ES2276402T3 - Obtencion modular de imagenes. - Google Patents

Abstract

UN METODO PARA FORMAR IMAGENES DE MOLECULAS DE INTERES DEL INTERIOR DE UN ESPECIMEN BIOLOGICO COMPRENDE ILUMINAR EL ESPECIMEN CON LUZ ULTRAVIOLETA (UV) Y DETECTAR LA ABSORCION UV MOLECULAR. SI LAS PROPIAS MOLECULAS DE INTERES SON ABSORBEDORAS DE UV, PUEDE UTILIZARSE LA ABSORCION INTRINSECA DE ESAS MOLECULAS. SI LAS MOLECULAS DE INTERES NO SON BUENAS ABSORBEDORAS DE UV, PUEDEN USARSE MOLECULAS TRAZADORAS ABSORBEDORAS DE UV. EL METODO PUEDE EMPLEARSE EN TODO TIPO DE DISPOSITIVOS DE FORMACION DE IMAGENES MOLECULARES Y EN SECUENCIADORES DE DNA. SE PRESENTA UN NUEVO DETECTOR BASADO EN DIAMANTE, QUE ES ADECUADO PARA NUMEROSAS APLICACIONES.

Description

Obtención molecular de imágenes.

La presente invención se refiere a un método para someter a secuenciación a una biomolécula y a un sistema de secuenciación molecular.

Los métodos actuales de secuenciación y mapeo de ácidos nucleicos, y la obtención de imágenes de proteínas y tejidos, se basan en emisores radiactivos, bio- y quimio-luminiscentes, placas fotográficas y algunas técnicas electrónicas. No se ha encontrado en la práctica que ninguna de estas sea totalmente satisfactoria.

La obtención fluorescente de imágenes, la radiorrotulación y los marcadores bio- y quimio-luminiscentes usados con película y/o emulsión son costosos, muy lentos, limitados y difíciles de interactuar con ordenadores. Las técnicas implicadas son difíciles y requieren procedimientos de manejo y eliminación peligrosos que requieren destreza técnica substancial. Los materiales a menudo son difíciles y costosos de obtener y tienen vidas útiles cortas. La obtención fotográfica de imágenes, que se usa frecuentemente, tarda días o a veces semanas o meses en efectuarse y es limitada en virtud de su pequeño intervalo dinámico y linealidad de respuesta relativamente escasa.

De las técnicas electrónicas, los sistemas de obtención fosforescente de imágenes/cámara proporcional multifilar (MWPC) y de placa de microcanales/MWPC son impopulares para muchos biólogos moleculares debido a su linealidad limitada y coste.

Puede ser útil a modo de antecedentes indicar con algún detalle el estado actual de la técnica en la obtención de imágenes de ácidos nucleicos. Existen dos metodologías separadas que están actualmente en uso común, cuyos detalles se indican posteriormente.

En primer lugar, existen aquellas que indican el uso de una película fotográfica para visualizar rótulos quimioluminiscentes o radiactivos y, en segundo lugar, aquellas que usan un emisor luminoso, tal como bromuro de etidio, que se une químicamente a ácidos nucleicos y emite luz naranja bajo estimulación UV. La primera tecnología de obtención de imágenes se usa habitualmente en la secuenciación de ácidos nucleicos. Este procedimiento implica la rotulación química de un componente de la reacción de secuenciación, habitualmente el cebador, con un radioisótopo o marcador qumioluminiscente o etiqueta. Después de la reacción de secuenciación y electroforesis, esta etiqueta se usa para obtener imágenes de la posición de las bandas de ácido nucleico mediante la exposición de película fotográfica normal al gel de electroforesis secado. Este es un procedimiento lento, que lleva de 24 a 72 horas, dependiendo de la técnica de secuenciación usada. Muchos de los marcadores radiactivos usados en la secuenciación de ácidos nucleicos son extremadamente peligrosos e introducen complicaciones adicionales en el procedimiento de secuenciación, por lo tanto, cualquier sistema de obtención de imágenes que elimine la necesidad de estos marcadores sería extremadamente ventajoso.

La segunda tecnología, la de emisores luminosos, se usa generalmente para análisis de restricción de DNA y planificación de construcción de plásmidos. Esta técnica se basa en la obtención de imágenes de ácidos nucleicos en geles de agarosa simples usando el producto químico carcinógeno bromuro de etidio que emite luz naranja después de la estimulación UV para visualizar el tamaño y estimar la concentración de ácido nucleico presente. El bromuro de etidio es un componente altamente indeseable de esta técnica con consecuencias médicas acumulativas arriesgadas. Su eliminación de la técnica de obtención de imágenes sería muy ventajosa en cualquier aplicación de análisis en gel de agarosa.

La secuenciación de ácidos nucleicos, en oposición a la obtención de imágenes espacial, hace uso normalmente de un procedimiento bastante diferente. Este procedimiento implica la rotulación química de un componente de la reacción de secuenciación, habitualmente el cebador, con un radioisótopo o marcador bio- o quimio-luminiscente o etiqueta. Después de la reacción de secuenciación y la electroforesis, esta etiqueta se usa para obtener imágenes de la posición de las bandas de ácido nucleico exponiendo película fotográfica al gel de electroforesis secado. Este es un procedimiento lento, que lleva de 24 a 72 horas, dependiendo de la técnica de secuenciación usada.

El análisis de DNA con enzimas de restricción (mapeo de DNA) y la construcción de vectores es un aspecto fundamental de la biología molecular. Estas técnicas de mapeo también se basan en la obtención fotográfica de imágenes de fragmentos de ácidos nucleicos en geles de agarosa simples usando bromuro de etidio. Este marcador emite luz naranja después de la estimulación UV, para visualizar el tamaño y estimar la concentración de ácidos nucleicos. El bromuro de etidio es un componente indeseable de esta técnica con consecuencias carcinógenas acumulativas arriesgadas. Su eliminación de la técnica de obtención de imágenes sería muy ventajosa en cualquiera de tales aplicaciones del análisis en gel de agarosa.

