JPS62247252A - 核酸の塩基配列決定のためのオ−トラジオグラフ解析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野１ 本発明は、核酸の塩基配列決定のためのオートラジオグ
ラフ解析方法に関するものである。

［発明の背景］ 近年、急速に発達して来た分子生物学の分野においては
、生物体の機能や複製のメカニズムを解明するために、
生物体のもつ遺伝情報を１５１らかにすることが必須の
こととなっている。とりわけ。

特定の遺伝情報を担うＤＮＡ（もしくはＤＮＡ断片物、
以ｆ同様）などの核酸の塩基配列を決定することが必要
不可欠なこととなっている。

ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸の塩基配列を決定するための
代表的な方法として、オートラジオグラフィーを利用す
るマキサム・ギルバート（にａｘａｓ−Ｇｉｌｂｅｒｔ
　）法およびサンガー・クールンン（Ｓａｎｇｅｒ−Ｇ
ｏｕｌｓｏｎ）法が知られている。前者のマキサム・ギ
ルバート法は、まず、塩基配列を決定すべきＤＮＡある
いはＤＮＡ断片物の鎖状分子の一方の端部に３２　ｐ等
の放射性同位元素を含むノ＾を結合させて放射性標識を
付Ｊｊシたのち、化学的な手段を利用して鎖状分子の構
成単位（塩基中位）間の結合を１１！基特異的に切断す
る０次に、得られた塩基特異的ＤＮＡ切断分解物の混合
物をゲル゛ＩＩｆ気泳動法により支持媒体上に分Ｓ展開
し、多数の切断分解物がそれぞれ分ｇｌ展開されて形成
された分Ｓ展開パターン（ただし、視覚的には見ること
ができない）を得る。この分離展開パターンをたとえば
ＸＭフィルムＬにｒｉ（像化してそのオートラジオグラ
フを得、得られたオートラジオグラフと各々の塩基特異
的切断手段とから、放射性同位元素が結合された鎖状分
子・の端部から一定の位置関係にある塩）↓を順次決定
し、これにより対象物全ての塩基配列を決定するもので
ある。

また、後者のサンガー−クールノン法は、ＤＮＡあるい
はＤＮＡ断片物の鎖状分子と相補的であって２かつ放射
性標識が付午されたＤＮＡ合成物を化学的な手段を利用
して塩基特異的に合成し、得られた塩基特異的ＤＮＡ合
成物の混合物を用いてＬ記と同様にしてそのオートラジ
オグラフからに１１基配列を決定する方法である。

本出願人は、オートラジオグラフィーにおいてＬ記Ｘ線
フィルム等の写真感光材料を用いる従来の放射線写真法
の代りに、蓄積性蛍光体シートを用いる放射線ｇＬ変換
力法を利用する方法について既に特許出願している（特
開昭５９−８３０５７号、特願昭５８−２０１２３４壮
）、蓄積性蛍光体シートは輝尽性蛍光体からなるもので
あり、放射線エネルギーを、Ｖ蛍光体シートの輝尽性イ
は光体に吸収させたのち、ｆ＋ｆ視乃至赤外領域の電磁
波（紬起光）で励起することにより、放射線エネルギー
をｉｈ光として放出させることができるものである。こ
の方法によれば、露光１■ν間を大幅に短縮化すること
ができ、また従来より１．−１題となっていた化学カブ
リ等が発生することがない、さらに。

放射性標識物質のオートラジオグラフは、一旦放射線エ
ネルギーとして蛍光体シートに蓄積されたのち輝尽光と
して光電的に読み出されるから、直接にデジタル信−）
として得たのち適当な記録媒体に保存することができる
。

従来より、オートラジオグラフの可視画像は、放射性標
識が付与された核酸の塩基特異的切断分解物もしくは塩
基特異的合成物（以下、巾に核酸の塩）、（特異的断片
物と称する）が分離展開された支持媒体と１．−、＋；
感度Ｘ線フィルムとを一定時間屯ね合わせて、該フィル
ムを感光させることにより得られている。そして、核酸
の塩基配列は、フィルム」二に可視化されたオートラジ
オグラフから核酸の塩基特異的断片物の分離展開位置（
バンド）を視覚的に判断し、それらバンドの位ｌを相互
に比較することにより決定されている。

