JPH11505613A - 分子画像化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 物質混合物内の個々の物質を同定する方法は、混合物が通過する際に該混合物の特徴を表す信号を生成するようにして各検出器が間隔を置いて配置された一連の検出器を混合物が通過する段階と、複数の時間でもって各検出器からの信号を繰り返し測定する段階と、速度間隔に変換する段階と、速度間隔内で生ずるピークにもとづいて混合物内の個々の物質を同定する段階とを有する。

Description

【発明の詳細な説明】 分子画像化 本発明は、分子画像化および遺伝子配列決定の一般的分野に関する。 現在行われている核酸の配列決定方法および地図作成方法、さらに蛋白質およ び組織画像化方法は、放射性発光体、生物発光体、化学発光体、フォトプレート 、さらに何らかの電子技術に基づいている。実際のところ、これらのなかで完全 に満足できるものは一つも見いだされていない。 フィルムおよび（または）乳剤と共に用いる蛍光画像化、放射性標識、生物発 光体、および化学発光体マーカーは、高価なものであり、非常に遅く、制限があ り、コンピューターと連携させることが困難である。関連する技術は難しく、実 質的技術的専門家を必要とする危険な取り扱いや廃棄処理が要求される。使用す る材料は手に入りにくく、高価であることが多く、貯蔵寿命が短い。しばしば用 いられる写真・画像化は完成までに数日または時には数週間、数カ月もかかり、 動態的領域が小さく、応答の直線性が比較的不十分なために制限がある。 電子技術のうちで、蛍光体画像化／マルチワイヤー・プロポーショナル・チェ ンバー(multiwire proportional chamber)（ＭＷＰＣ）およびマイクロチャンネ ル・プレート／ＭＷＰＣ法はそれらの限られた直線性およびコストのために、多 くの分子生物学者には不人気である。 背景として核酸画像化における現在の技術の状態を幾分詳細に述べることは有 用であるかも知れない。現在一般に使用されている２つの異なる方法があり、こ れらの詳細を次に述べる。 先ず第１には、写真フィルムを用いて化学発光または放射性標識を可視化する というものであり、第２に、核酸に化学的に結合し、ＵＶ励起下でオレンジ色を 発する臭化エチジウム等の発光体を使用するものである。第１の画像化法が核酸 配列決定に一般に用いられている。この方法は配列決定反応の１成分（通常、プ ライマー）を放射性同位元素または化学発光マーカー、または標識で化学的に標 識化することを含む。配列決定反応および電気泳動に続いて、乾燥した電気泳動 ゲルに通常の写真用フィルムをさらすことによって、この標識を用いて核酸バン ドの位置を可視化する。これは、用いる配列決定法のために時間がかかり、２４ 時間から７２時間を必要とする。核酸配列決定に用いる放射性マーカーの多くは 非常に危険で、配列決定法に余計な複雑化要因をもちこむ。そのためこれらのマ ーカーを必要としない画像化系がもしあれば極めて好都合である。 第２の方法、すなわち発光体法は、一般にＤＮＡ制限分析およびプラスミド構 造の設計に用いられる。この方法は発癌性の化学的臭化エチジウムを用いて簡単 なアガロースゲルの核酸を画像化することに基づく。臭化エチジウムはＵＶ励起 後オレンジ色の光を発し、存在する核酸のサイズを可視化し、濃度を推定する。 臭化エチジウムは危険な蓄積性という医学的結果をもたらし、この方法の非常に 好ましくない成分である。画像化法からこれを除外することが、あらゆるアガロ ースゲル分析の応用に際して非常に好都合である。 核酸配列決定は、立体的画像化と比べて、通常はかなり異なるプロセスを使用 する。このプロセスは配列決定反応の１成分（普通はプライマー）を放射性同位 元素または生物発光マーカーまたは化学発光マーカー、または標識で化学的標識 化することを含む。配列決定反応および電気泳動後、乾燥した電気泳動ゲルに写 真フィルムをさらすことによって、この標識を用いて核酸バンドの位置を画像化 する。これは配列決定を行うため、時間がかかる方法であり、２４時間から７２ 時間を必要とする。 ＤＮＡ制限酵素分析（ＤＮＡ地図作成）およびベクター作成は分子生物学の基 礎的面である。これらの地図作成技術も臭化エチジウムを用いて簡単なアガロー スゲルにおける核酸断片を写真・画像化することに基づく。このマーカーはＵＶ 励起後オレンジの光を発し、核酸のサイズを可視化し、濃度を推定する。臭化エ チジウムは蓄積することによって発癌作用を示す危険をなものであり、この方法 の好ましくない成分である。この画像化法からこれを除去することが、このよう なアガロースゲル分析のあらゆる用途に極めて好都合である。 ペプチドおよび蛋白質の画像化は多くの遺伝子工学プロセスの最終目的である ことが多い。しかし、それは一般的生物学、生化学、および医学的研究において 大きく立ちはだかる分野でもある。実際、蛋白質分析に少しでも依存しない生物 科学分野を考えることは難しい。この場合も分析は通常電気泳動法に基づいて行 われ、マーカーの添加に依存する。化学発光および特殊な化学的染料も用いられ るとはいえ、概してこれら（マーカー）は放射性である。 組織画像化分野は、薬剤開発領域、および医学的および分子診断学においては 極めて重要である。伝統的にβ放射マーカーを用いて組織試料内の薬剤の分布を 画像化する。このプロセスは普通は数週間または数カ月もかかり、潜在的危険物 質の使用を必要とする。 上記のこれらの方法のすべては、放射性同位元素かその他の危険物質かどちら かを付加的に使用しなければならず、上記の方法の少なくともいくつかのものは 高価でかつ不便な電気泳動ゲルの使用を必要とすることは理解される。