciales durantes los siguientes 0.1 min, y se volvió a equilibrar. El tiempo total del análisis fue de 4 minutos. El tiempo de retención para lab, IVa y IVe fue de 1.50, 1.67 y 1.73 minutos, respectivamente. El sistema CLAR formó interfases con un espectrómetro de masas de cuatro polos triple Sciex AP14000 (Toronto, Canadá) equipado con una fuente de rocío de turboiones fijada a 550°C y un voltaje de rocío de iones fijado a 4.5 kV. Se usó el nitrógeno UHP como nebulizador y gas auxiliar con una presión de 80 psi (5.62 kg/cm2) y 7 L/min, respectivamente. Las energías de colisión para lab, IVa y IVe fueron de 21, 29 y 31 voltios, respectivamente. La adquisición de datos utilizó un monitoreo de reacción seleccionado (SRM) . Los iones que representan las especies de modo de iones positivo (M+H)+ para lab, IVa y el estándar interno se seleccionaron en MSI y se disociaron por colisión con nitrógeno y optimizaron las energías de colisión para formar iones de productos específicos observados posteriormente por MS2. Las transiciones de SRM para lab, IVa y IVe fueron de m/z 533?435, 423?205 y 474?256, respectivamente. Las curvas estándar que van desde 5 nM hasta aO µM se prepararon a partir de soluciones de reserva y se diluyeron en serie para matrices lab y IVa. Las curvas estándar se formaron en alícuotas por duplicado, se extrajeron con las muestras y se inyectaron al comienzo a la mitad y la final de la secuencia analítica. Las curvas estándar se ajustaron con una regresión lineal ponderada por la concentración reciproca 1/x2. Los datos y los picos cromatográficos se procesaron y las concentraciones de los estándares e incógnitas se cuantificaron usando PEBiosystems Analyst™ 1.1.

Métodos in vitro (1) Estabilidad de lab en sangre EDTA, suero y solución amortiguadora Tris-HCl Se estudió la estabilidad de lab en sangre y suero fresco de rata perro, mono y humano (n=2) . Se recolectó la sangre en vacutainers que contienen K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . El suero se recolectó en vacutainers que no contienen anticoagulantes. lab se incubó a una concentración de partida de aproximadamente lOµM durante 60-90 min a 37 °C. Las muestras en serie se tomaron en tiempos predeterminados. Las alícuotas de las muestras de sangre (200µL) se mezclaron primero con lOOµL de agua seguido por 400µL de acetonitrilo. Se agregaron muestras de suero (50µL) en los microtainers que contienen K2EDTA (Becton Dickinson Franklin Lakes, NJ) seguido por la adición de lOOµL de acetonitrilo. Se analizó el sobrenadante para ambos lab e IVA por CL/EM/EM. La estabilidad de lab también se evaluó como se describe arriba en la solución amortiguadora Tris-HCl (0.1 M, pH 7.5) (2) Hidrólisis de lab en presencia de ALP de placenta humana El ALP de placenta humana se obtuvo a partir de Sigma (P-3895, St. Louis, MO) . Una solución de 1000 unidades/L se preparó en solución amortiguadora Tris-HCl (0.1 M, pH 7.5).

Se obtuvieron soluciones de 100 y 10 unidades/L por dilución en serie. Se incubó el lab en la solución de 10, 100 y 1000 unidades/L (n=2) a 37 °C durante 2 horas. La concentración de partidad de lab en la incubación fue de lOµM. Se tomaron alícuotas de las muestras de lOOµL en tiempos predeterminados y se agregaron en los microtainers K2EDTA seguido por la adición de 200 µL de acetonitrilo. Se analizó el sobrenadante para ambos lab y IVa por CL/EM/EM.

Estudios in vivo Se recolectaron todas las muestras de sangre (0.3 ml) en microtainers que contienen K2EDTA (Becton Dickinson Franklin Lakes, NJ) y se colocaron en hielo astillado. Después de la centrifugación se separó el plasma y se almacenó a -20°C hasta el análisis. La sal de monolisina de lab (forma 3, lote 1) se usó para los estudios farmacocinéticos . Se prepararon las soluciones de dosificación de lab en agua estéril (para administración IV en perros y monos) o agua destilada (para todas las otras administraciones de dosis). (1) Estudios in vivo en la rata Ratas macho Sprague-Dawley (300-350 g, Hilltop Lab Animáis, Inc. Scottsdale, PA) con cánulas implantadas en la vena yugular se usaron. Se pusieron en ayuno a las ratas durante la noche en los estudios farmacocinéticos PO. Se recolectaron muestras de sangre a partir de la vena yugular. En el estudio IV, lab se administró a 1.4 mg/kg (ácido libre, o 1.1 mg/kg o un equivalente IVa) como un bolo durante 0.5 min (n=3) . La concentración de la solución de dosificación fue de 1.4 mg/kg y el volumen de dosificación fue de 1 mg/kg. Se recolectaron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y a 2, 10, 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación. En el estudio PO, se administró lab a 7.9 mg/kg (ácido libre o 6.3 mg/kg de un equivalente IVa) por cebadura oral (n=3) . La concentración de la solución de dosificación fue de 40 mg/kg y el volumen de dosificación fue de 2 ml/kg. Las muestras de sangre en serie se recolectaron antes de la dosificación y a 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación. (2) Estudios in vivo en perros Los estudios IV y PO de lab se efectuaron en una forma cruzada en 3 perros machos sabuesos (11 + 1.1 kg, Marshall Farms USA Inc., North Rose, NY) . Existió un periodo de fracaso de 2 semanas entre los estudios IV y PO. En el estudio IV, se hizo infusión de lab por medio de la vena cefálica a 1.2 mg/kg (ácido libre o 0.95 mg/kg de un equivalente IVa) durante 5 minutos a una relación constante de 0.1 ml/kg/min. La concentración de la solución de dosificación fue de 2.4 mg/kg y el volumen de dosificación fue de 0.5 ml/kg. Las muestras de sangre en serie se recolectaron a partir de la arteria femoral antes de la dosificación y a 5, 10, 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación. En . el estudio PO se pusieron en ayuno los perros durante la noche antes de la dosificación. Se administró lab por cebadura oral a 6.6 mg/kg (ácido libre o 5.2 mg/kg de un equivalente IVa) . La concentración de la solución de dosificación fue de 13.2 mg/kg y el volumen de dosificación fue de 0.5 ml/kg. Se recolectaron muestras de sangre en serie antes de la dosificación y a 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación. Para estudiar el efecto de la alimentación en la absorción oral de IVa después de la administración de lab y IVa, se administraron estos 2 compuestos en cápsulas como un sólido a un grupo de 3 perros en una forma cruzada bajo ayuno durante la noche y condiciones de alimentación. Hubo un periodo de fracaso de 1 semana en cada estudio. lab se administró a 200 mg por perro { ca 20 mg/kg) de un equivalente IVa; IVa se administró en una formulación de cápsulas clínicas 200 mg por perro { ca 20 mg/kg) . En los estudios en donde se alimentaron los perros, se preparó el siguiente alimento: 2 rebanadas de tocino, 2 huevos, 2 piezas de pan tostado con mantequilla y mermelada, 4 oz. de papas a la parrilla y 8 oz. de leche entera. Después de la homogenización usando una licuadora de laboratorio, se dividió igualmente el alimento en 5 porciones y se congeló. Antes del estudio se deshelaron los alimentos y se le dio una porción a cada perro. Los estudios de formulación adicionales de IVa se efectuaron en perros en ayuno (n=2 por grupo de dosis) . A los perros se les administraron la forma clínica o la forma secada por rocío de IVa en cápsulas. La forma de cápsula clínica de IVa se administró a una dosis sencilla de 20 mg/kg. La forma secada por rocío de IVa se administró a 20, 75 y 200 mg/kg. (3) Estudios in vivo en el mono Los estudios IV y PO de lab se efectuaron en una forma cruzada en 3 monos cinomolgus machos (11 + 1.2 kg, Charles River Biomedical Research Foundation, Houston, TX) . Hubo un periodo de fracaso de 2 semanas entre los estudios IV y PO. En el estudio IV, el lab se puso por infusión por medio de la vena cefálica a 1.3 mg/kg (ácido libre o 1.1 mg/kg del equivalente IVa) durante 5 minutos a una relación constante de 0.1 ml/kg/min. La concentración de la solución de dosificación fue de 2.6 mg/ml y el volumen de dosificación fue de 0.5 ml/kg. Se recolectaron muestras de sangre en serie a partir de la arteria femoral antes de dosificar y a 5, 10, 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de dosificar. En el estudio PO se pusieron en ayuno durante la noche los monos antes de la dosificación. Se administró lab por cebadura oral a 7.1 mg/kg (ácido libre o 5.6 mg/kg de un equivalente IVa) . La concentración de la solución de dosificación fue de 14.2 mg/kg y el volumen de dosificación fue de 0.5 ml/kg. Las muestras de sangre en serie se recolectaron antes de la dosificación y a 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación. (4) Análisis de datos Todos los resultados se expresan como medias + SD a menos que se especifique de otra manera.

Los parámetros farmacocinéticos de lab y IVa se calcularon por una análisis que no es de compartimientos usando el programa de software KINETICA™ (versión 4.0.2, InnaPhase Co., Philadelphia, PA) . Los valores Cmax y T ax se registraron directamente a partir de las observaciones experimentales. Los valores AUCO-n y AUCtot se calcularon usando las sumas trapezoidales lineales logarítmicas mixtas. La depuración total en el cuerpo (Cl) , tiempo de residencia medio (MRT) y el volumen de distribución en régimen permanente (Vss) también se calcularon después de la administración intravenosa. Se estimó la biodisponibilidad oral absoluta (expresada como %) al tomar la relación de los valores AUC normalizados en la dosis después de dosis orales con aquellos después de dosis intravenosas. La depuración hepática ClH se calculó a partir de la siguiente ecuación usando el modelo bien agitado: Qh X Cl nt . in vivo C1H (ml/min/kg) = Qh + l nt. in vivo en donde Qh es el flujo de sangre al hígado de 55, 31, 44 y 21 ml/min/kg para la rata, perro, mono y humano, respectivamente (Davis and Morris, 1993) . La relación de extracción hepática (ER) se calculó como sigue: ER = C1H/Qh La prueba t de Student se usó para el análisis estadístico (Microsoft® Excel, Redmond, WA) . Se consideraron diferencias estadísticamente importantes al nivel de P <0.05.

Estudios In vitro Estabilidad de lab en sangre de EDTA, suero y solución amortiguadora Tris-HCl . Como parte de la validación del ensayo analítico, se estudio la estabilidad de lab en sangre que contiene EDTA que se sabe que es un inhibidor de las alcalinas fosfatasas (Bowers, Jr. and McComb, 1966; Yora and Sakagishi, 1986) . Después de una incubación a 37 °C durante 60 minutos, hubo una conversión de 1.2% a partir de la concentración inicial de lab a IVa en sangre de rata (Tabla 15) y una conversión menor al 1% en sangre de mono y humano (Tablas 15 y 16) . Hubo aproximadamente una conversión del 6% en sangre de perro y los porcentajes de conversión fueron similares entre dos perros diferentes así como en el mismo perro en dos ocasiones de prueba diferente (Tablas 15 y 16), Bajo la condición de almacenamiento de muestra de -20 °C los porcentajes pequeños anteriores de conversión observados a 37 °C no se espera que introduzcan ninguna conversión importante ex vivo durante el análisis de lab. lab fue estable en la solución amortiguadora Tris-HCl a 37 °C durante el periodo de estudio de 60 minutos (Tabla 17) .

Tabla 15: Estabilidad de lab en sangre fresca de EDTA de rata perro, y mono.

* Porcentaje formado como la concentración de partida de lab. Tabla 16: Estabilidad de lab en sangre fresca de EDTA de perro (repetición) y humano .

* Porcentaje formado como la concentración de partida de lab.

Tabla 17: Estabilidad de lab en solución amortiguadora Tris- HCl .

* Porcentaje formado como la concentración de partida de lab.

Para investigar la hidrólisis de lab en la circulación sistémica se incubó lab en suero fresco (rata, perro, mono y humano) a 37 °C durante 90 minutos. La tasa de hidrólisis fue la más rápida en el suero de rata seguido por los sueros de perro, mono y humano (Tabla 18) . La conversión de lab a IVa fue casi estequiométrica. El suero contiene actividades inferiores ALP en comparación con los tejidos (McComb et al., 1979a). Además el suero también contiene isoformas ALP a partir de fuentes de tejido tales como hueso, hígado, e intestino que se atribuye a una fuga a través de los vasos sanguíneos (Moss, 1983) . Por lo tanto, la hidrólisis de lab en suero está mediada probablemente por isoformas múltiples de ALP.

Tabla 18: Estabilidad de lab en suero fresco de rata , perro, mono y humano .

* Calculado como la desaparición de lab **Las vidas medias son mayores que el periodo de incubación Hidrólisis de lab en presencia de ALP de placenta humana Para estudiar la hidrólisis de lab en una forma purificada de ALP, humano, se incubó el lab en soluciones ALP de placenta humano a 10, 100 y 1000 unidades/L a 37 °C por 2 horas. Se determinó la desaparición de t?/2 de lab y se reportó en la Tabla 19. Como se esperaba la tasa de hidrólisis fue más rápida en soluciones con mayores actividades ALP. También se formó de esta manera IVa (figura 8) . Esto indica que lab se hidroliza por el ALP derivado de humanos para formar IVa.

Tabla 19: Hidrólisis de lab en soluciones ALP en placenta humana .

Nota : lab se incubó a una concentración de partida de ~10 µM a 37 ° C durante 120 min .

