JPH0520712B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、オートラジオグラフイーにおける放
射性同位元素の定量測定法に関するものである。

［発明の技術的背景］ 放射性同位元素の導入によつて放射性標識が付
与された物質を生物体に投与したのち、その生物
体、あるいはその生物体の組織の一部を試料と
し、この試料と高感度Ｘ線フイルムなどの放射線
フイルムと一定時間重ね合わせることによつて該
フイルムを感光させ、その感光部位から該試料中
における放射性標識物質の位置情報を得ることか
らなるオートラジオグラフイーが既に知られてい
る。

また、オートラジオグラフイーは、放射性標識
が付与された生物体の組織および／または生物体
由来の物質を含む媒体における放射性標識物質の
位置情報を得るためにも利用されている。たとえ
ば、蛋白質、核酸などのような生物体由来の高分
子物質に放射性標識を付与し、その放射性標識高
分子物質、その誘導体、あるいはその分解物また
はその合成物などをゲル電気泳動などの分離展開
操作にかけて支持媒体上で分離したのち、支持媒
体と放射線フイルムとを重ね合わせてフイルムを
感光させ、そのオートラジオグラフ像から得られ
る支持媒体上の放射性標識物質の位置情報を基に
して、該高分子物質の分離、同定、あるいは高分
子物質の分子量、特性の評価などを行なう方法も
開発され、実際に利用されている。

特に近年においては、オートラジオグラフイー
は、DNA、RNAなどの核酸の塩基配列決定に有
効に利用されている。また、サザン・ブロツテイ
ング、ノアザン・ブロツテイング、ウエスタン・
ブロツテイングなどハイブリダイゼーシヨン法を
利用する遺伝子のスクリーニングにおいても不可
欠の手段となつている。

さらに、オートラジオグラフイーによつて得ら
れた画像（オートラジオグラフ像）に基づいて、
試料中の放射性標識物質の分布部位における放射
性同位元素（radioisotope、略してRIとも称す
る）の量を測定することも行なわれている。たと
えば、サザン・ブロツテイング法を利用した遺伝
子のスクリーニングは、目的とする遺伝子を含む
多数のDNA断片を電気泳動によりゲル支持媒体
上で分離展開したのち、少なともその一部を支持
体上に転写固定してハイブリダイゼーシヨン処理
を行なうことにより、転写支持体上の目的遺伝子
を有するDNA断片に放射性標識を付与する。次
いで、この転写支持体についてオートラジオグラ
フイー操作を行なうことにより、目的遺伝子を有
するDNAを検出するものである。また、ノアザ
ン・ブロツテイング法を利用する遺伝子のスクリ
ーニングは唯一検体がRNA断片である点で上記
のサザン・ブロツテイング法と異なるものである
が、いずれにおいても同時に、目的遺伝子を有す
るDNA断片もしくはRNA断片のRI量を定量測
定することが試られている。

なお、上記遺伝子のスクリーニングについては
次の文献に詳細に記載されている：METHODS
IN ENZYMOLOGY，VOL.68，P.152〜P.176，
P.220〜P.242，edited by Ray Wu，
ACADEMIC PRESS，NEW YORK，1979）；
〓蛋白質 核酸 酵素〓VOL.26，No.４，P.584〜
P.590（1981） 具体的には、オートラジオグラフが画像化され
ている放射線フイルムの感光部位（黒色部分）の
面積を測定し、基準マーカーと比較したり、ある
いはオートラジオグラフ像に基づいてゲル支持媒
体の分離展開部位を切り取つて、液体シンチレー
シヨンカウンタで直接測定することにより、RI
の定量測定を行なつている。

しかしながら、前者の放射線フイルムに基づい
てRIの定量測定をする場合には、RI量は単純に
感光部位の面積に比例せず、またフイルム自体の
感光特性が非線形であることから、測定精度を上
げることが非常に困難であつた。後者の直接にゲ
ル支持媒体からRIの定量測定をする場合には、
放射線フイルムとの位置合せ、ゲルの切り出し、
切り取つたゲルの調製など測定操作が煩雑であ
り、かつ放射性物質の扱いに特別の注意と熟練を
要していた。

