ES2249908T3 - Material fisiologicamente activo natural eficaz sobre enfermedades de los peces y alimento para peces que contiene el material. - Google Patents

Abstract

Uso de un material fisiológicamente activo que contiene al menos uno de ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12 para la fabricación de una formulación para tratar a los peces con enfermedades parasitarias o proteger a los peces de enfermedades parasitarias.

Description

Material fisiológicamente activo natural eficaz sobre enfermedades de los peces y alimento para peces que contiene el material.

Campo técnico

La presente invención se refiere al uso de un material fisiológicamente activo natural eficaz sobre enfermedades de los peces y a un alimento para peces que contiene el material. Más particularmente, la invención se refiere al uso de ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12 que actúan eficazmente sobre enfermedades parasitarias de los peces, y a un alimento para peces que contiene al menos uno de los ácidos grasos.

Técnica precedente

En la acuicultura, las enfermedades de los peces son problemas muy graves debido a sus grandes efectos sobre la producción estable de pez cultivado. Las enfermedades bacterianas se tratan en el campo aplicando substancias antibióticas. Sin embargo, con la aplicación de substancias antibióticas, surgen bacterias resistentes contra las substancias antibióticas usadas, dando como resultado una dificultad para asegurar la producción estable de peces cultivados y dando lugar a problemas medioambientales.

Además, recientemente, enfermedades virales han infectado pez cultivado principal en muchos casos y se han convertido en un serio problema en la industria de la acuicultura. En la actualidad, no existen agentes quimioterapéuticos eficaces para las enfermedades virales y el desarrollo de una vacuna se retrasa.

Por otra parte, enfermedades parasitarias que plantean graves problemas con la infección por el monogéneo Heterobothrium okamotoi en el fugo Tkifugu rubripes y la enfermedad del parásito de la piel en el pez limón Seriola quinqueradiata. La infección por Heterobothrium okamotoi se ha tratado en el campo solamente sumergiendo habitualmente el pez en un baño de fármaco durante aproximadamente una hora, en el que están disueltas aproximadamente 800 ppm de formalina. Sin embargo, este tratamiento meramente puede destruir aproximadamente 80% de las larvas como máximo, y no puede destruir en absoluto los parásitos adultos. Además, la formalina es una substancia carcinógena y surge un problema desde el punto de vista de la contaminación medioambiental. No se conocen medidas preventivas eficaces para la enfermedad del parásito de la piel. Los parásitos de la piel pueden destruirse completamente sumergiendo el pez en un baño de agua fresca durante aproximadamente cinco minutos o aplicando un antihelmíntico disponible comercialmente que contiene peróxido de hidrógeno como ingrediente principal. Reemplazar las redes habitualmente también es eficaz para retirar huevos unidos a las redes. Sería difícil reducir el nivel de infección en la piscifactoría a no ser que se tratara toda de una vez. Además, puesto que los huevos unidos a los filamentos de la red sobreviven después del tratamiento para destruir los parásitos, realmente se necesita repetir el tratamiento habitualmente. Especies afines que se han introducido en Japón con la lecha Seriola dumerili importada de China y Hongkong en los 1990 tienen baja peculiaridad para el huésped y se extienden no solo en la lecha sino también muchos otros tipos de peces, incluyendo el pez limón, cultivados en el mar.

Por esas razones, se demanda el desarrollo de un material natural eficaz sobre enfermedades de los peces cuando se use mediante administración oral, y el tratamiento apropiado para enfermedades de los peces usando tal material natural.

Descripción de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar el uso de un material fisiológicamente activo natural eficaz sobre enfermedades parasitarias, cuando se use mediante administración oral, y un alimento para peces que contenga el material.

Los inventores han realizado un rastreo de diversos materiales naturales con vistas a desarrollar un material natural que sea eficaz para enfermedades de los peces cuando se incluyen en alimento para consumo oral. Como resultado, los inventores han encontrado que los ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12 actúan eficazmente sobre cualesquiera bacterias, virus y parásitos que provocan enfermedades de los peces, y el uso de tales ácidos grasos mediante administración oral remedia las enfermedades de los peces y evita su presencia. Basándose en este hallazgo, se ha realizado la presente invención.

El hecho de que los ácidos grasos de cadena media tengan una actividad antimicrobiana y una actividad antiviral se conoce de por sí. Sin embargo, en el pasado, esas actividades se han demostrado mediante pruebas que solamente ponen en contacto esos ácidos grasos con bacterias y virus a un nivel in vitro, y la eficacia de esos ácidos grasos que resulte a través de la administración oral a un nivel in vivo no se ha presentado todavía, excepto la Patente Japonesa Nº 2831835, que describe acciones de ácidos grasos contra bacterias in vivo. Las acciones de esos ácidos grasos sobre parásitos que provocan enfermedades de los peces no se conocen todavía. No se han publicado informes relativos a los casos de añadir esos ácidos grasos a alimento para peces y prevenir y remediar las enfermedades de los peces provocadas por parásitos. Ejemplos de informes relacionados previos son como sigue. (Todos estos informes se basan en experimentos in vitro).

Lett. Appl. Microbiol, 27(6)362-368(1988) describe una acción bactericida del ácido láurico contra bacterias Gram positivas (Lysteria monocytogenes). Antimicrob. Agents Chemother, 40(2)302-306(1996) describe acciones de ácidos grasos de cadena media contra Helicobacter pylori. US 4002775 describe una actividad antibacteriana de ácidos grasos. Arch. Virol. 66(4)301-307(1980) describe acciones de ácidos grasos insaturados contra virus con envuelta en animales a un nivel in vitro. EP 465423 describe acciones de ácidos grasos contra bacterias y virus. Pstic. Sci. 30, 295-202(1990) describe acciones de ácidos grasos contra insectos dañinos sobre plantas (caupí Vigna catiang). Pesticide Biochem. Physiol. 50, 229-239(1994) describe ácidos grasos contra nematodos en plantas. EP 279523 describe una acción plaguicida (contra piojos) de ácidos grasos. Antimicrob. Agents Chemother, 31(1)27-31(1987) describe acciones de ácidos grasos de cadena media contra virus con envuelta. Chem. Pharm. Bull. 35(7)2880-2886(1987) describe acciones de ácidos grasos contra parásitos de perros. Fish Pathology, 32(1)15-20(1997) describe la infección por Heterobothrium okamotoi en el fugo. Fish Pathology, 33(4)221-227(1998) describe enfermedades bacterianas de peces cultivados. Fish Pathology, 33(4)303-309(1998) describe enfermedades parasitarias de peces cultivados. Gyobyo Kenkyu, 27(2)97-102(1992) describe Kuchijirosho (enfermedad ulcerosa de la boca) en el fugo.

US-A-5 208 257 se dirige a una composición farmacéutica antiparasitaria para la aplicación tópica a seres humanos o animales inferiores que evita estados de la piel relacionados con microbios. Esta composición contiene ácidos grasos C_{6} a C_{18} (cfr. el resumen, reivindicación 1).

AKAO N, y otros, Jpn. J. Parasitol, Vol. 41, Nº 6, p. 519-526 y KIUCHI F, y otros, Chem. Pharm. Bull., Vol. 36, p. 1796-1802 describen experimentos in vitro sobre la actividad larvicida del ácido cáprico.

JP-A-4158750 describe un alimento para peces que inhibe el crecimiento de patógenos virales o bacterianos que provocan enfermedades infecciosas. Este pienso puede contener un ácido graso de cadena media C6-12, por ejemplo ácido caproico, ácido caprílico o ácido láurico, o sus sales.

WO 98/23152 describe composiciones que contienen un material que tiene una actividad de vitamina C (es decir, un derivado de ácido ascórbico en la forma de un éster de ácido graso) que puede comprender glicérido cáprico o glicérido caprílico como un disolvente (cfr., por ejemplo, la página 11, 2º párrafo).

JP-A-1-2962953 describe un alimento para organismos acuáticos, en el que partículas de vitamina C son revestidas con una composición que puede comprender ácido cáprico.

JP-A-6-336443 describe una composición que contiene éster de ácido L-ascórbico y triglicéridos de ácido caprílico/ácido cáprico, composición que puede usarse para alimento o productos farmacéuticos.

Los resultados de que los ácidos grasos que tienen número de carbonos de 6 a 12 actúen eficazmente sobre cualesquiera de las enfermedades de los peces atribuibles a bacterias, virus y parásitos y de que el uso de tales ácidos grasos mediante administración oral remedie las enfermedades de los peces y evite su presencia son descubrimientos únicos realizados por los inventores. La presente invención se ha efectuado con estudios intensivos basados en ese descubrimiento.

