JPH011960A - Ｄｎａ塩基配列決定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子上の塩基配列決定装置に関する。

〔従来の技術〕

従来、遺伝子上の塩基配列決定はＤＮＡを放射性元素で
標識し、電気泳動により塩基長に応じて分離したパター
ンをオートラジオグラフィーにより読み取る事により行
なっていた。しかし、放射性元素を用いる煩雑さに加え
て手間のかかる難点があり、特開昭６０−２２０８６０
号公報に示すように蛍光標識を用いる手法が提案されて
いる。

蛍光標識を用いる方法では、光照射により蛍光の発しな
い無蛍光ガラスや石英のパイプ中あるいは板の間にゲル
を保持し、特定箇所に光を照射し−でそこを通過する蛍
光標＊ＤＮＡから発せられる蛍光を検出する。ゲル保持
剤に通常のガラスや高分子フィルムをゲル保持材に用い
るとこれらから蛍光が出るため背景光が強くなり検出感
度が低下する鷺点がある。塩基配列決定用のゲルの作製
はかなりの手間のかかる事であり、フィルム状の使い捨
てゲルが開発され使用され始めている。しかし、このゲ
ルは高分子フィルムでサンドイッチされ保持されており
、光検出用には使用できなかった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

光検出方式での分離ゲルは石英保持板を用いて測定のつ
ど作製する必要があり問題であった。

本発明の目的は、このような問題を解決するためになさ
れたもので、光検出型ＤＮＡ検出装置でも手軽な使い捨
てゲルが使用できるようにする事にある。

〔問題点を解決するための手段〕

上記目的は、泳動分に部と検出部を分離可能な構成にす
る事により達成される。すなわち、泳動分離部を使い捨
てゲル板で構成し、検出部を石英ガラスなどで保持され
たゲルで構成する事により達成される。

〔作用〕

電気泳動ゲルを測定のたびに作り直す手間はゲルを再利
用できれば解決する。ゲルを再利用する上で障害となる
のはゲル中に広く分布して保持された蛍光標、７ｇＩＤ
　Ｎ　Ａフラグメントである。そこで分離用ゲルと検出
用ゲルを分離可能とし、大部分の蛍光標識ＤＮＡフラグ
メントを保持している分離用ゲルとして使い捨てゲルを
用いればゲル作製の手間が省ける。検出部ゲルの光照射
位置を分離ゲルとの界面から１ｃｍ程度の所に取れば界
面から検出部の間に保持された残留蛍光標識ＤＮＡは、
試料泳動に先立って行なうプレラン中に検出ゲルト方に
泳動し測定に支障はおきない。

〔実施例〕

以下、本発明の一実施例を第１図により説明する。本発
明の装置はＤＮＡ分離検出部とデーター処理部とから成
っている。分離検出部はゲル保持板１２公離用ゲル２．
検出用ゲル３．バッファー槽４．励起光ｇ５．ミラー６
、段継ぎ部固定治具７、フィルターおよびレンズおよび
蛍光検出部９から成っている。分離用ゲル２と検出用ゲ
ル３はＢＢ’部で密着して１つＮＡフラグメントがスム
ーズに検出用ゲル３に流れるようにしである。測定しよ
うとするＤＮＡ試料１６を化学反応等により片方の末端
を蛍光ａ識し、他端がアデニン塩基Ａで終る試料群、チ
ミン塩基Ｔで終る試料群、シトシン塩基Ｃで終る試料群
、グアニン塩基Ｇで終る試料群の４種の試料群を作成す
る。第２図に示したように各試料群には種々の長さのＤ
ＮＡフラグメントが含まれる。これら試料１６は群毎に
泳動ゲル１７、別々の泳動路１８上に充填され泳動分離
される。短いフラグメント１３はど早く泳動するので一
定時間泳動後には第２図に示したように分離される。オ
ートラジオグラフィーではこのパターンを写真に転写し
、低い方からバンドを順次読む事により配列を決定する
。光検出では光で照射し、泳動を続行しながらそこを通
過する蛍光標識ＤＮＡから出る蛍光を観測する。短がい
ＤＮＡ断片から順次光照射領域に到達するので泳動レー
ンを識別してＡ、Ｇ、Ｃ５あるいはＴＤＮＡ断片群のう
ちどの群からの信号が区別し、Ｖｔ間と共に出現する信
号を迫ってゆけば塩基配列が決定できる。実施例ではフ
ィルムで保持された使い捨てゲル２の下部を一直線状に
切断し、検出部用ゲル３に端部を密着させて用いた。第
３図に示したように検出部２０は石英板１４とそれに保
持されたゲル３から成っている。ゲル３は石英板１４上
端部から２〜５ｍｍ下まで満たされており、フィルム保
持されたゲル２は二枚のガラス板あるいは熱電導の良い
金属などの板１に保持され、フィルムゲル端部は石英板
１４の隙間に挿入される。密着させた時気泡などが入る
のを防ぐため治具７を第３図（ｂ）のようにしてバッフ
ァー液を接合部にみたしておく事もできる。励起光源５
にはアルゴンレーザーを用いたが蛍光体に応じて他のレ
ーザーでも良い。レーザ光は石英板１４で保持されたゲ
ル３を横側面から、ゲル平面と平行に入射し、ゲル接合
部の５ｍ＋ｍ位下方を一様に照射する。直線状の蛍光像
はフィルターを通過した後、カメラレンズで蛍光検出部
９のイメージ増幅器上に結像され増幅された後にダイオ
ードアレーあるいはビジコンカメラ等を用いて検出され
る。フレームメモリ１０、計算機１１．出力機器で信号
処理される。