Estudios In Vivo Estudios in vivo en la rata Los parámetros farmacocinéticos de lab y IVa en ratas después de administración oral e intravenosa de lab se resumen en la Tabla 20. Los perfiles de concentración de plasma contra tiempo se muestran en la figura 9. Para comparación, también se muestran los datos históricos de los estudios farmacocinéticos de IVa en ratas. La depuración total del cuerpo (Cl) de lab después de la administración IV fue de 14 ml/min/kg lo que sugiere que lab es un compuesto de baja depuración en ratas. La vida media de eliminación (t?/2) y el tiempo de residencia medio (MRT) después de la administración IV fueron de 0.16 hr y 0.14 hr, respectivamente. No se detectó el lab mas allá de 2 horas. El volumen de distribución de lab en estado permanente (Vss) fue de 0.12 L/kg, lo que sugiere una distribución de tejido muy limitada. La formación de IVa a partir de lab después de la administración IV fue rápida; IVa se detectó en un primer punto de tiempo de muestreo de dos minutos (no se muestran los datos) . La relación IV AUC de IVa formada a partir de lab contra aquella del estudio histórico IVa fue de 1.5. (valor teórico para la conversión completa es de 1) , lo que sugiere una conversión completa de lab a IVa. Con la excepción de una muestra (5 nM; Tabla 20) , lab no se detectó en ningunas muestras después de la administración oral. El Tmax de IVa después de la administración oral de lab fue de 0.83 horas, que es más corto que el Tmax de IVa de 2.0 hr histórico lo que indica una absorción mas rápida de IVa después de la administración oral del profármaco. La absorción más rápida de IVa a partir del profármaco es probablemente en resultado de una mejor solubilidad acuosa de lab así como de una hidrólisis rápida de lab para formar IVa en el intestino. Aunque la biodisponibilidad absoluta oral de IVa a partir de lab fue 62% inferior a aquella de los datos históricos de IVa, la exposición de IVa a partir del estudio de escalamiento de dosis oral de rata lab fue superior a los datos históricos con IVa (Tabla 16 y figura 8) .

La concentración terminal de plasma contra los perfiles de tiempo de IVa formados a partir de lab son similares a los perfiles históricos IVa. Tabla 20: Parámetros f armacocinéticos de lab y IVa después de una administración IV y oral de lab en ratas (medía + SD, n =3) NA - no aplicable; ND no detectado (> 5nM) * Las relaciones se calcularon a partir de ?043 AUC después de dosificación con profármaco para IV y PO respectivamente ?043 AUC después de dosificación con ?043 ** lab se detectó solamente en una rata a 15 min (5nM) . *** calculado a partir de los datos históricos IV de IVa. 31. Estudios in vivo en el perro. Los parámetros farmacocinéticos de lab y IVa en perros después de una administración oral IV lab se resumen en el Tabla 21. Los perfiles de concentración de plasma contra tiempo se muestran en la figura 10. Para comparación, los datos históricos de los estudios farmacocinéticos de IVa en perros también se muestran. El Cl de lab después de la administración IV fue de 70 ml/min/kg que es significativamente superior al nivel de sangre en el hígado de 31 ml/min/kg en perro, lo que sugiere un involucramiento potencial de hidrólisis extrahepática y/u otras vías de eliminación (por ejemplo, excreción renal) . El ti2 y MRT después de la administración IV fue de 0.15 hr respectivamente. lab no fue más allá de 45 minutos. El Vss de lab fue de 0.30 L/kg lo que sugiere un bajo potencial para la distribución del tejido. La formación de IVa a partir de lab después de la administración intravenosa fue rápida; IVa se detectó en un primer punto de muestreo de 5 minutos (no se muestra en los datos) . La relación IV AUC de IVa formada a partir de lab contra el estudio histórico IVa fue de 0.80 lo sugiere una buena conversión de lab a IVa.

El lab se detectó a 5 Nm (LLQ) solamente a 15 min y 30 min en un perro después de administración oral. El Tmax de IVa después de administración oral de lab fue de 0.25 horas que es más corto que el IVa histórico de Tmax de IVa de 2.9 horas lo que indica una absorción más rápida de IVa que sigue a la administración oral del profármaco. La biodisponibilidad oral absoluta de IVa a partir de lab fue de 94% mayor que los IVa de datos históricos de 57%. La concentración terminal en plasma contra tiempo en los perfiles de IVa formados a partir de lab son similares a los perfiles históricos de IVa.

Tabla 21: Parámetros f armacocinéticos de lab y IVa que siguen a la administración oral e intravenosa de lab en perros (media + SD, n =3) * lab se detectó a 5nM (LLQ) solamente a 15 min y 30 min en un perro . Para estudiar - el efecto de la alimentación en la absorción oral de IVa después de la administración de lab y IVa se administraron los perros ya sea con lab y IVa en cápsulas bajo condiciones de ayuno y alimentación. El estudio se llevó a cabo en una forma cruzada con un periodo de fracaso de 1 semana entre cada estudio. No se observaron diferencias importantes en el AUC y Cmax entre las condiciones de ayuno y alimentadas después de la administración de lab (Tabla 2), mientras que se observó una mejora de 9 veces en AUC y Cmax después de la administración de IVa con alimentación (Tabla 23) . En general, el efecto de la alimentación fue más pronunciado en perros (Tabla 23) que en sujetos humanos (Tabla 24) que reciben IVa. Esto sugiere diferencias cuantitativas de especie en el efecto de alimentación en la absorción oral de IVa. La absorción oral de IVa se muestra que está limitada por la relación de disolución en especies humanas y animales. La mejora de la exposición de IVa en humanos con la alimentación con un alimento de alta grasa se debe presumiblemente a la secreción creciente de las sales biliares que facilita la disolución de IVa. En los perros, la falta del efecto de alimentación en la absorción oral de IVa después de una administración con lab sugiere beneficios potenciales en humanos para quienes no se puede requerir una modificación en la dieta.

Tabla 22; Efecto de alimentación en la exposición oral de IVa en perros después de la administración oral de lab en cápsulas llenadas en seco (20 mg/kg de un equivalente IVa) (media + ds , n=3) Nota: lab se detectó a <200 nM en unas cuantas muestras en puntos de tiempo tempranos Tabla 23 : Efecto de alimentación en la exposición oral de IVa en perros después de la administración oral de IVa en Cápsulas de forma clínica (20 mg/kg de un equivalente IVa) (media + ds , n=3) * Significativamente diferentes de los valores bajo condición de ayuno Tabla 24; Efecto del alimento en la exposición oral de IVa en el primer estudio en humanos (Media + ds , n-6) Se efectuaron estudios adicionales de formulación de cápsulas en los mismos perros en ayuno con formas clínicas y secadas por rocío de IVa para comparar con lab. Como se muestra en la Tabla 25 a 20 mg/kg del equivalente IVa, se observó una exposición similar de IVA después de la administración de lab y la forma secada por rocío de IVa. Sin embargo, lab suministró una exposición significativamente mayor de IVa en comparación con la forma clínica de IVa. El AUC y Cmax de IVa del profármaco fue 37 veces y 45 veces mayor respectivamente que los valores de la forma clínica de IVa. El incremento en veces en los perros es probablemente una sobrepredicción de la situación clínica con base a la experiencia con IVa en desarrollo (no se muestran los datos) .

En el estudio de escalamiento de dosis en la forma secada por rocío de IVa en perros, los incrementos de AUC y Cmax a partir de 20 mg/kg hasta 75 mg/kg fueron menos proporcionales al incremento de dosis (Tabla 26) . No se observaron incrementos importantes adicionales en la exposición a partir de 75 mg/kg hasta 200 mg/kg. Tabla 25: Exposición oral de IVa en perros después de administración oral de lab y formulaciones diferentes de IVa en cápsulas (estudios cruzados) * AUC fue 0-24 hr Tabla 26: Exposición oral de IVa en perros después de administración oral de la forma secada por rocío de IVa en cápsulas ** Como en tabla. **AUC fue 0-24 hr.

Estudios in vivo en el mono Los parámetros farmacocinéticos de lab y IVa después de administración oral de IV de lab se resumen en la Tabla 27. los perfiles de concentración de plasma contra el tiempo se muestran en la figura 11. Para comparación los datos históricos de los estudios farmacocinéticas de IVa en monos también se muestran. El Cl de lab después de administración IV fue de 4.4 ml/min/kg lo que sugiere que lab es un compuesto de baja depuración en monos. El tH y MRT después de la administración IV fue de 1.0 hr y 0.18 hr, respectivamente. El MRT refleja un estimado más realista de la duración de lab en plasma ya que las concentraciones en plasma de lab en la fase terminal fueron bajas (figura 11) . lab no se detecto después de 6 horas. El Vss de lab fue 0.048 L/kg lo que sugiere una distribución de tejido muy limitada. La formación de IVa a partir de lab después de la administración IV fue rápida; IVa se detecta en el primer punto de muestreo de 5 minutos (no se muestran datos) . La relación de IV AUC de IVa formada a partir de lab contra el estudio histórico de IVa fue 0.70 lo que sugiere una buena conversión de lab a IVa. El lab se detectó a una concentración de 18 nM a 15 minutos solamente en un mono después de la administración oral. El Tmx de IVa después de administración oral de lab fue 0.83 hr. que es más corto que el Tmax histórico de IVa de 2.7 hr. Lo que indica una absorción más rápida de IVa que sigue la administración oral del profármaco. La biodisponibilidad oral absoluta de IVa a partir de lab fue de 66% similar a los datos históricos de IVa de 60%. Los perfiles de la concentración terminal de plasma contra tiempo de IVa formados a partir de lab son similares a los perfiles históricos de IVa. Tabla 27: Parámetros f rmaco cinéticos de lab y IVa que siguen a una administración IV y oral de lab en monos media + ds , n=3) *Iab se detecta a 18 nM a 15 minutos solamente en un mono.

Sección adicional 2 de formación de perfiles Estudios adicionales con el profármaco Ibb Los estudios farmacocinéticos IV y PO de Ibb se efectuaron en ratas, perros y monos. En todos los casos, se recolectaron muestras de sangre en presencia de EDTA. La presencia de EDTA, un inhibidor conocido de ALP minimizó la conversión importante ex vivo de Ibb durante el procesamiento de la muestra. IVb se formó rápidamente después de una administración intravenosa de Ibb. Se observaron buenas biodisponibilidades orales de IVb (50-310%; calculado usando el IV AUC histórico de IVb) después de la administración de Ibb en ratas, perros y monos con niveles muy bajos de Ibb presentes en plasma. Ya que hay niveles elevados de expresión de ALP en los intestinos, es probable que después de la administración oral de Ibb, el Ibb se hidrolice por ALP presente en las membranas de frontera de cepillado de lumen intestinal para formar IVb, que se absorbe rápidamente debido a su alta permeabilidad. Se llevaron a cabo estudios de incubación in vitro para una evaluación cualitativa de la hidrólisis dependiente de ALP de Ibb en diferentes tejidos. Ibb se hidrolizó en presencia de suero y hepatocitos a partir de rata, perro, mono y humano así como de ALP de placenta humana. En ocasiones en donde se midieron los Ibb e IVb la conversión de Ibb a IVb fue casi estequiométrica. Debido a la hidrólisis en el suero, no se pudo determinar el enlace de proteínas de Ibb. Con base en los datos in vitro se anticipa que Ibb se hidrolizará por el ALP humano y que IVb se formará después de la administración oral de Ibb a los sujetos humanos. La solubilidad cristalina de Ibb-03 a temperatura ambiente es de >11 mg/ml en el rango de pH de 1.5 hasta 8.7; se han preparado soluciones acuosas que contienen >75 mg/ml para estudios de toxicología in vivo. En comparación, la solubilidad acuosa del compuesto precursor IVb a temperatura ambiente como material cristalino se determina que es 0.007-0.19 mg/ml (rango de pH de 1.0-9.6). Ibb-03 muestra estabilidades aceptables en solución y sólidos. La solubilidad acuosa superior de Ibb proporciona una media para superar la absorción limitada por la velocidad de disolución de IVb debajo de ciertas dosis y con ello se incrementan las exposiciones de IVb en estudios toxicocinéticos y de escalamiento de dosis oral. Ibb cuando se dosifica oralmente hasta 200 mg/kg de los equivalentes de IVb suministran 11 y 2.6 veces (BID) superiores de AUC de IVb en ratas y perros, respectivamente con una exposición relativamente baja de plasma al profármaco (<0.9 µM) en comparación con el AUC de los estudios de suspensión IVb históricos a una dosis similar.

Estudios toxicocinéticos de dosis sencillas en ratas Sprague Da wl ey Un estudio toxicocinético oral de 1 día en ratas se efectúo al usar el profármaco Ibb (sal de monolisina) . Ibb se administró en dosis de 19, 64 y 236 mg/kg (ácido libre) por cebadura oral a 3 ratas macho/grupo usando agua como el vehículo (formulación en solución) . Las dosis del ácido libre de profármaco corresponden a dosis equivalentes molares IVb (precursores) de 15, 51 y 190 mg/kg, respectivamente. El punto final evaluado fue la toxicocinética de Ibb y IVb en las ratas individuales. Se proporcionan los valores medios toxicocinéticos en la Tabla 28. Tabla 28: Valores medios toxicocinéticos para Ibb y IVb en ratas macho que se les dan <200 mg/kg de Ibb como una dosis oral sencilla Dosis (mg/kg) Ibb 19 64 236 Eq. Molar IVb 15 51 190 Ibb IVb Ibb IVb Ibb IVb Cmax (µM) 0.027 58 0.14 135 0.25 290 C2 h (µM) <LLQ 0.048 <LLQ 0.29 <LLQ 29 0.181 9972 0.491 37002 AUC (µM«h) 0.0301 2832 4.6 2.1 3.6 5.8 Tl/2 (h) 1.3 2.1 Los valores representan medias de una a tres ratas/grupo para los datos de Ibb y 3 ratas/grupo para los datos de IVb. LLQ es el límite inferior de cuantificación. 1 AUC desde cero hasta el último punto de tiempo 2 AUC desde cero hasta infinito.