ここで、オートラジオグラフのｉｉｌ視画像画像通常、
放射性標識物質を含む支持媒体と放射線フィルムとを玉
ね合わせて露光することにより該フィルムにに得られる
放射性標識物質の放射！ａ像を、ｆｉ味し、たとえば第
１図に示すような画像である（なお、実際のフィルム上
にはＣ淡のある写真画像が得られる）、第１図は、放射
性標識が付与された核酸のＩｉ！基特異的断片物が電気
泳動によりゲル支持媒体上に凸刻に分離展開された泳動
パターンを示し、黒い帯状のバンドはそれぞれ塩基特異
的断片物の泳動部位を表わしている。上述の放射線像変
換方法を利用した場合にも、蓄積性蛍光体シートを光電
的に読み出して得られた電気信号を適当な変換手段を介
して写真フィルム等に画像化することにより、同様のオ
ートラジオグラフ像が得られる。なお、画像化する前に
この電気信号には種々の画像処理を施すことができ、こ
れによりオートラジオグラフ像を視覚的に一層解析しや
すくすることができる。

しかしながら、このようにして得られるオートラジオグ
ラフのＩｉｆ視画像画像、第１図に示すように、放射性
標識物質の二次元的な位置が主として表示され、放射線
強度（すなわち、これに比例する放射性標識物質の量）
について正確に把握することは殆ど不ζ１丁能である。

オートラジオグラフを解析してバンドの帰属を行なう際
においては具体的に、バンドの幅が広い場合にその真の
位置（強度のピーク位７１）を精確に判断することが難
しい、バンドの密な領域ではハンドの位置および数を精
確に判断することができないなどの聞届があり、核酸の
塩基配列決定を精度高くかつ情報量多くして行なうこと
が困難であった。

さらに、オートラジオグラフの解析を容易にするために
、オートラジオグラフに対応する電気信号に階調処理な
どの画像処理を施したのち画像表示する方法も試みられ
ているが、階調用グラフィックディスプレイなど特別の
表示装置を必要とし、解析コストが高いものとなってい
る。

なお１本出願人は、従来のｉ１？ｉ淡画像におけるこれ
らの問題点を軽減することを目的として、オートラジオ
グラフに対応するデジタル信号について信５′ｆ処理を
行なうことにより、各分離展開列について分離展開方向
に沿った位置と信号のレベルとからなる二次元波形を少
なくとも一つ得たのち。

これらの二次元波形を分離展開方向に垂直な方向に一定
間隔で多重表示することを特徴とするオートラジオグラ
フ表示方法（いわゆる鳥轍図として表示する方法）につ
いて既に特許出願している（特許１１／（６０−１８１
４３１号）。

［発明の要旨］ 本発明は、核酸の１１！基配列を高精度でかつ簡易に決
定することができるオートラジオグラフ解析方法を提供
するものである。

また、本発明は、オートラジオグラフの解析を容易かつ
安価にし、さらには放射性標識物質の！４的情報をも享
えうるオートラジオグラフ解析方法を提供するものであ
る。

すなわち１本発明は、放射性ｅ！識が付′トされた塩基
特異的ＤＮＡ断片物もしくはＲＮＡ断片物が支持媒体上
に一次元的方向に分ａ展開されて形成Ｊれた複数の分離
展開列のす−トラジオグラフを解析することにより、核
酸の塩基配列を決定する方法において、 ｌ）オートラジオグラフに対応するデジタル信−シーに
ついて信り処理を行なうことにより、各分離展開列につ
いて分離展開方向に沿った位置と信号のレベルとからな
る一次元波形を少なくとも一つ得る工程。

２）複数の一二次元波形を分離展開過程に対して前直な
方向に一定間隔をおいて多毛表示する工程、および ３）この多毛表示から決定された二次元波形の波高に関
する入力情報に基づいて、二次元波形の波高を変更して
表示する工程。

を含むことを特徴とする核酸の１１！ス（配列決定のた
めのオートラジオグラフ解析方法を提供するものである
。

末完ＩＪＪは、核酸の塩基配列決定においてオートラジ
オグラフを上記烏轍図によって表示する方法の改良に関
するものである。すなわち、本発明の力υ、においでは
、核酸の塩基特異的断片物のオートラジオグラフに対応
するデジタル信号を、０壮処理機能を有する適′５な信
−）処理回路を通すことにより、分ｇＩ展開パターンは
分離展開方向に沿った位置とその位置における放射線強
度（信号のレベル）とからなる多数の二次元波形として
得られ、これら二次元波形をある間隔を置いて多毛化し
て表示することによりオートラジオグラフが表現される
。次いで、この多重表示された二次元波形の波高（信号
レベル）を人力された情報に従って調節し、そして得ら
れた鳥轍図を解析することにより核酸の塩基配列決定が
行なわれる。

