JP2914758B2 - タンパク質溶液濃度の２次元測定方法および装置 - Google Patents
タンパク質溶液濃度の２次元測定方法および装置Info
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-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D9/00—Crystallisation
- B01D9/005—Selection of auxiliary, e.g. for control of crystallisation nuclei, of crystal growth, of adherence to walls; Arrangements for introduction thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C30—CRYSTAL GROWTH
- C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
- C30B7/00—Single-crystal growth from solutions using solvents which are liquid at normal temperature, e.g. aqueous solutions
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
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- G—PHYSICS
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生体高分子溶液濃度の
２次元測定方法および該方法を実施するための装置に関
し、更に詳しくは生体高分子結晶化の過程を観察する方
法および該方法を実施するために該高分子結晶化過程を
２次元で走査する装置に関する。
２次元測定方法および該方法を実施するための装置に関
し、更に詳しくは生体高分子結晶化の過程を観察する方
法および該方法を実施するために該高分子結晶化過程を
２次元で走査する装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】蛋白質、ポリペプチド核酸などの生体高
分子は生体内でエネルギー代謝、構造構築、情報伝達な
どの重要な機能を果たしている。このような生体高分子
の機能は、その構造に由来していることが知られてきて
いる。そこで生体高分子の３次元構造を調べる必要が近
年高まりつつある。３次元構造解析法としては、ＮＭＲ
（核磁気共鳴）法、Ｘ線回折法などが一般的な方法であ
るが、直接３次元構造解析が可能であることから、Ｘ線
回折法が注目されている。
分子は生体内でエネルギー代謝、構造構築、情報伝達な
どの重要な機能を果たしている。このような生体高分子
の機能は、その構造に由来していることが知られてきて
いる。そこで生体高分子の３次元構造を調べる必要が近
年高まりつつある。３次元構造解析法としては、ＮＭＲ
（核磁気共鳴）法、Ｘ線回折法などが一般的な方法であ
るが、直接３次元構造解析が可能であることから、Ｘ線
回折法が注目されている。
【０００３】Ｘ線回折を行うためには、構造の乱れが少
ない、良質な生体高分子結晶を得ることが重要である。
しかしながら、良質な生体高分子結晶を得るのは従来困
難であった。これは、結晶化条件が、各生体高分子で異
なるために、試行錯誤に最適化条件決定を行う必要があ
ったためである。また、生体高分子結晶の結晶核に成長
過程についての知見が少ないことも、良質な生体高分子
結晶を得ることを困難にしている。
ない、良質な生体高分子結晶を得ることが重要である。
しかしながら、良質な生体高分子結晶を得るのは従来困
難であった。これは、結晶化条件が、各生体高分子で異
なるために、試行錯誤に最適化条件決定を行う必要があ
ったためである。また、生体高分子結晶の結晶核に成長
過程についての知見が少ないことも、良質な生体高分子
結晶を得ることを困難にしている。
【０００４】近年、生体高分子、とりわけ蛋白質結晶成
長過程を詳細に調べようとする試みが成され始めた（例
えばAzuma et al.J.Crystal Growth, 98,371-376,198
9)。彼らの論文では、蛋白質結晶過程追跡を、結晶近傍
の屈折率変化を微分干渉光学系を利用して測定すること
により行っている。この方法により、結晶近傍での２次
