JPS62184352A - オ−トラジオグラフイ−測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 く技術分野〉 本発明は、オートラジオグラフィーを利用する測定法に
係り、特にＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸由来物質の塩基配列
やその他の蛋白質などの情報を読取る新規なオートラジ
オグラフィー測定法に関する。

〈従来技術およびその問題点〉 近年、急激に発達して来た分子生物学においては、生物
体の機能や複製のメカニズムを解明するために、生物体
のもつ遺伝情報を明らかにすることが必須のこととなっ
ている。とりわけ、特定の遺伝情報を担うＤＮＡ　（も
しくはＤＮＡ断片物、以下同様）などの核酸の塩基配列
を決定することは必要不可欠なこととなっている。その
一つの方法としてオートラジオグラフィーが知られてい
る。

このオートラジオグラフィーを利用してＤＮＡの塩基配
列を決定する方法としては、サンガー・クールソン（Ｓ
ａｎｇｅｒ−Ｃｏｕｌｓｏｎ）法およびマキサム・ギル
バー）　（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法、が知られ
ている。これらの方法は、ＤＮＡが二重ラセン構造を有
し、かつ、その二重ラセンな形成する二本の鎖状分子の
間の結合が、その分子の構造単位である多数の塩基間の
水素結合に起因すること、そして、その多数の構成塩基
単位は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（
Ｃ）モしてチミン（Ｔ）の四種類の塩基のみからなり、
かつ各構成塩基単位の間の水素結合は、Ｇ−ＣおよびＡ
−Ｔの二種類の組合わせのみにおいて実現しているとい
うＤＮＡの特徴的な構造を巧妙に利用して、その塩基配
列を決定する方法である。

上記二重のうち、代表的にサンガー・クールラン法につ
いて簡単に説明する。

サンガー・クールラン法において、塩基配列を決定しよ
うとしている検体ＤＮＡと相補的なりＮＡ断片を合成す
るためには幾つかの方法があるが、基本的には一本３ｎ
の検体ＤＮＡを鋳型（テンプレート）とし、上記の四種
類の塩基を含むモノヌクレオチドトリフオスフェートの
存在下でＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）を作用
させることにより、検体ＤＮＡと相補的な種々の長さの
ＤＮＡ断片を合成する。このとき、一部のモノヌクレオ
チドトリフオスフェートに放射性標識が付与されたもの
を用いることにより、放射性標識された合成りＮＡ断片
（ＤＮＡ合成物）が得られる。

次に、この操作により得られる多数の合成りＮＡ断片か
らなるｆｕ合物をゲル？；ｔ２沫勤法により支持媒体上
に分離展開する。この支持媒体についてオートラジオグ
ラフィー操作を行うことにより、合成りＮＡ断片が分１
１１展開されてなる分ｍ展開列のオートラジオグラフを
得る。そして、このオートラジオグラフに基づいて、Ｓ
ｎ状分子の末端から順にその塩基配列を決定することが
でき、このようにして検体ＤＮＡのすべての塩基の配列
を決定することができる。

従来よりオートラジオグラフィーをＤＮＡ、ＲＮＡ等の
核酸由来物質の塩基配列やその他の蛋白質の情報の解析
に適用するに際しては、記録媒体としてＸ線フィルムが
用いられている。すなわち、放射性標識が付与されたＤ
ＮＡ等をゲル電気泳動法によりゲル膜等の支持媒体中に
一定時間分離展開し、このゲル膜にＸ線フィルムを密着
してＸ線フィルムにＤＮＡ等の放射線像を露光記録し、
その１ｋ　Ｘ線フィルムを化学処理してオートラジオグ
ラフを可視像として得、それを目視により判読して解析
する方法がとられている。

最近、上述のＸ線フィルムを用いるオートラジオグラフ
ィーに代わるものとして、蓄積性蛍光体シートを用いる
オートラジオグラフィーが提案された。このオートラジ
オグラフィーは放射性標識が付与されたＤＮＡ等をゲル
電気泳動法によりゲル膜等の支持媒体中に分離展開し、
このゲル膜に輝尽性蛍光体を担持する蓄積性蛍光体シー
トを密着して、輝尽性蛍光体にＤＮＡ等の放射線像を蓄
積・記録し、この蓄積性蛍光体シートを励起光をで２次
元的に走査して蛍光体を輝尽発光させ、これをフォトマ
ル等で受光して放射線像（オートラジオグラフ）を電気
信号として取出し、これを信号処理して解析するもので
ある（特願昭５８−２０　１　２３　１　　号−等　）
　。

