CN111500539A - 低温等离子与抗坏血酸联用的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了低温等离子与抗坏血酸联用的应用，更为具体的是低温等离子照射后的培养基与抗坏血酸联用在体外非治疗性诱导胶质瘤细胞死亡的应用。本发明提供了低温等离子照射后的培养基与抗坏血酸联用在体外非治疗性诱导胶质瘤细胞死亡的应用，表明低温等离子照射后的培养基与抗坏血酸联用对体外培养的胶质瘤细胞系U251、U87细胞具有明显的协同抑制作用，能显著诱导细胞死亡。通过本发明提供的方案可为研究低温等离子体与抗坏血酸联用在胶质瘤治疗方面的应用提供新策略，以期为设计治疗胶质瘤的新产品或新方案提供新的思路。

Description

低温等离子与抗坏血酸联用的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种低温等离子与抗坏血酸联用的应用。
背景技术
脑神经胶质瘤是由大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的、最常见的原发性颅内肿瘤，包括星形细胞肿瘤、少突胶质细胞肿瘤、混合性胶质细胞肿瘤和室管膜肿瘤，其中星形细胞瘤在胶质瘤中最为常见，约占胶质细胞瘤的65％。世界卫生组织(WHO)根据胶质瘤的恶性程度将其分为Ⅰ～Ⅳ级。其中Ⅰ级、Ⅱ级为分化良好的低级别胶质瘤，属于良性肿瘤；Ⅲ级、Ⅳ级为低分化的高级别胶质瘤，属于恶性肿瘤，GBM占50％～80％。恶性胶质瘤作为神经系统中发病率最高的恶性肿瘤，在过去的10年里，即使手术、放射和化学治疗已经取得较大进展，其中位生存期也仅由10个月提高至14个月，并且在针对胶质瘤的多个大型新药试验中，都未能取得令人满意的结果。目前，胶质母细胞瘤的治疗方法主要为手术和放化疗。而部分患者会对放化疗产生抗性，因此，探索新的肿瘤治疗方法，是临床上的迫切需要。
抗坏血酸(Ascorbate)，也叫VC，是一个六碳酮内酯，结构类似葡萄糖，具有强还原性，是强大的自由基清除剂，保护细胞免受氧化损伤。在生理学浓度下具有抗癌作用。在过去十年中，越来越多的研究表明药理学浓度的抗坏血酸可在体外杀死癌细胞并减缓体内肿瘤生长。其发挥抗癌作用的机制主要是促氧化机制。在肿瘤微环境中，抗坏血酸与氧分子或Fe3+反应，导致细胞内ROS水平增加，破坏DNA，抑制ATP产生，导致癌细胞死亡。然而，由于缓慢的自动氧化，其治疗功效受到限制。
低温等离子体(Cold atmospheric plasma，CAP)是物质运动的第四种基本状态，一种接近室温的电离气体，由各种分子，自由基，离子，电子和受激物质组成。已有许多文献报道了CAP的抗癌能力，产生活性氧和氮(RONS)引起细胞氧化损伤，导致细胞死亡。目前，已有两种CAP的使用策略。一种是直接用等离子射流(plasma jet)或者DBD直接对实体肿瘤或者培养在培养皿中的肿瘤细胞进行处理。这种方法只能穿透皮肤表层或作用于肿瘤细胞表面，具有一定的局限性。另外一种是用等离子处理过的培养基(CAM)培养肿瘤细胞，或者在异种移植的肿瘤细胞周围注射等离子体处理过的培养基，通过溶解在培养基中活性氧基/氮基来杀伤肿瘤细胞。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种低温等离子与抗坏血酸联用的应用。
本发明的一方面在于，提供低温等离子与抗坏血酸联用的应用，更为具体的是低温等离子照射后的培养基与抗坏血酸联用在体外非治疗性诱导胶质瘤细胞死亡的应用。
优选的是，包括对体外胶质瘤细胞先采用抗坏血酸进行处理，然后再使用低温等离子体照射后的培养基培养。
优选的是，先配置抗坏血酸浓度为1-20毫摩尔/升的培养基培养体外胶质瘤细胞，培养0.5-3小时，然后使用低温等离子体照射1-20分钟后的培养基培养1-6小时。
优选的是，先配置抗坏血酸浓度为1-20毫摩尔/升的培养基培养体外胶质瘤细胞，培养1小时，然后使用低温等离子体照射1-20分钟后的培养基培养2小时。
优选的是，先配置抗坏血酸浓度为4毫摩尔/升的培养基培养体外胶质瘤细胞，培养1小时，然后使用低温等离子体照射6分钟后的培养基培养2小时。
优选的是，其中使用低温等离子体照射的培养基的容积为10ml。
本发明的另一方面在于，进一步提供低温等离子照射后的培养基与抗坏血酸联用在体外非治疗性诱导U251细胞死亡的应用。