Más específicamente, un aspecto de la presente invención reside en el uso de un material fisiológicamente activo natural definido de acuerdo con la reivindicación 1.

Cuando las enfermedades de los peces son enfermedades parasitarias, la presente invención proporciona el uso de un material fisiológicamente activo natural eficaz sobre las enfermedades parasitarias, que contiene al menos uno de los ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12 y, según se requiera, un material que tiene una actividad de vitamina C.

Los ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12 incluyen, por ejemplo, ácido caproico (C6), ácido caprílico (C8), ácido pelargónico (C9), ácido cáprico (C10) y ácido láurico (C12). Ácidos grasos preferibles que tienen un número de carbonos de 6 a 12 son ácido cáprico, ácido caprílico y ácido pelargónico. En este caso, la presente invención proporciona un material fisiológicamente activo natural eficaz para enfermedades de peces, específicamente enfermedades parasitarias, enfermedades bacterianas y/o enfermedades virales, que contiene al menos uno de ácido cáprico, ácido caprílico y ácido pelargónico. Otro aspecto de la invención reside en el uso de una formulación como alimento para peces que contiene material fisiológicamente activo natural eficaz sobre enfermedades parasitarias de los peces, que contiene al menos uno de ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12, específicamente ácido cáprico, ácido caprílico y ácido pelargónico. El contenido del material fisiológicamente natural es preferiblemente aproximadamente 0,25% en peso, que es adecuado para proporcionar un efecto apropiado sobre las enfermedades parasitarias.

Otro aspecto más de la invención reside en el uso de una formulación como un aditivo alimentario que contiene un material fisiológicamente activo natural eficaz sobre enfermedades de los peces, específicamente enfermedades parasitarias, enfermedades bacterianas y enfermedades virales, que contiene al menos uno de ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12, específicamente ácido cáprico, ácido caprílico y ácido pelargónico. El contenido del material fisiológicamente activo natural es preferiblemente aproximadamente 0,25% en peso, que es adecuado para proporcionar un efecto apropiado sobre las enfermedades parasitarias.

El material fisiológicamente activo natural de la presente invención es un material que contiene al menos uno de ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12, es eficaz sobre enfermedades de los peces y actúa sólo sobre parásitos de peces dañinos para los peces. Estos resultados se prueban a partir de los Ejemplos descritos posteriormente junto con el hecho de que el material fisiológicamente activo natural de la presente invención es eficaz sobre muchas enfermedades parasitarias conocidas de los peces; las concentraciones adecuadas del material que han de aplicarse para los tipos respectivos de peces y el hecho de que la eficacia de los ácidos grasos sea mejorada por un material que tiene una actividad de vitamina C que se usa de una manera combinada según se requiera.

La presente invención es aplicable a todos los tipos de peces cultivados. Ejemplos de peces cultivados incluyen peces sopladores (pez fugo), besugos (pargo japonés Pagrus major y sargo Acanthopagrus schlegeli), pez ámbar (pez limón, lecha rayada Seriola lalanndi, lecha y lecha de aleta larga Seriola rivoliana), salmones (trucha arcoiris y salmón coho), platijas (solla y platija moteada) y carpas (ciprínido Cyprinus y ciprinoide Ctenopharyngodonib idellus).

Se describirán posteriormente enfermedades parasitarias de los peces. El pez fugo está afectado por, por ejemplo, la infección por Heterobothrium okamotoi y la infección por Cryptocaryon irritans. El pargo japonés está afectado por, por ejemplo, la infección por Cryptocaryon irritans y la infección por Bivagina tai. La solla está afectada por, por ejemplo, la infección por Cryptocaryon irritans. La lecha está afectada, por ejemplo, por la infección por la lombriz de la sangre (Paradeontacylix) y la infección por Heteraxine heterocerca. El ciclo vital del patógeno de la infección por Heterobothrium okamotoi del pez fugo está más adelante. Los oncomiracidios eclosionados a partir de los huevos atacan en primer lugar las branquias y crecen allí hasta larvas. Las larvas que han crecido hasta aproximadamente 5-6 mm se mueven hasta la pared de la cavidad branquial y se convierten en parásitos maduros con sus pinzas embebidas en el tejido. Los parásitos maduros depositan entonces huevos en el tejido. El patógeno de la enfermedad del parásito de la piel del pez limón es Benedenia serilae perteneciente al monogéneo Copsala Benedenia y vive en la lecha rayada, la lecha y la lecha de aleta larga además del pez limón. No se conocen materiales naturales eficaces sobre estas enfermedades de los peces que sean utilizables en la piscicultura real.

Los inventores aclararon previamente que el pranziquantel usado como un parasiticida contra el trematodo del hígado en seres humanos es eficaz contra un parásito de los peces Heterobothrium okamotoi, y presentaron una solicitud de Patente (Solicitud de Patente Japonesa Nº 9-230316). Además, la lactoferrina es bien conocida como proteína multifuncional contenida en la leche materna. Para los mamíferos, se sugiere que la lactoferrina toma parte en la prevención local contra la infección, como se encontró con la lisozima y la IgA secretora. Para los peces, se presenta que la lactoferrina derivada de mamíferos muestra una mejora inmunológica contra la infección bacteriana en trucha arcoiris cuando se usa mediante administración oral. Por último, los inventores aclararon que la lactoferrina es eficaz tanto sobre mamíferos como sobre peces en común, y presentaron una solicitud de patente para un alimento para peces que contiene lactoferrina como un material fisiológicamente activo natural eficaz contra Heterobothrium okamotoi (Solicitud de Patente Japonesa Nº 9-230317).

En la técnica de la piscicultura, el desarrollo de fármacos y materiales naturales que sean eficaces contra parásitos a bajas concentraciones es muy importante para el propósito de eliminar fiablemente ectoparásitos en los peces. En particular, existe una intensa demanda para el desarrollo de un material natural como la lactoferrina que haya resultado ser eficaz contra las enfermedades parasitarias en común tanto para mamíferos como para peces.

Enfermedades bacterianas de los peces se describirán posteriormente. Desarrollar un material natural que sea eficaz sobre las enfermedades bacterianas de los peces cuando se usa mediante administración oral en la piscifactoría, sin recurrir a substancias antibióticas, se demanda intensamente desde los puntos de vista no solo de la producción estable de peces sino también de la protección de los entornos. Sensibles a tal demanda, los inventores estudiaron la actividad antibacteriana de ácidos grasos, principalmente ácido decanoico, sobre las enfermedades bacterianas de los peces (prueba in vitro contra patógenos de enfermedades de los peces) y encontraron que los ácidos grasos de cadena media tienen una actividad antibacteriana. Bacterias que provocan las enfermedades bacterianas de los peces incluyen, por ejemplo, Vibrio, Edwardsiella y enterococos, pero no se limitan a estas especies.

Se describirán enfermedades virales de los peces. Los inventores obtuvieron el resultado de que la administración oral de ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12 mostraba eficacia para prevenir la presencia de enfermedades virales en los peces. Virus que provocan las enfermedades virales de los peces incluyen, por ejemplo, el virus de Kuchijrosho en el pez fugo, pero no se limitan a esta especie.

Los ácidos grasos usados en la presente invención son ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12. Estos ácidos grasos son preferiblemente ácidos grasos libres, pero no se limitan a ácidos grasos libres y también son eficaces en formas de sales, glicéridos, ésteres y amidas que tienen radicales residuales de los ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12 en sus moléculas. Un ejemplo de sales es la sal sódica. Ejemplos de glicéridos incluyen monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos. Ejemplos de ésteres incluyen ésteres etílicos y ésteres metílicos. Ejemplos de amidas incluyen etilamidas y metilamidas.

Ejemplos del material que tiene una actividad de vitamina C incluyen ácido ascórbico, ascorbato sódico y ésteres de ascorbato.

El ácido octanoico como un ejemplo típico es un material natural comestible contenido en el aceite de palma, la mantequilla y las nueces, y también se denomina ácido octílico o ácido caprílico. Específicamente, el ácido octanoico es un ácido graso de cadena normal saturado que tiene un número de carbonos de 8, es ligeramente soluble en agua y se expresa mediante la fórmula molecular CH_{3}(CH_{2})_{6}COOH con el peso molecular de 144,21, el punto de fusión de 16,5 grados centígrados y el punto de ebullición de 237 grados centígrados. El ácido octanoico es un material natural comestible contenido en el aceite de palma y la mantequilla y se ha usado en un fármaco aplicado a los dispépticos, por ejemplo.

