ES2248823T3 - Neutroquina alfa. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA PROTEINA DE NEUTROQUINA AL , QUE ES UN MIEMBRO DE LA FAMILIA DE PROTEINAS TNF. ESPECIALMENTE, SE PROPORCIONAN MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO AISLADAS, QUE CODIFICAN PARA LA PROTEINA DE NEUTROQUINA AL HUMANA, INCLUYENDO FORMAS SOLUBLES DEL DOMINIO EXTRACELULAR. SE PROPORCIONAN ASIMISMO POLIPEPTIDOS DE NEUTROQUINA AL , ASI COMO VECTORES, CELULAS HUESPED Y PROCEDIMIENTOS RECOMBINANTES PARA PRODUCIRLOS. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A PROCEDIMIENTOS DE SELECCION PARA IDENTIFICAR AGONISTAS Y ANTAGONISTAS DE LA ACTIVIDAD NEUTROQUINA AL . ASIMISMO, SE PROPORCIONAN PROCEDIMIENTOS DIAGNOSTICOS PARA DETECTAR ALTERACIONES RELACIONADAS CON EL SISTEMA INMUNITARIO Y PROCEDIMIENTOS TERAPEUTICOS PARA TRATAR ALTERACIONES RELACIONADAS CON EL MISMO.
Description
Neutroquina \alpha.
La presente invención se refiere a una nueva
citoquina expresada por los neutrófilos que ha sido denominada
proteína Neutroquina-\alpha
("Neutroquina-\alpha"). En particular, se
proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína
Neutroquina-\alpha. También se proporcionan
polipéptidos Neutroquina-\alpha, así como
vectores, células hospedantes y métodos recombinantes para producir
los mismos.
Los factores de necrosis tumoral
(TNF-\alpha) y (TNF-\beta, o
linfotoxina), son miembros relacionados de una amplia clase de
polipéptidos mediadores, que incluyen interferones, interleuquinas y
factores de crecimiento, colectivamente llamados citoquinas
(Beutler, B. y Cerami, A., Annu. Ret. Immunol.,
7:625-655 (1989)). El análisis de secuencias de
los receptores de citoquinas han definido varias subfamilias de
proteínas de membrana (1) la superfamilia de Ig, (2) la superfamilia
de la hematopoyetina (receptor de citoquina) y (3) la superfamilia
del factor de necrosis tumoral (TNF)/receptor del factor de
crecimiento del nervio (NGF) (para revisar la superfamilia del TNF
véase, Gruss y Doler, Blood
85(12):3378-3404 (1995) y Aggarwal y
Natarajan, Eur. Cytokine Netw.,
7(2):93-124 (1996)). La superfamilia del
TNF/receptor del NGF contiene al menos 10 proteínas diferentes.
Gruss y Doler, arriba. Se han identificado los ligandos para
esos receptores y pertenecen a al menos dos superfamilias de
citoquinas. Gruss y Dower, arriba.
El factor de necrosis tumoral (una mezcla de
TNF-\alpha y TNF-\beta) fue
descubierto originalmente como resultado de su actividad
antitumoral, sin embargo, ahora es reconocido como una citoquina
pleotrópica, capaz de numerosas actividades biológicas, que incluyen
la apoptosis de algunas líneas celulares trasformadas, la mediación
de la activación y proliferación celular, y también con papeles
importantes en la regulación inmune y la inflamación.
Hasta el momento, miembros conocidos de la
superfamilia de los ligandos del TNF incluyen
TNF-\alpha, TNF-\beta
(linfotoxina-\alpha), LT-\beta,
OX40L, ligando de Fas, CD30L, CD27L, CD40L y 4-IBBL.
Los ligandos de la superfamilia de los ligandos del TNF son
moléculas similares al TNF, ácidas, con aproximadamente un 20% de
homología de secuencias en los dominios extracelulares (intervalo,
12%-36%), y existen principalmente como formas unidas a membrana,
siendo la forma biológicamente activa un complejo
trimérico/multimérico. Las formas solubles de la superfamilia de los
ligandos del TNF solo han sido identificadas hasta el momento para
TNF, LT \beta, y ligando de Fas (para una revisión general, véase
Gruss, H. y Dower, S.K., Blood,
85(12):3378-3404 (1995)), que se
incorpora aquí mediante referencia en toda su extensión. Estas
proteínas están implicadas en la regulación de la proliferación,
activación y diferenciación celular, incluyendo el control de la
supervivencia o muerte celular mediante apoptosis o citotoxicidad
(Armitage, R.J., Curr. Opin. Immunol. 6:407 (1994) y Smith,
C.A., Cell 75:959 (1994)).
El factor de necrosis tumoral alfa
(TNF-\alpha, también denominada caquectina; de
aquí en adelante "TNF") es secretado primariamente por
monolitos y macrófagos, en respuesta a la endotoxina u otros
estímulos, como un heterodímero soluble de subunidades de proteína
de 17 kD (Smith, R.A. et al., J. Biol. Chem.
262:6951-6954 (1987)). También se ha descrito
una forma precursora de TNF de 26 kD unida a membrana (Kriegler, M.
et al., Cell 53:45-53 (1988)).
La evidencia acumulada indica que el TNF es una
citoquina reguladora con actividades biológicas pleotrópicas. Estas
actividades incluyen: inhibición de la síntesis de
lipoprotein-lipasa (actividad "caquectina")
(Beutler, B. et al., Nature 316:552 (1985)), activación de
leucocitos polimorfonucleares (Klebanoff, S.J. et al., J.
Immunol. 136:4220 (1986); Perussia, B., et al., J. Immunol.
138:765 (1987)), inhibición del crecimiento celular o
estimulación del crecimiento celular (Vilcek, J. et al., J. Exp.
Med. 163:632 (1986); Sugarman, B.J. et al., Science
230:943 (1985); Lachman, L.B. et al., J. Immunol.
138:2913 (1987)), acción citotóxica de ciertos tipos de células
trasformadas (Lachman, L.B. et al., arriba); Darzynkiewicz,
Z, et al., Canc. Res. 44:83 (1984)), actividad antiviral
(Kohase, M. et al., Cell 45:659 (1986); Wong, G.H.W. et
al., Nature 323:819 (1986)), estimulación de la resorción ósea
(Bertolini, D.R. et al., Nature 319:516 (1986); Saklatava,
J., Nature 322:547 (1986)), estimulación de la producción de
colagenasa y prostaglandina E2 (Dayer, J.M. et al., J. Exp. Med.
162:2163 (1985)); y acciones inmunorreguladoras, incluyendo
activación de células T (Yolota, S. et al., J. Immunol.
140:531 (1988)), de células B (Kehrl, J.H. et al., J. Exp.
Med. 166:786 (1987)), de monocitos (Philip, R. et al., Nature
323:86 (1986)), de timocitos (Ranges, G.E. et al., J. Exp.
Med. 167:1472 (1988)), y estimulación de la expresión en la
superficie celular de las moléculas de clase I y clase II del
complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (Collins, T. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:446 (1986);
Pujol-Borrel, R. et al., Nature 326:304
(1987)).
El TNF es conocido por sus acciones
pro-inflamatorias que dan como resultado la lesión
tisular, tales como la inducción de actividad procoagulante en las
células endoteliales vasculares (Pober, J.S. et al., J. Immunol.
136:1680 (1986)), el aumento de la adherencia de los neutrófilos
y linfocitos (Pober, J.S. et al., J. Immunol. 138:3319
(1987)), y la estimulación de la liberación de factor activador de
las plaquetas por los macrófagos, neutrófilos y células endoteliales
vasculares (Camussi, G. et al., J. Exp. Med. 166:1390
(1987)).
Evidencias recientes implican al TNF en la
patogénesis de muchas infecciones (Cerami, A. et al., Immunol.
Today 9:28 (1988)), alteraciones inmunes, patología neoplásica,
es decir, en la caquexia que acompaña a algunos cánceres (Oliff, A.,
et al., Cell 50:555 (1987)), y en las patologías autoinmunes
y en la patología del injerto contra el huésped (Piguet, P.F. et
al., J. Exp. Med. 166:1280 (1987)). La asociación de TNF con
cáncer y patologías infecciosas se relaciona frecuentemente con el
estado catabólico del huésped. Un problema principal en los
pacientes con cáncer es la pérdida de peso, habitualmente asociado
con anorexia. El intenso desgaste que resulta se conoce como
"caquexia" (Kern, K.A. et al., J. Parent. Enter. Nutr.
12:286-298 (1988)). La caquexia incluye pérdida
progresiva de peso, anorexia, y erosión persistente de la masa
corporal, en respuesta al crecimiento del cáncer. El estado
caquéctico está por lo tanto asociado con una morbilidad
significativa, y es responsable de la mayoría de la mortalidad del
cáncer. Un número de estudios han sugerido que el TNF es un mediador
importante en la caquexia en el cáncer, la patología infecciosa y en
otros estados catabólicos.
Se piensa que el TNF juega un papel central en
las consecuencias patofisiólogicas de la sepsis por Gram negativos y
en el shock endotóxico (Michie, H.R., et al., Br. J. Surg.
76:670-671 (1989); Debets, J.M.H. et al.,
Second Viena Shock Forum, pag. 463-466 (1989);
Simpson, S.Q. et al., Crit. Care Clin.
5:27-47 (1989)), incluyendo fiebre, malestar
general, anorexia, y caquexia. La endotoxina es un potente activador
de monocitos/macrófagos, que estimula la producción y la secreción
de TNF (Kornbluth, S.K. et al., J. Immunol
137:2585-2591 (1986)) y otras citoquinas. Como
el TNF podría simular muchos efectos biológicos de la endotoxina, se
concluyó que es un mediador central, responsable de las
manifestaciones clínicas de las enfermedades relacionadas con la
endotoxina. El TNF y otras citoquinas derivadas de monocitos median
las respuestas metabólicas y neurohormonales a la endotoxina
(Michie, H.R. et al., N. Eng. J. Med.
318:1481-1486 (1988)). La administración de
endotoxina a voluntarios humanos produce una enfermedad aguda con
síntomas similares a un resfriado, incluyendo fiebre, taquicardia,
tasa metabólica aumentada y liberación de hormonas de estrés
(Revhaug, A. et al., Arch. Surg. 123:162-170
(1988)). También se han encontrado niveles circulante elevados de
TNF en pacientes que padecen sepsis por Gram negativos (Waage, A.
et al., Lancet I:355-357 (1987); Hammerle,
A.F. et al., Second Vienna Shock Forum pag.
715-718 (1989); Debets, J.M.H. et al., Crit. Care
Med. 17:489-497 (1989); Calandra, T. et al.,
J. Infec. Dis. 161:982-987
(1990)).
(1990)).
La inmunoterapia pasiva dirigida a neutralizar el
TNF puede tener un efecto beneficioso en la sepsis por Gram
negativos y en la endotoxemia, debido a la producción aumentada de
TNF y los niveles aumentados de TNF existentes en estos estados
patológicos, como se ha discutido previamente. Cerami et al.,
han descrito anticuerpos contra un material "modulador" que se
caracterizó como caquectina (después identificado como idéntico a
TNF) (Publicación de Patente EPO 0.212.489, 4 de Marzo de 1987).
Tales anticuerpos parecían ser útiles para inmunoensayos
diagnósticos y como terapia del shock en las infecciones
bacterianas. Rubin et al. (Publicación de Patente EPO
0.218.868, 22 de abril de 1987) describieron anticuerpos
monoclonales contra el TNF humano, los hibridomas que secretan
dichos anticuerpos, métodos para producir dichos anticuerpos, y el
uso de dichos anticuerpos en inmunoensayos de TNF. Yone et
al. (Publicación de Patente EPO 0.288.088, 26 de octubre de
1988), describieron anticuerpos anti-TNF, incluyendo
mAbs, y su utilidad en el diagnóstico por inmunoensayo de
patologías, en particular la enfermedad de Kawasaki y la infección
bacteriana. Los líquidos orgánicos corporales de los pacientes con
enfermedad de Kawasaki (síndrome agudo febril nodular linfático
mucocutáneo infantil; Kawasaki, T. Allergy 16:178 (1967);
Kawasaki, T., Shonica (Pediatrics) 26:935 (1985)) contienen
niveles elevados de TNF que están relacionados con la progresión de
la enfermedad (Yone et al., arriba).
Otros investigadores han descrito mAbs
específicos para TNF recombinante humano, que tenían actividad
neutralizante in vitro (Liang, C.M. et al., Biochem.
Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986); Meager,
A. et al., Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly
et al., Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman,
T.S. et al., Hybridoma 6:489-507 (1987);
Hirai, M. et al., J. Immunol. Meth. 96:57-62
(1987); Moller, A. et al., Cytokine 2:162-169
(1990)). Algunos de estos mAbs se utilizaron para localizar epítopos
de TNF humano y desarrollar inmunoensayos enzimáticos (Fendly et
al., arriba; Hirai et al., arriba; Moller et al.,
arriba), y para ayudar a la purificación de TNF recombinante
(Bringman et al., arriba). Sin embargo, estos estudios no
proporcionan una base para producir anticuerpos neutralizantes para
TNF que puedan ser utilizados para uso diagnóstico in vivo o
uso terapéutico en humanos, debido a la inmunogenicidad, falta de
especificidad y/o adecuación farmacéutica.
Los sueros neutralizantes o los mAbs contra el
TNF han demostrado, en mamíferos diferentes al hombre, eliminar los
cambios fisiológicos adversos, y prevenir la muerte después de un
estímulo mortal en endotoxemia y bacteriemia experimental. Este
efecto ha sido demostrado, por ejemplo, en ensayos de mortalidad de
roedores y en sistemas de modelo de patología en primates (Mathison,
J.C. et al., J. Clin. Invest. 81:1925-1937
(1988); Beutler, B. et al., Science
229:869-871 (1985); Tracey, K.J. et al.,
Nature 330:662-664 (1987); Shimamoto, Y. et
al., Immunol. Lett. 17:311-318 (1988); Silva,
A.T. et al., J. Infect. Dis. 162:421-427
(1990); Opal, S.M. et al., J. Infect. Dis.
161:1148-1152 (1990); Hinshaw, L.B. et al.,
Circ. Shock 30:279-292 (1990)).
Hasta el momento, la experiencia con terapia con
mAb anti-TNF en humanos es limitada, pero muestra
resultados terapéuticos beneficiosos, por ejemplo en artritis y
sepsis. Véase, por ejemplo, Elliott, M.J. et al.,
Baillieres Clin. Rheumatol. 9:633-52 (1995);
Feldmann M, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. USA
766:272-8 (1995); van der Poll, T. et al.,
Shock 3:1-12 (1995); Wherry et al., Crit.
Care Med. 21:S436-40 (1993); Tracey K.J., et
al., Crit. Care Med. 21:S415-22 (1993).
El desarrollo de mamíferos es dependiente tanto
de la proliferación y la diferenciación de las células, como de la
muerte celular programada que ocurre a través de la apoptosis
(Walter, et al., Methods Achiev. Exp. Pathol. 13:18 (1988).
La apoptosis juega un papel crítico en la destrucción de los
timocitos inmunes que reconocen a los antígenos propios. El fracaso
de este proceso de eliminación normal puede jugar un papel en las
enfermedades autoinmunes (Gammon et al., Immunology Today
12:193 (1991)).
Itoh et al. (Cell 66:233 (1991)),
describieron un antígeno de superficie celular, el Fas/CD23, que
media la apoptosis y está implicado en la deleción clonal de las
células T. El Fas se expresa en células T activadas, células B,
neutrófilos y en el timo, el hígado, el corazón y el pulmón y el
ovario en ratones adultos (Watanabe-Fukunaga et
al., J. Immunol. 148:1274 (1992)), además de en células T
activadas, células B y neutrófilos. En experimentos en los que un
anticuerpo monoclonal se entrecruza con Fas, se induce la apoptosis
(Yonehara et al., J. Exp. Med. 169:1747 (1989); Trauth et
al., Science 245:301 (1989)). Además, hay un ejemplo en el que
la unión de un anticuerpo monoclonal a Fas es estimuladora para las
células T bajo ciertas condiciones (Alderson et al., J. Exp. Med.
178:2231 (1993)).
El antígeno Fas es una proteína de superficie
celular de MW relativo de 45 Kd. Tanto el gen humano como el murino
han sido clonados por Watanabe-Fukunaga et al.,
(J. Immunol. 148:1274 (1992)) e Itoh et al. (Cell 66:233
(1991)). Las proteínas codificadas por estos genes son ambas
proteínas transmembrana, con homología estructural con la
superfamilia de los receptores del Factor de Crecimiento del
Nervio/Factor de Necrosis Tumoral, que incluye dos receptores de
TNF, el receptor del Factor de Crecimiento de Nervio de baja
afinidad y el CD40, el CD27, el CD30 y el OX40.
Recientemente se ha descrito el ligando de Fas
(Suda et al., Cell 75:1169 (1993)). La secuencia de
aminoácidos indica que el ligando de Fas es una proteína
transmembrana de tipo II, perteneciente a la familia del TNF. Así,
el polipéptido ligando de Fas contiene tres dominios principales: un
dominio intracelular corto en el extremo amino y un dominio
extracelular más largo en el extremo carboxilo, conectados por un
dominio transmembrana hidrófobo. El ligando de Fas es expresado en
los esplenocitos y timocitos, en consistencia con la citotoxicidad
mediada por células T. El ligando de Fas purificado tiene un MW de
40 kD.
Recientemente, se ha demostrado que las
interacciones Fas/ligando de Fas se requieren para la apoptosis
después de la activación de las células T (Ju et al., Nature
373:444 (1995); Brunner et al., Nature 373:441 (1995)).
La activación de las células T induce ambas proteínas sobre la
superficie celular. La interacción posterior entre el ligando y el
receptor da como resultado la apoptosis de las células. Esto apoya
el posible papel regulador de la apoptosis inducido por la
interacción Fas/ligando de Fas durante la respuesta inmune
normal.
De acuerdo con esto, existe una necesidad para
proporcionar citoquinas similares a TNF que estén implicadas en las
situaciones patológicas. Dichas nuevas citoquinas podrían utilizarse
para fabricar nuevos anticuerpos u otros antagonistas que se unan a
las citoquinas similares a TNF, para la terapia de enfermedades
relacionadas con las citoquinas similares a TNF.
La presente invención proporciona moléculas de
ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica una
citoquina que es estructuralmente similar al TNF y las citoquinas
relacionadas, y que se cree que tiene efectos biológicos y
actividades similares. Esta citoquina se denomina
Neutroquina-\alpha, y la invención incluye
polipéptidos Neutroquina-\alpha que tienen al
menos una parte de la secuencia de aminoácidos de la Figura 1 (SEQ
ID NO:2), o una secuencia de aminoácidos codificada por el clon de
cDNA depositado en un hospedante bacteriano el 22 de octubre de
1996, asignado con el número 97768 de ATCC. La secuencia de
nucleótidos determinada por secuenciación del clon de la
Neutroquina-\alpha depositado, que se muestra en
la Figura 1 (SEQ ID NO:1), contiene un marco de lectura abierta que
codifica un polipéptido completo de 285 residuos de aminoácidos,
incluyendo una metionina N-terminal, un dominio
intracelular predicho de alrededor de 46 residuos de aminoácidos, un
dominio transmembrana predicho de alrededor de 26 aminoácidos, un
dominio extracelular predicho de alrededor de 213 residuos de
aminoácidos, y un peso molecular deducido para la proteína completa
de alrededor de 31 kDa. Como para otros tipos de proteínas
transmembrana de tipo II, las formas solubles de la
Neutroquina-\alpha incluyen todo o una parte del
dominio extracelular escindido del dominio transmembrana, y un
polipéptido que contiene el polipéptido
Neutroquina-\alpha completo, que carece del
dominio transmembrana, es decir, el dominio extracelular ligado al
dominio intracelular.
Así, un aspecto de la invención proporciona una
molécula de ácido nucleico que contiene un polinucleótido que tiene
una secuencia de nucleótidos seleccionada de un grupo que consiste
en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido
Neutroquina-\alpha de longitud completa, que tiene
la secuencia de aminoácidos completa de la Figura 1 (SEQ ID NO:2), o
como la codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito de
ATCC del 22 de octubre de 1996, con el Número 97768 de ATCC; (b)
una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular
predicho del polipéptido Neutroquina-\alpha, que
tiene la secuencia de aminoácidos de la posición 73 a la 285 de la
Figura 1 (SEQ ID NO:2), o como la codificada por el clon de cDNA
contenido en el Depósito de ATCC del 22 de octubre de 1996, con el
Número 97768 de ATCC; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica
un polipéptido que contiene el dominio intracelular de la
Neutroquina-\alpha (residuos de aminoácidos desde
alrededor del 1 hasta alrededor del 46 de la Figura 1 (SEQ ID
NO:2)), o como la codificada por el clon de cDNA contenido en el
Depósito de ATCC del 22 de octubre de 1996, con el Número 97768 de
ATCC; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido
que contiene el dominio transmembrana de la
Neutroquina-\alpha (residuos de aminoácidos desde
alrededor del 47 hasta alrededor del 72 en la Figura 1 (SEQ ID
NO:2), o como la codificada por el clon de cDNA contenido en el
Depósito de ATCC del 22 de octubre de 1996, con el Número 97768 de
ATCC; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido
Neutroquina-\alpha soluble, que contiene los
dominios extracelular e intracelular, pero que carece del dominio
transmembrana; y (f) una secuencia de nucleótidos complementaria a
cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a), (b), (c), (d) o
(e) anteriores.
Otras realizaciones de la invención incluyen
moléculas de ácido nucleico aisladas, que contienen un
polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica al
menos en un 90%, y más preferiblemente, idéntica al menos en un 95%,
96%, 97%, 98% ó 99%, a cualquiera de las secuencias de nucleótidos
de (a), (b), (c), (d) o (e) anteriores, y que codifican un
polipéptido que tiene actividad de
Neutroquina-\alpha, o un polinucleótido que se
hibrida, bajo condiciones astringentes de hibridación, a un
polinucleótido descrito anteriormente en (a), (b), (c), (d), (e) o
(f), y que codifica un polipéptido que tiene actividad de
Neutroquina-\alpha. Este polinucleótido que se
hibrida, no se hibrida bajo condiciones astringentes de hibridación
a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que
consiste solo en residuos A o solo en residuos T. La presente
invención adicionalmente describe una molécula de ácido nucleico,
que contiene un polinucleótido que codifica una secuencia de
aminoácidos de una parte del polipéptido
Neutroquina-\alpha que contiene el epítopo, que
tiene una secuencia de aminoácidos como la descrita anteriormente en
(a), (b), (c), (d) o (e).