元濃度測定が可能となった。しかしながら微分干渉光学
系による蛋白質濃度測定には幾つかの問題がある。まず
第一には、蛋白質濃度を屈折率により測定するために、
結晶母液中の溶質濃度変化を蛋白質濃度変化と誤認する
可能性があげられる。また第二点目としては屈折率から
蛋白質濃度への換算のためには、結晶近傍と母液中での
干渉縞の間隔測定が必要であるために、画像処理など煩
雑な操作が必要である。
長過程を詳細に調べようとする試みが成され始めた（例
えばAzuma et al.J.Crystal Growth, 98,371-376,198
9)。彼らの論文では、蛋白質結晶過程追跡を、結晶近傍
の屈折率変化を微分干渉光学系を利用して測定すること
により行っている。この方法により、結晶近傍での２次
元濃度測定が可能となった。しかしながら微分干渉光学
系による蛋白質濃度測定には幾つかの問題がある。まず
第一には、蛋白質濃度を屈折率により測定するために、
結晶母液中の溶質濃度変化を蛋白質濃度変化と誤認する
可能性があげられる。また第二点目としては屈折率から
蛋白質濃度への換算のためには、結晶近傍と母液中での
干渉縞の間隔測定が必要であるために、画像処理など煩
雑な操作が必要である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ところで、紫外線を利
用した２次元計測装置が分析、測定用に開発され始めて
いる。この例として、紫外線を用いた２次元計測装置と
しては、例えば紫外顕微鏡などが挙げられる。この紫外
顕微鏡に顕微鏡光度計システムを組み合わせることによ
り、細胞内カルシウム濃度測定やＤＮＡ量測定を行える
ようにした装置が存在する。例えばカールツァイス社Ｍ
ＰＭシステムなどの例である。しかしながらこの装置
は、生体高分子結晶解析用に設計されたものではなく、
また用いる紫外光も、例えば蛋白質結晶に必要な紫外領
域とは異なっている。またポイント測光は行えるもの
の、広範囲の測光を迅速に行うことは出来ない。
用した２次元計測装置が分析、測定用に開発され始めて
いる。この例として、紫外線を用いた２次元計測装置と
しては、例えば紫外顕微鏡などが挙げられる。この紫外
顕微鏡に顕微鏡光度計システムを組み合わせることによ
り、細胞内カルシウム濃度測定やＤＮＡ量測定を行える
ようにした装置が存在する。例えばカールツァイス社Ｍ
ＰＭシステムなどの例である。しかしながらこの装置
は、生体高分子結晶解析用に設計されたものではなく、
また用いる紫外光も、例えば蛋白質結晶に必要な紫外領
域とは異なっている。またポイント測光は行えるもの
の、広範囲の測光を迅速に行うことは出来ない。
【０００６】従って、生体高分子の結晶化過程を２次元
でかつ容易・迅速に追跡し、生体高分子溶液濃度の測定
方法並びにこの方法を実施するための簡易でかつ小型の
装置の開発が望まれていた。
でかつ容易・迅速に追跡し、生体高分子溶液濃度の測定
方法並びにこの方法を実施するための簡易でかつ小型の
装置の開発が望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は上記課題を達成
するためになされたものであり、本発明の生体高分子溶
液濃度の２次元測定方法においては、生体高分子溶液と
結晶化剤を結晶化セルに装入し、紫外光源からの紫外光
を該結晶化セルに照射し、該結晶化セルを透過した紫外
光をリニアセンサーにより２次元に走査して透過光量を
検出し、検出した透過光量よりタンパク質濃度換算を行
うことを含んでなる。
するためになされたものであり、本発明の生体高分子溶
液濃度の２次元測定方法においては、生体高分子溶液と
結晶化剤を結晶化セルに装入し、紫外光源からの紫外光
を該結晶化セルに照射し、該結晶化セルを透過した紫外
光をリニアセンサーにより２次元に走査して透過光量を
検出し、検出した透過光量よりタンパク質濃度換算を行
うことを含んでなる。
【０００８】更に、本発明は上記方法を実施するための
生体高分子溶液濃度の２次元測定装置を提供するもので
あり、この装置は紫外線光源部と結晶化セルと吸光度検
出部および吸光度検出部からの透過光量を除算または差
分演算を行う演算・制御部とから成り、紫外線光源部、
結晶化セルおよび吸光度検出部の順序に配置されている
ことを特徴とする。
生体高分子溶液濃度の２次元測定装置を提供するもので
あり、この装置は紫外線光源部と結晶化セルと吸光度検
出部および吸光度検出部からの透過光量を除算または差
分演算を行う演算・制御部とから成り、紫外線光源部、
結晶化セルおよび吸光度検出部の順序に配置されている
