JP2000298116A

JP2000298116A - サンプルローディングシート

Info

Publication number: JP2000298116A
Application number: JP2000020866A
Authority: JP
Inventors: Yuichi Enomoto; 友一榎本; Hisashi Hagiwara; 久萩原; Kazuyoshi Kurihara; 一義栗原; Toshio Yoshida; 敏雄吉田; Yusuke Miyazaki; 祐輔宮崎
Original assignee: Hitachi Electronics Engineering Co Ltd
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 1999-02-08
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2000-10-24
Also published as: US6376231B1

Abstract

(57)【要約】【課題】ＤＮＡサンプルの注入作業を大幅に軽減する
ことのできるサンプルローディングシートを提供する。【解決手段】ゲル電気泳動装置で使用される泳動板の
ゲル電解質層の所定の泳動路位置に被検体サンプルをロ
ーディングするためのサンプルローディングシートにお
いて、該シートを陽イオン交換クロマトグラフィー用ペ
ーパーから形成し、前記シートの少なくとも一方の主要
面の一部または全部に耐水性樹脂フィルムをコーティン
グする。ＤＮＡサンプルは一般的に、負電荷を帯びてい
るので、陽イオン交換クロマトグラフィー用ペーパーか
ら形成された本発明のサンプルローディングシートに容
易に吸収させることができる。本発明のサンプルローデ
ィングシートを泳動板にセットし、高電圧を印加する
と、サンプルローディングシートに吸収されたＤＮＡサ
ンプルはシートから離脱され、ゲル電解質層を介して泳
動される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ゲル電気泳動装置で使
用される泳動板のゲル電解質層の所定の泳動路位置に被
検体サンプルをローディングするためのサンプルローデ
ィングシートに関する。更に詳細には、本発明は、蛍光
標識を用いてＤＮＡの塩基配列を効率的に迅速に決定す
ることのできるＤＮＡ塩基配列決定装置などのゲル電気
泳動装置で使用される泳動板のゲル電解質層の所定の泳
動路位置に被検体サンプルをローディングするためのサ
ンプルローディングシートに関する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡ等の塩基配列を決定する方法とし
て、ゲル電気泳動法が広く実施されている。

【０００３】電気泳動する際に、従来は試料をラジオア
イソトープでラベルし、分析していたが、この方法では
手間と時間がかかる難点があった。更に、放射能管理の
点から常に最大限の安全性と管理が求められ、特別な施
設内でなければ分析を行うことができない。このため、
最近では、試料を蛍光体でラベルする方式が検討されて
いる。

【０００４】光を用いる方法では、蛍光ラベルしたＤＮ
Ａ断片をゲル中を泳動させるが、泳動開始部から、１０
〜７０cm下方に各泳動路毎に光励起部と光検出器を設け
ておき、ここを通過するＤＮＡ断片を順に計測する。例
えば、配列を決定しようとするＤＮＡ鎖を鋳型として酵
素反応（ダイデオキシ法）による操作で末端塩基種がわ
かった種々の長さのＤＮＡを複製し、これらに蛍光体を
標識する。つまり、蛍光体で標識されたアデニン（Ａ）
断片群，シトシン（Ｃ）断片群，グアニン（Ｇ）断片群
およびチミン（Ｔ）断片群を得る。これらの断片群を混
合して電気泳動用ゲルの別々の泳動レーン溝に注入し、
電圧を印加する。ＤＮＡは負の電荷を持つ鎖状の重合体
高分子のため、ゲル中を分子量に反比例した速度で移動
する。短い（分子量の小さい）ＤＮＡ鎖ほど早く、長い
（分子量の大きい）ＤＮＡ鎖ほどゆっくりと移動するの
で、分子量によりＤＮＡを分画できる。

【０００５】特開昭６３−２１５５６号公報には、レー
ザで照射される電気泳動装置のゲル上のラインと光ダイ
オードアレイの配列方向が電気泳動装置内のＤＮＡ断片
の泳動方向と直角となるように構成されたＤＮＡ塩基配
列決定装置が開示されている。

【０００６】図１４は該装置の構成を説明する模式図で
ある。図１４の装置では、光源７０から出たレーザ光は
ミラー７２で反射され、泳動板７４のゲル中の一定ポイ
ントに横から水平にレーザ光を照射する。ゲル中を泳動
してきた蛍光ラベルされたＤＮＡ断片７６がこの照射領
域を通過する際、このＤＮＡ断片から蛍光が順次放出さ
れる。このとき、蛍光放出の水平位置から末端塩基の種
類が、また、泳動スタートからの泳動時間の差から断片
の長さを、更に、発光波長で検体の識別ができる。各泳
動路からの蛍光はレンズ７８によりイメージインテンシ
ファイヤ８０の受光部８２で結像する。この信号は増幅
されて光ダイオードアレイ８４で電気信号に変換されて
計測される。計測結果をコンピュータ処理することによ
って各ＤＮＡ断片の配列を計算し、目的とするＤＮＡの
塩基配列を決定する。

【０００７】図１５に示されるように、泳動板７４は、
ガラス板８６と８８の間に、電気泳動用ゲル（例えば、
ポリアクリルアミド）からなるゲル電解質層９０が挟装
されている。２枚のガラス板の長手方向両端部にはゲル
電解質層９０の厚さを規制するためのスペーサ９２が間
挿されている。ガラス板８８の上端部は、両端から幅方
向の中心に向けて若干の部分を除いて、所定の深さで幅
方向に切り欠かれている。この切り欠き部分９４はゲル
電解質層９０の上端をバッファ液と接触させるために設
けられている。泳動板全体の厚さは約１０ｍｍ程度であ
るが、ゲル電解質層９０自体の厚さは約０．３ｍｍ程度
である。ガラス板８８の切り欠き部９４の下端面９６と
大体同じ位置に、凹凸の櫛歯状のゲル電解質層上端が存
在する。この櫛歯の凹陥部７５内に蛍光物質で標識され
たＤＮＡ断片を注入する。