要するに 、主な問題は次のようなものである。 １．トレーニング。健康および安全基準は、あらゆる種類の放射能と接触するす べての作業者が放射能の取り扱い、使用および廃棄の広範なトレーニングを受け ることを要求している。 ２．使用。システムに放射能を組み込むと、複雑な、時間のかかるプロセスにな ることが多い。作業者は十分注意しなければならない、例えばＤＮＡ配列決定に 一般的に使用される同位元素³²Ｐは、パースペクスによって研究者から遮断しな ければならない。このことは、すでに複雑な実験をさらにずっと難しくする。最 初の実験に続き、すでにこわれやすい電気泳動ゲルをさらに操作することは、放 射能の存在によって複雑になる。放射能は化学発光または生物発光からなる画像 化手段(imager)に置き換えることができる。しかし、これらはより安全ではある が、その使用はまだ複雑である。 ３．時間。これらの画像化システムは、オートラジオグラフィーを使用して核酸 または蛋白質を可視化することに基づく。これは１枚のフィルターペーパー上で ゲルを乾燥し、それを１枚の写真フィルムにさらすことによって実現する。フィ ルムはどうあっても２４時間ないし３カ月間さらさなければならない。そのため 、実験がうまくいったかどうかがわかるまでにさえ数日から数カ月はかかる。こ れは分子生物学においては大きい問題であり、研究プロジェクトの期間を著しく 延長する。 ４．費用。これらの実験の種々の成分は高価である。放射能は自然崩壊するため 貯蔵寿命が限られ、しかも高価である、³⁵Ｓは配列決定反応２０回につき約２５ ０ポンドかかる。使用するフィルムも、そのいくつかは３５×４５ｃｍの大きさ のものを使用することになるので、非常に高価である。 ５．廃棄。これらのプロセスは大量の固体および液体廃棄物を発生し、そのすべ てを合法的に、責任をもって廃棄しなければならない。これらに要する費用は非 常に高く、さらに面倒である。 本発明の第１の態様は、試料にＵＶ光を照射し、選択した群の分子の位置をそ の群の分子の分子ＵＶ吸収によって検出することを含んでなる、生物学的試料中 の分子の画像化法を提供する。 本発明の第２の態様は、試験すべき試料を照射するように配置されたＵＶ光源 と、選択した群の分子の位置をその群の分子の分子ＵＶ吸収によって検出するよ うに配置されたＵＶ検出器とを含んでなる、生物学的試料内の分子を画像化する 分子画像化装置を提供する。 本発明の別の態様は、分析すべき試料を担う電気泳動材料、その材料に電位差 をかけ、それによって試料をその材料に沿って動かす（移動、または漂流させる ）手段、およびその材料の１部分に位置し、選択した群の分子がその検出器を通 過して移動するときにその分子を検出するように配置された固定検出器とを含む 電気泳動装置を提供する。 さたにまた別の態様によって、分析すべき試料を担う電気泳動材料と、その材 料に電位差をかけ、それによって試料をその材料上を動かす（移動、または漂流 させる）手段と、その材料を照射するように配置された光源と、選択した群の分 子の位置を、その群の分子の分子光吸収によって検出するように配置された検出 器とを含む電気泳動装置が提供される。 本発明の好適な方法において、分子は、それらの固有のＵＶ光吸収を検出する ことによって画像化される。本発明のこの態様においては、核酸断片であろうと 、蛋白質、または実にポリペプチド鎖であろうと、分子そのものの固有の画像を 用いる。光学的スペクトロメトリーの公知の方法とは異なり、分子ＵＶ吸収スペ クトロメトリーを用い、画像は分子の吸収から生ずる。重要な利点は標識がな いことである。 これは多くの重要な結果をもたらす。多分、最も明らかなことは危険な標識は 、それが放射能であろうと公知の発癌物質様臭化エチジウムであろうと、もはや 必要とされない。もう一つの問題は、配列決定反応では、標識がないため、配列 決定し得る塩基数に関する大きな制約の一つ、すなわち試料内に挿入される放射 能量が除去されることである。 好適には、興味の対象である分子は、ダイアモンド検出器上の核酸、蛋白質ま たは組織地図の画像化により、それらの分子の吸収を検出することによって直接 画像化される。これは画像化すべき物体を、核酸であれ、蛋白質または組織であ れ、ヘリウム放電管のような広域スペクトル装置かまたは１９６ｎｍのエキシマ ーレーザーのような単色レーザーからの一定輝度のＵＶ光で照らすことによって 実現する。画像化すべき物体の後に置かれた検出器に異なる量の光が達するのが 認められる。二次元または三次元の画像化の場合は、影も同時に画像化され、そ れによって物体が同定される。これはピクセル・デバイスまたはピクセル化リッ ジ（隆起）デバイスのような二次元検出器を必要とする。 指向性レーザーのすぐれた場合には、同定すべき物体を平面（ストリップ電極 ）または隆起した一次元検出器上で走査し、二次元画像を作成する。後者の場合 は別の方法で優れている。非平行レーザー・ビームで２回（またはそれ以上）走 査することにより、立体的画像（３Ｄ）を再構成することができる。 本発明を核酸操作および定量に適用する場合、この方法によって透過エネルギ ーと吸収エネルギーとを量的に区別することができよう。これらの条件下におけ るＤＮＡの定量は、治療に用いる特殊の蛋白質の製造に使用する発現ベクターの 作成に重要な用途を有する。 本発明をペプチドおよび蛋白質の画像化に用いるとき、ＤＮＡ制限酵素地図を 画像化するために用いるものと同じ機器を用いることができる。