ことを特徴とする。
【０００９】
【作用】すなわち、本発明では、多くの生体高分子が紫
外線領域の光に特異的な吸収を示すことに着目して、紫
外吸光度の２次元走査を行うように構成したものであ
り、従って蛋白質結晶成長過程、より具体的には蛋白質
濃度の測定が２次元で行なえる。
外線領域の光に特異的な吸収を示すことに着目して、紫
外吸光度の２次元走査を行うように構成したものであ
り、従って蛋白質結晶成長過程、より具体的には蛋白質
濃度の測定が２次元で行なえる。
【００１０】以下、実施例により更に本発明を説明す
る。
る。
【００１１】
実施例１ 図１は本発明装置の構成図である。この構成図に示され
るように本発明装置は測定領域を特定紫外光で均一に照
射することが可能な光源部、結晶化を行うセル部、蛋白
質濃度変化を測定するための検出部（吸光度検出部）、
検出部出力を生体高分子濃度換算を行うための演算・制
御部により成り立っている。なお吸光度検出部には後記
のようにリニアイメージセンサー移動部が接続されてお
り、この移動部は演算・制御部と連係している。
るように本発明装置は測定領域を特定紫外光で均一に照
射することが可能な光源部、結晶化を行うセル部、蛋白
質濃度変化を測定するための検出部（吸光度検出部）、
検出部出力を生体高分子濃度換算を行うための演算・制
御部により成り立っている。なお吸光度検出部には後記
のようにリニアイメージセンサー移動部が接続されてお
り、この移動部は演算・制御部と連係している。
【００１２】紫外線光源部は、紫外線光源と分光部から
構成されている。光源としては、例えば重水素放電管又
は低圧水銀ランプが用いられる。この低圧水銀ランプは
約10,000時間の長寿命を有する。分光部は、例えばモノ
クロメーター又は干渉フィルターから構成される。な
お、紫外線光源部には電圧を一定に保持するための安定
化電源部が接続されている。安定化電源装置は、通常の
蛍光灯点灯回路を利用して作成できる。
構成されている。光源としては、例えば重水素放電管又
は低圧水銀ランプが用いられる。この低圧水銀ランプは
約10,000時間の長寿命を有する。分光部は、例えばモノ
クロメーター又は干渉フィルターから構成される。な
お、紫外線光源部には電圧を一定に保持するための安定
化電源部が接続されている。安定化電源装置は、通常の
蛍光灯点灯回路を利用して作成できる。
【００１３】濃度測定に必要な特定波長の紫外光を得る
ために、280nm(蛋白質に特異的波長）の光を得るために
は、フォスファと干渉フィルタを用い、260nm(核酸に特
異的波長) の光は低圧水銀ランプの254nm の輝線スペク
トルで代用した。以上述べた光源装置により、下記に示
す結晶化セルの紫外光透過面（４×10mm）を均一に照射
することができる。
ために、280nm(蛋白質に特異的波長）の光を得るために
は、フォスファと干渉フィルタを用い、260nm(核酸に特
異的波長) の光は低圧水銀ランプの254nm の輝線スペク
トルで代用した。以上述べた光源装置により、下記に示
す結晶化セルの紫外光透過面（４×10mm）を均一に照射
することができる。
【００１４】蛋白質結晶化セルは、結晶成長方式の違い
から、液液界面２液拡散法と膜介在２液拡散法について
実施できるように設計した（図２）。図２（Ａ）は、液
液界面二液法による場合の蛋白質結晶化セルの概略図で
あり、図２（Ｂ）は、膜介在２液拡散法による場合の蛋
白質結晶化セルの概略図である。
から、液液界面２液拡散法と膜介在２液拡散法について
実施できるように設計した（図２）。図２（Ａ）は、液
液界面二液法による場合の蛋白質結晶化セルの概略図で
あり、図２（Ｂ）は、膜介在２液拡散法による場合の蛋
白質結晶化セルの概略図である。
【００１５】液液界面２液拡散法は、結晶化剤溶液と蛋
白質溶液との間で液液界面が形成され濃度勾配を形成せ
しめるようにしたものである。この方法による場合、結
晶化セルは図２（Ａ）に図示されるように蛋白質溶液と
結晶化剤溶液とが結晶化セル１内に別個に導入できるよ
うに分枝管が設けられ、かつ各々には仕切り板２が設け
られている。また、セルの一方端は開口し、オーバフロ
ーした溶液を排出するように構成されている。この方法
による場合は、仕切板２を開け結晶化剤溶液を結晶化セ
ル１の一方端に設けられた導管から該セル内に導入して
セル１内を満たし、仕切板２を閉じ、次いで仕切板２′
を開け蛋白質溶液を支管から該セル１に装入し該蛋白質
溶液が該セル１のほぼ中央付近に位置するようになった
場合に仕切板２′を閉じる。この操作の過程においてオ
