ES2249207T3 - Agente de supresion de la resorcion osea. - Google Patents
Agente de supresion de la resorcion osea.Info
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Abstract
Un agente de supresión de la resorción ósea que comprende una cistatina básica derivada de la leche y/o el producto de descomposición de cistatina básica derivada de la leche como un componente eficaz, siendo dicha cistatina básica derivada de la leche una proteína obtenible por un procedimiento que comprende (i) pasar leche desnatada de vaca a través de una columna de S-sefarosa; (ii) lavar la columna con agua desionizada; (iii) eluir una fracción de la columna usando un gradiente de concentración lineal de 0, 1 a 1, 0 M de cloruro de sodio; (iv) calentar la fracción eluida hasta 90 ºC durante 10 minutos; (v) centrifugar la fracción eluida para eliminar precipitados, creando de esta manera una primera fracción; (vi) fraccionar la primera fracción usando cromatografía de intercambio iónico MonoS, creando así una segunda fracción; (vii) fraccionar la segunda fracción usando cromatografía de intercambio iónico MonoQ y cromatografía de filtración con gel Superose 12 con un sistema HPLC, posteriormente con cromatografía con hidroxiapatita y cromatografía de fase inversa C4 usando un sistema HPLC, o por un procedimiento que comprende (I) calentar una solución de proteína de suero de leche de vaca al 5% a 90 ºC durante 10 minutos; (II) centrifugar la solución para eliminar precipitados, creando así una primera fracción; (III) pasar la primera fracción a través de una columna llena con un vehículo en el que papaína carboximetilada está unida a Tresyl-Toyopearl y equilibrada con una solución de cloruro de sodio 0, 5 M; (IV) lavar la columna con una solución de cloruro de sodio 0, 5 M y luego con una solución de cloruro de sodio 0, 5 M que contiene 0, 1% de Tween 20; (V) eluir la proteasa de cisteína con una solución de cloruro de sodio 0, 5 M-ácido acético 20 mM; (VI) neutralizar la fracción eluida con una solución de hidróxido de sodio 1 M, creando así una segunda fracción; y (VII) fraccionar la segunda fracción usando cromatografía de intercambio aniónico MonoS, posteriormente cromatografía con hidroxiapatita y cromatografía de fase inversa C4 usando un sistema HPLC.
Description
Agente de supresión de la resorción ósea.
La presente invención se refiere a agentes de
supresión de la resorción ósea que comprenden una cistatina básica
derivada de la leche y/o producto de descomposición de cistatina
básica derivada de la leche como un componente efectivo y en
particular se refiere a agentes de supresión de la resorción ósea
para usarse en la prevención y tratamiento de enfermedades de las
articulaciones o enfermedades periodontales.
La presente invención también se refiere a
bebidas, productos alimenticios y alimentos en los que se mezcla una
cistatina básica derivada de la leche y/o producto de descomposición
de cistatina básica derivada de la leche para proveer una actividad
para prevenir y tratar enfermedades de las articulaciones o
enfermedades periodontales. En particular la presente invención
también se refiere a bebidas, productos alimenticios y alimentos en
los que se mezcla una composición cálcica altamente absorbible y
vitamina D y/o vitamina K, además de una cistatina básica derivada
de la leche y/o producto de descomposición de cistatina básica
derivada de la leche para proveer una actividad para prevenir y
tratar enfermedades de las articulaciones o enfermedades
periodontales.
En los últimos años ha crecido la cantidad de
personas que sufren enfermedades de las articulaciones tales como
osteoporosis y reumatismo debido al envejecimiento de la población.
La formación y la resorción ósea tienen lugar continuamente en el
tejido óseo y están bien balanceadas en la temprana edad, pero el
balance se pierde con un incremento en la resorción ósea con la edad
por varias razones. Si este desbalanceo continúa durante un largo
período de tiempo, el tejido óseo se vuelve frágil, lo que da como
resultado enfermedades óseas tales como osteoporosis, fracturas
óseas y lumbago. Se cree que si se puede prevenir este
desacoplamiento, puede prevenirse también la osteoporosis, fracturas
óseas, lumbago o similares.
Los procedimientos convencionales para prevenir y
tratar enfermedades de los huesos previniendo el desacoplamiento
incluyen (1) suplemento dietario de calcio, (2) ejercicio moderado,
(3) baños solares y (4) terapia con medicamentos.
Para el suplemento dietario se usan sales de
calcio tales como carbonato de calcio y fosfato de calcio,
suplementos de calcio naturales tales como polvos de hueso bovino,
cáscara de huevo y polvos de espina de pescado. Hasta el momento,
tales productos y materiales alimenticios se usaron exclusivamente
para suplementar calcio.
Por ejercicio moderado, son altamente
recomendables correr o caminar moderadamente. Sin embargo, el
ejercicio moderado resulta difícil para las personas físicamente
débiles y, sin mencionar, prácticamente imposible para personas
mayores confinadas a la cama.
Los baños de sol son buenos para suplementar la
vitamina D_{3} activada, pero no son suficientes.
Como medicamentos terapéuticos la
1\alpha-hidroxi vitamina D_{3} y las
preparaciones de calcitonina o similares son conocidos por ser
eficaces para curar y tratar la osteoporosis. Las preparaciones de
calcitonina son preparaciones hormonales. No se han estudiado aún
sustancias seguras para la obtención de calcitonina desde materiales
alimenticios. La calcitonina es difícil de preparar en grandes
cantidades y de proveer como un material alimenticio seguro ya que
deben usarse como materia prima los tejidos animales, células,
sangre u orina.
Se cree que el reumatismo, una enfermedad de las
articulaciones puede prevenirse y tratarse suprimiendo la resorción
ósea puesto que está asociado con la resorción ósea.
En los últimos años, las enfermedades
periodontales se han convertido también en un problema social serio.
A diferencia de las caries dentales, las enfermedades periodontales
debilitan las raíces de los dientes, lo que inutiliza aún a los
dientes sanos. Actualmente, mucha gente desarrolla síntomas de
enfermedades periodontales. Las enfermedades periodontales pueden
ser más serias que las caries dentales.