本发明的还一方面在于，进一步提供低温等离子照射后的培养基与抗坏血酸联用在体外非治疗性诱导U87细胞死亡的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供了低温等离子照射后的培养基与抗坏血酸联用在体外非治疗性诱导胶质瘤细胞死亡的应用，表明低温等离子照射后的培养基与抗坏血酸联用对体外培养的胶质瘤细胞系U251、U87细胞具有明显的协同抑制作用，能显著诱导细胞死亡。通过本发明提供的低温等离子与抗坏血酸联用在诱导神经胶质瘤死亡的应用的方案可为研究低温等离子体与抗坏血酸联用在胶质瘤治疗方面的应用提供新策略，以期为设计治疗胶质瘤的新产品或新方案提供新的思路。
附图说明
图1为本发明的实施例1的结果；
图2为本发明的实施例2的结果；
图3为本发明的实施例3的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供低温等离子与抗坏血酸联用的应用，更为具体的是低温等离子照射后的培养基与抗坏血酸联用在体外非治疗性诱导胶质瘤细胞死亡的应用。先对体外胶质瘤细胞先采用抗坏血酸进行处理，然后再使用低温等离子体照射后的培养基培养，诱导体外培养的胶质瘤细胞死亡。需要理解的是，本发明用于非疾病治疗，主要是用于体外研究，通过本发明的方案可研究低温等离子体与抗坏血酸联用在胶质瘤治疗方面的应用，以期为设计治疗胶质瘤的新产品或新方案提供新的思路。
以下实施例中以U251和U87脑胶质瘤细胞为对象进行实验，以对本发明作进一步说明，其中使用的都是常用的分子生物学和细胞生物学相关的试剂与耗材。以下，抗坏血酸用“VC”表示，CAP照射处理后的培养基用“CAM”表示。CAP的基本参数：3KV，1MHZ，4slm；CAP照射处理时距离也没大约2cm左右，照射的培养基采用10ml的培养基。
实施例一：测定低温等离子体照射的培养基与抗坏血酸单用、联用对U251/U87脑胶质瘤细胞的抑制效果。
为了判断低温等离子体照射的培养基和抗坏血酸单独作用对胶质瘤细胞系的细胞活力是否有影响，以下分别检测了低温等离子体照射的培养基和抗坏血酸对胶质瘤细胞系活力的影响。首先将U251细胞系、U87细胞系分别按10*104个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后：
(1)抗坏血酸单独作用：分别配置抗坏血酸浓度为0，1，2，4，6，8毫摩尔/升的培养基处理细胞，1h后换普通培养基继续培养2h；
(2)低温等离子体照射的培养基单独作用：分别用低温等离子体照射处理3min、6min后的培养基(容积为10ml)培养细2h。
(3)联用处理：用抗坏血酸浓度为0，1，2，4，6，8毫摩尔/升的培养基处理细胞，1h后换分别用低温等离子体照射处理3min、6min后的培养基(容积为10ml)培养细胞2h。
用CellTiter Blue法分别检测上述处理后细胞活力，参照图1A，结果表明：单独使用抗坏血酸或低温等离子体照射的培养基对细胞活力没有明显的抑制效果。其中，用TWO-WAY ANOVA分析计算出相应P值，VC与6min CAM联用与对照组(OmM VC,0min CAM)比较差异有统计学意义(***表示P≤0.001,****表示P≤0.0001)。
联用处理的结果表明：用抗坏血酸处理后，能够增加低温等离子体对细胞活力的抑制效果；参照图1B和下表1、表2，用CompuSyn软件分析可知，低温等离子体和抗坏血酸的联合用药具有协同抑制效应。用CompuSyn软件分计算，不同比例的VC与CAM组合下的药物联合指数(CI50)。CI50(下表1和表2中的CI)小于1.0表示该组合的联用具有协同效应，从表中结果可以看出，当VC含量和CAM处理时间达到一定程度时，产生了显著的协同效应。
表1：针对U87细胞联用处理的药物联合指数
Figure BDA0002432648420000051
表2：针对U251细胞联用处理的药物联合指数
Figure BDA0002432648420000052
实施例二 测定低温等离子体和抗坏血酸联用诱导胶U251/U87脑胶质瘤细胞死亡的效果
将U251、U87胶质瘤细胞在96孔板中培养24小时后，用抗坏血酸浓度为4毫摩尔/升的培养基继续培养1小时，再用低温等离子体照射处理6min后的培养基培养2h。
参照图2A，表明低温等离子体照射的培养基和抗坏血酸联用后(图中combined所指)，使细胞变圆，呈现一种死亡样的形态。参照图2B，通过细胞活死试剂盒检测，相比于单一处理，联用确实能够显著诱导细胞死亡，图中比例尺＝100μm，图中下方为对应的统计数据：死细胞与活细胞的相对比例。通过t检验计算出与处理的细胞与对照组相比的P值：相对于对照组，***p、****p<0.001，具有显著性差异。