ーバフローした結晶化剤溶液はドレイン管から排出され
る。
白質溶液との間で液液界面が形成され濃度勾配を形成せ
しめるようにしたものである。この方法による場合、結
晶化セルは図２（Ａ）に図示されるように蛋白質溶液と
結晶化剤溶液とが結晶化セル１内に別個に導入できるよ
うに分枝管が設けられ、かつ各々には仕切り板２が設け
られている。また、セルの一方端は開口し、オーバフロ
ーした溶液を排出するように構成されている。この方法
による場合は、仕切板２を開け結晶化剤溶液を結晶化セ
ル１の一方端に設けられた導管から該セル内に導入して
セル１内を満たし、仕切板２を閉じ、次いで仕切板２′
を開け蛋白質溶液を支管から該セル１に装入し該蛋白質
溶液が該セル１のほぼ中央付近に位置するようになった
場合に仕切板２′を閉じる。この操作の過程においてオ
ーバフローした結晶化剤溶液はドレイン管から排出され
る。
【００１６】一方、膜介在２液拡散法は、膜の両側で濃
度勾配を形成せしめるようにしたものである。この方法
による場合、図２（Ｂ）に図示されるように結晶化セル
１′のほゞ中央に透析膜３が取付けられている。透析膜
３の孔径は、結晶化剤を通過させ蛋白質は通過させない
ような大きさのものに選定される。この透析膜によって
セル内を２つの室に２分し、一方の室に蛋白質溶液を導
入するため、セルの一方端を開口し、更にオーバフロー
した溶液を排出する開口部を設けている。同様に他方の
室に結晶化剤溶液を導入するため、セルの他方端を開口
し、更にオーバフローした溶液を排出する開口部を設け
ている（図２（Ｂ）、図３参照）この方法の場合、例え
ば結晶化剤溶液と蛋白質溶液とを同時にセルに導入して
実験を行うことができる。
度勾配を形成せしめるようにしたものである。この方法
による場合、図２（Ｂ）に図示されるように結晶化セル
１′のほゞ中央に透析膜３が取付けられている。透析膜
３の孔径は、結晶化剤を通過させ蛋白質は通過させない
ような大きさのものに選定される。この透析膜によって
セル内を２つの室に２分し、一方の室に蛋白質溶液を導
入するため、セルの一方端を開口し、更にオーバフロー
した溶液を排出する開口部を設けている。同様に他方の
室に結晶化剤溶液を導入するため、セルの他方端を開口
し、更にオーバフローした溶液を排出する開口部を設け
ている（図２（Ｂ）、図３参照）この方法の場合、例え
ば結晶化剤溶液と蛋白質溶液とを同時にセルに導入して
実験を行うことができる。
【００１７】いずれの方法であっても、蛋白質濃度勾配
を形成し、この濃度勾配のどの辺で蛋白質の結晶が最初
にできるかの知見を以下に述べる手順によって得る。な
お、このような上記の２つの方法以外の方法、例えば静
置バッチ法に関しても適用できることは明らかである。
本実施例においては、紫外線吸光度測定を行うために、
セル材質には石英ガラスを用いた。セルの厚さ（光路
長）は、用いた蛋白質濃度（通常１〜50mg／ml）を考慮
して、２mmとした。また結晶化セルの縦・横の大きさ
は、１次元走査用センサーの大きさを考慮して、４×10
mmとした。セルの形を直方体としたのは、石英ガラスの
加工性の悪さのためである。実施例で用いる蛋白質溶液
と結晶化剤溶液の量は、膜介在二液拡散法の場合にはそ
れぞれ0.３ml, 1.５mlが適当であり、液液界面二液拡散
法の場合には、それぞれ0.３mlが適当であった。
を形成し、この濃度勾配のどの辺で蛋白質の結晶が最初
にできるかの知見を以下に述べる手順によって得る。な
お、このような上記の２つの方法以外の方法、例えば静
置バッチ法に関しても適用できることは明らかである。
本実施例においては、紫外線吸光度測定を行うために、
セル材質には石英ガラスを用いた。セルの厚さ（光路
長）は、用いた蛋白質濃度（通常１〜50mg／ml）を考慮
して、２mmとした。また結晶化セルの縦・横の大きさ
は、１次元走査用センサーの大きさを考慮して、４×10
mmとした。セルの形を直方体としたのは、石英ガラスの
加工性の悪さのためである。実施例で用いる蛋白質溶液
と結晶化剤溶液の量は、膜介在二液拡散法の場合にはそ
れぞれ0.３ml, 1.５mlが適当であり、液液界面二液拡散
法の場合には、それぞれ0.３mlが適当であった。
【００１８】吸光度検出部には、紫外線の分光感度が高
く、空間分解能の良さが要求され、このためリニアイメ
ージセンサー（例えば浜松ホトニクス社製、S3923-1024
Q)を用いた。このセンサーは25.6mmの範囲を、25μｍの
分解能で走査することができる。駆動回路としては、同