Hoy, los medios para prevenir las enfermedades
periodontales son la prevención del crecimiento de los
microorganismos causales, por ejemplo, mediante la remoción de la
placa dental o mediante buches usando lavados bucales que contienen
agentes antibacterianos o similares. Sin embargo, estos medios
parecen ser menos eficaces para síntomas muy desarrollados. A saber,
en el estadio tardío de las enfermedades periodontales, la masa ósea
alveolar disminuye y una vez que se pierden los huesos alveolares,
se producen síntomas no regeneramiento. La pérdida de dientes debida
a enfermedades dentales hace que resulte difícil y doloroso comer,
lo que molesta en la vida diaria. Por lo tanto, hay una necesidad de
medios eficaces para la prevención y tratamiento de enfermedades
periodontales.
Sin embargo, hasta ahora, no hay un agente
disponible para la prevención y tratamiento de enfermedades
periodontales que supriman eficazmente la disminución en la masa
ósea alveolar.
Por lo tanto, como la osteoporosis, las
enfermedades periodontales se han convertido en un problema social.
Por consiguiente es necesario un tratamiento eficaz para las
enfermedades periodontales, lo que contribuirá enormemente a la
salud de la población.
Los autores de la presente invención buscaron
intensamente una fracción del suero de la leche con actividad
estimulante del crecimiento de osteoblastos, con actividad de
supresión de la resorción ósea y actividad fortalecedora ósea, con
el fin de obtener un material que pueda ser usado para la prevención
y tratamiento de enfermedades de las articulaciones y enfermedades
periodontales. A saber, los autores de la presente invención
fraccionaron proteínas de la leche, en particular del suero de la
leche, con la intención de obtener una fracción con actividad de
supresión de la resorción ósea, y obtuvieron una actividad
fortalecedora del hueso en una mezcla
proteína-péptido que se obtuvo tratando una fracción
hidrosoluble de las proteínas del suero con una membrana de ósmosis
inversa o electrodiálisis para remover las sales derivadas del suero
(Patente Japonesa expuesta a la inspección pública Nº
4-183371). Además, los autores de la presente
invención encontraron que en una fracción obtenida por el
tratamiento de una solución acuosa de esta mezcla
proteína-péptido con etanol, calor, sales o una
membrana de ultrafiltración tiene una actividad fortalecedora de los
huesos (Patente Japonesa en trámite Nº 5-176715,
Patente Japonesa expuesta a la inspección pública Nº
5-320066). Los autores de la presente invención
también hallaron que proteínas básicas presentes en la leche como
trazas tienen una actividad estimulante de la síntesis de colágeno
en osteoblastos y una actividad supresora de la resorción ósea
(Patente Japonesa expuesta a la inspección pública Nº
8-151331).
La cistatina es un inhibidor de la proteasa de
cisteína que inhibe la actividad proteolítica de las proteasas de
cisteína que tienen un grupo SH en el centro activo y se encuentra
en tejidos animales, células y orina. Se reconoció una actividad
inhibitoria del crecimiento viral como una de las actividades útiles
de la cistatina (Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 127, pág.
1072, 1985).
La Patente Japonesa expuesta a la inspección
pública Nº 2-223529 describe el uso de cistatina
como agentes antialérgicos y como agentes terapéuticos para
enfermedades de los huesos en la forma de una preparación
inyectable, supositorio, polvo nasal o similar. Más específicamente,
describe el resultado de una prueba en la que se redujo el nivel de
calcio en sangre en ratones por inyección intravenosa con cistatina
derivada de ratones preparada por ingeniería genética. Sin embargo,
no se puede concluir que la cistatina tiene una actividad para
prevenir y tratar enfermedades de las articulaciones tales como
osteoporosis y reumatismo, solo con este resultado.
Además, hasta ahora, no se conoce un agente de
supresión de la resorción ósea que comprenda una cistatina básica
derivada de la leche y/o producto de descomposición de cistatina
básica derivada de la leche que sea eficaz por administración oral y
no necesariamente intravenosa, como un componente eficaz. Tampoco se
conocen, una bebida, producto alimenticio o alimento que contengan
tales componentes en concentraciones mayores, con calcio y
vitaminas, y que pueda administrarse por vía oral.
A pesar de que los autores de la presente
invención solicitaron previamente una patente (Patente Japonesa
expuesta a la inspección pública Nº 7-126294) para
un inhibidor de proteasa de cisteína diferente de la cistatina
básica derivada de la leche, la actividad de supresión de la
resorción ósea de la cistatina básica derivada de la leche de la
presente invención es superior de la de dicho inhibidor.
Los autores de la presente invención trataron de
aislar y purificar una sustancia activa de una fracción proteica
básica con actividad de supresión de la resorción ósea,
identificaron la sustancia resultante y hallaron que esta sustancia
es una cistatina básica derivada de la leche. Además, encontraron
que la cistatina básica derivada de la leche tiene una actividad
supresora de la resorción ósea particularmente alta comparada con la
de cistatinas de otros orígenes. Posteriormente, los autores de la
presente invención encontraron que un producto de la descomposición
de la cistatina básica derivada de la leche también tiene una alta
actividad supresora de la resorción ósea.
De acuerdo con esto, el objeto de la presente
invención es proveer agentes de supresión de la resorción ósea que
comprenden la cistatina derivada de la leche y/o producto de
descomposición de cistatina derivada de la leche como un componente
efectivo y bebidas, productos alimenticios y alimentos en los que se
mezclan cistatina derivada de la leche y/o producto de
descomposición de cistatina derivada de la leche para proveer una
actividad supresora de la resorción ósea.
Además, la presente invención es útil
industrialmente porque puede prepararse en grandes cantidades
cistatina básica derivada de la leche segura a partir de un material
alimenticio, es decir leche y mezclas como material alimenticio
seguro.
Los autores de la presente invención encontraron
que una cistatina básica derivada de la leche y un producto de
descomposición de la cistatina básica derivada de la leche tienen
una excelente actividad supresora de la resorción ósea.