ここで、ｒ鳥轍図１とは多数の二次元波形を−一定１１
１Ｆ隔で多重に表示してなる図形をいう。

この鳥撤図によれば、分［＋開パターン七のニー次元の
位置（分離展開過程の位置とそれに東直な方向の位７１
）および放射線強度からなる三つの情報を、（ｘ　、　
ｙ　、　ｚ）の直角座標系に準じて三次元的に表わすこ
とができる。そして、横軸に分離展開方向の位置をとる
ことにより、異なる分離展開列間におけるバンドの位置
関係を−［１瞭然に表わすことができる。

従来のように得られたオートラジオグラフをそのまま白
黒のＣ淡画像として可視化した場合には、核酸の塩基特
異的断片物の位置は単に黒い帯状のバンドとして表示さ
れ、量的情報はバンドのｅ淡からしか推測することがで
きなかったが、本発明においては、二次元波形のピーク
の高さとして表わされるから精確に量的情報を得ること
ができる。また、バンドのピーク位置を精確に判断する
ことができるから分離展開列間でバンドの比較が容易で
あり、バンドの帰属を正確に行なうことができる。

未発ＩＪにおいてはさらに、−１多毛表示された一次元
波形について入力情報に）＾づいてその波高（信号レベ
ル）を任意に調節することにより好適な波高の鳥轍図を
得ることができるために、烏轍図に基づくオートラジオ
グラフ解析を一層容易にし、かつその解析精度を高める
ことができる。すなわち、信−）レベルの倍率を大きく
して波高を高くすることによりバンドのピークの高さお
よび位置をより鮮明にすることができ、バンドの比較照
合がしやすくなる。逆に、倍率を小さくして波高を低く
することによりスマイリング現象、オフセット歪みなど
のレーン間の位置ずれが把握しやすくなる０分離展開パ
ターンの歪みや位置ずれは、波高を小さくして（例えば
信号レベルを０付近にして）′＋Ｌ面に近い表示とする
ことにより大局的に判断しやすくなるものである。

ここで、スマイリング現象とは、分離展開過程における
放熱効果（エツジ効果）などが原因となって生じるもの
であり、支持媒体の中央部の分離展開距離に比べて両端
部の分離展開距離が短くなる現象をいう、またオフセッ
ト歪みとは、試料注入口（スロット）の形状の相違等に
より試料の分離展開開始位置、開始時間が各レーンで異
なることなどが原因となって生じるものであり、レーン
間相！Ｌの全体的な位置ずれをいう、これらのバンドの
位置ずれのほかにも分＃展開パターンにはバンド自体の
欠陥、レーンの蛇行などが生じることがある。

換１已：゛すれば、解析者は目的に応じて、／曳ンドの
ピークが強調された＼＞：体内な鳥轍１４あるいは反対
に１・而に近い、Ｃ′Ｊ＠図を自由に入手することがで
きる。特に烏轍図をＣＩ？Ｔなどの表示装置に゛ｒｆｉ
気的に表示した場合には、即座に所望の形状に調整され
た烏轍図を得ることができる。これにより解析者の視覚
的な′ｌ′４断を容易にし、バンドの序列付けの際に順
序の逆転、バンドの読み落とし、重複読みなどの読み取
りミスを防止することができる。

さらに、１−記烏轍図を二次元波形の波高に応じて二色
以上に色分して表示した場合には、一層バンドのピーク
をＤ　Ｍｌたせることかでき、バントとバンドが離れて
いても周辺のｔ：’：＋さおよび起伏の変化に影響され
ることなくどちらのハントが高いかを正確に判断するこ
とができる。また１分離展開開始位置近くのハントの密
な領域においてバンドの融合が生じていても、バンドを
正確に分離して／へントに序列を付すことができる。