本発明によって もたらされる画像化速度は、３カ月もかかることがある従来の技術にくらべて著 しい利点を有する。 このような考えは、核酸のための最適範囲でもあるは波長２３０ｎｍ以下のＵ Ｖ光の、蛋白質による吸収に基づく。こうして同じ検出器が両タイプの分子を 画像化することができる。この特徴の付加的利点は、脂質、炭水化物およびその 他の小マクロ分子がこの範囲ではＵＶを（もし吸収するとしても）わずかしか吸 収せず、そのため画像上の生物学的ノイズの固有の本質的濾去が可能になること である。 このスペクトル反応はダイアモンドのそれに理想的にマッチする。ダイアモン ドは２２４ｎｍで動作し（turn on）、それより大きい波長または小さいエネル ギーの光には極端に不感受性である。これは検出器がもつべき非常に力強い特質 である。ダイアモンド検出器のための典型的波長領域は約１８０〜２２４ｎｍで あるが、下限は検出器メジウムよりも材料および（または）光源によって与えら れるから、より低い波長の検出はあらゆる事情において排除しなくてよい。いく つかの出願においてシリコン検出器が用いられた（検出領域１９０−３００ｎｍ ）。光電子増倍管を用いることもできる。 組織画像化にこれを応用する場合、ピクセル化検出器を用いるか、またはスト リップを用いる（この場合光源がこのストリップに垂直に走査される）ことによ って二次元画像が作り上げられる。本発明の好適実施態様において、ダイアモン ド検出器が使用され、そしてそのダイアモンドをピクセル化するか、またはＵＶ 光源をストリップに垂直に走査することによって二次元画像が作り上げられる。 非常に有用なことに、同じ検出器で画像化された、非平行レーザーからの画像を 加えることによって、三次元立体画像を形成し得ることである。この場合には、 三次元構造を決めるパララックスシフトによって読み出しする検出器とともに、 レーザーを交互にストロボ照射することが提案される。高度に解析された三次元 画像から、誘導すべき組織構造に関する詳細が与えられる。これは新薬の開発時 間を著しく切り詰め、したがって全体的費用を減少させる。 １実施態様において、本発明は例えばＤＮＡ配列決定のための電気泳動装置に も及ぶ。装置は好適には、光源からのシグナルの変化を、電気泳動ゲル上の光源 と検出器との間を通過する核酸バンドとして定量的にモニターする。バンドが検 出器を通過するとき、それらは直接データベースに数字で記録される。 この装置はさらに、電気泳動のために不活性の再利用可能の固相を用いるとい う概念を組み込むことができる。ＤＮＡシーケンサーでは、固相は石英基板（例 えば管）上に被覆されるかまたはその他の方法で支持され、４塩基のためには４ 本の別々の管があるのが好ましい。 本発明の主な利点または本発明の従属的態様をまとめて以下に記す。 １．トレーニング。システムからの放射能の排除は健康および安全トレーニング の必要性をなくす。 ２．使用。実験プロセスからの放射能またはその他のあらゆる外部からの画像化 成分の排除はこれらの反応効率および速度を劇的に高める。標識化段階（放射性 マーカーを反応に加える場合）は複雑であることが多く、実験の最後までその失 敗に気づくことができない。 ３．時間。分子生物学では実験が計画通りに行かなかったことを確認するまでに 時間がかかるために、多くの時間が失われている。しかし、例えばシーケンシン グ・ゲルの結果を時間単位でなく分単位で画像化することができれば、ヒト・ゲ ノム・プロジェクトのような大規模シーケンシング操作の効率を劇的に高めるこ とができることが期待される。それは反応中の諸問題のより早い発見を可能にす る。 ４．費用。この方法を基礎にしたハードウエアーの応用はあらゆる研究グループ の消費可能予算からの基金の大幅削減に導くかも知れない。最初の装置のコスト 後、多くの分子生物学研究グループは彼らの放射能およびフィルム必要経費が実 質的に低下することを期待できる。 ５．廃棄。環境的にこの方法の利益は大きい。システムから放射能がまるごと排 除されるため、その廃棄の必要性はもちろんなくなる。 本発明のもう一つの態様により、下記の段階を含んでなる物質混合物中の個々 の物質を同定する方法が提供される。すなわち、 （ａ）混合物を、間隔をおいた複数の検出器を通って移動させ、各検出器Ｉ_k は混合物が検出器Ｉ_kを通るとき、その混合物の特徴をあらわすシグナルＳ_kを 生成するように配置し、 （ｂ）各検出器Ｉ_kで、複数の時間 ｔ＝ｔ₁、ｔ₂、ｔ₃... にシグナルＳ_k( ｔ)を反復測定し、 （ｃ）公称速度Ｖ_k(ｔ)（移動混合物中の或る物質が時間ｔに検出器に達す るために必要な速度）によってシグナルＳ_k(ｔ)をグループ化し、 （ｄ）混合物中の個々の物質を、グループ化したシグナルのコレクション中 のピークによって同定する。 もう一つの態様により、下記の段階を含んでなる物質混合物中の個々の物質の 同定法が提供される。すなわち、 （ａ）混合物を、間隔をおいた複数の検出器を移動させ、各検出器Ｉ_kは、 混合物が検出器Ｉ_kを通るとき、その混合物の特徴をあらわすシグナルＳ_kを生じ るように配置し、 （ｂ）各検出器Ｉ_kで、複数の時間 ｔ＝ｔ₁、ｔ₂、ｔ₃... にシグナルＳ_k( ｔ)を反復測定し、 （ｃ）シグナルＳ_k(ｔ)を速度空間においてグループ化し、 （ｄ）混合物中の個々の物質を、速度空間においてグループ化したシグナル 中のピークによって同定する。 速度空間に変換し、時間的に統合することによって、個々の物質（例えば生物 分子）は速度空間における個々のスパイクまたはピークとして速やかに同定され る。