A saber, la presente invención provee agentes de
supresión de la resorción ósea que comprende la cistatina derivada
de la leche y/o producto de descomposición de cistatina derivada de
la leche, como un componente efectivo, siendo dicha cistatina básica
derivada de la leche una proteína obtenible por un procedimiento que
comprende (i) pasar leche desnatada de vaca a través de una columna
de S-sefarosa; (ii) lavar la columna con agua
desionizada; (iii) eluir una fracción de la columna usando un
gradiente de concentración lineal de 0,1 a 1,0 M de cloruro de
sodio; (iv) calentar la fracción eluida hasta 90ºC durante 10
minutos; (v) centrifugar la fracción eluida para eliminar
precipitados, creando de esta manera una primera fracción; (vi)
fraccionar la primera fracción usando cromatografía de intercambio
iónico MonoS, creando así una segunda fracción; (vii) fraccionar la
segunda fracción usando cromatografía de intercambio iónico MonoQ y
cromatografía de filtración con gel Superose 12 con un sistema HPLC,
posteriormente con cromatografía con hidroxiapatita y cromatografía
de fase inversa C4 usando un sistema HPLC, o por un procedimiento
que comprende (I) calentar una solución de proteína de suero de
leche de vaca al 5% a 90ºC durante 10 minutos; (II) centrifugar la
solución para eliminar precipitados, creando así una primera
fracción; (III) pasar la primera fracción a través de una columna
llena con un vehículo en el que papaína carboximetilada está unida a
Tresyl-Toyopearl y equilibrada con una solución de
cloruro de sodio 0,5 M; (IV) lavar la columna con una solución de
cloruro de sodio 0,5 M y luego con una solución de cloruro de sodio
0,5 M que contiene 0,1% de Tween 20; (V) eluir la proteasa de
cisteína con una solución de cloruro de sodio 0,5 M-ácido acético 20
mM; (VI) neutralizar la fracción eluida con una solución de
hidróxido de sodio 1 M, creando así una segunda fracción; y (VII)
fraccionar la segunda fracción usando cromatografía de intercambio
aniónico MonoS, posteriormente cromatografía con hidroxiapatita y
cromatografía de fase inversa C4 usando un sistema HPLC. Además, la
presente invención puede proveer una actividad supresora de la
actividad ósea a bebidas, productos alimenticios y alimentos
mezclándolos con cistatina básica derivada de la leche y/o producto
de descomposición de cistatina básica derivada de la leche. Además,
la presente invención puede proveer una actividad supresora de la
actividad ósea y una actividad estimulante de la formación ósea a
bebidas, productos alimenticios y alimentos mezclándolos con
cistatina básica derivada de la leche y/o producto de descomposición
de cistatina básica derivada de la leche y con un componente de
calcio altamente absorbible y vitamina D y/o vitamina K.
Más específicamente, en base a la actividad
supresora de la resorción ósea de la cistatina básica derivada de la
leche y/o producto de descomposición de cistatina básica derivada de
la leche mencionada anteriormente, pueden proveerse agentes de
supresión ce la resorción ósea, que comprenden cistatina básica
derivada de la leche y/o producto de descomposición de cistatina
básica derivada de la leche como componente eficaz, siendo dicha
cistatina básica derivada de la leche una proteína obtenible por
medio del procedimiento descrito anteriormente, para la prevención y
tratamiento de enfermedades de las articulaciones o enfermedades
periodontales. También pueden proveerse bebidas, productos
alimenticios y alimentos con actividad de prevención y tratamiento
de enfermedades de las articulaciones o enfermedades periodontales
mezclándolas con cistatina básica derivada de la leche y/o producto
de descomposición de cistatina básica derivada de la leche.
La presente invención provee una actividad
supresora de la resorción ósea a bebidas, productos alimenticios y
alimentos por la mezcla de cistatina básica derivada de la leche y/o
producto de descomposición de cistatina básica derivada de la leche
seguro, preparado usando leche de vaca, un producto alimenticio,
como materia prima.
Los ejemplos de leche para ser usada como materia
prima para cistatina básica derivada de la leche incluyen leche
cruda, leche en polvo, leche desnatada y leche reconstituida. La
cistatina básica derivada de la leche puede obtenerse de estos
materiales lácteos por calentamiento, tratamiento con sal,
tratamiento con etanol, varios procedimientos cromatográficos, tal
como cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de
filtración en gel, tratamiento con membrana de ultrafiltración, o
similares.
Un producto de degradación de cistatina básica de
la leche de la presente invención es una mezcla de péptidos
preparada por descomposición restrictiva de la cistatina básica
derivada de la leche anteriormente mencionada con protesasa, tales
como tripsina, quimotripsina, pepsina, papaína, calicreína,
catepsina, termolisina y proteasa B8.
En la presente invención, se agregan la cistatina
básica derivada de la leche y/o producto de descomposición de
cistatina básica derivada de la leche a bebidas y productos
alimenticios para brindarles actividad supresora de la resorción
ósea. Los ejemplos de tales bebidas y productos alimenticios
incluyen leche, bebidas lácteas, jugos, jaleas, bizcochos, panes,
fideos y salchichas. Las enfermedades de las articulaciones, tales
como osteoporosis y reumatismo y las enfermedades periodontales
pueden ser prevenidas o tratadas ingiriendo tales bebidas y
productos alimenticios a los que se provee actividad supresora de la
resorción ósea.
En la presente invención, se usan la cistatina
básica derivada de la leche y/o producto de descomposición de
cistatina básica derivada de la leche como medicamentos, o mezclados
con bebidas, productos alimenticios y alimentos como un componente
eficaz para la prevención o tratamiento de enfermedades de las
articulaciones, tales como osteoporosis y reumatismo, en una
cantidad desde aproximadamente 8 \mug hasta 10 \mug por día para
un individuo adulto, administrados en dosis divididas. En
particular, la cistatina básica derivada de la leche y/o producto de
descomposición de cistatina básica derivada de la leche son de
preferencia mezclados en bebidas, productos alimenticios y
alimentos, en una concentración de más de 4 \mu% en peso de manera
de obtener fácilmente la dosificación mencionada anteriormente.
En la presente invención, una cistatina básica
derivada de la leche y/o producto de descomposición de cistatina
básica derivada de la leche se usan como medicamentos, o mezclados
en bebidas, productos alimenticios y alimentos como un componente
eficaz para la prevención o tratamiento de enfermedades
periodontales, por ejemplo en forma de pasta dental, enjuague bucal,
caramelo, goma de mascar o pastilla poniéndolos en contacto con la
superficie dental en una cantidad de aproximadamente 8 \mug hasta
10 \mug por día para un individuo adulto y administrado en dosis
divididas.