なお、本出願人は、オートラジオグラフイーに
おいて上記放射線フイルムを用いる従来の放射線
写真法の代りに、蓄積性蛍光体シートを用いる放
射線像変換方法を利用する方法について既に特許
出願している（特開昭59−83057号、特開昭60−
10174号、特開昭60−66998号）。蓄積性蛍光体シ
ートは輝尽性蛍光体からなるものであり、放射線
エネルギーを該蛍光体シートの輝尽性蛍光体に吸
収させたのち、可視乃至赤外領域の電磁波（励起
光）で励起することにより、放射線エネルギーを
蛍光（輝尽光）として放出させることができるも
のである。この方法によれば、露光時間を大幅に
短縮化することができ、また従来より問題となつ
ていた化学カブリ等が発生することがない。さら
に、放射性標識物質のオートラジオグラフは、一
旦放射線エネルギーとして蛍光体シートに蓄積さ
れたのち輝尽光として時系列的に読み取られるか
ら、画像のほかに記号、数値など任意の形で表示
記録することが可能である。

［発明の要旨］ 本発明は、オートラジオグラフイーにおいて高
精度かつ簡易に試料の放射性同位元素を定量測定
する方法を提供するものである。

すなわち、本発明は、放射性同位元素によつて
放射性標識が付与された生物体の組織、および生
物体の組織および／または生物体由来の物質を含
む媒体からなる群より選ばれる試料に含まれてい
る放射性標識物質の位置情報を得ることからなる
オートラジオグラフイーにおける放射性同位元素
の定量測定法において、 １ 該試料と輝尽性蛍光体を含有する蓄積性蛍光
体シートとを一定時間重ね合わせて試料のオー
トラジオグラフを蛍光体シートに蓄積記録した
のち、この蛍光体シートに励起光を照射してオ
ートラジオグラフを輝尽光として光電的に読み
取ることにより、該試料のオートラジオグラフ
に対応するデジタル信号を得る工程、 ２ デジタル信号に基づいて放射性標識物質の分
布部位を検出する工程、および ３ 放射性標識物質の分布部位内の各デジタル信
号の信号レベルから放射性同位元素の量を算出
したのち積算することにより、該分布部位にお
ける放射性同位元素の総量を決定する工程、 を含むことを特徴とするオートラジオグラフイー
における放射性同位元素の定量測定法を提供する
ものである。

本発明の方法は、試料のオートラジオグラフを
放射線フイルム上に直接画像化する代りに、蓄積
性蛍光体シートに蓄積記録してデジタル信号とし
て得、このデジタル信号に基づいて試料中の特定
部位における放射性同位元素の定量測定を実現す
るものである。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは放射
線に対して非常に優れた線形性を有しており、試
料から放射された放射線エネルギーは蛍光体シー
トに一旦吸収蓄積されたのち、励起光で励起する
と輝尽光として放出されるのであるが、この輝尽
光の量は試料から放射された放射線の量によく比
例している。また、蓄積性蛍光体シートを光電的
に読み取ることにより輝尽光はデジタル信号とし
て得られるから、オートラジオグラフの画像情報
は放射性標識物質の位置情報のみならずその放射
線強度に関する情報をも含めて、直接数値化され
た形で得られる。

本発明によれば、このオートラジオグラフに対
応するデジタル信号に好適な信号処理を行なうこ
とにより、放射性標識物質の分布部位（存在領
域）を検出したのち該領域に含まれるデジタル信
号に演算処理を施して、その信号レベルからRI
量を自動的にもしくは半自動的に決定することが
できる。従つて、従来の定量測定法と比較して、
測定操作を顕著に簡略化することができるととも
に高い精度でRI量を求めることができる。