La obtención de imágenes de péptidos y proteínas a menudo es el destino final de muchos procedimientos de ingeniería genética. Sin embargo, también forma una gran porción de investigación biológica, bioquímica y médica general. En efecto, es difícil pensar en un área de la biociencia que no dependa, al menos de algún modo, del análisis de proteínas. El análisis se basa de nuevo normalmente en técnicas electroforéticas, dependiendo de la adición de un marcador. Generalmente, estos son radiactivos aunque también se usan quimioluminiscencia y colorantes químicos especiales.

El campo de la obtención de imágenes de tejidos es muy importante en las áreas de desarrollo de fármacos y el diagnóstico médico y molecular. Tradicionalmente, pueden usarse marcadores que emiten partículas \beta para obtener imágenes de la distribución de un fármaco dentro de una muestra de tejido. Este procedimiento emplea típicamente semanas o incluso meses y requiere el uso de substancias potencialmente peligrosas.

Se entenderá que todos los métodos presentes mencionados anteriormente requieren el uso de radioisótopos u otras substancias peligrosas y además, al menos algunas de las técnicas listadas requieren el uso de geles de electroforesis costosos e incómodos. En resumen, los problemas principales son los que siguen:

1. Entrenamiento. Los patrones de Salud y Seguridad requieren que todos los trabajadores en contacto con cualquier forma de radiactividad tengan un entrenamiento intensivo en el manejo, el uso y la eliminación de radiactividad.

2. Uso. La incorporación de radiactividad en un sistema a menudo es un procedimiento complejo y que exige mucho tiempo. El trabajador debe tomar precauciones extremas, por ejemplo con el isótopo ^{32}P, que se usa comúnmente en la secuenciación de DNA, el trabajador tiene que protegerse de él mediante plexiglás, lo que hace a un procedimiento ya complejo mucho más difícil. Después del experimento inicial, la manipulación adicional del ya frágil gel de electroforesis es complicada por la radiactividad presente. La radiactividad puede reemplazarse por formadores de imágenes quimio- o bio-luminiscentes, pero estos, aunque son más seguros, todavía son complicados de usar.

3. Tiempo. Todos estos sistemas de obtención de imágenes se basan en el uso de autorradiografía para visualizar los ácidos nucleicos o las proteínas. Esto se alcanza secando el gel sobre un trozo de papel de filtro y exponiéndolo a un trozo de película fotográfica. La película debe exponerse durante entre 24 horas y 3 meses. Por lo tanto, puede llevar de días a meses incluso observar si el experimento funciona. Este es un problema principal en la biología molecular e incrementa significativamente la duración de los proyectos de investigación.

4. Coste. Los diversos componentes de estos experimentos son costosos. La radiactividad tiene una vida útil limitada debido a su desintegración natural, y también es costosa, costando el ^{35}S aproximadamente 250 libras esterlinas para 20 reacciones de secuenciación. La película usada también es muy costosa ya que algunas de ellas miden 35 x 45 cm.

5. Eliminación. Estos procedimientos generan grandes volúmenes de residuos sólidos y líquidos, todos los cuales deben eliminarse legalmente y responsablemente. Esto también es muy costoso y problemático.

US-A-4539297 describe un aparato para separar moléculas grandes tales como plásmidos de DNA usando obtención ultravioleta de imágenes junto con una placa fotográfica estándar. Este documento describe las siguientes características: un dispositivo de obtención molecular de imágenes que comprende una fuente de luz UV dispuesta para incidir sobre una muestra que contiene biomoléculas; un material de electroforesis; medios para aplicar una diferencia de potencial a lo largo del material para hacer que las biomoléculas se muevan a lo largo del material; y una placa fotográfica que actúa en el detector UV para obtener imágenes de las biomoléculas mediante su absorción molecular de UV.

En aplicaciones electroforéticas y otras dentro de las cuales han de identificarse substancias moleculares, por supuesto, es bien conocido medir la velocidad de una banda molecular particular e identificar la especie molecular implicada de acuerdo con esa velocidad. Típicamente, eso se realiza midiendo el tiempo que una banda particular emplea para moverse entre sensores fijos primero y segundo. Ejemplos típicos de esta técnica se describen en WO-A-94/01581, y también en Beckers y otros: Use of a Double-Detector System for the Measurement of Mobilities in Zone Electrophoresis, Journal of Chromatography, 452 (1988) 591-600. También se conoce, según se describe, por ejemplo, en los extractos de patente de Japón, volumen 6, número 82 (P-116)[190], 11 de julio de 1980, el uso de detectores múltiples para seguir la velocidad de partículas individuales dentro de una mezcla móvil.

La invención se indica en las reivindicaciones independientes 1 y 7.

En el método preferido de la presente invención, se obtienen imágenes de las moléculas detectando su absorción intrínseca de luz UV. En este aspecto de la invención, se usó la obtención intrínseca de imágenes de la propia molécula, ya fuera un fragmento de ácido nucleico, una proteína o en efecto una cadena polipeptídica. La imagen proviene de la absorción de esa molécula, usando espectrometría de absorción UV molecular, en contraste con la técnica bien conocida de espectrometría óptica. La ventaja clave es la falta de una etiqueta.

Esto tiene muchas consecuencias importantes. Quizá la más obvia sea que ya no se necesita una etiqueta peligrosa, ya sea radiactiva o un carcinógeno bien conocido como el bromuro de etidio. Otro punto es que, para las reacciones de secuenciación, la falta de la etiqueta elimina una de las restricciones principales sobre el número de bases que puede someterse a secuenciación: esto es, la cantidad de radiactividad que puede incorporarse dentro de la muestra.

Al transformar a la velocidad-espacio, puede realizarse un cálculo de la velocidad que es necesaria para que una substancia dentro de la mezcla que se desplaza alcance un detector dado I_{k} en el momento en el que se ha registrado la señal procedente de ese detector. Esta velocidad nominal puede calcularse como Z_{k} a lo largo de t donde Z_{k} es la distancia desde un origen al detector I_{k} y t es el tiempo transcurrido. Sin embargo, puede haber otros métodos para determinar velocidades nominales, por ejemplo medir el tiempo transcurrido para que una substancia conocida se mueva entre un detector y el siguiente. También sería posible determinar la velocidad identificando una secuencia particular de bandas en un detector y midiendo cuánto tiempo lleva que esa secuencia de banda se mueva, de media, hacia el siguiente detector. De este modo, una banda individual dentro de la secuencia puede identificarse y cronometrarse exactamente en dos detectores separados, calculándose a continuación la velocidad a partir de un conocimiento de la distancia entre los detectores.