La presente invención también se refiere a
vectores recombinantes, que incluyen las moléculas de ácido nucleico
de la presente invención, y a células hospedantes que contienen los
vectores recombinantes, así como a métodos para fabricar dichos
vectores y células hospedantes, para utilizarlas para la producción
de polipéptidos o péptidos Neutroquina-\alpha
mediante técnicas recombinantes.
La invención además proporciona un polipéptido
Neutroquina-\alpha que contiene una secuencia de
aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en: (a) la
secuencia de aminoácidos del polipéptido
Neutroquina-\alpha de longitud completa, que tiene
la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la Figura 1 (SEQ ID
NO:2), o como la codificada por el clon de cDNA contenido en el ATCC
Nº 97768, depositado el 22 de octubre de 1996; (b) la secuencia de
aminoácidos del dominio extracelular predicho del polipéptido
Neutroquina-\alpha, que tiene la secuencia de
aminoácidos de la Figura 1 (SEQ ID NO:2) desde la posición 73 hasta
la 285, o como la codificada por el clon de cDNA contenido en el
ATCC Nº 97768, depositado el 22 de octubre de 1996; (c) la secuencia
de aminoácidos del dominio intracelular de la
Neutroquina-\alpha (residuos de aminoácidos desde
alrededor del 1 hasta alrededor del 46 en la FIG 1 (SEQ ID NO:2)), o
como la codificada por el clon de cDNA contenido en el ATCC Nº
97768, depositado el 22 de octubre de 1996; (d) la secuencia de
aminoácidos del dominio transmembrana de la
Neutroquina-\alpha (residuos de aminoácidos desde
alrededor del 47 hasta alrededor del 72 en la FIG 1 (SEQ ID NO:2), o
como la codificada por el clon de cDNA contenido en el ATCC Nº
97768, depositado el 22 de octubre de 1996; y (e) la secuencia de
aminoácidos del polipéptido Neutroquina-\alpha
soluble, que tiene los dominios intracelular y extracelular, pero
que carece del dominio transmembrana, donde cada uno de estos
dominios está definido como se describió anteriormente.
Los polipéptidos de la presente invención también
incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con al
menos el 90% de similitud, y más preferiblemente al menos el 95% de
similitud a los descritos en (a), (b), (c), (d) o (e) anteriormente,
así como polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos
idéntica al menos en un 90%, y todavía más preferiblemente idéntica
en un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a los anteriores, donde dichos
polipéptidos similares tienen actividad de
Neutroquina-\alpha.
Además, la presente invención describe un péptido
o polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una parte del
polipéptido Neutroquina-\alpha portadora del
epítopo, que tiene una secuencia de aminoácidos como la descrita en
(a), (b), (c), (d) o (e) anteriormente. Los péptidos o polipéptidos
que tienen una secuencia de aminoácidos de una parte del polipéptido
Neutroquina-\alpha de la invención, portadora del
epítopo, incluyen partes de dichos polipéptidos con al menos seis o
siete, preferiblemente al menos nueve, y más preferiblemente al
menos desde alrededor de 30 aminoácidos hasta alrededor de 50
aminoácidos, aunque los polipéptidos portadores del epítopo de
cualquier longitud, incluyendo los que tienen la secuencia de
aminoácidos entera de un polipéptido de la invención descrito
anteriormente, también están descritos en la invención. En otra
realización, la invención proporciona un anticuerpo que se une
específicamente a un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos descrita en (a), (b), (c), (d) o (e) anteriormente.
La invención además proporciona métodos para
aislar anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido
Neutroquina-\alpha que tiene una secuencia de
aminoácidos como la descrita aquí. Tales anticuerpos son útiles
desde el punto de vista diagnóstico o terapéutico, como se describe
más adelante.
La invención también proporciona composiciones
farmacéuticas que contienen polipéptidos
Neutroquina-\alpha solubles, particularmente
polipéptidos Nuetroquina-\alpha humanos, que
pueden emplearse por ejemplo, para tratar tumores y metástasis de
tumores, infecciones por bacterias, virus y otros parásitos,
inmunodeficiencias, enfermedades inflamatorias, linfadenopatía,
enfermedades autoinmunes, enfermedades injerto contra huésped, y
para estimular la tolerancia periférica, destruir algunas líneas
celulares trasformadas, mediar la activación y la proliferación
celular, y que están ligadas funcionalmente como mediadores
primarios de la regulación inmune y las respuestas
inflamatorias.
La invención además proporciona composiciones que
contienen un polinucleótido para
Neutroquina-\alpha o un polipéptido
Neutroquina-\alpha, para utilizar en la
administración de células in vitro, y a células ex
vivo. Dichas composiciones pueden ser adecuadas para ser
administradas a células in vivo, o a un organismo
multicelular. En ciertas realizaciones particularmente preferidas de
este aspecto de la invención, las composiciones contienen un
polinucleótido para Neutroquina-\alpha, para la
expresión de un polipéptido Neutroquina-\alpha en
un organismo hospedante, para el tratamiento de una enfermedad.
Particularmente preferida en este aspecto es la expresión en un
paciente humano, para el tratamiento de una disfunción asociada con
actividad endógena aberrante de un gen de
Neutroquina-\alpha.
La presente invención también describe un método
de cribado para identificar compuestos capaces de aumentar o inhibir
una respuesta celular inducida por
Neutroquina-\alpha, que incluye poner en contacto
células que expresan Neutroquina-\alpha con el
compuesto candidato, analizar una respuesta celular, y comparar la
respuesta celular con una respuesta celular estándar, siendo el
estándar analizado el que se produce tras el contacto en ausencia
del compuesto candidato; por lo tanto, una respuesta celular
aumentada sobre el estándar, indica que el compuesto es un agonista,
y una respuesta celular disminuida sobre el estándar indica que el
compuesto es un antagonista.
En otro aspecto, se describe un método para
identificar receptores de Neutroquina-\alpha, así
como un ensayo de cribado para agonistas y antagonistas, utilizando
dichos receptores. Este ensayo incluye la determinación del efecto
que un compuesto candidato tiene sobre la unión de una
Neutroquina-\alpha a un receptor de
Neutroquina-\alpha. En particular, el método
incluye poner en contacto un receptor de
Neutroquina-\alpha con un polipéptido
Neutroquina-\alpha y un compuesto candidato, y
determinar si la unión del polipéptido
Neutroquina-\alpha al receptor de
Neutroquina-\alpha está aumentada o disminuida
debido a la presencia del compuesto candidato. Los antagonistas
pueden emplearse para prevenir el shock séptico, la inflamación, la
malaria cerebral, la activación del virus HIV, el rechazo del
injerto contra el huésped, la resorción ósea, la artritis reumatoide
y la caquexia (debilitación o malnutrición).
Los presentes inventores han descubierto que la
Neutroquina-\alpha no se expresa solo en
neutrófilos, sino también en tejidos de riñón, pulmón, leucocitos de
sangre periférica, médula ósea, células de linfoma T, células de
linfoma B, células T activadas, cáncer de estómago, músculo liso,
macrófagos y sangre de cordón. En un número de enfermedades de estos
tejidos y células, tales como los tumores y las metástasis
tumorales, las infecciones por bacterias, virus y otros parásitos,
las inmunodeficiencias, el shock séptico, la inflamación, la malaria
cerebral, la activación del virus HIV, el rechazo de injerto contra
huésped, la resorción ósea, la artritis reumatoide y la caquexia
(debilitación o malnutrición), se piensa que pueden detectarse
niveles significativamente más altos o más bajos de expresión del
gen de Neutroquina-\alpha en ciertos tejidos (por
ejemplo, médula ósea), o líquidos orgánicos corporales (por ejemplo
suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo
espinal), extraídos de un individuo que tiene dicha enfermedad, en
relación a un "estándar" de nivel de expresión del gen de
Neutroquina-\alpha en tejidos o líquidos orgánicos
corporales, de un individuo que no tiene la enfermedad. Así, la
invención describe un método diagnóstico útil durante el diagnóstico
de una enfermedad, que incluye: (a) analizar el nivel de expresión
del gen de Neutroquina-\alpha con respecto a un
nivel de expresión estándar del gen de
Neutroquina-\alpha, de tal forma que tanto si el
nivel de expresión del gen de Neutroquina-\alpha
está aumentado como si está disminuido respecto del nivel de
expresión estándar, es indicativo de una enfermedad.
La presente invención también describe una
utilización de un polipéptido Neutroquina-\alpha
de la invención, para la preparación de una composición farmacéutica
para tratar a un individuo con necesidad de un nivel de actividad de
Neutroquina-\alpha aumentado en el organismo.
La presente invención además describe la
utilización de anticuerpos específicos para
Neutroquina-\alpha, para la preparación de una
composición farmacéutica para tratar a un individuo con necesidad de
un nivel de actividad de Neutroquina-\alpha
disminuido en el organismo.
La Fig 1 muestra las secuencias de nucleótidos
(SEQ ID NO:1) y la deducida de aminoácidos (SEQ ID NO:2) de la
proteína Neutroquina-\alpha. Los aminoácidos 1 al
46 representan el dominio intracelular, los aminoácidos 47 a 72 el
dominio transmembrana (la secuencia subrayada), y los aminoácidos 73
a 285, el dominio extracelular (la secuencia restante).
La Figura 2 muestra las regiones de identidad
entre las secuencias de aminoácidos de la proteína
Neutroquina-\alpha y el
TNF-\alpha (SEQ ID NO:3),
TNF-\beta (linfotoxina; SEQ ID NO:4), y ligando de
FAS (SEQ ID NO:5), determinado mediante la rutina "Megalign",
que es parte del programa informático llamado "DNAStar".
La Figura 3 muestra un análisis de la secuencia
de aminoácidos de la Neutroquina-\alpha. Se
muestran las regiones alfa, beta, giro y espiral; la hidrofilicidad
y la hidrofobicidad; las regiones amfifáticas; las regiones
flexibles; el índice antigénico y la probabilidad de superficie. En
el gráfico "Índice
antigénico-Jameson-Wolf", la
localización indicada de las regiones altamente antigénicas de la
proteína Neutroquina-\alpha, es decir, las
regiones de las cuales pueden obtenerse los péptidos portadores de
epítopos de la invención.
La Figura 4 muestra el alineamiento de la
secuencia de nucleótidos de la Neutroquina-\alpha,
determinada a partir del cDNA depositado en el Depósito ATCC del 22
de octubre de 1996, con clones de cDNA humanos de la invención, que
se han denominado HSOAD55R (SEQ ID NO:7), HSLAH84R (SEQ ID NO:8) y
HLTBM08R (SEQ ID NO:9).
La presente invención proporciona moléculas de
ácido nucleico que contienen una polinucleótido que codifica un
polipéptido Neutroquina-\alpha, que tiene la
secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:2), que
se determinó mediante secuenciación de un clon de cDNA de
Neutroquina-\alpha. La secuencia de nucleótidos
mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1), se obtuvo mediante
secuenciación del clon HNEDU15, que se depositó el 22 de octubre de
1996 en el American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive,
Rockville, Maryland. El clon depositado está contenido en el
plásmido pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA).
La proteína Neutroquina-\alpha
de la presente invención comparte homología de secuencia con el
producto de tradución de los mRNA humanos para
TNF-\alpha, TNF-\beta y ligando
de Fas (Figura 2). Como se ha especificado anteriormente, se piensa
que el TNF-\alpha es una citoquina importante que
juega un papel en la citotoxicidad, la necrosis, la apoptosis, la
co-estimulación, la proliferación, la formación de
los ganglios linfáticos, el cambio de clase de las inmunoglobulinas,
la diferenciación, la actividad antiviral, la regulación de
moléculas de adhesión y otras citoquinas y factores de
crecimiento.
A no ser que se especifique otra cosa, todas las
secuencias de nucleótidos determinados mediante secuenciación de una
molécula de DNA aquí incluida, se determinó utilizando un
secuenciador automático de DNA (tal como el Modelo 373 de Applied
Biosystems, Inc., Foster City, CA), y todas las secuencias de
polipéptidos codificadas por las moléculas de DNA determinadas aquí
se predijo mediante la tradución de una secuencia de DNA
determinada, como se especificó anteriormente. De este modo, como es
conocido en la técnica, para cualquier secuencia de DNA determinada
mediante esta aproximación automática, cualquier secuencia de
nucelótidos determinada aquí puede contener algunos errores. Las
secuencias de nucleótidos determinadas automáticamente son
típicamente idénticas al menos en un 90%, más típicamente idénticas
al menos desde alrededor de un 95% hasta al menos alrededor de un
99,9% a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de DNA
secuenciada. La secuencia real puede ser más precisamente
determinada mediante otras aproximaciones, incluyendo métodos de
secuenciación manual de DNA, bien conocidas en la técnica. Como
también se conoce en la técnica, una inserción o deleción única en
una secuencia de nucleótidos determinada, comparada con la secuencia
real, ocasionará un cambio de marco en la tradución de la secuencia
de aminoácidos, de tal forma que la secuencia de aminoácidos
predicha codificada por una determinada secuencia de nucleótidos,
será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos
realmente codificada por la molécula de DNA secuenciada, comenzando
en el punto de dicha inserción o deleción.
Por "secuencia de nucleótidos" de una
molécula de ácido nucleico o polinucleótido, se entiende una
molécula o polinucleótido de DNA, una secuencia de
deoxirribonucleótidos, y una molécula o polinucleótido de RNA, la
correspondiente secuencia de ribonucleótidos (A, G, C y U), en la
que cada desoxirribonucleótido timidina (T) en la secuencia
especificada de desoxirribonucleótidos, se reemplaza por el
ribonucleótido uridina (U).
Utilizando la información aquí proporcionada, tal
como la secuencia de nucleótidos de la Figura 1, una molécula de
ácido nucleico de la presente invención que codifica un polipéptido
Neutroquina-\alpha, puede obtenerse utilizando
procedimientos de clonación y cribado estándar, tales como los de
clonación de cDNA utilizando mRNA como material de inicio. Como
ilustrativo de la invención, la molécula de ácido nucleico descrita
en la Figura 1 (SEQ ID NO:1), se descubrió en una biblioteca de cDNA
derivada de neutrófilos. También se encontraron marcadores de
secuencia, correspondientes a una parte del cDNA de la
Neutroquina-\alpha, expresados en neutrófilos.
El gen de la Neutroquina-\alpha
contiene un marco de lectura abierta, que codifica una proteína de
alrededor de 285 residuos de aminoácidos, un dominio intracelular de
alrededor de 46 aminoácidos (residuos de aminoácidos desde alrededor
del 1 hasta alrededor del 46 en la Figura 1) (SEQ ID NO:2)), un
dominio transmembrana de alrededor de 26 aminoácidos (residuos de
aminoácidos desde alrededor del 47 hasta alrededor del 72 en la FIG
1 (SEQ ID NO:2)), un dominio extracelular de alrededor de 213
aminoácidos (residuos de aminoácidos desde alrededor del 73 hasta
alrededor del 285 en la Figura 1 (SEQ ID NO:2)); y un peso molecular
deducido de alrededor de 31 kDa. La proteína
Neutroquina-\alpha mostrada en la Figura 1 (SEQ ID
NO:2) tiene una similitud de alrededor del 20% y es idéntica en un
10% al TNF-\alpha, al que puede accederse en el
GenBank con el Nº de Acceso 339764.
Como cualquier experto normal podrá apreciar,
debido a las posibilidades de error de secuencia discutidas
previamente, el polipéptido Neutroquina-\alpha
completo real, codificado por el cDNA depositado, que contiene
alrededor de 285 aminoácidos, puede de alguna forma ser más corto.
En particular, la secuencia determinada de
Neutroquina-\alpha contiene un segundo codón de
metionina, que puede servir como un codón de iniciación alternativo
para la tradución del marco de lectura abierta, en los nucleótidos
de las posiciones 210-213 en la Figura 1 (SEQ ID
NO:1). Más generalmente, el marco de lectura abierta real puede
estar en cualquier lugar en el intervalo de \pm20 aminoácidos, más
preferiblemente en el intervalo de \pm10 aminoácidos, del predicho
del primer o del segundo codón de metionina del extremo N mostrado
en la Figura 1 (SEQ ID NO:1). Será además apreciado que, dependiendo
de los criterios analíticos utilizados para identificar varios
dominios funcionales, la "dirección" exacta de los dominios
extracelular, intracelular y transmembrana del polipéptido
Neutroquina-\alpha pueden diferir levemente. Por
ejemplo, la localización exacta del dominio extracelular de la
Neutroquina-\alpha en la Figura 1 (SEQ ID NO:2),
puede variar levemente (por ejemplo, la dirección puede
"moverse" alrededor de 1 a 20 residuos, más probablemente desde
alrededor de 1 hasta alrededor de 5 residuos), dependiendo de los
criterios utilizados para definir el dominio. En este caso, los
extremos del dominio transmembrana y el comienzo del dominio
extracelular se predecirán sobre la base de la identificación de la
secuencia de aminoácidos hidrófoba en las posiciones indicadas
anteriormente, como se muestra en la Figura 3. En cualquier evento,
como se discutió mejor anteriormente, la invención además
proporciona polipéptidos que tienen varios residuos deleccionados
del extremo N del polipéptido completo, incluyendo polipéptidos que
carecen de uno o más aminoácidos del extremo N del dominio
extracelular aquí descrito, que constituyen formas solubles del
dominio extracelular de la proteína
Neutroquina-\alpha, sin embargo, retienen la
actividad de Neutroquina-\alpha.
Como se ha indicado, las moléculas de ácido
nucleico de la presente invención pueden estar en forma de RNA, tal
como mRNA, o en forma de DNA, incluyendo por ejemplo, cDNA y DNA
genómico obtenido mediante clonación u obtenido sintéticamente. El
DNA puede ser de doble cadena o de cadena única. El DNA de cadena
única o el RNA pueden ser la hebra codificadora, también conocida
como la hebra en sentido, o pueden ser la hebra no codificadora,
también denominada hebra en anti-sentido.
Mediante molécula(s) de ácido nucleico
"aislada(s)", se entiende una molécula de ácido
nucleico, DNA o RNA, que se ha extraído de su ambiente natural. Por
ejemplo, las moléculas de DNA recombinantes contenidas en un vector
se consideran aisladas para los propósitos de la presente invención.
Más ejemplos de moléculas de DNA aisladas incluyen moléculas de DNA
recombinante mantenidas en células hospedantes heterólogas o
moléculas de DNA purificadas (parcialmente o sustancialmente), en
solución. Las moléculas de RNA aisladas incluyen, trascritos de RNA
in vivo o in vitro de las moléculas de DNA de la
presente invención. Las moléculas de ácido nucleico aisladas según
la presente invención también incluyen las mismas moléculas
producidas sintéticamente.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención incluyen moléculas de DNA que contienen un marco de
lectura abierta (ORF) con un codón de iniciación en las posiciones
147-149 de la secuencia de nucleótidos mostrada en
la Figura 1 (SEQ ID NO:1). Además, las moléculas de ácido nucleico
de la invención incluyen moléculas de DNA que contienen una
secuencia sustancialmente diferente de las descritas anteriormente
pero que, debido a la degeneración del código genético, todavía
codifican la proteína Neutroquina-\alpha. Por
supuesto, el código genético es bien conocido en la técnica. Así,
será rutinario para cualquier experto en la técnica generar las
variantes degeneradas descritas anteriormente. En otro aspecto, la
invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican el
polipéptido Neutroquina-\alpha que tiene una
secuencia de aminoácidos codificada por el cDNA contenido en el
plásmido depositado el 22 de octubre de 1996. Preferiblemente, esta
molécula de ácido nucleico comprenderá una secuencia que codifica el
dominio extracelular del polipéptido codificado por el clon de cDNA
depositado descrito anteriormente.
La invención además proporciona una molécula de
ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la
Figura 1 (SEQ ID NO:1), o la secuencia de nucleótidos del cDNA de la
Neutroquina-\alpha, contenida en clon depositado
descrito anteriormente, o una molécula de ácido nucleico que tiene
una secuencia complementaria a una de las secuencias anteriores.
Dichas moléculas, particularmente las moléculas de DNA, son útiles
como sondas para mapeo genético, mediante hibridación in situ
con cromosomas, y para detectar la expresión del gen de la
Neutroquina-\alpha en tejido humano, por ejemplo,
mediante análisis de Northern blot.
La presente invención se dirige además a
moléculas de ácido nucleico que codifican partes de las secuencias
de nucleótidos descritas aquí, así como a fragmentos de las
moléculas de ácido nucleico aisladas descritas aquí, donde dichas
partes o fragmentos codifican un polipéptido que tiene actividad de
Neutroquina-\alpha. En particular, la invención
proporciona un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos
que representa la parte de la SEQ ID NO:1 que consiste en las
posiciones 1-1001 de la SEQ ID NO:1.
Más generalmente, por un fragmento de una
molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos del
cDNA depositado, o la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura
1 (SEQ ID NO:1), se entiende fragmentos de al menos alrededor de 15
nt, y más preferiblemente al menos de alrededor de 20 nt, todavía
más preferiblemente al menos de alrededor de 30 nt, e incluso
todavía más preferiblemente, al menos alrededor de 40 nt de
longitud, que son útiles como sondas y cebadores diagnósticos, como
se ha discutido aquí. Por supuesto, fragmentos mayores, de
50-300 nt de longitud son también útiles según la
presente invención, como son los fragmentos correspondientes a la
mayoría, si no a todas, las secuencias de nucleótidos del cDNA
depositado o como la mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1). Por un
fragmento de al menos 20 nt de longitud, por ejemplo, se entienden
fragmentos que incluyen 20 o más bases contiguas de la secuencia de
nucleótidos del cDNA depositado, o de la secuencia de nucleótidos
mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1).