じく浜松ホトニクス社製の MOSリニアイメージセンサー
用駆動回路C4074 とパルスジェネレータC4091 を用い
た。また出力はストレージオシロフコープに取り込ませ
た。リニアイメージセンサーにより４×10mmの２次元領
域を走査させるために、25μｍ刻みにリニアイメージセ
ンサーを移動させる必要がある。そのため、リニアイメ
ージセンサー移動のために、顕微鏡用メカニカルステー
ジを用いた。この装置を用いることにより、４×10mmの
領域を25μｍ刻みで走査することが可能となった（図
３）。
く、空間分解能の良さが要求され、このためリニアイメ
ージセンサー（例えば浜松ホトニクス社製、S3923-1024
Q)を用いた。このセンサーは25.6mmの範囲を、25μｍの
分解能で走査することができる。駆動回路としては、同
じく浜松ホトニクス社製の MOSリニアイメージセンサー
用駆動回路C4074 とパルスジェネレータC4091 を用い
た。また出力はストレージオシロフコープに取り込ませ
た。リニアイメージセンサーにより４×10mmの２次元領
域を走査させるために、25μｍ刻みにリニアイメージセ
ンサーを移動させる必要がある。そのため、リニアイメ
ージセンサー移動のために、顕微鏡用メカニカルステー
ジを用いた。この装置を用いることにより、４×10mmの
領域を25μｍ刻みで走査することが可能となった（図
３）。
【００１９】演算・制御回路は、リニアイメージセンサ
ーの移動制御と紫外線検出部からの出力演算を行う。紫
外線検出部での演算は、空の結晶化セルでの出力と測定
時のセル出力の間での差分または除算演算を行う。この
演算により、照射強度ムラを除くことができる。またこ
の演算部では、吸光度からの濃度換算を行うことも可能
である。
ーの移動制御と紫外線検出部からの出力演算を行う。紫
外線検出部での演算は、空の結晶化セルでの出力と測定
時のセル出力の間での差分または除算演算を行う。この
演算により、照射強度ムラを除くことができる。またこ
の演算部では、吸光度からの濃度換算を行うことも可能
である。
【００２０】 実施例２ 蛋白質ミオグロビンを用いた場合の蛋白質濃度測定方法
の一実施例を次に示す。実験は液液界面二液拡散法につ
いて行った。結晶化剤である硫安溶液（97％飽和）と1.
０％ミオグロビン溶液（55％飽和硫安溶液に溶解)をそ
れぞれシリンジに充填し、三方コックにより連結して、
石英ガラスセル（２（Ａ）図参照）中に順に注入し、硫
安溶液とミオグロビン溶液の液液界面を形成し、静置し
た。実験は室温にて行った。
の一実施例を次に示す。実験は液液界面二液拡散法につ
いて行った。結晶化剤である硫安溶液（97％飽和）と1.
０％ミオグロビン溶液（55％飽和硫安溶液に溶解)をそ
れぞれシリンジに充填し、三方コックにより連結して、
石英ガラスセル（２（Ａ）図参照）中に順に注入し、硫
安溶液とミオグロビン溶液の液液界面を形成し、静置し
た。実験は室温にて行った。
【００２１】石英ガラスセルに溶液を注入する直前に、
空の石英セルの透過光量を測定した。リニアイメージセ
ンサーをメカニカルステージにより25μｍづつ移動させ
て、４×10mmの石英セル全域について測定し、 64000点
からデータを取得した。石英セル中の測定点位置を図４
に示す。取得したデータは空セルでの透過光量として16
ビットアナログデジタル（ＡＤ）変換してマイクロコン
ピュータ内にストレージした。実験開始後は２時間ごと
にデータの取得を行ない、結晶化過程の追跡を行った。
空の石英セルの透過光量を測定した。リニアイメージセ
ンサーをメカニカルステージにより25μｍづつ移動させ
て、４×10mmの石英セル全域について測定し、 64000点
からデータを取得した。石英セル中の測定点位置を図４
に示す。取得したデータは空セルでの透過光量として16
ビットアナログデジタル（ＡＤ）変換してマイクロコン
ピュータ内にストレージした。実験開始後は２時間ごと
にデータの取得を行ない、結晶化過程の追跡を行った。
【００２２】各測定点から得た出力は、空セルでのデー
タ（Ｉ0)と各時間での透過光量（Ｉ）の比の常用対数を
取ったもの（吸光度：Ａ）としてデータ蓄積した。また
吸光度は、Lambert-Beerの関係式、 log(I0／I)＝Ａ＝ｋ×Ｃ×ｌ （式中、ｋはモル吸光係数であり、Ｃは蛋白質のモル濃
度であり、ｌは行路長（本実施例では２mm）である）を
用いて蛋白質のモル濃度Ｃに換算できる。また、より簡
便には、 蛋白質濃度（mg／ml）＝1.45×Ａ の関係式を用いて換算できる。なお、上記式における1.