また、オートラジオグラフは濃淡画像として表゛　示ご
れるのではないから、従来のように放射線フィルムまた
は写真フィルムなど特定の画像記録材料を必要としない
。このことはまた、オートラジオグラフに対応する゛心
気信号をｐｉ画像して表示するために、レーザープリン
タ、階調用グラフィックディスプレイなどの特別な出力
装置が不要であることを、・ユ味する。未発ＩＪＩにお
いては、たとえば通常、パーソナルコンピュータに取り
付けられるディスプレイまたはドツトプリンタなど安価
な汎用出力装置で上のである。

［発ＩＪの構成］ 本発明において用いられる試料の例としては、放射性標
識が付与されたＤＮＡ、ＲＮＡ”９の核酸の塩基特異的
断片物の混合物を挙げることができる。ここで、核酸の
断片物とは長鎖状の分子の一部分を意味する。たとえば
、塩基特異的ＤＮＡ断片物混合物の一種である塩基特異
的Ｄ　Ｎ　Ａ　！／Ｊ断分解物混合物は、前述のマキサ
ム・ギルバート法に従って、放射性標識が付与されたＤ
ＮＡを塩基特異的に切断分解することにより得られる。

また、塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物は前述のサンガー
・クールノン法に従って、ＤＮＡをテンプレート（鋳型
）として、放射性標識が付怪されたデオキシヌクレオシ
ドトリフオスフェートとＤＮＡ合Ｉ＆酵素とを用いて合
成することにより得られる。

さらに、塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物も上記と同様
の方法により、切断分解物混合物としてまたは合成物混
合物として得ることができる。なお、ＤＮＡはその構Ｌ
ＡＩ位としてアデニン、グアニン、チミン、シトシンの
四種類のＪ１！基からなるが、一方ＲＮＡはアデニン、
グアニン、ウラシル、シトシンの四種類の塩基からなる
。

放射性標識は、これらの物質に適当な方法でコ２Ｐ、＋
４（：、３ＳＳ、’　Ｈ，１２’　Ｉ　ｌｘ　、！：’
　）ｈ３（耐性１ｉ４４Ｑ元素を保持させることによっ
て付かされる。

試料である放射性標識が付与された核酸の塩基特異的断
片物の混合物はゲル状支持媒体など公知の各種の支持媒
体を用いて、電気泳動法、薄層クロマトグラフィー、カ
ラムクロマドグラフイー、ペーパークロマトクラフィー
など種々の分離　ＪＩＧ　１５Ｈ方法により支持媒体上
に分離展開される。

次に、未発ＩＪＪの方法を用いたオートラジオグラフ解
析の実施５島様を、ＤＮＡの塩基配列決定を例にとって
説ＩＪＩする。

まず、以ドの四種類の放射性標識が付与された塩）＾特
異的ＤＮＡ断片物の混合物が電気泳動によりゲル支持媒
体上に分離展開されてなる泳動パターンについて、従来
の写真感光材料を用いる放射線写真法により、あるいは
蓄積性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法によりそ
のオートラジオグラフを１！）、次いで適当な読取り（
読出し）系を介して該オートラジオグラフに対応するデ
ジタル信−）を得る。

ｌ）グアニン（Ｇ）特異的ＤＮＡ断片物２）アデニン（
Ａ）特異的ＤＮＡ断片物３）チミン（Ｔ）特異的ＤＮＡ
断片物 ４）シトシン（Ｃ）特異的ＤＮＡ断片物ここで、各塩Ｘ
、特異的ＤＮＡ断片物は、塩基特異的に切断分解もしく
は合成された。すなわち末端の塩基を同じくする種々の
長さのＤＮＡ断片物からなる。

前者の放射線写真／、Ｉ：を利用する場合には、まず支
持媒体とＸ線フィルム笠の写真感光材料とを低温もしく
は常温で長時間（Ｉａ時時間数十時間）重ね合わせて放
射線フィルムを感光させたのち、現像して放射性標識物
質のオートラジオグラフを放射線フィルム−Ｌにｉｉｆ
視画像画像化０次いで、画像読取装置を用いて放射線フ
ィルムＥにｏｆ視化されたオートラジオグラフを読み取
る。たとえば、放射線フィルムに光ビームを照射してそ
の透過光または反射光を光電的に検出することにより、
オートラジオグラフは電気信号として得られる。さらに
、この電気０壮をＡ／Ｄ変換することにより、オートラ
ジオグラフに対応するデジタル信−）を得ることができ
る。