En otro aspecto, la invención proporciona una
molécula de ácido nucleico que contiene un polinucleótido que se
hibrida, bajo condiciones de hibridación astringentes, con una parte
del polinucleótido en una molécula de ácido nucleico de la invención
descrita anteriormente, por ejemplo, el clon de cDNA contenido en el
ATCC Nº 97768 depositado el 22 de octubre de 1996, y que codifica un
polipéptido que tiene actividad de
Neutroquina-\alpha. Por "condiciones de
hibridación astringentes" se entiende incubación durante la noche
a 42ºC en una solución que contiene formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl
150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico (pH 7,6) 50 mM, 5 x
solución de Denhardt's, sulfato de dextrano al 10%, y 20 \mug/ml
de esperma de salmón desnaturalizado, cortado, seguido de lavado de
los filtros en 0,1 x SSC a alrededor de 65ºC.
Por un polinucleótido que se hibrida con una
"parte" de un polinucleótido, se entiende un polinucleótido
(cualquiera de DNA o RNA), que se hibrida al menos con alrededor de
15 nucleótidos (nt), y más preferiblemente al menos alrededor de 20
nt, todavía más preferiblemente alrededor de 30-70
(por ejemplo 50) nt del polinucleótido de referencia. Éstos son
útiles como sondas y cebadores diagnósticos, como se ha discutido
anteriormente, y se discutirá en más detalle más adelante.
Por una parte de un polinucleótido de "al menos
20 nt de longitud", por ejemplo, se entiende 20 o más nucleótidos
contiguos de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de
referencia (por ejemplo, del cDNA depositado, o de la secuencia de
nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1)). Por supuesto, un
polinucleótido que se hibrida solo con una secuencia de poli A (tal
como el tracto de poli(A) del extremo 3' del cDNA de la
Neutroquina-\alpha mostrada en la Figura 1 (SEQ ID
NO:1)), o con el tracto complementario de residuos T (o U), no será
incluido en un polinucleótido de la invención, utilizado para
hibridar a una parte del ácido nucleico de la invención, ya que
dicho polinucleótido se hibridará con cualquier molécula de ácido
nucleico que contenga un tracto de poli (A) o su complementario (por
ejemplo, prácticamente cualquier clon de cDNA de doble cadena).
Como se ha indicado, las moléculas de ácido
nucleico de la presente invención que codifican el polipéptido
Neutroquina-\alpha pueden incluir, pero no se
limitan a aquellas que codifican secuencias de aminoácidos del
dominio extracelular del polipéptido y a secuencias adicionales,
tales como las que codifican las secuencias de los dominios
intracelular y transmembrana, o una secuencia de pre-, o pro-, o
prepro-proteína; la secuencia de codificación del
dominio extracelular del polipéptido, con o sin las secuencias de
codificación adicionales mencionadas previamente.
También codificadas por los ácidos nucleicos de
la invención son las secuencias de las proteínas anteriores, junto
con secuencias adicionales, no codificantes, incluyendo por ejemplo,
pero no limitándose a intrones y secuencias 5' y 3' no codificantes,
tales como las secuencias trascritas, no traducidas, que juegan un
papel en la trascripción, el procesamiento del mRNA, incluyendo las
señales de empalme y poliadenilación, por ejemplo la unión a
ribosomas y la estabilidad del mRNA; y secuencias codificantes
adicionales que codifican aminoácidos adicionales, tales como los
que proporcionan funcionalidades adicionales.
Así, la secuencia de codificación del polipéptido
puede fusionarse a una secuencia marcadora, tal como una secuencia
que codifica un péptido que facilita la purificación del polipéptido
fusionado. En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la
invención, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido
hexa-histidina, tal como el marcador proporcionado
en el vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA,
91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles
comercialmente. Como está descrito en Gentz et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por
ejemplo, la hexa-histidina permite la purificación
conveniente de la proteína de fusión. El marcador "HA" es otro
péptido útil para la purificación, que corresponde a un epítopo
derivado de la proteína de hemaglutinación de la influenza, que ha
sido descrito por Wilson et al., Cell 37:767 (1984).
Como se discutirá más adelante, otras proteínas de fusión incluyen
la Neutroquina-\alpha fusionada al Fc en el
extremo N o el C.
La presente invención además se refiere a
variantes de las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención, que codifican partes, análogos o derivados de la proteína
Neutroquina-\alpha que tienen actividad de
Neutroquina-\alpha. Las variantes pueden ocurrir
naturalmente, tales como las variantes alélicas naturales. Por una
"variante alélica" se entiende una de las varias formas
alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un
organismo. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons,
New Cork (1985). Las variantes que no ocurren naturalmente pueden
producirse utilizando técnicas conocidas en la técnica de
mutagénesis.
Tales variantes incluyen las producidas mediante
sustituciones, delecciones o adiciones de nucleótidos. Las
sustituciones, delecciones o adiciones pueden implicar a uno o más
nucleótidos. Las variantes pueden estar alteradas en las regiones de
codificación, las regiones de no codificación, o ambas. Las
alteraciones en las regiones de codificación pueden producir
sustituciones, delecciones o adiciones de aminoácidos conservadoras
o no conservadoras. Especialmente preferidas entre éstas son las
sustituciones, delecciones o adiciones silentes, que no alteran las
propiedades y actividades de la proteína
Neutroquina-\alpha o de sus partes. También
especialmente preferidas en este aspecto son las sustituciones
conservadoras.
Más altamente preferidas son las moléculas de
ácido nucleico que codifican el dominio extracelular de la proteína
que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ
ID NO:2), o el dominio extracelular de la secuencia de aminoácidos
de la Neutroquina-\alpha, codificada por el clon
de cDNA depositado. Más realizaciones incluyen una molécula de ácido
nucleico que contiene un polinucleótido, que tiene una secuencia de
nucleótidos idéntica al menos en un 90%, y más preferiblemente
idéntica al menos en un 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% a un polinucleótido
seleccionado del grupo que consiste en: (a) una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido
Neutroquina-\alpha, que tiene la secuencia de
aminoácidos completa de la Figura 1 (SEQ ID NO:2); (b) una secuencia
de nucleótidos que codifica el dominio extracelular predicho del
polipéptido Neutroquina-\alpha, que tiene la
secuencia de aminoácidos de las posiciones 73-285 en
la Figura 1 (SEQ ID NO:2); (c) una secuencia de nucleótidos que
codifica el polpéptido Neutroquina-\alpha, que
tiene la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de
cDNA contenido en el ATCC Nº 97768, depositado el 22 de octubre de
1996; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio
extracelular del polipéptido Neutroquina-\alpha,
que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA
contenido en el ATCC Nº 97768, depositado el 22 de octubre de 1996;
y (e) una secuencia de nucleótidos complementaria a la longitud
completa de cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b),
(c) o (d) anteriores.
Por un polinucleótido que tiene una secuencia de
nucleótidos "idéntica" al menos en un 95% a la secuencia de
nucleótidos de referencia, que codifica un polipéptido
Neutroquina-\alpha, se entiende que la secuencia
de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de
referencia excepto en que la secuencia del polinucleótido puede
incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de
la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el
polipéptido Neutroquina-\alpha. En otras palabras,
para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de
nucleótidos idéntica al menos en un 95% a la secuencia de
nucleótidos de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la
secuencia de referencia pueden deleccionarse o sustituirse con otro
nucleótido, o un número de nucleótidos de hasta el 5% del total de
nucleótidos en la secuencia de referencia pueden ser insertados en
la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de
referencia pueden ocurrir en las posiciones de los extremos 3' o 5'
de la secuencia de nucleótidos de referencia, o en cualquier lugar
entre esas dos posiciones terminales, intercaladas individualmente
entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más
grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
De forma práctica, si cualquier molécula
particular de ácido nucleico es idéntica al menos en un 90%, 95%,
96%, 97%, 98% ó 99% a, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos
mostrada en la Figura 1, o a la secuencia de nucleótidos del clon de
cDNA depositado, puede determinarse convencionalmente utilizando
programas informáticos conocidos tales como el programa Bestfit
(Wisconsin Sequence Análisis Package, Versión 8 para Unix, Genetics
Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive,
Madison, WI 53711). El programa Bestfit utiliza el algoritmo de
homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied
Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el
mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se utiliza
Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para
determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, idéntica en
un 95% a una secuencia de referencia según la presente invención,
los parámetros se establecen, por supuesto, de tal forma, que el
porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la
secuencia de nucleótidos de referencia, y se permiten fallos en la
homología de hasta el 5% del número total de nucleótidos en la
secuencia de referencia.
La presente solicitud se dirige a moléculas de
ácido nucleico idénticas en al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó
99% a la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la Figura 1 (SEQ
ID NO:1), o a la secuencia de ácidos nucleicos del cDNA depositado,
que codifica un polipéptido que tiene actividad de
Neutroquina-\alpha. Incluso donde una molécula de
ácido nucleico particular no codifica un polipéptido que tiene
actividad de Neutroquina-\alpha, cualquier experto
en la técnica todavía sabrá como utilizar la molécula de ácido
nucleico, por ejemplo, como sonda de hibridación o como cebador para
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los usos de las
moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no
codifican un polipéptido que tiene actividad de
Neutroquina-\alpha incluyen, entre otros, (1)
aislamiento del gen de la Neutroquina-\alpha, o
sus variantes alélicas en una biblioteca de cDNA; (2) hibridación
in situ (por ejemplo "FISH") con preparaciones de
cromosomas en metafase, para proporcionar la localización
cromosómica precisa del gen de la
Neutroquina-\alpha, como está descrito en Verma
et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic
Techniques, Pergamon Press, New York (1988); y análisis Northern
Blot para la detección de la expresión de mRNA de
Neutroquina-\alpha en tejidos específicos.
Preferidas, sin embargo, son las moléculas de
ácido nucleico que tienen secuencias idénticas en al menos un 90%,
95%, 96%, 97%, 98% ó 99% a la secuencia de ácido nucleico mostrada
en la Figura 1 (SEQ ID NO:1), o a la secuencia de ácido nucleico del
cDNA depositado, que de hecho codifican un polipéptido que tiene
actividad de proteína Neutroquina-\alpha. Por
"un polipéptido que tiene actividad de
Neutroquina-\alpha", se entiende polipéptidos
que exhiben actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a
una actividad del dominio extracelular o de la proteína
Neutroquina-\alpha de longitud completa de la
invención, medido en un ensayo biológico particular. Por ejemplo, la
proteína Neutroquina-\alpha de la presente
invención modula la proliferación celular, la citotoxicidad y la
muerte celular. Puede llevarse a cabo un ensayo in vitro de
proliferación celular, citotoxicidad y muerte celular, para medir el
efecto de una proteína sobre ciertas células, utilizando reactivos
bien conocidos y habitualmente disponibles en la técnica, para la
detección de replicación y/o muerte celular. Por ejemplo, numerosos
de dichos ensayos para las actividades de las proteínas relacionadas
con TNF, se describen en las diversas referencias en la sección de
Antecedentes de este documento, arriba. Brevemente, dichos ensayos
incluyen recolectar células humanas o animales (por ejemplo, de
ratón), y mezclarlas con (1) sobrenadante de células hospedantes
trasfectadas, que contiene proteína
Neutroquina-\alpha (o un polipéptido candidato) o
(2) sobrenadante de células hospedantes de control no trasfectadas,
y medir el efecto sobre el número de células o su viabilidad,
después de incubación durante cierto periodo de tiempo. Tales
actividades de modulación de la proliferación celular, como pueden
medirse en este tipo de ensayos, son útiles para tratar tumores,
metástasis de tumores, infecciones, enfermedades autoinmunes,
inflamación y otras enfermedades relacionadas con la inmunidad.
La Neutroquina-\alpha modula la
proliferación y la diferenciación celular de una forma dosis
dependiente en los ensayos anteriormente descritos. Así, "un
polipéptido que tiene actividad de proteína
Neutroquina-\alpha", incluye polipéptidos que
también exhiben cualquiera de las mismas actividades moduladoras de
la célula (particularmente inmunomoduladoras), en los ensayos
descritos anteriormente, de una forma dosis dependiente. Aunque el
grado de actividad dosis dependiente no necesita ser idéntica a la
de la proteína Neutroquina-\alpha,
preferiblemente, "un polipéptido que tiene actividad de proteína
Neutroquina-\alpha", exhibirá una dosis
dependencia similar en una actividad dada, comparada con la proteína
Neutroquina-\alpha (es decir, el polipéptido
candidato exhibirá mayor actividad o no más de alrededor de 25 veces
menos y, preferiblemente, no más de alrededor diez veces menos
actividad relativa a la proteína
Neutroquina-\alpha de referencia).
Como otros miembros de la familia de TNF, la
Neutroquina-\alpha exhibe actividad sobre los
leucocitos incluyendo por ejemplo monocitos, linfocitos y
neutrófilos. Por esta razón, la Neutroquina-\alpha
es activa en dirigir la proliferación, diferenciación y migración de
este tipo de células. Tal actividad es útil para el aumento o la
supresión inmune, mieloprotección, movilización de células
progenitoras, control de inflamación aguda y crónica y tratamiento
de la leucemia. Los ensayos para medir tal actividad son conocidas
en la técnica. Por ejemplo, véase Peters et al., Immun. Today
17:273 (1996); Young et al., J. Exp. Med. 182:1111
(1995); Caux et al., Nature 390:258 (1992); y
Santiago-Schwarz et al., Adv. Exp. Med, Biol.
378:7 (1995).
Por supuesto, debido a la degeneración del código
genético, cualquier experto en la técnica reconocerá inmediatamente
que un gran número de las moléculas de ácido nucleico que tienen una
secuencia idéntica en al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%, a
la secuencia de ácido nucleico del cDNA depositado o a la secuencia
de ácido nucleico mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1), codificará
un polipéptido "que tiene actividad de proteína
Neutroquina-\alpha". De hecho, como todas las
variantes degeneradas de estas secuencias de nucleótidos codificarán
el mismo polipéptido, esto estará claro para cualquier experto en la
técnica, incluso sin llevar a cabo los ensayos de comparación
descritos anteriormente. Será además reconocido en la técnica que,
para tales moléculas de ácido nucleico que no son variantes
degeneradas, un número razonable también codificará un polipéptido
que tiene actividad de proteína
Neutroquina-\alpha. Esto es porque cualquier
experto se dará cuenta de las sustituciones de aminoácidos que
afectan menos probablemente o no afectan significativamente la
función de la proteína (por ejemplo, reemplazar un aminoácido
alifático con un segundo aminoácido alifático), como se describirá
mejor más adelante.
La presente invención también se refiere a
vectores que incluyen las moléculas de DNA de la presente invención,
a células hospedantes que se han modificado genéticamente con los
vectores recombinantes, y a la producción de polipétidos
Neutroquina-\alpha o sus fragmentos mediante
técnicas recombinantes. El vector puede ser, por ejemplo un fago, un
plásmido, o un vector viral o retroviral. Los vectores retrovirales
pueden ser competentes en replicación o defectuosos en replicación.
En el último caso, la propagación viral generalmente ocurrirá solo
en las células hospedantes complementarias. Los polinucleótidos
pueden unirse a un vector que contiene un marcador seleccionable
para la propagación en un hospedante. Generalmente, un vector
plásmido se introduce en un precipitado, tal como precipitado de
fosfato cálcico, o en un complejo con un lípido cargado. Si el
vector es un virus, puede empaquetarse in vitro utilizando
una línea celular de empaquetamiento apropiada, y después
traspasarse a las células hospedantes.
El inserto de DNA deberá ligarse operativamente a
un promotor apropiado, tal como el promotor PL del fago lambda, los
promotores lac, trp, phoA y tac de E. coli, los
promotores precoz y tardío del SV40, y promotores de LTRs virales,
por nombrar algunos. Otros promotores adecuados serán conocidos por
los expertos en la técnica. Las construcciones de expresión
contendrían además lugares para la iniciación de la trascripción, la
terminación y, en la región trascrita, un lugar de unión a ribosoma
para tradución. La parte de codificación del dominio extracelular de
los trascritos expresada por las construcciones, incluirá
preferiblemente un codón de iniciación de la tradución al comienzo,
y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG), posicionado
apropiadamente al final del polipéptido que se está traduciendo.
Como se ha indicado, los vectores de expresión
incluirán preferiblemente al menos un marcador seleccionable. Tales
marcadores incluyen dihidrofolato reductasa, resistencia a G418 o a
neomicina, para cultivo en células eucariotas, y genes de
resistencia a tetraciclina, kanamicina o ampicilina para cultivo de
E. coli y otras bacterias. Ejemplos representativos de
hospedantes apropiados incluyen, pero no se limitan a, células
bacterianas, tales como E. coli, célula de Streptomyces y de
Salmonella typhimurium; células de hongos, tales como células
de levadura, células de insecto, tales como células de Drosophila S2
y Spodoptera Sf9; células animales tales como células CHO, COS, 293,
y células de melanoma Bowes; y células de plantas. Los medios de
cultivo y las condiciones apropiados para las células hospedantes
descritas anteriormente son bien conocidos en la técnica.
Entre los vectores preferidos para utilizar en
bacterias se incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9,
disponibles de QIAGEN, Inc., arriba; vectores pBS, vectores
Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A,
disponibles de Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3,
pKK233-3, pDR540, pRIT5, disponibles de Pharmacia.
Entre los vectores eucarióticos preferidos están pWLNEO, pSV2CAT,
pOG44, pXT1 y pSG, disponibles de Pharmacia. Otros vectores
adecuados serán aparentes para los expertos en la técnica.
La introducción de las construcciones en las
células hospedantes puede efectuarse mediante transfección con
fosfato cálcico, transfección mediada por
DEAE-dextrano, transfección mediada por lípido
catiónico, electroporación, transducción, infección u otros métodos.
Tales métodos están descritos en muchos manuales de laboratorio
estándar, tales como Davis et al., Basic Methods In Molecular
Biology (1986).
El polipéptido puede expresarse de una forma
modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no solo
señales de secreción, sino también regiones funcionales heterólogas
adicionales. Por ejemplo, puede añadirse una región de aminoácidos
adicionales, particularmente aminoácidos cargados, al extremo N del
polipéptido, para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula
hospedante, durante la purificación, o durante el posterior manejo y
almacenamiento. También pueden añadirse restos de péptidos al
polipéptido, para facilitar la purificación. Tales regiones pueden
eliminarse antes de la preparación final del polipéptido. La adición
de restos de péptidos a los polipéptidos para producir secreción o
excreción, para mejorar la estabilidad y para facilitar la
purificación, entre otras, son técnicas familiares y rutinarias en
la técnica. Una proteína de fusión preferida comprende una región
heteróloga de una inmunoglobulina que es útil para estabilizar y
purificar proteínas. Por ejemplo, el Documento
EP-A-O 464 533 (Contrapartida
Canadiense 2045869), describe proteínas de fusión que comprenden
varias partes de la región constante de las moléculas de
inmunoglobulina, junto con otra proteína humana o una de sus partes.
En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión es claramente
ventajosa para utilizar en terapia y diagnóstico y de esta forma, da
como resultado, por ejemplo, una mejora en las propiedades
farmacocinéticas (Documento EP-A- 0232 262). Por
otro lado, para algunos usos sería deseable ser capaz de eliminar la
parte Fc después de que la proteína de fusión se ha expresado,
detectado y purificado de la forma ventajosa descrita. Este es el
caso cuando la parte Fc prueba ser un obstáculo para su utilización
en terapia y diagnóstico, por ejemplo cuando la proteína de fusión
va a utilizarse como antígeno para inmunización. En el
descubrimiento de fármacos, por ejemplo, proteínas humanas tales
como hIL-5 se han fusionado con partes Fc, con el
propósito de tener ensayos de cribado de alto rendimiento para
identificar antagonistas de hIL-5. Véase D.
Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995) y K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995).
Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995) y K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995).
La proteína Neutroquina-\alpha
puede ser recuperada y purificada de cultivos celulares
recombinantes mediante métodos bien conocidos, incluyendo la
precipitación con sulfato amónico o con etanol, la extracción ácida,
la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la
cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía de
afinidad, la cromatografía de hidroxiapatita y la cromatografía de
lectina. Más preferiblemente, se emplea cromatografía de alta
resolución ("HPLC") para la purificación. Los polipéptidos de
la presente invención incluyen productos purificados naturalmente,
productos de procedimientos sintéticos químicos, y productos
producidos mediante técnicas recombinantes en hospedantes
procarióticos y eucarióticos, incluyendo, por ejemplo, células de
bacterias, levaduras, plantas más evolucionadas, insectos o
mamíferos. Dependiendo del hospedante empleado en el procedimiento
de producción recombinante, los polipéptidos de la presente
invención pueden ser glicosilados o pueden ser no glicosilados.
Además, los polipéptidos de la invención pueden también incluir un
residuo de metionina modificada inicial, en algunos casos como
resultado de los procesos mediados por el hospedante.
La invención además proporciona un polipéptido
Neutroquina-\alpha que tiene la secuencia de
aminoácidos codificada por el cDNA depositado, o la secuencia de
aminoácidos de la Figura 1 (SEQ ID NO:2), o un péptido o polipéptido
que contiene una parte de los polipéptidos anteriores, que tienen
actividad de Neutroquina-\alpha.
Para mejorar o alterar las características de los
polipéptidos Neutroquina-\alpha, puede emplearse
ingeniería de proteínas. La tecnología de DNA recombinante conocida
por los expertos en la técnica, puede utilizarse para crear nuevas
proteínas mutantes o "muteínas", incluyendo sustituciones,
delecciones o sustituciones de uno o múltiples aminoácidos, o
proteínas de fusión. Tales polipéptidos modificados pueden mostrar,
por ejemplo, actividad aumentada o estabilidad aumentada. Además,
pueden purificarse con altos rendimientos y muestran mejor
solubilidad que el polipéptido natural correspondiente, al menos
bajo ciertas condiciones de purificación y almacenamiento.
Por ejemplo, para muchas proteínas, incluyendo el
dominio extracelular o la(s) forma(s) madura(s)
de la proteína secretada, es conocido en la técnica que pueden
eliminarse uno o más aminoácidos del extremo N o del extremo C, sin
pérdida sustancial de la función biológica. Por ejemplo, Ron et
al., J. Biol. Chem. 268:2984-2988 (1993),
describieron proteínas KGF modificadas, que tenían actividad de
unión a heparina incluso si los residuos de aminoácidos
aminoterminales 3, 8 ó 27 estaban ausentes.