Transformando en velocidad-espacio e integrando a lo largo del tiempo las substancias individuales (por ejemplo, biomoléculas) pueden identificarse rápidamente como dientes o picos individuales en velocidad-espacio. El tamaño y/o la anchura de cada pico pueden usarse para obtener una medida de la cantidad de cada substancia individual.

Preferiblemente, las moléculas de interés son sometidas directamente a obtención de imágenes detectando su absorción obteniendo imágenes del mapa del ácido nucleico, la proteína o el tejido sobre un detector de diamante. Esto puede efectuarse iluminando el objeto que ha de someterse a obtención a imágenes, por ejemplo ácidos nucleicos, con luz UV de brillo constante procedente de un dispositivo de amplio espectro como un tubo de descarga de helio o un láser monocromático como un láser excímero a 196 nm. Se observan las diferentes cantidades de luz que alcanzan un detector situado detrás del objeto del que se obtienen imágenes. En el caso de dos obtenciones de imágenes dimensionales, se obtiene una imagen de la sombra simultáneamente y el objeto se identifica de ese modo. Esto requiere un detector bidimensional, como un dispositivo de píxeles o un dispositivo de borde pixelado.

En el caso superior del láser direccional, se puede escanear el objeto que ha de identificarse sobre un detector unidimensional, bien plano (con electrodos de tiras) o bien con bordes, y formar una imagen bidimensional.

Cuando la invención se aplica a la manipulación y cuantificación de ácidos nucleicos, la tecnología permitirá una diferenciación cuantitativa entre energía transmitida y absorbida. La cuantificación del DNA bajo estas condiciones tiene aplicaciones importantes en la construcción de vectores de expresión que se usan para producir proteínas especializadas usadas en terapéutica.

Cuando la presente invención se aplica a la obtención de imágenes de péptidos y proteínas, puede usarse el mismo equipo que el usado para obtener imágenes de mapas de enzimas de restricción de DNA. La rapidez de obtención de imágenes proporcionada por la presente invención ofrece ventajas significativas sobre técnicas existentes, algunas de las cuales pueden emplear hasta tres meses.

Esta idea se basa en la absorción por proteínas de luz UV a <230 nm, también un intervalo óptimo para los ácidos nucleicos. Así, el mismo detector podría obtener imágenes de ambos tipos de moléculas. Un valor añadido de la característica es que los lípidos, los carbohidratos y otras macromoléculas pequeñas absorben UV escasamente, si es que lo hacen, en este intervalo, permitiendo así una filtración intrínseca de ruido biológico sobre la imagen.

Esta respuesta espectral se adapta idealmente a la del diamante, que se activa a 224 nm, y es extremadamente insensible a luz de longitudes de onda mayores o energía menor. Este es un atributo muy poderoso para que lo posea un detector. Un intervalo de longitud de onda típico para un detector de diamante es aproximadamente 180-224 nm, pero puesto que el límite inferior está impuesto más por los materiales y/o la fuente que por el medio detector, la detección a longitud de onda inferior no puede excluirse en todas las circunstancias. Para ciertas aplicaciones, podrían usarse detectores de silicio (intervalo de detección 190-300 nm). También podrían usarse fotomultiplicadores.

En una modalidad preferida, la invención se extiende a un aparato de electroforesis, por ejemplo a un secuenciador de DNA. El aparato preferiblemente verifica de forma cuantitativa los cambios en una señal procedente de una fuente como bandas de ácidos nucleicos que pasan entre la fuente y el detector sobre un gel de electroforesis. A medida que las bandas pasan por el detector, pueden digitalizarse directamente a una base de datos.

El aparato puede incorporar además el concepto de usar una fase sólida reutilizable inerte para electroforesis. Para un secuenciador de DNA, la fase sólida puede estar revestida o soportada de otro modo sobre un substrato de cuarzo (por ejemplo, un tubo), habiendo preferiblemente cuatro tubos separados para las cuatro bases.

En resumen, las siguientes son las principales ventajas de la presente invención o aspectos subsidiarios de la presente invención:

1. Entrenamiento. La eliminación de radiactividad del sistema obvia la necesidad de entrenamiento en Salud y Seguridad.

2. Uso. La eliminación de radiactividad o cualquier otro componente de obtención de imágenes extrínseco del procedimiento experimental incrementa drásticamente la eficacia y la rapidez de esas reacciones. La etapa de rotulación (donde el marcador radiactivo se añade a la reacción) a menudo es complicada, y su fallo no puede percibirse hasta el final del experimento.

3. Tiempo. Se espera que la capacidad para obtener imágenes de los resultados de, por ejemplo, un gel de secuenciación en minutos en vez de en horas conduzca a un incremento drástico en la eficacia de operaciones de secuenciación a gran escala tales como el Proyecto Genoma Humano. También permitiría el descubrimiento más rápido de problemas dentro de la reacción - se pierde una gran cantidad de tiempo en la biología molecular debido al tiempo que puede emplearse para percibir que un experimento no ha marchado de acuerdo con el plan.

4. Coste. La aplicación de hardware basado en esta tecnología conduciría a una liberación masiva de fondos del presupuesto de consumibles de cualquier grupo de investigación. Después de los costes de equipo iniciales, muchos grupos de biología molecular podrían esperar ver disminuir substancialmente sus requerimientos de radiactividad y películas.

5. Eliminación. Medioambientalmente, los beneficios de la tecnología son inmensos. La liberación total de radiactividad del sistema suprime por supuesto la necesidad de su eliminación.