La concentración media máxima de plasma (Cmax) de IVb (precursor) se logró dentro de alrededor de 1-3 horas posterior a la dosis. En ratas que se les dio <236 mg/kg, el incremento en AUC de IVb fue casi proporcional con la dosis de Ibb, y la Cmax se incrementa en una forma menos que proporcional a la dosis entre 19 y 236 mg/kg de Ibb. La Ibb se detectó en plasma de ratas dado > 19 mg/kg de Ibb pero a muy bajas concentraciones con relación a aquellas de IVb. Una comparación de IVb Cmax y AUC obtenido en ratas ya sea IVb o Ibb se muestra en la figura 12. La exposición a IVb se incrementa sustancialmente después de la administración de Ibb en comparación con lo logrado después de dosificar IVb.

Estudio de Tolerancia y Toxicocinétíco de Dosis Sencilla en Perros Se efectuó un estudio de dos fases para evaluar la tolerancia del profármaco, Ibb (sal de monolisina) a dosis de 25, 92 ó 250 mg/kg (ácido libre, equivalente molar para 20, 74 ó 201 mg/kg de precursor IVb, respectivamente) y la toxicocinética de Ibb y IVb (1) . El día 1, se administró el IBB a un perro/sexo/grupo una vez al día en cápsulas llenadas en seco a las dosis anteriores. Se usó un periodo de fracaso de 1 semana entre las dosis en el estudio. El día 8, el Ibb se administró a un perro/sexo/grupo una vez al día como una solución acuosa de 25 mg/kg o dos veces al día en cápsulas llenas en seco a 46 ó 125 mg/kg BID. Los puntos finales fueron: signos clínicos, peso corporal, consumo de alimento, química de suero, hematología y toxicocinética de plasma de Ibb e IVb.

Los valores de toxicocinética de plasma de los perros individuales se muestran en la tabla 29.

Tabla 29 : Valores toxicocinéticos para IVb en perros administrados con <250 mg/kg de Ibb . 1 Formulado como cápsulas llenas en seco el día 1 y como una solución acuosa formulada el día 8 (dosificación QD en ambos días) 2 Como 92 mg/kg QD el día 1 y como 46 mg/kg BID el día 8; formulado como cápsulas llenas en seco en ambos días 3 Como 250 mg/kg QD el día 1 y como 125 mg/kg BID el día 8; formulados como cápsulas llenas en seco ambos días Emesis observada dentro de 2 horas de dosificación con la cápsula restante presente invención 5 Emesis observada dentro de dos horas de dosificación sin remanente de cápsulas . Se detectaron niveles bajos de Ibb (<0.9 µM) en algunas muestras de plasma los días 1 y 8. La concentración media máxima de plasma (Cmax) de IVb se alcanzó entre 1-4 horas después de la dosis para la dosificación QD, y 1-2 horas después de la segunda dosis para la dosificación BID. A 25 mg/kg QD, se observó la Cmax equivalente y AUC de IVb cuando se administró Ibb como cápsulas llenas en seco o como solución acuosa. El día 1, la emesis (blanca con franjas rojas que contenían los restos de la cápsula) se observó a alrededor de 0.5-1.25 horas después de la dosificación en todos los perros que se les dio >92 mg/kg QD (3101M, 3201F, 4101M, y 4201F) , que probablemente contribuyó a la exposición plana entre 92 y 250 mg/kg. El día 8, la emesis (blanca o café) se observó dentro de 2 horas después de la dosificación en todos los perros administrados con >46 mg/kg BID; solamente se observaron los restos de las cápsulas en los vómitos de dos perros (3101M después de la primera dosis y 4201F después de la segunda dosis) . La dosificación dos veces al día suministró una mayor exposición a IVb en perros que la dosificación una vez al día. Aparte de la emesis, no se observaron signos clínicos, y no existieron efectos en el peso corporal y el consumo de alimentos . A pesar de la emesis observada en perros, un AUC de IVb superior se observa en perros administrados con Ibb que en perros administrados con IVb. Una comparación del AUC IVb obtenido en perros que se les administra Ibb o IVb (2) se muestra en la figura 13. La biodisponibilidad absoluta oral de IVb, compuesto precursor, después de la administración de soluciones acuosas de Ibb-03, el profármaco de fosfato, en el intervalo de 50% a 310% en ratas, perros y monos. Estos cálculos se basan en datos históricos IV. La exposición de IVb, después de la administración oral de soluciones acuosas del profármaco, Ibb-03, se dosificó con hasta 190 mg/kg de IVb equivalente es de 3 a 10 veces superior en el estudio de escalamiento de dosis oral en ratas en comparación con los datos históricos con IVb. Cuando el Ibb-03 se dosifica BID como fármaco en cápsula en perros, se alcanza una mejora de 2-3 veces en la exposición en comparación con los datos históricos de estudios de toxicología pre-ECN con dosificación BID de IVb como suspensiones. Los datos de exposición in vivo del fármaco en formulaciones de cápsula sugiere que la exposición oral de IVb en humanos se puede mejorar significativamente por la administración de formas de dosis orales sólidas tradicionales de Ibb. Ibb es el profármaco de fosfato del aducto de N- hidroximetilo de IVb y se hidroliza por la fosfatasa alcalina (ALP) para formar IVb . Después de la administración de Ibb a los animales por lo tanto, se prepararon muestras de plasma de la sangre recolectada en presencia de EDTA, un inhibidor conocido de ALP. La conversión de Ibb a IVb fue mínima (<2%) en la sangre que contiene EDTA (rata, perro, mono y humano) . No se espera una conversión importante ex vivo de IBB durante el almacenamiento de la muestra (-20 °C) y análisis de Ibb. La hidrólisis de Ibb se estudió en sistemas in vitro de animales y humanos. Ya que las isoformas mpultiples de ALP se distribuyen ampliamente en varios tejidos, no se intentaron correlaciones cuantitativas in vivo a in vitro (Fishman et al., 1968; Cómoda et al., 1981; Moss, 1983; Yora y Sakagishi, 1986; Sumikawa et al., 1990) . Por lo tanto, los estudios se limitaron a la evaluación cualitativa de la hidrólisis dependiente de ALP en tejidos diferentes. Se hidrolizó el Ibb en presencia de suero (rata, perro, mono y humano) , hepatocitos (rata, perro, y humano) así como en ALP de placenta humana. No se observó retorno en hepatocitos de mono. La conversión de Ibb a IVb fue casi estequiométrica. Debido a la hidrólisis en suero, el enlace de proteína a Ibb no se pudo determinar. El Ibb se hidrolizó completamente para formar IVb en células Caco-2 y como se esperaba, se detectaron niveles muy bajos de Ibb en plasma de rata, perro y mono después de la administración oral de Ibb. Estos datos son consistentes con los reportes que describen los altos niveles de expresión de ALP en los intestinos (McComb et al., 1979a; Butterworth, 1983) . La ALP de enlace a membranas se localiza principalmente en las membranas de frontera de cepillo de las microvellosidades que cubren el lumen intestinal (Butterworth, 1983; Testa y Mayer, 2003) . Es probable que después de la administración oral de Ibb, se hidrolice Ibb por el ALP presente en las membranas de frontera de cepillo del lumen intestinal para formar IVb, que se absorbe rápidamente debido a su alta permeabilidad. Aunque existen diversas isoformas de ALP en diferentes tejidos y especies, la especificidad del substrato para ALP es relativamente amplia (Heimbach et al., 2003), que es consistente con los hallazgos anteriores para Ibb. Se formó rápidamente IVb después de la administración IV de Ibb en ratas, perros y monos. Las relaciones de conversión de AUC IV fueron 0.62 en ratas, 1.6 en perros y 1.7 en monos, lo que sugiere una conversión de buena a satisfactoria de Ibb a IVb. Se observaron buenas disponibilidades orales (50-310%; calculado usando el AUC IV histórico de IVb) de IVb después de la administración de Ibb en ratas, perros y monos. Más importantemente, la solubilidad acuosa superior de Ibb disminuyó la absorción limitada por la tasa de disolución de IVb y por ello incrementó las exposiciones de IVb en estudios toxicocinéticos y de escalamiento de dosis oral en comparación con las exposiciones de estudios históricos de IVb (Discovery Toxicology, sección Tablas 28-29 y Fig. 12- 13) .

Métodos Los estudios descritos en este informe usaron la sal de monolisina de Ibb.

Cuantif ícación de Ibb y IVb por CL/EM/EM Se desarrolló un método CL/EM/EM par a el análisis de Ibb e IVb en muestras de plasma de estudios farmacocinéticos en animales así como en el sobrenadante en acetonitrilo de estudios de incubación in vitro. Para el análisis en plasma, se usó un instrumento Packard Multiprobe para transferir 50 µL de cada estándar, QC, y muestra de plasma a una placa limpia de 96 pozos para la extracción por precipitación de proteínas. Después de la adición de 200 µL de acetonitrilo que contiene el estándar interno IVe, se mezclaron por vórtice las muestras y se separó el sobrendanate resultante de las proteínas precipitadas por centrifugación durante 10 min. Para el análisis en el sobrenadante generado de los estudios in vitro, se mezcló un volumen igual del sobrenadante y el acetonitrilo que contiene el estándar interno. Se transfirió una alícuota del sobrenadante anterior usandp un manej ador de líquido automatizado Tomtec a una segunda placa limpia de 96 pozos. Se agregó un volumen igual de agua, y se cerró la placa y se mezcló por vórtice. El sistema CLAR consistió de bombas Shimadzu LClOAdvp (Columbia MD) y un automuestreador HTC PAL (Leap Technologies, Cary, NC) ligada a una columna analítica RP- Phenomenex Synregi Fusión (2.0 x 50 mm, 5µ; Torrance, CA) . La fase móvil A consistió de formiato de amonio 5mM en agua; la fase móvil B fue 100% acetonitrilo. La relación de flujo LC fue 0.38 ml/min. La composición de fase móvil inicial fue de 2% B, inclinada a 50% B durante 1.8 min y se mantuvo por 0.5 min, inclinada a 100% B durante 0.1 min y se mantuvo durante 0.5 min, regresó a condiciones iniciales durante el siguiente 0.1 min y se re-equilibró. El tiempo de análisis total fue de 4.0 min. El tiempo de retención para Ibb, IVb e IVe fue 1.42, 2.21 y 1.73 min, respectivamente. El sistema CLAR se colocó en inferíase a un espectrómetro de masa de cuatro polos triple Sciex API4000 (Toronto, Canadá) equipado con la fuente de turborocío de iones colocada a 550 °C y el voltaje de rocío de iones colocado a 4.5 kV. Se usó nitrógeno UHP como nebulizador y gas auxiliar con la presión de 80 psi (5.62 Kg/cm2) y 7L/min, respectivamente. Las energías de colisión para Ibb, IVb y Ivc fueron 19, 25 y 29 voltios, respectivamente. La adquisición de datos utiliza monitoreo de reacción seleccionado (SRM) .

Los iones representan la especie del modo de ion positivo (M+H)+ para Ibb, IVb y los estándares internos se seleccionan en MSI y se disocian en forma de colisión con nitrógeno y las energías de colisión optimizadas para formar iones de producto específico monitoreado posteriormente por MS2. Las transiciones para Ibb, IVb y Ivc fueron m/z 558?-432, 448—>202 y 474—>256, respectivamente. Se preparan curvas estándar en el rango desde 5 nM hasta 10 µM de soluciones de almacenamiento y se diluyen en serie en una matriz tanto para Ibb como IVb. Las curvas estándar se coloca en alícuotas por duplicado, se extrae con las muestras, y se inyecta al inicio, la mitad, y al final de la secuencia analítica. Las curvas estándar se equipan con una regresión lineal pesada por 1/x2 de concentración recíproca. Los datos y picos cromatográficos se procesan y las concentraciones de estándares y desconocidos se cuantifican usando el PEBiosystems Analyst® 1.1. Métodos In Vi tro (1) Estabilidad de Ibb en sangre EDTA, suero y solución amortiguadora Tris-HCl La estabilidad de Ibb se estudió en sangre fresca y suero de rata, perro, mono y humano (n = 2) . La sangre se colectó en vacunadores que contienen K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . El suero se colectó en vacunadores que no contienen anticoagulantes. Se incubó el Ibb a una concentración de partida de aproximadamente 15 µM durante 90 minutos a 37 °C. Se toman muestras en serie en los tiempos predeterminados. Las alícuotas de muestras de sangre (200 µL) se mezclan primero con 100 µL de agua seguido por 400 µL de acetonitrilo. Las muestras de suero (50 µL) se agregan en microtainers que contienen K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) seguido por la adición de 100 µL de acetonitrilo. El sobrenadante se analizó tanto para Ibb como IVb por CL/EM/EM. La estabilidad de Ibb también se evalúa, como se describe arriba, en solución amortiguadora Tris-HCl (0.1 M, pH 7.5). (2) Hidrólisis de Ibb en Presencia de ALP de Placenta Humana Se obtiene ALP de placenta humana sólido de Sigma (P-3895, San Luis, MO) . Se prepara una solución de 1000 unidades/L en solución amortiguadora Tris-HCl (0.1 M, pH 7.5). Se obtienen soluciones de 100 y 10 unidades/L por dilución en serie.- Se incuba el Ibb en las soluciones de 10, 100 y 1000 unidades/L (n = 2) a 37°C durante 2 horas. La concentración inicial de Ibb en la incubación fue 10 µM. Las alícuotas de muestras de 100 µL se toman a tiempos predeterminados y se agrega en microtainers K2EDTA seguido por la adición de 200 µL de acetonitrilo. El sobrenadante se analizó tanto para Ibb como IVb por CL/EM/EM.