さらに、デジタル信号処理によつて算出される
ため、放射性標識物質の分布部位が小面積であつ
たり、密集している場合であつても、あるいは放
射性同位元素の量が少ない場合であつても、十分
精度高くRI量を求めることができる。

また、決定されたRI量は、オートラジオグラ
フの可視画像と一緒に任意の表示装置および記録
材料上に容易に表示記録することができる。

［発明の構成］ 本発明において測定の対象とされる試料は、放
射性同位元素の導入によつて放射性標識が付与さ
れた生物体の組織、および生物体の組織および／
または生物体由来の物質を含む媒体である。その
うちでも、放射性標識が付与された生物体の組織
および／または生物体由来の物質を含む媒体を試
料とした場合に本発明の方法は有効に利用され
る。

たとえば、放射性標識を有する蛋白質、核酸、
それらの誘導体、それらの分解物、合成物のよう
な生物体由来の高分子物質を挙げることができ
る。放射性標識はこれらの物質に適当な方法で
³²P、¹⁴C、³⁵S、³H、¹²⁵Iなどの放射性同位元素を保
持させることによつて付与される。試料は、これ
らの放射性標識が付与された物質をゲル支持媒体
など公知の各種の支持媒体を用いて、電気泳動
法、薄層クロマトグラフイー、カラムクロマトグ
ラフイー、ペーパークロマトグラフイーなど種々
の分離展開方法により支持媒体上に分離展開する
ことによつて得られる。ただし、本発明の放射性
同位元素の定量測定法の対象となる試料はこれら
の高分子物質が分離展開された支持媒体に限定さ
れるものではない。

以下に、本発明の放射性同位元素の定量測定法
について、放射性標識物質が分離展開されてなる
支持媒体を試料とする場合を例にとり、具体的に
説明する。

まず第一に、放射性標識物質が分離展開された
支持媒体について、蓄積性蛍光体シートを用いて
そのオートラジオグラフに対応するデジタル信号
を得る。

支持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で短時
間（数秒〜数十分間）重ね合わせて蛍光体シート
に放射性標識物質から放出される放射線エネルギ
ーを蓄積させることにより、そのオートラジオグ
ラフを蛍光体シートに一種の潜像として記録す
る。ここで、蓄積性蛍光体シートは、たとえばプ
ラスチツクフイルムからなる支持体、二価ユーロ
ピウム賦活弗化臭化バリウム（BaFBr：Eu²⁺）
等の輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、および透明
な保護膜がこの順に積層されたものである。蓄積
性蛍光体シートに含有されている輝尽性蛍光体
は、Ｘ線等の放射線が照射されるとその放射線エ
ネルギーを吸収して蓄積し、そののち可視乃至赤
外領域の光で励起すると蓄積していた放射線エネ
ルギーを輝尽光として放出するという特性を有す
る。

次いで、読取装置を用いて蓄積性蛍光体シート
に蓄積記録されたオートラジオグラフを読み取
る。具体的には、たとえば蛍光体シートをレーザ
ー光で走査して放射線エネルギーを輝尽光として
放出させ、この輝尽光を光電的に検出することに
より、放射性標識物質のオートラジオグラフは可
視画像化することなく直接に電気信号として得ら
れる。さらに、この電気信号をＡ／Ｄ変換するこ
とにより、オートラジオグラフに対応するデジタ
ル信号を得ることができる。

上述のオートラジオグラフ測定操作およびオー
トラジオグラフに対応するデジタル信号を得る方
法の詳細については、たとえば前記特開昭59−
83057号、特開昭60−10174号、特開昭60−66998
号等の各公報に記載されている。

なお、オートラジオグラフの読取りは蓄積性蛍
光体シートの全面に亘つて行なう必要はなく、画
像領域のみについて行なうことも勿論可能であ
る。

得られたデジタル信号D_xyは、蓄積性蛍光体蛍
光体シートに固定された座標系で表わされた座標
（ｘ，ｙ）とその座標における信号のレベル（ｚ）
とからなる。信号のレベルはその座標における放
射線強度、すなわち放射性同位元素の量と一定の
相関関係がある。従つて、一連のデジタル信号
（すなわち、デジタル画像データ）は放射性標識
物質の二次元的な位置情報を有している。