La invención puede ponerse en práctica de un número de modos y varias modalidades específicas que se describirán ahora, a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos, en los que:

la Figura 1 muestra un detector de la técnica anterior;

la Figura 2 es una sección transversal a través de un detector adecuado para usar con el método y el aparato de la presente invención;

la Figura 3 es una vista en perspectiva del detector de la Figura 2;

la Figura 4a muestra otra modalidad, estando conectados los electrodos en una configuración de voltaje bipolar;

la Figura 4b muestra la modalidad de la Figura 4a, estando conectados los electrodos en una configuración de cadena de resistores;

la Figura 5 muestra una modalidad adicional más de un detector adecuado para usar con el método y el aparato de la presente invención;

la Figura 6 muestra un dispositivo de obtención molecular de imágenes que comprende una modalidad de la presente invención;

la Figura 7 muestra una vista lateral del dispositivo de obtención de imágenes de la Figura 6;

la Figura 8 muestra, esquemáticamente, un secuenciador de DNA automatizado que comprende otra modalidad de la presente invención;

la Figura 9 es una sección esquemática a través del secuenciador mostrado en la Figura 8;

la Figura 10 ilustra esquemáticamente la modalidad preferida para aislar biomoléculas; y

la Figura 11 muestra los resultados de los análisis preferidos como una gráfica en velocidad-espacio.

En referencia en primer lugar a las Figuras 6 y 7, se muestra un dispositivo de obtención molecular de imágenes que comprende una modalidad preferida de una forma de la presente invención. El dispositivo mostrado en las Figuras 6 y 7 es principalmente un formador de imágenes de ácidos nucleicos/proteínas y en su forma más directa comprende una porción 710 de base generalmente plana, una porción 715 de cuerpo asegurada a lo largo de un borde de la posición de base y una tapa 720 que está asegurada a charnela a la porción 715 de cuerpo por medio de una bisagra 730 alargada. Entre la tapa y la base hay un montículo 740 para gel electroforético. La porción 710 de base incorpora una unidad detectora de UV de barrido, que tiene, preferiblemente, aunque no necesariamente, un detector de la forma que se describirá más tarde con referencia a las Figuras 1 a 5.

Para usar el formador de imágenes, la tapa 720 se eleva en primer lugar y una muestra (no mostrada) que va a someterse a obtención de imágenes se pone sobre el montículo 740. La muestra puede incluir un gel de electroforesis que contiene muestras moleculares (fragmentos) que se han separado de modo convencional usando un campo eléctrico. Una vez que la muestra se ha colocado en posición, la tapa 720 se cierra y una caja 722 de luz ultravioleta ligada a la cara inferior de la tapa se activa. Esto baña las muestras con luz ultravioleta, detectándose la cantidad de absorción UV mediante la unidad detectora con la porción de base a medida que el detector barre transversalmente la muestra. El patrón detectado de absorción a través de la superficie de la muestra se digitaliza y se transfiere a través de un puerto 750 de datos a un ordenador externo (no mostrado) que ejecuta un programa de gráficos adecuado.

La caja 722 de luz puede incorporar cualquier fuente ultravioleta adecuada, tal como una lámpara de deuterio. Un conmutador 723 proporciona la capacidad al usuario de cambiar entre longitudes de onda UV, de modo que tanto ácidos nucleicos como proteínas puedan someterse a obtención de imágenes fácilmente.

En una disposición alternativa, la fuente UV podría estar montada en una unidad de barrido transversal (no mostrado) asegurada a la tapa 720. En esa disposición, la fuente UV barrería la muestra mientras el detector, dentro de la porción 710 de base, permanecería estacionario. También sería posible que tanto la fuente UV como el detector estuvieran montados en unidades de barrido, barriendo ambas unidades el gel a la misma velocidad. En la disposición preferida o en la alternativa, puede usarse un láser graduable como la fuente de luz.

La ventaja de usar el detector de diamante preferido, que ha de describirse más tarde con referencia a las Figuras 1 a 5, es que el detector es naturalmente bastante insensible a la absorción que se produce en muestras biológicas que no son de particular interés, tales como lípidos y carbohidratos. La resolución apropiada puede determinarse, mediante experimento simple, de acuerdo con la aplicación particular. Se espera que para la detección de ácidos nucleicos y proteínas a resolución razonable se use un tamaño (anchura) del reborde de entre aproximadamente 5 y 200 \mum.

Se hará ahora referencia a las Figuras 8 y 9 que muestran esquemáticamente un secuenciador de DNA automatizado de acuerdo con una modalidad de una forma adicional de la presente invención.

Las Figuras 8 y 9 muestran una subunidad de la máquina de secuenciación propuesta. La máquina como un todo comprende cuatro o cinco de tales subunidades. Cada subunidad comprende un depósito 810 superior para tampón que contiene solución 820 tamponadora; un depósito inferior que contiene solución 840 tamponadora; una fuente 870 UV o una pluralidad de tales fuentes; un detector 860 UV conectado a una salida de lectura 865 estándar; un cátodo 822 conectado a la solución 820 tamponadora; y un ánodo 842 conectado a la solución 840 tamponadora. El dispositivo también incluye cuatro tubos 850 de matriz en fase sólida que se extienden entre los depósitos superior e inferior.

Los depósitos 810, 830 tanto superior como inferior pueden construirse de un material de plástico transparente y contienen soluciones 820, 840 tamponadoras simples para prevenir la acumulación excesiva de acidez en el sistema. Los tubos 850 de matriz en fase sólida entran en contacto con la solución 820 tamponadora en la parte superior y la solución 840 tamponadora en la parte inferior.

La fuente 870 de luz comprende una lámpara UV o una lámpara de deuterio o descarga. Alternativamente, podría comprender un láser capaz de funcionar en el intervalo entre 220 nm y 180 nm, o incluso un diodo.

El detector 860 comprende cualquier detector óptico adecuado, adaptado a la longitud de onda de la fuente 870 de luz. El detector comprende preferiblemente un detector de reborde de diamante, como se describirá con más detalle posteriormente con referencia a las Figuras 1 a 5. Las anchuras de los rebordes pueden estar entre 5 y 200 \mum dependiendo de las longitudes de onda que han de detectarse y la resolución requerida. La estrechez de los rebordes y el hecho de que se use iluminación substancialmente plana permiten gran precisión y resolución.