En el presente caso, como la proteína de la
invención es un miembro de la familia de polipétidos de TNF, las
delecciones de los aminoácidos N-terminales hasta el
residuo Gly (G) en la posición 191 en la Figura 1 (SEQ ID NO:2),
pueden retener alguna actividad biológica tal como la citotoxicidad
en células diana apropiadas. No se esperaría que los polipéptidos
que tienen más delecciones N-terminales incluyendo
el residuo Gly (G), retengan tales actividades biológicas, porque se
sabe que este residuo, en los polipéptidos relacionados con TNF,
está en el comienzo del dominio conservado requerido para las
actividades biológicas. Sin embargo, incluso si la delección de uno
o más aminoácidos del extremo N de una proteína da como resultado la
modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la
proteína, todavía pueden retenerse otras actividades biológicas.
Así, la capacidad de la proteína acortada para inducir y/o unirse a
anticuerpos que reconocen la proteína completa o el dominio
extracelular de la proteína, será generalmente retenida cuando menos
de la mayoría de los residuos de la proteína completa o del dominio
extracelular de la proteína se eliminan del extremo N. Si un
polipéptido particular que carece de residuos
N-terminales de una proteína completa retiene tales
actividades inmunológicas, puede determinarse fácilmente mediante
métodos de rutina descritos aquí y por otro lado bien conocidos en
la técnica.
Según esto, la presente invención además
proporciona polipéptidos que tienen uno o más residuos del extremo
amino de la secuencia de aminoácidos de la
Neutroquina-\alpha mostrada en la Figura 1 (SEQ ID
NO:2), hasta el residuo Gly191 del extremo amino, y los
polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. En particular, la
presente invención proporciona polipéptidos que tienen la secuencia
de aminoácidos de los residuos n-285 de la SEQ ID
NO:2, donde n es un número entero en el intervalo de
2-190, y 191 es la posición del primer residuo del
extremo N del polipéptido Neutroquina-\alpha
completo (mostrado en la SEQ ID NO:2), que se cree que es requerido
para la actividad de la proteína
Neutroquina-\alpha. Más en particular, la
invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos que
tienen la secuencia de aminoácidos de los residuos
2-285, 3-285, 4-285,
5-285, 6-285, 7-285,
8-285, 9-285,
10-285, 11-285,
12-285, 13-285,
14-285, 15-285,
16-285, 17-285,
18-285, 19-285,
20-285, 21-285,
22-285, 23-285,
24-285, 25-285,
26-285, 27-285,
28-285, 29-285,
30-285, 31-285,
32-285, 33-285,
34-285, 35-285,
36-285, 37-285,
38-285, 39-285,
40-285, 41-285,
42-285, 43-285,
44-285, 45-285,
46-285, 47-285,
48-285, 49-285,
50-285, 51-285,
52-285, 53-285,
54-285, 55-285,
56-285, 57-285,
58-285, 59-285,
60-285, 61-285,
62-285, 63-285,
64-285, 65-285,
66-285, 67-285,
68-285, 69-285,
70-285, 71-285,
72-285, 73-285,
74-285, 75-285,
76-285, 77-285,
78-285, 79-285,
80-285, 81-285,
82-285, 83-285,
84-285, 85-285,
86-285, 87-285,
88-285, 89-285,
90-285, 91-285,
92-285, 93-285,
94-285, 95-285,
96-285, 97-285,
98-285, 99-285,
100-285, 101-285,
102-285, 103-285,
104-285, 105-285,
106-285, 107-285,
108-285, 109-285,
110-285, 111-285,
112-285, 113-285,
114-285, 115-285,
116-285, 117-285,
118-285, 119-285,
120-285, 121-285,
122-285, 123-285,
124-285, 125-285,
126-285, 127-285,
128-285, 129-285,
130-285, 131-285,
132-285, 133-285,
134-285, 135-285,
136-285, 137-285,
138-285, 139-285,
140-285, 141-285,
142-285, 143-285,
144-285, 145-285,
146-285, 147-285,
148-285, 149-285,
150-285, 151-285,
151-285, 153-285,
154-285, 155-285,
156-285, 157-285,
158-285, 159-285,
159-285, 160-285,
161-285, 162-285,
163-285, 164-285,
165-285, 166-285,
167-285, 168-285,
169-285, 170-285,
171-285, 172-285,
173-285, 174-285,
175-285, 176-285,
177-285, 178-285,
179-285, 180-285,
181-285, 182-285,
183-285, 184-285,
185-285, 186-285,
187-285, 188-285,
189-285, 190-285, de la SEQ ID NO:2.
También se proporcionan los polinucleótidos que codifican estos
polipéptidos.
De forma similar, se conocen muchos ejemplos de
muteínas de delección del extremo C biológicamente funcionales. Por
ejemplo, el Interferón gamma muestra hasta diez veces mayor
actividad mediante la delección de los 8-10 residuos
de aminoácidos del extremo carboxilo de la proteína (Döbeli et
al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988).
Como la presente proteína es un miembro de la familia de
polipéptidos del TNF, se espera que las delecciones de aminoácidos
C-terminales hasta la Leu en la posición 284,
retengan la mayoría, si no toda la actividad biológica, tal como la
unión al receptor y la modulación de la replicación celular. Los
polipéptidos que tienen deleciones de hasta alrededor de 10 residuos
C-terminales adicionales (es decir, hasta el residuo
Gly en la posición 273), también pueden retener alguna actividad,
tal como la unión al receptor, aunque dichos polipéptidos carecerían
de una parte del dominio conservado de TNF que comienza alrededor de
la Leu284. Sin embargo, incluso si la delección de uno o más
aminoácidos del extremo C de una proteína da como resultado la
modificación o la pérdida de una o más funciones biológicas de la
proteína, pueden retenerse aún otras actividades biológicas. Así, la
capacidad de las proteínas acortadas para inducir y/o unirse a
anticuerpos que reconocen la proteína completa o madura, serán
retenidos cuando menos de la mayoría de los residuos de la proteína
completa o madura se eliminen del extremo C. Si un polipéptido
particular que carece de los residuos C-terminales
de una proteína completa retiene tales actividades inmunológicas,
puede determinarse fácilmente mediante métodos de rutina descritos
aquí y por otra parte conocidos en la técnica.
Según esto, la presente invención además
proporciona polipéptidos que tienen uno o más residuos del extremo
carboxilo de la secuencia de aminoácidos de la
Neutroquina-\alpha mostrada en la Figura 1 (SEQ ID
NO:2), hasta el residuo Gly274 desde el extremo carboxilo, y los
polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. En particular, la
presente invención proporciona polipéptidos que tienen la secuencia
de aminoácidos de los residuos 1-m de la secuencia
de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, donde m es cualquier número entero
en el intervalo entre 274 y 284. Más en particular, la invención
proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen
las secuencias de aminoácidos de los residuos 1-274,
1-275, 1-276, 1-277,
1-278, 1-279, 1-280,
1-281, 1-282, 1-283
y 1-284 de la SEQ ID NO:2. También se proporcionan
los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos.
También se proporcionan polipéptidos que tienen
uno o más aminoácidos deleccionados de ambos extremos amino y
carboxilo, que pueden ser descritos generalmente como que tienen los
residuos n-m de la SEQ ID NO:2, donde n y m son
números enteros como los descritos anteriormente. También se
incluyen secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que
consiste en una parte de la secuencia de aminoácidos completa de la
Neutroquina-\alpha, codificada por el clon de cDNA
contenido en el Depósito ATCC del 22 de octubre de 1996, donde esta
parte excluye del aminoácido 1 al 190 del extremo amino o desde el
aminoácido 1 al 11 del extremo C de la secuencia de aminoácidos
completa (o cualquier combinación de estas delecciones
N-terminales o C-terminales),
codificada por el clon de cDNA en el clon depositado. También se
proporcionan los polinucleótidos codificados por todos los
polipéptidos de delección anteriores.
Además de las formas de delección terminal de la
proteína discutidas anteriormente, se reconocerá por cualquier
experto en la técnica, que algunas secuencias de aminoácidos del
polipéptido Neutroquina-\alpha pueden variar sin
efecto significativo en la estructura o función de la proteína. Si
tales diferencias en secuencia se contemplan, deberá recordarse que
habrá áreas críticas en la proteína que determinarán su
actividad.
Así, la invención además incluye variaciones del
polipéptido Neutroquina-\alpha que muestran
actividad sustancial del polipéptido
Neutroquina-\alpha, o que incluyen regiones de la
proteína Neutroquina-\alpha, tales como las partes
discutidas más adelante. Tales mutantes incluyen delecciones,
inserciones, inversiones, repeticiones y tipos de sustituciones
seleccionadas según las reglas generales conocidas en la técnica, de
tal forma que tienen un efecto pequeño sobre la actividad. Por
ejemplo, se proporcionan guías concernientes a como hacer
sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silentes en Bowie, J.U.
et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences:
Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science
247:1306-1310 (1990), donde los autores indican
que hay dos formas principales de aproximación al estudio de la
tolerancia de una secuencia de aminoácidos a cambiar. El primer
método tiene su base en el proceso de la evolución, en el que las
mutaciones son tanto aceptadas como rechazadas mediante selección
natural. La segunda aproximación utiliza la ingeniería genética para
introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un
gen clonado, y selecciona o criba para identificar secuencias que
mantienen la funcionalidad.
Como establecen los autores, estos estudios han
revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las
sustituciones de aminoácidos. Los autores además indican qué tipo de
cambios de aminoácidos son probablemente permisivos en determinadas
posiciones de la proteína. Por ejemplo, la mayoría de los residuos
de aminoácidos ocultos requieren cadenas laterales no polares,
mientras que pocos hechos de las cadenas laterales de superficie
están generalmente conservados. Otras de dichas sustituciones
fenotípicamente silentes están descritas en Bowie, J.U. et al.,
arriba, y en las referencias allí citadas. Típicamente vistas
como sustituciones conservadoras son los reemplazos, uno por otro,
entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; el intercambio
de los residuos de Ser y Thr, el intercambio de los residuos ácidos
de Asp y Glu. La sustitución entre los residuos amida de Asn y Gln,
el intercambio de los residuos básicos de Lys y Arg, y el reemplazo
entre los residuos aromáticos de Phe, Tyr.
Así, el fragmento, derivado o análogo del
polipéptido que tiene actividad de
Neutroquina-\alpha de la Figura 1 (SEQ ID NO:2), o
el codificado por el cDNA depositado, puede ser (i) uno en el que
uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un
residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un
residuo de aminoácido conservado), y tal residuo de aminoácido
sustituido puede ser o puede no ser uno codificado por el código
genético, o (ii) uno en el que uno o más de los residuos de
aminoácidos incluyen un grupo sustituto, o (iii) uno en el que el
dominio extracelular del polipéptido está fusionado con otro
compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del
polipéptido (por ejemplo polietilén-glicol), o (iv)
uno en el que los aminoácidos adicionales están fusionados al
dominio extracelular del polipéptido, tal como un péptido de región
de fusión IgG Fc, o una secuencia líder o secretora, o una secuencia
que se emplea para la purificación del dominio extracelular del
polipéptido, o una secuencia de pro-proteína. Tales
fragmentos, derivados o análogos están completamente incluidos
dentro del alcance de todos los expertos en la técnica, a partir de
las enseñanzas aquí incluidas.
Así, la Neutroquina-\alpha de
la presente invención puede incluir una o más sustituciones,
delecciones o inserciones de aminoácidos, procedentes tanto de
mutaciones naturales como de manipulación humana. Como se ha
indicado, los cambios son preferiblemente de naturaleza menor, tal
como sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan
significativamente al plegamiento o la actividad de la proteína
(véase Tabla 1).
Aromáticos | Fenilalanina |
Triptófano | |
Tirosina | |
Hidrófobos | Leucina |
Isoleucina | |
Valina | |
Polares | Glutamina |
Asparagina | |
Básicos | Arginina |
Lisina | |
Histidina | |
Ácidos | Ácido Aspártico |
Ácido Glutámico | |
Pequeños | Alanina |
Serina | |
Treonina | |
Metionina | |
Glicina |
Los aminoácidos de la proteína
Neutroquina-\alpha de la presente invención que
son esenciales para la función, pueden identificarse por métodos
conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida a un
lugar o la mutagénesis mediante escanéo de alanina (Cunningham y
Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)). El
último procedimiento introduce mutaciones de alanina únicas en cada
residuo en la molécula. Las moléculas mutantes resultantes son
después ensayadas para alguna actividad biológica, tal como la unión
a receptor o la actividad proliferativa in vivo o in
vitro.
De especial interés son las sustituciones de
aminoácidos cargados por otros aminoácidos cargados o neutros, que
pueden producir proteínas con características mejoradas altamente
deseables, tales como menor agregación. La agregación puede no solo
reducir la actividad, sino también ser problemática cuando se
preparan formulaciones farmacéuticas, porque los agregados pueden
ser inmunogenéticos (Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol.
2:331-340 (1967); Robbins et al.,
Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland et
al., Crit Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems
10:307-377 (1993).
El reemplazo de aminoácidos también puede cambiar
la selectividad de la unión de un ligando a los receptores de la
superficie celular. Por ejemplo, Ostade et al., Nature
361:266-268 (1993) describen ciertas mutaciones
que dan como resultado la unión selectiva del
TNF-\alpha a solamente uno de los dos tipos de
receptores de TNF conocidos. Como la
Neutroquina-\alpha es un miembro de la familia de
polipéptidos de TNF, es probable que las mutaciones similares a las
de TNF-\alpha tengan efectos similares sobre la
Neutroquina-\alpha.
Lugares que son críticos para la unión
ligando-receptor pueden determinarse también
mediante análisis estructural tal como cristalización, resonancia
magnética nuclear o marcaje de fotoafinidad (Smith et al., J.
Mol. Biol. 224:899-904 (1992), y de Vos et
al., Science 255:306-312 (1992)). Como la
Neutroquina-\alpha es un miembro de la familia de
proteínas relacionada con el TNF, para modular, más que para
eliminar completamente las actividades biológicas de la
Neutroquina-\alpha, preferiblemente las mutaciones
se hacen en secuencias que codifican aminoácidos en el dominio
conservado de TNF, es decir, en las posiciones
191-284 de la Figura 1 (SEQ ID NO:2), más
preferiblemente en residuos dentro de esta región que no están
conservados en todos los miembros de la familia del TGF. Haciendo
mutaciones específicas en la Neutroquina-\alpha en
la posición en las que un determinado aminoácido conservado se
encuentra típicamente en las proteínas relacionadas con TNF, la
Neutroquina-\alpha actuará como un antagonista,
poseyendo así actividad angiogénica. Según esto, los polipéptidos de
la presente invención incluyen mutantes de la
Neutroquina-\alpha. Tales mutantes de la
Neutroquina-\alpha están comprendidos en la
secuencia de longitud completa, o preferiblemente en el dominio
extracelular de la secuencia de aminoácidos de la
Neutroquina-\alpha mostrada en la Figura 1 (SEQ ID
NO:2). También forman parte de la presente invención, los
polinucleótidos aislados que comprender secuencias de ácidos
nucleicos que codifican los mutantes de la
Neutroquina-\alpha anteriores.
Los polipéptidos de la presente invención se
proporcionan preferiblemente de forma aislada, y preferiblemente
están sustancialmente purificados. Una versión producida de forma
recombinante del polipéptido Neutroquina-\alpha,
pueden estar sustancialmente purificados mediante el método de una
etapa descrita en Smith y Jonson, Gene
67:31-40 (1988).
Los polipéptidos de la presente invención
incluyen el polipéptido completo codificado por el cDNA depositado,
incluyendo los dominios intracelular, transmembrana y extracelular
del polipéptido codificado por el cDNA depositado, el dominio
extracelular menos los dominios intracelular y trasmembrana de la
proteína, el polipéptido completo de la Figura 1 (SEQ ID NO:2), el
dominio extracelular de la Figura 1 (SEQ ID NO:2) menos los dominios
intracelular y trasmembrana, así como polipéptidos que tienen una
similitud de al menos el 95% y todavía más preferiblemente una
similitud de al menos el 96%, 97%, 98% ó 99% de los descritos
anteriormente.
Por "% de similitud" para dos polipéptidos,
se entiende una puntuación de similitud producida por comparación de
las secuencias de aminoácidos de los dos polipéptidos, utilizando el
programa Bestfit (Wisconsin Sequence Análisis Package, Versión 8
para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575
Science Drive, Madison, WI 53711), y ls establecimientos por defecto
para determinar la similitud. El programa Bestfit utiliza el
algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in
Applied Mathematics 2:482-489, 1981), para encontrar
el mejor segmento de similitud entre dos secuencias.
Por un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos "idéntica" al menos en, por ejemplo, un 95% a una
secuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido
Neutroquina-\alpha, se entiende que dicha
secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia
de referencia, excepto en que la secuencia del polipéptido puede
incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 110
aminoácidos de los aminoácidos de referencia del polipéptido
Neutroquina-\alpha. En otras palabras, para
obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
idéntica al menos en un 95% a la secuencia de aminoácidos de
referencia, hasta el 5% de los residuos de aminoácidos en la
secuencia de referencia pueden deleccionarse o sustituirse con otro
aminoácido, o un número de aminoácidos de hasta el 5% del total de
los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia, pueden
insertarse en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la
secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones amino o
carboxilo terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia, o
en cualquier lugar entre estas dos posiciones terminales,
intercaladas tanto individualmente entre residuos en la secuencia de
referencia, como en uno o más grupos contiguos dentro de la
secuencia de referencia.
De forma práctica, si cualquier polipéptido
particular es idéntico al menos en un 90%. 95%, 96%, 97%, 98% o 99%
a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1
(SEQ ID NO:2), o a la secuencia de aminoácidos codificada por el
clon de cDNA depositado, puede determinarse convencionalmente
utilizando programas informáticos conocidos, tales como el programa
Bestfit (Wisconsin Sequence Análisis Package, Versión 8 para Unix,
Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science
Drive, Madison, WI 53711). Cuando se utiliza el programa Bestfit, o
cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para
determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, idéntica en
un 95% a la secuencia de referencia según la presente invención, se
establecen los parámetros, por supuesto, de tal forma, que el
porcentaje de identidad se calcule sobre la longitud completa de la
secuencia de aminoácidos de referencia, y se permiten fallos de
homología hasta en un 5% del número total de residuos de aminoácidos
en la secuencia de referencia.
El polipéptido de la presente invención podría
ser utilizado como marcador de peso molecular en geles de
SDS-PAGE o en columnas de filtración en gel de
cribado, utilizando métodos bien conocidos en la técnica.
Como se describirá en detalle más adelante, los
polipéptidos de la presente invención también pueden utilizarse para
producir anticuerpos policlonales y monoclonales, que son útiles en
experimentos para detectar la expresión de la proteína
Neutroquina-\alpha, como se describe más adelante,
o como agonistas y antagonistas capaces de estimular o inhibir la
función de la Neutroquina-\alpha. Además, tales
polipéptidos pueden utilizarse en el sistema de dos híbridos de
levadura, para "capturar" las proteínas de unión a la proteína
Neutroquina-\alpha, que son también agonistas y
antagonistas candidatos, según la presente invención. El sistema de
dos híbridos de levadura está descrito en Fields y Song, Nature
340:245-246 (1989).
En otro aspecto, se describe un péptido o
polipéptido que comprende una parte portadora del epítopo de un
polipéptido de la invención. El epítopo de esta parte del
polipéptido, es un epítopo inmunogénico o antigénico de un
polipéptido de la invención. Un "epítopo inmunogénico" se
define como una parte de una proteína que induce una respuesta de
anticuerpos, cuando la proteína completa es el inmunógeno. Por otra
parte, una región de una molécula de proteína a la cual puede unirse
un anticuerpo, se define como "epítopo antigénico". El número
de epítopos inmunogénicos de una proteína, generalmente es menor que
el número de epítopos antigénicos. Véase, por ejemplo, Geysen et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002
(1983).
En cuanto a la selección de péptidos o
polipéptidos que portan un epítopo antigénico (es decir, que
contiene una región de una molécula de proteína a la cual puede
unirse un anticuerpo), es bien conocido en la técnica que los
péptidos sintéticos relativamente cortos, que simulan parte de una
secuencia de la proteína, son capaces de forma rutinaria de inducit
la producción de un antisuero que reacciona con la proteína
parcialmente simulada. Véase, por ejemplo, Sutcliffe, J.G.,
Shinnick, T.M., Green, N. y Learner, R.A. (1983) "Antibodies that
react with predetermined sites and proteins", Science,
219:660-666. Los péptidos capaces de inducir un
suero que reacciona contra la proteína, están frecuentemente
representados en la secuencia primaria de la proteína, pueden
caracterizarse por un conjunto de reglas químicas simples, y no
están confinados a las regiones inmunodominantes de las proteínas
intactas (es decir, epítopos inmunogénicos), ni a las amino y
carboxilo terminales. Los péptidos y polipéptidos de la invención
que portan epítopos antigénicos, son de esta forma útiles para
estimular la producción de anticuerpos, incluyendo anticuerpos
monoclonales, que se unen específicamente al polipéptido de la
invención. Véase, por ejemplo, Wilson et al., Cell
37:767-778 (1984) en la 777.
Los péptidos y polipéptidos que portan epítopos
antigénicos, preferiblemente contienen una secuencia de al menos
siete, más preferiblemente al menos nueve y más preferiblemente
entre desde alrededor de 15 hasta alrededor de 30 aminoácidos,
contenidos dentro de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido
de la invención. Ejemplos no limitantes de polipéptidos o péptidos
antigénicos, que pueden utilizarse para generar anticuerpos
específicos para Neutroquina-\alpha incluyen: un
polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos entre
alrededor de Phe-115 hasta alrededor de
Leu-147 en la Figura 1 (SEQ ID NO:2); un polipéptido
que comprende los residuos de aminoácidos entre alrededor de
Ile-150 hasta alrededor de Tyr-163
en la Figura 1 (SEQ ID NO:2); un polipéptido que comprende los
residuos de aminoácidos entre alrededor de Ser-171
hasta alrededor de Phe-194 en la Figura 1 (SEQ ID
NO:2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos
desde alrededor de Glu-223 hasta alrededor de
Tyr-247 en la Figura 1 (SEQ ID NO:2); un polipéptido
que comprende los residuos de aminoácido desde alrededor de
Ser-271 hasta alrededor de Phe-278
en la Figura 1 (SEQ ID NO:2); Se ha determinado que estos fragmentos
de polipéptido portan epítopos antigénicos de la proteína
Neutroquina-\alpha, mediante el análisis del
índice antigénico de Jameson-Wolf, como se muestra
en la Figura 3, anteriormente.