各ピークのサイズおよび（または）巾を用いて個々の各物質の量の測定値が 得られる。 用語“物質”の使用は極めて広い意味で読まれねばならない、なぜならば最も 一般的な形におけるこの方法は、生物分子の識別および同定以外の多くの用途に 応用できるからである。同じ方法が例えば共通のパイプラインを流れる個々の物 質の流れを同定するために用いられるし、トラフィック流の分析の場合のような 個々の異なる物にも応用できるかも知れない。 速度空間への変換において、移動する混合物中の或る物質が或る検出器Ｉ_kに 、その検出器からのシグナルが記録される時間ｔに、到達するために必要な速度 が計算される。この公称速度は“Ｚ_k／ｔ”として計算される。ここでＺ_kは起点 から検出器Ｉ_kまでの距離であり、ｔは経過した時間である。しかし公称速度を 決める他の方法がある、例えば既知の物質が１つの検出器から次の検出器まで移 動するのにかかる時間を測定するのである。バンドの特定配列を１検出器で同定 し、そのバンド配列が平均して次の検出器に移動するためにかかる時間を測 定することによって速度を決定することもできる。その方法で配列内の個々のバ ンドが同定され、２つの離れた検出器で正確に時間を記録する、それから速度を 両検出器間の距離の知識から計算する。 本発明は多くの方法で実地に行われる。いくつかの特殊の実施態様を実施例の 形で図を参照して説明する。 図１は、先行技術の検出器を示す。 図２は、本発明の方法および装置で使用するために適した検出器の断面図であ る。 図３は、図２の検出器の斜視図である。 図４ａは、別の実施態様を示し、電極は二極性電圧構造で連結している。 図４ｂは、図４ａの実施態様を示し、電極は抵抗鎖構造で連結している。 図５は、本発明の方法および装置で使用するのに適した検出器のまた別の実施 態様を示す。 図６は、本発明の実施態様を含む分子画像化装置を示す。 図７は、図６の画像化装置の側面図である。 図８は、本発明の別の実施態様を構成する自動ＤＮＡシーケンサーの略図であ る。 図９は、図８に示されるシーケンサーを通る略断面図である。 図１０は、分離しつつある生物分子の好適実施態様の略図である。 図１１は、好適分析の結果を速度−間隔のグラフとして示す。 先ず最初に図６および図７では、本発明の一つの形の好適実施態様を構成する 分子画像化装置が示される。図６および７に示される装置は主として核酸／蛋白 質イメージャーであり、大部分直線的なこの形において、概して平らな基底部分 （７１０）、基底部分の１端に沿って固定されたボディ部分（７１５）および長 いヒンジ（７３０）によってボディ部分にピボット状に固定された蓋（７２０） を含んでなる。蓋と基底部分の間には電気泳動ゲル・マウント（７４０）がある 。基底部分（７１０）には走査ＵＶ検出器アセンブリーが組み込まれるが、必ず しもこの後で図１ないし図５を参照して説明するような形の検出器をもたなくて もよい。 このイメージャーを使用するために、最初に蓋（７２０）を持ち上げ、画像化 すべき試料（示されていない）をマウント（７４０）上に置く。その試料は特に 、電場を用いて一般的方法で分離した分子試料を含む電気泳動ゲル、生物学的組 織の薄い切片、または適した平らなマウントの表面に増殖した細胞単層を含む。 ひとたびその試料が正しい位置に置かれた後、蓋（７２０）を閉じ、蓋の下側に 取り付けられた紫外線光ボックス（７２２）にスイッチが入れられる。これは試 料に紫外光を浴びせ、検出器が試料を横切って走査するとき、ＵＶ吸収量が、基 底部分と一緒になった検出器アセンブリーによって検出される。検出された試料 表面の吸収パターンは数字化され、データポート（７５０）を介して、適切なグ ラフィックス プログラムを行う外部のコンピューター（示されていない）に伝 達される。 光ボックス（７２２）は例えば重水素ランプなど、いかなる紫外線源を組み込 んでもよい。スイッチ（７２３）により使用者はＵＶ波長間をスイッチすること ができ、核酸も蛋白質も容易に画像化することができる。 別の配列では、蓋（７２０）に固定された横方向の走査アセンブリー（示され ていない）にＵＶ光源を取り付けることができる。この配列ではＵＶ光源は試料 を横切って走査し、その間基底部分（７１０）内の検出器は一定の場所にとどま る。ＵＶ光源も検出器も両方とも走査アセンブリーに取り付け、両アセンブリー が同じ速度でゲルを横切って走査することもできる。好適配列またはこれに代わ る配列どちらにおいても、整調可能レーザーを光源として用いる。一つの特殊な 配列において、１対のレーザー、またはそれに代わってツイン・ビーム・レーザ ー、が備えられ、これらビームが異なる方向から試料を照射する。これによって 立体画像化を行うことができ、適切なビーム走査メカニズムの使用によって三次 元ならびに２次元画像化ができる。そのような画像化は、研究者が試料の深さ内 部の核酸および（または）蛋白質を研究できるため、非常に役に立つ。例えば、 個々の細胞内の核酸および蛋白質の分布を検出することができるであろう。示差 吸収標識を用いることができれば、薬剤が細胞内に蓄積する仕方を検出すること ができる。ウィルスが細胞内でどのように増えるかも検出することができる。 後で図１ないし図５を参照して説明するが、好適ダイアモンド検出器を使用す る利点は、その検出器が本来、特別関心のない生物学的構造、例えば脂質および 炭水化物に起きる吸収にはかなり不感受性であるということである。特殊の用途 に応じて、簡単な実験により適切な解析が行われる。合理的解析で核酸および蛋 白質を検出するために、約５μｍと２００μｍとの間のリッジ・サイズ（巾）を 用いる。 