De preferencia, se mezcla una sal de calcio
altamente absorbible con los agentes de supresión de la resorción
ósea, bebidas, productos alimenticios y alimentos de la presente
invención. Los ejemplos de sales de calcio altamente absorbibles
incluyen cloruro de calcio, carbonato de calcio, lactato de calcio,
cáscaras de huevo y sustancias que contienen calcio derivado de la
leche. Pueden agregarse también componentes eficaces para los
huesos, tales como vitamina D y vitamina K. En tales casos, puede
lograrse el efecto sinérgico deseable de actividad estimulante de la
formación ósea provisto por el agregado del calcio altamente
absorbible anteriormente mencionado y vitaminas con la actividad
supresora de la resorción ósea provista por una cistatina básica
derivada de la leche y/o producto de descomposición de cistatina
básica derivada de la leche.
La cistatina básica derivada de la leche tiene
actividad supresora de la resorción ósea cuando se la ingiere
mezclada con productos alimenticios y es un material excelente para
el procesamiento de alimentos debido a su buena estabilidad frente
al calor.
La presente invención será explicada en detalle
en los ejemplos y ejemplos de pruebas siguientes.
Se lavó totalmente una columna con
S-Sefarosa (3.000 g) con agua desionizada. Se hizo
pasar leche desnatada (10.000 l) a través de la columna, se lavó la
columna completamente con agua desionizada y se llevó a cabo la
elución con un gradiente de concentración lineal de cloruro de sodio
de 0,1 hasta 1,0 M. La fracción eluída se calentó a 90ºC durante 10
minutos y se centrifugó para eliminar precipitados. Posteriormente,
la fracción resultante conteniendo cistatina básica derivada de la
leche se fraccionó nuevamente usando cromatografía de intercambio
iónico MonoS. La fracción obtenida de esta manera se fraccionó
usando cromatografía de intercambio iónico MonoQ y cromatografía de
filtración en gel Superose 12 usando un sistema HPLC, posteriormente
con cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía en fase inversa
C4 usando un sistema HPLC para obtener cistatina básica derivada de
la leche (fracción A, 58 mg).
Se calentó una solución protéica de suero lácteo
(10.000 l) al 5% a 90ºC durante 10 minutos y se centrifugó para
eliminar precipitados. Se llenó una columna con un vehículo, en el
que la papaína carboximetilada está unida a
Tresyl-Toyopearl (un producto de Toso), y se
equilibró con una solución de cloruro de sodio 0,5 M. Se pasó la
solución resultante a través de esta columna, la que posteriormente
se lavó con una solución de cloruro de sodio 0,5 M y luego con una
solución de cloruro de sodio 0,5 M conteniendo 0,1% Tween 20.
Posteriormente se eluyó proteasa de cisteína con una solución de
cloruro de sodio 0,5 M-ácido acético 20 mM. La fracción eluída se
neutralizó inmediatamente con una solución de hidróxido de sodio 1
M, luego se fraccionó con cromatografía de intercambio iónico MonoS,
luego con cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía en fase
inversa C4 usando un sistema HPLC para obtener cistatina básica
derivada de la leche (fracción B, 48 mg).
Se suspendió la fracción A (25 mg) obtenida en el
Ejemplo 1 en 100 ml de agua, se agregó pancreatina en una
concentración final de 1% y se llevó a cabo el tratamiento
enzimático a 37ºC durante 5 horas. Posteriormente, se inactivó la
enzima calentando a 90ºC durante 5 minutos luego de lo que se
liofilizó la sustancia resultante para obtener un producto de
degradación de cistatina derivada de la lecha (fracción C, 23
mg).
Se trató la fracción B (25 mg) obtenida en el
Ejemplo 2 de manera similar para obtener un producto de degradación
de cistatina derivada de la lecha (fracción D, 24 mg).
Ejemplo de prueba
1
Se extirparon peronés de ratones ICR
(10-20 días de edad), se eliminaron los tejidos
blandos, posteriormente se cultivaron los huesos en una solución
\alpha-MEM conteniendo 5% de suero bovino fetal
para obtener células óseas incluyendo esteoclastos. Se marcaron
estas células (aproximadamente 2 x 10^{6}) en una pieza de marfil
usando una solución \alpha-MEM conteniendo 5% de
suero bovino fetal. Tras varias horas, se agregó una solución
\alphaMEM conteniendo 5% de suero bovino fetal, a la que se le
agregó cistatina básica derivada de la leche o un producto de
descomposición de cistatina básica derivada de la leche en una
concentración de 50 ng/ml y se incubó la pieza de marfil en
presencia de CO_{2} a 37ºC durante 5 días para examinar la
actividad de resorción ósea de los osteoclastos.
Tras la incubación, las células se despegaron de
la pieza de marfil, se tiñeron con hematoxilina y se sometieron a
análisis de imagen usando un dispositivo analizador de imágenes
(PIASLA-555, un producto de PIAS) para contar el
número de marcas de resorción ósea. La actividad de resorción ósea
(%) como se define en la fórmula se obtiene con los recuentos para
evaluar la actividad supresora de la resorción ósea.
Actividad de
resorción ósea (%) = (recuento de marcas de resorción ósea con
agregado de muestra de prueba/recuento de marcas de resorción ósea
sin agregado de muestra de prueba) x
100
Las muestras de prueba usadas fueron las
cistatinas básicas derivadas de la leche y los productos de
descomposición de cistatina básica derivada de la leche (fracciones
A a D) obtenidas en los Ejemplos 1, 2 y 3, y las siguientes
cistatinas no derivadas de la leche y un inhibidor de proteasa de
cisteína derivado de la leche.