Estudios In Vivo Todas las muestras de sangre { 0 . 3 ml) se colectan en microtainers que contienen K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y se colocan en hielo molido. Después de la centrifugación, se separa el plasma y se almacena a -20 °C hasta su análisis. La sal de mono-lisina de Ibb (Forma 3= se usa para los estudios farmacocinéticos . Las soluciones de dosificación de Ibb se preparan ya sea en agua estéril (para administración IV en perros y monos) o agua destilada (para todas las otras administraciones de dosis) . (1) Estudios In Vivo en la Rata Se usan ratas Sprague-Dawley machos (300-350 g, Hilltop Lab Animáis, Inc. Scottsdale, PA) con cánulas implantadas en la vena yugular. Las ratas se ayunan durante la noche en los estudios farmacocinéticos PO. Las muestras de sangre se colectan de la vena yugular. En el estudio IV, el Ibb se entrega a 1.3 mg/kg (ácido libre, o 1.0 mg/kg de equivalente IVb) como un bolo durante 0.5 minuto (n = 3) . La concentración de la solución de dosificación fue 1.3 mg/ml, y el volumen de dosificación fue 1 ml/kg, las muestras de sangre en serie se colectaron antes de dosificar y a 2, 10, 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de dosificar. En el estudio PO, el Ibb se administra a 6.6 mg/kg (ácido libre, o 5.2 mg/kg de equivalente IVb) por dosificación oral (n = 3) . La concentración de la solución de dosificación fue 1.3 mg/ml, y el volumen de dosificación fue 5 ml/kg. Las muestras de sangre en serie se colectaron antes de dosificar y a 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de dosificar. (2) Estudios In Vivo en el Perro Los estudios IV y PO de Ibb se conducen en perros macho beagle (10+0.78 kg, Marshall Farms USA In., North Rose, NY) . Se usan tres perros en cada estudio. De los tres perros, se usan dos perros iguales para ambos estudios IV y PO. Hubo un periodo de lavado de dos semanas entre los estudios IV y PO. En el estudio IV, el Ibb se vierte por medio de la vena cefálica a 1.3 mg/kg (ácido libre, o 1.0 mg/kg de equivalente IVb) durante 5 minutos a una velocidad constante de 0.1 ml/kg/minuto. La concentración de la solución de dosificación fue 2.6 mg/ml, y el volumen de dosificación fue 0.5 ml/kg. Se colectaron muestras sanguíneas en serie de la arteria femoral antes de dosificar y a 5, 10, 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de dosificar. En el estudio PO, lo perros se ayunaron durante la noche antes de dosificar. El Ibb se administró por dosificado oral a 7.0 mg/kg (ácido libre, o 5.6 mg/kg de equivalente IVb) . La concentración de la solución de dosificación fue 7.0 mg/ml, y el volumen de dosificación fue 1 ml/kg. Se colectaron muestras sanguíneas en serie antes de dosificar y a 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de dosificar. (3) Estudios In Vivo en el Mono Los estudios IV y PO de Ibb se conducen en una manera cruzada en tres monos cynomolgus macho (9.9 ± 2.4 kg, Charles River Biomedical Research Foundation, Houston, TX) . Hubo un periodo de lavado de dos semanas entre los estudios IV y PO. En el estudio IV, el Ibb se vierte por medio de la vena femoral a 1.3 mg/kg (ácido libre, o 1.1 mg/kg de equivalente IVb) durante 5 minutos a una velocidad constante de 0.1 ml/kg/minuto. La concentración de la solución de dosificación fue 2.7 mg/ml, y el volumen de dosificación fue 0.5 ml/kg. Se colectaron muestras sanguíneas en serie de la arteria femoral antes de dosificar y a 5, 10, 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de dosificar. En el estudio PO, los monos se ayunaron durante la noche antes de dosificar. El Ibb se administró por dosificado oral a 5.8 mg/kg (ácido libre, o 4.7 mg/kg de equivalente IVb) . La concentración de la solución de dosificación fue 5.8 mg/ml, y el volumen de dosificación fue 1 ml/kg. Se colectaron muestras sanguíneas en serie antes de dosificar y a 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de dosificar. (4) Análisis de Datos Todos los resultados se expresan como media ± SD, salvo que se especifique de otra manera. Los parámetros farmacocinéticos de Ibb y IVb se calculan por Análisis de No División usando el programa de software KINETICA® (versión 4.0.2, InnaPhase Co., Filadelfia, PA) . Los valores Cmax y Tmax se registraron directamente de observaciones experimentales. Los valores AUCo-n y AUCtot se calculan usando las sumas trapezoides no lineales mezcladas. La evacuación corporal total (Cl) , tiempo de residencia medio (MRT) , y volumen de estado firme de distribución (Vss) también se calculan después de la administración intravenosa. La biodisponibilidad oral absoluta (expresada como %) se estima al tomar la relación de valores AUC de dosis normalizada después de las dosificaciones orales para aquellas dosis intravenosas posteriores. La evacuación intrínseca in vitro de Ibb en hepatocitos (Clint) se calcula como sigue: lint (µL/min/millón de células) =Velocidad/CE donde la Velocidad es la velocidad del metabolismo en hepatocitos (pmol/min/millón de células) , y CE es la concentración de Ibb en la incubación. La evacuación hepática intrínseca in vivo de Ibb (CIint, in vio) se calcula como sigue: 120 (millón de células) X g de hígado 1 CIintlin vivO x x x_ g de hígado kg de peso corporal 1000 donde ? es 40 , 32 , 30 y 26 g de hígado/kg de peso corporal para la rata, perro, mono y humano, respectivamente ( Davis and Morris , 1993 ) . La evacuación hepática C1H se calcula de la siguiente ecuación usando el modelo bien agitado : Qh x CZipt,. C1H (ml/min/kg) = + j i r±n. ivo donde Qh es el flujo sanguíneo del hígado de 55, 31, 44 y 21 ml/min/kg para la rata, perro, mono y humano, respectivamente (Davis and Morris, 1993) . La relación de extracción hepática (ER) se calcula como sigue: ER - C1H/Qh Se usan pruebas t de Student para análisis estadístico (Microsoft® Excel, Redmond, WA) . Las diferencias se consideran estadísticamente importante al nivel de P < 0.05.

Estudios In Vitro Estabilidad de Ibb en Sangre EDTA, Suero y Solución Amortiguadora Tris-HCl Como parte de la validación de ensayo analítico, la estabilidad de Ibb se estudia en la sangre que contiene EDTA, que se conoce que es un inhibidor de ALP (Bowers, Jr. And McComb, 1966; Yora and Sakagishi, 1986) . Después de la incubación a 37 °C durante 90 minutos, hay menos del 2% de conversión de Ibb a IVb en la sangre que contiene EDTA y en presencia de solución amortiguadora Tris-HCl (Tablas 30 y 31). Los porcentajes pequeños anteriores de la conversión observada a 37 °C, indica que la conversión bajo las condiciones de almacenamiento de la muestra (-20 °C) no es posible. Por lo tanto, se espera una conversión ex vivo relativamente mínima a IVb durante el análisis de Ibb. Tabla 30 : Estabilidad de Ibb en la Sangre EDTA Fresca de Rata , Perro y Mono Tiempo Sangre de Rata (n = 2) Sangre de Perro (n = 2) Sangre de Mono (n = 2) (min) Ibb Nb % /Vfc Ibb IVb % IVb Ibb IVb (µM) Formado Formado (µM) Formado Formado (µM) Formado Form (µM) * (µM) * ' (µM) * 0 15 0.23 1.6 13 0.089 0.68 16 0.075 0.47 15 15 0.22 1.5 12 0.079 0.60 19 0.12 0.76 30 18 0.26 1.7 15 0.085 0.65 18 0.13 0.80 45 15 0.29 1.9 16 0.095 0.73 18 0.13 0.82 60 16 0.31 2.0 13 0.088 0.67 19 0.14 0.86 90 17 0.32 2.1 16 0.11 0.82 17 0.14 0.89 * Porcentaje formado como la concentración inicial de Ibb Tabla 31 : Estabilidad de Ibb en la Sangre EDTA Fresca de Humano y Solución Amortiguadora Tris-HCl Tiempo Sangre Humana (n = 2) Solución Amortiguadora Tris-HCl (n = 2) ^ Ibb (µM) IVb % IVb Ibb (µM) TVb Formado % IVb Formado Formado Formado * (µM) * (µM) 0 16 0.099 0.62 14 0.30 2.2 15 15 0.093 0.58 12 0.30 2.1 30 16 0.097 0.60 13 0.33 2.3 45 16 0.11 0.67 12 0.41 2.9 60 16 0.10 0.65 13 0.51 3.7 90 18 0.12 0.73 12 0.51 3.6 * Porcentaje formado como la concentración inicial de Ibb Para investigar la hidrólisis de Ibb en la circulación sistémica, el Ibb se incuba en suero fresco (rata, perro, mono y humano) a 37 °C durante 90 minutos. La velocidad de hidrólisis fue más rápida en el suero de mono, seguido por el de suero humano, perro y rata (Tabla 3) . La conversión de Ibb a IVb casi fue estoiquiométrica. El suero contiene actividades ALP reducidas en comparación con los tejidos (McComb et al., 1979a). Además, el suero también contiene isoformas ALP de fuentes de tejido tales como hueso, hígado e intestino, como resultado de la filtración de enzima a través de los vasos sanguíneos (Moss, 1983) . Por lo tanto, la hidrólisis de Ibb en el suero se media probablemente por isoformas múltiples de ALP.

Tabla 32 : Estabilidad de Ibb en la Suero Fresco de Rata, Perro, Mono y Humano Tiempo Suero de Rata (n = 2) Suero de Perro (n = 2) Suero de Mono Suero de Humano (min) (n = 2) (n = 2) Ibb IVb Ibb IVb Ibb IVb Ibb P b (µM) Formado (µM) Formado (µM) Formado (µM) Formado (µM) (µM) (µM) (µM) 0 12 0.095 13 0.13 14 0.34 13 0.14 9.4 0.33 12 0.66 6.6 6.5 9.0 0.96 9.2 0.60 11 1.2 3.1 8.5 10 2.0 45 9.4 0.92 10 1.7 1.7 10 10 3.1 60 9.3 1.3 10 2.4 0.85 11 8.0 3.6 90 9.0 2.2 8.9 3.6 0.22 13 6.5 5.0 * Calculado como la desaparición de ibb- ** Las vidas medias son mayores que el periodo de incubación.

Hidrólisis de Ibb en Presencia de ALP de Placenta Humana Para estudiar la hidrólisis de Ibb en una forma purificada de ALP humano, el Ibb se incuba a 37 °C (2 horas) con soluciones que contienen ALP de placenta humana (10, 100 y 1000 unidades/L) . La desaparición de t?/2 de Ibb se determina (Tabla 4) . Como se espera, la velocidad de hidrólisis fue más rápida en las soluciones con actividades ALP mayores. IVb también se forma en consecuencia (Figura 14) . Esto indica que Ibb se hidroliza por la ALP derivada de humanos para formar IVb.

Tabla 33 : Hidrólisis de Ibb en Soluciones de ALP de Placenta Humana Actividad ALP (Unidades ll) (n - 2) 10 100 1000 Nota: Ibb se incuba a una concentración de inicio de 10 µM a 37 °C durante 120 minutos.

Estudios In Vivo Estudios In Vivo en la Rata Los parámetros farmacocinéticos de Ibb y IVb en ratas después de la administración IV y oral de Ibb, se resumen en la Tabla 34. La concentración de plasma contra los perfiles de tiempo se muestra en la Figura 15. Para comparación, los datos históricos de los estudios farmacocinéticos de IVb en ratas también se muestran. La evacuación corporal total (Cl) de Ibb después de la administración fue de 19 ml/min/kg, lo que sugiere que Ibb es un compuesto de evacuación bajo a moderado en ratas. La vida media de eliminación (tx/2) y tiempo de residencia medio (MRT) después de la administración IV fueron 0.18 hora y 0.079 hora, respectivamente. El lab no se detecta más allá de 2 horas. El volumen de distribución de Ibb en el estado firme (Vss) fue 0.10 L/kg, lo que sugiere una distribución de tejido muy limitada. La formación de IVb de Ibb después de la administración IV fue rápida; IVb se detectó en el primer punto de tiempo de muestreo de 2 minutos (datos no mostrados) . La relación IV AUC de IVb formado de Ibb contra el del estudio IVb histórico, fue 0.62 (valor teórico para conversión completa = 1) , lo que indica la conversión satisfactoria de Ibb a IVb en ratas después de dosificación IV. El Ibb se detectó (< 10 nM) en el plasma (0.25 y 0.5 hora) después de la administración oral. El Tmax de IVb después de la administración oral de Ibb fue 0.83 hora, que es más corto que el Tmax histórico de IVb de 4.7 horas, lo que indica una absorción más rápida de IVb después de la administración oral del profármaco. La absorción más rápida de IVb del profármaco, posiblemente es el resultado de una mejor solubilidad acuosa de Ibb así como una hidrólisis rápida de Ibb para formar IVb en el intestino. La biodisponibilidad oral absoluta de IVb del Ibb fue 50%, similar al valor IVb histórico de 60% (Tabla 34) . Por otro lado, la exposición de IVb del estudio de escala de dosis oral de Ibb de rata fue superior comparado con los datos históricos con IVb (Tabla 31 y Figura 14).

Tabla 34: Parámetros Farmacocinéticos de Ibb y IVb Después de la Administración Oral e IV de Ibb en la Rata (Media ± SD, n = 3) .

NA - no aplicable; ND - no detectado (<5 nM) . * Las relaciones se calculan de IVb AUC después de la dosificación del profármaco / IVb AUC después de la dosificación de IVb para IV y PO, respectivamente. ** Calculado de los datos IV históricos de IVb- Estudios In Vivo en el Perro Los parámetros farmacocinéticos de Ibb y IVb en perros después de la administración IV y oral de Ibb, se resumen en la Tabla 35. La concentración de plasma contra los perfiles de tiempo se muestra en la Figura 16. Para comparación, los datos históricos de los estudios farmacocinéticos de IVb en perros también se muestran. La Cl de Ibb después de la administración IV fue de 27 ml/min/kg, similar al flujo sanguíneo del hígado de 31 ml/min/kg en perros, lo que sugiere que Ibb es un compuesto de evacuación alto en perros. La t?/2 y MRT después de la administración IV fueron 0.83 hora y 0.21 hora, respectivamente. El MRT refleja un estimado más realista de duración de Ibb en el plasma, ya que las concentraciones de plasma de Ibb en la fase terminal fueron bajas (Figura 3) . Ibb no se detecta más allá de 4 horas. El Vss de Ibb fue 0.35 L/kg, lo que sugiere una distribución de tejido limitada. La formación de IVb de Ibb después de la administración IV fue rápida; IVb se detectó en el primer punto de tiempo de muestreo de 5 minutos (datos no mostrados) . La relación IV AUC de IVb formado de Ibb contra el del estudio IVb histórico, fue 1.6, lo que sugiere una conversión completa de Ibb a IVb en perros después de dosificación IV.

