ES2280800T3 - Aislamiento de proteinas de la leche y su procedimiento de preparacion. - Google Patents
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Abstract
Procedimientos de aislamiento de proteínas de la leche a partir de leche o de un suero lácteo, incluyendo las etapas siguientes: a) la leche o el suero lácteo es esterilizado y descremado; b) la fracción láctea resultante de la etapa a) se pasa a través de una resina intercambiadora de cationes, acondicionada en una columna de elusión; c) la fracción retenida en la resina es objeto de elusión por una solución acuosa salada; d) el eluado resultante de la etapa c) es desalado y esterilizado; estando dichos procedimientos caracterizados porque: alfa) la resina intercambiadora de cationes es una resina injertada mediante funciones ácidas fuertes; el parámetro BV que designa la relación del volumen de materia prima al volumen de resina húmeda en la columna, el parámetro SV que designa la relación del caudal de alimentación de la columna al volumen de resina húmeda en la columna, el parámetro LV que designa la relación del caudal de alimentación de la columna a la sección de la columna; beta) durante la etapa b), los parámetros de fijación presentan los valores siguientes: - BV f está comprendido entre 50 y 400; - SVf está comprendido entre 2 y 40 h -1 - LV f es superior o igual a 1 m/h e inferior o igual a 5 m/h gamma) durante la etapa c), los parámetros de elución presentan los valores siguientes: - BV e está comprendido entre 1,5 y 7; - LVe es inferior a 1 m/h.
Description
Aislamiento de proteínas de la leche y su
procedimiento de preparación.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento de aislamiento de proteínas de la leche, la
composición, aislamiento de proteínas de la leche o fracción
proteica láctea, que resultan de dicho procedimiento y sus
aplicaciones, en particular alimenticias y farmacéuticas.
Se conocen numerosos documentos de la técnica
anterior que describen la purificación de proteínas de la leche.
El documento EP-253395 describe
la obtención de una lactoferrina bovina de alta pureza (> 80% en
una etapa, o >98% en dos etapas) por adsorción de la leche o del
suero lácteo en una resina intercambiadora de cationes, que
comprende radicales de carboximetilo y a continuación, enjuague y
desorción de la lactoferrina.
El documento EP-348508 describe
igualmente un procedimiento de preparación de una lactoferrina
bovina de elevada pureza (>95%) por adsorción de leche o de
suero lácteo sobre una resina intercambiadora de cationes de
polisacáridos, que incluyen funciones de éster de ácido sulfúrico y
elusión mediante una solución acuosa de sal.
El documento EP-198875 describe
un procedimiento que permite aislar determinadas proteínas del suero
lácteo por adsorción sobre un soporte mineral poroso en forma de
granos, estando estos granos recubiertos de una capa de
polisacárido aminado, que presenta en superficie grupos funcionales
ácidos, tales como agrupamientos carboxílicos o sulfónicos.
El documento EP-418074 describe
un procedimiento para purificar secuencialmente la lactoferrina y la
lactoperoxidasa por elusión en una columna cargada con una resina
de polisacárido injertada con grupos de ácido sulfónico.
El documento US-6.096.870
describe un procedimiento de separación secuencial de proteínas del
suero desnatado por elusión en resinas catiónicas.
El documento EP-1017286 describe
un procedimiento de separación secuencial de proteínas del suero
desnatado por cromatografía de flujo radial.
La lactoferrina y la lactoperoxidasa son
proteínas de la leche dotadas de propiedades interesantes: su
capacidad de enlazar con el hierro le confiere un papel de agente
anti-bacteriano contra las bacterias cuyo
metabolismo requiere importantes cantidades de hierro. La
lactoperoxidasa es indispensable para la marcación proteica por el
iodo. La lactoferrina favorece el crecimiento de los linfocitos y
favorece la absorción del hierro por el organismo, regula la
diferenciación de los leucocitos e inhibe la peroxidación de los
lípidos.
No obstante, todos estos documentos se refieren
a procedimientos cuyo objetivo es obtener una lactoferrina y/o una
lactoperoxidasa, lo más puras posible, es decir procedimientos cuyo
objetivo es reducir, lo más posible, la proporción de otras
proteínas inicialmente presentes en la leche o en el suero lácteo.
Además, las condiciones de fijación de la materia prima y la
elusión de las proteínas son condiciones suaves, con flujos de
materiales lentos. Por el contrario, el objetivo que se ha fijado
la solicitante es la obtención de una fracción proteica láctea que
comprende, entre otros constituyentes, la lactoferrina y la
lactoperoxidasa, pero incluyendo, sobre todo, una proporción de las
otras proteínas más elevada que en la leche o el suero láctico de
partida. Para ello, la solicitante ha puesto a punto un
procedimiento con flujos más elevados que los descritos en los
documentos antes analizados, permitiendo este procedimiento una
fijación más selectiva frente a determinadas proteínas.
El documento WO93/13676 da a conocer un
procedimiento que permite aislar la lactoferrina y la
lactoperoxidasa mediante el paso por una resina intercambiadora de
cationes de flujo elevado, a partir del suero. Este procedimiento
se distingue del procedimiento según la presente invención por el
hecho de que el flujo es más elevado que en el procedimiento según
la invención (superior a 5 m/h) y que pretende purificar la
lactoferrina y a lactoperoxidasa y no obtener una fracción proteica
láctea particular que contenga una tasa relativamente elevada de las
otras proteínas y dotada de propiedades biológicas mejoradas.
Se conoce igualmente, por el documento
EP-704218, un agente destinado a reforzar los
huesos, comprendiendo este agente una fracción proteica básica y
una fracción peptídica básica, derivadas de la leche y obtenidas
por el paso de la leche a través de una resina catiónica y por
elusión. No obstante, las condiciones de adsorción y de elusión,
descritas en este documento, son distintas de las empleadas en el
procedimiento según la invención y permiten aislar una fracción
proteica distinta de la obtenida según la presente invención.