この蓄積性蛍光体シートを用いる方法は、従来のｘ、！
！フィルムを用いる方法に比して、システム感度がきわ
めて高く、従って露光時間が著しく短縮される等、Ｘ線
フィルムを用いる方法に比べて多くの利点を有している
。

しかしながら、この蓄積性蛍光体シートを用いる方法に
は以下のような問題点がある。すなわち、この方法にお
いては露光済蓄積性蛍光体シートを励起光で２次元的に
走査し、この走査により生じる輝尽発光を受光しなけれ
ばならないので、そのための装置が複雑て高価となる。

また、ゲル膜等に放射性標識材′ｙ−物質を電気泳動さ
せ、この電気泳動終了後にシートへの露光が行われ、そ
の後シートの読取りが行われるので、電気泳動中の情報
をリアルタイムで検出することができない。

このため、スマイリング効果等の影響により高い測定積
度を実現することが困難である（リアルタイム検出が不
可能であることに基づくこの問題は従来のＸ線フィルム
を用いる方法についても言えることである）。

さらに、蓄積性蛍光体シートを、露光後読取装置にロー
ディングする工程が必要となり、自動操作工程とすれば
高価となり、手動操作とすればオペレーターが必要とな
る。

〈発明の目的〉 本発明の目的は、Ｂｆｔ＋１性蛍光体シートを用いるオ
ートラジオグラフィーによるＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸由
来物質の塩基配列やその他の蛋白質などの情報解析にお
ける前述したような問題点を解決し、蓄積性蛍光体シー
トにＤＮＡ等の放射線像を蓄積記録し、これを光電的に
読取って解析するに際し、シートを２次元的に走査して
読取りを行うための複雑高価な機構を必要とせず、電気
泳動中の情報をリアルタイムで検出でき、誤差が少なく
短時間で情報解析することのできるオートラジオグラフ
ィー測定法を提供するものである。

〈発明の構成〉 上述のように、従来ＤＮＡ等の塩基配列などの情報解析
は、放射性標識付与物質を一定時間泳動させた後の泳動
パターンに基づいて行われていた。

本発明者等は支持媒体中で一定時間電気泳動させた後の
泳動パターンを解析するのではなく、支持媒体中を泳動
中のパターンをリアルタイムで解析することができれば
、より短い時間で精度のよい情報が得られ、しかも泳動
パターンを２次元走査により光電的に読取るための複雑
な機構を省くことができるとの考えから本発明に至ワた
ものである。

すなわち、本発明は、基板間に挟持されたゲル層中にて
放射性標識が付与された物質を少なくとも１個の情報バ
ンドで構成される情報列として分離展開中の支持媒体に
、輝尽性蛍光体層を存する蓄積性蛍光体シートを装着し
、前記放射性標識を付与された物質からの放射線により
前記輝尽性蛍光体層を露光して放射線エネルギーを前記
蓄積性蛍光体シートに蓄積し、該シートの補記放射線エ
ネルギーが蓄積された輝尽性蛍光体層の少なくとも一つ
の放射線エネルギー情報分ｌ！！展開列に励起光を照射
してそこに蓄積されたエネルギーの一部を輝尽発光とし
て放出させ、該発光を光検知手段により受光し、この後
蓄積性蛍光体シートに残存する放射線エネルギーを、該
シートに消去光を照射することにより消去し、上記操作
を繰り返して、前記放射性標識が付恨された物質の前記
支持媒体中での分離展開中の情報を読取ることを特徴と
するオートラジオグラフィー測定法である。

この本発明の方法において、前記基板の内一方の基板を
他方の基板より薄く構成し、この薄い方の基板の側に前
記蛍光体シートを装着するのが好ましい。

また、励起光の照射は複数の励起光光源によって行うの
が好ましい。

さらに、励起光の照射は、励起光光源からの光を光偏向
手段により、蓄積性蛍光体シートに対して偏向させて行
なうのが好ましい。

また、励起光の照射はレーザーあるいは発光ダイオード
を励起光光源として行うのが好ましい。

さらに励起光の照射は、励起光光源と蓄積性蛍光体シー
トとの間に、励起光を集束させるための手段を設けて行
うのが好ましい。

以下に本発明を実施例により説明する。

本発明の方法は、−例として第１図に示す装置を用いて
行うことが好ましい。

中間ゲル層２２を基板２１．２３間に挟持した支持媒体
２を適切な位置に設置する。支持媒体２は、図示しない
適当な電極により電圧か矢印６方向に印加され、これに
より放射性標識が付与された物質は支持媒体２のゲル層
２２中を電気泳動により移動せしめられる。