検出信号は時間と共に変化するがその様子を第４図に示
した。横軸は泳動板で光照射されている部分の横方同座
Ｆ（ｘ座標）でＡ、Ｇ、Ｃ，Ｔの断片群はそれぞれ別の
泳動路を取るので別のＸ位置にその信号が現われる。縦
軸は蛍光強度で斜軸は時間軸である。それぞれの群のピ
ークを与えるＸ点における蛍光強度の時間変化を取ると
第５図のようになり、出現するピークを順次読む事によ
り配列決定ができる。

本実施例では励起光を側面から入射させ、ライン上を照
射したが、レーザ光をスキャンする事もできる。更に検
出部に二次電子増倍管を並べたり、１つあるいは複数個
の二次電子増倍管をスキャンして信号を検出しても良い
。

１回目の泳動分離測定後は分離用ゲルを交換し１時間程
度予備泳動させて検出部ゲルに残留している試料を流出
させると共に泳動板内、特に接続部の塩濃度むらを除去
してから使用する。また、接合部から気泡などが入る事
を防止するため、実施例では接合部にバッファー液を保
持できるような枠を設けている。ＤＮＡを電気泳動分離
する場合、泳動距離を一定（通常１５ｃｍ〜３０ｃｍ）
にすると分離能はゲル濃度に依存する。長いＤＮＡを分
離するにはゲル濃度を高くした方が良いが、この場合空
間的な間隔はひろがらない、装置の分解能はレーザービ
ーム巾で決まるためＤＮＡバンド間隔がレーザービーム
幅（実施例では０　、５　＋＋ｎｏ）と同じになると２
つのバンドを識別できなくなる。

このような場合、検出部ゲル濃度を下げてＤＮＡ断片の
泳動速度を大きくＬ／、ＤＮＡ断片の空間的な間隔を大
きくして実質的な分解能を上げる事も可能である。更に
測定時の検出限界はゲルからの背景光で決まる。この大
きさはゲル濃度が低い方が小さくなるので高感度化にも
都合が良い、ただし、ゲルの無い状態にするとＤＮＡの
泳動速度が速くなりすぎて高感度が得られないことがあ
る。

〔発明の効果〕

本発明によれば１分離用ゲルに市販の使い捨てゲルを使
用できるのでゲル作製の手間が省ける利点がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例装置の概念図である第２図は
ＤＮＡ試料作製および塩基配列決定の原理図である。第
３図（ａ）は本発明によるゲル板接合部の拡大図で（ｂ
）はその変形例である。第４図は測定例であり、第５図
は測定例をもとにした配列決定例である。 図において、１・・・ゲル保持板、２・・・分離用ゲル
、３・・・検出用ゲル部分、４・・・バッファー漕、５
・・・励起用レーザ、６・・・反射ミラー、７・・・段
継ぎ部固定治具、８・・・フィルターおよびレンズ、９
・・・蛍光検出部、ｌＯ・・・フレームメモリ、１１・
・・計算機、１２・・・出力機器、１３・・・ＤＮＡバ
ンド、１４・・・光励起部（レーザー光路）、１５・・
・バッファー液。 １６・・・決定しようとするＤＮＡの塩基配列、Ｉ７・
・・泳動分離板、１８・・・試料注入ウェル、１９・・
・決定されたＤＮＡ塩基配列。 −じ 肴　Ｉ　目 一 β ｆＺ凹 （久）　　　　　　　　　　　　　　　　　（レノオＪ
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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、電気泳動ゲル部、励起光源、および蛍光検出器を有
   する電気泳動分離を用いたＤＮＡ塩基配列決定装置にお
   いて、上記電気泳動ゲル部を泳動分離部と検出部とから
   構成し、両者を独立に脱着可能としたことを特徴とする
   ＤＮＡ塩基配列決定装置。 ２、特許請求の範囲第１項記載の装置において、上記検
   出部のゲル保持板として無蛍光ガラスを用いた事を特徴
   とするＤＮＡ塩基配列決定装置。 ３、特許請求の範囲第１項記載の装置において、上記泳
   動分離部および検出部ゲルは平板型であり、複数の泳動
   帯を持ち、励起光がゲル側面から複数の泳動帯を同時に
   照射するように構成されていることを特徴とするＤＮＡ
   塩基配列決定装置。