Los documentos JP-8165249,
JP-9187250, JP-9294537 y
EP-1010430 describen composiciones destinadas al
reforzamiento de los huesos y/o la prevención de enfermedades
parodontales, comprendiendo estas composiciones una fracción
proteica básica derivada de la leche obtenida por adsorción de la
leche y la elusión sobre una resina catiónica. No obstante, las
condiciones de adsorción y de elusión descritas en estos documentos
son distintas a las empleadas en el procedimiento según la
invención, y permiten aislar una fracción proteica distinta de la
obtenida según la presente invención.
De este modo, resulta una novedad que la
solicitante haya descubierto un nuevo procedimiento de aislamiento
de las proteínas de la leche que permite obtener una fracción
proteica láctea dotada de propiedades biológicas mejoradas, en
particular una fracción proteica láctea que favorece el crecimiento
de los osteoblastos y la inhibición de la proliferación de los
pre-osteoclastos y osteoclastos.
La invención tiene por objeto un procedimiento
de aislamiento de proteínas de la leche a partir de la leche o de
un suero lácteo, que comprende las etapas siguientes:
- a)
- la leche o el suero lácteo es esterilizado y descremado;
- b)
- la fracción láctea resultado de la etapa a) se pasa sobre una resina intercambiadora de cationes, acondicionada en una columna de elusión;
- c)
- la fracción retenida en la resina es objeto de elusión por una solución acuosa salada;
- d)
- el eluado resultante de la etapa c) se desala, preferentemente por ultrafiltración y diafiltración, y luego se esteriliza, preferentemente por microfiltración.
Este procedimiento se caracteriza porque:
- \alpha)
- la resina intercambiadora de cationes es una resina injertada por funciones ácidas fuertes;
- el parámetro BV que designa la relación de volumen de materia prima al volumen de resina húmeda en la columna,
- el parámetro SV que designa la relación del caudal de alimentación de la columna al volumen de resina húmeda en la columna,
- el parámetro LV que designa la relación de caudal de alimentación de la columna a la sección de la columna;
- \beta)
- durante la etapa b), los parámetros de fijación presentan los valores siguientes:
- -
- BV_{f} está comprendido entre 50 y 400, preferentemente, entre 80 y 300;
- -
- SV_{f} está comprendido entre 2 y 40 h^{-1}
- -
- LV_{f} es superior o igual a 1 m/h e inferior o igual a 5 m/h.
- \gamma)
- durante la etapa c), los parámetros de elusión presentan los valores siguientes:
- -
- BV_{e} está comprendido entre 1,5 y 7;
- -
- LV_{e} es inferior a 1 m/h, preferentemente inferior a 0,5 m/h.
Se puede utilizar como producto de partida, en
el procedimiento según la invención, leche o suero lácteo,
preferentemente obtenidos de la vaca. El suero lácteo es el líquido
residual obtenido después de la extracción de proteínas y de la
materia grasa de la leche o del suero desnatado. Se distinguen, en
general, tres categorías de suero lácteo. Las dos primeras
categorías se clasifican según la acidez del suero lácteo, que puede
ser inferior o superior a 1,8 g de ácido láctico/litro; el suero
lácteo dulce, resultado de la fabricación de queso en pasta cocido
o no cocido (emmenthal, saint-paulin, etc.) y de
suero lácteo ácido, obtenido de la caseína o de tres quesos
obtenidos por coagulación mixta o láctica (pastas blandas, pastas
frescas). La composición media del suero lácteo dulce tiene
carácter indicativo, para 61 g de materas secas por kg del suero
lácteo, de 42 a 48 g de lactosa, 8 g de proteínas, 2 g de grasas, 5
a 7 g de minerales, 1 a 5 g de ácido láctico y el resto en
minerales y vitaminas.
Se conoce igualmente el suero lácteo ideal
obtenido por microfiltración de la leche sobre un soporte de
porosidad media de 0,1 \mum.
Según una primera variante de la invención, se
utiliza como producto de partida la leche, y ventajosamente leche
de vaca, cuya composición permite, por el procedimiento según la
invención, la obtención de un aislado de proteínas que presenta
propiedades biológicas más interesantes. Esta variante permite
igualmente obtener un rendimiento en proteínas superior a las
variantes que utilizan el suero lácteo como producto de partida.
Según una segunda variante preferida de la
invención, se utiliza como producto de partida suero lácteo ácido
de caseinería. Esta variante representa una ventaja económica
importante en la medida en que el producto de partida es un
subproducto resultado de la explotación industrial y, por tanto, de
bajo coste.
En la primera etapa del procedimiento, la leche
o el suero lácteo se esteriliza y desengrasa por desnatado, de la
forma conocida:
El desnatado de la leche designa la separación
de la nata de la leche, sea cual fuere el procedimiento puesto en
práctica para obtener esta separación.
De forma tradicional, la fabricación de la nata
se hace según un proceso natural: cuando la leche reposa, los
elementos que la componen se separan en función de su densidad. Los
glóbulos de materia grasa, al ser más ligeros que el agua, suben a
la superficie para formar una capa de nata. En producción
industrial, la formación de la nata se acelera por paso de la leche
en una desnatadora centrífuga.
De forma habitual, la pasteurización se hace por
calentamiento controlado de corta duración, con el fin de eliminar
los gérmenes patógenos que puedan estar presentes en la nata.
Ventajosamente, la pasteurización se realiza a una temperatura
comprendida entre 65ºC y 95ºC, preferentemente entre 80ºC y 95ºC. Se
puede, por ejemplo, tratar la leche o el suero durante 15 segundos
a una temperatura comprendida entre 65ºC y 82ºC. Se puede
esterilizar igualmente la leche o el suero lácteo de partida por
microfiltración en un filtro provisto de poros, de un diámetro de
0,1 a 2 \mum.