【０００８】このゲル電解質層上端の凹陥部７５に被分
析検体であるＤＮＡ断片が注入される。しかし、この凹
陥部７５の幅は約１．５ｍｍであり、深さは約５ｍｍ程
度しかない。凹陥部の間隔は２ｍｍ程度である。このた
め、検体はキャピラリのような微小なガラス管を用いて
凹陥部７５内に注入しなければならない。しかし、泳動
板のガラス板およびゲル電解質は何れも透明なため、凹
陥部７５の位置確認または判別が極めて困難であり、検
体の注入に失敗することが度々あった。

【０００９】このＤＮＡ断片のサンプル注入を支援する
ために、図１６に示されるようシャークコーム１１０が
開発され、使用されてきた。このようなシャークコーム
は例えば、特開平８−３２７５９６号公報に記載されて
いる。このシャークコーム１１０は一方の長手辺縁に複
数個の櫛歯１１３を有する。このシャークコーム１１０
は例えば、水膨潤性の素材（例えば、紙）から形成さ
れ、図１７に示されるように、シャークコーム１１０は
２枚のガラス板の間の隙間に、例えば、この泳動板７４
の上端側から挿入される。シャークコーム１１０の櫛歯
１１３の先端部を若干ゲル電解質層内に進入させる。シ
ャークコーム１１０がバッファ液に浸漬されると、櫛歯
１１３が膨潤し、２枚の泳動板の隙間を完全に閉塞す
る。その結果、隣接する櫛歯１１３同士が壁となり、空
間１１５により画成されるサンプル充填区画を隣接の区
画から隔離させることができる。

【００１０】図１８は図１７におけるXVIII−XVIII線に
沿った断面図である。図示されているように、泳動板を
構成する一方のガラス板８８の上端が長手方向に沿って
一部切り欠かれており、櫛歯１１３が所定の長さを有す
るので、ガラス板８８の切り欠き部９４の下端面９６と
の間に開口１１７が形成される。実際にサンプルを注入
する場合、作業者１３は泳動板ガラス越しに注入部位を
確認しながら、この開口１１７から、キャピラリ（毛細
管）又は平板チップなどの注入手段１１９の先端をサン
プル充填空間１１５内に差込み、液体状サンプル１２１
を注入する。このため、注入部位をガラス越しに確認す
ることが極めて困難であるばかりか、キャピラリなどの
極微量注入手段１１９の液詰まりが起こるなどの問題が
あった。マイクロピペットなどの注入手段が使用できれ
ば液詰まりの問題は起きないが、開口１１７の視認性が
非常に悪いことと、開口１１７が物理的に小さ過ぎるた
めに、マイクロピペットを使用することはできなかっ
た。

【００１１】ＤＮＡの塩基配列の決定には、ＤＮＡを構
成するアデニン（Ａ），グアニン（Ｇ），シトシン
（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を規則正しく検出する必要が
あるので、検体の注入失敗はとりもなおさず、分析結果
のエラーにつながりやすい。このため、検体の注入は細
心の注意を払いながら行わなければならず、作業能率を
大幅に低下させる原因にもなっていた。特に、泳動路の
うちの一つの泳動路へのサンプル注入の失敗は泳動板全
体について注入作業をやり直す羽目になるので、サンプ
ル注入を行う作業者の精神的及び肉体的疲労は無視でき
ないものがある。

【００１２】従って、本発明の目的は、ＤＮＡサンプル
の注入作業を大幅に軽減することのできる、ゲル電気泳
動装置用のサンプルローディングシートを提供すること
である。

【００１３】

【課題を解決するための手段】前記課題は、ゲル電気泳
動装置で使用される泳動板のゲル電解質層の所定の泳動
路位置に被検体サンプルをローディングするためのサン
プルローディングシートであり、該シートは陽イオン交
換クロマトグラフィー用ペーパーから形成されており、
前記シートの少なくとも一方の主要面の一部または全部
に耐水性樹脂フィルムがコーティングされていることを
特徴とするサンプルローディングシートにより解決され
る。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明のサンプルローディングシ
ートは陽イオン交換クロマトグラフィー用ペーパーから
形成される。分析すべきＤＮＡサンプルをこの陽イオン
交換クロマトグラフィー用ペーパーからなるサンプルロ
ーディングシートの所定位置に吸収させ、その後、この
シートをゲル電気泳動装置の泳動板に装着し、電圧を印
加して電気泳動を行う。従来はＤＮＡサンプルを泳動板
のゲル電解質層に直接注入していたが、本発明のサンプ
ルローディングシートを使用することにより、ＤＮＡサ
ンプルを泳動板のゲル電解質層に直接注入する作業は不
要になる。正確なメカニズムは未だ解明されていないの
で不明であるが、陽イオン交換クロマトグラフィー用ペ
ーパーは、蛍光標識されたＤＮＡサンプルの吸着性が低
く、電気泳動における電圧の印加により蛍光標識ＤＮＡ
サンプルが陽イオン交換クロマトグラフィー用ペーパー
からなるサンプルローディングシートから速やかに離脱
されるために、従来のようなゲル電解質層に蛍光標識Ｄ
ＮＡサンプルを直接注入して電気泳動する場合と同等の
分離能が得られるものと思われる。

【００１５】本発明で使用できる陽イオン交換クロマト
グラフィー用ペーパーは、例えば、一般的に市販されて
いる、ワットマン(Whatman)（登録商標）のグレードＰ
８１である。グレードＰ８１は本質的にリン酸セルロー
スからなる、厚さが約０．２３ｍｍの薄手パーパーであ
り、強陽イオン交換体である。イオン交換容量は１８．
０μＥｑ／ｃｍ²であり、吸水速度は１２５ｍｍ／３０
ｍｉｎである。言うまでもなく、グレードＰ８１以外の
陽イオン交換クロマトグラフィー用ペーパーも本発明で
同様に使用できる。