後者の放射線像変換方法を利用する場合には、まず、支
持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で短時間（数秒〜
数十分間）重ね合わせて蛍光体シートに放射性標識物質
から放出される放射線エネルギーを蓄［５せることによ
り、そのオートラジオグラフを蛍光体シートに一種の潜
像として記録する。ここで、蓄積性蛍光体シートは、た
とえばプラスチックフィルムからなる支持体、二価ユー
ロピウム賦活弗化臭化バリウム（ＢａＦＢｒ：Ｅｕ”）
’ｐの輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、および透明な保
護膜がこの順に積層されたものである。蓄積性蛍光体シ
ートに含有されている輝尽性蛍光体は、Ｘ線笠の放射線
が照射されるとその放射線エネルギーを吸収して蓄積し
、そののちＯｆ視乃至赤外領域の光で励起すると蓄積し
ていた放射線エネルギーを輝尽光として放出するという
特性を有する。

次いで、読出装置を用いて蓄量性蛍光体シートに蓄積記
録されたオートラジオグラフを読み出す。具体的には、
たとえば蛍光体シートをレーザー光で走査して放射線エ
ネルギーを輝尽光として放出させ、この輝尽光を光電的
に検出することにより、放射性標識物質のオートラジオ
グラフは可視画像化することなく直接に電気信号として
スＩＩられる。ざらに、この電気信号をＡ／Ｄ変換する
ことにより、オートラジオグラフに対応するデジタル信
号を得ることができる。

旧述のオートラジオグラフ測定操作およびオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号を得る方法の、；Ｔ細に
ついては、たとえば特開昭５９−８３０５７号公報およ
び特願昭５８−２０１２３１号明細古に記載されている
。

なお、上記においては、支持媒体上に分離展開された放
射性標識物質のオートラジオグラフに対応するデジタル
信号を得る方法として、従来の放射線写真法および放射
線像変換方法を利用する方法について述べたが、これら
の方法に限定されるものではなく、それ以外の如何なる
方法により得られたデジタル信号であっても放射性標識
物質のオートラジオグラフと対応関係がある限り、本発
明の解析方法に用いることがｉ４　ｆｆｉ、である。

また、上記いずれの方法においてもオートラジオグラフ
の読取り（または読出し）は、放射線フィルム（または
蓄積性蛍光体シート〕の全面に亘って行なう必要はなく
１画像領域のみについて行なうことも勿論可滝である。

さらに１本発明においでは、予め各分ａ展開列の位ｌお
よびバンドの幅等についての情報を入力して読取り（読
出し）条件を１没定しておき、読取り（読出し）操作に
おいては各バンド上を二本以との走査線が通過するよう
な走査線密度で光ビームによる走査を行なうことにより
、読取り（読出し）時間を短縮化して必要な情報を効率
良く得ることができる。なお、本発明においてオートラ
ジオグラフに対応するデジタル信号とは、このようにし
て得られたデジタル信号をも包含する。

得られたデジタル信号ｏｘｙは、放射線フィルム（また
は蛍光体シート）に固定された座標系で表わされた座標
（ｘ　、　ｙ）とその座標における信号のレベル（２）
とからなる、信号のレベルはその座標における画像濃度
、すなわち放射性標識物質のＦｌ）を表わしている。従
って、一連のデジタル信号（すなわち、デジタル画像デ
ータ）は放射性標識物質の二次元的な位置情報を有して
いる。

このオートラジオグラフに対応するデジタル信１副−を
−μメモリ（バッファーメモリ、または磁気ディスク等
の不揮発性メモリ）に記憶したのち、信シ３　処理回路
と、オートラジオグラフを鳥轍図の形ｙｌｉで表示する
ことができるＣＲＴなどの表示−ｆ没と、二次元波形の
波高１所のための入力を行なうことができる入力、１段
とを有する装置に送る。

この表示１段には波高についての表示部が設けられてい
るのが好ましい、さらに、表示手段は鳥轍図を色付けし
て表示することができるのが好ましく、入力り段は色分
けのための入力も行ないうるのが好ましい。

なお、得られたデジタル信号に基づいて、泳動パターン
のオートラジオグラフを従来のようにそのまま画像化し
た濃淡画像を第１図に部分的に示す。

このデジタル信号に適当な信号処理を施すことにより、
泳動方向における位置と信号のレベルとからなる複数の
二次元波形を得る。

たとえば、泳動方向をＸ方向とし、それに直角な泳動列
の方向をｙ方向とすると（第１図参照）、ｙ方向の任意
の位置（ｙ＝ｙａ）における二二次元波形は、Ｘ座標が
Ｙａである全ての信号を取り出して泳動方向の位′ｊ１
ｘと信号のレベルＺとからなるグラフを作成することに
より得られる。