1. Cistatina (clara de huevo; pureza mayor que
99%)
2. Cistatina (placenta humana; pureza mayor que
99%)
3. Cistatina (plasma humano; pureza mayor que
99%)
4. Cistatina (orina bovina; pureza mayor que
99%)
5. Cistatina (plasma bovino; pureza mayor que
99%)
6. Inhibidor de proteasa de cisteína (ver Patente
Japonesa expuesta a la inspección pública Nº
95-126294) (leche bovina; pureza mayor que 99%)
Los resultados se muestran en la Tabla 1. La
supresión de la actividad de resorción ósea fue mayor en células
cultivadas en un medio suplementado con cistatinas básicas derivadas
de la leche o productos de descomposición de cistatina básica
derivada de la leche que en las células cultivadas en un medio sin
estos suplementos. Además, las cistatinas básicas derivadas de la
leche y los productos de descomposición de cistatina básica derivada
de la leche (fracciones A a D) mostraron una marcada actividad
supresora de la resorción ósea en comparación con las cistatinas de
otros orígenes, y así se confirmó la excelente actividad supresora
de la resorción ósea de las cistatinas derivadas de la leche.
\vskip1.000000\baselineskip
| Muestra de prueba | Actividad de resorción ósea (%\pmDE) |
| Fracción A | 44,2 \pm 6,9 |
| Fracción B | 55,8 \pm 5,2 |
| Fracción C | 32,5 \pm 5,6 |
| Fracción D | 41,3 \pm 4,7 |
| Cistatina (clara de huevo) | 75,1 \pm 3,5 |
| Cistatina (placenta humana) | 78,1 \pm 2,9 |
| Cistatina (plasma humano) | 79,5 \pm 1,9 |
| Cistatina (orina bovina) | 77,2 \pm 3,7 |
| Cistatina (plasma bovino) | 68,7 \pm 3,3 |
| Inhibidor de proteasa de cisteína (leche bovina) | 64,3 \pm 2,5 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de prueba
2
Se administraron las fracciones A a C obtenidas
en los Ejemplos 1 y 3, respectivamente, a ratones desarrollados como
modelo de osteoporosis para estudiar el efecto en la supresión de la
resorción ósea.
Los alimentos usados para la prueba de
administración fueron alimentos con agregado de fracción A o
fracción C y un alimento con el agregado de fracción A o fracción C,
un componente de calcio derivado de la leche altamente absorbible
(Ca de leche, ver Patente Japonesa expuesta a la inspección pública
Nº 1992-306622) como fuente de calcio y 200 UI de
vitamina D.
Las composiciones de los alimentos usados en la
prueba de administración se muestran en la Tabla 2. Tanto la
cantidad de calcio como de fosfato fue de 300 mg por 100 g de
alimento en todos los grupos de prueba de manera que la relación
entre calcio y fosfato fue 1:1.
| Fracción | Fracción + Ca de | |||||
| Leche^{2)} + VD^{3)} | ||||||
| Control | Simulación | A | C | A | C | |
| Sucrosa | 50,0 | 50,0 | 50,0 | 50,0 | 50,0 | 50,0 |
| Caseína | 20,0 | 20,0 | 18,0 | 18,0 | 18,0 | 18,0 |
| Almidón de maíz | 15,0 | 15,0 | 15,0 | 15,0 | 15,0 | 15,0 |
| Celulosa | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,0 |
| Aceite de maíz | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,0 |
| Mezcla de Vitaminas | 1,2 | 1,2 | 1,2 | 1,2 | 1,2 | 1,2 |
| (incluyendo colina) | ||||||
| Mezcla de Minerales | 4,5^{1)} | 4,5^{1)} | 4,5^{1)} | 4,5^{1)} | 4,5^{2)} | 4,5^{2)} |
| Fracción A | - | - | 0,0004 | - | 0,0004 | - |
| Fracción C | - | - | - | 0,0004 | - | 0,0004 |
| (Unidades: g/100 g) | ||||||
| ^{1)} Se mezcló carbonato de calcio como fuente de calcio. | ||||||
| ^{2)} Se mezcló un componente de calcio derivado de leche como fuente de calcio. | ||||||
| ^{3)} Se mezclaron 200 UI de vitamina D. |
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron ratones hembra SD (32 meses de edad)
como animales de experimentación. Tras criarlos durante una semana,
se llevó a cabo una ovariectomía, luego se criaron los ratones
durante 2 semanas con una dieta baja en calcio para crear ratones
con modelo de osteoporosis. Para tener un grupo de simulación, se
realizaron operaciones sin ovariectomía en 7 ratones.
Los ratones anteriormente mencionados se
dividieron en seis grupos (7 ratones en un grupo), es decir, grupo
control, grupo simulación, grupo fracción A, grupo fracción C, grupo
fracción A + calcio de leche + vitamina D y grupo fracción C +
calcio de leche + vitamina D, y se las alimentó con los alimentos de
prueba mostrados en la Tabla 2, durante un mes.
Tras la administración de los alimentos de
prueba, se extirpó el fémur a los ratones de cada grupo, se midió la
cantidad de mineral óseo con un dispositivo de medición de mineral
óseo y se midió la fortaleza del hueso por medio de un dispositivo
de medición de fractura por tensión.
Los resultados se muestran en la Tabla 3 y en la
Tabla 4.
Como se muestra en la Tabla 3, la cantidad de
mineral óseo fue estadísticamente mayor en los animales alimentados
con fracción A o fracción C en comparación con aquellos en el grupo
control. De acuerdo con esto, se reveló que la fracción A y la
fracción C tuvieron actividad supresora de la resorción ósea. La
actividad fue además aumentada por el agregado de calcio de leche
altamente absorbible y vitamina D.
Como se muestra en la Tabla 4, la fortaleza del
hueso fue estadísticamente mayor en los animales alimentados con
fracción A o fracción C en comparación con aquellos en el grupo
control. De acuerdo con esto, se reveló que la fracción A y la
fracción C tuvieron actividad fortalecedora del hueso. La actividad
fue además aumentada por el agregado de calcio de leche altamente
absorbible y vitamina D.
Se obtuvo un resultado similar con el alimento
con el agregado de vitamina K en lugar de vitamina D.