次に図８および図９を参照する。これらは本発明の別の形の実施態様による自 動ＤＮＡシーケンサーの略図である。 図８および図９は、提案の配列決定機の１サブユニットを示す。機械は全体と してこのようなサブユニットを４または５個含む。各サブユニットは緩衝溶液（ ８２０）を含む頂上の緩衝液貯蔵器（８１０）、緩衝溶液（８４０）を含む下方 の貯蔵器、ＵＶ光源（８７０）または複数のこのような光源、標準読み出し装置 （８６５）に連結したＵＶ検出器（８６０）、緩衝溶液（８２０）に結合した陰 極（８２２）、緩衝溶液（８４０）に連結した陽極（８４２）を含む。装置は４ 本の固相基質管（８５０）も含み、これらは上方および下方貯蔵器間に延びる。 上方および下方貯蔵器（８１０）、（８３０）は両方とも透明なプラスチック 材料から作られており、システムが過剰の酸性にならないように簡単な緩衝溶液 （８２０）、（８４０）を含む。固相基質管（８５０）は頂上で緩衝溶液（８２ ０）に接触し、底部で緩衝溶液（８４０）に接触する。 光源（８７０）としては、例えばＵＶランプ、重水素ランプ、または放電ラン プが挙げられる。さらに、２２０ｎｍないし１８０ｎｍの領域で働くことができ るレーザー、またはダイオードであってもよい。 検出器（８６０）は光源（８７０）の波長にマッチするいかなる適した光検出 器でもよい。その検出器は好適にはダイアモンド・リッジ検出器を含んでなる。 これは後で図１ないし５を参照してより詳細に説明する。リッジの巾は検出すべ き波長および必要な解析に応じて、５ないし２００μｍである。リッジの狭さ、 および実質上平面的照射が用いられるという事実が、高度の正確さおよび解析を 可能とする。 検出器（８６０）は、出口（８６５）で数字的読み出しを提供する適切なエレ クトロニックスに連結する。標準的読み出し装置、例えばラビュー(Labview、登 録商標）などは、適切なデータベース・プロセッサー、例えばマクベクター(Mac Vector、登録商標）またはマックＤＮＡシス(MacDNAsys、登録商標)などに直接 インプットする。 固相基質管（８５０）は適した固相基質を含む４本の石英管を含んでなる。適 した材料としてはシリコン・ベースの既存のゲル基質、例えばセファデックス（ 登録商標）群が含まれる。固相は比較的ＵＶ透過性であり、再利用可能である。 管の長さは選択した固相の正確な性質によって決まるが、普通は１５ないし２０ ｃｍ以下である。 使用に際して、電圧を陽極と陰極との間にかけ、固相基質管（８５０）の長さ に沿って電位差を生じさせる。検出すべき４つの個々の反応物が各々それらの別 々のカラム上に置かれ、陽極に電気泳動する。バンドが光源（８７０）と検出器 （８６０）の間を通過するとき各バンドの簡単な定性的画像がデータベースに数 字として記録される。生成した数字情報は即時に読み出してもよいし、電気泳動 が完了するまで検出システム・エレクトロニックス内に保存してもよい。すべて の情報をその後一度に読み出すことができる。 シーケンシング混合物がカラムを通過した後、電場および緩衝溶液に連続的に さらすことによってＤＮＡの痕跡をすべて除去することができる。徹底的に洗っ た後、その固相を再利用することができる。 本発明の装置の操作の簡単さおよび固相の再利用可能性は、少なくとも１部は 放射性標識化をもはや必要としないという事実によってもたらされることは注目 しなければならない。 もちろん、本発明はその大部分の一般的形では上記の特殊の特徴に制限されな いことは当然である。適した同等の装置は熟練せる当業者によって容易に製作さ れ、これら構造の正確な詳細は関心とする特殊領域に依存する。本発明の装置お よび方法が利用される特殊領域としては次ぎのものがある：組織画像化、例えば 薬剤の標的化、パーフォーマンスおよび細胞診断、核酸インターロゲーションお よび地図作成―配列決定、制限酵素地図作成、定量、高圧液体クロマトグラフ ィー（ＨＰＬＣ）およびオリゴヌクレオチド精製を含める、蛋白質画像化―ペプ チド分析および核酸操作および医学的診断のモニターを含める。 適切な使用では、下に図１ないし５を参照して説明するようなＵＶセンサーが 用いられる。このような使用は、画像化が大体２２０ないし１９０ｎｍの範囲で 行われるような使用であるらしい。しかし詳細に記載されているような隆起した 形状(ridged topology)を用いる必要はなく、或る用途には平面ダイアモンド検 出器が非常に適している。ダイアモンド検出器の長所はノイズがほとんど完全に ないこと、そのすぐれた量子効率、およびその直線性である。 ダイアモンド検出器を使用するには適さない領域、例えば２２０ないし２９０ ｎｍ領域（ここではＤＮＡが吸収する）では、ダイアモンドでない半導体を使う ことができる。適した検出器としてはＵＶを高めるシリコン検出器および光増倍 管が含まれる。 本発明の好適実施態様は分子の本来の吸収特性（光にさらされたとき）を利用 してもよいし、或いは関心とする分子に付着させた標識の吸収特性を利用しても よい。異なる分子付加物を有する特殊化分子吸収体を利用して感度を改良するこ とができる。このような吸収体は無毒性である。 本発明のいくつかの実施態様において、立体ＵＶレーザーを用いて、簡単なシ ャドウイング(shadowing)ソフトウエア 技術によって、走査中の物体の複雑な 構造の三次元画像を作成することができる。この場合も、これは、被検分子の固 有の吸収特性を用いて、または特殊化された分子吸収体標識の使用によって実現 する。 典型的先行技術の荷電粒子検出器を図１に示す。