支持媒体２に蓄積性蛍光体シート１が装置される。支持
媒体２のゲル層２２中を泳動する放射性標識骨！ｊ物質
からの放射線エネルギーが効率良くシートｌ中に蓄積さ
れるように、支持媒体２とシート１はできるだけ相互の
表面が近接するよう装着されることが好ましい。シート
１は、支持媒体２０基板２１側に装着してもよいし、基
板２３の側に装着してもよい。

シートｉ上の所望の部分を照射できるようシート１表面
から適当Ｚａ趙隔して励起光光源３を設ける。

励起光光源３からシー１−１上に照射された励起光によ
る励起により輝尽性蛍光体から放射される輝尽発光を受
光できる位置に光検出器４を設ける。

また、シート１　、ｈの所望の部分を照射できるよう消
去光光源５をシート１表面から適切路Ｓａして設け、励
起光照射による輝尽発光後のシート１に残存する放射線
エネルギーを放出させつるようにする。

シート１、励起光光源３、光検出器４、消去光光源５の
位置関係は、上記条件を満たすものであればいかなる位
置関係であってもよい。

本発明の方法は、第２図に示すように、支持媒体２中を
泳動する放射性標識が付与された物質の泳動速度と、放
射線エネルギーを輝尽性蛍光体中に蓄積する露光時間８
、読取励起光照射９、輝尽発光検知、消去光照射７のタ
イミングの調整により支持媒体２のゲル層２２中を泳動
する放射性標識が付与された物質の情報をリアルタイム
で測定する方法であるが、以下にシートｌ、支持媒体２
、励起光光源３、光検知器４．消去光光源５を各々説明
しその後にこれらを用いたリアルタイム測定のタイミン
グ調整を説明する。

（＋）蓄積性蛍光体シート 蓄積性蛍光体シートｌは放射線像変換パネルとも呼ばれ
るものであり、その例は、例えば特開昭５５−１２１４
５号公報、特願昭５７−１９３４１８号明細書などに記
載されており、一般的な構成として既に公知であるので
詳細な説明は省略する。

すなわち、蓄積性蛍光体シート１は輝尽性蛍光体層１２
を有するものであり、被写体を透過した放射線エネルギ
ー、あるいは被検体から発せられた放射線エネルギーを
該シートの輝尽性蛍光体に吸収（＃ｉ積）させ、そのの
ちに該シートを可視ないし赤外領域の電磁波（励起光）
を用いて励起することにより、該シートの輝尽性蛍光体
中に蓄積されている放射線エネルギーを蛍光（輝尽発光
）として放出させることができるものである。従って、
被写体あるいは被検体の放射線像は、この輝尽発光を光
電的に読み取って電気信号に変換し、得られた電気信号
を写５゛〔フィルムなどの記録材料、ＣＲＴなどの表示
装置上に可視画像として再生するが、あるいは数値化も
しくは記号化した位置情報などとして表わすことができ
る。

本発明のオートラジオグラフィー測定法において好適に
使用される蓄積性蛍光体シート１は、一般に基本構造と
して、ベースフィルム１１と、このベースフィルム１１
上に設けられた輝尽性蛍光体を分数状態で含有支持する
結合剤からなる蛍光体層１２と保護膜１３とから構成さ
れる。ただし、蛍光体層１２が自己支持性である場合に
は、必らずしもベースフィルム１１を設ける必要はない
。

ベースフィルム１１としては、従来の放射線写真法にお
ける増感紙（または増感スクリーン）の支持体として用
いられている各種の材料から任意に選ぶことができる。

そのような材料の例としては、セルロースアセテート、
ポリエチレンテレフタレートなとのプラスチック物質の
フィルム、アルミニウム箔などの金属シート、通常の紙
、バライタ紙、レジンコート紙などを挙げることができ
る。

なお、ベースフィルム１１の蛍光体層１２が設けられる
側の表面には、接着性付与層、光反射層、光吸収層など
が設けられていてもよい。

蓄積性蛍光体シート１は規格化されたものを用いてもよ
いが、従来支持媒体中を一定時間泳動後に露光する際に
用いるシートに比べて泳動中の情報をリアルタイムで検
出できるので、電気泳動方向であるＸ方向には短い巾の
（例えば２０ｃｍ〜３０ｃｍＸ　１　ｃｍ〜１０ＣＤＩ
等）シート１でよい。