あるいは、ｙａを中°心とする一定領域の信−）を取り
出し、その平均イ〆ｉ′３に基づいて二次元波形を作成
してもよい、なお、デジタル信号の検出を、前記のよう
に各バンドについて複数の走査線がかかるような走査Ｍ
密度で泳動方向に走査することにより行なった場合には
、各走査線ごとに得られたデジタル信−）から直接に二
次元波形を作成することができる。

二次元波形は、一つの泳動列（レーン）について少なく
とも一つ以上作成される。解析精度の点から好ましくは
、一つのレーン当り五〜十個作成する。このように多数
個作成することにより、各バンドのピークを精確に知る
ことができ、またＤＮＡ断片物が分布されてなるバンド
の形状を知ることが可能となる。すなわち、二次元波形
をレーン方向に多数作成することにより、第２図に示す
ように、泳動方向の位７１ｘ、レーン方向の位置ｙおよ
び信号のレベル２からなる三次元の情報を含んだ画像表
示が可能となる。

放射性標識物質の量がスロットによってかなり異なって
いる場合には１個々の二次元波形の波高を予め調節する
ことにより、表示された泳動パターンを解析しやすくす
ることができる。

泳動パターンに種々の歪みやノイズが発生している場合
には、デジタル信号に好適な信号処理を施して歪みの補
正またはノイズの消去をしたのち、上記二次元波形を作
成してもよい、これらの歪みの補正などの信号処理の詳
細については、たとえば本出願人による特願昭６０−６
２２９８号明細書等に記載されている。

次に、得られた多数の二次元波形を多重化して表示する
。

たとえば、第３図に示すように、泳動方向上の位７１ｘ
とその位置における信号のレベル２とからなる二次元波
形を、レーン方向ｙに一定間隔をとって平行に玉ねて表
示する。

第３図は、画面上に、多数の二次元波形をレーン方向に
等間隔をおいて多重表示した例（鳥轍図）を示す図であ
る。なお第３図において、鳥轍図１は三色に色分けされ
ており、実線、破線および細線はそれぞれ赤色、黄色お
よび緑色に色付けされていることを意味する。鳥轍図の
右側には、信ｔ）レベルの高さおよび信号レベルの相対
値に基づく色分けの基準かそれぞれ、波高インジケータ
２および色彩インジケータ３として表示されている。

このとき、レーン方向の間隔および泳動方向の位置を各
二次元波形のＸ座標およびＸ座標に対応するようにとれ
ば、Ｘ線フィルムになどに１１）られる従来の濃淡画像
と同し大きさで表示されることになる。反対に、レーン
方向の間隔、二次元波形の長さおよび強度を適当に変え
ることにより好適な大きさに縮小して表示することもて
きる。あるいはまた、レーンとレーンの間隔を多少大き
くとって表示することによりレーン間の比較ｆＢＩ察を
より容易にすることもできる。

鳥謙図は、ＣＲＴ、Ｊ＋階調用グラフィ、クディスプレ
イなどの表示装置に電気的に表示するのみならず、たと
えば、グラフィック用ドツトプリンタ、感光材料上をレ
ーザー光等で走査して光学的に記録するもの、ｆ！＋線
を用いて感熱記録材料上に記録するものなど種々の原理
に基づいた記録装置を用いて記録してもよい。なお、５
！ｌ１ＢＩＩＩ図を表示記録する方法の詳細については
、前記特願昭６０−１８１４３　ｔ　ｓ５明細、！″ｉ
に記載されている。

次いで１表示記録された鳥轍図から決定された一次元波
形の波高（信リレベル）に関する入力情報に従って、−
二次元波形の波高を調節する０通常は、表示された全て
の二次元波形について一様に波高の変更を行なう。具体
的に、まず人力情報に従って波高インジケータの信号レ
ベルの比率を変える。情報の入力は、キーボード操作な
どにより行なうことができる。波高インジケータには、
たとえば全てのユニ次元波形の平均の信号レベルを表示
してもよいし、あるいは最大の信ｔ）レベルを表示して
もよい。次いで、波高インジケータの表示確認のための
入力に基づいて全ての二次元波形の波高を該比率に従っ
て変化させる。あるし）は、波１ｔ６に関する入力情報
に従ってｆＪ−ｒ　／−’：ｒインジケータの表示と鳥
轍図とを同時に変更してもよい。