El Ibb se detectó (< Cmax = 0.034 nM) en muestras de plasma en puntos de tiempo previos (hasta 2 horas en un perro) después de la administración oral. El Tmax de IVb después de la administración oral de Ibb fue 0.40 hora, que es similar al Tmax histórico de IVb de 0.50 hora. La biodisponibilidad oral absoluta de IVb del Ibb fue 310%, similar a los datos IVb históricos de 179%. Por otro lado, la exposición de IVb del estudio de tolerancia de perro Ibb (escala de dosis) fue mayor cuando se compara con los datos históricos con IVb (Tabla 31 y Figura 15) .

Las concentraciones de plasma terminal contra los perfiles de tiempo de IVb formados de Ibb, son similares a los perfiles IVb históricos (Figura 16) .

Tabla 35: Parámetros Farmacocinéticos de Ibb y IVb Después de la Administración Oral e IV de Ibb en el Perro (Media ± SD, n = 3) .

* Las relaciones se calculan de IVb AUC después de la dosificación del profármaco / IVb después de dosificación de IVb por IV y PO, respectivamente. ** Calculado de los datos IV históricos de IVb.

Estudios In Vivo en el Mono Los parámetros farmacocinéticos de Ibb y IVb en monos después de la administración IV y oral de Ibb, se resumen en la Tabla 36. La concentración de plasma contra los perfiles de tiempo se muestra en la Figura 17. Para comparación, los datos históricos de los estudios farmacocinéticos de IVb en monos también se muestran. La Cl de Ibb después de la administración IV fue de 28 ml/min/kg, lo que sugiere que Ibb es un compuesto de evacuación moderado a alto en monos. La t?2 y MRT después de la administración IV fueron 0.10 hora y 0.093 hora, respectivamente. El Vss de Ibb fue 0.15 L/kg, lo que sugiere una distribución de tejido muy limitada. La formación de IVb de Ibb después de la administración IV fue rápida; IVb se detectó en el primer punto de tiempo de muestreo de 5 minutos (datos no mostrados) . La relación IV AUC de IVb formado de Ibb contra el del estudio IVb histórico, fue 1.7, lo que sugiere una conversión completa de Ibb a IVb en monos después de dosificación IV. El Ibb no se detectó (LLQ = 5 nM) en ninguna de las muestras de plasma después de la administración oral. El Tmax de IVb después de la administración oral de Ibb fue 1.5 hora, que es similar al Tmax histórico de IVb de 2.5 horas. La biodisponibilidad oral absoluta de IVb del Ibb fue 187%, que es mayor que los datos históricos con IVb del 49% (Tabla 36) .

Las concentraciones de plasma terminal contra los perfiles de tiempo de IVb formados de Ibb, son similares a los perfiles IVb históricos (Figura 17) .

Tabla 36: Parámetros Farmacocinéticos de Ibb y IVb Después de la Administración Oral e IV de Ibb en el Mono (Media ± SD, n = 3) .

* Las relaciones se calculan de IVb AUC después de la dosificación del profármaco / IVb para AUC después de dosificación de IVb por IV y PO, respectivamente. ** Calculado de los datos IV históricos de IVb.

Sección de formación de Perfil 3 : Estudios Adicionales con el Profármaco Icb Estudio de Tolerancia Toxicocinética de Dosis Sencilla Un estudio de toxicocinética oral de 1 día en ratas se conduce usando el profármaco Icb (sal de disodio) . El Icb se administra a dosis de 5, 25, y 200 mg/kg (ácido libre) por dosificación oral a tres ratas macho/grupo usando agua como el vehículo (formulación de solución) . Las dosificaciones del ácido libre profármaco corresponden a las dosis equivalentes molares de Ivc (precursor) de 4.5, 21, y 163 mg/kg, respectivamente. El punto final evaluado fueron los toxicocinéticos de plasma de Icb y Ivc en ratas individuales. Los valores toxicocinéticos medios se proporcionan en la tabla 37.

Tabla 37: Valores toxicocinéticos medios para Icb y Ivc en ra tas machos dando =200 mg/kg de Icb como una dosis oral sencilla Los valores representan medias de las tres ratas/grupo para datos Icb y 3 ratas/grupo para datos Ivc. "? c desde cero hasta 8 2AUC desde cero hasta 24 horas La concentración de plasma máxima media (Cmax) de Ivc (precursor) se alcanza dentro de «1.7 hora después de la dosis. En las ratas que se les da <267 mg/kg de Icb, el incremento en AUC de Ive fue cercanamente proporcional con la dosificación Icb, y el Cmax se incrementa en menos que de manera proporcional a loa dosis entre 25 y 200 mg/kg de Icb. El Icb no se detecta en el plasma de ratas que se les da <25 mg/kg de leb, y muy bajas concentraciones («0.02-0.04 µM) se detectan en el plasma de ratas que se les da 200 mg/kg de Icb en algunos puntos de tiempo. Una comparación de Ivc AUC obtenido en ratas que se les da ya sea Ivc (1) o Icb, se muestra en la Figura 18. El AUC de Ivc es similar después de la administración de ya sea el precursor o profármaco a dosificaciones inferiores (por ejemplo, <25 mg/kg) debido a que ambas pueden formularse como soluciones (PEG-400/etanol/NaOH 0.1N para precursor y agua para profármaco) pero a una dosificación mayor (por ejemplo, 200 mg/kg) el precursor natural sólo puede formularse como una suspensión, mientras que la sal de profármaco puede formularse como una solución acuosa, que proporciona una exposición superior de Ivc.

Estudio de Tolerancia y Toxicocinético de Dosis Sencilla en Perros Se conduce un estudio de dos fases para evaluar la tolerancia del profármaco, Icb (sal de monotrometamina) a dosis de 25, 92, ó 250 mg/kg (ácido libre, equivalente molar a 20, 75, ó 203 mg/kg del IVe precursor, respectivamente) y los toxicocinéticos de Icb y IVe (2) . El día 1, el Icb se administra a un perro/sexo/grupo una vez al día en cápsulas de relleno seco a las dosis anteriores. Se usa un periodo de lavado de 1 semana entre las dosis en el estudio. El día 8, el Icb se administra a un perro/sexo/grupo una vez al día como una solución acuosa a 25 mg/kg o dos veces al día en cápsulas de relleno seco a 46 ó 125 mg/kg BID. Los puntos finales fueron: señales clínicas, peso corporal, consumo de alimento, química del suero, hematología y toxicocinéticos del plasma de Icb y IVc. Los valores toxicocinéticos del plasma de perros individuales se muestran en la Tabla 38.

Tabla 38: Valores toxicocinéticos para IVe en perros que se les da =250 mg/kg de Icb Dosificaciones (mg/kg) „ Icb 251 2^ 2503 rVc equiv. molar 20 75 203 Animal 2101M 2201F 3101M 3201F 4101M 4201F Cmax (µM) 4 4 día 1 65.1 24.6 1174 157 92.6 88.9 4 día 8 59.4 46.8 121 104 2265 96.9 C24h (µM) dia l 0.008 0.688 1.90 •0202 2.61 0.704 día 8 0.547 0.107 10.6 0.307 54.2 1.96 4 4 día 1 365 122 820 730 739 5234 día 8 362 173 1137 490 37835 5964'5 Tl/2 (h) dia l 1.5 4.5 3.6 2.3 4.1 3.2 día 8 3.3 3.4 5.2 2.4 8.0 3.3 ^"Formulado como cápsulas de relleno seco el día 1 y como una solución acuosa el día 8 formulada (dosificación QD en ambos días) 2Como 92 mg/kg QD el día 1 y como 46 mg/kg BID el día 8; formulado como cápsulas de relleno seco en ambos días 3Como 250 mg/kg QD el día 1 y como 125 mg/kg BID el día 8; formulado como cápsulas de relleno seco en ambos días 4Se observa emesis dentro de 2 horas de la dosificación con remanente de cápsula presente 5Se observa emesis dentro de 2 horas de la dosificación sin remanente de cápsula Se detectan bajos niveles (< 0.1 µM) de Icb en algunas muestras de plasma en los días 1 y 8. La concentración de plasma máxima media (Cmax) de IVe se alcana entre 1-2 horas después de la dosificación QD, y 1-2 horas después de la segunda dosis para dosificación BID. A 25 mg/kg QD, el Cmax equivalente y AUC de IVe se observa cuando el Icb se administra ya sea como cápsulas de relleno seco o una solución acuosa. El día 1, se observa emesis (blanco o café, jaspeado con rojo que contiene restos de cápsula) a alrededor de 1-1.25 hora después de la dosificación en perros dando <92 mg/kg QD (3101M, 4101M, y 4201F) , que posiblemente contribuye a la exposición plante entre 92 y 250 mg/kg. El día 8, se observa emesis dentro de 2 horas después de dosificar en ambos perros que se les da 125 mg/kg BID, pero con diferentes resultados. El animal 4101M tiene una exposición substancial no obstante la emesis, consistente con la ausencia de restos de cápsula en el vómito. Sólo se detectan niveles bajos (=O.l µM) de Icb en algunas muestras de plasma en los días 1 y 8. Diferentes al emesis, no hay señales clínicas observadas, y no hay efectos en el peso corporal y consumo alimenticio . A pesar del emesis observado en perros, se observa una IVe AUC mayor en perros que se les da Icb que en perros que se les da IVc. La comparación de IVe AUC obtenida en perros que se les da ya sea Icb o IVe (3, 4), se muestra en la Figura 19. Vehículos y Formulaciones Resumen de Formulaciones Usadas para PK Clave y Estudios de Seguridad Todos los estudios PK in vivo en ratas, perros, y monos se realizan usando soluciones acuosas para dosificación PO e IV. Los estudios de toxicología Pre-ECN en perros se realizaron con soluciones acuosas preparadas a dosis equivalentes IVe de 20 mg/kg y como fármaco en formulaciones de cápsula a dosis de 20, 75, y 203 mg/kg de equivalentes IVc. En el estudios de escala de dosis oral de rata, se dosifica Icb-03 como soluciones acuosas a dosis de 4.5, 21, y 163 mg/kg de equivalentes IVc. Se observan mejoras importantes en AUC y Cmax de IVe, compuesto precursor, después de la dosificación oral de Icb, el profármaco, en comparación con los datos históricos después de la dosificación oral de IVc. Metabolismo y Resumen de Farmacocinéticos Resumen de Hallazgos e Interpretación El Icb es el profármaco de fosfato del aducto de N-hidroximetilo de IVe, y se hidroliza por la fosfatasa alcalina (ALP) para formar IVc. Después de la administración .de Icb a animales, por lo tanto, las muestras de plasma se preparan de la sangre colectada en presencia de EDTA, un inhibidor ALP conocido. La conversión de Icb a IVe fue mínima (< 2%) en la sangre que contiene EDTA (rata, perro, mono y humano) . No se espera una conversión ex vivo importante de Icb durante el almacenamiento de la muestra (-20 °C) y el análisis de Icb. La hidrólisis de Icb se estudia en sistemas in vitro anima y humano. Ya que las múltiples isoformas ALP se distribuyen ampliamente en varios tejidos, no se intentan correlaciones cuantitativas in vitro a in vivo (Fishman et al., 1968; Komoda et al., 1981; Moss, 1983; Yora and Sakagishi, 1986; Sumikawa et al., 1990). Por lo tanto, los estudios se limitan a una evaluación cualitativa de la hidrólisis dependiente de ALP en diferentes tejidos. El Icb se hidroliza en presencia de suero (rata, perro, mono y humano) , hepatocitos (rata, perro y humano) así como en ALP de placenta humana. No se observa cambio en los hepatocitos de mono. La conversión de Icb a IVe fue casi estoiquiométrica . Debido a la hidrólisis en el suero, el enlace de la proteína de Icb no podrá determinarse. El IVe se formó rápidamente después de la administración IV de Icb en ratas, perros y monos. Las relaciones de conversión IV AUC fueron 1.0 en ratas, 0.67 en perros y 0.90 en monos, lo que sugiere una buena conversión de Icb a IVc. Se observan buenas biodisponibilidades orales (80-122%) de IVe después de la administración de Icb en ratas, perros, y monos. Más significativamente, la solubilidad acuosa mayor de Icb disminuye la absorción limitada por la velocidad de disolución de IVe debajo de ciertas dosis y por ello incrementa las exposiciones de IVe en la escala de dosis oral y estudios toxicocinéticos en comparación con las exposiciones de los estudios IVe históricos. Métodos Los estudios descritos en este reporte usando la sal de onotrometanima de Icb, salvo que se establezca de otra manera. Cuantif icación de Icb y IVe por CL/EM/EM Se desarrolla un método de CL/EM/EM para el análisis de Icb y IVe en muestras de plasma de los estudios farmacocinéticos animales, así como en sobrenadante de acetonitrilo de estudios de incubación in vitro. Para el análisis del plasma, se usa un instrumento Packard Multiprobe para transferir 50 µL de cada estándar, QC, y muestra de plasma a una placa de 96 pozos limpia para la extracción por precipitación de proteína. Después de la adición de 200 µL de acetonitrilo que contiene el compuesto X estándar interno de abajo, las muestras se mezclaron en vórtice y el sobrenadante resultante se separó de las proteínas precipitadas por centrifugación durante 10 minutos. Para el análisis en el sobrenadante generado de los estudios in vitro, se mezcla un volumen igual del sobrenadante y acetonitrilo que contiene el estándar interno. Una alícuota del sobrenadante anterior se transfiere usando un manej ador líquido automatizado Tomtec para una segunda placa de 96 pozos limpia. Se agrega un volumen igual de agua, y la placa se tapa y se mezcla por vórtice. Compuesto X 4-metoxi-3- (2-oxo-2- (4- (quinazolin-4-il) piperazin-1-il) acetil) -lH-pirrolo [2, 3-c] piridina-7-carboxamida El sistema CLAR consiste de bombas Shimadzu LClOAdvp (Columbia, MD) , y un automuestreador HTC PAL (Leap Technologies, Cary, NC) enlazado a una columna analítica Phenomenex Synergi Fusion-RP (2.0 x 50 mm, 5 µ; Torrance, CA) . La fase móvil A consiste de formiato de amonio 5 mM en agua; la fase móvil B fue 100% acetonitrilo. La velocidad de flujo fue 0.4 ml/min. La composición de fase móvil inicial fue 3% B, elevado hasta 60 % B durante 1.75 minuto y mantenido por 0.5 minuto, elevado hasta 100% B durante 0.1 minuto y mantenido por 0.5 minuto, regresando a las condiciones iniciales durante el siguiente 0.1 minuto, y re-equilibrando. El tiempo de análisis total fue de 4.0 minutos, el tiempo de retención para Icb, IVe y Compuesto X fue 1.2, 1.7 y 1.6 minutos, respectivamente. El sistema CLAR se colocó en inferíase a un espectrómetro de masa de cuatro polos triple Sciex API4000 (Toronto, Canadá) equipado con la fuente de turborocío de iones colocada a 550 °C y el voltaje de rocío de iones colocado a 4.5 kV. Se usó nitrógeno UHP como nebulizador y gas auxiliar con la presión de 80 psi (5.62 Kg/cm2) y 7 L/min, respectivamente. Las energías de colisión para Icb, IVe y Compuesto X fueron 23, 29 y 37 voltios, respectivamente. La adquisición de datos utiliza monitoreo de reacción seleccionado (SRM) . Los iones representan la especie del modo de ion positivo (M+H)+ para Icb, IVe y los estándares internos se seleccionan en MSI y se disocian en forma de colisión con nitrógeno y las energías de colisión optimizadas para formar iones de producto específico monitoreado posteriormente por MS2. Las transiciones SRM para Icb, IVe y Compuesto X fueron m/z 584->486, 474Y256 y 460—218, respectivamente. Se preparan curvas estándar en el rango desde 5 nM hasta 10 µM de soluciones de almacenamiento y se diluyen en serie en una matriz tanto para Icb como IVc. Las curvas estándar se colocan en alícuotas por duplicado, se extraen con las muestras, y se inyecta al inicio, la mitad, y al final de la secuencia analítica. Las curvas estándar se equipan con una regresión lineal pesada por 1/x2 de concentración recíproca. Los datos y picos cromatográficos se procesan y las concentraciones de estándares y desconocidos se cuantifican usando el PEBiosystems Analyst® 1.1.