El detector 860 está conectado a dispositivos electrónicos apropiados que proporcionan una lectura digital en una salida 865. Una lectura estándar tal como Labview(™) entra directamente en un procesador de bases de datos adecuado tal como MacVector(™) o MacDNAsys(™).

Los tubos 850 de matriz en fase sólida comprenden cuatro tubos de cuarzo que contienen un material en fase sólida adecuado. Materiales adecuados incluyen matrices de gel preexistentes basadas en silicio tales como el grupo Sephadex(™). La fase sólida es relativamente transparente al UV y también es reutilizable. La longitud de los tubos depende de la naturaleza exacta de la fase sólida elegida, pero típicamente no será mayor que de 15 a 20 cm.

Durante el uso, se aplica un voltaje entre el ánodo y el cátodo para producir una diferencia de potencial a lo largo de la longitud de los tubos 850 de matriz en fase sólida. Las cuatro reacciones individuales que han de detectarse se cargan, cada una en su columna separada, y se someten a electroforesis hacia el ánodo. A medida que las bandas pasan entre la fuente 870 y el detector 860, una imagen cualitativa simple de cada banda se digitaliza hacia una base de datos. La información digital resultante puede leerse en tiempo real o puede almacenarse dentro de los dispositivos electrónicos del sistema de detección, hasta que se complete la electroforesis. Toda la información puede leerse entonces de una vez.

Después de que la mezcla de secuenciación se haya hecho pasar a través de la columna, todas las trazas del DNA pueden eliminarse mediante exposición continua a un campo eléctrico y una solución tamponadora. Después del lavado a fondo, la fase sólida puede reutilizarse.

Debe apuntarse que la simplicidad de operación del presente instrumento y la capacidad de reutilización de la fase sólida vienen al menos en parte del hecho de que ya no se requiere etiquetaje radiactivo.

Se apreciará, por supuesto, que la invención en su forma más general no está restringida a las características específicas descritas anteriormente. Dispositivos equivalentes adecuados pueden ser construidos fácilmente por un experto en la técnica, dependiendo los detalles exactos de esas estructuras del área específica de interés. Áreas específicas en las que el dispositivo y el método de la presente invención pueden encontrar aplicación incluyen obtención de imágenes de tejidos, por ejemplo, diagnóstico de orientación a la diana, de comportamiento y celular de fármacos; interrogación y mapeo de ácidos nucleicos, incluyendo secuenciación, mapeo con enzimas de restricción, cuantificación, cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y purificación de oligonucleótidos; y obtención de imágenes de proteínas, incluyendo análisis de péptidos y verificación de la manipulación de ácidos nucleicos y diagnóstico médico.

Para aplicaciones adecuadas, puede usarse un sensor UV tal como el que se describe posteriormente con referencia a las Figuras 1 a 5. Es probable que tales aplicaciones sean aquellas en las que la obtención de imágenes pueda alcanzarse en el intervalo aproximado de 220 a 190 nm. Sin embargo, no es esencial usar una topología rebordeada, tal como se describe específicamente y, para ciertas aplicaciones, serían totalmente adecuados detectores de diamante planos. La ventaja de un detector de diamante es su falta casi total de ruido, su excelente eficacia cuántica y su linealidad.

En regiones que no son adecuadas para usar con detectores de diamante, tales como, por ejemplo, la región de 220 a 290 nm (donde absorbe el DNA), pueden usarse semiconductores que no son de diamante. Detectores adecuados incluirían detectores de silicio mejorado para UV y fotomultiplicadores.

Las modalidades preferidas de la presente invención pueden hacer uso de las propiedades de absorción intrínseca de las moléculas, cuando se exponen a la luz, o alternativamente, pueden hacer uso de las propiedades de absorción de etiquetas ligadas a las moléculas de interés. Pueden usarse absorbentes moleculares especializados con ligazón molecular diferencial para mejorar la sensibilidad. Tales absorbentes pueden ser atóxicos.

En algunas modalidades de la invención, pueden usarse láseres UV estéreo para crear imágenes tridimensionales de estructuras complejas en el objeto que se somete a barrido, mediante simples técnicas de software de sombreado. De nuevo, esto podría alcanzarse usando las propiedades de absorción intrínseca de las moléculas que se investigan o usando etiquetas absorbentes moleculares especializadas.

Un detector de partículas cargadas de la técnica anterior típico se muestra en la Figura 1. El detector comprende una lámina 10 plana y un material aislante tal como diamante, que tiene revestimientos 12, 14 de electrodos de oro delgados sobre sus superficies superior e inferior. El revestimiento 12 de electrodo superior comprende una pluralidad de tiras de lectura paralelas que están alineadas en una dirección perpendicular al plano del papel en la Figura, y el revestimiento 14 de electrodo inferior comprende una pluralidad adicional de tiras de lectura alineadas en una dirección paralela al plano del papel. Se mantiene una diferencia de potencial V grande entre los revestimientos del electrodo. El electrodo superior e inferior puede ser continuo y las tiras pueden tener polaridad alterna.

Una partícula cargada que sigue un camino 16 a través del diamante produce pares 18, 20 de electrón-hueco, que se separan bajo la influencia del campo eléctrico e inducen una carga en las tiras de lectura. La energía de la partícula puede determinarse mediante la cantidad de carga que se recoge y su posición mediante la intersección de las tiras superior e inferior que reciben las cargas inducidas mayores.

Un detector preferido, adecuado para usar con el método y el aparato de la presente invención, se describirá ahora con detalle, con referencia particular a las Figuras 2 y 3. Es un detector de diamante y comprende un substrato 30 de diamante que tiene, sobre una superficie, una pluralidad de rebordes 40 de diamante mordentados paralelos. Sobre un lado de cada reborde hay un electrodo 50 de lectura positivo y sobre el otro lado un electro 60 negativo. Estos son preferiblemente conductores, pero en cambio podrían ser de un material semiconductor impurificado de alta conductividad.