第４図に、第３図に示した鳥轍図の波高を全体に一様に
低くして得られた烏轍図を示す。

第３図と第４図を比較することにより、波高を１ｔ：１
〈すれば個々のバンドのピーク位置および高さが明確に
なり、逆に波高を低くすれば泳動パターン全体の歪みや
位置ずれが明確になることがＩＪＩらかである。従って
、［１的に応じて波高が好適に調整された烏轍図を得て
、これに基づいてオートラジオグラフ解析を行なうこと
ができる。

なお、１１１られた。ａ轍図が所望の波高ではない場合
には上記操作を繰り返すことにより、１ｍ　Ｉ′ｌ’−
に波高を変更することができる。また、解析途中で烏轍
図の波高を変更する必要が生じた場合にも同様の操作を
行なうことにより所望の波高形状の烏尉図を得ることが
できる。

また、上記においては鳥轍図全体について一様に波高を
変更する場合について説ＩＩしたが、波高の調節は部分
的に行なうこともＥｊ（能であり、たとえばレーンごと
に異なる基準で行なってもよい。

さらに、第３図および第４図に示したように、烏轍図を
波高によって色分けして表示してもよい。

たとえば信号レベルの大きさによって何種類に何色で色
分けするかを予め信号処理回路に人力設定しておくこと
により、個々の二次元波形について色分けすることがで
きる。信号レベルの大きさは絶対イ４でｒ４断してもよ
いし、あるいは複数の二次元波形全体における信ｔ′Ｆ
レベルの最大値を算出し、その最大値に対する比率など
相対的なイ１で判断してもよい。

」二記第３図および第４図には、緑色、黄色および赤色
からなる三色に色分けされた。！′１ｕｌ１図が示され
ている。

なお１色分けはこれら三色に限定されるものではなく、
二色であってもよいし、あるいは囲包以］二であっても
よく、また任意の色彩を使用することができる。たとえ
ば、二色に色分けして、そのうちの信Ｖ）レベルが低い
方の色を画面の地色と同色とすることにより、バンドの
ピーク部分のみを際立たせることができる。さらに、こ
の色分けは鳥轍図全体について統一的に行なってもよい
し、あるいはレーンごとなど部分的に異なる基準で行な
ってもよい。

さらに１人力情報に基づいて色分けを変更できるように
してもよい、具体的に、上記三色の場合を例にとれば、
まず中間レベルの色である黄色をｅ、準において黄色と
それより高いレベルの赤色との境界（悶（ルベル）がキ
ー人力などにより指定されると、画面−Ｌの色彩インジ
ケータの黄色と赤色の比率が変化する０次いで、色彩イ
ンジケータを色分は変更の目安としてその確認のための
人力がなされると、鳥轍図の色分けを該比率に従って変
化して表示する。黄色とそれより低いレベルの緑色との
閾値レベルの変更についても同様にして行なうことがで
きる。

このようにして波高の変更、更には色分けがなされた烏
逝図は、ｌ二記の種々の装置により表示。

記録することができる。さらに、この鳥轍図についての
情報は信号処理回路から出力されたのち、磁気ディスク
や磁気テープなどの記址保存手段に保存することができ
る。

所９（の波高形状に調整された烏轍図に基づいて、解析
者自身が視覚的にバンドの序列付けを行なうことにより
、ＤＮＡの塩基配列を正確かつ容易に決定することがで
きる。バンドの序列付けについては具体的に、たとえば
本出願人による昭和６１年３　ＪＪ　５　Ｉ＋出願の特
願昭６１−４７９２４号および昭和６１年３月１２［１
出願の特願昭６１−５５４８１４、；の各明細書に記載
されている方法を利用することができる。

また、−］Ｊ−決定されたバンドの序列付けの確認訂正
を行なう場合に、Ｌ記鳥轍図を用いることができる。な
お１．Ω緻図およびバンドの序列などの情報の記録保存
およびバンドの序列の確認訂正については、本出願人に
よる昭和６１年３月１２１］出願の特願昭６１−５５４
８２号および昭和６１年３月１２１１７ｆｆ願の特願昭
６１−５５４８３　ｔ３の各明細＋’、ｔに記載されて
いる方法を利用することができる。