検出器は絶縁材料、例えばダ イアモンドなどの平らなシート（１０）を含んでなり、この上面および下面には 薄い金電極コーティング（１２）、（１４）がある。上方電極コーティング（１ ２）はこの図では紙面に垂直方向に一列に並んだ複数の読み出しストリップを含 み、下方電極コーティング（１４）は紙面と平行方向に一列に並んださらに複数 の読み出しストリップを含む。大きい電位差Ｖが電極コーティング間に維持され る。頂上または底部電極のどちらかが一定で(continuous)、ストリップは交番極 性を有する。 ダイアモンドを通過する路（１６）を辿る荷電粒子は電子孔対（１８）、（２ ０）を生じ、それら電場の影響下で分離し、読み出しストリップに電荷を誘起す る。粒子のエネルギーは集められた電荷の量によって測定でき、その位置は最も 大きい誘起電荷を受ける上方および下方ストリップの交差点によって決定される 。 本発明の方法および装置で使用するのに適した好適検出器をここに図２および 図３を特に参照して詳細に説明する。それはダイアモンド検出器で、１面に複数 の平行した、エッチングされたダイアモンドリッジ（４０）を有するダイアモン ド基板（３０）を含んでなる。各リッジの１端には正の読み出し電極（５０）が あり、他端には負電極（６０）がある。これらは導体であるのが好ましいが、代 わりに、高伝導度を与えた半導体材料であってもよい。 使用中、基板が、検出すべき粒子または照射ビーム（７０）に実質上垂直にな るように、検出器が配置される。リッジの１つに入る個々の粒子はイオン化され た担体を作り出し、それらは電極間に維持される大きい電位差のため、速やかに 電極（５０）、（６０）に移動する。そのため電極には電荷が生じ、この電荷は リッジ末端の読み出し装置（示されていない）によって読み取られる。 基板およびリッジは好適にはダイアモンドである。そのダイアモンドは天然も のでも人工的に大きくしたものでもよい。リッジは基板とともに成長させてもよ いし、それらはエッチングしてもよい（例えばエクシマーレーザーで）。電極（ ５０）、（６０）は、適した処理（例えばアブレーション、イオン・インプラン テーションまたはアニーリングなど）でダイアモンド表面にオーム接触を形成す るいかなる材料またはいかなる材料の組み合わせ（例えばチタン、バナジウム、 クロムおよび（または）金）でもよい。標準的付着法を用いてリッジの側面に金 属を薄いコーティングとして塗布する。一般的にはこの装置は、リッジをエッチ ングし、金属を付着し、それから最上面をみがくことによって作られる。 図２から、示される装置の感度はＤ値（またはリッジの高さ）を大きくするこ とによって高められることは理解できる。リッジの高さを高くすればするほど、 粒子が通過しなければならない物質の量は大きくなり、そのため装置内における イオン化は大きくなる。リッジの高さは通常、検出すべき粒子または光子の予想 される浸透深さに合わせる。読み出し速度および効率は各リッジの巾Ｌによって 決まる。特殊の用途によってＬの値は数マイクロメーターのように小さくても、 約２００μｍまでの比較的大きい数値でもよく、Ｄ値は１０μｍ以上である。シ グナル対ノイズ比は大きい、それは個々のリッジから発するシグナル間の漏話(c ross-talk)が無視し得る程だからである。典型的基板深さは約１００μｍであり 、リッジを支持し、付加的支持体の必要なく自立構造で立っているのに十分の厚 さである。好適にはこの装置は、再結合長さが多分６μｍ程度の比較的低品質の ダイアモンドを使用する。 リッジ末端の読み出し装置（示されていない）のインピーダンスは電極（５０ ）、（６０）のインピーダンスとマッチングするのが好ましい、それによって読 み出し速度を高め、シグナル損失を減らすことができる。 図２に示される電極（５０）、（６０）間に電位差をかける方法は多数ある。 最も簡単な形では、電圧源を単に２電極間で連結する。或いは電極を抵抗鎖（示 されていない）に結合す、この場合、電極間の電位差は対応する抵抗の電位降下 によって決まる。 その他の実施態様を図４に示す、ここでは電極は基板上およびダイアモンドリ ッジ（４０）間の空間の両側に形成される。これは実際的には、次々にリッジ（ ４０）の左側の各電極（５０′）が次のリッジの右側の対応する電極（６０′） と電気的に対になり、それらは一緒になって１つＵ型電極（６１）を形成するこ とを意味する。図４ａの実施態様において、Ｕ型電極（６１）の第１の交互対は 第１の電圧源Ｖ₁に結合し、第２の交互対は第２の電圧源Ｖ₂に結合する。このよ うな二極電圧構造は、リッジ（４０）の各々に定電位差Ｖ₁−Ｖ₂が常に存在する ことを確実にする。 電圧をＵ型電極（６１）にかける別の方法を図４ｂに示す。ここでは抵抗鎖を 用いて、入力電圧Ｖを複数のシリーズ抵抗Ｒを経て降下される。各リッジ（４０ ）を通る電圧はＶおよびＲの適切な数値を選択することによって決まる。 同様な二極性電圧構造または抵抗鎖電圧構造を図２の実施態様と組合わせて用 いることができるのは当然である。 リッジ（４０）にかかる典型的電位差はμｍあたり１ボルトの領域である。所 望ならば実質的により高い電圧を用いることもできる（ダイアモンドは非常に高 い破壊電圧を有するため）、しかしより大きい電圧では担体速度が急速に飽和す るから、高電位差は概ね必要ない。 その他の実施態様（示されていない）では、第１のリッジ組に直交するもう一 つの平行なリッジ組が基板（３０）の下面に取り付けられる。これらの２つの垂 直するリッジ組は検出すべき各粒子の正確なｘ−ｙ位置決めを可能にする。 リッジ間の空間はプラスチック材料またはその他の吸収体で充填され、それに よって中性粒子を検出する検出器能力は改良される。 