El ácido decanoico como otro ejemplo típico también se denomina ácido decílico o ácido cáprico. Específicamente, el ácido decanoico es un ácido graso de cadena normal saturado que tiene un número de carbonos de 10, es ligeramente soluble en agua y se expresa mediante la fórmula CH_{3}(CH_{2})_{8}COOH con el peso molecular de 172,27, el punto de fusión de 31,4 grados centígrados y el punto de ebullición de 269 grados centígrados. El ácido decanoico es un material natural contenido en el aceite de palma y la grasa capilar.

Los inventores efectuaron experimentos usando pez fugo para probar si el ácido octanoico afecta adversamente al crecimiento del pez. Se prepararon dos grupos experimentales; es decir, un grupo se alimentó con la dieta basal complementada con 0,5% de ácido octanoico (5 g de ácido octanoico añadidos para 1 kg de dieta) y el otro grupo se alimentó solo con la dieta basal. Las condiciones experimentales eran que 50 piezas de pez fugo para cada grupo se pusieron en un depósito de agua de 1 t y los fugos se alimentaron dos veces al día, es decir, por la mañana y por la tarde. El período experimental de sangrado era 45 días y la temperatura del agua era 25 \pm 1 grados centígrados durante el período experimental.

El peso medio para cada grupo era 34 g al comienzo del período experimental y 95 g al final. Los valores de la longitud corporal, el factor de condición, la ganancia de peso y la eficacia de la alimentación también mostraban diferencias similares entre el comienzo y el final del período experimental. Así, no se encontraron efectos adversos sobre el crecimiento de los fugos. El sangrado de esos fugos se continuó durante 7 meses sucesivos y no existían peces muertos. Como resultado de analizar el contenido de ácido octanoico en el músculo comestible de los fugos de una manera normal, no se detectó ácido octanoico. Para seres humanos, se presenta que la ruta de absorción de los ácidos grasos de cadena media en el cuerpo es más simple que la de ácidos grasos de cadena larga y los ácidos grasos de cadena media son absorbidos rápidamente y utilizados inmediatamente como fuentes de energía, dando como resultado una falta de acumulación apreciable en el cuerpo. Basándose en tales propiedades, los ácidos grasos de cadena media se usan como fuentes de energía para pacientes que sufren enfermedades del tracto digestivo. El resultado anterior sugiere que los ácidos grasos de cadena media pueden utilizarse como fuentes de energía y se acumulan difícilmente en el cuerpo del pez como con los seres humanos. Si los ácidos grasos de cadena media se acumulan en el cuerpo del pez, la cantidad de los ácidos grasos de cadena media acumulada sería tan pequeña que no actuarían efectos adversos sobre las personas que han comido el pez.

El uso de un material fisiológicamente activo natural eficaz sobre enfermedades parasitarias de los peces de acuerdo con la presente invención no está limitado particularmente en la forma, puede emplearse añadiéndose a una solución de fármaco para el tratamiento en forma de baño y alimento para peces para darles una actividad antiparasitaria, una actividad antibacteriana y/o una actividad antiviral. La composición y el método de fabricación del alimento para peces de acuerdo con la reivindicación 5 de la presente invención no están particularmente limitados, pero pueden seleccionarse opcionalmente con tal de que el alimento para peces contenga ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12.

Se espera que el material fisiológicamente activo natural usado de acuerdo con la presente invención sea eficaz sobre enfermedades parasitarias de los peces cuando se añade a una dieta basal. El alimento para peces y el aditivo de alimento para peces de acuerdo con la reivindicación 5 de la presente invención no están particularmente limitados en composición y método de fabricación con tal de que el producto final contenga ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12. Cuando los ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12 se añaden a alimento para peces en forma de una solución, gránulos o tabletas, el alimento para peces contiene preferiblemente los ácidos grasos en una cantidad de 0,125-2% en peso con respecto al peso total.

El alimento para peces y el aditivo de alimento para peces de acuerdo con la reivindicación 5 de la presente invención no dan lugar a efectos adversos tales como reducción en la toma de alimento, crecimiento, etc. Los ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12 se añaden al alimento para peces en alguna fase del procedimiento de fabricación del alimento, lo que es apropiado desde el punto de vista técnico, de modo que los ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12 se distribuyen uniformemente en el producto final.

Una solución para inmersión para usar en la presente invención no está particularmente limitada con tal de que la solución contenga ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12. Cuando la solución para inmersión se prepara disolviendo los ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12 en la forma de una solución, gránulos o tabletas, la concentración de la solución se ajusta preferiblemente para estar en el intervalo de 80-200 ppm.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una gráfica que muestra la eficacia de ácidos grasos sobre la eliminación de oncomiracidios y larvas de Heterobothrium okamotoi.

\newpage

La Fig. 2 es una gráfica que muestra la eficacia de ácidos grasos sobre la eliminación de terontes de Cryptocaryon irritans.

La Fig. 3 es una gráfica que muestra resultados de comparación de supervivencia de peces infectados en el experimento de Heterobothrium okamotoi sobre pez fugo en el caso de n = 6.

La Fig. 4 es una gráfica que muestra resultados de comparación de supervivencia de peces normales en el experimento de Heterobothrium okamotoi sobre pez fugo en el caso de n = 8.

La Fig. 5 es una gráfica que muestra resultados de comparación del número de parásitos que se unen a los peces infectados muertos durante el período del experimento de Heterobothrium okamotoi sobre pez fugo.

La Fig. 6 es una gráfica que muestra resultados de comparación del número de parásitos que se unen a los peces infectados que sobreviven al final del período (después de 63 días) del experimento de Heterobothrium okamotoi sobre pez fugo.

La Fig. 7 es una gráfica que muestra resultados de comparación del número de parásitos que se unen a los peces normales que sobreviven después de 30 días en el experimento de Heterobothrium okamotoi sobre pez fugo (n = 4 para cada grupo).

La Fig. 8 es una gráfica que muestra resultados de comparación del número de parásitos que se unen a los peces normales muertos durante el período de experimento de Heterobothrium okamotoi sobre pez fugo.

La Fig. 9 es una gráfica que muestra resultados de comparación del número de parásitos que se unen a los peces normales en el grupo con ácido octanoico añadido que sobrevive al final del período (después de 73 días) del experimento de Heterobothrium okamotoi sobre pez fugo.

La Fig. 10 es una gráfica que muestra resultados de comparación del número de parásitos Cryptocaryon irritans después de 3 días desde el principio de la estimulación en el experimento de Cryptocaryon irritans sobre pargo japonés.

La Fig. 11 es una gráfica que muestra resultados de comparación del número de parásitos en el experimento de Cryptocaryon irritans sobre pargo japonés.

La Fig. 12 es una gráfica que muestra resultados de comparación del número de parásitos Heteraxine heterocerca en el experimento de campo sobre lecha (n = 20 para cada grupo).

La Fig. 13 es una gráfica que muestra resultados de comparación del número de parásitos Benedenia seriolae en el experimento de campo sobre lecha (n = 20 para cada grupo).

La Fig. 14 es una gráfica que muestra resultados de comparación del número de huevos de lombrices de la sangre (Paradeontacylix) por branquia en el experimento de campo sobre lecha (n = 20 para cada grupo).

La Fig. 15 es una gráfica que muestra resultados de comparación del número de parásitos Heterobothrium okamotoi en el experimento de mejora con vitamina C sobre pez fugo (n = 5).

La Fig. 16 es una gráfica que muestra resultados de comparación del número de parásitos Cryptocaryon irritans en el experimento de mejora con vitamina C sobre pargo japonés (n = 5 para cada grupo en cada muestreo).

La Fig. 17 es una gráfica que muestra resultados de comparación de supervivencia en el experimento de mejora con vitamina C sobre pargo japonés.

La Fig. 18 es una gráfica que muestra resultados del número de parásitos Cryptocaryon irritans en los experimentos de comparación de eficacia de ácido octanoico y monoglicérido y triglicérido del mismo sobre pargo japonés (n = 5 para cada grupo en cada muestreo).

La Fig. 19 es una gráfica que muestra una actividad antibacteriana de ácidos grasos contra Vibrio anguillarum.

La Fig. 20 es una gráfica que muestra la actividad antibacteriana de ácidos grasos contra Edwardsiella tarda.

La Fig. 21 es una gráfica que muestra la actividad antibacteriana de ácidos grasos contra Enterococcus seriolicida.