Los péptidos y polipéptidos que portan epítopos
pueden producirse por cualquier medio convencional. Véase, por
ejemplo, Houghten, R.A. (1985) General method for the rapid
solid-phase synthesis of large numbers of peptides:
specificity of antigen-antibody interaction at the
level of individual amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:5131-5135; este proceso de "Síntesis de
Péptidos Múltiples Simultánea (SMPS)" está mejor descrito en la
Patente de EE. UU. Nº 4.631.211 de Houghten et al. 1986).
Los péptidos y polipéptidos que portan epítopos,
se utilizan para inducir anticuerpos según métodos bien conocidas en
la técnica. Véase, por ejemplo, Sutcliffe et al., arriba;
Wilson et al., arriba; Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82:910-914; y Bittle, F.J., et al.,
J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985). Los péptidos
que portan epítopos inmunogénicos, es decir, aquellas partes de una
proteína que inducen una respuesta de anticuerpos cuando la proteína
completa es el inmunógeno, se identifican según métodos conocidos en
la técnica. Véase, por ejemplo, Geysen et al., arriba.
Todavía además, la Patente de EE. UU. Nº 5.194.392 de Geysen (1990),
describe un método general para detectar o determinar la secuencia
de monómeros (aminoácidos u otros componentes), que es un
equivalente topológico del epítopo (es decir, un "mimotopo"),
que es complementario con un particular paratopo (lugar de unión al
antígeno), de un anticuerpo de interés. Más generalmente, la Patente
de EE. UU. Nº 4.433.092 de Geysen (1989) describe un método ara
detectar o determinar una secuencia de monómeros que es un
equivalente topográfica de un ligando, que es complementario al
lugar de unión al ligando de un receptor particular de interés.
Similarmente, la Patente de EE. UU. Nº 5.480.971, de Houghten, R.A.
et al (1996) sobre Mezclas de Oligopéptidos Prealquilados,
describe oligopéptidos prealquilados lineales
C1-C7-alquilados, y conjuntos y
bibliotecas de dichos pétidos, así como métodos para utilizar tales
conjuntos y bibliotecas de dichos oligopéptidos para determinar la
secuencia de un oligopéptido prealquilado que preferentemente se une
a una molécula receptora de interés. Así, análogos no péptidos de
los péptidos que portan epítopos de la invención, también pueden
fabricarse rutinariamente con estos métodos.
Como cualquier experto en la técnica apreciará,
los polipéptidos Neutroquina-\alpha de la presente
invención y sus fragmentos que portan epítopos descritos
anteriormente, pueden combinarse con partes del dominio constante de
las inmunoglobulinas (IgG), dando como resultado polipéptidos
quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y
muestran una vida media aumentada in vivo. Esto ha sido
demostrado, por ejemplo, para proteínas quiméricas que consisten en
los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano, y varios
dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera
de las inmunoglobulinas de mamíferos (Documento EP A 394.827;
Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)).
Las proteínas de fusión que tienen una estructura dimérica ligada
por puentes disulfuro debido a la parte IgG, también pueden ser más
eficientes en la unión y neutralización de otras moléculas que la
proteína Neutroquina-\alpha monomérica, o que solo
un fragmento de la proteína (Fountoulakis et al., J. Biochem.
270:3958-3964 (1995)).
Los presentes inventores han descubierto que la
Neutroquina-\alpha se expresa en varios tejidos, y
particularmente en neutrófilos. Para un número de enfermedades
relacionadas con el sistema inmune, pueden detectarse niveles de
expresión sustancialmente alterada (aumentada o disminuida) en los
tejidos del sistema inmune u otras células o líquidos orgánicos
corporales (por ejemplo suero, plasma, orina, líquido sinovial o
líquido cefalorraquídeo espinal), extraídos de un individuo que
tiene una de dichas enfermedades, en relación con un nivel de
expresión de Neutroquina-\alpha "estándar",
es decir, el nivel de expresión de
Nuetroquina-\alpha en los tejidos del sistema
inmune o en los líquidos orgánicos corporales de un individuo que no
tiene la enfermedad del sistema inmune. Así, la invención
proporciona un método diagnóstico útil durante el diagnóstico de una
enfermedad del sistema inmune, que incluye medir el nivel de
expresión del gen que codifica la proteína
Neutroquina-\alpha en tejidos del sistema inmune o
en otras células o líquidos orgánicos de un individuo, y comparar el
nivel medido de expresión génica con un nivel estándar de expresión
del de la Neutroquina-\alpha, donde un aumento o
una disminución en el nivel de expresión del gen, comparado con el
estándar, es indicativo de una enfermedad del sistema inmune.
En particular, se cree que ciertos tejidos en
mamíferos con cáncer del sistema inmune, expresan niveles
significativamente aumentados o reducidos de la proteína
Neutroquina-\alpha y del mRNA que codifica la
proteína Neutroquina-\alpha, cuando se comparan
con los niveles "estándar" correspondientes. Además, se cree
que pueden detectarse niveles aumentados o disminuidos de la
proteína Neutroquina-\alpha, en ciertos líquidos
orgánicos corporales (por ejemplo suero, plasma, orina, y líquido
cefalorraquídeo espinal), de mamíferos con dichos tipos de cáncer,
cuando se comparan con suero de mamíferos de la misma especie que no
tienen cáncer.
Así, aquí descrito está un método diagnóstico
útil durante el diagnóstico de una enfermedad del sistema inmune,
incluyendo cánceres de este sistema, que implica medir el nivel de
expresión del gen que codifica la proteína
Neutroquina-\alpha en el tejido del sistema
inmune, o en otras células o líquidos orgánicos corporales de un
individuo, y comparar el nivel medido de expresión génica con un
nivel de expresión estándar de Neutroquina-\alpha,
donde un aumento o disminución en el nivel de expresión génica
comparado con el estándar, es indicativo de una enfermedad del
sistema inmune.
Cuando el diagnóstico de una enfermedad en el
sistema inmune, incluyendo el diagnóstico de un tumor, ha sido ya
realizado según métodos convencionales, la presente invención es
útil como indicador pronóstico, donde los pacientes que exhiben
expresión aumentada o disminuida del gen de la
Neutroquina-\alpha, experimentarán un peor curso
clínico, en relación con pacientes que expresan el gen a nivel
cercano al nivel estándar.
Por "analizar el nivel de expresión del gen que
codifica la proteína Neutroquina-\alpha", se
entiende medir o estimar cualitativamente o cuantitativamente el
nivel de la proteína Neutroquina-\alpha o el nivel
del mRNA que codifica la proteína
Neutroquina-\alpha, en una primera muestra
biológica directamente (por ejemplo, mediante determinación o
estimación del nivel absoluto de proteína o del nivel de mRNA) o
relativamente (por ejemplo, mediante comparación del nivel de
proteína Nuetroquina-\alpha o del nivel de mRNA en
una segunda muestra). Preferiblemente, el nivel de proteína
Neutroquina-\alpha o el nivel de mRNA en la
primera muestra biológica, se mide o se estima y se compara a un
nivel estándar de proteína Neutroquina-\alpha, o a
un nivel estándar de mRNA, siendo el estándar tomado de una segunda
muestra biológica, obtenida de un individuo que no tiene la
enfermedad, o siendo determinado mediante los niveles medios de una
población de individuos que no tienen una enfermedad del sistema
inmune. Como será apreciado en la técnica, una vez que se conoce el
nivel estándar de proteína Neutroquina-\alpha o el
nivel estándar de mRNA, puede utilizarse repetidamente como estándar
para comparación.
Por "muestra biológica" se entiende
cualquier muestra biológica obtenida de un individuo, líquido
orgánico corporal, línea celular, cultivo celular, u otra fuente que
contiene proteína o mRNA de Neutroquina-\alpha.
Como se ha indicado, las muestras biológicas incluyen líquidos
orgánicos corporales (tales como suero, plasma, orina, líquido
sinovial y líquido cefalorraquídeo espinal), que contienen dominios
extracelulares libres de la proteína
Neutroquina-\alpha, tejido del sistema inmune, y
otros tejidos en los que se ha encontrado expresión del dominio
extracelular completo o libre de la
Neutroquina-\alpha, o de un receptor de
Neutroquina-\alpha. Los métodos para obtener
biopsias tisulares y líquidos orgánicos corporales de mamíferos son
bien conocidos en la técnica. Cuando la muestra biológica es para
incluir mRNA, la fuente preferida es una biopsia de tejido.
La presente invención es útil para el diagnóstico
o el tratamiento de varias enfermedades relacionadas con el sistema
inmune en mamíferos, preferiblemente seres humanos. Tales
enfermedades incluyen, pero no se limitan a tumores y metástasis de
tumores, infecciones por bacterias, virus y otros parásitos,
inmunodeficiencias, enfermedades inflamatorias, linfadenopatía,
enfermedades autoinmunes, y enfermedad injerto contra huésped.
El RNA celular total puede aislarse de una
muestra biológica utilizando cualquier técnica adecuada, tal como el
método de etapa única de
guanidin-tiocianato-fenol-cloroformo,
descrito en Chomczynski y Sacchi, Anal. Biochem.
162:156-159 (1987). Los niveles del mRNA que
codifica la proteína Neutroquina-\alpha son
después analizados utilizando cualquier método apropiado. Éstos
incluyen análisis de Northern blot, mapeo de nucleasa S1, reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), trascripción inversa en
combinación con reacción en cadena de la polimerasa
(RT-PCR), y trascripción inversa en combinación con
reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR).
El análisis de los niveles de proteína
Neutroquina-\alpha en una muestra biológica puede
realizarse utilizando técnicas basadas en anticuerpos. Por ejemplo,
la expresión de proteína Neutroquina-\alpha en
tejidos, puede estudiarse con métodos inmunohistológicos clásicos
(Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol.
101:976-985 (1985); Jalkanen, M., et al., J.
Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos
basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión génica de
la proteína Neutroquina-\alpha incluyen
inmunoanálisis, tales como como el ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzima (ELISA) y el radioinmunanálisis (RIA). Los marcadores de
anticuerpos adecuados para los análisis son bien conocidos en la
técnica, e incluyen marcadores enzimáticos, tales como glucosa
oxidasa, y radioisótiopos, tales como yodo (^{125}I, ^{121}I),
carbono (^{14}C), azufre (^{35}S), tritio (^{3}H), indio
(^{112}In), y tecnecio (^{99m}Tc), y marcadores fluorescentes,
tales como fluoresceína y rodamina, y biotina.
Además de analizar los niveles de proteína
Neutroquina-\alpha en una muestra biológica
obtenida de un individuo, la Neutroquina-\alpha
puede también detectarse in vivo mediante técnicas de imagen.
Los marcadores o etiquetas de anticuerpos para técnicas de imagen
in vivo de la proteína Neutroquina-\alpha,
incluyen los detectables mediante rayos X, NMR o ESR. Para rayos X,
los marcadores adecuados incluyen radioisótopos tales como bario o
cesio, que emiten radiación detectable, pero nos son abiertamente
peligrosos para el sujeto. Los marcadores adecuados para NMR y ESR
incluyen aquellos con un giro característico detectable, tales como
deuterio, que puede incorporarse al anticuerpo mediante marcaje de
los nutrientes del hibridoma relevante.
Un anticuerpo específico contra la proteína
Neutroquina-\alpha o un fragmento del anticuerpo
que se ha marcado con un resto de imagen detectable adecuado, tal
como un radioisótopo (por ejemplo, ^{131}I, ^{112}In,
^{99m}Tc), una sustancia radio-opaca, o un
material detectable mediante resonancia magnética nuclear, se
introduce (por ejemplo, parenteralmente, subcutáneamente o
intraperitonealmente), en un mamífero que va a ser examinado para
una enfermedad del sistema inmune. Se entenderá que el tamaño del
sujeto y del sistema de imagen utilizado, determinará la cantidad de
resto de imagen necesario para producir imágenes diagnósticas. En el
caso de un resto radioisotópico, para un sujeto humano, la cantidad
de radiactividad inyectada estará normalmente en el intervalo de
desde alrededor de 5 hasta 20 milicurios de ^{99m}Tc. El
anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado, se acumulará entonces
preferiblemente en la localización de las células que contienen la
proteína Neutroquina-\alpha. La técnica de imagen
tumoral in vivo está descrita en S.W. Burchiel et al.,
"Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their
Fragments" (Capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical
Detection of Cancer, S.W. Burchiel y B.A. Rhodes, eds. Masson
Publishing Inc. (1982)).
Los anticuerpos específicos contra la proteína
Neutroquina-\alpha para utilizar en la presente
invención, pueden producirse contra la proteína
Neutroquina-\alpha intacta o contra uno de sus
fragmentos de polipéptido antigénicos, que pueden presentarse junto
con un trasportador proteico adecuado, tal como una albúmina, a un
sistema animal (tal como conejo o ratón), o, si es suficientemente
largo (al menos alrededor de 25 aminoácidos), sin un
trasportador.
Como aquí se utiliza, el término
"anticuerpo" (Ab), o "anticuerpo monoclonal" (Mab),
pretende incluir moléculas intactas así como fragmentos de
anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y
F(ab')2), que son capaces de unirse específicamente a la
proteína Neutroquina-\alpha. Los fragmentos Fab y
F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se
aclaran más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos
unión no-específica al anticuerpo intacto (Wahl
et al., J. Nucl. Med. 24:316-325
(1983)). Por eso, estos fragmentos son preferidos.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
prepararse por cualquiera de una diversidad de métodos. Por ejemplo,
las células que expresan la proteína
Neutroquina-\alpha, o uno de sus fragmentos
antigénicos, pueden ser administradas a un animal, con objeto de
inducir la producción de suero que contiene anticuerpos
policlonales. En un método preferido, se prepara una preparación de
proteína Neutroquina-\alpha y se purifica para
dejarla sustancialmente libre de contaminantes naturales. Dicha
preparación es después introducida en un animal, con el objetivo de
producir antisuero policlonal de mayor actividad específica.
En el método más preferido, los anticuerpos de la
presente invención son anticuerpos monoclonales (o sus fragmentos de
unión a la proteína Neutroquina-\alpha). Dichos
anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando la tecnología
de hibridoma (Köhler et al., Nature 256:495 (1975); Köhler
et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Köhler et al., Eur.
J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., en
Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,
Elsevier, N.Y., (1981), pags. 563-681). En general,
dicho procedimiento implica inmunizar a un animal (preferiblemente
un ratón), con un antígeno de la proteína
Neutroquina-\alpha o, más preferiblemente, con una
célula que expresa una proteína
Neutroquina-\alpha. Las células adecuadas pueden
reconocerse por su capacidad para unirse a un anticuerpo contra la
proteína Neutroquina-\alpha. Dichas células pueden
cultivarse en cualquier medio de cultivo tisular adecuado; sin
embargo, es preferible cultivar las células en medio de Eagle
modificado por Earle, suplementado con suero bovino fetal al 10%
(inactivado a alrededor de 56ºC), y suplementado con alrededor de 10
g/l de aminoácidos no esenciales, alrededor de 1000 U/ml de
penicilina, y alrededor de 100 \mug/ml de estreptomicina. Los
esplenocitos de dichos ratones se extraen y se fusionan con una
línea celular de mieloma adecuada. Cualquier línea celular de
mieloma adecuada puede emplearse según la presente invención; sin
embargo es preferible emplear la línea celular de mieloma parental
(SP2O), disponible del American Type Cultura Collection, Rockville,
Maryland. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes
son mantenidas selectivamente en medio HAT, y después se clonan
mediante dilución limitante como describieron Wands et al.
(Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Las
células de hibridoma obtenidas a través de dicha selección se
analizan después, para identificar clones que secretan anticuerpos
capaces de unirse al antígeno de la proteína
Neutroquina-\alpha.
Alternativamente, pueden producirse anticuerpos
adicionales capaces de unirse al antígeno de la proteína
Neutroquina-\alpha, en un procedimiento de dos
etapas, a través de la utilización de anticuerpos
anti-idiotípicos. Dicho método hace uso del hecho de
que los anticuerpos son antígenos en si mismos, y que, por eso, es
posible obtener un anticuerpo que se une a un segundo anticuerpo.
Según este método, los anticuerpos específicos contra la proteína
Neutroquina-\alpha se utilizan para inmunizar a un
animal, preferiblemente a un ratón. Los esplenocitos de dichos
animales se utilizan después para producir células de hibridoma, y
las células de hibridoma se criban para identificar clones que
producen un anticuerpo, cuya capacidad para unirse al anticuerpo
específico contra la proteína Neutroquina-\alpha
puede bloquearse por el antígeno de la proteína
Neutroquina-\alpha. Dichos anticuerpos comprenden
anticuerpos anti-idiotípicos contra los anticuerpos
específicos contra la proteína Neutroquina-\alpha,
y pueden utilizarse para inmunizar a un animal, para inducir la
formación de más anticuerpos específicos contra la proteína
Neutroquina-\alpha.
Será apreciado que los fragmentos Fab y
F(ab')2 y otros fragmentos de anticuerpos de la presente
invención, pueden utilizarse según los métodos aquí descritos. Tales
fragmentos son producidos típicamente mediante escisión
proteolítica, utilizando enzimas tales como papaína (para producir
fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2).
Alternativamente, los fragmentos de unión a la proteína
Neutroquina-\alpha, pueden producirse a través de
la aplicación de la tecnología de DNA recombinante, o a través de la
química sintética.
Cuando se utilizan técnicas de imagen in
vivo para detectar niveles aumentados de proteína
Neutroquina-\alpha para el diagnóstico en seres
humanos, puede ser preferible utilizar anticuerpos monoclonales
quiméricos "humanizados". Dichos anticuerpos pueden producirse
utilizando construcciones genómicas derivadas de células de
hibridoma, que producen los anticuerpos monoclonales descritos
previamente. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son
conocidos en la técnica. Véase, como revisión, Morrison, Science
229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986);
Cabilly et al., Patente de EE. UU. Nº 4.816.567; Taniguchi
et al., Documento EP 171496; Morrison et al.,
Documento EP 173494; Neuberger et al., Documento WO 8601533;
Robinson et al., Documento WO 8702671; Boulianne et al.,
Nature 312:643 (1984); Neuberger et al., Nature 314:268
(1985)
Como se ha especificado previamente, los
polinucleótidos y polipéptidos Neutroquina-\alpha,
son útiles para el diagnóstico de enfermedades que implican
expresión anormalmente alta o baja de las actividades de la
Neutroquina-\alpha. Dadas las células y los
tejidos en los que se expresa la
Neutroquina-\alpha, así como las actividades
moduladas por la Neutroquina-\alpha, es fácilmente
aparente que un nivel de expresión sustancialmente alterado
(aumentado o disminuido) de la Neutroquina-\alpha
en un individuo, comparado con el nivel estándar o "normal",
produce enfermedades patológicas relacionadas con sistemas del
organismo en los que la Neutroquina-\alpha se
expresa y/o es activa.
También será apreciado por cualquier experto en
la técnica que, como la proteína
Neutroquina-\alpha de la invención es un miembro
de la familia del TNF, el dominio extracelular de la proteína puede
liberarse en forma soluble de las células que expresan
Neutroquina-\alpha, mediante escisión proteólitica
y por lo tanto, cuando la proteína
Neutroquina-\alpha (particularmente una forma
soluble del dominio extracelular) se añade desde una fuente exógena
a células, tejidos, o el organismo de un individuo, la proteína
ejercerá sus actividades moduladoras sobre cualquiera de sus células
diana en ese indivisuo. También, las células que expresan este tipo
II de proteína transmembrana pueden añadirse a células, tejidos o al
organismo de un individuo, donde las células añadidas se unirán a
las células que expresan el receptor para la
Neutroquina-\alpha, donde las células que expresan
la Neutroquina-\alpha pueden producir acciones
(por ejemplo citotoxicidad) en las células diana portadoras del
receptor.
De este modo, será apreciado que el uso de una
proteína Neutroquina-\alpha (en forma de un
dominio extracelular soluble o células que expresan la proteína
completa), para la preparación de una composición farmacéutica, es
adecuado para tratar enfermedades ocasionadas por una disminución en
el nivel estándar o normal de la actividad de
Neutroquina-\alpha en un individuo,
particularmente pueden tratarse enfermedades del sistema inmune. Así
la invención también proporciona un uso de un polipéptido
Neutroquina-\alpha de la invención, para la
preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de
un individuo con necesidad de un nivel aumentado de actividad de
Neutroquina-\alpha.
Como la Neutroquina-\alpha
pertenece a la superfamilia del TNF, también podría modular la
angiogénesis. Además, como la Neutroquina-\alpha
inhibe las funciones celulares inmunes, tendrá un amplio rango de
actividades anti-inflamatorias. La
Neutroquina-\alpha puede ser adecuada para
emplearse como un agente anti-neovascularizante,
para tratar tumores sólidos mediante el estímulo de la invasión y la
activación de las defensas de la célula hospedante, por ejemplo
células T citotóxicas y macrófagos, y mediante inhibición de la
angiogénesis de tumores. Los expertos en la técnica reconocerán
otras indicaciones no cancerosas, en las que no se quiere tener una
proliferación de vasos sanguíneos. También pueden ser adecuados para
emplearse en la estimulación de las defensas del hospedante contra
infecciones crónicas y agudas resistentes, por ejemplo, infecciones
por micobacterias, a través de la atracción y la activación de los
leucocitos microbicidas. La Neutroquina-\alpha
también puede ser adecuada para emplearse en la estimulación de la
cicatrización de heridas, tanto a través del reclutamiento del
aclaramiento de restos y de células inflamatorias estimuladoras del
tejido conectivo. De esta misma forma, la
Neutroquina-\alpha puede también ser adecuada para
emplearse para tratar otras enfermedades fibróticas, incluyendo la
cirrosis hepática, la artrosis y la fibrosis pulmonar. La
Neutroquina-\alpha también aumenta la presencia de
eosinófilos, que tienen la función particular de matar las larvas de
los parásitos que invaden los tejidos, como en la esquistosomiasis,
la triquinosis y la ascariasis. También puede ser adecuada para
emplearse para regular la hematopoyesis, mediante la regulación de
la activación y diferenciación de varias células progenitoras
hematopoyéticas, por ejemplo, para liberar leucocitos maduros de la
médula ósea después de la quimioterapia, es decir, en la
movilización de células progenitoras. La
Neutroquina-\alpha también puede emplearse para
tratar la sepsis.