La materia prima estéril y descremada se pasa
entonces por una resina intercambiadora de cationes. Según la
invención, la resina intercambiadora de cationes es una resina
injertada por funciones ácidas fuertes y con una capacidad de
intercambio de iones comprendido entre 200 y 1000 \muE/ml, con
preferencia entre 400 y 700 \muE/ml. Por función ácida fuerte se
entiende una función ácida dotada de un pKa \geq 2. En particular,
puede ser injertada por funciones de ácido sulfónico, generalmente
en forma de sales de sulfonato para su puesta en práctica,
determinándose la naturaleza de la sal por la solución que ha
servido para acondicionar la columna antes de la puesta en práctica
del procedimiento. Preferentemente, se elige un injerto mediante
agrupamientos aromáticos o alifáticos portadores de funciones de
ácido sulfónico, aún más preferentemente, en forma de sales de
propil-sulfonato. La resina en la que se injertan
las funciones ácidas sulfónicas puede ser de cualquier naturaleza,
en particular, poliacrílica o de poliestireno. La granulometría de
la resina está comprendida, ventajosamente, entre 100 \mum y 900
\mum, con preferencia entre 200 y 750 \mum y aún más
preferentemente, entre 250 y 600 \mum. La resina utilizable según
la invención debe presentar preferentemente una densidad superior a
1,15.
Entre las resinas comercialmente disponibles
utilizables en la presente invención, se puede citar, en particular,
la resina Trisacryl SP ® comercializada por la sociedad BIOSEPRA,
la resina MacroPrep High S ® comercializada por la sociedad BioRad.
Con preferencia, se elige una resina de poliestireno injertada
mediante funciones de sulfonato de alquilo o de arilo.
La resina se acondiciona en una columna antes de
su utilización, de una forma conocida por los especialistas,
mediante tratamiento por una solución desinfectante y enjuague, con
el fin de evitar la contaminación por microorganismos, A
continuación, es ocasionalmente equilibrada por el paso a través de
una solución tampón y enjuague.
La etapa b) de fijación de la materia prima,
leche o suero láctico, esterilizada o descremada, se desarrolla con
las condiciones preferenciales siguientes:
La resina es acondicionada en una columna cuya
temperatura se mantiene entre 2 y 15ºC, preferentemente entre 4 y
12ºC. Preferentemente, la columna es alimentada de materia prima por
la parte baja. En una forma de realización preferida, se trabaja en
lecho fluidificado. Preferentemente, los parámetros de fijación se
ajustan de forma que se verifiquen una o varias de las condiciones
siguientes:
- -
- BV_{f} está comprendido entre 80 y 150, preferentemente, entre 80 y 120;
- -
- SV_{f} está comprendido entre 5 y 40 h^{-1}, preferentemente entre 8 y 20 h^{-1} aún más preferentemente entre 8 y 15 h^{-1}
- -
- LV_{f} está comprendido entre 3 y 4,8 m/h, preferentemente entre 3,2 y 4 m/h.
Preferentemente, el conjunto de condiciones
siguientes se verifica durante la etapa b):
- -
- BV_{f} está comprendido entre 80 y 120;
- -
- SV_{f} está comprendido entre 8 y 15 h^{-1}
- -
- LV_{f} está comprendido entre 3 y 4,8 m/h
en el curso de la etapa c)
- -
- BV_{e} está comprendido entre 3 y 7
- -
- LV_{e} es inferior a 1 m/h.
Mediante el intercambio de iones, las proteínas
de la fracción láctea utilizada como producto de partida se fijan
en las funciones ácidas de la resina. La elección de los parámetros
de fijación, según la invención, permite realizar una fijación
selectiva de las proteínas en la columna. En las condiciones
clásicas de fijación de la leche en una resina catiónica, la
lactoferrina y la lactoperoxidasa, mayoritarias, se fijan
preferentemente en la resina. En el procedimiento según la
invención, las otras proteínas, minoritarias, se ven favorecidas
por las condiciones de fijación antes definidas y su proporción en
la mezcla de proteínas fijadas en la resina es significativamente
superior a su proporción en el producto de partida. El procedimiento
según la invención permite, de este modo, aislar una fracción
láctea con una composición en proteínas nueva en relación con las
composiciones proteicas lácteas de la técnica anterior y presentando
propiedades biológicas interesantes. La etapa c) de elusión de las
proteínas fijadas se desarrolla en las condiciones preferidas
siguientes:
La resina se mantiene a una temperatura
comprendida entre 2 y 15ºC, con preferencia entre 4 y 12ºC.
Preferentemente, la columna es alimentada con materia prima
(solución acuosa salada) por arriba. La solución acuosa salina
empleada para la puesta en práctica de la invención es generalmente
una solución de un cloruro metálico alcalino, tal como K+, Na+,
Ca+, Mg+. Con preferencia, se emplea una solución acuosa de cloruro
de sodio. Ventajosamente, la solución acuosa de sal tiene una
concentración comprendida entre 2% y 25%, preferentemente del 5% al
15% en peso de sal por peso de líquido. Con preferencia, la fuerza
iónica de la solución acuosa de sal está comprendida entre 1 y 2 M.
El pH de la solución de elusión está comprendida, en general, entre
6 y 7 y ventajosamente entre 6, 5 y 7.
Con preferencia, los parámetros de elusión
verifican una o varias de las condiciones siguientes:
- -
- BV_{e} está comprendido entre 3 y 7 y preferentemente entre 3 y 5;
- -
- LV_{e} es inferior a 0,5 m/h.