本発明において利用される蓄積性蛍光体シート１に用い
られる輝尽性蛍光体は、先に述へたように放射線を照射
した後、励起光を照射すると輝尽発光を示す蛍光体であ
るが、実用的な面からは５５０〜８５０ｎｍの波長範囲
の励起光によって３００〜５００ｎｍの波長範囲の輝尽
発光を示す蛍光体であることが望ましい。そのような輝
尽性蛍光体の例としては、米国特許第３，８５９゜５２
７号明細吉、特開昭５５−１２１４２号公報、同５５−
１２１４３号公報、同５５−１２１４４号公報、同５５
−１２１４５号公報、同５５−１６００７８号公報、同
５６−１１６７７７号公報、同５７−２３６７３号公報
、同５７−２３６７５号公報、特願昭５６−１６７４９
８号明細書、同５７−８９８７５号明細書、同５７−１
３７３７４号明細書、同５７−１５８０４８号明細書、
同５７−１６６３２０号明細書、同５７−１６６６９６
号明細書、同５７−１８４４５５号明細書などに記載さ
れているものを代表例として挙げることができる。

（２）支持媒体 支持媒体２は放射性標識が付与された物質を電気泳動法
などにより分離展開するのに用いられるものである。

支持媒体２の構成は種々あるが、その好適例を第１図に
示す。

支持媒体２は透明な媒体であって、挟持基板２３、中間
ゲル層２２、挟持基板２１の三層で構成するのが好まし
い。中間ゲル層２２は放射性標識が付！ｊ、された物質
を分離展開する媒体でありポリアクリルアミド８％ゲル
で構成される。基板２３、基板２１は中間ゲル層２２の
表面保護と支持を行うものでＰＥＴ等の透明樹脂やガラ
スで作製される。

本発明においては、後に述へるように支持媒体２あるい
は蓄積性蛍光体シート１を介し゛て励起光の照射、輝尽
発光の受光および消去光の照射を行うので、基板２３お
よび基板２１は光の不必要な拡散を防ぐために透明ガラ
スあるいは透明樹脂製であるのが好ましく、蓄積性蛍光
体シート１と接する一方の基板２３は他方の基板２１よ
り薄く構成するのが好ましい。蓄積性蛍光体シート！と
接する基板２３が厚すぎると中間ゲル層２２中で分離展
開されている放射性標識付与物質からの放射線エネルギ
ーを輝尽性蛍光体中に蓄積する際に放射線エネルギーが
基板２３により吸収されてしまい放射線エネルギーが輝
尽性蛍光体中に充分蓄積されないからである。基板２１
のＪ″Ｊ、みはできるだけ薄い方がよいが基板としての
機械的強度を持つ厚みであることが必要である。

支持媒体２の一方の端部（通常は上端部）においては、
中間ゲル層２２が切り欠かれて複数のスロット１５が形
成される。このスロット１５は放射性標識が付与された
物質をピペット等により中間ゲル層２２中に適当量注入
するためのものである。なお、中間ゲル層２２の端面を
切り欠いてスロット１５を形成する代わりに、櫛状部材
を中間ゲル層２２の端面に軽く突き差すことによりスロ
ット様の空間を設けてもよい。

上記スロット１５より注入された検体ＤＮＡは電圧の印
加により電気泳動操作が行われ、スロット１５ごとに検
体ＤＮＡが分Ｍ　Ｊｉｌ開される。この分′ＩＩＬＪｉ
？開されたＤＮＡ情報列は、後述するように分離展開と
同時に蓄積性蛍光体シートに放射線エネルギー蓄積像と
して転写される。したがって、以後の説明においては、
理解し易いように、電気泳動方向をＸ方向とし、これに
直交するスロットの配列方向をＹ方向として説明する。

なお、支持媒体２としては、上記電気泳動ゲル膜が最も
好ましいが、これに限られるものではなく、クロマトグ
ラフなど放射性標識が付与された物質を分離展開可能な
ものであれば何でもよい。

支持媒体２と蓄積性蛍光体シート１の密着は航速のよう
に支持媒体挟持基板２３と蓄積性蛍光体シート保護膜１
３を介して行われるので、中間ゲル層２２と蛍光体層１
２の実質的間隔はできるだけ近接させることが好ましい
。この間隔が大きいと中間ゲル層２２中に分離展開中の
放射性標識物質から放射される放射線エネルギーが蛍光
体層１２に届くまでに吸収されてしまうからである。

支持媒体２面上への蓄積性蛍光体シートを密着させるＸ
方向位置は、隣接する放射性標識を有する情報バンド間
の識別が可能な距離（ＤＮＡ＠基配列の場合では一塩基
差）が例えば０．６ｍｍのところ、あるいはこれより情
報間の間隔が大きくなる位置とするのが好ましい。しか
し、あまりバンド間の距離が大きいところで測定しよう
とするとその位置までの電気泳動時間が長くなるので、
その距離は適当に決定される。

また、支持媒体２面上への蓄積性蛍光体シート！密着位
置は適切な範囲で移動可能にしておき、情報の周期とサ
ンプリング周期、放射性標識付与物質から放射される放
射線の強度、蓄積性蛍光体シートの感度等に応じて測定
中に適切位置に移動できることが好ましい。