La composición del polipéptido
Neutroquina-\alpha (que contiene preferiblemente
un polipéptido del domino extracelular que está en forma soluble),
será formulada y dosificada de una forma consistente con la buena
práctica médica, teniendo en cuenta la condición clínica del
paciente individual (especialmente los efectos secundarios del
tratamiento con el polipéptido Neutroquina-\alpha
solo), el lugar de liberación de la composición del polipéptido
Neutroquina-\alpha, el método de administración,
la agenda de administración, y otros factores conocidos para los
expertos. La "cantidad efectiva" del polipéptido
Neutroquina-\alpha para el propósito actual se
determina así, mediante dichas consideraciones.
Como proposición general, la cantidad
farmacéuticamente efectiva total del polipéptido
Neutroquina-\alpha administrada parenteralmente
por dosis, estará en el intervalo de alrededor de 1 \mug/kg/día a
10 mg/kg/día por peso corporal del paciente, aunque, como se ha
especificado previamente, ésto estará sujeto a la discreción
terapéutica. Más preferiblemente, esta dosis es al menos 0,01
mg/kg/día, y más preferiblemente para seres humanos, entre alrededor
de 0,01 y 1 mg/kg/día para la hormona. Si se administra
continuamente, el polipéptido Neutroquina-\alpha
se administra típicamente a una tasa de dosis de desde alrededor de
1 \mug/kg/hora hasta alrededor de 50 \mug/kg/hora, bien mediante
1-4 inyecciones por día, o mediante infusión
subcutánea continua, por ejemplo, utilizando una
mini-bomba. También puede emplearse una bolsa de
solución intravenosa. La duración del tratamiento necesitada para
observar cambios, y el intervalo después de los tratamientos para
que ocurran las respuestas, parecen variar dependiendo del efecto
deseado.
Las composiciones farmacéuticas que contienen la
Neutroquina-\alpha de la invención, pueden
administrarse oralmente, rectalmente, parenteralmente,
intracisternalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente,
tópicamente (como polvos, ungüentos, gotas o parches trasdérmicos),
bucalmente, o como un inhalador oral o nasal. Por "excipiente
farmacéuticamente aceptable", quiere decirse un material de
relleno, diluyente o encapsulante sólido, semisólido o líquido o una
formulación auxiliar de cualquier tipo. El término "parenteral"
como aquí se utiliza, se refiere a modos de administración que
incluyen la inyección e infusión intravenosa, intramuscular,
intraperitoneal, intracisternal, subcutánea e
intra-articular.
El polipéptido
Neutroquina-\alpha es también adecuado para
administrarse mediante sistemas de liberación sostenida. Ejemplos
adecuados de composiciones de liberación sostenida incluyen matrices
de polímeros semi-permeables en forma de artículos
con forma, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de
liberación sostenida incluyen polilactidos (Patente de EE. UU. Nº
3.773.919, Documento EP 58.481), copolímeros de ácido
L-glutámico y
gamma-etil-L-glutamato
(Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556
(1983)), poli (2-hidroxietil metacritlato) (R.
Langer et al., Id), o ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico
(Documento EP 133.988). Las composiciones de polipéptido
Neutroquina-\alpha de liberación sostenida, pueden
incluir polipéptido Neutroquina-\alpha atrapado en
liposomas. Los lipsomas que contienen el polipéptido
Neutroquina-\alpha se preparan por métodos
conocidos por sí mismos: Documento DE 3.218.121; Epstein et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985);
Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77:4030-4034 (1980); Documento EP 52.322;
Documento 36.676; Documento 88.046; Documento 143.949; Documento
142.641; Solicitud de Patente Japonesa 83-118008;
Patentes de EE. UU.Nº 4.485.045 y Nº 4.544.545; y Documento EP
102.324. Generalmente, los liposomas son de los pequeños (alrededor
de 200-800 Angstroms), de tipo unilaminar, en los
que el contenido lípido es mayor que alrededor de 30 mol. por ciento
de colesterol, siendo las proporciones seleccionadas ajustadas para
la terapia óptima con un polipéptido
Neutroquina-\alpha.
Para administración parenteral, en una
realización, el polipéptido Neutroquina-\alpha se
formula generalmente mezclándolo en el grado deseado de pureza, en
una forma inyectable de dosis unitaria (solución, suspensión o
emulsión), con un excipiente farmacéuticamente aceptable, es decir,
uno que no es tóxico para los recipientes, a las dosis y
concentraciones empleadas, y que es compatible con otros
ingredientes de la formulación. Por ejemplo, la formulación
preferiblemente no incluye agentes oxidantes y otros componentes que
son conocidos por ser perjudiciales para los polipéptidos.
Generalmente, las formulaciones se preparan
poniendo en contacto el polipéptido
Neutroquina-\alpha uniformemente e íntimamente,
con excipientes líquidos o excipientes sólidos finamente divididos,
o ambos. Después, si es necesario, el producto se pone en la forma
de la formulación deseada. Preferiblemente, el excipiente es un
excipiente parenteral, más preferiblemente una solución que es
isotónica con la sangre del recipiente. Ejemplos de tales
excipientes incluyen agua, solución salina, solución de Ringer y
solución de dextrosa. Los vehículos no acuosos, tales como aceites
fijos y etil-oleato son también útiles aquí, así
como los liposomas.
El excipiente adecuado contiene cantidades
menores de aditivos tales como sustancias que aumentan la
isotonicidad y la estabilidad química. Tales materiales son no
tóxicos para los recipientes a las dosis y concentraciones
empleadas, e incluyen soluciones de tampón tales como fosfato,
citrato, succinato, ácido acético, y otros ácidos orgánicos o sus
sales; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de
bajo peso molecular (menos de alrededor de diez residuos), por
ejemplo, poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como albúmina
sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales
como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido
glutámico, ácido aspártico, o arginina; monosacáridos, disacáridos,
y otros carbohidratos incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa,
manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de
azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como sodio;
y/o surfactantes no iónicos, tales como polisorbatos, poloxámeros, o
PEG.
El polipéptido
Neutroquina-\alpha está formulado típicamente en
dichos vehículos, a concentración de desde alrededor de 0,1 mg/ml
hasta 100 mg/ml, preferiblemente 1-10 mg/ml, a un pH
de alrededor de 3 a 8. Se entenderá que el uso de determinados de
los excipientes, trasportadores o estabilizantes anteriores, dará
como resultado la formación de sales de
Neutroquina-\alpha.
El polipéptido
Neutroquina-\alpha para utilizarse en la
preparación de una composición farmacéutica para la administración
terapéutica debe ser estéril. La esterilidad se consigue fácilmente
mediante filtración a través de membranas de filtración estériles
(por ejemplo membranas de 0,2 micras). Las composicones terapéuticas
de polipéptido Neutroquina-\alpha, generalmente
están localizadas en un contenedor que tiene un puerto de acceso
estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial
que tiene un tapón que puede ser atravesado por una aguja de
inyección hipodérmi-
ca.
ca.
El polipéptido
Neutroquina-\alpha generalmente se almacenará en
contenedores de una o múltiples dosis, por ejemplo, ampollas o
viales sellados, o una solución acuosa, o como una formulación
liofilizada para reconstitución. Como ejemplo de una formulación
liofilizada, viales de 10 ml se rellenan con 5 ml de solución acuosa
de polipéptido Neutroquina-\alpha al 1%
(peso/volumen) estéril por filtración, y la mezcla resultante se
liofiliza. La solución de infusión se prepara mediante
reconstitución del polipéptido Neutroquina-\alpha
utilizando agua para inyección bacteriostética.
La invención también proporciona un paquete o kit
farmacéutico que contiene uno o más contenedores, rellenos con uno o
más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la
invención. Asociados con tal(es) contenedor(es) puede
haber una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental
regulando la fabricación, utilización o venta de productos
farmacéuticos o biológicos, donde dicha nota refleja la aprobación
por la agencia de la fabricación, utilización o venta para
administración humana. Además, los polipéptidos de la presente
invención pueden emplearse en conjunción con otros compuestos
terapéuticos.
La invención también describe un método de cribar
compuestos, para identificar aquellos que aumentan o bloquean la
acción de la Neutroquina-\alpha sobre las células,
tal como su interacción con moléculas de unión a
Neutroquina-\alpha, tales como las moléculas
receptoras. Un agonista es un compuesto que aumenta las funciones
biológicas naturales de la Neutroquina-\alpha, que
funciona de una manera similar a la
Neutroquina-\alpha, mientras que los antagonistas
disminuyen o eliminan tales funciones.
En otro aspecto de esta realización, la invención
describe un método para identificar una proteína receptor u otras
proteínas de unión al ligando, que se unen específicamente al
polipéptido Neutroquina-\alpha. Por ejemplo, un
compartimiento celular, tal como una membrana o una de sus
preparaciones, puede prepararse a partir de células que expresan una
molécula que se une a la Neutroquina-\alpha. La
preparación se incuba con Neutroquina-\alpha
marcada, y se aislan complejos de
Neutroquina-\alpha unida al receptor o a otras
proteínas de unión, y se caracterizan según métodos de rutina
conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido
Neutroquina-\alpha puede unirse a un soporte
sólido, de tal forma que las moléculas de unión solubilizadas de las
células se unen a la columna, y después se eluyen y se caracterizan
según métodos de rutina.
En el experimento de la invención para agonsitas
o antagonistas, un compartimiento celular, tal como una membrana o
una de sus preparaciones, puede prepararse a partir de una célula
que expresa una molécula que se une a la
Neutroquina-\alpha, tal como una molécula de una
vía de señalización o regulación modulada por la
Neutroquina-\alpha. La preparación se incuba con
la Neutroquina-\alpha marcada, en ausencia o
presencia de una molécula candidata, que puede ser un agonista o un
antagonista de la Neutroquina-\alpha. La capacidad
de la molécula candidata para unirse a la molécula de unión, se
refleja en la disminución de la unión al ligando marcado. Las
moléculas que se unen gratuitamente, es decir, sin inducir los
efectos de la Neutroquina-\alpha en la unión de la
molécula de unión a la Neutroquina-\alpha, es más
probable que sean buenos antagonistas. Las moléculas que se unen
bien, e inducen efectos que son los mismos, o muy cercanos a los que
produce la Neutroquina-\alpha, son agonistas.
Los efectos similares a los de la
Neutroquina-\alpha de los agonistas y antagonistas
potenciales pueden medirse, por ejemplo, determinando la actividad
de un sistema de segundo mensajero, después de la interacción de la
molécula candidata con una célula o una preparación celular
apropiada, y comparando el efecto con el de la
Neutroquina-\alpha, o con moléculas que inducen
los mismos efectos que la Neutroquina-\alpha.
Sistemas de segundo mensajero que pueden ser útiles en este aspecto
incluyen, pero no se limitan a, sistemas de segundo mensajero de AMP
guanilato ciclasa, canal iónico, o hidrólisis de fosfoinositido.
Otro ejemplo de un ensayo para antagonistas de
Neutroquina-\alpha es un ensayo competitivo que
combina la Neutroquina-\alpha y un antagonista
potencial, con moléculas de receptor unidas a membrana, o moléculas
de receptor de Neutroquina-\alpha recombinantes,
bajo condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición
competitiva. La Neutroquina-\alpha puede marcarse,
tal como mediante radiactividad, de tal forma que pueda determinarse
exactamente el número de moléculas de
Neutroquina-\alpha unidas a una molécula de
receptor, para determinar la efectividad del antagonista
potencial.
Antagonistas potenciales incluyen moléculas
orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen
a un polipéptido de la invención, y que inhiben o extinguen su
actividad. Antagonistas potenciales también pueden ser moléculas
orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína
cercanamente relacionada o un anticuerpo que se une a los mismos
lugares en una molécula de unión, tal como una molécula de receptor,
sin inducir actividades inducidas por
Neutroquina-\alpha, previniendo así la acción de
la Neutroquina-\alpha, mediante la exclusión de la
unión de la Neutroquina-\alpha.
Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas
anti-sentido. La tecnología
anti-sentido puede utilizarse para controlar la
expresión génica a través de DNA o RNA anti-sentido,
o a través de la formación de triple hélice. Las técnicas
anti-sentido se discuten, por ejemplo, en Okano,
J. Neurochem. 56:560 (1991); "Oligodeoxinucleotides as
Antisense Inhibitors of Gene Expression", CRC Press, Boca Raton,
FL (1988). La formación de triple hélice se discute, por ejemplo en
Lee et al., Nucleic Acid Research 6:3073 (1979); Cooney et
al., Science 241:456 (1988); y Dervan et al., Science
251:1360 (1991). Los métodos están basados en la unión de un
polinucleótido a la DNA o RNA complementario. Por ejemplo, la parte
de codificación 5' de un polinucleótido que codifica el dominio
extracelular del polipéptido de la presente invención, puede
utilizarse para diseñar oligonulceótidos de RNA
anti-sentido, de desde alrededor de 10 a 40 pares de
bases de longitud. Un oligonucleótido de DNA se diseña para ser
complementario a una región del gen implicado en la trascripción,
previniendo así la trascripción y la producción de
Neutroquina-\alpha. El oligonucleótido de RNA
anti-sentido se hibrida al mRNA in vivo y
bloquea la tradución de la molécula de mRNA en el polipéptido
Neutroquina-\alpha. Los oligonucleótidos descritos
previamente pueden también liberarse a las células, de tal forma que
el RNA o DNA anti-sentido puede expresarse in
vivo para inhibir la producción de
Neutroquina-\alpha.
Los antagonistas que son anticuerpos de la
presente invención, o una construcción anti-sentido
como la descrita aquí anteriormente, pueden emplearse en una
composición con un excipiente farmacéuticamente aceptable, por
ejemplo, como los descritos previamente.
Los antagonistas pueden utilizarse, por ejemplo,
para inhibir la quimiotaxis y la activación de los macrófagos y sus
precursores, y de los neutrófilos, basófilos, linfocitos B y algunos
subgrupos de células T, por ejemplo células T activadas y células T
citotóxicas CD8, y células asesinas naturales, producida por la
Neutroquina-\alpha en ciertas enfermedades
autoinmunes e inflamatorias crónicas e infecciosas. Ejemplos de
enfermedades autoinmunes incluyen la esclerosis múltiple y la
diabetes insulín-dependiente. Los antagonistas
también pueden ser adecuados para emplearse para tratar enfermedades
infecciosas inluyendo silicosis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar
idiopática, mediante la prevención del reclutamiento y la activación
de los fagocitos mononucleares. También pueden ser adecuados para
emplearse para tratar el síndrome hiper-eosinofílico
idiopático, mediante la prevención de la producción y la migración
de los eosinófilos. El shock endotóxico también puede ser tratado
con los antagonistas mediante la prevención de la migración de los
macrófagos y su producción de los polipéptidos quimioquinas humanos
de la presente invención. Los antagonistas también pueden ser
adecuados para emplearse para tratar las reacciones alérgicas
mediadas por histamina y las alteraciones inmunológicas, incluyendo
las reacciones alérgicas de fase tardía, la urticaria crónica y la
dermatitis atópica, mediante la inhibición de la degranulación de
las células cebadas y los basófilos inducida por quimioquinas, y la
liberación de histamina. Las reacciones alérgicas mediadas por IgE
tales como el asma alérgica, la rinitis y el ezcema, también pueden
tratarse. Los antagonistas también pueden ser adecuados para
emplearse para tratar la inflamación aguda y crónica, mediante la
prevención de la atracción de los monocitos a un área inflamada.
También pueden ser adecuados para emplearse para regular las
poblaciones de macrófagos pulmonares normales, ya que las
enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas y agudas, se asocian
con el secuestro de los fagocitos mononucleares en el pulmón. Los
antagonistas también pueden ser adecuados para emplearlos para
tratar la artritis reumatoide, mediante la prevención de la
atracción de los monocitos al líquido sinovial en las articulaciones
de los pacientes. El influjo de monocitos y la activación juegan un
papel significativo en la patogénesis de las artropatías tanto
degenerativas como inflamatorias. Los antagonistas pueden ser
adecuados para emplearse para interferir con las cascadas
perjudiciales atribuidas primariamente a IL-1 y TNF,
que previenen la biosíntesis de otras citoquinas inflamatorias. En
este sentido, los antagonistas pueden ser adecuados para emplearse
para prevenir la inflamación. Los antagonistas también pueden ser
adecuados para emplearse para tratar casos de fracaso de médula
ósea, por ejemplo anemia aplásica y síndrome mielodisplásico. Los
antagonistas también pueden ser adecuados para emplearse para tratar
el asma y la alergia, mediante la prevención de la acumulación de
eosinófilos en el pulmón. Los antagonistas también pueden ser
adecuados para emplearse para tratar la fibrosis de la membrana
basal subepitelial, que es un hecho prominente del pulmón
asmático.
asmático.
Los anticuerpos contra la
Neutroquina-\alpha pueden ser adecuados para
emplearse para unirse e inhibir la actividad de la
Neutroquina-\alpha, para tratar el ARDS, mediante
la prevención de la infiltración de los neutrófllos en el pulmón
después de una injuria. Los antagonistas pueden ser adecuados para
emplearse en una composición con un excipiente farmacéuticamente
adecuado, por ejemplo, los descritos aquí previamente.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención también son valiosas para la identificación cromosómica.
La secuencia es alcanzada específicamente, y puede hibridarse con
una localización particular en un cromosoma humano individual.
Además, existe una necesidad actual de identificar lugares
particulares en el cromosoma. Pocos reactivos marcadores de
cromosomas basados en datos de secuencia real (polimorfismos
repetidos), están disponibles actualmente para localización por
marcaje de cromosomas. El mapeo de DNA a cromosomas según la
presente invención, es una primera etapa importante para
correlacionar aquellas secuencias con los genes asociados con la
enfermedad.
En ciertas realizaciones preferidas en este
aspecto, el cDNA aquí descrito se utiliza para clonar el DNA
genómico del gen de la proteína
Neutroquina-\alpha. Esto puede conseguirse
utilizando una variedad de técnicas y bibliotecas bien conocidas,
que están generalmente disponibles comercialmente. El DNA genómico
es después utilizado para mapeo de cromosomas in situ
utilizando técnicas bien conocidas para este propósito.
Además, en algunos casos, pueden mapearse
secuencias en cromosomas preparando cebadores de PCR
(preferiblemente de 15-25 pares de bases), a partir
del cDNA. El análisis informático de la región 3' del gen no
traducida, se utiliza para seleccionar rápidamente cebadores que no
abarcan más de un exón en el DNA genómico, lo que complicaría el
proceso de amplificación. Estos cebadores son después utilizados
para cribado mediante PCR de híbridos de células somáticas que
contienen cromosomas humanos individuales. La hibridación in
situ con fluorescencia ("FISH") de un clon de cDNA con una
extensión de cromosomas en metafase, puede utilizarse para
proporcionar una localización cromosómica precisa en una etapa. Esta
técnica puede utilizarse con sondas del cDNA tan cortas como de 50 ó
60 pares de bases. Para una revisión de esta técnica, véase Verma
et al., Human Chromososmes: A Manual Of Basic Techniques,
Pergamon Press, New York (1988).
Una vez que la secuencia se ha mapeado en la
localización cromosómica precisa, la posición física de la secuencia
en el cromosoma puede correlacionarse con datos de mapas genéticos.
Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian
Inheritance In Man, disponible en línea a través de la John
Hopkins University, Welch Medical Library. La relación entre
enfermedades y genes que han sido mapeados en la misma región
cromosómica se identifican después mediante análisis de ligamiento
(co-herencia de genes físicamente adyacentes).
A continuación, es necesario determinar las
diferencias en el cDNA o la secuencia genómica entre los individuos
afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o en
todos los individuos afectados, pero no en los individuos normales,
entonces la mutación es presumiblemente el agente causal de la
enfermedad.
Habiendo descrito generalmente la invención, la
misma será más fácilmente inteligible mediante referencia a los
siguientes ejemplos, que se proporcionan como vía de ilustración, y
se entiende que no son limitantes.
El vector de expresión bacteriano pQE9 (pD10) se
utiliza para expresión bacteriana en este ejemplo. (QIAGEN, Inc.,
arriba). El pQE9 codifica la resistencia antibiótica a
ampicilina ("Ampr"), y contiene un origen de replicación
bacteriano ("ori"), un promotor inducible por IPTG, un lugar de
unión a ribosoma ("RBS"), seis codones que codifican residuos
de histidina que permiten la purificación por afinidad, utilizando
resina de afinidad de ácido de
níquel-nitrilo-tri-acético
("Ni-NTA"), disponible de QIAGEN, Inc.,
arriba, y lugares de escisión únicos para enzimas de
restricción adecuados. Estos elementos están colocados de tal manera
que un fragmento de DNA insertado, que codifica un polipéptido,
expresa el polipéptido con los seis residuos de His (es decir, un
"marcador 6 X His"), unidos covalentemente al extremo amino del
polipéptido.
La secuencia de DNA que codifica la parte deseada
de la proteína Neutroquina-\alpha que contiene la
secuencia del dominio extracelular, se amplifica a partir del clon
de cDNA depositado, utilizando cebadores de oligonucleótidos para
PCR, que se unen a las secuencias amino-terminales
de la parte deseada de la proteína
Neutroquina-\alpha, y a las secuencias 3' de la
secuencia de codificación de cDNA en la construcción depositada. Se
añaden nucleótidos adicionales que contienen lugares de restricción,
para facilitar la clonación en el vector pQE9, a las secuencias de
los cebadores 3' y 5', respectivamente.