第二に、オートラジオグラフに対応するデジタ
ル信号について信号処理を行なうことにより、あ
るいはデジタル信号に基づいてオートラジオグラ
フを電気的に画像表示したのちこれを目測するこ
とにより、放射性標識物質の分離展開部位（バン
ド）を検出する。

第１図は、放射性同位元素が導入されたDNA
断片からなる放射性標識物質を電気泳動にかけて
得られた泳動パターンのオートラジオグラフの例
を示す。泳動パターンは一つの泳動列（レーン）
からなり、泳動方向はｘ方向である。

このオートラジオグラフに対応するデジタル信
号は、信号処理回路において一旦メモリ（バツフ
アーメモリ、または磁気デイスク等の不揮発性メ
モリ）に記憶される。

バンドは、たとえば、デジタル信号について以
下のような閾値処理によるエツジ検出を行なうこ
とにより、信号処理によつて自動的に検出するこ
とができる。

まず、泳動方向上の任意の点（探索開始点）か
ら始めて泳動方向ｘに沿つた直線（探索線）上
で、探索開始点の信号レベルl_sおよび信号の初期
閾値l_pに基づいてバンドを探し出す。

ここで、泳動方向は、放射性標識物質を電気泳
動させようとした方向であつて通常は支持媒体
（すなわち、重ね合わせられた蓄積性蛍光体シー
ト）の長軸方向（ｘ方向）を意味する。

初期閾値l_pは、バンドの有無を判別するための
信号レベルの閾値（基準値）l_o（ただし、ｎは０
または正の整数である）の初期値であり、比較的
低い値に設定され、バンドの大きさが一定範囲以
上である場合には順次より高い値に設定変更され
うる。

具体的には、 ａ 開始レベルl_sが初期閾値l_p以下（l_s≦l_p）であ
る場合には、デジタル信号の信号レベルが次に
初めて閾値l_p以上となる点をバンド検知点とす
る、 ｂ 開始レベルl_sが初期閾値l_pより高い（l_s＞l_p）
場合には、デジタル信号の信号レベルが次に閾
値l_pを下回つた後閾値l_p以上となる点、もしく
は信号レベルが次に閾値l_pを下回ることなく開
始レベルl_s以上となる点をバンド検知点とす
る。

次に、探し出されたバンドについて閾値l_pに基
づいてその領域を求め、次いで領域の大きさから
該バンドが真のバンドであるか否かを決定し、真
のバンドである場合にのみ検出すべきバンドとす
る。

バンドは上記バンド検知点に連なつている点の
集合であるとして、バンド検知点を基点としてそ
れに上下左右斜めのいずれかで連続し、かつ信号
レベルが閾値l_p以上である点を求める。このバン
ド検知点を含む連続した領域がバンドの領域であ
る。バンドの領域の大きさはたとえば、領域のｘ
方向の最大距離x_pおよびｘ方向に直角な方向ｙの
最大距離y_pで見積ることができる。

具体的には、予め、一つのバンドとして容認で
きるｘ方向およびｙ方向の最小の幅ｘ min，ｙ
min、並びにｘ方向およびｙ方向の最大の幅ｘ
max，ｙ maxを設定しておく。