（３）励起光光源 励起光光源３は、支持媒体２中の放射性標識が付与され
た物質からの放射線エネルギーを吸収した輝尽性蛍光体
を輝尽発光させ得る光を放射するものであればいかなる
光源であっても良い。

好適な例としては、レーザーが挙げられ、特に５１程度
のｔｌ　ｅ　−Ｎ　ｅレーザーが光特性などの上で最も
好ましい。また、発光ダイオード（例えばスタンレー製
）１−２に型；ビーク波゛長６８０ｎｍ、出力６ＩＤＷ
）を用いるのも好ましい。

励起光の照射は、支持媒体２側から行ってもよいし、蓄
積性蛍光体シートｉ側から行ワてもよい。

励起光光源の照射方法によって、ｒＢ−光源および複数
光源のいずれを用いてよいが、ＤＮＡの塩Ｊ＆配列の解
析におけるオートラジオグラフィーでは、「Ａ（アデニ
ン）」、「Ｇ（グアニン）」、「Ｔ（チミン）」、「Ｃ
（シトシン）」の４種の塩基に対応する情報が必要なの
で、それぞれの塩基に対応する試料を入れた４木のスロ
ットについての情報を同時に検出できれば非常に有効で
あり、このため第３図に示すように４コの励起光光源、
すなわち「Ａ」塩基試料を分離展開中のスロット用励起
光光源３１、ｒＱＪ塩基試料を分離展開中のスロット用
励起光光源３２、「Ｔ」塩基試料を分離展開中のスロッ
ト用励起光光源３３、「Ｃ」塩基試料分離展開中のスロ
ット用励起光光源３４等の複数の励起光光源を設け、そ
れぞれの励起光による輝尽発光を個別に受光する光検知
器４をそれぞれ設ければ、４本のスロットにおける４つ
の塩基に関する情報が同時にえられる。

また各スロット毎に設けた励起光光源で各スロットを順
次経時的に照射し、１個の光検知器４で全スロット一括
受光する構成とすれば、複数のスロットにおける複数の
塩基に関する情報を経時的に測定することができる。

また、複数の励起光光源を用いずに、単一の励起光光源
をＡＯＤ　（音響光学偏光素子）ガルバノメーターミラ
ー等の光偏向手段により、経時的にＹ方向に偏向し、各
スロットに励起光を順次振り分けることによって読取を
行って複数スロットの情報を測定するようにしてもよい
。また、Ｙ方向に連続して偏向する励起光により各スロ
ットの間をも照射してスロット位置を検出することもで
きる。

励起光光源と蓄積性蛍光体シートとの間に、励起光を集
束させるための手段を設け、読取分解能を上げるように
してもよい。この励起光集束手段としては、励起光光源
３から適当位置に配設した集光レンズ等が挙げられるが
、蓄積性蛍光体シート保護膜１３上に設けたＡｎまたは
Ｃ「等の金属蒸着膜に読取用開口部をあけて読取サンプ
リングサイズの限定を行うようにしてもよい。この読取
用開口部は全スロットに渡って連続のものを設けてもよ
いが、各スロットごとに設けるのが好ましい。

読取サンプリングサイズについて述べると、泳動方向の
幅（×方向）はＤＮＡ塩基配列決定の場合１１００ｔｉ
〜２００μｍが好ましい。ＤＮＡ塩」、し配列決定用電
気泳動パターンの観測結果では、一般にＤＮＡの特定の
塩基数に対応する一個の情報バンドは支持媒体内で泳動
方向く×方向）に１００μｍ〜２００μｍ程度の広がり
を持っている。−・方泳動パターンの目視分解能（隣接
バンド間の距離の最小値）は１００μ山程度であるから
蓄積性蛍光体シートの分解能を考慮して、１００μ−未
満の分解能は不要である。２００μｍを越えると隣接バ
ンドとのクロストークが増大する。

泳動方向と直角方向（Ｙ方向）の幅はスロット幅以下〜
０．５　ｏｎ＋以上とすることが好ましい。泳動用スロ
ット幅より広すぎると隣接スロットとのクロストークが
発生する。しかしながら、サンプリングサイズはある程
度広幅の方が輝尽発光量を多く検出できるし、ノイズ（
放射線エネルギーカンタムノイズ、蛍光体層粒状ノイズ
等）を平均化できてスムーズな信号プロファイルが得ら
れるので、０．５ｍｍ以上の幅とするのが好ましい。