La Fig. 22 es una gráfica que muestra dietas consumidas y cambios de mortalidad en el experimento de sangrado sobre la platija moteada.

La Fig. 23 es una gráfica que muestra el cambio de mortalidad en el experimento de estimulación con Kuchijirosho sobre pez fugo.

Mejor modo para llevar a cabo la invención

Los detalles de la presente invención se describirán posteriormente con relación a los Ejemplos. Ha de entenderse que no debe considerarse de ningún modo que los Ejemplos limiten el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 Propósito

Larvas de parásitos Heterobothrium okamotoi se sumergieron en agua marina en la que se disolvió ácido octanoico. Como resultado, se observó que las larvas morían debido a la presencia de daños estructurales (tales como vacuolación). El ácido octanoico es un material natural comestible contenido en aceite de palma, mantequilla y nueces, y se ha usado en un fármaco aplicado a dispépticos, por ejemplo.

Teniendo en cuenta el resultado anterior, se efectuaron los siguientes experimentos. En el Experimento 1, la eficacia de ácidos grasos, principalmente ácidos grasos de cadena media, contra parásitos se investigó mediante un ensayo in vitro. Los parásitos probados eran Heterobothrium okamotoi que pertenece a los platelmintos y parasita el pez fugo, y Cryptocaryon irritans que pertenece a los protozoos e infecta muchos tipos de peces con daños notables. En el Experimento 2, la eficacia del ácido octanoico contra los siguientes parásitos se investigó mediante un ensayo in vitro; Bivagina tai que pertenece a los platelmintos y parasita el pargo japonés, Heteraxine heterocerca que parasita pez limón joven, Benedenia seriolae que provoca un problema grave en el pez limón y la platija joven, Kudoa que pertenece a los protozoos y parasita el músculo, el corazón, etc. con daños en el valor de peces comestibles, y Caligus que pertenece a los artrópodos y da lugar a daños notables en salmones y muchos otros peces marinos. En los Experimentos 3, 4 y 5, la eficacia del ácido octanoico contra parásitos se investigó añadiendo ácido octanoico a alimento para peces que ha de suministrarse oralmente. Más específicamente, en el Experimento 3, se estudió la eficacia contra Heterobothrium okamotoi en pez fugo. En el Experimento 4, se estudió la eficacia contra Cryptocaryon irritans en pargo japonés. En el Experimento 5, se estudió la eficacia contra Heteraxine heterocerca, Benedenia seriolae y lombrices de la sangre (Paradeontacylix) en la lecha. Además, en los Experimentos 6 y 7, se investigó si la eficacia se mejora o no añadiendo vitamina C al alimento con ácido octanoico añadido en una cantidad mayor que la contenida en alimento para peces normal. Más específicamente, en el Experimento 6, se estudió el efecto de mejora de la vitamina C sobre pez fugo. En el Experimento 7, se estudió el efecto de mejora de la vitamina C sobre pargo japonés. En el Experimento 8, se investigó si el monoglicérido y el triglicérido de ácido octanoico actúan contra Cryptocaryon irritans en el pargo japonés tan eficazmente como el ácido octanoico libre. Por otra parte, en los Experimentos 9 y 10, se investigó si sumergir los peces en agua marina con ácido octanoico añadido es eficaz contra los parásitos. Más específicamente, en el Experimento 9, se estudió la eficacia sobre los peces en el caso de sumergir pez fugo en agua marina con ácido octanoico añadido. En el Experimento 10, se estudió la eficacia para eliminar Cryptocaryon irritans en el caso de sumergir pez fugo infectado con Cryptocaryon irritans en agua marina con ácido octanoico añadido.

Experimento 1

Método

Ácidos grasos que tienen un número de carbonos C2, C4 y C6-C10 se disolvieron cada uno en agua marina a una concentración 1 mM y oncomiracidios de Heterobothrium okamotoi y larvas que se unen a las branquias se sumergieron en las soluciones de agua marina. Después de 2 horas desde el comienzo de la inmersión, la eficacia de los ácidos grasos se investigó contando el número de oncomiracidios muertos y el número de larvas que caen de las branquias. Más de 30 individuos de parásitos se transfirieron a cada grupo.

Para Cryptocaryon irritans, ácidos grasos que tenían un número de carbonos C2, C4 y C6-C10 se disolvieron cada uno en agua marina a una concentración de 0,5 mM y los terontes de Cryptocaryon irritans se sumergieron en las soluciones de agua marina. Después de 1 hora desde el comienzo de la inmersión, la eficacia de los ácidos grasos se investigó contando el número de terontes muertos. Más de 200 individuos de parásitos se transfirieron a cada grupo.

Para cualquiera de los grupos, el experimento se realizó bajo la condición de 20 grados centígrados.

Resultados y Análisis

Se observó que las larvas de Heterobothrium okamotoi estaban aparentemente atrofiadas y caían de las branquias en las soluciones de agua marina de C6 a C10. De las soluciones de agua marina de C6 a C10 que mostraban la eficacia, el grado de caída más alto se obtenía con C8 (véase la Fig. 1). De forma similar, se observaron individuos muertos de los oncomiracidios de Heterobothrium okamotoi en las soluciones de agua marina de C6 a C10. En particular, la mortalidad de los oncomiracidios en las soluciones de agua marina de C6 a C10 eran 100%. Entre estas soluciones, los individuos muertos emergían los primeros en C8 (Fig. 1).

Para Cryptocaryon irritans, los individuos muertos emergían en C6 a C10. Como en el caso de Heterobothrium okamotoi, C8 a C10 mostraban una actividad antiparasitaria alta y proporcionaban una mortalidad de 100%. Entre estas soluciones, los individuos muertos emergían los primeros en C8 (Fig. 2).

A partir de los resultados anteriores, se probó que los ácidos grasos de cadena media eran eficaces contra parásitos. De los ácidos grasos de cadena media, los que tenían un número de carbonos C8 a C10 eran más eficaces y los que tenían un número de carbonos C8 eran los más eficaces. El ácido graso que tenía un número de carbonos C12 era tan bajo en solubilidad que el experimento no podía realizarse bajo la misma condición. Sin embargo, se encontró una actividad similar incluso a una concentración baja.

Experimento 2

Métodos

Se añadieron 800 ppm de ácido octanoico a agua marina y se disolvieron en la misma de forma máxima. En esta solución de agua marina, larvas de Bivagina tai muestreadas de las branquias de pargo japonés, larvas de Heteraxine heterocerca muestreadas de las branquias de pez limón joven, adultos de Benedenia seriolae muestreados de la superficie corporal de pez limón joven, esporas de Kudoa shiomitsui muestreadas del corazón de pez fugo y adultos de Pseudocaligus fugu muestreados de la superficie corporal de pez fugo se sumergieron bajo la condición de 20 grados centígrados, seguido por observación. Como control, otro grupo se trató usando agua marina sola. Más de 30 individuos de parásitos se transfirieron a cada grupo.

Resultados y Análisis

Se observó en el grupo con ácido octanoico añadido que Bivagina, Heteraxine y Benedenia se contraían aparentemente. Para cualquiera de los parásitos, la contracción se presentaba en aproximadamente 10 minutos. Para Kudoa, se observó una imagen explosiva de las esporas en aproximadamente 1 hora. Para Caligus no se observó atrofia (Pseudocaligus sin contracción), pero se encontró una reducción en la actividad natatoria después de aproximadamente 1 hora. Por otra parte, no se encontraron cambios de los parásitos en el control.

A partir de los resultados de los Experimentos 1 y 2, se elucidó que el ácido octanoico tiene un efecto para eliminar parásitos bastante diferentes desde el punto de vista de la clasificación, tales como gusanos planos, artrópodos y protozoos. Por lo tanto, se cree que el ácido octanoico desarrollará su eficacia contra todos los tipos de parásitos de los peces. Además, se cree a partir de los resultados del Experimento 1 que los ácidos grasos de cadena media distintos del ácido octanoico desarrollan de forma similar un efecto para eliminar una variedad de parásitos.

Experimento 3

Métodos

Pez probado: Pez fugo que pesa aproximadamente 133,6 g de media.

Grupos experimentales: Dos grupos, es decir un grupo con ácido octanoico añadido en el que los peces fueron alimentados con dietas con ácido octanoico añadido, y un grupo de control en el que los peces fueron alimentados con dietas sin ácido octanoico añadido. La dosis de alimentación era 1% de peso del pez/día para cada grupo.