ａ 距離x_pおよび距離y_pがいずれも上記最小幅と
最大幅の範囲内にある（ｘ min≦x_p≦ｘ
maxかつｙ min≦y_p≦ｙ max）場合には、
得られたバンドは真のバンドであり、検出すべ
きバンドであると決定する、 b₁ 距離x_pおよび距離y_pのうちの少なくとも一方
が上記最小幅よりも小さい（x_p＜ｘ minまた
はy_p＜ｙ min）場合には、得られたバンドは
真のバンドではないと決定したのち、バンド検
知点よりさらに下部の領域についてバンド探索
を行なう、または b₂ 上記ａおよびb₁以外の場合であつて、距離x_p
および距離y_pのうち少なくとも一方が上記最大
幅よりも大きい（x_p＞ｘ maxもしくはy_p＞ｙ
max）場合には、バンドの分離が十分では
ないとして、閾値l_pをl₁に変更して探索開始点
から再びバンド探索をやり直す。ここで、新た
な閾値l₁はl_pに一定の増分Δlを加えた値（l₁＝l_p
＋Δl）である。

以上に述べたバンドの検出の詳細については、
本出願人による特願昭61−90606号明細書に記載
されている。

このようにして、信号処理によりバンドの形状
（存在領域）を精確に求めることができる。ある
いは、バンドの形状を精確に求めずにバンドを含
む一定領域、たとえば四角形の枠で区切られた領
域を求めるだけにとどめてもよい。

あるいはまた、デジタル信号に基づいてオート
ラジオグラフをCRTなどの表示画面に電気的に
画像表示し、この表示画面を目視により観察する
ことによつてバンドを検出し、カーソル、ライト
ペン、ジヨイステイツク等を操作してバンドの領
域を情報として信号処理回路に入力してもよい。

第三に、検出されたバンドの領域内に存在する
各デジタル信号の信号レベルから放射性同位元素
（RI）の量を算出したのち積算することにより、
該バンド領域におけるRIの総量を決定する。

たとえば、試料からの放射線による蓄積性蛍光
体シートの露光量と、蛍光体シートを励起光で励
起した時の発光量とは線型関係にあり、読取装置
内では発光量に対数変換を施すことにより画素値
（信号レベル）が算出されるから、露光量［放射
線量ｒ（ｔ）を露光時間Ｔで積分したもの；∫_p ^Tｒ
（ｔ）dt］と、信号レベル（ｚ）を逆対数変換し
た値は線型な関係にある。これを数式で表わす
と、 ∫_p ^Tｒ（ｔ）dt＝C₁・10^C2Z （ただし、C₁およびC₂はそれぞれ読取装置の
感度、画素値のビツト数などによつて決まる装置
定数である） なる換算式が得られる。これらの装置定数を予
め求めておき、上記換算式に信号レベル（画素
値）を代入して露光量を求める。各信号（すなわ
ち各画素）に対する露光量を計算したのち積算す
ると、該バンドにおける総露光量が得られ、これ
からRI量を求めることができる。

あるいは、露光量が既に判明している試料を同
時に露光し、上記換算式の代りに第２図に示すよ
うな露光量（∫_p ^Tｒ（ｔ）dt）と信号レベル10^zとの
関係を表わす検量線を作成しておいて、この検量
線に基づいて信号レベルから露光量を算出しても
よい。

なお、第２図は露光量と信号レベルについての
検量線の例を示すグラフである。

あるいはまた、上述したようにバンドの領域を
大枠で検出した場合には、まず枠内で存在するデ
ジタル信号の信号レベル全てについて上記のよう
にしてRI量を算出したのちこれを積算する。次
いで、該枠内のバツクグランド値に相当する量を
差し引くことにより、該バンドについてのRIの
総量を得ることができる。

本発明の方法に従つて得られる放射性同位元素
の量は絶対値に限定されるものではなく、従来の
液体シンチレーシヨンカウンタ測定による場合と
同様に相対値として得られる場合も含まれる。ま
た、本発明に係る放射性同位元素の定量測定は、
一つの試料当り一つの分布部位に限られず、同時
に複数の分布部位について実施することができ
る。

このようにして、デジタル信号処理により自動
的もしくは半自動的に決定された放射性標識物質
の分布部位における放射性同位元素の量に関する
情報は、信号処理回路から出力されたのち、直接
的にもしくは必要により磁気デイスクや磁気テー
プなどの記憶保存手段を介して表示、記録され
る。