もう一つの実施態様を図５に示す。ここではリッジ（４０）間の空間が極めて 狭くなり、それらは各々別個の電極（６２）を含む。このような実施態様は、多 くの状況に適する、なぜならばリッジ（４０）間の隙間が狭いため、図２、図３ およ図４の実施態様と比較してアクセプタンス ロスが小さいからである。隙間 の巾、したがって電極（６２）の巾は主としてダイアモンド基板に如何に狭いス ロットを切ることができるかにかかっている。電極（６２）は便利な方法、例え ば図４ａまたは図４ｂの方法を用いて対になり、リッジ（４０）間に適切な電位 差を生じさせる。 例えばガンマ線などの高エネルギー電磁放射の検出は、シャワーリング層（示 されていない）をリッジ頂上に加えることによって改良することができる。入っ てくる光子は最初にシャワーリング層にあたり、生成するシャワーがその後下の リッジの１つに浸透し、検出されるシグナルを与える。 上記の電離放射線検出器は極めて速い電荷読み出しを、多分３５ｐｓ以内、確 実には５０ｐｓ以内に行うことができる。これらの読み出し速度は、現在のとこ ろ匹敵する感度および位置的正確さを有するいかなる単一パルス検出器でも実現 することはできない。 次ぎに、上記装置を実際に用いて混合物内の個々の分子を同定する方法につい て論ずる。 図１０はその配置を略図として示したものである。分子が移動する長い基板 （９１０）の片側にＵＶランプ（９２０）があり、他の側に間隔をおいた一連の ＵＶ検出器Ｉ₁、Ｉ₂、Ｉ₃、....Ｉ_nがある。前に述べたように、検出器要素前方 の生物分子のバンドの通過を検出することによって配列決定が行われる。生物分 子は関心とする領域のＵＶ光を吸収するから、検出器前のいかなるバンドの通過 も、その検出器要素のＵＶ光源（９２０）による絶え間ない照射（９３０）によ って起きる公称ＤＣ電流をドロップさせる。電流のドロップは測定され、標識が 付けられ、或る生物分子バンドに関連づけられる個々のシグナルとして処理され る。名目上、電気泳動ゲルでは与えられたバンドの速度はバンドの核酸の塩基配 列の量の根に逆比例する、塩基配列の電荷は、摩擦減速力によってその長さから 分離され、その長さに比例するこの摩擦減速力によって生ずる“末端速度”が課 される。 個々の分子を同定するために、この系は時間ｔ＝ｔ₁、ｔ₂、ｔ₃... における 検出器Ｓ_k配列のシグナルＳ_k(ｔ)の塩基配列を自動的に集める。 さて、各検出器要素の位置は既知であり、経過した時間も既知であるから、特 定分子が与えられた経過時間に特定検出器に到達するために必要な速度を計算す ることができる。例えば、経過時間をｔ₀＝０から測定し、検出器Ｉ_kが起点０か ら距離Ｚ_kのところにあると仮定すれば、式Ｚ_k／ｔによって公称速度Ｖ_k(ｔ)を 計算することができる。 各シグナルＳ_k(ｔ)はその後、公称速度によってグループ化され重みづけされ て作られているヒストグラム中の適切なビンに加えられる。個々のシグナルをい かなる便利な方法で適切なビンに加えてもよいが、好適実施態様においては重さ ｗが各シグナルごとにビンに加えられ、その重さはシグナルサイズＳ_k(ｔ)に比 例する。速度空間にプロットされた重さの対応するグラフまたはヒストグラムが 図１１に示される。 検出すべき異なる各生物分子は異なる長さをもつから、それは異なる速度で運 搬され、したがって図１１のヒストグラムの異なる場所にあらわれる。個々の分 子はヒストグラムにおいて分離したスパイクまたはピークとしてあらわれる、示 した実施例では分子Ａ、Ｂ、Ｃが検出された。 １つの可能な配列では、シグナルＳ_kが時間ｔ₁、ｔ₂、ｔ₃... に反復して集め られる。すべてのデータが集められたならば、それらをその後、図１１に示すよ うにプロットし、分析する。だが別のより好適な配列では、データを集めたとき にそれらをグループ化する。このような配列の利点は、図１１に示すようなグラ フを例えばコンピューター スクリーン上でプロットし、即時に最新の情報にす ることができることである。データ収集が進むにつれて、検出分子をあらわすス パイクは徐々によりはっきりしてくる。 検出器の逐次的サンプリング間の時間間隔は用途によって選ぶことができるの は理解できる。好適実施態様では、サンプリングは１００ミリ秒ごとに行われる 、しかし他の用途ではその期間は数ミリ秒のように小さくても、数分または数時 間と大きくなってもよい。読み出しエレクトロニクスがデータ流を処理できるな らば、時間をだんだん短くしていくことに対して支払われる実際的代償はない。 その上、次に時間間隔を置く必要がない、ただし実際には測定の次ぎに隣接時間 (contiguous period)がある方がより便利であるかも知れない、特に期間が漂流 速度、バンドのサイズおよび幾つかのその他の要因によって決まる本発明におい てはこれが言える。 各検出器Ｉ_kにおけるシグナルＳ_kは、ビーム（９３０）の通路に分子が１つも ないときに存在する公称ＤＣレベルからの電流相殺をあらわすことを思い出して ほしい。統計的変動がこのシグナルを負（平均ＤＣレベルより上）または正 （平均ＤＣレベルより下）にするかも知れない。平均するとこれらは帳消しにな る傾向があり、データをより多く集めるにつれてノイズは徐々に抑制される。個 々の物体を追おうとしないで、その代わりに各段階で速度空間の数値を“盲目的 ”に合計することによって、その物体が自然に、非常に速く、ノイズが最小にな るような仕方で自動的に見いだされる。必要なハードウエアは非常に単純であり 、ソフトウエアおよび分析はさらに簡単である。