Dietas experimentales: Las dietas con ácido octanoico añadido se prepararon pulverizando 2,5 g de ácido octanoico a 1 kg de nódulos disponibles comercialmente para pez fugo. Los peces del grupo de control fueron alimentados con los nódulos disponibles comercialmente para pez fugo.

Experimento de estimulación: Cada 12 piezas de pez (pez normal) de entre un banco de peces, en el que no se encontraban enfermedades tales como infección por Heterobothrium okamotoi, se pusieron en un depósito de agua de 100 litros y se alimentaron con las dietas experimentales respectivas. Después de 7 días, 6 piezas de pez (peces infectados), que se habían infectado por adelantado con aproximadamente 100 individuos de Heterobothrium okamotoi, se añadieron a cada grupo experimental. A continuación, la extracción de sangre se continuó durante 73 días mientras se alimentaba con las dietas experimentales. En este experimento, los parásitos Heterobothrium okamotoi en los peces infectados estaban en fase de adulto. Después de 30 días de añadir los peces infectados, 4 piezas de pez normal se muestrearon de cada grupo, y se contó el número de parásitos que se unían a las branquias. Durante el período experimental, la temperatura del agua estaba en el intervalo de 16,5-20,9 grados centígrados y el agua se intercambió a 20 ciclos/día.

La evaluación se realizó comparando la mortalidad de los peces en los grupos respectivos durante el período experimental y contando el número de parásitos que se unen a las branquias de los peces infectados en cada grupo para la investigación de la eficacia remediadora y la eficacia de prevención de la infección.

Resultados y Análisis

El grado de supervivencia de los peces infectados al final del experimento era 66,7% en el grupo con ácido octanoico añadido y 16,7% en el grupo de control (Fig. 3). Se confirmaba así la eficacia del ácido octanoico. El número de parásitos que se unían a los peces infectados en el grupo con ácido octanoico añadido, que sobrevivían al final del experimento, se reducía aparentemente tanto en adultos como en larvas en comparación con el grupo de control (Fig. 6). También se confirmó una tendencia similar con relación a un número de peces infectados muertos (Fig. 5). Los aproximadamente 100 individuos adultos que se unen a cada pez infectado al comienzo del experimento se reducían hasta aproximadamente 27 individuos al final del experimento en cada uno de los peces que sobrevivía en el grupo con ácido octanoico añadido. Estos resultados mostraban que el ácido octanoico es eficaz para eliminar adultos de Heterobothrium okamotoi y de ahí eficaz para remediar la infección por Heterobothrium okamotoi. Fármacos tales como el peróxido de hidrógeno y la formalina no están confirmados en cuanto a su eficacia para eliminar los adultos y no pueden prevenir la propagación de la siguiente generación. Por esta razón, cuando se usan fármacos tales como peróxido de hidrógeno y formalina, será imposible evitar completamente la infección de Heterobothrium okamotoi y remediar la enfermedad infectada a no ser que el tratamiento con fármaco haya de repetirse frecuentemente.

El grado de supervivencia de los peces normales era 75% en el grupo con adición y 0% en el grupo de control (Fig. 4). Así, también se confirmó la eficacia del ácido octanoico como con los peces infectados. El número de parásitos que se unen a los peces normales en el grupo con adición después de 30 días se reducía aparentemente en comparación con el grupo de control, y por lo tanto se confirmó la eficacia de prevención de la infección (Fig. 7). El número de los parásitos también se redujo aparentemente tanto en los peces que sobrevivían después del final del experimento como en los peces que morían durante el período experimental (Figs. 8 y 9). A partir de los resultados anteriores, se confirmaron la eficacia remediadora y la eficacia de prevención de la infección sobre peces infectados con Heterobothrium okamotoi cuando se añadía ácido octanoico a dietas para administración oral a los peces. También se estimó que la eficacia similar sobre enfermedades parasitarias en los peces también puede esperarse mediante la adición de otros ácidos grasos que tienen un número de carbonos C6 a C12 distintos del ácido octanoico.

Experimento 4

Métodos

Pez probado: Pargo japonés que pesa aproximadamente 9,8 g de media.

Grupos experimentales: Dos grupos, es decir, un grupo con ácido octanoico añadido en el que los peces fueron alimentados con dietas con ácido octanoico añadido, y un grupo de control en el que los peces fueron alimentados con dietas sin ácido octanoico añadido. La dosis de alimentación era 3% de peso del pez/día para cada grupo.

Dietas experimentales: Las dietas con ácido octanoico añadido se prepararon pulverizando 5 g de ácido octanoico a 1 kg de nódulos disponibles comercialmente para pargo japonés. Los peces del grupo de control fueron alimentados con los nódulos disponibles comercialmente para pargo japonés.

Experimento de estimulación: Cada 30 piezas de pez de entre un banco de peces, en el que no se encontraban enfermedades tales como infección por Cryptocaryon irritans, se pusieron en un depósito de agua de 100 litros y se alimentaron con las dietas experimentales respectivas. Después de 5 días, aproximadamente 2.000 individuos (terontes de oncomiracidios) de Cryptocaryon irritans se pusieron en cada depósito de agua para infectar a los peces mientras el flujo de agua se detenía durante 1 hora. A continuación, el sangrado se continuó durante 15 días. Durante el período experimental, la temperatura del agua estaba en el intervalo de 22,5-23,2 grados centígrados y el agua se intercambió a 20 ciclos/día.

La evaluación se realizó muestreando 5 piezas de pez de cada grupo después de 3 días desde el comienzo de la estimulación, comparando el número de parásitos que se unen a las branquias y la superficie corporal de cada pez infectado y comparando la mortalidad de los peces durante el período experimental entre los grupos respectivos.

Resultados y Análisis

En los peces muestreados a partir del grupo con ácido octanoico añadido después de 3 días desde la estimulación, no se encontraron parásitos, pero en el grupo de control se encontraron los parásitos (Fig. 10). Después de eso, en el grupo de control, la muerte de los peces comenzó el séptimo día y todos los peces morían el octavo día (Fig. 11). El número de los parásitos que se unen a esos peces muertos en el grupo de control era aproximadamente 800 en las branquias y aproximadamente 20 x 1 cm^{2} de la superficie corporal. Así, los parásitos se propagaban aparentemente. Por otra parte, en el grupo con ácido octanoico añadido, no morían peces y no se encontraron parásitos ni al final del experimento. A partir de los resultados anteriores, era evidente que la infección y la propagación de Cryptocaryon irritans puede prevenirse añadiendo ácido octanoico a dietas para administración oral a peces.

Experimento 5

Métodos

Pez probado: Lecha que pesa aproximadamente 117 g de media.

Grupos experimentales: Dos grupos, es decir, un grupo con ácido octanoico añadido en el que los peces fueron alimentados con dietas con ácido octanoico añadido y un grupo de control en el que los peces fueron alimentados con dietas sin ácido octanoico añadido. La dosis de alimentación era 3% de peso del pez/día para cada grupo.

Dietas experimentales: Las dietas con ácido octanoico añadido se prepararon pulverizando 8 g de ácido octanoico a 1 kg de nódulos disponibles comercialmente para lecha. Los peces del grupo de control fueron alimentados con los nódulos disponibles comercialmente para lecha.

Experimento: El experimento se efectuó usando jaulas de red no costeras de 10 x 10 x 9 m situadas en el mar abierto. Cada 15.000 piezas de pez para cada grupo se trataron con un parasiticida que contenía peróxido de hidrógeno disponible comercialmente como un ingrediente principal, y a continuación se pusieron en cada jaula de red. En este momento, se confirmaba que Heteraxine heterocerca que parasitaba en las branquias y Benedenia seriolae que parasitaba en la superficie corporal se eliminaban, investigando 20 piezas de pez para cada grupo. También se confirmó simultáneamente que las lombrices de la sangre (Paradeontacylix) estaban presentes en los peces, investigando la presencia de huevos en los filamentos de las branquias. A continuación, el sangrado se continuó durante 9 días mientras se alimentaban con las dietas experimentales. La temperatura del agua durante el período experimental estaba en el intervalo de 18,5-20,0 grados centígrados.

La evaluación se realizó muestreando 20 piezas de pez de cada grupo después de 9 días desde el comienzo del sangrado, y contando y comparando el número de Heteraxine heterocerca en las branquias de cada pez muestreado, el número de Benedenia seriolae sobre la superficie corporal y el número de huevos de lombrices de la sangre (Paradeontacylix) en los filamentos de las branquias.