【００１６】図１は本発明のサンプルローディングシー
トの一例の平面図である。本発明のサンプルローディン
グシート１は、その片側に長手方向に沿って整列した複
数の櫛歯３を有する。櫛歯３の数は特に限定されない。
使用される泳動板の幅に応じて適宜決定することができ
る。

【００１７】図２は、本発明のサンプルローディングシ
ート１における櫛歯３の部分拡大平面図である。櫛歯３
は矩形状をしている。この形状以外に、台形状、三角錐
状などの形状も使用できる。本発明のサンプルローディ
ングシート１では、各櫛歯３がそれぞれの泳動路を画成
し、各泳動路は櫛歯３と櫛歯３との間の切欠き分離空間
区域５により、各泳動路が離隔され、隣接する各泳動路
間のコンタミネーション（汚染）が防止される。

【００１８】電気泳動の際に各泳動路に添加されるＤＮ
Ａサンプル量は約１．５μｌ〜４μｌ程度である。この
程度の量のＤＮＡサンプルを吸収するのに必要な櫛歯３
の面積は約９ｍｍ²〜２４ｍｍ²程度である。例えば、２
μｌのＤＮＡサンプルを吸収するには、少なくとも約１
２ｍｍ²程度の面積が必要である。従って、各泳動路に
添加されるＤＮＡサンプル量を参考にして、ＤＮＡサン
プルの吸収に必要な櫛歯３の面積を決定し、これに基づ
き櫛歯３の長さ（Ｌ₁）と幅（Ｗ₁）を決定すればよい。

【００１９】一例として、櫛歯３の長さＬ₁は３ｍｍ〜
１０ｍｍの範囲内であることができる。櫛歯３の長さＬ
₁が１０ｍｍ超の場合、櫛歯３が折れ曲がり易くなり、
サンプルローディングシート１の泳動板への装着が困難
になる。また、櫛歯３の幅Ｗ ₁は泳動路の幅ともなる
が、一例として、櫛歯３の幅Ｗ₁は１ｍｍ〜１０ｍｍの
範囲内であることができる。櫛歯３の幅Ｗ₁が１ｍｍ未
満の場合、サンプルロード作業が困難になるばかりか、
櫛歯３が折れ曲がり易くなり、サンプルローディングシ
ート１の泳動板への装着が困難になる。一方、櫛歯３の
幅Ｗ₁が１０ｍｍ超の場合、櫛歯３が折れ曲がり難くな
るので泳動板への装着は容易になるが、サンプルローデ
ィングシート１全体に配設される櫛歯３の総数が少なく
なり、一度に分析できるＤＮＡサンプル数が限定され、
分析作業の回数を増やさなければならなくなり好ましく
ない。櫛歯３と櫛歯３との間隔Ｄ₁は特に限定されな
い。ＤＮＡサンプルの注入作業を行う際に、櫛歯３と櫛
歯３を物理的に明確に区別でき、かつ、隣接する各泳動
路間のコンタミネーションを確実に防止できるような間
隔であればよい。図２に示されるような矩形状の櫛歯３
の場合、一例として、Ｌ₁＝６．５ｍｍ、Ｗ₁＝２．２ｍ
ｍ、Ｄ₁＝０．８ｍｍとすることができる。

【００２０】本発明のサンプルローディングシート１は
基本的に、吸水性の陽イオン交換クロマトグラフィー用
ペーパー材料（例えば、ワットマン(Whatman)（登録商
標）のグレードＰ８１ペーパー）から形成されている。
しかし、陽イオン交換クロマトグラフィー用ペーパーだ
けから形成されたサンプルローディングシートは吸水す
ると破れ易くなり、取り扱いが困難になる。このため、
サンプルローディングシート１の少なくとも一方の面に
耐水性樹脂又は撥水性樹脂フィルムをコーティングし、
サンプルローディングシート全体の機械的強度を高める
ことが好ましい。

【００２１】図３は、図２におけるIII−III線に沿った
概要部分断面図である。図３は、陽イオン交換クロマト
グラフィー用ペーパーからなるサンプルローディングシ
ート１へのコーティング部７の配設例を示す。（ａ）は
サンプルローディングシート１の一方の面にコーティン
グ部７が配設された実施態様を示す。（ｂ）はサンプル
ローディングシート１２の両方の面にコーティング部７
が配設された実施態様を示す。（ｃ）はサンプルローデ
ィングシート１の一方の面にコーティング部７が配設さ
れているが、櫛歯３の上面の先端寄り部分が露出された
実施態様を示す。コーティング部７はサンプルローディ
ングシート１の少なくとも一方の面の一部分（例えば、
櫛歯部分）又は全部に配設することごできる。

【００２２】コーティング部７は例えば、耐水性又は撥
水性を有する熱可塑性プラスチック樹脂又は疎水性塗料
（例えば、ワックス）を塗布することにより形成するこ
とができる。コーティング部７に使用できる熱可塑性プ
ラスチック樹脂は例えば、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリオレフィン、ナイロン、テフロン、塩化ビニ
ル、塩化ビニリデン、ポリブタジエン、アクリレート、
ポリスチレン、ＥＶＡ樹脂などである。その他の樹脂も
使用できる。コーティング部７の膜厚は特に限定されな
いが、陽イオン交換クロマトグラフィー用ペーパーとコ
ーティング部との合計厚さが０．３ｍｍ未満となること
が必要である。コーティング部７は無色透明でもよく、
あるいは、陽イオン交換クロマトグラフィー用ペーパー
の色（例えば、白色）と異なる色を有することもでき
る。