Métodos In Vitro (1) Estabilidad de Ibc en sangre EDTA, suero y solución amortiguadora Tris-HCl La estabilidad de Icb se estudió en sangre fresca y suero de rata, perro, mono y humano (n = 2) . La sangre se colectó en vacunadores que contienen K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . El suero se colectó en vacunadores que no contienen anticoagulantes. Se incubó el Icb a una concentración de partida de aproximadamente 10 µM durante 90 minutos a 37 °C. Se toman muestras en serie en los tiempos predeterminados. Las alícuotas de muestras de sangre (200 ml) se mezclan primero con 100 ml de agua seguido por 400 ml de acetonitrilo. Las muestras de suero (50 ml) se agregan en microtainers que contienen K2EDTA (Becton - Dickinson, Franklin Lakes, NJ) seguido por la adición de 100 ml de acetonitrilo. El sobrenadante se analizó tanto para Icb como IVe por CL/EM/EM. La estabilidad de Icb también se evalúa, como se describe arriba, en solución amortiguadora Tris-HCl (0.1 M, pH 7.5). (2) Hidrólisis de Icb en Presencia de ALP de Placenta Humana Se obtiene ALP de placenta humana sólido de Sigma (P- 3895, San Luis, MO) . Se prepara una solución de 1000 unidades/L en solución amortiguadora Tris-HCl (0.1 M, pH 7.5). Se obtienen soluciones de 100 y 10 unidades/L por dilución en serie. Se incuba el Icb en las soluciones de 10, 100 y 1000 unidades/L (n = 2) a 37 °C durante 2 horas. La concentración inicial de Icb en la incubación fue 10 µM. Las alícuotas de muestras de 100 ml se toman a tiempos predeterminados y se agrega en microtainers K2EDTA seguido por la adición de 200 ml de acetonitrilo. El sobrenadante se analizó tanto para Icb como IVe por CL/EM/EM. (1) Estudios In Vivo en la Ra ta Se usan ratas Sprague-Dawley machos (300-350 g, Hilltop Lab Animáis, Inc. Scottsdale, PA) con cánulas implantadas en la vena yugular. Las ratas se ayunan durante la noche en los estudios farmacocinéticos PO. Las muestras de sangre se colectan de la vena yugular. En el estudio IV, el Icb se entrega a 1.4 mg/kg (ácido libre, o 1.0 mg/kg de equivalente IVe) como un bolo durante 0.5 minuto (n = 3) . La concentración de la solución de dosificación fue 1.4 mg/ml, y el volumen de dosificación fue 1 ml/kg, las muestras de sangre en serie se colectaron antes de dosificar y a 2, 10, 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de dosificar. En el estudio PO, el Icb se administra a 6.9 mg/kg (ácido libre, o 5.6 mg/kg de equivalente IVe) por dosificación oral (n = 3) . La concentración de la solución de dosificación fue 1.4 mg/ml, y el volumen de dosificación fue 5 ml/kg. Las muestras de sangre en serie se colectaron antes de dosificar y a 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de dosificar. (2) Estudios In Vivo en el Perro Los estudios IV y PO de Icb se conducen de una manera cruzada en tres perros macho beagle (12+2.8 kg, Marshall Farms USA In., North Rose, NY) . Hubo un periodo de lavado de dos semanas entre los estudios IV y PO.

En el estudio IV, el Icb se vierte por medio de la vena cefálica a 1.3 mg/kg (ácido libre, o 1.0 mg/kg de equivalente IVe) durante 5 minutos a una velocidad constante de 0.1 ml/kg/minuto. La concentración de la solución de dosificación fue 2.6 mg/ml, y el volumen de dosificación fue 0.5 ml/kg. Se colectaron muestras sanguíneas en serie de la arteria femoral antes de dosificar y a 5, 10, 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de dosificar. En el estudio PO, lo perros se ayunaron durante la noche antes de dosificar. El Icb se administró por dosificado oral a 6.0 mg/kg (ácido libre, o 4.9 mg/kg de equivalente IVe) . La concentración de la solución de dosificación fue 12 mg/ml, y el volumen de dosificación fue 0.5 ml/kg. Se colectaron muestras sanguíneas en serie antes de dosificar y a 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de dosificar. (3) Estudios In Vivo en el Mono Los estudios IV y PO de Icb se conducen en una manera cruzada en tres monos cynomolgus macho (10 + 1.6 kg, Charles River Biomedical Research Foundation, Houston, TX) . Hubo un periodo de lavado de dos semanas entre los estudios IV y PO.

En el estudio IV, el Icb se vierte por medio de la vena femoral a 1.4 mg/kg (ácido libre, o 1.1 mg/kg de equivalente IVe) durante 5 minutos a una velocidad constante de 0.1 ml/kg/minuto. La concentración de la solución de dosificación fue 2.8 mg/ml, y el volumen de dosificación fue 0.5 ml/kg. Se colectaron muestras sanguíneas en serie de la arteria femoral antes de dosificar y a 5, 10, 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de dosificar. En el estudio PO, los monos se ayunaron durante la noche antes de dosificar. El Icb se administró por dosificado oral a 4.9 mg/kg (ácido libre, o 4.0 mg/kg de equivalente IVe) . La concentración de la solución de dosificación fue 9.8 mg/ml, y el volumen de dosificación fue 0.5 ml/kg. Se colectaron muestras sanguíneas en serie antes de dosificar y a 15, 30, 45 minutos, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de dosificar. (4) Análisis de Da tos Todos los resultados se expresan como media + SD, salvo que se especifique de otra manera. Los parámetros farmacocinéticos de Icb y IVe se calculan por Análisis de No División usando el programa de software KINETICA® (versión 4.0.2, InnaPhase Co . , Filadelfia, PA) . Los valores Cmax y Tmax se registraron directamente de observaciones experimentales. Los valores AUC0-n y AUCtot se calculan usando las sumas trapezoides no lineales mezcladas. La evacuación corporal total (Cl) , tiempo de residencia medio (MRT) , y volumen de estado firme de distribución (Vss) también se calculan después de la administración intravenosa.

La biodisponibilidad oral absoluta (expresada como %) se estima al tomar la relación de valores AUC de dosis normalizada después de las dosificaciones orales para aquellas dosis intravenosas posteriores. La evacuación intrínseca in vitro de Icb en hepatocitos (Clint) se calcula como sigue: Clnt (µl/min/millón de células) =Velocidad/CE donde la Velocidad es la velocidad del metabolismo en hepatocitos (pmol/min/millón de células) , y CE es la concentración de Icb en la incubación. La evacuación hepática intrínseca in vivo de Icb (Clint, m vxvo>) I se calcula como sigue: 120 (millón de células) X g de hígado Cljntin vi o x x g de hígado kg de peso corporal 1000 donde X es 40 , 32 , 30 y 26 g de hígado/kg de peso corporal para la rata, perro, mono y humano, respectivamente ( Davis and Morris , 1993 ) . La evacuación hepática C1H se calcula de la siguiente ecuación usando el modelo bien agitado : QÍ1 X l n^in vivo ClH (ml/min/kg) = Qh + 0-ii ,in vivo donde Qh es el flujo sanguíneo del hígado de 55, 31, 44 y 21 ml/min/kg para la rata, perro, mono y humano, respectivamente (Davis and Morris, 1993) .

La ración de extracción hepática (ER) se calcula como sigue: ER = C1H/Qh Se usan pruebas t de estudiante para análisis estadístico (Microsoft® Excel, Redmond, WA) . Las diferencias se consideran estadísticamente importante al nivel de P < 0.05. Estudios In Vi tro Estabilidad de Icb en Sangre EDTA, Suero y Solución Amortiguadora Tris-HCl Como parte de la validación de ensayo analítico, la estabilidad de Icb se estudia en la sangre que contiene EDTA, que se conoce que es un inhibidor de fosfatasa alcalina (Bowers, Jr. And McComb, 1966; Yora and Sakagishi, 1986) . Después de la incubación a 37 °C durante 90 minutos, hay menos del 2% de conversión de Icb a IVe en la sangre que contiene EDTA y en presencia de solución amortiguadora Tris-HCl (Tablas 39 y 40) . Bajo la condición de almacenamiento de la muestra de -20 °C, los porcentajes pequeños anteriores de la conversión observada a 37 °C, no se espera que introduzca ninguna conversión ex vivo importante durante el análisis de Icb.

Tabla 39 : Estabilidad de Icb en la Sangre EDTA Fresca de Ra ta , Perro y Mono * Porcentaje formado como la concentración inicial de Icb Tabla 40: Estabilidad de Icb en la Sangre EDTA Fresca de Humano y Solución Amortiguadora Tris-HCl * Porcentaje formado como la concentración inicial de Icb Para investigar la hidrólisis de Icb en la circulación sistémica, el Icb se incuba en suero fresco (rata, perro, mono y humano) a 37 °C durante 90 minutos. La velocidad de hidrólisis fue más rápida en el suero de mono, seguido por el de suero de rata, humano y de perro (Tabla 41) . La conversión de Icb a IVe casi fue estoiquiométrica. El suero contiene actividades ALP reducidas en comparación con los tejidos (McComb et al., 1979a). Además, el suero también contiene isoformas ALP de fuentes de tejido tales como hueso, hígado e intestino, como resultado de la filtración de enzima a través de los vasos sanguíneos (Moss, 1983) . Por lo tanto, la hidrólisis de Icb en el suero se media probablemente • por isoformas múltiples de ALP.

Tabla 41: Estabilidad de Icb en la Suero Fresco de Rata, Perro, Mono y Humano * Calculado como la desaparición de Icb. ** Las vidas medias son mayores que el periodo de incubación.

Hidrólisis de Icb en Presencia de ALP de Placenta Humana Para estudiar la hidrólisis de Icb en una forma purificada de ALP humano, el Icb se incuba a 37 °C (2 horas) con soluciones que contienen ALP de placenta humana (10, 100 y 1000 unidades/L) . La desaparición de t1 2 de Icb se determina (Tabla 42) . Como se espera, la velocidad de hidrólisis fue más rápida en las soluciones con actividades ALP mayores. IVe también se forma en consecuencia (Figura 14) . Esto indica que Icb se hidroliza por la ALP derivada de humanos para formar IVc.

Tabla 42: Hidrólisis de Icb en Soluciones de ALP de Placenta Humana Nota: Icb se incuba a una concentración de inicio de 10 µM a 37 °C durante 120 minutos.