De forma conocida, la columna de resina se lava
antes de una nueva utilización.
Después de esta etapa, el eluado obtenido que
contiene la mezcla de proteínas de leche se somete de forma
conocida a una o más etapas de ultrafiltración y de diafiltración,
destinadas a eliminar las sales. Otros medios conocidos por los
especialistas, tales como la electrodiálisis o el paso sobre resinas
aniónicas y catiónicas débiles pueden emplearse en esta etapa, en
sustitución de la ultrafiltración y la diafiltración. Con
preferencia, este tratamiento se efectúa hasta la obtención de un
permeado que presente una conductividad inferior a 15 mS. Cualquier
otro procedimiento que permita eliminar las sales, como en
particular la electrodiálisis, puede utilizarse en sustitución de
esta etapa. La solución es entonces someterse a una microfiltración
destinada a esterilizar el resultado de la ultrafiltración, antes
de secado. Pueden emplearse otros medios técnicos para esterilizar
la fracción láctea obtenida en esta etapa, en particular un
tratamiento térmico adaptado, ultrasonidos o campos eléctricos
pulsados.
Preferentemente, el producto desalado y
esterilizado es secado con el fin de obtener la fracción láctea,
resultante del procedimiento de la invención, en forma de un polvo,
lo que permite a continuación, su acondicionamiento y su
almacenamiento. De forma conocida, el secado se puede realizar por
liofilización o por atomización.
La fracción proteica láctea, preferentemente
obtenida de la leche de vaca, y obtenida por el procedimiento según
la invención, es nueva. En forma seca, se caracteriza porque
tiene:
- -
- un contenido en proteínas superior al 90%
- -
- un contenido en sales minerales en sales minerales inferior al 1%
- -
- un contenido en materias grasas inferior al 1%
- -
- un contenido en lactosa inferior al 1%
- -
- un contenido en humedad inferior a un 5%
- -
- un contenido en lactoferrina inferior al 80%
- -
- un pH en solución al 2% comprendido entre 6 y 7,5
- -
- una pureza espectrofotométrica en UV visibles, definida por una relación
DO^{412}/DO^{280}<
0.15.
- -
- al menos un 1% de proteínas con un punto isoeléctrico superior o igual a 8, siendo los porcentajes dados en peso en relación con el peso de materia seca de la fracción láctea, según la invención.
En el caso en que el producto de partida
utilizado sea leche y no un suero lácteo, el producto obtenido por
el procedimiento de la invención, se caracteriza por las condiciones
suplementarias:
- -
- presencia de al menos un 40% de proteínas con peso isoeléctrico superior o igual a 8.
- -
- el contenido en lactoferrina es superior al 30% e inferior al 80%
- -
- la actividad de la lactoperoxidasa es superior o igual a 120 unidades ABTS por mg de aislado (ABTS= 2,2'-Azino-bis-(3-etil benzo-tiazolina 6-ácido sulfónico)
La medida de DO a 412 nm debe aportar una
evaluación cuantitativa de la lactoferrina y de la lactoperoxidasa
presentes en la fracción proteica láctea.
La relación DO^{412}/DO^{280}< 0,15
muestra que la lactoferrina y la lactoperoxidasa están
sub-representadas en relación con las otras
proteínas en la composición según la invención por comparación con
las proporciones en las que están presentes en la leche y en y en
las fracciones proteicas lácteas de la técnica anterior.
Con preferencia, la fracción proteica láctea,
obtenida por el procedimiento según la invención, responde al menos
a una de las características siguientes:
- -
- un contenido en proteínas superior al 95%
- -
- un contenido en sales minerales inferior al 0,5%
- -
- un contenido de materias grasas inferior al 0,5%
- -
- un contenido en lactosa inferior al 0,5%
- -
- un contenido en humedad inferior a un 4%
- -
- un pH en solución al 2%, comprendido entre 6 y 7,2
- -
- una pureza espectrofotométrico en UV visible, definida por una relación
DO^{412}/DO^{280}<
0.1.
- -
- contiene al menos un 1% de proteínas con un punto isoeléctrico entre 8,2 y 8,7.
En el caso en que el producto de partida
utilizado sea leche y no suero láctico, el producto obtenido por el
procedimiento de la invención se caracteriza por la condición
preferencial adicional.
- -
- el contenido en lactoferrina es superior al 50% e inferior al 80%.
Las fracciones proteicas lácteas, según la
invención, presentan propiedades ventajosas: en particular las que
favorecen el crecimiento de las células osteoblásticas y las células
intestinales.
Las fracciones proteicas lácteas de la invención
son igualmente eficaces para inhibir el crecimiento de los
osteoclastos y los pre-osteoclastos.
Estas propiedades, así como las propiedades ya
conocidas de las fracciones proteicas lácteas de la técnica
anterior, permiten considerar la posible utilización de estas
composiciones en numerosas aplicaciones, en particular en los
campos alimenticio y farmacéutico. La invención, por tanto, tiene
igualmente, por objeto, cualquier composición alimenticia,
farmacéutica y cualquier producto de higiene que incluya una
fracción proteica láctea, según la invención.
Una composición alimenticia según la invención
puede ser, por ejemplo, una leche alimenticia, en particular una
leche destinada a la alimentación infantil, obtenida por simple
rehidratación del polvo de fracción proteica láctea según la
invención. La invención, por lo tanto, tiene como objetivo la
utilización de una fracción proteica láctea, según la invención,
para la preparación de una leche alimenticia.
La invención tiene, igualmente, como objetivo,
composiciones alimenticias que comprenden una fracción proteica
láctea según la invención y otros ingredientes alimenticios. Se
puede, en particular, considerar la posibilidad de añadir la
fracción proteica láctea según la invención a una leche de vaca con
el fin de enriquecerla con determinadas proteínas. La presencia de
calcio en los alimentos, que incluyen la fracción proteica según la
invención, será en particular beneficiosa en la medida en que esta
fracción proteica láctea mejora la absorción de calcio por el
organismo humano, en particular la fijación de calcio en el tejido
óseo.