【００２３】図３の（ａ）及び（ｂ）に示されるように
櫛歯３の先端部までコーティング部７が配設されている
場合、サンプルローディングシート１の櫛歯３自体をＤ
ＮＡサンプルに浸漬させることにより、櫛歯３の側面の
非コーティング露出部分（カットエッジとも呼ばれる）
から、櫛歯３にサンプルを吸収させることができる。一
方、図３の（ｃ）に示されるように櫛歯３の上面の先端
寄り部分が露出されている場合、図４に示されるよう
に、陽イオン交換クロマトグラフィー用ペーパー２の露
出部９にマイクロピペット、マイクロシリンジ又はキャ
ピラリなどの液体注入手段１１を当接し、該注入手段１
１から適量のＤＮＡサンプルを、櫛歯３に吸収させる。
注入手段１１としては、液詰まりを起こし難くく、常に
定量の液体を吐出することができるマイクロピペットを
使用することが好ましい。このＤＮＡサンプル注入作業
はサンプルローディングシート１を水平な台（例えば、
机又はテーブルなど）（図示されていない）の上に置
き、作業者１３が露出部９を直接目視しながら行うこと
ができるので、従来のＤＮＡサンプル注入作業に比べ
て、作業性が飛躍的に向上する。

【００２４】図５は、本発明のサンプルローディングシ
ート１を泳動板７４にセットした状態の部分拡大正面図
である。サンプルローディングシート１は２枚のガラス
板の間の隙間に、例えば、この泳動板７４の上端側から
挿入される。サンプルローディングシート１の櫛歯３の
先端部がゲル電解質層９０の上端に接する程度の位置に
まで挿入する。斯くして、隣接する櫛歯３同士の間隔Ｄ
により、各櫛歯により形成される泳動路同士が分離され
る。図示されているように、泳動板を構成する一方のガ
ラス板８８の上端が長手方向に沿って一部切り欠かれて
おり、ガラス板８８の切り欠き部９４の下端面９６を越
えて上部バッファ液の液面９８を位置させると、上部バ
ッファ液はサンプルローディングシート１の露出面（す
なわち、非コーティング面）から迅速に吸収される。そ
の結果、サンプルローディングシート１の各櫛歯３に吸
収されていたＤＮＡサンプルはバッファ液により拡散さ
れる。従って、上下両バッファ液を介してゲル電解質層
９０に電圧を印加すると、再溶解されたＤＮＡサンプル
は各泳動路に沿って泳動板下部に向かって泳動してい
く。

【００２５】図６は、本発明のサンプルローディングシ
ート１の別の実施態様の部分概要平面図である。この実
施態様では、櫛歯３’は根本から先端に向けて細くなる
ようにテーパが付けられた略台形の形状をしている。こ
の台形状櫛歯３’の面積が、図２に示される矩形状櫛歯
３と同様に、約９ｍｍ²〜２４ｍｍ²程度になるように、
台形状櫛歯３’の長さＬ₂及び幅Ｗ₂を決定すればよい。
隣接する台形状櫛歯３’間には三角形状の切欠き分離空
間区域５’が存在する。台形状櫛歯３’の先端幅Ｗ₂と
間隔Ｄ₂は同一値でもよく、Ｗ₂よりも小さいか又は大き
いこともできる。一例として、Ｌ₂＝５ｍｍ、Ｗ₂＝３ｍ
ｍ、Ｄ₂＝２ｍｍとすることができる。

【００２６】台形状櫛歯３’の先端から櫛歯の終端まで
の適当な箇所まで耐水性樹脂又は撥水性樹脂フィルムが
コーティングされている。このコーティング部７の一部
は除去されて、露出開口部１０が設けられている。露出
開口部１０の露出面積は特に限定されない。ＤＮＡサン
プルの露出開口部１０への注入作業を容易に実施するこ
とができる程度の露出面積を有すればよい。露出開口部
１０の形状は図示された矩形形状に限定されない。円
形、台形、三角形など任意の形状をとることもできる。

【００２７】露出開口部１０の形成方法は特に限定され
ない。例えば、コーティング部７を例えば、グラビア印
刷などの印刷方法により形成すれば、露出開口部１０も
自動的に形成される。言うまでもなく、その他の開口部
形成方法も使用できる。しかし、印刷による形成方法が
最も効率的である。

【００２８】図７は、図６におけるVII−VII線に沿った
断面図である。図示されているように、コーティング部
７に配設された露出開口部１０内にマイクロピペット、
マイクロシリンジ又はキャピラリなどの液体注入手段１
１を挿入し、該注入手段１１から適量のＤＮＡサンプル
を、サンプルローディングシート１の台形状櫛歯３’に
吸収させる。別法として、台形状櫛歯３’をＤＮＡサン
プル液中に浸漬させることにより、台形状櫛歯３’にサ
ンプルを吸収させることもできる。

【００２９】図８は、本発明のサンプルローディングシ
ート１の更に別の実施態様の部分概要平面図である。こ
の実施態様では、台形状櫛歯３’の先端寄り部分を除い
て、シートの片面全体にコーティング部７が設けられて
いる。台形状櫛歯３’の先端寄り部分には、ＤＮＡサン
プルを吸収させるための露出部９’が配設されている。
この場合、露出部９’は耐水性樹脂フィルムにより包囲
されておらず、櫛歯３’の先端と側面の三面が露出され
ている。この実施例でも、耐水性樹脂のグラビア印刷に
より露出部を極めて容易に形成することができる。