（４）光検知器 光検知器４としては蓄積性蛍光体シート１上に照射され
た励に光による輝尽性蛍光体からの輝尽発光を受光して
電気信号に変換するものであればいかなるものであって
も良い。代表例として光電管、光電子増倍管などを挙げ
ることができるが、イ８号増幅能力を有する光電子増倍
管を用いるのが好ましい。

複数のスロットからの励起光を一括受光するためには浜
松ホトニクス製光電ｒ増倍管Ｒ８７７（［１径１２７ｍ
ｍ）等が好ましい。

また光検知器４に強力な消去光が入射しないように、消
人光照射時に閉じるメカニカルシャッターや液晶光バル
ブ等のエレクトロニクスシャッターを設けるのが好まし
い。

（５）消去光光源 消去光光源５は、読取後に輝尽性蛍光体中に残存してい
る放射線エネルギーを放出させ得る光を照射するもので
あればいかなるものであってもよい。消去は１例として
ハロゲンランプ、キセノンフラッシュランプからの光を
１００ミリ秒ａ　Ｍ　ｈｅ性蛍光体シートに照射し、全
スロット一括して行うのが好ましい。消去光照射は支持
媒体２側から行っても蓄積性蛍光体シート１側から行っ
てもよいが、励起光照射および輝尽発光検出側とは反対
側から行えば、励起光光源３および光検知器４に対して
消去光光源５設置位置を自由に選定することができて好
都合である。

支持媒体中を電気泳動する放射性標識付与物質の放射線
エネルギーの蓄積（露光）の前にあらかじめ蓄積性蛍光
体シート１に消去光を照射し、シートに蓄積されている
放射線エネルギーを放出させておくのが好ましい。また
、露光、励起光照射、輝尽発光検出の一サンプリング周
期終了後は再び消去光を照射し、蓄積性蛍光体シートｌ
中に残存する放射線エネルギーを放出させる。

（６）放射性標識物質の泳動速度、蓄積性蛍光体シート
への露光時間、励起光照射、光検知、消去光照射のタイ
ミング調整 放射性標識付与物質の泳動速度は、物質の種類や試料調
整法等によって大きく異り、したがって測定周期等のタ
イミング調整も取扱う物質によって大きく異る。以−Ｆ
の説明はＤＮＡ塩基配列決定の場合を一例としてタイミ
ング調整を述べるもので、他の放射性標識付与物質を試
料として取扱う場合は、それぞれの条件を考慮してタイ
ミング調整することが必要である。第２図に消去光照射
７−″Ｒ光時間８−励起光照射９のタイミング調整を模
式的に示した。第２図では４つの励起光光源を順次点燈
し１個の光検知器で一括受光する場合を示した。

■放射性標識付与物質の泳動速度 ＤＮＡ塩基配列決定に′おいては、Ｍ−！３法やＭ−Ｇ
法等の試料調整法があるが、ＤＮＡ断片長（構成塩基数
）により泳動速度が異なり、泳動距離、−塩基差情報バ
ンド間距離等もＤＮＡ艮（塩基数）に依存する。

検体ＤＮＡにプラスミドＰＢＲ３２２を用い、Ｍ−１３
法によりえられた放射性試料をポリアクリルアミド８％
ゲル膜を支持媒体として、電圧１５００Ｖで電気泳動を
行った場合の各塩基長について、２時間後の泳動データ
を測定すると表１に示す結果かえられた。

表　　　　　　１ ＊・・・・推定値 ■必要な露光時間 リアルタイムで測定を行うためには、試料の移動中に蓄
積性蛍光体シートへの露光が充分性われうることが必要
である。Ｍ−１３法で塩基数の最小のものを例えば１５
塩基数と考えて対応する情報バンドの泳動速度は約１．
５時間で３５０ｍｍであるから、読取サンプリングサイ
ズ（Ｘ方向）を２００μｍとすると、上記の泳動バンド
がこのサンプリングサイズ幅を移動する時間は３．６秒
である。この時間がすなわち露光時間となる。大きな塩
基数のものはこれより長時間かかって移動するから露光
時間は３，６秒以上である。

一方［”　ＰＩを用いるＭ−１３法で容積性蛍光体シー
トの感度はＸ線フィルム直接露光の２０００倍以上であ
り、読取サンプリングサイズ０．２ｍｍ　Ｘｌ、０ｍｍ
の場合は、約２．７秒の露光で充分である。

以上の結果から、１５塩基のごく小さい塩基数（泳動速
度が最も速い場合）でも泳動時間内で充分蓄積性蛍光体
シートを露光しつる。

■励起時間 読取励起光光源にスタンレー製Ｈ−２に型（６８０ｎｍ
、　６　ｍＷ）を用いると、蓄積性蛍光体シート表面上
駒３ｍｍφ内に５ｍＷを集中できるので、パワー密度は
０．００５６Ｗ／（ユｆｌ１ｍ）２πである。