Los resultados anteriormente mencionados
mostraron que la cistatina básica derivada de la leche y el producto
de descomposición de cistatina básica derivada de la leche tuvieron
actividad supresora de la resorción ósea y actividad fortalecedora
del hueso.
| Mineral óseo (mg, \pm DE) | ||
| Simulación | 136,2 \pm 6,3* | |
| Control | 116,3 \pm 5,9 | |
| Fracción A | 122,4 \pm 4,3* | |
| Fracción C | 123,8 \pm 5,1* | |
| Fracción A + Ca de leche + vitamina D | 126,1 \pm 2,9* | |
| Fracción C + Ca de leche + vitamina D | 127,3 \pm 3,1* | |
| * Significativamente diferente del grupo control (p<0,05) |
\vskip1.000000\baselineskip
| Energía de rotura ósea (x 10^{5} erg) | ||
| Simulación | 13,4 \pm 2,6* | |
| Control | 8,3 \pm 1,7 | |
| Fracción A | 10,8 \pm 3,1* | |
| Fracción C | 10,5 \pm 4,1* | |
| Fracción A + Ca de leche + vitamina D | 11,3 \pm 2,3* | |
| Fracción C + Ca de leche + vitamina D | 11,5 \pm 2,6* | |
| * Significativamente diferente del grupo control (p<0,05) |
Ejemplo de prueba
3
Se mezclaron los ingredientes mostrados en la
Tabla 5, se colocaron en recipientes y se esterilizaron por calor
para preparar bebidas. Se agregó albúmina al grupo control para
ajustar la cantidad de proteínas.
Con veinte pacientes con osteoartritis
(constricción de hendidura articular) se formaron dos grupos de diez
pacientes en cada uno y se les dieron las bebidas durante un mes. Se
midió la cantidad de deoxipiridinolina urinaria, un marcador del
metabolismo óseo para la resorción ósea, antes y después del periodo
en el que se ingirió la bebida.
Los resultados se muestran en la Tabla 6 y Tabla
7. Como se muestra en la Tabla 6, mientras que la cantidad de
deoxipiridinolina se redujo aún en el grupo control con la bebida
con calcio y vitamina, se redujo aún más en el grupo de prueba. Este
resultado sugiere que la resorción ósea debida a fractura ósea fue
bien suprimida. Como se muestra en la Tabla 7, se redujeron varios
dolores articulares por la ingesta de la bebida. Además, se
obtuvieron resultados similares usando queso en el que se agregó
cistatina básica derivada de la leche.
| Ingredientes | Grupo control | Grupo de prueba | |
| Glucosa cristalina | 15,0 | 15,0 (% en peso) | |
| Fracción A | 0,000008 | ||
| Albúmina | 0,000008 | ||
| Calcio | 0,5 | 0,5 | |
| Vitamina D | (200 UI) | (200 UI) | |
| Agua | 74,0 | 74,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Reducción en la cantidad de deoxipiridinolina | ||
| (nmol/día \pm DE) | ||
| Grupo control | 0,32 \pm 0,3 | |
| Grupo de prueba | 0,99 \pm 0,2* | |
| * Significativamente diferente del grupo control (p<0,05) |
| Número de pacientes | ||||
| Grupo control | Grupo de prueba | |||
| Antes de la | Tras la | Antes de la | Tras la | |
| ingesta | ingesta | ingesta | ingesta | |
| Dolor articular por esfuerzo físico | 10 | 10 | 10 | 8 |
| Dolor articular con movilidad | 5 | 5 | 6 | 2 |
| Dolor articular durmiendo | 5 | 4 | 5 | 0 |
| Dolor articular en situación de agotamiento | 8 | 8 | 9 | 5 |
| Fatiga | 7 | 7 | 6 | 1 |
| Dolor articular en toda la articulación | 9 | 8 | 9 | 3 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de prueba
4
Se criaron cuarenta y ocho hámsters dorados (6
semanas de edad) durante una semana, luego se les enroscó cinco
vueltas de un hilo de sutura Nº 4 esterilizado alrededor de la base
de la pieza dental M1 de cada animal y se continuó la cría
alimentándolos con el alimento de Keyes y col. (D#2000, Keyes P.H. y
Jordan: Archs. Oral. Biol. 9, 377-400, 1964) para
inducir enfermedades periodontales. Posteriormente, se dividieron
los hámsters en cuatro grupos, es decir, grupo control, grupo
fracción A, grupo fracción B y grupo fracción C. Se preparó una
solución de prueba diluyendo adecuadamente cada fracción (4 \mug)
y se la aplicó a los animales de cada grupo dos veces al día todos
los días, dejando la cavidad oral interna de los animales húmeda
durante aproximadamente 10 minutos cada vez. Se seleccionaron seis
animales de cada grupo y, siete días después de la aplicación, se
les extirparon ambos lados de la mandíbula inferior tras fijación
por perfusión con una solución de glutaraldehído 2,5% (pH 7,4)
durante aproximadamente 20 minutos, posteriormente se evaluó la
reducción de la masa ósea alveolar mediante el siguiente
procedimiento. A saber, se fijaron ambos lados de las mandíbulas
extirpadas con una solución de glutaraldehído 2,5% y se les
realizaron rayos X suaves, posteriormente se analizaron las
fotografías resultantes usando un dispositivo analizador de imágenes
(PIAS LA-555). Se midió el área entre el borde del
cemento con esmalte y la parte superior del hueso alveolar cercana a
M1 para evaluar la reducción de la masa ósea alveolar.
Los resultados se muestran en la Tabla 8. La
reducción de masa ósea alveolar en los hámsters del grupo fracción
A, grupo fracción B y grupo fracción C fue significativamente
inferior comparada con la del grupo control. De acuerdo con esto, se
reveló que la cistatina básica derivada de la leche y el producto de
descomposición de cistatina básica derivada de la leche fueron
eficaces en la supresión de la reducción de masa ósea alveolar y en
la prevención y tratamiento de enfermedades periodontales.