45の値は吸光度からmg／ml単位表示の濃度に変換する際
の定数である。
タ（Ｉ0)と各時間での透過光量（Ｉ）の比の常用対数を
取ったもの（吸光度：Ａ）としてデータ蓄積した。また
吸光度は、Lambert-Beerの関係式、 log(I0／I)＝Ａ＝ｋ×Ｃ×ｌ （式中、ｋはモル吸光係数であり、Ｃは蛋白質のモル濃
度であり、ｌは行路長（本実施例では２mm）である）を
用いて蛋白質のモル濃度Ｃに換算できる。また、より簡
便には、 蛋白質濃度（mg／ml）＝1.45×Ａ の関係式を用いて換算できる。なお、上記式における1.
45の値は吸光度からmg／ml単位表示の濃度に変換する際
の定数である。
【００２３】実験開始24時間後および48時間後の具体的
な吸光度の値を次の表１および表２に示す。なお、表１
および表２中、角の値（4250）は左上の測定点番号を示
す。また、★はスケールアウトしたことを示す。
な吸光度の値を次の表１および表２に示す。なお、表１
および表２中、角の値（4250）は左上の測定点番号を示
す。また、★はスケールアウトしたことを示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【００２６】表１の結果から次の事実が判明した。すな
わち、ミオグロビンの結晶化は実験開始後24時間位から
始まった。結晶化は液液界面から２〜３mm離れた位置か
ら帯状に始まり（ちなみに、測定点4253〜4255での吸光
度の値を参照) 、結晶核の形成は吸光度の急峻な立ち上
がりと吸光度の測定レンジからのスケールアウト（透過
光が測定不能となったため）から判断できた（ちなみ
に、表２中の測定点4653, 4654, 4655, 5051, 5053、お
よび5054などの吸光度の値を参照）。また、結晶核の周
辺部では蛋白質濃度の増加が観測できた。
わち、ミオグロビンの結晶化は実験開始後24時間位から
始まった。結晶化は液液界面から２〜３mm離れた位置か
ら帯状に始まり（ちなみに、測定点4253〜4255での吸光
度の値を参照) 、結晶核の形成は吸光度の急峻な立ち上
がりと吸光度の測定レンジからのスケールアウト（透過
光が測定不能となったため）から判断できた（ちなみ
に、表２中の測定点4653, 4654, 4655, 5051, 5053、お
よび5054などの吸光度の値を参照）。また、結晶核の周
辺部では蛋白質濃度の増加が観測できた。
【００２７】また、結晶核成長の様子は、結晶の占める
測定点の数を追跡することにより行うことができる。ち
なみに表２において、スケールアウトした位置において
結晶核が成長していることが分かる。
測定点の数を追跡することにより行うことができる。ち
なみに表２において、スケールアウトした位置において
結晶核が成長していることが分かる。
【００２８】
【発明の効果】本発明は、以上説明したように構成され
るものであるから以下のような種々の効果を奏する。第
一に生体高分子結晶化過程を２次元で追跡可能である。
ちなみに、本発明の装置を用いることにより、蛋白質な
どの生体高分子結晶化過程を、空間分解能25μｍ、濃度
差分解能初期濃度の１／100 、ダイナミックレンジ５〜
50mg／mlで測定可能である。また従来の蛋白質濃度測定
装置よりも光学系がはるかに単純であり、小型化、軽量
化が実現できる。また、従来装置の問題点であった、塩
濃度変化による測定誤差を完全に除去できる。更に従来
装置より、濃度換算を容易に行うことができる。更にま
た、本発明装置は種々の結晶化方法について適用可能で
ある。
るものであるから以下のような種々の効果を奏する。第
一に生体高分子結晶化過程を２次元で追跡可能である。
ちなみに、本発明の装置を用いることにより、蛋白質な
どの生体高分子結晶化過程を、空間分解能25μｍ、濃度
差分解能初期濃度の１／100 、ダイナミックレンジ５〜
50mg／mlで測定可能である。また従来の蛋白質濃度測定
装置よりも光学系がはるかに単純であり、小型化、軽量
化が実現できる。また、従来装置の問題点であった、塩
濃度変化による測定誤差を完全に除去できる。更に従来
装置より、濃度換算を容易に行うことができる。更にま
た、本発明装置は種々の結晶化方法について適用可能で
ある。
【図１】本発明装置の構成図である。
【図２】蛋白質結晶化セルの概略図である。
【図３】本発明一実施例の要部斜視図である。
【図４】石英セル中の測定点位置を示すグラフである。
１，１′…結晶化セル ３…透析膜 ４…リニアイメージセンサー
フロントページの続き (56)参考文献 Ｔ．ＡＺＵＭＡ ｅｔ ａｌ”ＣＬＵ ＳＴＥＲＩＮＧ ＰＨＥＮＯＭＥＮＯＮ ＡＮＤ ＧＲＯＷＴＨ ＵＮＩＴＳ ＩＮ ＬＹＳＯＺＹＭＥ ＡＱＵＥＯＵ Ｓ ＳＯＬＵＴＩＯＮ ＡＳ ＲＥＶＥ ＡＬＥＤ ＢＹ ＬＡＳＥＲ ＬＩＧＨ Ｔ ＳＣＡＴＴＥＲＩＮＧ ＭＥＴＨＯ Ｄ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｒｙｓ ｔａｌＧｒｏｗｔｈ 98，ｐ．371−376 （1989) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/10 G01N 21/33
Claims (8)
- 【請求項１】 タンパク質溶液濃度の２次元測定方法で
あって、タンパク質 溶液と結晶化剤を結晶化セルに装入し、 紫外光源からの紫外光を該結晶化セルに照射し、 該結晶化セルを透過した紫外光をリニアセンサーにより
２次元に走査して透過光量を検出し、 検出した透過光量より吸光度を算出し、これよりタンパ
ク質濃度換算を行うことを含んでなる前記測定方法。 - 【請求項２】 透過光量の検出を、１次元に配列したフ
ォトダイオードにより行う請求項１記載の測定方法。 - 【請求項３】 リニアイメージセンサーを作動させるこ
とにより、２次元での吸光度測定を行う、請求項１又は
２に記載の測定方法。 - 【請求項４】 空の測定セルについて予じめ透過光量を
検出して吸光度を測定し、該測定データを保持し、画素
ごとに差分演算を行う請求項１記載の測定方法。 - 【請求項５】 紫外線光源部と結晶化セルと吸光度検出
部および吸光度検出部からの透過光量を除算または差分
演算を行う演算・制御部とから成り、紫外線光源部、結
晶化セルおよび吸光度検出部の順序に配置されているこ