实施例三 进行低温等离子体和和抗坏血酸联用的协同抑制效果机理的分析实验。
1)将10ml培养基用低温等离子体照射6min后，用过氧化氢试剂盒检测培养基内的过氧化氢水平；如图3A所示，用H2O2检测试剂盒检测普通培养基(High DMEM)与6min CAM中H2O2含量，图中结果表明低温等离子体显著提高细胞培养基内的过氧化氢水平。其中，t检验计算出与High DMEME组相比较的P值：相对于对照组，****p<0.001具有显著性差异。
2)将U251，U87胶质瘤细胞在96孔板中培养24小时后，用抗坏血酸浓度分别为0、4和8毫摩尔/升的培养基培养1小时，再加入300U的过氧化氢酶，加入等离子体照射6min后的培养基继续培养2h，用CellTiter Blue细胞活力检测试剂盒检测细胞活力；如图3B所示，可以发现加入过氧化氢酶之后，逆转了低温等离子体照射的培养基和抗坏血酸对细胞活力的协同抑制效果。
将U251，U87胶质瘤细胞在96孔板中培养24小时后，用抗坏血酸浓度分别为0、4和8毫摩尔/升的培养基培养1小时，再分别加入0.05mM、0.1mM过氧化氢继续培养2h，用CellTiter Blue细胞活力检测试剂盒检测细胞活力，如图3B所示，可以发现过氧化氢和抗坏血酸联用达到了低温等离子体与抗坏血酸联用类似的协同抑制效果。以上实验说明由低温等离子产生的H2O2在低温等离子体和抗坏血酸的协同抑制效果中有重要作用。其中，通过WO-WAY ANOVA分析计算出相应P值，与对照组(OmM VC,0min CAM)比较，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001具有显著性差异。
本实施说明由低温等离子产生的H2O2在低温等离子体和抗坏血酸的协同抑制效果中有重要作用。通过该实验结果，一方面能对低温等离子体和抗坏血酸的协同抑制机理进行研究，另一方面可为设计以低温等离子体和抗坏血酸联用为基础的胶质瘤治疗方案、产品或装置等提供参考。需要理解的是，虽然以上实验说明CAP产生的H2O2在低温等离子体和抗坏血酸的协同抑制效果中起重要作用，仅是对其协同抑制效果的机理进行探索，为其应用提供更多的参考，但并非说明可以直接采用H2O2代替CAP与抗坏血酸联用。主要原因在于：H2O2在医学中的应用主要在于消毒，极少见其用于疾病的治疗，部分原因由于H2O2的氧化性不仅会对病害细胞有损伤，对正常细胞也有损伤，而CAP是已经验证过的能够在一定剂量内能够选择性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞没影响。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (8)

1.一种低温等离子与抗坏血酸联用的应用，其特征在于，低温等离子照射后的培养基与抗坏血酸联用在体外非治疗性诱导胶质瘤细胞死亡的应用。
2.根据权利要求1所述的低温等离子与抗坏血酸联用的应用，其特征在于，对体外胶质瘤细胞先采用抗坏血酸进行处理，然后再使用低温等离子体照射后的培养基培养。
3.根据权利要求2所述的低温等离子与抗坏血酸联用的应用，其特征在于，先配置抗坏血酸浓度为1-20毫摩尔/升的培养基培养体外胶质瘤细胞，培养0.5-3小时，然后使用低温等离子体照射1-20分钟后的培养基培养1-6小时。
4.根据权利要求3所述的低温等离子与抗坏血酸联用的应用，其特征在于，先配置抗坏血酸浓度为1-20毫摩尔/升的培养基培养体外胶质瘤细胞，培养1小时，然后使用低温等离子体照射1-20分钟后的培养基培养2小时。
5.根据权利要求4所述的低温等离子与抗坏血酸联用的应用，其特征在于，先配置抗坏血酸浓度为4毫摩尔/升的培养基培养体外胶质瘤细胞，培养1小时，然后使用低温等离子体照射6分钟后的培养基培养2小时。
6.根据权利要求5所述的低温等离子与抗坏血酸联用的应用，其特征在于，其中使用低温等离子体照射的培养基的容积为10ml。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的低温等离子与抗坏血酸联用的应用，其特征在于，低温等离子照射后的培养基与抗坏血酸联用在体外非治疗性诱导U251细胞死亡的应用。
8.根据权利要求1-6中任意一项所述的低温等离子与抗坏血酸联用的应用，其特征在于，低温等离子照射后的培养基与抗坏血酸联用在体外非治疗性诱导U87细胞死亡的应用。
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