Resultados y Análisis

Inmediatamente después del tratamiento con baño de fármaco, no se encontraban parásitos Heteraxine heterocerca ni Benedenia seriolae en ninguno de ambos grupos. El número de Heteraxine heterocerca en los peces muestreados al final del sangrado era aparentemente inferior en el grupo con ácido octanoico añadido que en el grupo de control y se confirmaba la eficacia del ácido octanoico (Fig. 12). En contraste, no se encontraba una diferencia apreciable en el número de Benedenia seriolae entre ambos grupos (Fig. 13). Los huevos de las lombrices de la sangre (Paradeontacylix) se observaban en ambos grupos al comienzo del experimento y se confirmaba la presencia de lombrices de la sangre (Paradeontacylix) en los peces. En los peces muestreados al final del sangrado, se observaban los huevos de lombrices de la sangre (Paradeontacylix) en el grupo de control, pero no se observaban huevos de lombrices de la sangre en el grupo con ácido octanoico añadido. Se concluía que el ácido octanoico es eficaz para eliminar las lombrices de la sangre (Fig. 14).

A partir de los resultados de los Experimentos 3, 4 y 5, se confirmaba que la eficacia remediadora y la eficacia de prevención de la infección sobre las infecciones parasitarias se desarrollaban aparentemente añadiendo ácido octanoico a dietas para administración oral a peces. Puesto que cada eficacia se confirmaba en varias especies de peces diferentes en las clasificaciones, tales como pez fugo, pargo japonés y lecha, se cree que el ácido octanoico desarrollará su eficacia sobre todas las especies de peces. En los seres humanos, los ácidos grasos de cadena media son rápidamente absorbidos después de la administración y a continuación se utilizan como fuentes de energía. También se sabe que los ácidos grasos de cadena media aparecen en la sangre hasta que son finalmente utilizados como fuentes de energía. En peces, se estima de forma similar que los ácidos grasos de cadena media son rápidamente absorbidos después de la administración y a continuación aparecen en la sangre hasta que finalmente son utilizados como fuentes de energía. Se presenta que Heterobothrium okamotoi, Cryptocaryon irritans y Heteraxine heterocerca, contra las que se confirmaba la eficacia del ácido octanoico con experimentos in vivo, toman nutrientes de la sangre del huésped. Las lombrices de la sangre (Paradeontacylix) parasitan en los vasos sanguíneos del huésped y por lo tanto siempre están en contacto con la sangre del huésped. Por otra parte, se presenta que Benedenia seriolae, contra la que no se confirmaba la eficacia del ácido octanoico, parasita en la superficie corporal y toma nutrientes del moco. De acuerdo con esto, se estima que la actividad antiparasitaria de los ácidos grasos de cadena media, confirmada con experimentos in vivo, se desarrolla a través del mecanismo en el que los ácidos grasos aplicados aparecen en la sangre y los parásitos toman la sangre del huésped que contiene los ácidos grasos o entran en contacto con la misma.

Experimento 6

Métodos

Pez probado: Pez fugo que pesa aproximadamente 50,0 g de media.

Grupos experimentales: Tres grupos, es decir, un grupo con ácido octanoico añadido en el que los peces se alimentaron con dietas con ácido octanoico añadido, un grupo con ácido octanoico añadido/mejorado con vitamina C en el que los peces se alimentaron con dietas con ácido octanoico y vitamina C añadidos y un grupo de control en el que los peces se alimentaron con dietas sin ácido octanoico añadido. La dosis de alimentación era 2% de peso del pez/día para cada grupo.

Dietas experimentales: Las dietas con ácido octanoico añadido se prepararon pulverizando 5 g de ácido octanoico a 1 kg de nódulos disponibles comercialmente para pez fugo. Las dietas con ácido octanoico y vitamina C añadidos se prepararon pulverizando 200 mg de vitamina C, disuelta en agua, a 1 kg de las dietas anteriores con ácido octanoico añadido. Los peces del grupo de control se alimentaron con los nódulos disponibles comercialmente para pez fugo.

Experimento de estimulación: Cada 5 piezas de pez de entre un banco de peces, en el que no se encontraban enfermedades tales como infecciones parasitarias, se pusieron en un depósito de agua de 100 litros y se alimentaron con las dietas experimentales respectivas. Después de 7 días, aproximadamente 750 individuos de oncomiracidios de Heterobothrium okamotoi se pusieron en cada depósito de agua para infectar los peces mientras que el flujo de agua se detenía durante 1 hora. El procedimiento de infección se repitió cada 2 días 5 veces en total bajo la misma condición. A continuación, el sangrado se continuó durante 15 días después de la primera infección mientras se alimentaba con las dietas experimentales. Durante el período del experimento, la temperatura del agua era 25 \pm 5 grados centígrados y el agua se intercambió a 20 ciclos/día.

La evaluación se realizó muestreando todos los peces bajo el experimento en cada grupo después de 15 días desde la primera estimulación, comparando el número de los parásitos que se unen a las branquias de cada pez y comparando la mortalidad de los peces durante el período experimental entre los grupos respectivos.

Resultados y Análisis

El número de los parásitos era aparentemente menor en el grupo con ácido octanoico añadido que en el grupo de control y la eficacia de la adición de ácido octanoico se reproducía (Fig. 15). El número de los parásitos en el grupo con ácido octanoico añadido/mejorado con vitamina C era incluso menor en el grupo con ácido octanoico añadido para el que se confirmaba la eficacia del ácido octanoico. A partir de los resultados anteriores, resultaba que la eficacia del ácido octanoico contra los parásitos Heterobothrium okamotoi se incrementaba más añadiendo tanto ácido octanoico como vitamina C a las dietas de una manera combinada, estando la vitamina C en una cantidad mayor que la cantidad en alimento para peces normal.

Experimento 7

Métodos

Pez probado: Pargo japonés que pesaba aproximadamente 15,80 g de media.

Grupos experimentales: Tres grupos, es decir, un grupo con ácido octanoico añadido en el que los peces se alimentaron con dietas con ácido octanoico añadido, un grupo con ácido octanoico añadido/mejorado con vitamina C en el que los peces se alimentaban con dietas tanto con ácido octanoico como con vitamina C añadidos y un grupo de control en el que los peces se alimentaron con dietas sin ácido octanoico añadido. La dosis de alimentación era 3% de peso del pez/día para cada grupo.

Dietas experimentales: Las dietas con ácido octanoico añadido se prepararon pulverizando 2,5 g de ácido octanoico a 1 kg de nódulos disponibles comercialmente para pargo japonés. Las dietas tanto con ácido octanoico como con vitamina C añadidos se prepararon pulverizando 200 mg de vitamina C, disuelta en agua, a 1 kg de las dietas anteriores con ácido octanoico añadido. Los peces del grupo de control se alimentaron con los nódulos disponibles comercialmente para pargo japonés.

Experimento de estimulación: Cada 30 piezas de peces de entre un banco de peces, en el que no se encontraron enfermedades tales como infección por Cryptocaryon irritans, se pusieron en un depósito de agua de 100 litros y se alimentaron con las dietas experimentales respectivas. Después de 5 días, aproximadamente 2.000 individuos de terontes de Cryptocaryon irritans se pusieron en cada depósito de agua para infectar los peces mientras el flujo de agua se detenía durante 1 hora. A continuación, el sangrado se continuó durante 60 días. Durante el período experimental, la temperatura del agua era 24 \pm 5 grados centígrados y el agua se intercambió a 20 ciclos/día.

La evaluación se realizó muestreando 5 piezas de pez de cada grupo después de 18 y 31 días desde el comienzo de la estimulación, comparando el número de los parásitos que se unen a las branquias de cada pez y comparando la mortalidad de los peces durante el período experimental entre los grupos respectivos.

Resultados y Análisis

En los peces muestreados después de 18 y 31 días desde el comienzo de la estimulación, el número de los parásitos era aparentemente menor en el grupo con ácido octanoico añadido que en el grupo de control y se reproducía la eficacia de adición del ácido octanoico (Fig. 16). Los peces del grupo con ácido octanoico añadido morían todos como con los peces del grupo de control, pero el tiempo en el que los peces empiezan a morir era mayor en el grupo con ácido octanoico añadido que en el grupo de control. Se confirmaba así la eficacia de adición de ácido octanoico (Fig. 17). Los números de los parásitos después de 18 y 31 días eran comparables entre el grupo con ácido octanoico añadido/mejorado con vitamina C y el grupo con ácido octanoico añadido. Sin embargo, en el grupo con ácido octanoico/mejorado con vitamina C no morían peces hasta el final del experimento y no se encontraban parásitos en las branquias ni sobre la superficie corporal de los peces que sobrevivían. Además, no se encontraron quistes de los parásitos en el depósito de agua. Por lo tanto, se cree que los parásitos se aliviaban en los peces del grupo con ácido octanoico añadido/mejorado con vitamina C.