Durante el uso, el detector se sitúa de modo que el substrato esté substancialmente normal con respecto a una partícula o haz 70 de radiación que ha de detectarse. Una partícula individual que pasa a uno de los rebordes crea portadores ionizados, que rápidamente avanzan hacia los electrodos 50, 60 en virtud de la gran diferencia de potencial que se mantiene entre ellos. De ese modo se induce una carga sobre los electrodos, siendo leída esta carga por dispositivos de lectura (no mostrados) en los extremos de los rebordes.

El substrato y los rebordes son preferiblemente de diamante, que puede ser natural o desarrollado artificialmente. Los rebordes pueden desarrollarse, con el substrato, o pueden mordentarse (por ejemplo, con un láser exímero). Los electrodos 50, 60 pueden ser de cualquier material o combinación de materiales (por ejemplo, titanio, vanadio, cromo y/u oro) que forman un contacto óhmico con la superficie del diamante con un procesamiento adecuado (por ejemplo, ablación, implantación iónica o recocido). Pueden usarse técnicas de deposición estándar para aplicar el metal como un revestimiento delgado a los lados de los rebordes. Típicamente, el dispositivo puede elaborarse mordentando los rebordes, depositando el material y a continuación puliendo la superficie superior.

Se apreciará a partir de la Figura 2 que la sensibilidad del dispositivo mostrado puede incrementarse haciendo mayor el valor de D (o la altura de los rebordes). Cuanto mayor sea la altura de los rebordes, mayor será la cantidad de material a través del cual tiene que pasar una partícula, incrementando de ese modo la ionización dentro del dispositivo. La altura del reborde se adaptará normalmente a la profundidad de penetración esperada de la partícula o los protones que han de detectarse. La velocidad y la eficacia de lectura se determinan mediante la anchura L de cada uno de los rebordes. Dependiendo de la aplicación particular, el valor de L puede ser tan pequeño como unos pocos micrómetros, o un valor mayor de hasta aproximadamente 200 \mum, y el valor de D 10 \mum o más. La relación señal a ruido es grande, ya que existe una interferencia insignificante entre señales que emanan de rebordes individuales. Una profundidad de substrato típica es alrededor de 100 \mum, suficientemente grueso para soportar los rebordes y para ser autoportante sin requerir una base de soporte adicional. Preferiblemente, el dispositivo hace uso de diamante de calidad relativamente pobre, que tiene una longitud de recombinación quizás de 6 \mum aproximadamente.

La impedancia de los dispositivos de lectura (no mostrados) en el extremo de los rebordes está adaptada preferiblemente a la impedancia de los electrodos 50, 60, incrementando de ese modo la velocidad de lectura y reduciendo las pérdidas de señal.

Existe un número de modos en los que puede aplicarse una diferencia de potencial entre los electrodos 50, 60 mostrados en la Figura 2. En su forma más simple, una fuente de voltaje puede conectarse simplemente entre los dos electrodos. Alternativamente, los electrodos pueden acoplarse a una cadena de resistores (no mostrada), definiéndose de ese modo la diferencia de potencial entre los electrodos por la caída de potencial a través del resistor correspondiente.

Otra modalidad se muestra en la Figura 4, en la que los electrodos se forman sobre la base y los lados del espacio entre los rebordes 40 de diamante. Esto significa, efectivamente, que cada electrodo 50' del lado izquierdo de un reborde 40 está eléctricamente acoplado con un electrodo 60' correspondiente del lado derecho del siguiente reborde en la secuencia, de modo que juntos forman un solo electrodo 61 con conformación de U. En la modalidad de la Figura 4a, primeros pares alternos de electrodos 61 con conformación de U se acoplan a través de una primera fuente V_{1} de voltaje y segundos pares alternos se acoplan mediante una segunda fuente V_{2} de voltaje. Tal configuración de voltaje bipolar asegura que haya siempre una diferencia de potencial constante V_{1}-V_{2} a través de cada uno de los rebordes 40.

Un método alternativo para aplicar voltaje a los electrodos 61 con conformación de U se muestra en la Figura 4b. Aquí, se usa una cadena de resistores para hacer caer un voltaje V de entrada a través de una pluralidad de resistores R en serie. El voltaje a través de cada reborde 40 puede elegirse seleccionando valores apropiados para V y R.

Por supuesto, se entenderá que una configuración de voltaje bipolar o una configuración de voltaje de cadena de resistores similares pueden usarse junto con la modalidad de la Figura 2.

Una diferencia de potencial típica a través del reborde 40 puede estar en la región de 1 voltio por \mum. Podrían usarse voltajes substancialmente superiores, si se deseara (ya que el diamante tiene un potencial de descomposición muy alto), pero generalmente no hay necesidad de diferencias de potencial altas ya que a voltajes superiores la velocidad del portador rápidamente se satura.

En una modalidad adicional (no mostrada) un grupo paralelo adicional de rebordes, ortogonal al primer grupo, se proporciona sobre la superficie inferior del substrato 30. Estos dos grupos de rebordes perpendiculares permiten el posicionamiento x-y exacto de cada partícula detectada.

Los espacios entre los rebordes pueden rellenarse con un material plástico, u otro absorbente, mejorando de ese modo la capacidad del detector para detectar partículas neutras.

Una modalidad adicional más se muestra en la Figura 5. Aquí, los espacios entre los rebordes 40 se han hecho extremadamente estrechos y contienen cada uno un electrodo 62 separado. Tal modalidad se prefiere, en muchas circunstancias, ya que la estrechez de los espacios entre los rebordes 40 produce solo una pequeña pérdida de aceptación en comparación con las modalidades de las Figuras 2, 3 y 4. La anchura del espacio, y de ahí la anchura del electrodo 62, puede depender principalmente de cuán estrecha pueda cortarse una ranura en el substrato de diamante. Los electrodos 62 pueden acoplarse entre sí de cualquier manera conveniente a fin de producir una diferencia de potencial adecuada a través de los rebordes 40, por ejemplo usando el sistema de la Figura 4a o de la Figura 4b.

La detección de radiación electromagnética de alta energía, tal como rayos gamma, puede mejorarse añadiendo una capa de chisporroteo (no mostrada) sobre la parte superior de los rebordes. Un fotón entrante choca en primer lugar con la capa de chisporroteo y el chorro resultante penetra a continuación en uno de los rebordes inferiores, proporcionando una señal que será detectada.