La invención tiene igualmente por objeto la
asociación de una fracción proteica láctea según la invención con
la de calcio.
La invención afecta igualmente a los kits
alimenticios que contienen varios constituyentes acondicionados de
manera aislada, destinados a una preparación extemporánea del
alimento y que comprenden polvo de fracción proteica láctea, según
la invención.
Dichos alimentos pueden utilizarse para la
prevención de patologías tales como: el retardo del crecimiento, la
osteoporosis, la fragilidad ósea, las fracturas óseas, los
reumatismos, las enfermedades periodontales y la deficiencia de la
barrera intestinal.
Una composición farmacéutica, según la
invención, que comprende al menos una fracción proteica láctea según
la invención y un soporte farmacéuticamente aceptable, se puede
utilizar en el tratamiento de una o varias de las siguientes
patologías: retardo del crecimiento, osteoporosis, fragilidad ósea,
fracturas óseas, reumatismos, artrosis, enfermedades periodontales
y deficiencia de la barrera intestinal.
Por supuesto, una composición de tal naturaleza
puede, además, incorporar uno o varios otros activos terapéuticos.
El calcio puede, ventajosamente, asociarse a la fracción proteica
láctea según la invención. Una asociación de ese tipo forma parte
de la presente invención. En efecto, una fracción proteica láctea
según la invención permite mejorar la absorción del calcio en el
organismo, en particular la fijación del calcio en el tejido óseo,
lo que permite mejorar el efecto reforzador de los huesos.
El calcio con la vitamina D puede también
asociarse a la fracción proteica láctea según la invención. Tal
asociación forma también parte de la presente invención. En efecto,
la vitamina D mejora la absorción intestinal del calcio y una
fracción proteica láctea, según la invención, permite mejorar la
fijación del calcio en el tejido óseo. Este efecto de sinergia
permite particularmente mejorar la salud de los huesos.
Composiciones farmacéuticas o complementos
alimenticios, según la invención, pueden administrarse bajo
cualquier forma apropiada, tal como en forma de polvo, de
granulados, de comprimidos, de cápsulas, de bebida, como por
ejemplo, en solución o en jarabe. La frecuencia de administración y
la dosis a administrar se adaptarán, de forma conocida, en función
del peso y la edad de la persona.
Se incluyen igualmente en la presente invención,
los productos de higiene, en particular los destinados a la higiene
de la cavidad bucal, tales como los dentífricos en forma de gel o de
pasta, los productos para el enjuague de la boca y las gomas de
mascar, que contienen una fracción proteica láctea según la
invención.
La resina empleada en los ejemplos siguientes es
una resina Trisacryl SP®. Sufre los tratamientos de
acondicionamiento siguientes antes de su puesta en práctica
inicial: puesta en contacto con una solución acuosa al 0,4% de
desinfectante ASEPTO ®, a razón de 3 litros de desinfectante por
kilogramo de resina húmeda, seguido por un enjuagado. Puesta en
equilibrio por paso de una solución tampón de acetato (80 mM,
pH=5,3) que contenga cloruro cálcico (33 g/l) y cloruro potásico
(50 g/l), a razón de 4 litros de esta solución tampón por kilogramo
de resina húmeda. Por último, la resina se enjuaga con agua hasta
la obtención de un eluado con un pH comprendido entre 6 y 7 y una
conductividad inferior a 5 mS.
Después de cada secuencia de fijación de materia
prima y de elusión, la resina es limpiada por tratamiento
enzimático con la proteasa alcalina del Bacillus
licheniformis en solución tampón con un pH = 8, a 60ºC durante
2 horas y luego, tratamiento con una solución de Nacl a 100 g por
litro durante treinta minutos (repetido dos veces). Antes de su
reutilización, se somete al tratamiento de acondicionamiento antes
expuesto.
La ultrafiltración se realiza sobre el eluado a
una temperatura comprendida entre 5 y 10ºC en membranas orgánicas
cuyo umbral de corte es de 10kD. El factor de concentración volúmica
aplicado está comprendido entre 10 y 60, con el fin de obtener un
producto resultante que tenga el extracto seco lo más elevado
posible, con preferencia entre el 15 y el 20%. La diafiltración se
realiza a una temperatura comprendida entre 15 y 25ºC en las mismas
membranas, utilizando un volumen de agua desmineralizada comprendido
entre 8 y 10 veces el volumen del producto retenido, obtenido como
resultado de la ultrafiltración, hasta alcanzar una conductividad
del permeado inferior a
15 mS.
15 mS.
La microfiltración se efectúa a 35ºC a partir
del producto resultante de la ultrafiltración/diafiltración en
membranas cerámicas, con un umbral de corte de 1,4 \mum.
El secado del permeado de microfiltración se
realiza en una torre de atomización de turbinas con una temperatura
de entrada de 140ºC y una temperatura de salida de 80ºC.
La resina SPEC 70 está constituida por un
soporte químicamente inerte y mecánicamente resistente.
Químicamente, el soporte está fabricado por
polimerización de AMPS: ácido 2-acrilamida
2-metil propano sulfónico. La resina tiene una
capacidad de intercambio de iones entre 400 y 700 \muE/ml y una
capacidad de fijación proteica medida en la lactoferrina (mínimo 20
mg/ml) o la lactoperoxidasa (mínimo 40 mg/ml) o la lisozima (mínimo
70 mg/ml); su densidad es superior a 1,15 y su granulometría se
sitúa entre 250 y 560 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
300.000 litros de leche desnatada y tratada
térmicamente a 68ºC, durante 15 segundos, se hacen pasar a 10º C
sobre 3.000 litros de resina intercambiadora de cationes (Referencia
SPEC 70 suministrada por la sociedad BIOSEPRA) a un caudal de
14.000 litros/h en flujo ascendente, en dos columnas que funcionan
en paralelo y que tengan cada una un radio de 1 metro.