A partir de los resultados anteriores, resultaba que la eficacia del ácido octanoico contra los parásitos Cryptocaryon irritans se incrementaba adicionalmente añadiendo tanto ácido octanoico como vitamina C a las dietas de una manera combinada, estando la vitamina C en una cantidad mayor que la contenida en alimento para peces normal. En los peces, se han realizado estudios sobre la mejora inmunológica de la vitamina C y se confirma la eficacia de la vitamina C. Indicado de otro modo, la actividad antiparasitaria del ácido octanoico se mejoraba mediante el uso combinado de ácido octanoico y el material que muestra la mejora inmunológica. También se estimaba que tal efecto combinado se desarrolla de forma similar contra bacterias y virus descritos más adelante.

Experimento 8

Métodos

Pez probado: Pargo japonés que pesa aproximadamente 15,8 g de media.

Grupos experimentales: Cuatro grupos, es decir un grupo con ácido octanoico añadido en el que los peces se alimentaron con dietas con ácido octanoico añadido, un grupo con monoglicérido añadido en el que los peces se alimentaron con dietas con monoglicérido de ácido octanoico añadido, un grupo con triglicérido añadido en el que los peces se alimentaron con dietas con triglicérido de ácido octanoico añadido y un grupo de control en el que los peces se alimentaron con dietas sin ácido octanoico ni glicéridos añadidos. La dosis de alimentación era 3% de peso del pez/día para cada grupo.

Dietas experimentales: Las dietas con ácido octanoico añadido se prepararon pulverizando 2,5 g (17,5 mM con respecto al peso de la dieta) de ácido octanoico a 1 kg de nódulos disponibles comercialmente para pargo japonés. El monoglicérido y el triglicérido de ácido octanoico se añadieron a las dietas a una cantidad igual a 17,5 mM de radicales residuales de ácido octanoico. Específicamente, las dietas con monoglicérido y triglicérido añadido se prepararon respectivamente pulverizando 3,8 g de monoglicérido y 2,7 g de glicérido a 1 kg de los nódulos disponibles comercialmente para pargo japonés. Los peces del grupo de control se alimentaron con los nódulos disponibles comercialmente para pargo japonés.

Experimento de estimulación: Cada 10 piezas de pez de entre un banco de peces, en el que no se encontraron enfermedades tales como infección por Cryptocaryon irritans, se pusieron en un depósito de agua de 100 litros y se alimentaron con las dietas experimentales respectivas. Después de 5 días, aproximadamente 2.000 individuos de terontes de Cryptocaryon irritans se pusieron en cada depósito de agua para infectar los peces mientras se detenía el flujo de agua durante 1 hora. A continuación, el sangrado se continuó durante 31 días mientras se alimentaba con las dietas experimentales respectivas. Durante el período experimental, la temperatura del agua era 24 \pm 1 grados centígrados y el agua se intercambió a 20 ciclos/día.

La evaluación se realizó muestreando 5 piezas de pez de cada grupo después de 18 y 31 días desde el comienzo de la estimulación y comparando el número de los parásitos que se unen a las branquias de cada pez.

Resultados y Análisis

En los peces muestreados después de 18 y 31 días desde el comienzo de la estimulación, el número de los parásitos era aparentemente inferior en el grupo con ácido octanoico añadido que en el grupo de control y se reproducía la eficacia de adición de ácido octanoico (Fig. 18). El número de los parásitos en cada uno de los grupos con monoglicérido y triglicérido añadidos también ara aparentemente menor que en el grupo de control y se confirmaba la eficacia de la adición de monoglicérido y triglicérido.

Los inventores confirmaron mediante un ensayo in vitro que el triglicérido de ácido octanoico no mostraba actividad antibacteriana contra Cryptocaryon irritans, pero el monoglicérido de ácido octanoico mostraba una actividad antibacteriana aunque a un nivel inferior que el ácido octanoico. En seres humanos, los triglicéridos de ácidos grasos de cadena media se convierten en ácidos grasos libres en el tracto intestinal bajo la acción de la lipasa y son transportados al hígado a través de la vena portal. Durante tal transferencia, los ácidos grasos libres aparecen en la sangre. En los peces, se cree que los triglicéridos de ácidos grasos de cadena media se convierten en ácidos grasos libres en el cuerpo del pez y desarrollan una actividad antibacteriana a través de un proceso de digestión similar.

A partir de los resultados y fenómenos anteriores, resultaba que los monoglicéridos y triglicéridos de ácidos grasos de cadena media desarrollan la eficacia contra los parásitos, junto con bacterias y virus descritos más adelante, a través del metabolismo del cuerpo del pez.

Experimento 9

Métodos

Cada grupo, es decir 130 g de pez fugo, se sumergió en 2 litros de agua marina que contenía ácido octanoico a 100 ppm, 200 ppm y 400 ppm, seguido por observación.

Resultados y Análisis

En el grupo de 100 ppm, después de 60 minutos, la actividad natatoria de los peces se disminuía ligeramente, pero no se encontraba anormalidad en los peces. Cuando se devolvían a agua marina de nuevo, los peces no mostraban anormalidad. En el grupo de 200 ppm, la actividad natatoria se disminuía aparentemente después de 30 minutos y los peces comenzaban a descender a los 60 minutos. Cuando se devolvían a agua marina de nuevo, los peces volvían a una condición normal después de aproximadamente 30 minutos. En el grupo de 400 ppm, los peces comenzaban a descender a los 3 minutos y casi morían a los 9 minutos. Cuando se devolvían a agua marina de nuevo en el estado casi moribundo, los peces volvían a una condición normal después de aproximadamente 60 minutos. Los peces devueltos a agua marina se observaron durante 7 días y no se encontró anormalidad. A partir de los resultados anteriores, se cree que el tratamiento de inmersión puede ponerse en práctica determinando concentraciones apropiadas dependiendo de la especie de pez.

Experimento 10

Métodos

Se sumergieron 300 g de pez fugo infectado con Cryptocaryon irritans en agua marina que contenía 200 ppm de ácido octanoico durante 2 minutos y a continuación se devolvieron a agua marina de nuevo. Después de 3 horas desde la vuelta a agua marina, se observaron los parásitos Cryptocaryon irritans y sus situaciones y números.

Resultados y Análisis

El número de los parásitos que se unen a la superficie corporal era 262/2 cm^{2}. De los individuos, el número de los que mostraban movimiento y parecían estar todavía vivos era 9. El número de los parásitos que se unen a las branquias era 356 por arco branquial. De los individuos, el número de los que mostraban movimiento y parecían estar todavía aparentemente vivos eran 193. El número de los parásitos en pez fugo investigado antes del tratamiento era 193/2 cm^{2} de superficie corporal y 624 por arco branquial. Cualquiera de los parásitos mostraba movimiento. A partir de los resultados anteriores, se cree que sumergir los peces en agua marina que contiene ácido octanoico también es eficaz para destruir los parásitos Cryptocaryon irritans que se unen a los peces.

Ejemplo 2

(Ejemplo de Referencia)

Propósito

Se conoce la actividad antibacteriana de los ácidos grasos de cadena media, pero no se han publicado informes relativos a bacterias patógenas de peces. En el Experimento 11, la actividad antibacteriana de ácidos grasos de cadena media, principalmente ácido decanoico, contra la bacterias patógenas de peces se investigó mediante ensayo in vitro. En el Experimento 12, la eficacia remediadora y la eficacia de prevención de la infección contra las enfermedades bacterianas se investigaron añadiendo ácido decanoico a dietas para platija moteada que han de administrarse oralmente.

Experimento 11

Métodos

Se empleó el análisis trubidimétrico. Ácidos grasos de C2, C4, C6-C10 se disolvieron cada uno en 2 ml de medio de cultivo líquido BHI a una concentración de 500 ppm. Un número de 1 x 10^{5} de bacterias típicas (Vibrio anguillarum, Edwardsiella tarda y Enterococcus seriolicida) que provocan las enfermedades bacterianas de los peces se inoculó en cada medio de cultivo ajustado, seguido por cultivo durante 13 horas a 23 grados centígrados. Después del cultivo, la turbidez del medio de cultivo se midió a 600 nm para determinar la cantidad de bacterias multiplicadas. El experimento se efectuó dos veces. Los resultados se muestran en la Fig. 19 (Vibrio anguillarum), Fig. 20 (Edwardsiella tarda) y Fig. 21 (Enterococcus seriolicida).