このパワー密度で輝尽性蛍光体の蓄積放射線エネルギー
の８０％を読出すに必要な照射時間は１００ミリ秒であ
る。実際には輝尽性蛍光体の蓄積放射線エネルギーの３
０％位読み出せば充分であるので、５０ミリ秒の照射と
する。

■消去時間 消去光は励起光に比して充分強力で波長的にもイｆ利な
選択が可能であるし、露光読取毎に毎回消失するので実
効的な消去効率はあがる。このため約１００ミリ秒の消
去光照射で充分である。

■サンプリング周期 上記■〜■を考慮して１例として 消去光照射０．１　ｓｅｃ十露光露光２％１ｓｃｃ＋励
起光照射０５ｓｅｃ ＋各操作移行時間０．１９ｓｅｃ　＝　２．６４ｓｅｃ
を１周期とするサンプリング周期にタイミング調整を行
うと、泳動速度の速い２０塩基長のものでも理論的には
読取サンプリングサイズ幅（０，２ｍｍ＝Ｘ方向）を通
過するのに少なくとも一回の読み出しが実行できる。

一方実際には蓄積性蛍光体シートによる泳動像の広がり
があり、一定の長さをもつＤＮＡ断片群（情報バンド）
のゲル層内での拡がり幅（Ｘ方向＝泳動方向）が最も狭
いものでもシートに露光されたときの露光像の拡がりは
約１ｍｍ程度以上に拡がっている（露光強度プロファイ
ル上にてピーク強度の１７１０に低下するところまでの
範囲をとる）。

従って、泳動中の情報バンド（ＤＮＡそのもの）がこの
露光拡がりに相当する距離だけゲル層中を移動する明間
中は読み取りを実行する意味かあり、従って読取サンプ
リングサイズ幅を通過するに要する泳動時間は約５倍と
なり、この時間内に実施てきる読取回数（サンプリング
回数）も約５倍となる。

以上のことは後に示す実施例による測定結果によっても
実証されている。

Ｍ−Ｇ法による試料調整の場合は、Ｍ−１３法の場合よ
り一般的には泳動速度が遅くなるので、その分だけ蓄積
性蛍光体シートへの露光時間が長くなる。Ｍ−Ｇ法での
放射性エネルギーの標識強度はＭ−１３の強度より一般
的には弱いので、露光時間を長くとることで強度の弱い
分をカバーすることができる。

〈実施例〉 検体ＤＮＡにプラスミドＰＢＲ３２２を用い［３２ｐ］
を用いたＭ−１３法で試料を調整し、得られた放射性試
料をポリアクリルアミド８％ゲル服で電圧１５００Ｖで
電気泳動により分離展開した。第１図に示す装置を用い
電気泳動中にリアルタイムで情報バンド検出を行った。

検出位置はＸ方向泳動距離１６０闘の位置で行った。サ
ンプリング周期は、 消去光照射０．１　ｓｅｃ＋露光２．３　ｓｅｃ＋励起
光照射０．０５ｓｅｃ＋各操作移行に要する時間の合計
０．１９ｓｅｃ　＝　２．６４ｓｅｃとした。

蓄積性蛍光体シートは、ＢａＦＢｒ　：　Ｅｕ２＋を輝
尽性蛍光体として用いた。励起光光源スタンレー製Ｈ−
２に型を用い、消去光光源はハロゲンランプを用い、光
検知器は浜松ホトニクス製光電子増倍管Ｒ８７７を用い
た。

用いた蓄積性蛍光体シートはＸ線フィルムによる直接露
光より２０００倍以上の感度があり、露光時間は２．３
秒で充分な信号かえられた。サンプリングサイズはシー
ト面上のＡＩ２蒸着膜にあけた読取用開口部とし、０．
２ｍｍ　Ｘ　１　ｍｍ程度とした。

各塩基長のＤＮＡ断片に関する各種特性は表２の如くで
あった。

表　　　　　　２ また、この場合の露光拡がり分（×方向約１ｍｍ）を泳
動する時間と、その時間内に実施した読取回数（サンプ
リング回数）の結果を表３に示す。

表　　　　　３ 以トのように、本発明のオートラジオグラフィー測定法
で充分精度良＜ＤＮＡの塩基配列測定をリアルタイムで
行うことができた。

第４図に４本のスロットにおける時間の経過による検出
信号を示す。第４図の検出信号からこの部分の塩基配列
はＡＧＴＣＣＡとなっていることが測定できた。

実施例２ 実施例１と同様の試料を用い、励起光照射をスロットご
とに設けた光源を経時的に点燈して行いサンプリング周
期を下記のように調整して１６スロツトを連続して順次
リアルタイムで測定することができた。