【００３０】図９は本発明のサンプルローディングシー
ト１の更に別の実施態様の部分拡大平面図である。この
実施態様では、サンプルローディングシート１は櫛歯３
を有しない。図２及び図６に示される実施態様のサンプ
ルローディングシート１では、櫛歯３と櫛歯３との間に
切欠き分離空間５が存在するが、図９に示されるサンプ
ルローディングシート１では、コーティング部７に設け
られたＤＮＡサンプル注入露出開口部１２と隣接する露
出開口部１２とは間隔Ｄ₃で離隔されているだけであ
る。一つの露出開口部１０から注入されたＤＮＡサンプ
ルは紙内に吸収され、拡散することがある。図２又は図
６に示される実施態様のサンプルローディングシート１
では、櫛歯同士の間に物理的分離空間５又は５’が存在
するため、一つの櫛歯３又は３’から注入されたＤＮＡ
サンプルが紙内に吸収され、紙内で多少拡散されても、
隣接する櫛歯３又は３’にまで拡散することは絶対に無
い。しかし、図９に示されるサンプルローディングシー
ト１では、露出開口部１２と露出開口部１２とは一枚の
連続的な紙面上に形成され、露出部同士を相互に分離す
べき物理的空間が存在しない。従って、一つの露出開口
部１２から注入されたＤＮＡサンプルが紙内に吸収さ
れ、紙内を拡散しても、隣接する露出開口部１２から注
入されたＤＮＡサンプルとコンタミネーションを起こさ
ないようにするため、一つの露出開口部１２と隣接する
露出開口部１２との間隔Ｄ₃は、図２又は図６に示され
た櫛歯３又は３’同士の間隔Ｄ₁又はＤ₂よりも大きいこ
とが好ましい。一例として、Ｄ₃は２ｍｍ〜３ｍｍの範
囲内であることが好ましい。

【００３１】また、図９に示されるように、サンプル注
入場所を明示するための識別手段１７を紙面に配設する
こともできる。このような識別手段は例えば、印刷によ
り紙面に配設することができる。例えば、Ａ，Ｔ，Ｃ，
Ｇの４種類のＤＮＡを一群として、１〜ｎ群のサンプル
レーンを明示する数字や罫線などを印刷することができ
る。特に、露出開口部１０の上端に延びる縦罫線は、露
出開口部１０の位置を認識し易くすると共に、この縦罫
線に沿ってマイクロピペットなどの注入手段の先端を露
出開口１２の位置に当接させることにより、サンプル注
入作業を容易かつ迅速に行うことができる。また、横罫
線は各群の境界を識別するのに役立つ。数字や罫線など
の印刷は例えば、黒色インキなどの単色で施すこともで
きるし、各群毎に色を変化させて施すこともできる。な
お、左右両側の複数のレーンは、サンプルが垂直に泳動
されるようにするため、サンプルと同じ位の塩濃度の液
体（例えば、リアクションバッファ、ローディングダイ
及び水からなる液体）を注入するために使用することも
できる。

【００３２】図１０は、本発明のサンプルローディング
シート１の更に他の実施態様の部分拡大平面図である。
この実施例では、露出開口部１３がサンプルローディン
グシート１の下端辺縁に沿って配設されている。また、
図１０に示されたサンプルローディングシート１も、図
９に示されるシート１と同様に、サンプル注入場所を明
示するための識別手段１７を紙面に配設することができ
る。このサンプル注入場所を明示するための識別手段１
７は図１に示されたサンプルローディングシート１にも
当然配設することができる。

【００３３】図１１は本発明のサンプルローディングシ
ート１の更に別の実施態様の部分拡大平面図である。こ
の実施例では、シート１は非吸水性素材から形成されて
いる。非吸水性素材は例えば、撥水性または耐水性の紙
若しくはプラスチックなどである。撥水性または耐水性
の紙は例えば、撥水性又は耐水性合成紙などである。こ
のような合成紙は例えば、王子製紙（株）から「ユポ」
という商品名で市販されている。ユポはポリプロピレン
を主原料とし、これに無機充填材を加えて二軸延伸成膜
をした、いわゆる、フィルム法合成紙である。ポリプロ
ピレンは殆ど無極性であり、接着性に劣るので、金属塩
を配合することにより接着性を高めて原紙を作製し、フ
ィルムはその成形時に方向性を生じることがあるので、
それぞれ方向性を変化させ、３層積層させる。この合成
紙は耐水性に優れ、他の合成紙に比べて腰が強いという
特性を有する。シート１の一方の端面に沿って形成され
た複数の三角錐状の櫛歯３”の一方の上面には、吸水性
の陽イオン交換クロマトグラフィー用ペーパー片１９が
貼着されている。この部材１９は例えば、吸水性紙また
は高吸水性樹脂などから形成することができる。図１１
に示されるサンプルローディングシート１は、例えば、
非吸水性素材からなる長尺シートの一方の長尺端面に沿
って、所定の幅の陽イオン交換クロマトグラフィー用ペ
ーパーを貼着し、その後、この陽イオン交換クロマトグ
ラフィー用ペーパー部分を打ち抜き、櫛歯３”を形成す
ることにより作製することができる。

【００３４】図１２は、図１１におけるXII−XII線に沿
った断面図である。図示されているように、各櫛歯３”
の上面に存在する陽イオン交換クロマトグラフィー用ペ
ーパー片１９にマイクロピペット、マイクロシリンジ又
はキャピラリなどの液体注入手段１１を近づけ、該注入
手段１１から適量のＤＮＡサンプルを、陽イオン交換ク
ロマトグラフィー用ペーパー片１９に吸収させる。別法
として、三角錐状櫛歯３”をＤＮＡサンプル液中に直接
浸漬させることにより、三角錐状櫛歯３”の陽イオン交
換クロマトグラフィー用ペーパー片１９にサンプルを吸
収させることもできる。