とを特徴とするタンパク質溶液濃度の２次元測定装置。 - 【請求項６】 紫外線光源部が、紫外線光源と分光部か
ら構成されている請求項５記載の２次元測定装置。 - 【請求項７】 紫外線光源が、重水素放電管または低圧
水銀ランプである請求項５記載の２次元測定装置。 - 【請求項８】 分光部が、モノクロメーターまたは干渉
フィルターである請求項５記載の装置。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2403315A JP2914758B2 (ja) | 1990-12-18 | 1990-12-18 | タンパク質溶液濃度の２次元測定方法および装置 |
| CA002057558A CA2057558C (en) | 1990-12-18 | 1991-12-17 | Method and apparatus for two-dimensional measurement of concentration of biological macromolecule solution |
| US07/809,123 US5214288A (en) | 1990-12-18 | 1991-12-18 | Method and apparatus for two-dimensional measurement of concentration of biological macromolecule solution |
| DE69119568T DE69119568T2 (de) | 1990-12-18 | 1991-12-18 | Verfahren und Vorrichtung zur zweidimensionalen Messung der Konzentration von biologischen Makromolekülen einer Lösung |
| EP91311730A EP0491558B1 (en) | 1990-12-18 | 1991-12-18 | Method and apparatus for two-dimensional measurement of concentration of biological macromolecule solution |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2403315A JP2914758B2 (ja) | 1990-12-18 | 1990-12-18 | タンパク質溶液濃度の２次元測定方法および装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04216441A JPH04216441A (ja) | 1992-08-06 |
| JP2914758B2 true JP2914758B2 (ja) | 1999-07-05 |
Family
ID=18513063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2403315A Expired - Lifetime JP2914758B2 (ja) | 1990-12-18 | 1990-12-18 | タンパク質溶液濃度の２次元測定方法および装置 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5214288A (ja) |
| EP (1) | EP0491558B1 (ja) |
| JP (1) | JP2914758B2 (ja) |
| CA (1) | CA2057558C (ja) |
| DE (1) | DE69119568T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JP3094880B2 (ja) * | 1995-03-01 | 2000-10-03 | 住友金属工業株式会社 | 有機化合物の結晶化制御方法およびそれに用いる結晶化制御用固体素子 |
| GB9509410D0 (en) | 1995-05-10 | 1995-07-05 | Imperial College | Molecular imaging |
| JP4020539B2 (ja) * | 1999-06-29 | 2007-12-12 | ジーイーヘルスケア バイオサイエンス株式会社 | 水晶発振子を用いた液滴中の溶質濃度測定方法 |
| DE10036880A1 (de) | 2000-07-28 | 2002-02-07 | Basf Ag | Regelung einer Waschkolonne in einem Schmelzkristallisationsprozess |
| US6831746B2 (en) * | 2001-05-30 | 2004-12-14 | Sciperio, Inc. | System, method, and apparatus for non-intrusively determining concentration of a solute in a solution |
| WO2004005898A1 (en) * | 2002-07-10 | 2004-01-15 | Uab Research Foundation | Method for distinguishing between biomolecule and non-biomolecule crystals |
| JP4458513B2 (ja) * | 2003-08-18 | 2010-04-28 | 株式会社リガク | 特定高分子結晶の評価装置 |
| JP4113063B2 (ja) * | 2003-08-18 | 2008-07-02 | 株式会社リガク | 特定高分子結晶の検出方法 |
| DE102004005878A1 (de) * | 2004-02-05 | 2005-09-01 | Rina-Netzwerk Rna Technologien Gmbh | Verfahren zur Überwachung der Herstellung von Biomolekülkristallen |