」二記においては、試料である塩基特異的ＤＮＡ断片物
の混合物として（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の排他的組合せを利
用した場合について説明したが、本発明の解析方法はこ
の組合せに限定されるものではなく１例えば（Ｇ、Ｇ十
Ａ、Ｔ＋Ｃ，Ｃ）なと゛の種々の組合せに適用すること
ができる。また同様に、塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合
物（例えば、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃの組合せ）についても本発
明の方法を適用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、泳動パターンのオートラジオグラフを従来法
に従ってそのまま放射線フィルムＬに可視化して得られ
たｅ淡画像の例を示す図である。 第２図は、未発ＩＪの方法に従って得られる泳動方向の
位置（Ｘ）と信号のレベル（Ｚ）とからなる多数の二次
元波形を、泳動方向の位置（Ｘ）。 レーン方向の位置（ｙ）および信号のレベル（ｚ）から
なる正次元座標系て部分的に表わした図である。 第３図は、画面りに、オートラジオグラフに対応する多
数の二次元波形を色分けしてレーン方向に等間隔をおい
て多重表示した。β轍図の例を示す図である。 第４図は、本発明の方法に従って、第３図に示した鳥轍
図の波高を低く変更して得られた鳥瞼図の例を示す図で
ある。 ｌ：鳥轍図、２：波高インジケータ、 ３：色彩インジケータ 実線：赤色、破線：黄色、細線：緑色 特許出願人　　富士写真フィルム株式会社代　　理　　
人　　　弁理士　　　柳　　川　　泰　　刀Ｍ３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ断片物も
   しくはＲＮＡ断片物が支持媒体上に一次元的方向に分離
   展開されて形成された複数の分離展開列のオートラジオ
   グラフを解析することにより、核酸の塩基配列を決定す
   る方法において、１）オートラジオグラフに対応するデ
   ジタル信号について信号処理を行なうことにより、各分
   離展開列について分離展開方向に沿った位置と信号のレ
   ベルとからなる二次元波形を少なくとも一つ得る工程、 ２）複数の二次元波形を分離展開方向に対して垂直な方
   向に一定間隔をおいて多重表示する工程、および ３）この多重表示から決定された二次元波形の波高に関
   する入力情報に基づいて、二次元波形の波高を変更して
   表示する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のためのオ
   ートラジオグラフ解析方法。 ２、上記第三工程において、全ての二次元波形の波高を
   一様に変更して表示することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のためのオートラジ
   オグラフ解析方法。 ３、上記第三工程において、二次元波形の波高を分離展
   開列ごとに変更して表示することを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のためのオート
   ラジオグラフ解析方法。 ４、上記第二工程において、二次元波形を電気的に表示
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸
   の塩基配列決定のためのオートラジオグラフ解析方法。 ５、上記第二工程において、二次元波形を信号レベルに
   よって少なくとも二色に色分けして表示することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定
   のためのオートラジオグラフ解析方法。 ６、上記第二工程において、二次元波形を信号レベルの
   相対値によって三色に色分けして表示することを特徴と
   する特許請求の範囲第４項記載の核酸の塩基配列決定の
   ためのオートラジオグラフ解析方法。 ７、上記第二工程において、色分けに関する入力情報に
   基づいて二次元波形を色分けして表示することを特徴と
   する特許請求の範囲第４項記載の核酸の塩基配列決定の
   ためのオートラジオグラフ解析方法。 ８、上記第一工程において、オートラジオグラフに対応
   するデジタル信号が、支持媒体と輝尽性蛍光体を含有す
   る蓄積性蛍光体シートとを重ね合わせて、支持媒体上の
   放射性標識物質のオートラジオグラフを該蛍光体シート
   に蓄積記録した後、該蛍光体シートに励起光を照射して
   該オートラジオグラフを輝尽光として光電的に読み出す
   ことにより得られたものであることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のためのオー
   トラジオグラフ解析方法。 ９、上記第一工程において、オートラジオグラフに対応
   するデジタル信号が、支持媒体と写真感光材料とを重ね
   合わせて、支持媒体上の放射性標識物質のオートラジオ
   グラフを該感光材料に感光記録した後、該感光材料上に
   可視化されたオートラジオグラフを光電的に読み取るこ
   とにより得られたものであることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のためのオート
   ラジオグラフ解析方法。