【００３５】図１３は本発明のサンプルローディングシ
ート１を使用したＤＮＡ塩基配列決定装置の一例の概要
斜視図である。図１３に示されるように、本発明のサン
プルローディングシート１を使用したＤＮＡ塩基配列決
定装置２０は、暗室にすることのできる測定室２２を有
する。測定室２２の正面には、開閉可能な扉２４が配設
されていて、測定の際には測定室２２を密閉し、暗室に
することができる。泳動板７４は測定室内で泳動板ホル
ダ２６により垂直に保持される。上部バッファ槽２８は
この泳動板ホルダ２６により泳動板７４と一体的に保持
される。泳動板７４の下部は下部バッファ槽３０内に挿
入されている。従って、上部バッファ槽２８内にバッフ
ァ液が充填されると、泳動板７４の一方のガラス板の切
り欠き部から泳動板内のゲル電解質層と接触する。ま
た、下部バッファ槽３０内に緩衝液が充填されると、泳
動板のゲル電解質層の下端部は緩衝液に浸漬される。上
部緩衝液から泳動板間のゲル電解質層を経て下部緩衝液
に電気を通電するために、上部バッファ槽の電極３２を
接続する。同様に、下部バッファ槽にも電極３４を接続
する。クランプ機構３６により泳動板７４はホルダ２６
から着脱することができる。泳動板７４と直交する位置
にある側壁にはレーザ光照射端３８が設けられている。
レーザ光照射端の光軸が泳動板のゲル電解質層に一致す
るように、レーザ光照射端３８が配設されている。

【００３６】本発明のサンプルローディングシートは図
示された垂直泳動タイプのゲル電気泳動装置に限らず、
水平泳動タイプのゲル電気泳動装置及びサンプルローデ
ィングシートを使用するあらゆるタイプのゲル電気泳動
装置においても当然使用できる。また、レーザ光照射方
向は、図示されたような、泳動板の横方向の他に、泳動
板の正面又は背面あるいは斜め方向も使用できる。この
ようなレーザ光照射方向は全て当業者に公知である。

【００３７】

【実施例】以下、実施例により本発明のサンプルローデ
ィングシートの効果を例証する。

【００３８】実施例 (1)測定用サンプルの調製方法鋳型ＤＮＡｐＵＣ１８（２６８１塩基）１．５μｇと、
蛍光色素のTexas Red（Molecular Probe社の登録商標）
で標識されたＭ１３Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（塩基配
列：５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−
３’）４ｐｍｏｌを、ダイデオキシ法に基づくシーケン
シング試薬キット(Thermo Sequenasepre-mixed cycle s
equencing kit, アムシャムファルマシアバイオテク社
製）で反応し、塩基ＡＣＧＴの最終溶液量を各９μｌと
した。

【００３９】(2)測定用の泳動ゲルの準備泳動ゲル試薬組成は６％ＬｏｎｇＲａｎｇｅｒ（ＦＭ
Ｃ社の登録商標）、６．１モル尿素、１．２×ＴＢＥと
し、ＡＰＳ及びＴＥＭＥＤを加えた後、図１５に示され
るような、厚さ０．３ｍｍのスペーサを挟んだパイレッ
クス製ガラス板（縦３７ｃｍ×横２０ｃｍ×厚さ０．５
ｃｍ）２枚の間に注入し、ゲル化したものを使用した。
泳動用バッファ液の組成は０．６×ＴＢＥとした。予備
泳動（電圧１０００Ｖを印加し、１時間泳動）した後、
測定に使用した。なお、１０×ＴＢＥの組成は、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン８８３ミリモル、ホ
ウ酸８８６ミリモル、ＥＤＴＡ−２Ｎａ２５ミリモルで
あった。

【００４０】(3)サンプルのローディング本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー用ペーパーの
Ｐ８１の他、比較例として、陰イオン交換クロマトグラ
フィー用ペーパー（ＤＥＡＥセルロースペーパー）のＤ
Ｅ８１、通常の濾過用濾紙及びガラス繊維からなる各原
反を裁断し、図１及び図３（ｃ）に示されるような矩形
状の櫛歯を有するサンプルローディングシートを作製し
た。前記(1)で調製した蛍光標識ＤＮＡサンプルを塩基
ＡＣＧＴの順番で、各サンプルローディングシートのそ
れぞれの櫛歯先端にピペットで各１．５μｌ量ずつ滴下
し、各櫛歯内に吸収させた。これを図５に示されるよう
に、泳動板のゲル電解質層の上端に差し込んだ。同時
に、対照として、図１６に示されるような紙製のシャー
クコームを、図１７に示されるように、泳動板のゲル電
解質層上端から若干内部に進入させるように差し込み、
図１７に示される櫛歯間の空間１１５の下部１２１の部
位に、前記(1)で調製した蛍光標識ＤＮＡサンプルを塩
基ＡＣＧＴの順番で、各１．５μｌ量ずつポリカーボネ
ート製キャピラリを用いて注入した。

【００４１】(4)電気泳動及び蛍光検出前記(3)でサンプルローディングされた各泳動板を、図
１３に示されるような日立電子エンジニアリング社から
ＳＱ５５００の商品名で市販されているＤＮＡ塩基配列
決定装置に装着した。１４００Ｖの電圧を２分間泳動板
に印加した後、対照例の紙製シャークコームと、Ｐ８
１、ＤＥ８１、濾過用濾紙及びガラス繊維からなる各サ
ンプルローディングシートを泳動板から除去した後、１
４００Ｖの電圧で１０時間泳動した。サンプルのローデ
ィング位置からＨｅＮｅレーザ照射・蛍光検出ラインま
でのサンプルの泳動距離は２７．５ｃｍであった。

