JPH0572536B2 - - Google Patents

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JPH0572536B2
JPH0572536B2 JP59167812A JP16781284A JPH0572536B2 JP H0572536 B2 JPH0572536 B2 JP H0572536B2 JP 59167812 A JP59167812 A JP 59167812A JP 16781284 A JP16781284 A JP 16781284A JP H0572536 B2 JPH0572536 B2 JP H0572536B2
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electrophoresis
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excitation light
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Jiro Tokita
Tamotsu Shimada
Kenichi Watanabe
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416Systems
    • G01N27/447Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704Details; Accessories
    • G01N27/44717Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、DNAあるいはRNAなど生体関連物
質の分離・検出を行なう装置、特に、蛍光を検出
することによりこれら物質の塩基配列など構造解
析を行なう蛍光検出型電気泳動装置に関するもの
である。
〔発明の背景〕
DNAなどを構成する塩基の配列決定には、従
来、放射性リン(32P)でラベルする手法が広く
用いられている。(蛋白質・核酸・酵素Vol.32、
P182(1978))放射性ラベルを用いる方法では、
構造決定しようとするDNAなどの片方の末端を
32Pでラベルした後、制限酵素によつて各塩基の
部所に特異的な化学反応を起こさせて切断する。
この化学反応の反応率をコントロールすることに
より、末端に32Pを含み種々の長さを持ち、かつ、
切断端に特定の塩基を持つフラグメント(断片)
を作製することができる。これらは電気泳動によ
り分離され、写真乾板などにより検出される。こ
の手法では放射性元素を使用せねばならない難点
があり、放射性元素に代わり蛍光体でラベルし、
光学的に検出する方法が検討されている(昭和58
年度科学研究費補助金研究成果報告集:昭和59年
3月、PP20−25参照)。蛍光体を用いた場合には
バツクグランドをいかに減少させるか、およびい
かに効率良く蛍光体の付加したDNAなどを励起
するかが大きな問題点である。
蛍光体が付加したDNAバンド21を光で励起
し、発する蛍光を検出するには、第1図a,bに
示したような方法が行なわれる。すなわち、励起
光源6Aを出た光は、ガラス板1Aを通過し、ゲ
ル部3に照射される。更にガラス板1Bを通過し
て外部に放出される。ゲル部3の励起光路中に蛍
光体を付加したDNAフラグメントがあると、光
によつてフラグメントが励起され蛍光を発し、検
出器7Aで検出される。
しかし、この方法では、多数ある泳動路毎に光
源を備えるか、あるいは1つの光源から出る光を
ミラー等を用いて分割して各バンドを照射する必
要がある。この場合、1つのバンド当りの励起光
量が減少する上、装置が複雑になる難点がある。
また、蛍光体を付加したDNA以外に、泳動ゲル
を保持したガラス等による反射光および蛍光がバ
ツクグランドを与えてしまい高感度測定ができな
い難点があつた。
〔発明の目的〕
本発明の目的は、上記課題を解決するためにな
されたもので、バツクグランドを少なくし、か
つ、いくつもの励起光源を使うことなく、1つの
光源でいくつものDNAなどのバンドを実質的に
同時に励起し得る蛍光検出型電気泳動装置を提供
するものである。
〔発明の概要〕
バツクグランドは、主にゲルを保持している両
側のガラス板から出る蛍光および散乱光とゲル自
身の発する散乱光および蛍光である。そこで、本
発明はガラス起因のバツクグランド除去を目的と
し、そのために入射励起光を二枚のガラス板のす
き間からゲル平面に沿つて入射させ、蛍光を光路
と垂直方向から検出する点に特徴がある。これに
より、ガラス部で発生する蛍光を減じると共に散