| US7545495B2 (en) * | 2004-04-27 | 2009-06-09 | Abbott Laboratories | Methods for visualizing crystals and distinguishing crystals from other matter within a biological sample |
| US20050237522A1 (en) * | 2004-04-27 | 2005-10-27 | Swift Kerry M | Methods for visualizing crystals and distinguishing crystals from other matter within a biological sample |
| US20070088508A1 (en) * | 2005-09-28 | 2007-04-19 | Scott Childs | Cocrystallization methods |
| CN101511441B (zh) * | 2006-09-12 | 2012-02-22 | 苏舍化学技术有限公司 | 净化离子液体的方法 |
| US20080225265A1 (en) * | 2007-03-17 | 2008-09-18 | Mi Research, Inc. | Method and apparatus for finding macromolecule crystallization conditions |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3751167A (en) * | 1971-02-23 | 1973-08-07 | G Claus | Method and apparatus for continuous monitoring of dissolved organics |
| DE2741068A1 (de) * | 1977-09-13 | 1979-03-22 | Arnold Dipl Phys Dr Binder | Verfahren und vorrichtung zur diagnose an gewebeproben |
| US4192996A (en) * | 1978-07-12 | 1980-03-11 | Hewlett-Packard Company | Measurement of oxygen by differential absorption of UV radiation |
| US4587428A (en) * | 1980-09-29 | 1986-05-06 | Arnold Binder | Method and apparatus for the diagnosis of tissue samples |
| JPS5892841A (ja) * | 1981-11-28 | 1983-06-02 | Shimadzu Corp | 濃度計 |
| JPS62106000A (ja) * | 1985-10-30 | 1987-05-16 | Fujitsu Ltd | 生体高分子結晶自動作製装置 |
| US4845552A (en) * | 1987-08-20 | 1989-07-04 | Bruno Jaggi | Quantitative light microscope using a solid state detector in the primary image plane |
| US4919899A (en) * | 1988-02-29 | 1990-04-24 | Herrmann Frederick T | Crystal growth apparatus |
-
1990
- 1990-12-18 JP JP2403315A patent/JP2914758B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-12-17 CA CA002057558A patent/CA2057558C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-12-18 DE DE69119568T patent/DE69119568T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-12-18 EP EP91311730A patent/EP0491558B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-18 US US07/809,123 patent/US5214288A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｔ．ＡＺＵＭＡ ｅｔ ａｌ"ＣＬＵＳＴＥＲＩＮＧ ＰＨＥＮＯＭＥＮＯＮ ＡＮＤ ＧＲＯＷＴＨ ＵＮＩＴＳ ＩＮ ＬＹＳＯＺＹＭＥ ＡＱＵＥＯＵＳ ＳＯＬＵＴＩＯＮ ＡＳ ＲＥＶＥＡＬＥＤ ＢＹ ＬＡＳＥＲ ＬＩＧＨＴ ＳＣＡＴＴＥＲＩＮＧ ＭＥＴＨＯＤ"，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＣｒｙｓｔａｌＧｒｏｗｔｈ ９８，ｐ．３７１−３７６（１９８９） |
Also Published As
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|---|---|
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| CA2057558C (en) | 1995-01-03 |
| US5214288A (en) | 1993-05-25 |
| DE69119568T2 (de) | 1996-09-19 |
| EP0491558A3 (en) | 1992-11-19 |
| DE69119568D1 (de) | 1996-06-20 |
| EP0491558B1 (en) | 1996-05-15 |
| CA2057558A1 (en) | 1992-06-19 |
| JPH04216441A (ja) | 1992-08-06 |
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