消去光照射（全スロット一括）　０．１ｓｅｃ＋露光２
．３ｓｅｃ＋励起光照射０．０５ｓｅｃ　Ｘ　１６＋各
操作移行時間０．０４ｓｅｃ　＝　３．２４ｓｅｃ〈発
明の効果〉 本発明のオートラジオグラフィー測定法は泳動中の放射
性標識が付与された物質の情報をリアルタイムで測定す
るのでＤＮＡ等の塩基配列決定等に用いると泳動速度の
遅い部分でも速い部分でも情報バンド間が精度の良い最
適間隔となる場所で測定でき、スマイリング効果等の誤
差も少ない位置で測定できるので測定精度が向上し誤差
の少ない測定をすることができる。

また、二次元走査機構を必要とせず、測定装置を静止し
たままであるいは一次元走査で測定が行えるので、装置
が簡易で安価である。

さらに、蓄積性蛍光体シートを露光後ローディングした
り読取ったりする工程がなく、測定時間と測定工程が効
率的である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のオートラジオグラフィー測定法の１
実施例に用いる装置を示す一部断面側面図である。 第２図は本発明方法のサンプリングタイミング調整を示
すグラフである。 第３図は本発明方法の別の実施例に用いる装置を示す一
部断面平面図である。 第４図は本発明方法による測定結果を示すグラフである
。 符号の説明 ！・・・蓄積性蛍光体シート、２・・・支持媒体、３・
・・励起光光源、　　　　４・・・光′検知器、５・・
・消去光光源、　　　　　６・・・電圧印加方向、７・
・・消去光照射、　　　　８・・・露光時間、９・・・
励起光照射、　　　　　ｌＯ・・・励起光、１１・・・
ベースフィルム、 １２−・・輝尽性蛍光体層、　　１３−・・保護膜、１
５−・・スロット、　　　　　２０・・・輝尽発光、２
１．２３−・・基板、　　　　２２−・・中間ゲル層、
３１．３２，３３．３４−・・読取励起光源特許出願人
　　富士写真フィルム株式会社ＦＩＧ、Ｉ ＦＩＧ、２ 糟　　　　聞 Ｆ　Ｉ　Ｇ、　３

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）基板間に挟持されたゲル層中にて放射性標識が付
   与された物質を少なくとも１個の情報バンドで構成され
   る情報列として分離展開中の支持媒体に、輝尽性蛍光体
   層を有する蓄積性蛍光体シートを装着し、前記放射性標
   識を付与された物質からの放射線により前記輝尽性蛍光
   体層を露光して放射線エネルギーを前記蓄積性蛍光体シ
   ートに蓄積し、 該シートの前記放射線エネルギーが蓄積された輝尽性蛍
   光体層の少なくとも一つの放射線エネルギー情報分離展
   開列に励起光を照射してそこに蓄積されたエネルギーの
   一部を輝尽発光として放出させ、該発光を光検知手段に
   より受光し、 この後蓄積性蛍光体シートに残存する放射線エネルギー
   を、該シートに消去光を照射することにより消去し、 上記操作を繰り返して、前記放射性標識が付与された物
   質の前記支持媒体中での分離展開中の情報を読取ること
   を特徴とするオートラジオグラフィー測定法。
2. （２）前記基板の内一方の基板が他方の基板より薄く構
   成されたものであり、この薄い方の基板の側に前記蓄積
   性蛍光体シートが装着されることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項に記載のオートラジオグラフィー測定法。
3. （３）前記励起光照射が、複数の励起光光源によって行
   われることを特徴とする特許請求の範囲第１項または第
   ２項に記載のオートラジオグラフィー測定法。
4. （４）前記励起光照射が、前記励起光光源からの光を光
   偏向手段により前記蓄積性蛍光体シートに対して偏向さ
   せて行われるものであることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項または第２項に記載のオートラジオグラフィー
   測定法。
5. （５）前記励起光照射が、レーザーを励起光光源として
   行われるものであることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項ないし第４項のいずれかに記載のオートラジオグラ
   フィー測定法。
6. （６）前記励起光照射が、発光ダイオードを励起光源と
   して行われるものである特許請求の範囲第１項ないし第
   ４項のいずれかに記載のオートラジオグラフィー測定法
   。
7. （７）前記励起光照射が、励起光源と前記蓄積性蛍光体
   シートとの間に、励起光を集束させるための手段が設け
   られて行われるものである特許請求の範囲第１項ないし
   第６項のいずれかに記載のオートラジオグラフィー測定
   法。