Para clonar el dominio extracelular de la
proteína, el cebador 5' tiene la secuencia 5'
CTGGGATCCAGCCTCCGG
GCAGAGCTG 3' (SEQ ID NO:10), que contiene subrayado el lugar de restricción de BamH I, seguido de 18 nucleótidos del extremo amino de la secuencia de codificación del dominio extracelular de la secuencia de la Neutroquina-\alpha en la Figura 1. Cualquier experto en la técnica apreciará, por supuesto, que el punto en la secuencia de codificación de la proteína en el que comienza el cebador 5', puede variar para amplificar un segmento de DNA que codifica cualquier parte deseada de la proteína Neutroquina-\alpha completa, más largo o más corto que el dominio extracelular de la forma. El cebador 3' tiene la secuencia 5' GTGAAGCTTTTATTACAGCAGTTTCAATGCACC 3'(SEQ ID NO:11), que contiene subrayado el lugar de restricción de Hind III, seguido de dos codones de parada, y 18 nucleótidos complementarios al extremo 3' de la secuencia de codificación de la secuencia de DNA de codificación de la Neutroquina-\alpha en la Figura 1.
GCAGAGCTG 3' (SEQ ID NO:10), que contiene subrayado el lugar de restricción de BamH I, seguido de 18 nucleótidos del extremo amino de la secuencia de codificación del dominio extracelular de la secuencia de la Neutroquina-\alpha en la Figura 1. Cualquier experto en la técnica apreciará, por supuesto, que el punto en la secuencia de codificación de la proteína en el que comienza el cebador 5', puede variar para amplificar un segmento de DNA que codifica cualquier parte deseada de la proteína Neutroquina-\alpha completa, más largo o más corto que el dominio extracelular de la forma. El cebador 3' tiene la secuencia 5' GTGAAGCTTTTATTACAGCAGTTTCAATGCACC 3'(SEQ ID NO:11), que contiene subrayado el lugar de restricción de Hind III, seguido de dos codones de parada, y 18 nucleótidos complementarios al extremo 3' de la secuencia de codificación de la secuencia de DNA de codificación de la Neutroquina-\alpha en la Figura 1.
El fragmento de DNA de la
Neutroquina-\alpha amplificado y el vector pQE9 se
digieren con BamH I y Hind III, y los DNA digeridos se ligan después
juntos. La inserción del DNA de la
Neutroquina-\alpha en los lugares de restricción
del vector pQE9, coloca a la región de codificación de la proteína
Neutroquina-\alpha aguas abajo del promotor
inducible por IPTG, y en marco con un AUG de inicio y los seis
codones de histidina.
La mezcla de ligación se trasforma en células
E. coli competentes, utilizando procedimientos estándar,
tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: a
Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY (1989). Se utiliza la cepa de E. coli
M15/rep4, que contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que
expresa el represor lac y confiere resistencia a la kanamicina
("Kan^{r}"), para llevar a cabo los ejemplos ilustrativos
aquí descritos. Esta cepa, que es solamente una de las muchas que
son adecuadas para la expresión de la proteína
Neutroquina-\alpha, está disponible comercialmente
de QIAGEN, Inc., arriba. Se identifican las células
trasformadas por su capacidad para crecer en placas de LB en
presencia de ampicilina y kanamicina. El plásmido de DNA se aísla de
las colonias resistentes y la identidad del DNA clonado se confirma
mediante análisis de restricción, PCR y secuenciación de DNA. Los
clones que contienen las construcciones deseadas se cultivan durante
la noche ("O/N") en cultivo líquido de medio LB suplementado
tanto con ampicilina (100 \mug/ml) como con kanamicina (25
\mug/ml). El cultivo O/N se utiliza para inocular un cultivo
mayor, a una dilución de aproximadamente 1:25 a 1:250. Las células
se cultivan hasta una densidad óptica a 600 nm ("OD600") de
entre 0,4 y 0,6. Después se añade
Isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido
("IPTG"), a una concentración final de 1 mM, para inducir la
trascripción desde el promotor sensible al represor lac, mediante la
inactivación del represor lacI. Las células posteriormente se
incuban durante otras 3 ó 4 horas. Las células después se recolectan
mediante centrifugación.
Las células son después agitadas durante
3-4 horas a 4ºC en guanidina-HCl pH
8, 6 M. Los restos celulares se eliminan mediante centrifugación, y
el sobrenadante que contiene la Neutroquina-\alpha
se carga en una columna de resina de afinidad de ácido
níquel-nitrilo-tri-acético
("Ni-NTA") (disponible de QIAGEN, Inc.,
arriba). Las proteínas con un marcador 6 x His se unen a la
resina Ni-NTA con alta afinidad, y pueden
purificarse con un procedimiento sencillo de una etapa (para
detalles véase: The QIAexpresionist, 1995, QIAGEN, Inc.,
arriba). Brevemente, el sobrenadante se carga en la columna
en guanidina-HCl, pH 8, 6 M, la columna primero se
lava con 10 volúmenes de guanidina-HCl, pH 8, 6 M, y
después se lava con 10 volúmenes de guanidina-HCl,
pH 6, 6 M, y finalmente la Neutroquina-\alpha se
eluye con guanidina-HCl, pH 5, 6 M.
La proteína purificada es después renaturalizada
mediante diálisis contra solución salina tamponada con fosfato (PBS)
o solución de tampon de acetato sódico, pH 6, 50 mM más NaCl 200 mM.
Alternativamente, la proteína puede ser replegada exitosamente
mientras está inmovilizada en la columna Ni-NTA. Las
condiciones recomendadas son las siguientes: renaturalizar
utilizando un gradiente lineal de urea 6 M-1 M en
NaCl 500 mM, glicerol al 20%, Tris/HCl pH 7,4, 20 mM, que contiene
inhibidores de proteasa. La renaturalización debería realizarse
durante un periodo de 1,5 horas o más. Después de la
renaturalización, las proteínas pueden eluirse mediante la adición
de imidazol 250 mM. El imidazol se elimina mediante una etapa final
de diálisis contra PBS o solución de tampón de acetato sódico pH 6,
50 mM más NaCl 200 mM. La proteína purificada se guarda a 4ºC o se
congela a -80ºC.
El vector de expresión bacteriano pQE60 se
utiliza para expresión bacteriana en este ejemplo. (QIAGEN; Inv.,
9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). El pQE60 codifica la
resistencia antibiótica a ampicilina ("Ampr"), y contiene un
origen de replicación bacteriano ("ori"), un promotor inducible
por IPTG, un lugar de unión a ribosoma ("RBS"), seis codones
que codifican residuos de histidina que permiten la purificación por
afinidad, utilizando resina de afinidad de ácido de
níquel-nitrilo-tri-acético
("Ni-NTA"), disponible de QIAGEN, Inc.,
arriba, y lugares de escisión únicos para enzimas de
restricción adecuados. Estos elementos están colocados de tal manera
que un fragmento de DNA que codifica un polipéptido, puede ser
insertado de tal forma que produce ese polipéptido con los seis
residuos de His (es decir, un "marcador 6 X His"), unidos
covalentemente al extremo carboxilo del polipéptido. Sin embargo, en
este ejemplo, la secuencia de codificación del polipéptido se
inserta de tal forma que la tradución de los seis codones de His se
previene y, por lo tanto, el polipéptido se produce sin el marcador
6 X His.
La secuencia de codificación de DNA de la parte
deseada de la proteína Neutroquina-\alpha, que
comprende la secuencia del dominio extracelular, se amplifica a
partir del clon de cDNA depositado, utilizando cebadores de
oligonucleótidos para PCR, que se unen a las secuencias amino
terminales de la parte deseada de la proteína
Neutroquina-\alpha y a las secuencias en la
construcción depositada 3' a la secuencia cDNA de codificación. Se
añaden nucleótidos adicionales que contienen lugares de restricción
para facilitar la clonación en el vector pQE60, a las secuencias 5'
y 3', respectivamente.
Para clonar el dominio extracelular de la
proteína, el cebador 5' tiene la secuencia 5'
GTGTCATGAGCCTCCGGG
CAGAGCTG 3' (SEQ ID NO:12) que contiene subrayado el lugar de restricción de BspH seguido por 17 nucleótidos de la secuencia amino terminal de codificación del dominio extracelular de la secuencia de la Neutroquina-\alpha en la Figura 1. Cualquier experto en la técnica apreciará, por supuesto, que el punto en la secuencia de codificación de la proteína en el que comienza el cebador 5' puede variar para ampliar la parte deseada de la proteína completa, más corta o más larga que el dominio extracelular de la forma. El cebador 3' tiene la secuencia 5' GTGAAGCTTTTATTACAGCAGTTTCAATGCACC 3' (SEQ ID NO:13), que contiene subrayado el lugar de restricción Hind III, seguido de dos codones de parada y 18 nucleótidos complementarios al extremo 3' de la secuencia de codificación de la secuencia de DNA de la Neutroquina-\alpha en la Figura 1.
CAGAGCTG 3' (SEQ ID NO:12) que contiene subrayado el lugar de restricción de BspH seguido por 17 nucleótidos de la secuencia amino terminal de codificación del dominio extracelular de la secuencia de la Neutroquina-\alpha en la Figura 1. Cualquier experto en la técnica apreciará, por supuesto, que el punto en la secuencia de codificación de la proteína en el que comienza el cebador 5' puede variar para ampliar la parte deseada de la proteína completa, más corta o más larga que el dominio extracelular de la forma. El cebador 3' tiene la secuencia 5' GTGAAGCTTTTATTACAGCAGTTTCAATGCACC 3' (SEQ ID NO:13), que contiene subrayado el lugar de restricción Hind III, seguido de dos codones de parada y 18 nucleótidos complementarios al extremo 3' de la secuencia de codificación de la secuencia de DNA de la Neutroquina-\alpha en la Figura 1.
Los fragmentos amplificados del DNA de la
Neutroquina-\alpha y el vector pQE60 se digieren
con BspH I y Hind III, y los DNA digeridos, se ligan juntos después.
La inserción del DNA de la Neutroquina-\alpha en
los lugares de restricción del vector pQE9, coloca a la región de
codificación de la proteína Neutroquina-\alpha,
incluyendo su codón de parada asociado, aguas abajo del promotor
inducible por IPTG y en marco con un AUG de inicio. El codón de
parada asociado previene la tradución de los seis codones de
histidina aguas abajo del punto de inserción.
La mezcla de ligación se transforma en células
E. coli competentes, utilizando procedimientos estándar,
tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: a
Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY (1989). Se utiliza la cepa de E. coli
M15/rep4, que contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que
expresa el represor lac y confiere resistencia a la kanamicina
("Kanr"), para llevar a cabo los ejemplos ilustrativos aquí
descritos. Esta cepa, que es solamente una de las muchas que son
adecuadas para la expresión de la proteína
Neutroquina-\alpha, está disponible comercialmente
de QIAGEN, Inc., arriba. Se identifican las células
trasformadas por su capacidad para crecer en placas de LB en
presencia de ampicilina y kanamicina. El plásmido de DNA se aísla de
las colonias resistentes y la identidad del DNA clonado se confirma
mediante análisis de restricción, PCR y secuenciación de DNA.
Los clones que contienen las construcciones
deseadas, se cultivan durante la noche ("O/N") en cultivo
líquido de medio LB suplementado tanto con ampicilina (100
\mug/ml) como con kanamicina (25 \mug/ml). El cultivo O/N se
utiliza para inocular un cultivo mayor, a una dilución de
aproximadamente 1:25 a 1:250. Las células se cultivan hasta una
densidad óptica a 600 nm ("OD600") de entre 0,4 y 0,6. Después
se añade
Isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido
("IPTG"), a una concentración final de 1 mM, para inducir la
trascripción desde el promotor sensible al represor lac, mediante la
inactivación del represor lacI. Las células posteriormente se
incuban durante otras 3 ó 4 horas. Las células después se recolectan
mediante centrifugación.
Las células son después agitadas durante
3-4 horas a 4ºC en guanidina-HCl pH
8, 6 M. Los restos celulares se eliminan mediante centrifugación, y
el sobrenadante que contiene la Neutroquina-\alpha
se dializa contra solución de tampón de acetato sódico pH 6, 50 mM,
suplementado con NaCl 200 mM. Alternativamente, la proteína puede
ser replegada con éxito mediante díálisis contra NaCl 500 mM,
glicerol al 20%, Tris/HCl pH 7,4, 25 mM, que contiene inhibidores de
proteasa. Después de la renaturalización, la proteína puede
purificarse mediante cromatografía de intercambio iónico,
interacción hidrófoba y exclusión de tamaño. Alternativamente, puede
llevarse a cabo una etapa de cromatografía de afinidad, tal como una
columna de anticuerpo, para obtener proteína
Neutroquina-\alpha pura. La proteína purificada se
guarda a 4ºC o se congela a -80ºC.
En este ejemplo ilustrativo, el vector plásmido
lanzadera pA2 GP se utiliza para insertar el DNA clonado que
codifica el dominio extracelular de la proteína, que carece de sus
secuencias intracelular y transmembrana naturalmente asociadas, en
un báculovirus, para expresar el dominio extracelular de la proteína
Neutroquina-\alpha, utilizando un líder
báculovirus y método estándar como los descritos en Summers et
al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell
Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station
Bulletin Nº 1555 (1987). El vector de expresión contiene el potente
promotor polihedrina del virus de la polihedrosis nuclear
Autographa californica (AcMNPV), seguido por el péptido de
señal secretora (líder) de la proteína gp67 del báculovirus, y
lugares de restricción convenientes tales como BamHI, Xba I y
Asp718. El lugar de poliadenilación del virus de simio 40
("SV40"), se utiliza para poliadenilación eficiente. Para la
selección fácil de los virus recombinantes, el plásmido contiene el
gen de la beta-galactosidasa de E. coli, bajo
el control de un débil promotor de Drosophila en la misma
orientación, seguido de la señal de poliadenilación del gen de
polihedrina. Los genes insertados están flanqueados a ambos lados
por secuencias virales para recombinación homóloga mediada por
células, con DNA viral de tipo natural, para generar virus viables
que expresen el polinucleótido clonado.
Muchos otros vectores báculovirus podrían
utilizarse en lugar del vector anterior, tales como pAc373, pVL941 y
pAcIM1, como cualquier experto en la técnica apreciará fácilmente,
siempre que la construcción proporcione señales para la
trascripción, la tradución, la secreción y similares, colocadas
apropiadamente, incluyendo un péptido de señal y un AUG en marco,
como se requiere. Tales vectores están descritos, por ejemplo, en
Luckow et al., Virology 170:31-39 (1989).
La secuencia de cDNA que codifica el dominio
extracelular de la proteína Neutroquina-\alpha en
el clon depositado, que carece del codón de iniciación AUG, y de las
secuencias de los dominios intracelular y transmembrana asociados
naturalmente, mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:2), se amplifica
utilizando cebadores de oligonucleótidos para PCR, correspondientes
a las secuencias 5' y 3' del gen. El cebador 5' tiene la secuencia
5' GTGGGATCCCCGGGCAGAGC
TGCAGGGC 3' (SEQ ID NO:14), que contiene subrayado el lugar de restricción de BamH I, seguido de 18 nucleótidos de la secuencia del dominio extracelular de la proteína Neutroquina-\alpha mostrada en la Figura 1, comenzando con el extremo N indicado del dominio extracelular de la proteína. El cebador 3' tiene la secuencia 5' GTGGGATCCTTATTA
CAGCAGTTTCAATGCACC 3' (SEQ ID NO:15), que contiene subrayado el lugar de restricción de Bam HI, seguido por dos codones de parada y 18 nucleótidos complementarios a la secuencia de codificación 3' en la Figura 1.
TGCAGGGC 3' (SEQ ID NO:14), que contiene subrayado el lugar de restricción de BamH I, seguido de 18 nucleótidos de la secuencia del dominio extracelular de la proteína Neutroquina-\alpha mostrada en la Figura 1, comenzando con el extremo N indicado del dominio extracelular de la proteína. El cebador 3' tiene la secuencia 5' GTGGGATCCTTATTA
CAGCAGTTTCAATGCACC 3' (SEQ ID NO:15), que contiene subrayado el lugar de restricción de Bam HI, seguido por dos codones de parada y 18 nucleótidos complementarios a la secuencia de codificación 3' en la Figura 1.
El fragmento amplificado se aísla de un gel de
agarosa al 1%, utilizando el kit disponible comercialmente
("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca). El fragmento después
se digiere con BamH I y de nuevo se purifica en un gel de agarosa al
1%. Este fragmento se denomina aquí F1.
El plásmido se digiere con la enzima de
restricción Bam HI y opcionalmente, puede desfosforilarse utilizando
fosfatasa intestinal de ternera, utilizando procedimientos de rutina
conocidos en la técnica. El DNA se aísla después de un gel de
agarosa al 1%, utilizando un kit disponible comercialmente
("Geneclean" BIO 101, La Jolla, Ca). Este vector se denomina
aquí "V1".
El fragmento F1 y el plásmido V1 desfosforilado
se ligan juntos con ligasa T4 de DNA. Células E. coli HB101 u
otros hospedantes E. coli adecuados, tales como las células
XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, La Jolla,
CA), se trasforman con la mezcla de ligación, y se siembran sobre
placas de cultivo. Las bacterias que contienen el plásmido se
identifican con el gen humano de la
Neutroquina-\alpha, digiriendo el DNA de colonias
individuales utilizando Bam HI, y después analizando el producto de
la digestión mediante electroforesis en gel. La secuencia del
fragmento clonado se confirma mediante secuenciación de DNA. El
plásmido se denomina aquí pA2GP
Neutroquina-\alpha.
Cinco \mug del plásmido pA2GP
Neutroquina-\alpha se
co-transfectan con 1,0 \mug de un DNA de
baculovirus hecho lineal, disponible comercialmente ("BaculoGold™
baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, CA), utilizando el
método de lipofección descrito por Felgner et al., Proc.Natl.
Acad. Sci. USA 84:7413-7417 (1987). Un \mug de
DNA de báculovirus BaculoGold™ y 5 \mug del plásmido pA2GP
Neutroquina-\alpha se mezclan en un pocillo
estéril de una placa de microtitulación que contiene 50 \mul de
medio de Grace (Life Technologies Inc., Gaithesburg, MD) libre de
suero. Después, se añaden 10 \mul de Lipofectina más 90 \mul de
medio de Grace, se mezclan y se incuban durante 15 minutos a
temperatura ambiente. Después, la mezcla de transfección se añade
gota a gota a células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711), plantadas en
una placa de cultivo celular de 35 mm, con 1 ml de medio de Grace
sin suero. La placa se incuba después durante 5 horas a 27ºC. La
solución de transfección se elimina después de la placa, y se añade
1 ml de medio de insectos de Grace suplementado con suero de ternera
fetal al 10%. Después se continúa el cultivo a 27ºC durante cuatro
días.
Después de cuatro días se recolecta el
sobrenadante, y se lleva a cabo un ensayo de placas, como
describieron Summers y Smith, arriba. Se utiliza un gel de
agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg),
para permitir la fácil identificación y aislamiento de los clones
que expresan gal, que producen placas teñidas de azul. (Una
descripción detallada de un "ensayo de placas" de este tipo
puede encontrarse en la guía del usuario para cultivo de células de
insecto y baculovirología distribuido por Life Technologies Inc.,
Gaithersburg, páginas 9-10). Después de la
incubación apropiada, las placas teñidas de azul se cogen con la
punta de una micropipeta de un micropipettor (por ejemplo,
Eppendorf). El agar que contiene los virus recombinantes se
resuspende después en un tubo de microcentrífuga que contiene 200
\mul de medio de Grace, y la suspensión que contiene los
baculovirus recombinantes se utiliza para infectar células Sf9
sembradas en placas de 35 mm. Cuatro días más tarde, los
sobrenadantes de estas placas de cultivo se receolectan y después se
guardan a 4ºC. El virus recombinante se denomina
V-Neutroquina-\alpha.
Para verificar la expresión del gen de la
Neutroquina-\alpha, se cultivan células Sf9 en
medio de Grace suplementado con FBS inactivado por calor al 10%. Las
células se infectan con el báculovirus recombinante
V-Neutroquina-\alpha, a una
multiplicidad de infección ("MOI") de alrededor de 2. Si se
desean proteínas radio-marcadas, 6 horas más tarde
el medio se elimina y se reemplaza con medio SF900 menos metionina y
cisteína (disponible de Life Technologies Inc., Rockville, MD).
Después de 42 horas, se añaden 5 \muCi de
^{35}S-metionina y 5 \muCi de
^{35}S-cisteína (disponibles de Amersham). Las
células se incuban durante 16 horas más, y después se recolectan
mediante centrifugación. Las proteínas en el sobrenadante así como
las proteínas intracelulares se analizan mediante
SDS-PAGE, seguida de autorradiografía (si están
radio-marcadas).
Puede utilizarse la microsecuenciación de la
secuencia de aminoácidos del extremo amino de la proteína
purificada, para determinar la secuencia amino terminal del dominio
extracelular de la proteína, y de esta forma el punto de escisión y
la longitud del péptido de señal secretora.
Un vector de expresión típico de mamífero
contiene el elemento promotor, que media la iniciación de la
trascripción del mRNA, la secuencia de codificación de la proteína,
y las señales requeridas para la terminación de la trascripción y la
poliadenilación del trascripto. Elementos adicionales incluyen
estimuladores, secuencias Kozak y secuencias de intervención
flanqueadas por lugares aceptores y donantes para el ensamblaje del
RNA. Puede alcanzarse una trascripción altamente eficiente con los
promotores precoz y tardío del SV40, las repeticiones terminales
largas (LTR) de retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLV1, HIV1 y el
promotor precoz del citomegalovirus (CMV). Sin embargo, también
pueden utilizarse elementos celulares (por ejemplo, el promotor de
la actina humana). Vectores de expresión adecuados para utilizar en
la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, vectores
tales como pSVL y pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC
37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC 67109). Las células
hospedante de mamífero que pueden utilizarse incluyen células
humanas HeLa, 293, H9 y Jurkat, células de ratón NIH3T3 y C127,
células Cos 1, Cos 7 y CV1, células de perdiz QC1-3,
células L de ratón, y células de ovario de hamster chino (CHO).