Las proteínas fijadas en la resina son eluidas
por 9.000 litros de una solución de cloruro de sodio al 10% en
flujo descendente.
El eluado obtenido presenta un pH de 6,5 y un
extracto seco de 80 g/kg. Se pasa a través de membranas de
ultrafiltración con un umbral de corte de 10 kD y de 17 m^{2} de
superficie suministradas por DSS, a 11ºC con un flujo de permeación
de 161/h/m^{2} hasta obtener un factor de concentración volúmica
de 7.
El resultado de la operación anterior presenta
un pH de 5,9 y un extracto seco de 170 g/kg; con el fin de eliminar
la sal, a continuación es diafiltrado en las mismas membranas a
25ºC, con el agua a la altura del 70% del volumen del eluado puesto
en práctica y hasta obtener un factor de concentración volúmica de
9,5 al final, con un flujo de permeación de 161/h/m^{2}.
El resultado de la operación anterior presenta
un pH de 6,5 y un extracto seco de 95 g/kg; entonces se pasa a
través de membranas de microfiltración de porosidad de 1,4 \mum a
30ºC con un flujo de permeación de 320 l/h/m^{2}. El perneado de
esta microfiltración tiene un pH de 6,6 y un extracto seco de 75
g/kg.
Este permeado es a continuación secado en una
torre de atomización provista de una turbina; la temperatura de
entrada en la torre es de 140ºC y la temperatura de salida es de
80ºC.
El aislado de polvo así obtenido presenta las
características siguientes:
- -
- Humedad: 4,7%
- -
- Proteínas (Nx6,38): 96,2%, de las cuales:
- Lactoferrina: 54%
- Lactoperoxidasa: 125 unidades ABTS/mg
- -
- Cenizas; 0,1% de las que:
- Na: 0,02%
- Cl: 0,44%
- -
- Pureza espectrofotométrica: DO^{412}/DO^{280} = 0,06
El perfil electroforético obtenido por
isofocalización con revelación al nitrato de plata es ilustrado por
la Figura 1. En la Figura 1 se compara la distribución de los puntos
isoeléctricos de la fracción proteica láctea según la invención
(marcada LN06) y un producto de referencia denominado Std que es un
kit de calibración proteica comercializado por la sociedad
Pharmacia bajo la referencia 17047101 y denominado "Isoelectric
Focusing Calibration Kit Broad Pl 3-10". Se
constata que están presentes mayoritariamente en las proteínas que
tienen puntos isoeléctricos elevados (alrededor de 8,4). Este
producto comporta aproximadamente un 50% en peso de lactoferrina en
relación con el peso total del aislado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
4,4 litros de suero ácido nativo de caseinería
(pH 4,7, extracto seco 65 g/kg) se hacen pasar a 10ºC sobre 22 ml
de resina intercambiadora de cationes (Referencia SPEC 70,
suministrada por la sociedad BIOSEPRA) a un caudal de 400 ml/h en
flujo descendente, en una columna con un diámetro de 15 mm.
Las proteínas fijadas en la resina son eluidas
por 90 ml de una solución de cloruro de sodio a un 10% en flujo
descendente.
Con el fin de eliminar la sal, el eluado
obtenido (100 ml) es a continuación dializado contra agua
desmineralizada durante 48 horas a 4ºC.
El producto dializado presenta las
características siguientes:
- -
- Extracto seco: 1, 5 g/kg
- -
- pH: 5,4
- -
- Conductividad: 24 \muS
- -
- DO^{412}<0,005,
- -
- DO^{280} = 4,6 (0,46 diluido 10 veces).
El perfil electroforético permite constatar que
al menos un 1% de las proteínas presentes presentan un punto
isoeléctrico superior o igual a 8. Este producto contiene en torno a
un 3% de lactoferrina en peso en relación con el peso total del
aislado de proteínas.
Las células MC373 se cultivan a 37ºC en
atmósfera húmeda conteniendo un 5% de CO_{2}. El medio de cultivo
utilizado es de alfa-MEM
(alpha-Modified Eagle Medium) complementado con la
ayuda de un 10% de suero de ternera fetal y de 50 \mu/ml de
penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina.
Para probar el efecto de las diferentes
proteínas sobre el crecimiento celular, las células son sembradas
en placas de 48 pocillos, a una densidad de 5 x 10^{4}
células/cm^{2}. Transcurridas 48 horas desde la siembra, las
proteínas son añadidas a las células. Las soluciones proteicas son
preparadas en el medio de cultivo a una concentración de 10 mg/ml y
luego, filtradas en filtro de 0,22 \mu y diluidas a la
concentración deseada en el medio de cultivo, inmediatamente antes
de su uso. Las células son enumeradas después de 72 h de cultivo,
evaluándose la cantidad de ADN.
Las células RAW 264.7 son cultivadas a 37ºC en
atmósfera húmeda conteniendo un 5% de CO_{2}. El medio de cultivo
utilizado es el DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium) conteniendo
25 mM de glucosa, 4 mM de glutamina y 1,5 g/litro de bicarbonato,
complementado con ayuda del 10% de suero de ternera fetal y de 50
\mu/ml de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina.