Estudios In Vivo Estudios In Vivo en la Rata Los parámetros farmacocinéticos de Icb y IVe en ratas después de la administración IV y oral de Icb, se resumen en la Tabla 43. La concentración de plasma contra los perfiles de tiempo se muestra en la Figura 21. Para comparación, los datos históricos de los estudios farmacocinéticos de IVe en ratas también se muestran. La evacuación corporal total (Cl) de Icb después de la administración fue de 49 ml/min/kg, lo que sugiere que Icb es un compuesto de evacuación alta en ratas. La vida media de eliminación (t?/2) y tiempo de residencia medio (MRT) después de la administración IV fueron 0.084 hora y 0.072 hora, respectivamente. El volumen de distribución de Icb en el estado firme (Vss) fue 0.21 L/kg, lo que sugiere una distribución de tejido muy limitada. La formación de IVe de Icb después de la administración IV fue rápida; IVe se detectó en el primer punto de tiempo de muestreo de 2 minutos (datos no mostrados) . La relación IV AUC de IVe formado de Icb contra el del estudio IVe histórico, fue 1.0 (valor teórico para conversión completa = 1) , lo que sugiere la conversión completa de Icb a IVc. El Icb no se detectó (LLQ = 5 nM) en ninguna muestra de plasma después de la administración oral. El Tmax de IVe después de la administración oral de Icb fue 0.80 hora, que es más corto que el Tmax histórico de IVe de 4.0 horas, lo que indica una absorción más rápida de IVe después de la administración oral del profármaco. La absorción más rápida de IVe del profármaco, posiblemente es el resultado de una mejor solubilidad acuosa de Icb así como una hidrólisis rápida de Icb para formar IVe en el intestino. La biodisponibilidad oral absoluta de IVe del Icb fue 80%, similar al valor IVe histórico de 82% (Tabla 34) . Por otro lado, la exposición de IVe del estudio de escala de dosis oral de Icb de rata fue superior comparado con los datos históricos con IVe (Tabla 37 y Figura 18) . La concentración de plasma terminal contra los perfiles de tiempo de IVe formado del Icb, son similares a los perfiles IVe históricos (Figura 21) . Tabla 43: Parámetros Farmacocinéticos de Icb y IVe Después de la Administración Oral e IV de Icb en la Rata (Media ± SD, n = 3) NA - no aplicable; ND - no detectado (<5 nM) .

* Las relaciones se calculan de IVe AUC después de la dosificación del profármaco / IVe AUC después de la dosificación de IVe para IV y PO, respectivamente. ** Calculado de los datos IV históricos de IVc. Estudios In Vivo en el Perro Los parámetros farmacocinéticos de Icb y IVe en perros después de la administración IV y oral de Icb, se resumen en la Tabla 44. La concentración de plasma contra los perfiles de tiempo se muestra en la Figura 22. Para comparación, los datos históricos de los estudios farmacocinéticos de IVe en perros también se muestran. La Cl de Icb después de la administración IV fue de 64 ml/min/kg, significativamente mayor que el flujo de sangre del hígado de 31 ml/min/kg en perros, y sugiere que involucra la hidrólisis extrahepática y/u otras rutas de eliminación (ver, excreción renal) . La t?/2 y MRT después de la administración IV fueron 0.25 hora y 0.14 hora, respectivamente. Icb no se detecta más allá de 2 horas. El Vss de Icb fue 0.50 L/kg, lo que sugiere un potencial bajo para la distribución de tejido. La formación de IVe de Icb después de la administración IV fue rápida; IVe se detectó en el primer punto de tiempo de muestreo de 5 minutos (datos no mostrados) . La relación IV AUC de IVe formado de Icb contra el del estudio IVe histórico, fue 0.67, lo que sugiere una conversión moderada de Icb a IVe en perros después de administración IV. El Icb no se detectó (LLQ = 5 nM) en ninguna muestra de plasma de la administración oral. El Tmax de IVe después de la administración oral de Icb fue 0.58 hora, que es más corto que el Tmax histórico de IVe, lo que indica una absorción más rápida de IVe después de la administración oral del profármaco. La biodisponibilidad oral absoluta de IVe del Icb fue 104%, similar a los datos IVe históricos de 89%. Por otro lado, la exposición de IVe del estudio de tolerancia de perro Icb (escala de dosis) fue mejor en comparación con los datos históricos con IVe (Tabla 41 y Figura 21) . Las concentraciones de plasma terminal contra los perfiles de tiempo de IVe formados de Icb, son similares a los perfiles IVe históricos (Figura 22).

Tabla 44: Parámetros Farmacocinéticos de Icb y IVe Después de la Administración Oral e IV de Icb en el Perro (Media ± SD, n = 3) .

* Las relaciones se calculan de IVe AUC después de la dosificación del profármaco / IVe AUC después de dosificación de IVe por IV y PO, respectivamente. ** Calculado de los datos IV históricos de IVc.

Estudios In Vivo en el Mono Los parámetros farmacocinéticos de Icb y IVe en monos después de la administración IV y oral de Icb, se resumen en la Tabla 45. La concentración de plasma contra los perfiles de tiempo se muestra en la Figura 23. Para comparación, los datos históricos de los estudios farmacocinéticos de IVe en monos también se muestran. La Cl de Icb después de la administración IV fue de 47 ml/min/kg, similar al flujo sanguíneo del hígado de 44 ml/min/kg en monos, lo que sugiere que Icb es un compuesto de evacuación alto en monos . La t?/2 y MRT después de la administración IV fueron 0.089 hora y 0.097 hora, respectivamente. El Vss de Icb fue 0.27 L/kg, lo que sugiere una distribución de tejido limitada. La formación de IVe de Icb después de la administración IV fue rápida; IVe se detectó en el primer punto de tiempo de muestreo de 5 minutos (datos no mostrados) . La relación IV AUC de IVe formado de Icb contra el del estudio IVe histórico, fue 0.90, lo que sugiere una buena conversión de Icb a IVc. El Icb no se detectó (LLQ = 5 nM) en ninguna de las muestras de plasma después de la administración oral. El Tmax de IVe después de la administración oral de Icb fue 0.92 hora, que es más corto que el Tmax histórico de IVe de 2.3 horas, lo que indica una absorción más rápida de IVe después de la administración oral del profármaco. La biodisponibilidad oral absoluta de IVe del Icb fue 122%, que es mayor que los datos IVe históricos del 64% (Tabla 45) . La concentración de plasma terminal contra los perfiles de tiempo de IVe formados de Icb, son similares a los perfiles IVe históricos (Figura 23) . Tabla 45: Parámetros Farma cocinéticos de Icb y IVe Después de la Administración Oral e IV de Icb en el Mono (Media ± SD, n = 3) .

Las relaciones se calculan de IVe AUC después de la dosificación del profármaco / IVe AUC después de dosificación por IV y PO, respectivamente. ** Calculado de los datos IV históricos de IVc.

Sección de Formación de Perfil Adicional 4 : Estudios Adicionales con el Profármaco le El profármaco le se dosifica oralmente a ratas usando la metodología similar a la que se describe arriba para los otros profármacos. Después de la dosificación PO, la molécula precursora IVe se detecta en el plasma.

Sección de Formación de Perfil Adicional 5 : Estudios Adicionales con el Profármaco If El profármaco If se dosifica oralmente a ratas usando la metodología similar a la que se describe arriba para los otros profármacos. Después de la dosificación PO, la molécula precursora IVf se detecta en el plasma. La siguiente Tabla 47 muestra los datos contenidos de estudios de dosificación oral en ratas como se describe en las secciones de perfil adicional 4 y 5.

Nota en la detección de profármaco en plasma y otros tejidos . Una vez que se administra una forma de sal de un profármaco, se entenderá que en el cuerpo, puede presentarse una revoltura de la sal . Sin embargo, los ensayos usados para cuantif icar los profármacos en los modelos de animal objeto detectado por análisis del ácido libre del fosfato . Esto analiza por ejemplo la sal de lisina lab o un ácido libre lac se supone que se analice para la misma especie y no se pretende que implique que las especies detectadas sea actualmente la sal de lisina . En esta solicitud, esta convención aplica a las muestras obtenidas de estudios in vivo y sólo muestras . Biología "µM" significa micromolar; "ml" significa mililitro; "µl" significa microlitro; "mg" significa miligramo; "DMSO" significa dimetilsulfoxido; Los materiales y procedimientos experimentales usados para evaluar la actividad anti VIH de los compuestos precursores que se generan los profármacos in vivo se describen a continuación: Células : Línea de célula T humana MT-2 y PMl (AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institutes of Health) se mantienen y se propagan en un medio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) , que contiene suero de bovino fetal al 10% (FBS, Sigma, St. Louis, MO) . Virus : Cepas de laboratorio de VIH 1. La Cepa trópica T LAI se obtiene a través del (AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institutes of Health) . Se amplifica en células MT-2 y se titula usando un ensayo de rendimiento de virus (2) . La detección se realiza a través del uso de un ensayo de transcriptasa inversa (3), adaptado para usarse con un protocolo de detección de proximidad de escentilación (1) (Amersham Biosciencies, Piscataway, NJ) . Experimento 1. Se preparan compuestos de almacenamiento al disolver en DMSO hasta 30 mM. Para placas de dilución, los compuestos se diluyen en serie tres veces en DMSO, usando placas de poliprpileno de 96 pozos, de manera que las concentraciones fueron 100 mayores que la concentración de ensayo final. Para ensayos de citotoxidad y antiviral, se agrega 2 µl por pozo (concetración de DMSO final al 1%)'. 2. Se agregan compuestos de las placas de dilución a placas de cultivo de tejido de 96 pozos, que contienen 100 µl de medio RPMI-1640, que contiene suero de bovino fetal al 10% a una concentración de <20 µM. 3. Para ensayos antivirales las células infectan a una multiplicidad de infección de 0.005. Después de 1 hora a 37 °C las células infectadas se diluyen hasta 200,000 células por Ml en un medio RPMI-1640, que contiene suero de bovino fetal al 10%. Se agrega lOOµl de esta solución por pozo, dando un volumen final de 200 µl . 4. Se incuban las placas a 37 °C en un incubador de C02 humidificado y se cosechan después de 5 días. 5. Se observan las infecciones virales al medir la actividad de la transcriptasa inversa en los sobrenadantes de los pozos infectados como se describe arriba. El porcentaje de inhibición para cada compuesto se calcula al cuantificar el nivel de lectura en las células infectadas en presencia de cada compuesto como un porcentaje del que se observa para las células infectadas en ausencia del compuesto y substrayendo tal valor determinado a partir de 100. 6. Un EC50 proporciona un método para comparar la potencia antiviral de los compuestos de esta invención. La concentración efectiva para una inhibición del 50% (EC50) se calcula con el sofware de colocación de curva Microsoft Excel Xlfit. Para cada compuesto las curvas se generan a partir del porcentaje de inhibición calculado a 8 diferentes concentraciones al usar 4 parámetros de modelo logistico (modelo 205) . Los datos EC50 para los compuestos se muestran en la Tabla 48.

Resultados Datos biológicos importantes para EC50S Tabla 48. Actividad antiviral de los compuestos IV (moléculas precursoras) La actividad antiviral VIH de los profármacos por si mismo no es relevante ya que las moléculas precursoras, como se muestra por los estudios de abajo, se generan de los profármacos in vivo y son el ingrediente activo y la especie mayor en el plasma. Además los profármacos pueden convertirse lentamente a precursores en los ensayos in vitro a al menos una extensión limitada, complicada de esta manera la interpretación de los datos antivirales.