Alternativamente, el gen puede expresarse en
líneas celulares estables, que contienen el gen integrado en un
cromosoma. La co-transfección con un marcador de
selección tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina, permite la
identificación y el aislamiento de las células transfectadas.
El gen transfectado puede también amplificarse
para expresar grandes cantidades de la proteína codificada. El
marcador DHFR (dihidrofolato reductasa), es útil para desarrollar
líneas celulares que portan varios cientos o incluso varios miles de
copias del gen de interés. Otro marcador de selección útil es la
enzima glutamina sintetasa (GS) (Murphy et al., Biochem J.
227:277-279 (1991); Bebbington et al.,
Bio/Technology 10:169-175 (1992)). Utilizando
estos marcadores, las células de mamífero se cultivan en medio
selectivo, y se seleccionan las células con la resistencia más alta.
Estas líneas celulares contienen el (los) gen(es)
amplificado(s) integrados en un cromosoma. Las células de
ovario de hamster chino (CHO) y NSO se utilizan frecuentemente para
la producción de proteí-
nas.
nas.
Los vectores de expresión pC1 y pC4 contienen el
potente promotor (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Cullen et
al., Molecular and Cellular Biology, 438-447
(Marzo, 1985)), más un fragmento del estimulador de CMV (Boshart
et al., Cell 41:521-530 (1985)). Múltiples
lugares de clonación, por ejemplo, con los lugares de escisión de
las enzimas de restricción BamHI, XbaI y Asp718, facilitan la
clonación de los genes de interés. Los vectores contienen además el
intrón 3', y la señal de poliadenilación y de terminación del gen de
la preproinsulina de rata.
El plásmido de expresión
pNeutrokine-\alpha HA, se construye mediante
clonación de una parte del cDNA depositado que codifica el dominio
extracelular de la proteína Neutroquina-\alpha, en
el vector de expresión pcDNAI/Amp o pcDNAIII (que pueden obtenerse
de Invitrogen, Inc.). Para producir una forma soluble, secretada del
polipéptido, el dominio extracelular se fusiona con la secuencia
secretora líder del gen de la IL-6 humana.
El vector de expresión pcDNAI/amp contiene: (1)
un origen de replicación de E. coli efectivo para la
propagación en E. coli y en otras células procarióticas; (2)
un gen de resistencia a la ampicilina para seleccionar las células
procarióticas que contienen el plásmido; (3) un origen de
replicación de SV40, para la propagación en células eucarióticas;
(4) un promotor de CMV, un poli-ligador, un intrón
de SV40; (5) varios codones que codifican un fragmento de la
hemaglutinina (es decir, un marcador "HA" para facilitar la
purificación), seguido de un codón de terminación y una señal de
poliadenilación, colocados de tal manera que un cDNA puede colocarse
convenientemente bajo el control de expresión del promotor del CMV,
y ligado operativamente al intrón del SV40 y la señal de
poliadenilación, por medio de los lugares de restricción del
poli-ligador. El marcador HA corresponde a un
epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de influenza descrito
por Wilson et al., Cell 37:767 (1984). La fusión del marcador
HA con la proteína diana permite la detección fácil y la
recuperación de la proteína recombinante con un anticuerpo que
reconoce el epítopo HA. El pcDNAIII contiene, además, el marcador de
selección de neomicina.
Un fragmento de DNA que codifica el dominio
extracelular del polipéptido Neutroquina-\alpha,
se clona en la región del poli-ligador del vector,
de tal forma que la expresión de la proteína recombinante es
dirigida por el promotor del CMV. La estrategia de construcción del
plásmido es la siguiente. El cDNA de la
Neutroquina-\alpha del clon depositado, se
amplifica utilizando cebadores que contienen lugares de restricción
convenientes, de forma similar a la descrita previamente para la
construcción de vectores para expresión de la
Neutroquina-\alpha en E. coli. Los
cebadores adecuados incluyen los siguientes, que se utilizan en este
ejemplo. El cebador 5', que contiene subrayado el lugar Bam HI, una
secuencia Kozak, un codón de iniciación AUG, una secuencia que
codifica el péptido líder secretor del gen de la
IL-6 humana, y 18 nucleótidos de la región de
codificación 5' del dominio extracelular de la proteína
Neutroquina-\alpha, tiene la siguiente
secuencia:
5'
GCGGGATCCGCCACCATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCTGGGG
CTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTGCCCCAGTTGTGAGACAAGGGGACCTGGCCAGC 3'
CTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTGCCCCAGTTGTGAGACAAGGGGACCTGGCCAGC 3'
(SEQ ID NO:16). El cebador 3', que contiene
subrayado el lugar de restricción de Bam HI y 18 nucelótidos
complementarios a la secuencia de codificación 3', inmediatamente
antes del codón de terminación, tiene la siguiente secuencia:
5' GTGGGATCCTTACAGCAGTTTCAATGCACC 3' (SEQ
ID NO:17).
El fragmento de DNA amplificado y el vector
pcDNAI/Amp se digieren con Bam HI y después se ligan. La mezcla de
ligación se transforma en la cepa de E. coli SURE (disponible
de Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La
Jolla, CA 92037), y el cultivo transformado se siembra en placas con
medio de ampicilina, que después se incuban para permitir el
crecimiento de colonias resistentes a la ampicilina. El DNA del
plásmido se aísla de las colonias resistentes y se examina mediante
análisis de restricción u otros métodos, para la presencia del
fragmento que codifica el dominio extracelular de la
Neutroquina-\alpha.
Para la expresión de la
Neutroquina-\alpha recombinante, las células COS
se transfectan con un vector de expresión, como se ha descrito
previamente, utilizando DEAE-DEXTRANO, como está
descrito, por ejemplo en Sambrook et al., Molecular Cloning: a
Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York (1989). Las células se incuban bajo condiciones
para la expresión de la Neutroquina-\alpha por el
vector.
La expresión de la proteína de fusión
Neutroquina-\alpha HA se detecta mediante marcaje
radiactivo e inmunoprecipitación, utilizando métodos descritos en,
por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd
Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
New York (1988). Para este objetivo, dos días después de la
transfección, las células se marcan mediante incubación en medio que
contiene ^{35}S-cisteína durante 8 horas. Las
células y el medio se recolectan, y las células se lavan y después
se lisan con solución de tampón RIPA que contiene detergente: NaCl
150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%,
NP-40 al 1%, DOC al 0,5%, TRIS pH 7,5, 50 mM, como
describieron Wilson et al., citados previamente. Las
proteínas se precipitan del lisado celular y del medio de cultivo,
utilizando un anticuerpo monoclonal específico para HA. Las
proteínas precipitadas se analizan después mediante
SDS-PAGE y autorradiografía. Un producto de
expresión del tamaño esperado se ve en el lisado celular, y no se ve
en los testigos negativos.
El vector pC4 se utiliza para la expresión de la
proteína Neutroquina-\alpha. El plásmido pC4 es un
derivado del plásmido pSV2-dhfr (ATCC Nº de Acceso
37146). Para producir una forma soluble, secretada del polipéptido
Neutroquina-\alpha, la parte del cDNA depositado
que codifica el dominio extracelular, se fusiona a la secuencia
líder secretora del gen de la IL-6 humana. El vector
plásmido contiene el gen de la DHFR bajo el control del promotor
precoz del SV40. Las células de ovario de hamster chino, u otras
células que carecen de actividad de hidrofolato, que se transfectan
con estos plásmidos, pueden seleccionarse cultivando las células en
un medio selectivo (alpha menos MEM. Life Technologies),
suplementado con el agente quimioterapéutico metotrexate. La
amplificación de los genes de DHFR en células resistentes a
metotrexate (MTX) ha sido bien documentado (véase, por ejemplo, Alt,
F.W., Kellems, R.M., Bertino, J.R., y Schimke, R.T., 1978, J.
Biol. Chem. 235:1357-1370, Hamlin, J.L. y Ma, C.
1990, Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143,
Page, M.J. y Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology
9:64-68). Las células cultivadas en
concentraciones crecientes de MTX desarrollan resistencias a la
droga, mediante superproducción de la enzima diana, DHFR, como
resultado de la amplificación del gen de la DHFR. Si un segundo gen
está ligado al gen de la DHFR, éste es generalmente
co-amplificado y super-expresado. Se
conoce en la técnica que esta aproximación puede utilizarse para
desarrollar líneas celulares que portan más de 1000 copias del (los)
gen(es) amplificado(s). Posteriormente, cuando se
retira el metotrexate, se obtienen líneas celulares que contienen el
gen amplificado integrado en uno o más cromoso-
ma(s) de la célula hospedante.
ma(s) de la célula hospedante.
El plásmido pC4 contiene, para expresar el gen de
interés, el potente promotor de la repetición terminal larga (LTR)
del Virus del Sarcoma de Rous (Cullen, et al., Molecular and
Cellular Biology, Marzo, 1985:438-447) más un
fragmento aislado del estimulador del gen inmediatamente precoz del
citomegalovirus (CMV) humano (Boshart et al.,
41:521-530 (1985)). Aguas abajo del promotor
están los siguientes lugares de escisión únicos de enzimas de
restricción, que permiten la integración de los genes: BamHI, Xba I
y Asp718. Detrás de estos lugares de clonación, el plásmido contiene
el intrón 3' y el lugar de poliadenilación del gen de la
preproinsulina de rata. También pueden utilizarse para la expresión
otros promotores altamente efectivos, por ejemplo el promotor de la
\beta-actina humana, los promotores precoz y
tardío del SV40, o las repeticiones terminales largas de otros
retrovirus, por ejemplo HIV y HTLV1. Pueden utilizarse los sistemas
de expresión génica Tet-Off y Tet-On
de Clontech, y otros sistemas similares, para expresar la
Neutroquina-\alpha de una forma regulada en
células de mamíferos (Gossen, M., y Bujard, H. 1992, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89:5547-5551). Para la
poliadenilación del mRNA, pueden utilizarse también otras señales,
por ejemplo, los genes de la hormona de crecimiento humana o de la
globina. Las líneas celulares estables que portan un gen de interés
integrado en el cromosoma, pueden también seleccionarse después de
la co-transfección, con un marcador de selección tal
como gpt, G418 o higromicina. Es ventajoso utilizar más de un
marcador de selección al comienzo, por ejemplo G418 más
metotrexate.
El plásmido pC4 se digiere con la enzima de
restricción Bam HI, y después se desfosforila utilizando fosfatasa
intestinal de ternera, mediante procedimientos conocidos en la
técnica. El vector después se aísla de un gel de agarosa al 1%.
La secuencia de DNA que codifica el dominio
extracelular de la proteína Neutroquina-\alpha, se
amplifica utilizando cebadores de oligonucleótios para PCR
correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen. El cebador 5',
que contiene subrayado el lugar de restricción de Bam HI, una
secuencia Kozak, un codón de iniciación AUG, una secuencia que
codifica el péptido líder secretor del gen de la
IL-6 humana, y 18 nucleótidos de la región de
codificación 5' del dominio extracelular de la proteína
Neutroquina-\alpha, tiene la siguiente
secuencia:
5'
GCGGGATCCGCCACCATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCTGGGG
CTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTGCCCCAGTTGTGAGACAAGGGGACCTGGCCAGC 3'
CTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTGCCCCAGTTGTGAGACAAGGGGACCTGGCCAGC 3'
(SEQ ID NO:16). El cebador 3', que contiene
subrayado el lugar de restricción de Bam HI y 18 nucleótidos
complementarios a la región de codificación 3' inmediatamente
anterior al codón de parada, tiene la siguiente secuencia:
5' GTGGGATCCTTACAGCAGTTTCAATGCACC 3' (SEQ
ID NO:17).
El fragmento amplificado se digiere con la
endonucleasa Bam HI y después se purifica de nuevo en un gel de
agarosa al 1%. El fragmento aislado y el vector desfosforilado se
ligan después con ligasa T4 de DNA. Las células E. coli HB101
o XL-1 Blue se trasforman después, y las bacterias
que contienen el fragmento insertado en el plásmido pC4 se
identifican utilizando, por ejemplo, análisis de enzimas de
restricción.
Las células de ovario de hamster chino que
carecen de un gen DHFR activo se utilizan para transfección. Cinco
\mug del plásmido de expresión pC4 se
co-transfectan con 0,5 \mug del plásmido pSVneo,
utilizando lipofectina (Felgner et al., arriba). El plásmido
pSVneo contiene un marcador de selección dominante, el gen
neo del Tn5, que codifica una enzima que confiere resistencia
a un grupo de antibióticos, incluyendo el G418. Las células se
siembran en medio alpha menos MEM, suplementado con 1 mg/ml de G418.
Después de 2 días, las células se tripsinizan y se siembran en
placas de clonación de hibridoma (Greiner, Alemania), en medio alpha
menos MEMM, suplementado con 10, 25 ó 50 ng/ml de metotrexate, más 1
mg/ml de G418. Después de alrededor de 10-14 días,
los clones únicos se tripsinizan y después se siembran en placas de
petri de 6 pocillos o en frascos de 10 ml, utilizando diferentes
concentraciones de metotrexate (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800
nM). Los clones que crecen a las concentraciones más altas de
metotrexate se trasfieren entonces a placas de 6 pocillos nuevas,
que contienen concentraciones incluso más altas de metotrexate (1
\muM, 2 \muM, 5 \muM, 10 mM, 20 mM). El mismo procedimiento se
repite hasta que se obtienen clones que crecen a una concentración
de 100-200 \muM. La expresión del producto del gen
deseado se analiza, por ejemplo, mediante SDS-PAGE y
Western blot, o mediante análisis HPLC de fase inversa.
Se lleva a cabo un análisis de Northern blot para
examinar la expresión del gen de la
Neutroquina-\alpha en tejidos humanos, utilizando
métodos descritos por, entre otros, Sambrook et al., citado
anteriormente. Una sonda de cDNA que contiene la secuencia de
nucleótidos entera de la proteína
Neutroquina-\alpha (SEQ ID NO:1), se marca con
^{32}P, utilizando el sistema de marcaje de DNA rediprime™
(Amersham Life Science), según las instrucciones del fabricante.
Después del marcaje, la sonda se purifica utilizando una columna
CHROMA SPIN-100™ (Clontech Laboratories, Inc.),
según el protocolo del fabricante número PT1200-1.
La sonda marcada purificada se utiliza entonces para examinar varios
tejidos humanos para mRNA de la
Neutroquina-\alpha.
Northern blots de Múltiples Tejidos (MTN) que
contienen varios tejidos humanos (H) o tejidos del sistema inmune
humano (IM), obtenidos de Clontech, se examinan con la sonda marcada
utilizando la solución de hibridación ExpressHyb™ (Clontech), según
el protocolo del fabricante número PT1190-1. Después
de la hibridación y el lavado, los blots se montan y se exponen a
una película a -70ºC durante la noche, y las películas se
desarrollan según procedimientos estándar.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: YU, GUO-LIANG
\hskip3.9cmEBNER, REINHARD
\hskip3.9cmNI, JIAN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NEUTROQUINA ALFA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 17
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: HUMAN GENOME SCIENCES, INC
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 9410 KEY WEST AVENUE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ROCKVILLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MD
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE UU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 20850
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: DISQUETE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1,0, Versión #1,30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BENSON, ROBERT H
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 30.446
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/DOCUMENTO: PF343
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (301) 309-8504
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: (301) 309-8512
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1100 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HECHO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 147..1001
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- HECHO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sig..peptide
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 285..381
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- HECHO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: mat..peptide
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 147..1001
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA. SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 285 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 233 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 205 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 244 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 281 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(8) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 338 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(9) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 509 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(10) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 497 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(11) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGGATCCA GCCTCCGGGC AGAGCTG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(12) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGAAGCTTT TATTACAGCA GTTTCAATGC ACC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(13) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGTCATGAG CCTCCGGGCA GAGCTG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(14) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGAAGCTTT TATTACAGCA GTTTCAATGC ACC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(15) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGGATCCC CGGGCAGAGC TGCAGGGC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(16) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGGATCCT TATTACAGCA GTTTCAATGC ACC
\hfill33
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(17) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 129 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(18) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGGATCCT TACAGCAGTT TCAATGCACC
\hfill30
Claims (27)
1. Una molécula de ácido nucleico que comprende
una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido
Neutroquina-\alpha, donde dicha secuencia de
polinucleótido se selecciona de un grupo que consiste en:
- (a)
- una secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido Neutroquina-\alpha de longitud completa, que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 al 285 de la SEQ ID NO:2;
- (b)
- una secuencia de polinucleótido que codifica el dominio extracelular del polipéptido Neutroquina-\alpha, que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 73 al 285 de la SEQ ID NO:2;
- (c)
- una secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de los residuos n al 285 de la SEQ ID NO:2, donde n es un número entero en el intervalo de 2-190, 1 al m de la SEQ ID NO:2, donde m es un número entero en el intervalo de 274-284, o n al m de la SEQ ID NO:2, donde n es un número entero en el intervalo de 2-190 y m es un número entero en el intervalo de 274-284, en las que la secuencia de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de Neutroquina-\alpha;
- (d)
- una secuencia de polinucleótido que es idéntica en al menos un 90% a la secuencia de polinucleótido definida en (a) o (b), y que codifica un polipéptido que tiene actividad de Neutroquina-\alpha;
- (e)
- una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos definida en (a), (b) o (c), en la que dicho polipéptido tiene actividad de Neutroquina-\alpha; y
- (f)
- una secuencia de polinucleótido que es el complemento de la secuencia de longitud completa de una secuencia de polinucleótido definida en (a) hasta (c).
2. Una molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que la secuencia de aminoácidos de dicho
polipéptido Neutroquina-\alpha de longitud
completa, es la que está codificada por el clon de cDNA contenido en
el Depósito de ATCC Nº 97768.
3. Una molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que la secuencia de aminoácidos de dicho
dominio extracelular del polipéptido
Neutroquina-\alpha es la codificada por el clon de
cDNA contenido en el Depósito de ATCC Nº 97768.
4. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que la actividad de
Neutroquina-\alpha es la modulación de la
proliferación, la diferenciación o la supervivencia de los
linfocitos.
5. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1 que comprende una secuencia de polinucleótido que
codifica un polipéptido que es idéntico, en al menos un 95%, a un
polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 134 al 285 de
la SEQ ID NO:2.
6. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 5 que comprende una secuencia de polinucleótido que
codifica los residuos de aminoácidos 134 al 285 de la SEQ ID
NO:2.
7. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 5 que consiste en la secuencia de polinucleótido que
codifica los residuos de aminoácidos 134 al 285 de la SEQ ID
NO:2
8. La molécula de ácido nucleico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que es DNA o RNA.
9. Un método de construir un vector recombinante
que comprende insertar la molécula de ácido nucleico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en un vector.
10. Un vector recombinante que contiene la
molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 8.
11. El vector de la reivindicación 10 en la que
la molécula de ácido nucleico está ligada operativamente a
secuencias de control de la expresión, que permiten la expresión de
dicho polinucleótido en células hospedantes procarióticas o
eucarióticas.
12. Un método para construir una célula
hospedante recombinante que comprende introducir el vector de las
reivindicaciones 11 ó 12 en una célula hospedante.
13. Una célula hospedante manipulada
genéticamente con la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8.
\newpage
14. Un proceso para producir un polipéptido
Neutroquina-\alpha que tiene actividad de
Neutroquina-\alpha, que comprende: cultivar la
célula hospedante de la reivindicación 13 y recuperar el polipéptido
Neutroquina-\alpha codificado por dicha molécula
de ácido nucleico.
15. Un polipéptido
Neutroquina-\alpha que tiene la secuencia de
aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o que se obtiene mediante
el proceso de la reivindicación 14.
16. El polipéptido
Neutroquina-\alpha de la reivindicación 15, que es
escindido proteolíticamente de la célula hospedante de la
reivindicación 13.
17. El polipéptido de las reivindicaciones 15 ó
16 que está marcado.
18. El polipéptido de la reivindicación 17 que
está marcado radiactivamente.
19. El polipéptido de la reivindicación 18, en el
que el polipéptido está marcado radiactivamente con un radioisótopo
seleccionado del grupo que consiste en:
(a) ^{131}I;
(b) ^{125}I;
(c) ^{121}I;
(d) ^{112}In; y
(e) ^{99m}Tc.
20. Un anticuerpo o una de sus partes, que se une
específicamente a la parte de la
Neutroquina-\alpha de un polipéptido
Neutroquina-\alpha que tiene la secuencia de
aminoácidos codificada por la molécula de ácido nucleico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1(a) hasta 1(f), o
la 7, o la parte de la Neutroquina-\alpha de un
polipéptido Neutroquina-\alpha de las
reivindicaciones 15 ó 16.
21. El anticuerpo o una de sus partes de la
reivindicación 20, que es un antagonista del polipéptido de las
reivindicaciones 15 ó 16.
22. El anticuerpo o una de sus partes de las
reivindicaciones 20 ó 21, que se selecciona de un grupo que consiste
en:
(a) un anticuerpo monoclonal;
(b) un anticuerpo policlonal;
(c) un anticuerpo quimérico;
(d) un fragmento Fab; y
(e) un fragmento F(ab')
23. El anticuerpo o una de sus partes de una
cualquiera de las reivindicaciones 22 a la 22 que está marcado.
24. El anticuerpo o una de sus partes de la
reivindicación 23, que está marcado con un marcador seleccionado de
un grupo que consiste en:
(a) un marcador enzimático;
(b) un radioisótopo;
(c) un marcador fluorescente; y
(d) biotina.
25. El anticuerpo o una de sus partes de la
reivindicación 24, en el que el marcador es un radioisótopo
seleccionado de un grupo que consiste en:
(a) ^{125}I;
(b) ^{121}I;
(c) ^{131}I;
(d) ^{112}In; y
(e) ^{99m}Tc.
26. Una composición farmacéutica que comprende la
molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 8, el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a
19, o el anticuerpo o una de sus partes, de una cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 25 y opcionalmente, un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
27. Una composición diagnóstica que comprende la
molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 8, el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a
19, o el anticuerpo o una de sus partes, de una cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 25.
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