Para probar el efecto de las diferentes
proteínas sobre el crecimiento celular, las células son sembradas
en placas de 48 pocillos, con una densidad de 5 x 10^{4}
células/cm^{2}. 48 horas después de la siembra, las proteínas son
añadidas a las células. Las soluciones proteicas son preparadas en
el medio de cultivo a una concentración de 10 mg/ml, luego
filtradas en filtro de 0,22 \mu y diluidas a la concentración
deseada en el medio de cultivo, inmediatamente antes de su uso. Las
células son enumeradas después de 72 horas de cultivo, evaluándose
la cantidad de ADN.
Las células Caco-2 se cultivan a
37ºC en atmósfera húmeda conteniendo un 5% de CO_{2} es el DMEM
(Dubelcco's Modified Eagle Medium), conteniendo 25 mM de glucosa
suplementada con ayuda de un 15% de suero de ternera fetal, de un
1% de ácidos aminados no esenciales, de 6 mM de glutamina y 50
\mu/ml de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina.
Para probar el efecto de las diferentes
proteínas sobre el crecimiento celular, las células son sembradas
en placas de 48 pocillos, con una densidad de 5 x 10^{4}
células/cm^{2}. 48 horas después de la siembra, las proteínas son
añadidas a las células. Las soluciones proteicas son preparadas en
el medio de cultivo a una concentración de 10 mg/ml, después
filtradas en filtro 0,22 \mu y diluidas a la concentración deseada
en el medio de cultivo, justo antes de su uso. Las células son
contadas después de 72h de cultivo, evaluándose la cantidad de
ADN.
Los ensayos antes descritos han sido puestos en
práctica en tres productos:
- -
- un aislado de proteínas de leche de vaca compuesta en un 90% de lactoferrina (Producto testigo) :T_{1}.
- -
- un aislado de proteínas de leche de vaca, cuyo contenido en lactoferrina es de menos del 0,01% (Producto testigo): T_{2}.
- -
- el producto preparado en el ejemplo 1: P_{1}
- -
- el producto preparado en el ejemplo 2: P_{2}
Los resultados de estos ensayos se exponen en la
Tabla I:
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración designa la concentración del
aislado de proteínas de leche en el medio de cultivo.
La técnica tiende a demostrar que la actividad
de un aislado de proteínas de leche está ligada al porcentaje de
lactoferrina que contiene (ver resultados de T_{2}).
A diferencia de lo prejuzgado por la técnica
anterior, los resultados de los ensayos anteriores demuestran que
los aislados de proteínas de leche, según la invención, si bien
contienen poca lactoferrina en relación con el testigo T_{1},
tienen una actividad notable en los ensayos de crecimiento celular
en osteoblastos y en las células intestinales y de inhibición de la
proliferación de los pre-osteoclastos.
Claims (40)
1. Procedimientos de aislamiento de proteínas de
la leche a partir de leche o de un suero lácteo, incluyendo las
etapas siguientes:
- a)
- la leche o el suero lácteo es esterilizado y descremado;
- b)
- la fracción láctea resultante de la etapa a) se pasa a través de una resina intercambiadora de cationes, acondicionada en una columna de elusión;
- c)
- la fracción retenida en la resina es objeto de elusión por una solución acuosa salada;
- d)
- el eluado resultante de la etapa c) es desalado y esterilizado;
estando dichos procedimientos
caracterizados porque:
- \alpha)
- la resina intercambiadora de cationes es una resina injertada mediante funciones ácidas fuertes;
- el parámetro BV que designa la relación del volumen de materia prima al volumen de resina húmeda en la columna,
- el parámetro SV que designa la relación del caudal de alimentación de la columna al volumen de resina húmeda en la columna,
- el parámetro LV que designa la relación del caudal de alimentación de la columna a la sección de la columna;
- \beta)
- durante la etapa b), los parámetros de fijación presentan los valores siguientes:
- -
- BV_{f} está comprendido entre 50 y 400;
- -
- SV_{f} está comprendido entre 2 y 40 h^{-1}
- -
- LV_{f} es superior o igual a 1 m/h e inferior o igual a 5 m/h
- \gamma)
- durante la etapa c), los parámetros de elución presentan los valores siguientes:
- -
- BV_{e} está comprendido entre 1,5 y 7;
- -
- LV_{e} es inferior a 1 m/h.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el producto de partida es leche de
vaca.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el producto de partida es un suero
lácteo ácido de caseína.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la resina
intercambiadora de cationes es una reina injertada por funciones
ácidas de pKa \geq 2 que tiene una capacidad de intercambio de
iones, comprendida entre 200 y 1000 \muE/ml.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque la resina es injertada por funciones de
ácido sulfónico o sal de sulfonato.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque la resina está injertada por funciones
propilsulfónicas o de propil-sulfonato.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
granulometría de la resina está comprendida entre 100 \mum y 900
\mum, con preferencia entre 200 y 750 \mum y más
preferentemente entre 250 y 600 \mum.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en el curso
de la etapa b) de fijación de la materia prima, se cumplen una o
varias de las condiciones siguientes:
- -
- BV_{f} está comprendido entre 80 y 150;
- -
- SV_{f} está comprendido entre 5 y 40 h^{-1},
- -
- LV_{f} está comprendido entre 3 y 4,3 m/h,
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se
verifican las condiciones siguientes en el curso de la etapa
b):
- -
- BV_{f} está comprendido entre 80 y 120;
- -
- SV_{f} está comprendida entre 8 y 15 h^{-1}
- -
- LV_{f} está comprendido entre 3 y 4,8 m/h
en el curso de la etapa
c)
- -
- BV_{e} está comprendido entre 3 y 7
- -
- LV_{e} es inferior a 1 m/h.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque, en el
curso de la etapa b), la resina es acondicionada en una columna
cuya temperatura se mantiene entre 2ºC y 15ºC.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque, en el
curso de la etapa c) de elución de las proteínas fijas, se cumple,
al menos, una de las condiciones siguientes:
- -
- BV_{e} está comprendido entre 3 y 5
- -
- LV_{2} es inferior a 0,5 m/h.
12. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en el
curso de la etapa c), la resina es acondicionada en una columna cuya
temperatura se mantiene entre 2 y 15ºC.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la solución
acuosa salina, empleada para la puesta en práctica de la invención,
es una solución de un cloruro de un metal alcalino elegido entre
K+, Na+, Ca+ y Mg+.
14. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque la solución acuosa salina es una
solución acuosa de cloruro de sodio.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque la solución acuosa salina es de una
concentración comprendida entre 2 y 25% en peso de sal por peso de
líquido.
16. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque la solución acuosa salina tiene una
fuerza iónica incluida entre 1 y 2 M.
17. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque el pH de la solución acuosa salina de
elusión está comprendida entre 6 y 7 y ventajosamente entre 6, 5 y
7.
18. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el desalado
se efectúa por ultrafiltración y diafiltración.
19. Procedimiento según la reivindicación 18,
caracterizado porque los tratamientos de ultrafiltración y
de diafiltración se realizan hasta la obtención de un perneado que
presente una conductividad inferior a 15 mS.
20. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
esterilización se realiza por microfiltración.
21. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el producto
desalado esterilizado es secado con el fin de obtener la fracción
láctea resultante del procedimiento de la invención bajo la forma
de polvo.
22. Fracción proteica láctea
caracterizada porque es susceptible de ser obtenida por el
procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
21.
23. Fracción proteica láctea
caracterizada porque responde a las características
siguientes:
- -
- un contenido en proteínas superior al 90%
- -
- un contenido en sales minerales inferior al 1%
- -
- un contenido de materias grasas inferior al 1%
- -
- un contenido en lactosa inferior al 1%
- -
- un contenido en humedad inferior a un 5%
- -
- un contenido en lactoferrina inferior al 80%
- -
- un pH en solución al 2% comprendido entre 6 y 7,5
- -
- una pureza espectrofotométrica en UV visibles, definida por una relación
DO^{412}/DO^{280}<
0.15.
- -
- al menos un 1% de proteínas con un punto isoeléctrico superior o igual a 8,
siendo los porcentajes dados en
peso en relación con el peso de materia seca de la fracción láctea
según la
invención.
24. Fracción proteica láctea según la
reivindicación 23, caracterizada porque responde, al menos, a
una de las características siguientes:
- -
- un contenido en proteínas superior al 95%
- -
- un contenido en sales minerales inferior al 0,5%
- -
- un contenido de materias grasas inferior al 0,5%
- -
- un contenido en lactosa inferior al 0,5%
- -
- un contenido en humedad inferior a un 4%
- -
- un contenido en lactoferrina inferior al 80%
- -
- un pH en solución al 2%, comprendido entre 6 y 7,2
- -
- una pureza espectrofotométrica en UV visible, definida por una relación
DO^{412}/DO^{280}<
0.1.
- -
- contiene al menos un 1% de proteínas con un punto isoeléctrico entre 8,2 y 8,7.
25. Fracción proteica láctea según una
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizada
porque procede de la leche de vaca.
26. Fracción proteica láctea según la
reivindicación 25, caracterizada porque contiene al menos un
40% de proteínas con un punto isoeléctrico superior o igual a
8.
27. Fracción proteica láctea según la
reivindicación 25 o la reivindicación 26, caracterizada
porque contiene un contenido de lactoferrina superior o igual al
30% y una actividad de lactoperoxidasa superior o igual a 120
unidades ABTS por mg de aislado.
28. Fracción proteica láctea según cualquiera de
las reivindicaciones 22 a 24, caracterizada porque procede
de un suero lácteo ácido de caseína.
29. Asociación de una fracción proteica láctea,
según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, con
calcio.
30. Asociación según la reivindicación 29,
caracterizada porque contiene, además, la vitamina D.
31. Composición alimenticia caracterizada
porque contiene una fracción proteica láctea según una cualquiera
de las reivindicaciones 22 a 30.
32. Kits alimenticios que comprenden un polvo de
fracción proteica láctea, según una cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 30.
33. Utilización de una fracción proteica láctea,
según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30, para la
preparación de una leche alimenticia.
34. Utilización de una fracción proteica láctea,
según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30, para la
preparación de un alimento destinado a la prevención de patologías
seleccionadas entre: retraso de crecimiento, osteoporosis,
fragilidad ósea, fracturas óseas, reumatismos, artrosis,
enfermedades periodontales, deficiencia de la barrera
intestinal.
35. Utilización de una fracción proteica láctea,
según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30, para la
preparación de un alimento destinado a favorecer el crecimiento de
los osteoblastos y/o de las células intestinales y/o a inhibir el
crecimiento de los pre-osteoclastos.
36. Composición farmacéutica
caracterizada porque comprende al menos una fracción proteica
láctea según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30 y un
soporte farmacéuticamente aceptable.
37. Utilización de una fracción proteica láctea,
según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30, para la
preparación de un medicamento destinado a la prevención y/o al
tratamiento de patologías seleccionadas entre: retraso de
crecimiento, osteoporosis, fragilidad ósea, fracturas óseas,
reumatismos, artrosis, enfermedades periodontales, deficiencia de
la barrera intestinal.
38. Utilización de una fracción proteica láctea,
según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30, para la
preparación de un medicamento destinado a mejorar la absorción del
calcio en el organismo.
39. Utilización de una fracción proteica láctea,
según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30, para la
preparación de un medicamento destinado a favorecer el crecimiento
de los osteoblastos y/o de las células intestinales y/o a inhibir
el crecimiento de los pre-osteoclastos.
40. Producto de higiene caracterizado
porque comprende al menos una fracción proteica láctea según una
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30.
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