乱によるバツクグランド増加を防いでいる。
〔発明の実施例〕
以下、本発明を実施例により説明する。
第2図および第3図は本発明による電気泳動装
置を模式的に示した図であり、それぞれ横断面図
と正面図である。
2枚の平板1A,1Bは、2枚のスペーサー2
A,2Bによつて一定距離だけへだてられて平行
に保持されている。ここで、スペーサー2A,2
Bは励起光に対して透明であり、平板1Bは透明
でも不透明でもよい。平板1A,1Bとスペーサ
ー2A,2Bで囲まれた空間にはポリアクリルア
ミドあるいはアガロースゲル3が満たされてい
る。平板1A,1Bの上下端には、それぞれ緩衝
液槽を介して2つの電極11A,11Bが取り付
けられており、両者の間には試料に泳動力を与え
るための泳動駆動電源12がつながれている。第
3図では試料は上下方向に泳動する。
泳動槽内に試料を注入すると試料は分子の大き
さの順序で、小さいものほど早く泳動される。泳
動は等電位線にほぼ垂直な泳動路に沿つておこ
る。すなわち、いろいろな大きさの分子を含む試
料はこの泳動路上を分子量の小さいものから順に
泳動されることになる。そこで試料分子を蛍光体
などでラベルし、泳動路上に励起光照射と蛍光検
出機能を具備させることにより試料分子を分子量
の小さいものから順に検出できることになる。こ
れを可能にするため、平板1A,1Bの側面のあ
る適当な箇所に、励起光源6Aが取り付けられて
いる。励起光源6Aにはレーザーや各種ランプが
用いられるが、いずれの場合も励起光はレンズ等
を用いて細く絞ると共に平行光15になるように
整形される。第4図にこの様子を示す。本発明の
よる励起光を泳動ゲルに導入するための光学系の
一実施例を第4図を用いて説明する。図は励起光
源、たとえばレーザ発振器6A、集光レンズ1
3、スリツト14で励起光学系を構成する。集光
レンズ13は、たとえば球面レンズあるいは円筒
レンズ(シリンドリカルレンズ)で良く、スリツ
ト14は遮光用の金属板で良い。これにより励起
光源6Aからのビームはゲル3の幅と等しいか、
狭い幅で入射させることが出来る。
なお、光束の直径が2枚の平板1A,1Bの間
隔より大きい場合にはスリツト等を用いてゲル部
分にだけ光が入射するようにする。入射光の発散
角が中央で最も細くなるようレンズで絞つて用い
られる。入射部のビームサイズが大きい場合に
は、ゲル厚よりも大きな部分はスリツト等で除去
して用いる。光は、かなりの率で反射される。す
なわち、2枚の平板1A,1Bで一種のオプテイ
カルガイドを形成するのので、ゲル照射効率を向
上させることができるとともに散乱光が検出部に
入るのを少なくできる。
DNAなどの塩基配列決定の場合には第3図に
示すようにいくつもの試料を同時に泳動させる。
この場合泳動方向と直角方向のゲル側面から光を
入射させる事により複数個の泳動路を同時に励起
することができる。各泳動路と励起光の交叉箇所
には蛍光検出器7A〜7Zが取り付けられてい
る。
励起光は側面から入射しゲル中を通過するがゲ
ル平面外に発散する光の成分はガラス板などのゲ
ル保持板で部分反射されながら反対側の側面まで
到達する。反対側の側面には反射ミラー20ある
いは別光源が設けてあり、励起効率を上げられる
よう工夫されている。
蛍光検出器の出力は増巾器8で増巾した後、デ
ータ処理装置9で処理し出力装置10により表示
あるいは打出される。
さらにけい光検出器の一実施例を第5図で説明
する。本発明ではDNAバンド21から発するけ
い光発光5は微弱なので、より多くのけい光を集
光するために、口径の広い集光レンズ17や凹面
状ミラー16が必要である。感度を上げるにはガ
ラス板1B側に発射される蛍光をミラーで集光す
ることも重要である。このような集光は本発明に
よる側面励起光入射で可能となる。蛍光以外の波
長の光はフイルター18により除去している。光
検出器19としては光電変換素子が用いられる。
また光検出器19は高感度の特性を有する2次電
子増倍光電管を使用することが望ましい。
〔発明の効果〕 本発明によれば、 (1) 励起光を必要部分にだけ有効に照射できるの
で検出器に入るバツクグランドを低減させるこ
とができ、ラジオアイソトープに代わつて蛍光
検出法を可能とする。
(2) DNAシーケンス決定の際にいくつものDNA
フラグメントバンドを励起することができ、多
種のDNAのシーケンス同時解析を可能にする。
【図面の簡単な説明】
第1図a,bは、各泳動路ごとに別々の励起光
源と光検出器を設けた従来の装置の横断面図と正
面図である。第2図および第3図は、本発明の一
実施例を示した横断面図と正面図である。第4図
および第5図は、それぞれ本発明による光学系の