Resultados y Análisis

Los ácidos grasos de C6 a C10 mostraban aparentemente una actividad antibacteriana contra Vibrio anguillarum y Edwardsiella tarda. Los ácidos grasos de C9 y C10 mostraban una actividad antibacteriana contra Enterococcus seriolicida además de Vibrio anguillarum y Edwardsiella tarda.

A partir de los resultados anteriores, resultaba que los ácidos grasos de C16 a C10 tenían una actividad antibacteriana contra las bacterias de los peces. De ellos, se espera que los ácidos grasos de C9 y C10 muestren una actividad antibacteriana contra muchas bacterias de los peces. El ácido graso de C12 era tan bajo en solubilidad que el experimento no podía realizarse bajo las mismas condiciones. Sin embargo, se encontró una actividad similar incluso a una concentración baja.

\newpage

Experimento 12

Métodos

Platija moteada que pesaba aproximadamente 60 g de media se empleó en este experimento. Cada 270 piezas de platija moteada se pusieron en jaulas de red alejadas de la costa de 4 x 4 x 2,5 m y se sangraron durante 100 días. El experimento se efectuó de dos maneras para la enfermedad bacteriana presentada; una en la que exitetraciclina (OTC), una substancia antibiótica, se mezclaba en las dietas que habían de aplicarse durante 6 días a una dosis de 0,5 g de OTC al 10%/kg de peso del pez, y la otra en la que dietas que contenían 0,5% de ácido decanoico se administraban continuamente. Se observó el número de peces muertos y las situaciones de los peces. Los peces se alimentaron dos veces al día, es decir por la mañana y por la tarde. La temperatura del agua durante el período experimental está en el intervalo de 14-17 grados centígrados.

Resultados y Análisis

El día 20º desde el comienzo del sangrado, se producía infección por especies de Vibrio e infección por bacterias de las branquias, y los peces muertos emergían. La OTC se aplicó durante 6 días desde el día 22º hasta el 27º desde el comienzo del sangrado. Después de eso, el número de peces muertos se reducía, pero el remedio completo de la infección por especies de Vibrio no se confirmó y la muerte de los peces todavía continuaba (Fig. 22). Desde el día 61º después del comienzo del experimento, el número de peces muertos debido a infección por especies de Vibrio y la infección por bacterias de las branquias se incrementaba de nuevo. Las dietas con ácido decanoico añadido se administraron desde el día 64º después del comienzo del experimento. El número de peces muertos se reducía aparentemente a continuación y no se encontraban peces muertos después del día 72º desde el comienzo del experimento. Además, tampoco se encontraron peces que sufrieran abrasión y sangrado debido a la infección por especies de Vibrio y la infección por bacterias de las branquias. Esta condición satisfactoria continuaba hasta el final del sangrado.

A partir de los resultados anteriores, la eficacia remediadora y la eficacia de prevención de la infección sobre las enfermedades bacterianas de los peces se confirmaron añadiendo ácido decanoico a dietas para administración oral a peces. También se estimó que también puede esperarse una eficacia similar sobre las enfermedades bacterianas de los peces mediante la adición de otros ácidos grasos de C6 a C12 distintos al decanoico. El resultado anterior también apoya la eficacia de ácidos grasos de cadena media contra parásitos a un nivel in vivo. Así, se cree que los ácidos grasos de cadena media aplicados aparecen en la sangre y las bacterias patógenas de los peces son afectadas durante el contacto con la sangre. Considerando el mecanismo anterior, la eficacia con la aplicación a un nivel in vivo puede esperarse en todas las especies de peces sobre enfermedades bacterianas para las que la eficacia se confirmaba mediante ensayo in vitro.

Ejemplo 3

(Ejemplo de Referencia)

Propósito

Se conoce la actividad antiviral de ácidos grasos de cadena media, pero no se han publicado informes relativos a la administración oral para virus patógenos de peces. En este ejemplo, los inventores estudiaron Kuchijirosho (enfermedad ulcerosa de la boca) en pez fugo que ha producido los mayores daños entre las enfermedades virales. Desde que se apreció en 1981, la presencia de Kuchijirosho ha aparecido cada año y se han encontrado daños graves. Sin embargo, no se han encontrado todavía métodos de prevención y tratamiento eficaces. En vista de las situaciones anteriores, los inventores estudiaron si la eficacia contra la presencia de Kuchijirosho se desarrolla al añadir ácidos grasos de C6 a C12 a dietas para pez fugo.

Experimento 13

Métodos

Pez probado: Pez fugo que pesa aproximadamente 27,7 g de media.

Grupos experimentales: Dos grupos, es decir, un grupo con ácido graso añadido en el que los peces se alimentaron con dietas con ácidos grasos añadidos y un grupo de control en el que los peces se alimentaron con dietas sin ácidos grasos añadidos. La dosis de alimentación era 2% de peso de pez/día para cada grupo.

Dietas experimentales: Las dietas con ácidos grasos añadidos se prepararon pulverizando 10 g de ácidos grasos, que consistían en C6, C8, C10 y C12 en cantidades iguales, a cada 1 kg de nódulos disponibles comercialmente para pez fugo. Los peces del grupo de control se alimentaron con los nódulos disponibles comercialmente para pez fugo.

Experimento de estimulación: Cada 20 piezas de peces de entre un banco de peces, en el que no se encontraron enfermedades tales como infección por Kuchijirosho, se pusieron en un depósito de agua de 100 litros y se alimentaron con las dietas experimentales respectivas. Después de 14 días, una solución de virus, preparada diluyendo una solución no diluida en un grado de 10-8, se inoculó a cada uno de todos los peces. La solución de virus se inoculó en el músculo en una cantidad de 50 \mum por pez. A continuación, el sangrado se continuó durante 16 días desde el comienzo de la estimulación. Se comparó la mortalidad de los peces en los grupos respectivos. La temperatura del agua durante el período experimental era 25 \pm 1 grados centígrados y el agua se intercambió en 20 ciclos/día.

Resultados y Análisis

Según se muestra en la Fig. 19, el grado de supervivencia de los peces infectados al final del experimento era 60% en el grupo con ácido graso añadido y 25% en el grupo de control (Fig. 23). Se confirmaba así que la presencia de Kuchijirosho puede prevenirse mediante la administración oral de ácidos grasos a los peces.

A partir de los resultados anteriores, resultaba que la eficacia remediadora y la eficacia de prevención de la infección sobre enfermedades virales de peces se esperan añadiendo ácidos grasos de C6 a C12 a dietas para peces. El resultado anterior también apoya la eficacia de ácidos grasos de cadena media contra parásitos y bacterias a un nivel in vivo. Así, se cree que los ácidos grasos de cadena media aplicados aparecen en la sangre y los virus patógenos de los peces son afectados durante el contacto con la sangre. Considerando el mecanismo anterior, la eficacia con la aplicación a un nivel in vivo es esperable en todas las especies de peces sobre las enfermedades virales para las que la eficacia se confirmaba mediante ensayo in vitro.

Aplicabilidad industrial

La presente invención puede proporcionar el uso de un material fisiológicamente activo natural eficaz sobre peces.

Por ejemplo, empleando meramente el material fisiológicamente activo natural como un componente de dietas basales para peces o disolviendo el material en una solución de tratamiento en baño para desarrollar un antiparasitario, se hace posible sangrar los peces en acuicultura mientras se evita que los peces mueran con las enfermedades parasitarias de los peces.

Claims (5)

1. Uso de un material fisiológicamente activo que contiene al menos uno de ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12 para la fabricación de una formulación para tratar a los peces con enfermedades parasitarias o proteger a los peces de enfermedades parasitarias.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el al menos uno de ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12 se selecciona de ácidos grasos libres que tienen un número de carbonos de 6 a 12 y sales, glicéridos, ésteres y amidas que tienen radicales residuales de los ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12 en moléculas de los mismos.

3. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el al menos uno de ácidos grasos que tienen un número de carbonos de 6 a 12 se selecciona de ácido cáprico, ácido caprílico y ácido pelargónico.

4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el material fisiológicamente activo contiene además un material que tiene una actividad vitamina C.

5. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la formulación es un alimento para peces o un aditivo de alimento para peces.