【００４２】(5)測定結果図１９（ａ）は対照例のラダーパターンを示す。このラ
ダーパターンに基づき、被検体である蛍光標識ＤＮＡサ
ンプルの塩基配列を決定し、対照基準とした。図１９
（ｂ）は本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー用ペ
ーパーからなるサンプルローディングシートを用いた場
合のラダーパターンを示す。図示されているように、本
発明の陽イオン交換クロマトグラフィー用ペーパーから
なるサンプルローディングシートを用いた場合、対照例
のラダーパターンと殆ど同等の分離能が得られることが
理解できる。このラダーパターンに基づく塩基配列決定
においても、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー
用ペーパーからなるサンプルローディングシートを用い
て決定された塩基配列は、対照例の塩基配列と完全に一
致していることが確認された。図１９（ｃ）は陰イオン
交換クロマトグラフィー用ペーパー（ＤＥ８１）からな
るサンプルローディングシートを用いた場合のラダーパ
ターンを示す。図示されているように、蛍光標識ＤＮＡ
サンプルは全く泳動されていない。この原因は、蛍光標
識ＤＮＡサンプルがＤＥ８１に強く吸着されていて、バ
ッファ液に浸漬され、高電圧を印加されても、ＤＥ８１
から全く離脱することができなかったためであると推測
される。図１９（ｄ）は通常の濾過用濾紙からなるサン
プルローディングシートを用いた場合のラダーパターン
を示す。図示されているように、蛍光標識ＤＮＡサンプ
ルはテーリングを起こし、十分な分離能が得られない。
この低分離能ではサンプルの塩基配列を決定することは
極めて困難である。この低分離能の原因は、通常の濾過
用濾紙の吸着力が強いために、サンプルローディングシ
ートがバッファ液に浸漬され、高電圧を印加されても、
蛍光標識ＤＮＡサンプルが濾紙から少ししか離脱されな
かったためであると推測される。図１９（ｅ）はガラス
繊維からなるサンプルローディングシートを用いた場合
のラダーパターンを示す。ガラス繊維からなるサンプル
ローディングシートは通常の濾過用濾紙からなるサンプ
ルローディングシートよりも更に低い分離能を有するこ
とが理解できる。ガラス繊維の吸着力のほうが、通常の
濾過用濾紙の吸着力よりも高いために、このような結果
になったものと推測される。従って、このガラス繊維か
らなるサンプルローディングシートは実際の分析には使
用できない。

【００４３】

【発明の効果】以上説明したように、本発明のＤＮＡ塩
基配列決定装置で使用するサンプルローディングシート
は陽イオン交換クロマトグラフィー用ペーパーから形成
されているので、ＤＮＡサンプルを確実に吸収させるこ
とができる。本発明のサンプルローディングシートにＤ
ＮＡサンプルを吸収させて泳動すると、従来のゲル電解
質層に直接ＤＮＡサンプルをローディングして泳動させ
たときと殆ど同等の分離能が得られる。更に、本発明の
サンプルローディングシートによれば、ＤＮＡサンプル
注入作業を極めて容易に、かつ、効率的に実施すること
ができる。例えば、本発明のサンプルローディングシー
トによればＤＮＡサンプル注入作業は、サンプルローデ
ィングシートを泳動板に挿入する前に、別のテーブル上
で極めて簡単に行うことができる。サンプルローディン
グに要する作業時間が大幅に短縮されたために、ＤＮＡ
塩基配列決定分析に要する全体的な作業時間も短縮さ
れ、分析作業のスループットを大幅に向上させることが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の、ＤＮＡ塩基配列決定装置における泳
動板に挿入して使用されるサンプルローディングシート
の一例の平面図である。

【図２】図１の矩形状の櫛歯を有するサンプルローディ
ングシートの部分拡大平面図である。

【図３】図２におけるIII−III線に沿った断面構造を示
す概要図であり、陽イオン交換クロマトグラフィー用ペ
ーパーからなるサンプルローディングシート１へのコー
ティング部７の配設例を示し、（ａ）はサンプルローデ
ィングシート１の一方の面にコーティング部７が配設さ
れた実施態様を示し、（ｂ）はサンプルローディングシ
ート１の両方の面にコーティング部７が配設された実施
態様を示し、（ｃ）はサンプルローディングシート１の
一方の面にコーティング部７が配設されているが、櫛歯
３の上面の先端寄り部分が露出された実施態様を示す。