El detector de radiación ionizante descrito anteriormente puede proporcionar una lectura de carga extremadamente rápida, probablemente en 35 ps y ciertamente en 50 ps. Estas velocidades de lectura no pueden alcanzarse actualmente para ningún detector pulsatorio simple de sensibilidad y exactitud de posición comparables.

Se vuelve ahora al análisis del modo en el que el aparato anterior puede usarse en la práctica para identificar moléculas individuales dentro de una
mezcla.

La Figura 10 ilustra la disposición esquemáticamente. En un lado del substrato 910 alargado junto con el que se moverán las moléculas hay una lámpara 920 UV mientras que en el otro lado hay una serie de detectores I_{1}, I_{2}, I_{3}, ... I_{n} UV espaciados. Como se ha analizado previamente, la secuenciación se alcanza detectando el paso de bandas de biomoléculas frente a los elementos detectores. Puesto que las biomoléculas absorben luz UV en la región de interés, el paso de cualquier banda frente al detector induce una caída en la corriente nominalmente continua que está provocada por la iluminación 930 constante de ese elemento detector por la fuente 920 de luz UV. La caída en la corriente se mide y se identifica y se trata como una señal individual que puede relacionarse con una banda de una biomolécula dada. Nominalmente, en un gel electroforético, la velocidad de una banda dada es inversamente proporcional a la raíz de la masa de la secuencia de ácido nucleico de la banda; la carga de la secuencia se desacopla de su longitud mediante fuerzas de retardo friccionales que imponen una "velocidad terminal" provocada por aquellas fuerzas que son proporcionales a la longitud.

Para identificar las moléculas individuales, el sistema recoge automáticamente una secuencia de señales S_{k}(t) para la serie de detectores S_{k} en los tiempos t = t_{1}, t_{2}, t_{3} ... . Ahora, puesto que se conoce la posición de cada elemento conector y también se conoce el tiempo transcurrido, es posible calcular la velocidad que habría necesitado una molécula particular para alcanzar un detector particular en ese tiempo transcurrido dado. Si se supone, por ejemplo, que el tiempo transcurrido se mide desde t_{0} = 0 y que el detector I_{k} está a una distancia Z_{k} desde el origen O, puede calcularse la velocidad nominal V_{k}(t) por medio de la expresión Z_{k}/t.

Cada señal S_{k}(t) se añade a continuación a un "bin" apropiado en un histograma de marcha ponderada que se agrupa por velocidad nominal. Las señales individuales pueden añadirse al "bin" apropiado de cualquier manera conveniente, pero en la modalidad preferida, un peso w se añade al "bin" para cada señal, siendo el peso proporcional al tamaño S_{k}(t) de la señal. Un gráfico o histograma correspondiente de los pesos representados en velocidad-espacio se muestra en la Figura 11.

Puesto que cada biomolécula diferente que ha de detectarse es de una longitud diferente, viajará a una velocidad diferente y de ahí que aparecerá en un lugar diferente en el histograma de la Figura 11. Moléculas individuales aparecen como dientes o picos separados en el histograma; en los ejemplos se han detectado las moléculas mostradas A, B y C.

En una posible disposición, las señales S_{k} pueden recogerse repetidamente durante los tiempos t_{1}, t_{2}, t_{3}, etc. Una vez que todos los datos se han recogido, pueden representarse y analizarse según se muestra en la Figura 11. Sin embargo, en una disposición alternativa y preferida, los datos se agrupan a medida que se están recogiendo. La ventaja de tal disposición es que puede representarse un gráfico tal como el que se muestra en la Figura 11, por ejemplo en una pantalla de ordenador, que puede actualizarse en tiempo real. A medida que avanza la recogida de datos, los dientes representativos de moléculas detectadas se hacen gradualmente más distintos.

Se entenderá que el período de tiempo entre muestreos sucesivos de los detectores puede elegirse de acuerdo con la aplicación. En la modalidad preferida, el muestreo se produce cada 100 milisegundos, pero para otras aplicaciones el período podría ser tan pequeño como unos pocos microsegundos o tan grande como varios minutos o incluso horas. Con tal de que los dispositivos electrónicos de lectura puedan manejar el flujo de datos, es impagable llegar a tiempos cada vez más cortos. Además, no existe necesidad de que los períodos de tiempo sean contiguos, aunque en la práctica es probable que los períodos contiguos de medida sean más convenientes, particularmente con la presente aplicación en la que el período está definido por la velocidad de avance, el tamaño de las bandas y ciertos otros factores.

Se recordará que la señal S_{k} en cada detector I_{k} es representativa de la desviación de corriente desde el nivel de corriente continua nominal que está presente cuando no existen moléculas en el camino del haz 930. Las fluctuaciones estadísticas pueden hacer a esta señal negativa (esto es, por encima del nivel de corriente continua medio) o positiva (esto es, por debajo del nivel de corriente continua). De media, estas tienden a cancelarse y, a medida que se recogen más datos, el ruido se suprime gradualmente. Tratando de no seguir objetivos individuales, sino en cambio reuniendo "ciegamente" los valores en velocidad-espacio en cada etapa, los objetos se encuentran automáticamente de un modo que es natural, muy rápido y que minimiza el ruido. El hardware necesario es muy simple y el software y el análisis aún más. El hardware podía proporcionarse, por ejemplo, mediante la carga de un elemento capacitativo mediante una cantidad proporcionada en las señal S_{k}.

Una ventaja adicional de método es que no solo se lleva a cabo la substracción automática del fondo, sino que la precisión obtenida es mucho mayor de lo que sería posible mediante el uso simple de información procedente de elementos detectores individuales. La información procedente de la serie S_{k} como un todo proporciona mucha más información y de ahí precisión que la que podría obtenerse de una consideración de los detectores individualmente.

Además, el método también permite la cuantificación. Considerando la altura y la anchura de cada uno de los dientes de la Figura 11, puede determinarse con alguna exactitud cuánto de cada substancia detectada estaba contenido en la mezcla original.