Citotoxidad 1. Se conducen ensayos de citotoxidad con las mismas células MT-2, usando la metodología bien conocida en el arte. Este método se describe en la literatura (4) . En breve, las células se incuban en presencia de fármaco durante 6 días, después de lo cual se mide la viabilidad celular usando un ensayo de reducción de tinte redox activo. Se agregan 50µl de reactivo XTT (1 mg/ml 2, 3-bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -2H-tetrazolio-5-carboxanilida, 10 µg/ml de metoslfato de fenazina disuleto en solución salina amortiguada en fosfato) a cada pozo y se incuba durante 3 horas. La formación de color por células que respiran activamente se cuantifica en un lector de placa a 450 nm, y se usa para determinar un CC50. El CC50 para las moléculas precursoras IVa, IVb, IVe y IVd fue mayor a 10 µM cuando se mide por este método. Los datos de citotoxidad es una separación por exclusión secundaria que muestra que los compuestos no eliminan no específicamente las células que se usan antiviral y proporciona un soporte adicional para la contención de que los compuestos poseen una actividad antiviral. De esta manera de conformidad con la presente invención, se proporciona además para tratar y una composición farmacéutica para tratar infecciones virales tales como infección por VIH y SIDA. El tratamiento involucra administrar al paciente que necesite de tal tratamiento una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéutico y una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención. La composición farmacéutica puede estar en forma de suspenciones o tabletas oralmente administrables; rocíos nasales preparaciones inyectables estériles, por ejemplo, como suspensiones acuosas u aloginosas inyectables estériles o supositorios. Cuando se administra oralmente como una suspensión, estas composiciones se preparan de conformidad con técnicas bien conocidas en el arte de la formulación farmacéutica y pueden contener celulosa microcristalina para impartir volumen, ácido alginico o alginato de sodio como agente de suspensión, metilcelulosa como aumentador de la viscosidad, y agentes saborizantes/endulzantes conocidos en el arte. Como tabletas de liberación inmediata, estas composiciones pueden contener celulosa microcristalina, fosfato de dicalcio almidón, estearato de magnesio y lactosa y/u otros excipientes, aglutinantes, extendedores desintegrantes diluyentes, y lubricantes conocidos en el arte. Las soluciones o suspensiones inyectables pueden formularse de conformidad con el arte conocido, usando diluyentes o solventes no tóxicos apropiados, parenteralmente aceptables, tales como amnitol, 1, 3-butanediol, agua, solución Ringer' s o solución de cloruro de sodio isotónico, o agentes dispersantes o humectantes o de suspensión apropiados, tales como, aceites estériles blandos, fijos, que incluyen mono o di gliceridos sintéticos, y ácidos grasos, que incluye ácido oleico. Los compuestos de esta invención pueden administrarse oralmente a humanos en un rango de dosis de 1 hasta 100 mg/kg peso corporal en dosis dividida. Un rango de dosis preferido es 1 hasta 10 mg/kg de peso corporal individualmente de dosis dividida. Otros rangos de dosis preferida son 1 hasta 20 mg/kg y 1 hasta 30 mg/kg de peso corporal oralmente en dosis dividida. Se entenderá, sin embargo, que el nivel de dosis específico y la frecuencia de dosificación para cualquier paciente en particular puede variar y dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y la longitud de acción de tal compuesto, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, modo y tiempo de administración velocidad de excresion, combinación de fármaco la severidad de la condición particular y la terapia que experimenta el hospedador. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (31)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un compuesto de la fórmula I, caracterizado porque: X es C o N con la condición de que cuando X es N, R1 no existe; es C o N con la condición de que cuando es N, R2 no existe; V es C; R1 es hidrógeno, metoxi o halógeno; R2 es hidrógeno; R3 es metoxi o heteroarilo, cada uno de los cuales puede ser opcionalmente independientemente sustituido con un substituyente seleccionado de G; en donde heteroarilo es triazolilo, pirazolilo u oxadiazolilo; E es hidrógeno o una sal mono o bis mono farmacéuticamente aceptable del mismo: Y se selecciona del grupo que consiste de
2. R10, R11, R12, R13, R14, R15, R1S, R17, son cada uno independientemente H o metilo con la condición de que no más de dos de R10-R17 son metilo; R18 se selecciona del grupo que consiste de C (0) -fenilo, C (0) -piridinilo, piridinilo, pirimidinilo, quinolilo, isoquinolilo, quinazolilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, ptalazinilo, azabenzofurilo, y azaindolilo, cada uno del cual puede opcionalmente independientemente sustituido de uno o dos miembros seleccionado del grupo que consiste de metilo, -amino, -NHMe, -NMe2, metoxi, hidroximetilo y halógeno; D se selecciona del grupo que consiste de ciano, S(0)2R24, halógeno, C(0)NR21R22, fenilo y heteroarilo; en donde el fenilo o heteroarilo es opcionalmente independientemente sustituido con uno a tres iguales o diferentes halógenos o de uno a tres iguales o diferentes substituyentes seleccionados de G; en donde heteroarilo se selecciona del grupo que consiste de piridinilo y oxadiazolilo; A se selecciona del grupo que consiste de fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo en donde el fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo son opcionalmente independientemente sustituido con uno a tres iguales o diferentes halógenos o de uno a tres iguales o diferentes substituyentes seleccionados de G; G se selecciona del grupo que consiste de (C?_e) alquilo,
3. (C?-ß) alquenilo, fenilo hidroxi, metoxi, halógeno, -NR23C(0)~ (C?_6) alquilo, -NR24R25, -S (0) 2NR24R25, COOR26 y -CONR24R25, en donde el (Ci-e) alquilo es opcionalmente sustituido con hidroxi, dimetilamino, o uno a tres iguales o diferentes halógenos; R25 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y (Ci-e) alquilo; R20, R21, R22, R23, R24, R25, son independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, (C?_ 6) alquilo y - (CH2)nNR27R28; y n es 0-6; y R27 y R28 son cada uno independientemente H o metilo. 2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: R1 es metoxi o fluoro R18 se selecciona del grupo que consiste de C(0) -fenilo, C (O) -piridinilo, isoquinolilo, quinozolinilo y ptalazinilo en donde cada isoquinolílo, quinazolinilo o pfalazanilo puede estar opcionalmente independientemente sustituido de uno o dos miembros seleccionado del grupo que consiste de metilo, -amino, -NHMe, -NMe2, metoxi, hidroximetilo y halógeno; D se selecciona del grupo que consiste de ciano, fenilo y heteroarilo ; en donde el heteroarilo es piridinilo u oxadiazolilo; en donde el fenilo o heteroarilo es independientemente substituido opcinalmente con uno a tres iguales o diferentes substituyentes seleccionados del grupo que consiste de C?-6 alquilo, trifluorometilo, metoxi o halógeno; A se selecciona del grupo que consiste de fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo o oxazolilo en donde el fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo o oxazolilo son opcionalmente independientemente sustituidos con uno a tres iguales o diferentes halógenos o de uno a tres iguales o diferentes susbtituyentes seleccionados del grupo que consiste de metilo, halógeno, metoxi y -NH2; y R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, son cada uno independientemente H o metilo con la condición de que un máximo de uno de R10-R17 es un metilo. 3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 2 caracterizado porque: Xy W son cada uno N.
4. 4. El compuesto de conformidad con la reivindicación 2 caracterizado porque: X es C; y es N.
5. 5. El compuesto de conformidad con la reivindicación 4 caracterizado porque: R18 es -C(0)-Ph; y
6. 6. El compuesto de conformidad con la reivindicación 5 caracterizado porque: R3 es metoxi o triazolilo; en donde el triazolilo es opcionalmente sustituido con un substituyente seleccionado de G; R10 - R17 son cada uno H; y G es metilo.
7. 7. El compuesto de conformidad con la reivindicación 6 caracterizado porque: R1 es F y R3 es 1, 2, 3-triazolilo enlazado en la posición N-l.
8. 8. El compuesto de conformidad con la reivindicación 6 caracterizado porque: R1 es metoxi; y R3 es 3-metil-l, 2, 4-triazolilo enlazado a la posición N-1.
9. 9. El compuesto de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque: R1 y R3 son cada uno metoxi.
10. 10. El compuesto de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la sal es sodio, lisina, o trometamina.
11. 11. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un cantidad efectiva antiviral de un compuesto de la Fórmula I, de conformidad con la reivindicación 1, y uno o más portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables .
12. 12. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, útil para el tratamiento de infección por VIH, caracterizada porque comprende adicionalmente una cantidad efectiva antiviral de un agente de tratamiento del SIDA seleccionado del grupo que consiste de: (a) un agente antiviral del SIDA (b) un agente anti-infeccioso (c) un inmunomodulador; e (d) inibidores de entrada del VIH.
13. 13. Un método para tratar un mamífero infectado con el virus del VIH, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad antiviral efectiva del compuesto de la Fórmula I, de conformidad con la reivindicación 1, y uno o más portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables .
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad antiviral efectiva del compuesto de la Fórmula I, en combinación con una cantidad antiviral efectiva de un agente para el tratamiento del SIDA seleccionado del grupo que consiste de un agente antiviral del SIDA; un agente antiinfeccioso; un inmunomodulador; y un inhibidor de la entrada del VIH.
15. 15. Un compuesto de la formula II, caracterizado porque: X es C o N con la condición de que cuando X es N, R1 no existe; W es C o N con la condición de que cuando W es N, R2 no existe; V es C; R1 es hidrógeno, metoxi o halógeno; R2 es hidrógeno; R3 es metoxi o heteroarilo, cada uno de los cuales puede ser opcionalmente independientemente sustituido con un substituyente seleccionado de G; en donde heteroarilo es triazolilo, pírazolilo u oxadiazolilo; L y M son independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, Ci-Ce alquilo, fenilo, bencilo, trialquilsilo, -2, 2, 2-tricloroetoxi y 2-trimetilsililetoxi con la condición de que no más de uno de L y M pueden ser hidrógeno,- Y se selecciona del grupo que consiste de R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, son cada uno independientemente H o metilo con la condición de que no más de dos de R10-R17 son metilo; R18 se selecciona del grupo que consiste de C (O) -fenilo, C (O) -piridinilo, piridinilo, pirimidinilo, quinolilo, isoquinolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, ptalazinilo, azabenzofurilo, y azaindolilo, cada uno de los cuales puede ser opcionalmente independientemente sustituido de uno o dos miembros seleccionados del grupo que consiste de metilo, -amino, -NHMe, -NMe2, metoxi, hidroximetilo y halógeno; D se selecciona del grupo que consiste de ciano, S(0)2R24, halógeno, C(0)NR21R22, fenilo y heteroarilo; en donde el fenilo o heteroarilo es opcionalmente independientemente sustituido con uno a tres iguales o diferentes halógenos o desde uno a tres iguales o diferentes substituyentes seleccionados de G; en donde el heteroarilo se selecciona del grupo que consiste de piridinilo y oxadiazolilo; A se selecciona del grupo que consiste de fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo en donde el fenilo, piridinilo, furilo, tienilo, isoxazolilo y oxazolilo son opcionalmente independientemente sustituidos con uno a tres iguales o diferentes halógenos o de uno a tres iguales o diferentes substituyentes seleccionados de G; G se selecciona del grupo que consiste de (C?-6) alquilo, (Ci-e) alquenilo, fenilo, hidroxi, metoxi, halógeno, -NR23C (OJ(C?-6) alquilo, -NR2R25, -S (0) 2NR24R25, COOR26 y -CONR24R25, en donde el { C?-6) alquilo es opcionalmente sustituido con hidroxi, dimetilamino, o uno a tres iguales o diferentes halógenos; R26 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y (Ci-ß) alquilo; R20, R21, R22, R23, R24, R25, son independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, (C?_ 6) alquilo y - (CH2) nNR27R28; y R27 y R28 son independientemente H o metilo; y n es 0-6.
16. 16. El compuesto de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la sal es lisina.
17. 17. El compuesto de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la sal es trometamina.
18. 18. El compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la sal es lisina.
19. 19. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17 son cada uno independientemente H o metilo, con la condiciones de que no más de dos de R10-R17 son metilo;
20. 20. El compuesto de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque: R1 es metoxi o fluoro; D se selecciona del grupo que consiste de ciano, fenilo y piridilo, en donde el fenilo o piridilo se substituyen opcionalmente independientemente con un substituyente seleccionado del grupo que consiste de metilo y halógeno; y A se selecciona del grupo que consiste de fenilo, piridilo, en donde el fenilo o piridilo se substituyen opcionalmente de manera independiente con un substituyente seleccionado del grupo que consiste de metilo y halógeno.
21. 21. El compuesto de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque: D es ciano; A se selecciona del grupo que consiste de fenilo o piridilo; X es C; W es N; G es metilo; R3 es metoxi o triazolilo en donde el triazolilo puede ser sustituido opcionalmente de manera independiente con un substituyente seleccionado de G; y R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17 son cada uno H.
22. 22. El compuesto de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque: R1 es metoxi; y R3 es triazol en donde el triazol puede sustituirse opcionalmente independientemente con otro substituyente seleccionado de G.
23. 23. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: Y es R18 se selecciona del grupo que consiste de isoquinolinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo o ftalazinilo, cada uno de los cuales puede ser sustituido opcionalmente independientemente con desde uno hasta dos miembros seleccionados del grupo que consiste de metilo, amino, -NHMe, -NMe2, metoxi, hidroximetilo y halógeno.
24. 24. El compuesto de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque: R1 es metoxi o fluoro; R18 se selecciona del grupo que consiste de isoquinolino, quinazolinilo y ftalazinilo; en donde el isoquinolinilo, quinazolinilo o ftalazinilo puede sustituirse opcionalmente de manera independiente con un grupo ya sea metilo o halógeno; y R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17 son cada uno independientemente H.
25. 25. El compuesto de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque: X es C; W es N; G es metilo; y R3 es metoxi o triazol en donde el triazol puede ser sustituido opcionalmente independientemente con un substituyente seleccionado de G.
26. 26. El compuesto de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque: R1 es metoxi; R3 es triazol, en donde el triazol puede sustituirse opcionalmente de manera independiente con un substituyente seleccionado de G; y R18 es quinazolinilo.
27. 27. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: R1 es metoxi o fluoro; R18 es C(0) -fenilo; R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17 son cada uno H; y G es metilo.
28. 28. El compuesto de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque: X es C; y es N.
29. 29. Un proceso para preparar el Compuesto lac que tiene la estructura lac caracterizado porque comprende: (a) alquilar el compuesto IVa que tiene la estructura IVa con alrededor de 1.2 equivalentes molares de di-tert-butil clorometil fosfato por mol de IVa, que tiene la estructura Z (Z) en presencia de alrededor de 2 equivalentes molares de K2C03 como una base, por mol del compuesto IVa, y alrededor de 5-10 ml de N-metilpirrolidinona como un solvente por gramo de IVa, a una temperatura de reacción de alrededor de 30 °C, para formar el compuesto R que tiene la estructura (R) (b) desproteger a temperatura ambiente el Compuesto R de ambos grupos ter-butilo añadiendo a la mezcla de reacción resultante la etapa (a) , aproximadamente 10 ml de solvente de diclorometano por gramo de IVa y aproximadamente 15 equivalentes molares de ácido trifluoroacético por mol de IVa; y (c) recuperar el Compuesto lac.
30. 30. Un proceso para preparar el compuesto le que tiene la estructura (le) caracterizado porque comprende: (a) alquilar el compuesto IVe que tiene la estructura con alrededor de 2.5 equivalentes molares de di-tert-butil clorometil fosfato por mol de IVe que tiene la estructura Z (Z) en presencia de alrededor de 2.5 equivalentes molares de Cs2C03 como una base por mol de IVe, alrededor de 2 equivalentes molares de KI por mol de IVe, y alrededor de 5-10 ml de N-metilpirrolidinona por gramo de IVe, a una temperatura de reacción de alrededor de 25-30 °C, para formar un Compuesto lie que tiene la estructura (lie) (b) desproteger a la temperatura ambiente de alrededor de 40 °C el Compuesto lie de ambos grupos ter-butilo en un exceso de acetona y agua; y (c) recupear el Compuesto le.
31. 31. Un proceso para preparar el Compuesto Ibc que tiene la estructura (Ibc) caracterizado porque comprende: (a) alquilar el compuesto IVb que tiene la estructura con alrededor de 2 equivalentes molares de di-tert-butil clorometil fosfato por mol de IVb, que tiene la estructura Z (Z) en presencia de alrededor de 2 equivalentes molares de Cs2C03 como una base por mol de IVb, y alrededor de 2 equivalentes molares de KI por mol de IVB, y aproximadamente 2.5 ml de N-metilpirrolidinona por gramo de IVb, a una temperatura de reacción de alrededor de 30 °C, para formar el Compuesto Ilb que tiene la estructura (Hb) (b) desproteger a la temperatura de alrededor de 40 °C el Compuesto Ilb de ambos grupos ter-butilo en un exceso de acetona y agua; y (c) recupear el compuesto Ibc.