ハードウエアは例えば容量性の 要素にシグナルＳ_kに釣り合う量だけ電荷をかけることによって作られる。 この方法のその他の利点は、バックグラウンドの差し引きが自動的に行われる のみならず、得られる精度が個々の検出器要素からの情報を単純に使用すること によって可能になる精度よりもはるかに大きいことである。全体として配列Ｓ_k からの情報は、個々に検出器を考慮して得られるよりもより大きい情報を、した がってより大きい精度を提供する。 さらに、本方法では定量もできる。図１１の各スパイクの高さおよび巾を考慮 することによって、各検出物質が元の混合物中にどのくらいの量含まれていたか を或る程度正確に測定することができる。 実質上平面の光ビーム（９３０）、および指向性検出器の使用は、分子が検出 器を通過するときに、その分子がそこに位置することを極めて正確に確実にする 。検出すべきシグナル、例えば放射能またはＵＶ光、を放射する分子でここに記 載の方法を使用することはもちろん可能であるが、精度は、付加的散乱によって 、および同じシグナルを生成するためには分子濃度はより高くなければならない という事実（なぜならば放射される光または放射能の大部分は、全方向に放射さ れるため無駄になるからである）によって、低くなりそうである。シグナルを生 成するためにＵＶ吸収を利用することによって、より速く動き、より速く分離す る非常に小さい分子を使用することができる。これは読み取り時間を従来の数時 間から多分数分に著しく短くすることができる。 ここに述べた方法は生物分子の塩基配列決定以外の用途にも使用できる。この ような技術が使われるその他の用途は、例えば供給パイプの個々のアイテムの追 跡またはトラフィック流のモニターにおけるオンライン・プロセス・コントロー ルを含める。より一般的には、本発明の方法は時間変化−多次元密度分布におけ るアイテムの分布の評価に用いてもよい。本発明の一般的方法は物質混合物中の 個々の物質を同定するのみならず、それらの比率も計算することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 コーリング，デイヴィッド，ジョン 英国 ダブリュ２ ３イーイー ロンドン クレイヴン ヒル ガーデンズ 22 ヒ ルトン ハウス 14

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．物質混合物内の個々の物質を同定する方法であって、 （ａ）混合物を、間隔をおいて配置した複数の検出器を経て移動させ、各検 出器Ｉ_kを、混合物が検出器Ｉ_kを通過するときにその混合物の特徴をあらわす信 号Ｓ_kを生ずるように配置する段階と、 （ｂ）複数の時間ｔ＝ｔ₁、ｔ₂、ｔ₃... に各検出器Ｉ_kで信号Ｓ_k(ｔ)を反 復測定する段階と、 （ｃ）公称速度Ｖ_k(ｔ)によって信号Ｓ_k(ｔ)_kをグループ化し、該速度を、 移動する混合物内の物質が時間ｔに検出器Ｉ_kに到達するために必要な速度とす る段階と、 （ｄ）グループ化した信号のコレクション内のピークによって混合物内の個 々の物質を同定する段階と、 を有することを特徴とする混合物内物質同定方法。 ２．物質混合物内の個々の物質を同定する方法であって、 （ａ）混合物を、間隔をおいて配置した複数の検出器を経て移動させ、各検 出器Ｉ_kを、混合物が検出器Ｉ_kを通過するときにその混合物の特徴をあらわす信 号Ｓ_kを生ずるように配置する段階と、 （ｂ）複数の時間ｔ＝ｔ₁、ｔ₂、ｔ₃... に各検出器Ｉ_kで信号Ｓ_k(ｔ)を反 復測定する段階と、 （ｃ）速度間隔において信号Ｓ_k(ｔ)_kをグループ化する段階と、 （ｄ）速度間隔におけるグループ化した信号内のピークによって混合物内の 個々の物質を同定する段階と、 を有することを特徴とする混合物内物質同定方法。 ３．信号Ｓ_k(ｔ)を全部集め、その後の段階でグループ化することを特徴とする 請求項１または請求項２に記載の混合物内物質同定方法。 ４．信号Ｓ_k(ｔ)が集まるにつれて、それらがグループ化されることを特徴とす る請求項１または請求項２に記載の混合物内物質同定方法。 ５．請求項１に従った場合に、公称速度Ｖ_k(ｔ)が、起点から検出器Ｉ_kまで移動 する距離および経過時間の情報から決定されることを特徴とする請求項１ないし ４のいずれか一項に記載の混合物内物質同定方法。 ６．公称速度がＺ_k／ｔとして計算され、前記式中Ｚ_kは起点から検出器Ｉ_kまで の距離であり、ｔは経過時間であることを特徴とする請求項５記載の混合物内物 質同定方法。 ７．信号Ｓ_k(ｔ)が、複数の公称速度ビン内の数値を合計することによってグル ープ化されることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか一項に記載の混合物 内物質同定方法。 ８．同定すべき物質による光吸収の結果として、信号Ｓ_kは、検出器によって受 容される光の減少をあらわすことを特徴とする請求項１ないし７のいずれか一項 に記載の混合物内物質同定方法。 ９．信号Ｓ_kが同定すべき物質から受ける照射をあらわすことを特徴とする請求 項１ないし請求項７のいずれかの一項に記載の混合物内物質同定方法。 １０．照射が放射性照射であることを特徴とする請求項９に記載の混合物内物質 同定方法。 １１．照射がＵＶ照射であることを特徴とする請求項９に記載の混合物内物質同 定方法。 １２．混合物内の個々の物質の比率が、グループ化された信号内のピークの相対 的大きさによって決められることを特徴とする請求項１ないし１１のいずれか一 項に記載の混合物内物質同定方法。