El uso de un haz 930 de luz esencialmente plano y detectores direccionales asegura que las moléculas puedan situarse de forma extremadamente precisa a medida que pasan por los detectores. Aunque, por supuesto, sería posible usar el método descrito con moléculas que emiten una señal que ha de detectarse, tal como radiactividad o luz UV, es probable que la precisión fuera inferior debido a la dispersión adicional y al hecho de que la concentración de moléculas tiene que ser mayor para producir la misma señal (ya que la mayoría de la luz o radiactividad emitida se desperdicia ya que se emite en todas las direcciones). Usando absorción UV para producir la señal, pueden usarse moléculas mucho más pequeñas de modo que se mueven más rápidamente y se separan más rápidamente. Esto permite que el tiempo de lectura se recorte drásticamente quizá hasta minutos en vez de las horas convencionales.

Claims (25)

1. Un método para someter a secuenciación una biomolécula, que comprende:

aplicar una reacción de secuenciación a una muestra que contiene una biomolécula que ha de someterse a secuenciación, para crear una muestra que ha reaccionado;

cargar la muestra que ha reaccionado sobre un material de electroforesis;

aplicar una diferencia de potencial a lo largo del material haciendo de ese modo que la muestra se traslade por una pluralidad de detectores espaciados, estando dispuesto cada detector I_{k} para producir una señal S_{k} representativa de la absorción molecular de UV de la muestra según pasa por el detector
I_{k};

medir repetidamente la señal S_{k}(t) en cada detector I_{k} a una pluralidad de tiempos t = t_{1}, t_{2}, t_{3} ...;

agrupar las señales S_{k}(t) por velocidad nominal V_{k}(t), la velocidad necesaria para que una substancia molecular dentro de la mezcla que se traslada alcance el detector I_{k} en el tiempo t; y

determinar la secuencia de la biomolécula de acuerdo con picos dentro de la colección de señales agrupadas.

2. Un método para someter a secuenciación una biomolécula de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la reacción de secuenciación incluye moléculas de etiquetaje que absorben UV.

3. Un método para someter a secuenciación una biomolécula de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la biomolécula comprende un ácido nucleico.

4. Un método para someter a secuenciación una biomolécula de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la biomolécula comprende un péptido.

5. Un método para someter a secuenciación una biomolécula de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la biomolécula comprende una proteína.

6. Un método para someter a secuenciación una biomolécula de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la biomolécula comprende un virus.

7. Un sistema de secuenciación molecular que comprende una fuente (722, 870) de luz UV dispuesta para incidir sobre una muestra que contiene los productos de una reacción de secuenciación de una biomolécula que ha de someterse a secuenciación; un material (740, 850) de electroforesis y medios (822, 842) para aplicar una diferencia de potencial a lo largo del material para hacer que la muestra se mueva a lo largo del material;

comprendiendo además el sistema

una pluralidad de detectores espaciados, estando dispuesto cada detector I_{k} para producir una señal S_{k} representativa de la absorción molecular de UV de la muestra según pasa por el detector I_{k};

medios para medir repetidamente la señal S_{k}(t) en cada detector I_{k} en una pluralidad de tiempos t = t_{1}, t_{2}, t_{3} ...;

medios para agrupar las señales S_{k}(t) por velocidad nominal V_{k}(t), la velocidad necesaria para que una substancia molecular dentro de la mezcla que se traslada alcance el detector I_{k} en el tiempo t; y

medios para determinar la secuencia de la biomolécula de acuerdo con picos dentro de la colección de señales agrupadas.

8. Un sistema de secuenciación molecular de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la pluralidad de detectores (860) es estacionaria con respecto a la muestra y está dispuesta para detectar dos fragmentos según se mueven sobre o dentro de la muestra por los detectores.

9. Un sistema de secuenciación molecular de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la fuente (870) UV está situada opuesta a los detectores (860).

10. Un sistema de secuenciación molecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que los detectores son de diamante.

11. Un sistema de secuenciación molecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que los detectores son de silicio mejorado para UV.

12. Un sistema de secuenciación molecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que el detector comprende una sola galleta (30) de material detector, teniendo la galleta una pluralidad de hendiduras de lados paralelos en una superficie de la misma, definiendo de ese modo entre las hendiduras una pluralidad de elementos (40) detectores de lados paralelos, portando los lados opuestos de cada elemento electrodos (50, 60) de lectura opuestos y medios (V_{1}, V_{2}) para aplicar una diferencia de potencial entre los electrodos opuestos de cada elemento para crear un campo eléctrico a través del elemento.

13. Un sistema de secuenciación molecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en el que la fuente de luz es un láser UV.

14. Un sistema de secuenciación molecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en el que la fuente de luz es una lámpara de deuterio.

15. Un sistema de secuenciación molecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en el que la fuente de luz es un tubo de descarga de helio.

16. Un sistema de secuenciación molecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, estando dispuesto el sistema para determinar que un fragmento es adyacente al detector cuando el detector registra una entrada de luz reducida debido a la absorción molecular de luz del fragmento.

17. Un sistema de secuenciación molecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 16, en el que el material de electroforesis está en fase sólida.

18. Un sistema de secuenciación molecular de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el material de electroforesis está montado en un substrato de cuarzo.

19. Un sistema de secuenciación molecular de acuerdo con la reivindicación 17 o la reivindicación 18, en el que el material de electroforesis es reutilizable.

20. Un sistema de secuenciación molecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el detector comprende un fotomultiplicador.

21. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las señales S_{k}(t) se agrupan a medida que se recogen.

22. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la velocidad nominal V_{k}(t) se determina a partir de un conocimiento de la distancia atravesada desde un punto original hasta el detector I_{k} y el tiempo transcurrido.

23. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la velocidad nominal se calcula como Z_{k}/t, donde Z_{k} es la distancia desde el origen hasta el detector I_{k} y t es el tiempo transcurrido.

24. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las señales S_{k}(t) se agrupan reuniendo los valores dentro de una pluralidad de "bin"es de velocidad nominal.

25. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las señales S_{k}(t) son representativas de la disminución de luz recibida por los detectores como resultado de absorción de luz por las substancias moleculares que han de identificarse.