【図４】図３（ｃ）に示されるサンプルローディングシ
ートの櫛歯の露出部分にＤＮＡサンプルを吸収させる状
態を示す模式図である。

【図５】図１に示されたサンプルローディングシートを
泳動板に挿入した状態を示す部分拡大平面図である。

【図６】本発明による台形状の櫛歯を有するサンプルロ
ーディングシートの一例の部分拡大平面図である。

【図７】図６におけるVII−VII線に沿った断面図であ
り、櫛歯の露出開口部から櫛歯にＤＮＡサンプルを吸収
させる状態を模式的に示す。

【図８】本発明による台形状の櫛歯を有するサンプルロ
ーディングシートの別の例の部分拡大平面図である。

【図９】本発明による櫛歯を有しないサンプルローディ
ングシートの一例の部分拡大平面図である。

【図１０】本発明による櫛歯を有しないサンプルローデ
ィングシートの別の例の部分拡大平面図である。

【図１１】本発明による三角錐状の櫛歯を有するサンプ
ルローディングシートの一例の部分拡大平面図である。

【図１２】図１１におけるXII−XII線に沿った断面図で
あり、櫛歯のＤＮＡサンプル吸収部にＤＮＡサンプルを
吸収させる状態を模式的に示す。

【図１３】本発明のサンプルローディングシートを使用
したＤＮＡ塩基配列決定装置の一例の概要斜視図であ
る。

【図１４】特開昭６３−２１５５６号公報に開示された
ＤＮＡ塩基配列決定装置の模式的構成図である。

【図１５】図１４に示された装置で使用される泳動板の
部分拡大斜視図である。

【図１６】従来のシャークコームの一例の平面図であ
る。

【図１７】図１６に示されたシャークコームを泳動板に
挿入した状態を示す部分拡大平面図である。

【図１８】図１７におけるXVIII−XVIII線に沿った部分
概要断面図であり、ＤＮＡサンプルをゲル電解質層上部
に注入する状態を模式的に示す。

【図１９】実施例で行われた各電気泳動により得られた
ラダーパターンを示し、（ａ）は従来技術に基づく対照
例によるラダーパターンであり、（ｂ）は本発明の陽イ
オン交換クロマトグラフィー用ペーパーからなるサンプ
ルローディングシートを用いて得られたラダーパターン
であり、（ｃ）は比較例としての、陰イオン交換クロマ
トグラフィー用ペーパーからなるサンプルローディング
シートを用いて得られたラダーパターンであり、（ｄ）
は比較例としての、通常の濾過用濾紙からなるサンプル
ローディングシートを用いて得られたラダーパターンで
あり、（ｅ）は比較例としての、ガラス繊維からなるサ
ンプルローディングシートを用いて得られたラダーパタ
ーンである。

【符号の説明】

１本発明のサンプルローディングシート３櫛歯５櫛歯と櫛歯との間の切欠き分離空間７コーティング部９露出部１０露出開口部１１サンプル注入手段１９陽イオン交換クロマトグラフィー用ペーパー片

フロントページの続き (72)発明者栗原一義東京都渋谷区東３丁目16番３号日立電子エンジニアリング株式会社内 (72)発明者吉田敏雄東京都渋谷区東３丁目16番３号日立電子エンジニアリング株式会社内 (72)発明者宮崎祐輔東京都渋谷区東３丁目16番３号日立電子エンジニアリング株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ゲル電気泳動装置で使用される泳動板の
ゲル電解質層の所定の泳動路位置に被検体サンプルをロ
ーディングするためのサンプルローディングシートであ
り、該シートは陽イオン交換クロマトグラフィー用ペー
パーから形成されており、前記シートの少なくとも一方
の主要面の一部または全部に耐水性樹脂フィルムがコー
ティングされていることを特徴とするサンプルローディ
ングシート。
【請求項２】前記シートはワットマン(Whatman)社か
らグレードＰ８１の商品名で市販されている陽イオン交
換クロマトグラフィー用ペーパーから形成されているこ
とを特徴とする請求項１に記載のサンプルローディング
シート。
【請求項３】前記シートの一方の端部には複数の矩形
状の櫛歯が形成され、前記櫛歯と櫛歯との間は空間によ
り離隔されており、前記櫛歯の平面部分の少なくとも一
部分が耐水性樹脂フィルムでコーティングされており、
前記櫛歯部分に液状の被検体サンプルを吸収させること
を特徴とする請求項１又は２に記載のサンプルローディ
ングシート。
【請求項４】前記シートの一方の端部には複数の台形
状の櫛歯が形成され、前記櫛歯と櫛歯との間は空間によ
り離隔されており、該櫛歯は根本から先端に向けて細く
なるようにテーパが付けられており、櫛歯の先端から根
本に至るまでの少なくとも一部分が耐水性樹脂でコーテ
ィングされており、該コーティング部分の一部の耐水性
樹脂フィルムが除去され、前記陽イオン交換クロマトグ
ラフィー用ペーパーの表面が露出された露出部が存在
し、前記露出部を介して前記櫛歯部分に液状の被検体サ
ンプルを吸収させることを特徴とする請求項１又は２に
記載のサンプルローディングシート。
【請求項５】前記シートの下方寄り部分の前記コーテ
ィングフィルムの一部が除去され、前記陽イオン交換ク
ロマトグラフィー用ペーパーの表面が露出された複数の
露出部が形成されており、前記露出部を介して前記シー
トの所定箇所に液状の被検体サンプルを吸収させること
を特徴とする請求項１又は２に記載のサンプルローディ
ングシート。
【請求項６】ゲル電気泳動装置で使用される泳動板の
ゲル電解質層の所定の泳動路位置に被検体サンプルをロ
ーディングするためのサンプルローディングシートであ
り、該シートは非吸水性素材から形成されており、該シ
ートの一方の端部には複数の櫛歯が形成され、前記櫛歯
と櫛歯との間は空間により離隔されており、該櫛歯の先
端から根本に至るまでの少なくとも一部には、陽イオン
交換クロマトグラフィー用ペーパー片が貼着されてお
り、前記陽イオン交換クロマトグラフィー用ペーパー片
部分に液状の被検体サンプルを吸収させることを特徴と
するサンプルローディングシート。
【請求項７】前記シートは撥水性または耐水性の紙若
しくはプラスチックから形成されており、前記陽イオン
交換クロマトグラフィー用ペーパー片はワットマン(Wha
tman)社からグレードＰ８１の商品名で市販されている
陽イオン交換クロマトグラフィー用ペーパーからなるこ
とを特徴とする請求項６に記載のサンプルローディング
シート。
【請求項８】前記ゲル電気泳動装置は、一方のガラス
板の上端部の一部が幅方向に切り欠かれた２枚のガラス
板の間にゲル電解質層を挟装してなる泳動板を収容する
測定室を有し、泳動板のゲル電解質層の下部および上部
を緩衝液に浸漬するための下部バッファ槽および上部バ
ッファ槽をそれぞれ有し、泳動板中の泳動路と直交する
ように、レーザ光を照射する光励起用のレーザ光照射手
段、レーザ光によって照射されたＤＮＡ断片から発生さ
れた蛍光を検出し電気信号に変換する蛍光検出手段とか
らなるＤＮＡ塩基配列決定装置であり、前記サンプルロ
ーディングシートは前記泳動板の上端部から泳動板の隙
間に挿入されて使用されることを特徴とする請求項１〜
７の何れかに記載のサンプルローディングシート。