一実施例を示す図である。 1A,1B……平板、2A,2B……スペーサ
ー、3……ゲル、4……励起光の光路、5……ケ
イ光の光路、6A,……6Z……励起光源、7
A,……7Z……光検出器、8……増巾器、9…
…データ処理装置、10……出力装置、11A,
11B……電極、12……泳動駆動電源、16…
…凹面状ミラー、21……DNAバンド。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 蛍光体で標識された試料が泳動するための泳
    動ゲルと、上記泳動ゲル中の試料に泳動力を付与
    するための泳動駆動手段と、上記試料を標識する
    蛍光体を励起するための励起手段と、光検出器と
    を具備する蛍光検出型電気泳動装置において、上
    記励起手段は光源からの励起光を、上記試料が泳
    動する上記泳動ゲルの成す平面に略平行の方向か
    ら上記泳動ゲルの特定部位に入射し、上記光検出
    器は、上記試料を上記泳動ゲルに泳動させなが
    ら、上記励起光の上記泳動ゲルの照射部位を泳動
    する上記試料を標識する蛍光体から発する螢光を
    検出することを特徴とする蛍光検出型電気泳動装
    置。 2 上記励起光を上記泳動ゲルの成す平面に略平
    行な一方向から上記泳動ゲルに入射させることを
    特徴とする特許請求の範囲第1項に記載の蛍光検
    出型電気泳動装置。 3 上記励起光を上記泳動ゲルの成す平面に略平
    行な上記泳動ゲルの相対する二つの方向から上記
    泳動ゲルに入射させることを特徴とする特許請求
    の範囲第1項に記載の蛍光検出型電気泳動装置。 4 上記励起光が上記試料の泳動方向と直角方向
    の上記泳動ゲルの側面より、上記泳動ゲルに入射
    することを特徴とする特許請求の範囲第1項に記
    載の蛍光型電気泳動装置。 5 上記励起光を実質的に上記泳動ゲル部分に照
    射するために、上記励起光が上記泳動ゲルに入射
    する部位にスリツトを配置することを特徴とする
    特許請求の範囲第1項に記載の蛍光型電気泳動装
    置。 6 上記励起光がレーザ光であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第1項に記載の蛍光型電気泳動
    装置。 7 蛍光体で標識された試料が泳動するための泳
    動ゲルと、上記泳動ゲル中の試料にほぼ一方向の
    泳動力を付与し、もつて複数の泳動路を形成する
    ための泳動駆動手段と、上記試料を標識する蛍光
    体を励起するための励起手段と、光検出器とを具
    備する蛍光検出型電気泳動装置において、上記励
    起手段は光源からの励起光を、上記試料が泳動す
    る上記泳動ゲルの成す平面に略平行の方向から上
    記泳動ゲルの特定部位に上記複数の泳動路と交叉
    する方向に入射し、もつて上記複数の泳動路を実
    質的に同時に照射し、上記光検出器は、上記試料
    を上記泳動ゲルに泳動させながら、上記励起光の
    上記泳動ゲルの照射部位を泳動する上記試料を標
    識する蛍光体から発する螢光を検出することを特
    徴とする蛍光検出型電気泳動装置。 8 上記励起光が上記試料の泳動方向と直角方向
    の上記泳動ゲルの側面より上記泳動ゲルに入射さ
    れ、上記励起光は複数の上記ゲル泳動路のすべて
    を、上記試料の泳動開始点からほぼ等しい距離だ
    け泳動した位置で横切り、上記励起光と上記ゲル
    泳動路の交叉する部位に泳動してくる上記試料を
    標識する蛍光体を実質的に同時に励起させて、交
    叉する上記部位に向かつて配置された光検出器に
    より、上記試料を標識する蛍光体から発する蛍光
    を実質的に同時に検出することを特徴とする特許
    請求の範囲第7項に記載の蛍光型電気泳動装置。 9 上記励起光がレーザ光であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第7項に記載の蛍光型電気泳動
    装置。 10 上記励起光を実質的に上記泳動ゲル部分に
    照射するために、上記励起光が上記泳動ゲルに入
    射する部位にスリツトを配置することを特徴とす
    る特許請求の範囲第7項に記載の蛍光型電気泳動
    装置。 11 上記泳動ゲルは、少なくとも一方が透明な
    二枚の平板の間に形成されたことを特徴とする特
    許請求の範囲第7項に記載の蛍光型電気泳動装
    置。
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