\vskip1.000000\baselineskip
| Control | Fracción A | Fracción B | Fracción C | |
| Reducción del área (mm^{2}) | ||||
| Día 4 | 0,31 | 0,16* | 0,18* | 0,15* |
| Día 7 | 0,98 | 0,53* | 0,58* | 0,47* |
| * Significativamente diferente del grupo control (p<0,05). |
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclaron los ingredientes de la Tabla 9,
además se agregaron Fracción A (0,000004% en peso) y vitamina D (200
UI), posteriormente se vertió la mezcla en un recipiente y se
esterilizó con calor para producir una bebida provista de actividad
supresora de la resorción ósea. Esta bebida es útil para la
prevención y tratamiento de enfermedades articulares.
| Mezclas de azúcares isomerizados | 15,0 (% en peso) | |
| Zumo de fruta | 10,0 | |
| Ácido cítrico | 0,5 | |
| Saborizante | 0,1 | |
| Calcio | 0,5 | |
| Agua | 73,9 |
Se mezclaron los ingredientes de la Tabla 10,
además se agregaron Fracción A (0,0005% en peso) y vitamina D (200
UI), posteriormente se moldeó la mezcla bajo presión para producir
comprimidos provistos de actividad supresora de la resorción ósea.
Estas tabletas son útiles para la prevención y tratamiento de
enfermedades articulares.
| Glucosa cristalina hidratada | 93,5 (% en peso) | |
| Calcio | 5,0 | |
| Ésteres de azúcar | 1,0 | |
| Saborizante | 0,5 |
Se mezclaron los ingredientes de la Tabla 11,
además se agregó Fracción B (0,00005% en peso), posteriormente la
masa resultante se moldeó y cocinó para producir bizcochos provistos
de actividad supresora de la resorción ósea. Estos bizcochos son
útiles para la prevención y tratamiento de enfermedades
articulares.
| Harina | 50,0 (% en peso) | |
| Azúcar | 20,0 | |
| Sal de mesa | 0,5 | |
| Margarina | 12,5 | |
| Huevo | 12,1 | |
| Agua | 4,1 | |
| Bicarbonato de sodio | 0,1 | |
| Bicarbonato de amonio | 0,2 | |
| Carbonato de Calcio | 0,5 |
Se mezclaron los ingredientes de la Tabla 12,
además se agregó Fracción D (0,000008% en peso), posteriormente se
vertió la mezcla en un recipiente y se esterilizó con calor para
producir jalea provista de actividad supresora de la resorción ósea.
Esta jalea es útil para la prevención y tratamiento de enfermedades
articulares.
| Fructosa | 20,0 (% en peso) | |
| Azúcar granulada | 15,0 | |
| Almíbar de almidón | 5,0 | |
| Ágar | 1,0 | |
| Saborizante | 0,1 | |
| Calcio | 0,1 | |
| Agua | 58,8 |
Se mezclaron los ingredientes de la Tabla 13,
además se agregó Fracción A (0,00005% en peso), posteriormente se
emulsionó la mezcla a una temperatura de emulsión de 85ºC para
producir queso provisto de actividad supresora de la resorción ósea.
Este queso es útil para la prevención y tratamiento de enfermedades
articulares.
\vskip1.000000\baselineskip
| Queso Gouda | 43,0 (% en peso) |
| Queso Cheddar | 43,0 |
| Citrato de sodio | 2,0 |
| Calcio derivado de leche | 1,0 |
| Agua | 10,5 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se pasteurizó leche desnatada (12%) con calor a
90ºC durante 20 minutos y se inocularon de manera individual
Lactobacillus acidophilus y Streptococcus thermophilus
para generar dos tipos de cultivo iniciales. Se mezclaron los
ingredientes de la Tabla 12 incluyendo una mezcla de yogur, cuyo
mayor componente es leche, además se agregó Fracción B (0,000008% en
peso), posteriormente se sometió la mezcla a la fermentación y
enfriamiento convencionales para producir yogur provisto de
actividad supresora de la resorción ósea. Este yogur es útil para la
prevención y tratamiento de enfermedades articulares.
\vskip1.000000\baselineskip
| Mezcla de yogur | 97 (% en peso) | |
| Cultivo (L. acidophilus) | 1,5 | |
| Cultivo (S. thermophilus) | 1,5 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclaron los ingredientes de la Tabla 15,
además se agregó Fracción A (0,00001% en peso) para producir
alimento para perros provisto de actividad supresora de la resorción
ósea. Este alimento para perros es útil para la prevención y
tratamiento de enfermedades articulares.
\vskip1.000000\baselineskip
| Torta de soja | 12,0 (% en peso) | |
| Leche desnatada en polvo | 14,0 | |
| Aceite de soja | 4,0 | |
| Aceite de maíz | 2,0 | |
| Aceite de palma | 28,0 | |
| Almidón de maíz | 15,0 | |
| Harina | 9,0 | |
| Salvado | 2,0 | |
| Mezcla de vitaminas | 9,0 | |
| Mezcla de minerales | 2,0 | |
| Celulosa | 3,0 |
Se mezclaron los ingredientes de la Tabla 16,
además se agregó Fracción C (0,0001% en peso), se formó una crema
con la mezcla y se la vertió en un recipiente para producir una
pasta dental provista de actividad supresora de la resorción ósea.
Esta pasta dental es útil para la prevención y tratamiento de
enfermedades articulares.
\vskip1.000000\baselineskip
| Glicerina | 70,0 (% en peso) | |
| Dióxido de silicona | 20,0 | |
| Goma xantán | 1,0 | |
| Saborizante de menta | 1,0 | |
| Dióxido de titanio | 0,7 | |
| Fluoruro de sodio | 0,3 | |
| Agua destilada | 7,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclaron los ingredientes de la Tabla 17,
además se agregó Fracción B (0,00001% en peso) para producir un
enjuague bucal provisto de actividad supresora de la resorción ósea.
Este enjuague bucal es útil para la prevención y tratamiento de
enfermedades articulares.
\vskip1.000000\baselineskip
| Etanol | 8,0 (% en peso) | |
| Saborizante | 1,0 | |
| Sorbitol | 5,0 | |
| Propilenglicol | 5,0 | |
| Agua destilada | 81,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclaron y agitaron los ingredientes de la
Tabla 18 incluyendo una base de goma disuelta, además se agregó
Fracción A (0,0001% en peso) para producir una goma de mascar
provista de actividad supresora de la resorción ósea. Esta goma de
mascar es útil para la prevención y tratamiento de enfermedades
articulares.