表示装置としては、前記のCRT、液晶表示装
置などを用いることができる。また、記録装置と
しては、たとえば、感光材料上をレーザー光等で
走査して光学的に記録するもの、CRT等に表示
された記号・数値をビデオ・プリンター等に記録
するもの、熱線を用いて感熱記録材料上に記録す
るものなど種々の原理に基づいた記録装置を用い
ることができる。

所望により、上記泳動パターンなどの試料の可
視化されたオートラジオグラフと一緒に放射性同
位元素の量を表示記録することもできる。これに
より、放射性標識物質の二次元的な位置情報とと
もにそのRI量を正確な情報として提供すること
ができる。そしてこの場合には、オートラジオグ
ラフの可視画像と直接比較することにより、得ら
れた放射性同位元素の量を確認することができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、放射性標識物質の泳動パターンのオ
ートラジオグラフの例を示す図である。第２図は
露光量と信号レベルについての検量線の例を示す
グラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 放射性同位元素によつて放射性標識が付与さ
   れた生物体の組織、および生物体の組織および／
   または生物体由来の物質を含む媒体からなる群よ
   り選ばれる試料に含まれている放射性標識物質の
   位置情報を得ることからなるオートラジオグラフ
   イーにおける放射性同位元素の定量測定法におい
   て、 １ 該試料と輝尽性蛍光体を含有する蓄積性蛍光
   体シートとを一定時間重ね合わせて試料のオー
   トラジオグラフを蛍光体シートに蓄積記録した
   のち、この蛍光体シートに励起光を照射してオ
   ートラジオグラフを輝尽光として光電的に読み
   取ることにより、該試料のオートラジオグラフ
   に対応するデジタル信号を得る工程、 ２ デジタル信号に基づいて放射性標識物質の分
   布部位を検出する工程、および ３ 放射性標識物質の分布部位内の各デジタル信
   号の信号レベルから放射性同位元素の量を算出
   したのち積算することにより、該分布部位にお
   ける放射性同位元素の総量を決定する工程、 を含むことを特徴とするオートラジオグラフイー
   における放射性同位元素の定量測定法。 ２ 上記分布部位における放射性同位元素の総量
   を、オートラジオグラフの可視画像とともに表示
   もしくは記録することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載のオートラジオグラフイーにおける
   放射性同位元素の定量測定法。 ３ 上記第二工程において、デジタル信号につい
   て信号処理を行なうことにより放射性標識物質の
   分布部位を検出することを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載のオートラジオグラフイーにおけ
   る放射性同位元素の定量測定法。 ４ 上記第二工程において、デジタル信号に基づ
   いてオートラジオグラフを電気的に画像表示する
   ことにより放射性標識物質の分布部位を検出する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のオ
   ートラジオグラフイーにおける放射性同位元素の
   定量測定法。 ５ 上記第三工程において、信号レベルと放射性
   同位元素の量との関係を表わす換算式に基づい
   て、放射性同位元素の量を算出することを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載のオートラジオグ
   ラフイーにおける放射性同位元素の定量測定法。 ６ 上記第三工程において、予め信号レベルと放
   射性同位元素の量との関係を表わす検量線を作成
   し、この検量線に基づいて放射性同位元素の量を
   算出することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載のオートラジオグラフイーにおける放射性同
   位元素の定量測定法。 ７ 上記試料が、放射性標識が付与された生体高
   分子物質群、その誘導体、もしくはそれらの分解
   物またはそれらの合成物が分布された媒体である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のオ
   ートラジオグラフイーにおける放射性同位元素の
   定量測定法。 ８ 上記試料が、放射性標識が付与された核酸、
   その誘導体、もしくはそれらの分解物またはそれ
   らの合成物が一次元的方向に分離展開された支持
   媒体であることを特徴とする特許請求の範囲第７
   項記載のオートラジオグラフイーにおける放射性
   同位元素の定量測定法。