\vskip1.000000\baselineskip
| Goma base | 20,0 (% en peso) | |
| Jarabe de maíz | 10,0 | |
| Dextrosa monohidratada | 10,0 | |
| Lactosa | 5,0 | |
| Glicerina | 5,0 | |
| Azúcar | 50,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los agentes de supresión de la resorción ósea de
la presente invención que comprenden una cistatina básica derivada
de la leche y/o el producto de descomposición de cistatina básica
derivada de la leche como un componente eficaz son útiles como
agentes para la prevención y tratamiento de enfermedades articulares
y enfermedades periodontales.
Además, las enfermedades articulares y
periodontales pueden prevenirse y tratarse ingiriendo bebidas,
productos alimenticios o alimentos a los que se les agregó la
cistatina básica derivada de la leche y/o el producto de
descomposición de cistatina básica derivada de la leche de la
presente invención para proveer actividad supresora de la resorción
ósea.
Claims (15)
1. Un agente de supresión de la resorción ósea
que comprende una cistatina básica derivada de la leche y/o el
producto de descomposición de cistatina básica derivada de la leche
como un componente eficaz, siendo dicha cistatina básica derivada de
la leche una proteína obtenible por un procedimiento que comprende
(i) pasar leche desnatada de vaca a través de una columna de
S-sefarosa; (ii) lavar la columna con agua
desionizada; (iii) eluir una fracción de la columna usando un
gradiente de concentración lineal de 0,1 a 1,0 M de cloruro de
sodio; (iv) calentar la fracción eluida hasta 90ºC durante 10
minutos; (v) centrifugar la fracción eluida para eliminar
precipitados, creando de esta manera una primera fracción; (vi)
fraccionar la primera fracción usando cromatografía de intercambio
iónico MonoS, creando así una segunda fracción; (vii) fraccionar la
segunda fracción usando cromatografía de intercambio iónico MonoQ y
cromatografía de filtración con gel Superose 12 con un sistema HPLC,
posteriormente con cromatografía con hidroxiapatita y cromatografía
de fase inversa C4 usando un sistema HPLC, o por un procedimiento
que comprende (I) calentar una solución de proteína de suero de
leche de vaca al 5% a 90ºC durante 10 minutos; (II) centrifugar la
solución para eliminar precipitados, creando así una primera
fracción; (III) pasar la primera fracción a través de una columna
llena con un vehículo en el que papaína carboximetilada está unida a
Tresyl-Toyopearl y equilibrada con una solución de
cloruro de sodio 0,5 M; (IV) lavar la columna con una solución de
cloruro de sodio 0,5 M y luego con una solución de cloruro de sodio
0,5 M que contiene 0,1% de Tween 20; (V) eluir la proteasa de
cisteína con una solución de cloruro de sodio 0,5 M-ácido acético 20
mM; (VI) neutralizar la fracción eluida con una solución de
hidróxido de sodio 1 M, creando así una segunda fracción; y (VII)
fraccionar la segunda fracción usando cromatografía de intercambio
aniónico MonoS, posteriormente cromatografía con hidroxiapatita y
cromatografía de fase inversa C4 usando un sistema HPLC.
2. El agente de supresión de la resorción ósea de
la Reivindicación 1, para ser usado para la prevención y/o
tratamiento de enfermedades articulares y enfermedades
periodontales.
3. El agente de supresión de la resorción ósea de
la Reivindicación 1, que además comprende un componente de calcio
altamente absorbible y vitamina D y/o vitamina K.
4. El agente de supresión de la resorción ósea de
la Reivindicación 2, que además comprende un componente de calcio
altamente absorbible y vitamina D y/o vitamina K.
5. Una bebida, producto alimenticio o alimento en
el que se mezclan más de 4 \mu% en peso de la cistatina básica
derivada de la leche y/o producto de descomposición de cistatina
básica derivada de la leche como se definió en la Reivindicación 1
para proveer una actividad para prevenir y/o tratar enfermedades
articulares o enfermedades periodontales.
6. La bebida, producto alimenticio o alimento de
la Reivindicación 5, en el que además se mezclan una composición de
calcio altamente absorbible y vitamina D y/o vitamina K.
7. El uso de un agente de supresión de la
resorción ósea de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 3 para la
preparación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de
enfermedades articulares y enfermedades periodonta-
les.
les.
8. Un agente de supresión de la resorción ósea
que comprende un producto de descomposición de cistatina básica
derivada de la leche como un componente eficaz, siendo dicho
producto de descomposición de cistatina básica derivada de la leche
una mezcla de péptidos obtenible por descomposición restrictiva de
la cistatina básica derivada de la leche definida en la
Reivindicación 1 con proteasas.
9. El agente de supresión de la resorción ósea de
la Reivindicación 8, en el que dicho producto de descomposición de
cistatina básica derivada de la leche se obtiene al (i) suspender la
cistatina básica derivada de la leche definida en la Reivindicación
1 en agua; (ii) agregar pancreatina en una concentración final de
1%; (iii) llevar a cabo el tratamiento enzimático de la suspensión a
37ºC durante 5 horas; (iv) inactivar la enzima calentando a 90ºC
durante 5 minutos; y (v) liofilizar la sustancia resultante.
10. El agente de supresión de la resorción ósea
de la Reivindicación 8, para ser usado para la prevención y/o
tratamiento de enfermedades articulares y enfermedades
periodontales.
11. El agente de supresión de la resorción ósea
de la Reivindicación 8, que además comprende un componente de calcio
altamente absorbible y vitamina D y/o vitamina K.
12. El agente de supresión de la resorción ósea
de la Reivindicación 10, que además comprende un componente de
calcio altamente absorbible y vitamina D y/o vitamina K.
13. Una bebida, producto alimenticio o alimento
en el que se mezclan más de 4 \mu% en peso del producto de
descomposición de cistatina básica derivada de la leche como se
definió en la Reivindicación 8 ó 9 para proveer una actividad para
prevenir y/o tratar enfermedades de las articulaciones o
enfermedades periodontales.
14. La bebida, producto alimenticio o alimento de
la Reivindicación 13 en el que además se mezclan una composición de
calcio altamente absorbible y vitamina D y/o vitamina K.
15. El uso de un agente de supresión de la
resorción ósea de acuerdo con la Reivindicación 8 u 11 para la
preparación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de
enfermedades articulares y enfermedades periodontales.
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