ES2216323T3

ES2216323T3 - Medicina para promover la cicatrizacion y que contiene trombocitos.

Info

Publication number: ES2216323T3
Application number: ES98954056T
Authority: ES
Inventors: Friedrich Braun; Hans-Peter Spangler; Johann Eibl
Original assignee: Bio Products and Bio Engineering AG
Current assignee: Bio Products and Bio Engineering AG
Priority date: 1997-11-12
Filing date: 1998-11-12
Publication date: 2004-10-16
Anticipated expiration: 2018-11-12
Also published as: WO1999024044A1; JP2001508807A; US20020001624A1; EP0966293B1; DE59810715D1; EP0966293A1; CA2277379A1; AT407484B; DK0966293T3; US8268362B2; AU1135499A; US20040191231A1; ATA191697A

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN MEDICAMENTO PARA PROMOVER LA CICATRIZACION, Y DISEÑADO PARA APLICACION LOCAL. DICHO MEDICAMENTO CONTIENE TROMBOCITOS O FRAGMENTOS DE TROMBOCITOS QUE INCLUYEN FACTORES DE CRECIMIENTO CAPACES DE DESCARGARSE Y QUE SE ENCUENTRAN PRESENTES EN ESTADO LIOFILIZADO O CONGELADO, Y SUJETOS A UN PROCEDIMIENTO PARA REDUCIR EL NUMERO DE VIRUS Y/O PARA INACTIVAR LOS VIRUS.

Description

Medicina para promover la cicatrización y que contiene trombocitos.

La presente invención se refiere a un medicamento de aplicación local para promover la curación de heridas.

Se ha descrito que la curación de heridas tiene lugar en varios estadios consecutivos temporalmente.

En el estadio I, precipita la proteína del plasma sanguíneo fibrinógeno mediante la trombina, de manera que comienza la formación de un coágulo de fibrina, el cual compacta en presencia del factor de coagulación de la sangre XVIII. Este primer estadio tiene como función detener el sangrado e impermeabilizar la superficie de la herida y tiene lugar en minutos.

En el estadio II, migran células en el coágulo de fibrina desde el área de la herida, más concretamente células inflamatorias, células de los tejidos conectores y células endoteliales. Éstas forman vasos, y tejido conector como matriz extracelular, que consta principalmente de colágeno. Este tejido conector designado como tejido de granulación sirve como base para la formación de tejido epitelial; en la superficie corporal es la base de la epidermis. El estadio II dura desde días hasta semanas y concluye cuando el área de la herida se cierra mediante el epitelio; en la piel mediante la epidermis.

La curación de la herida concluye en el estadio III, que dura desde semanas hasta meses. En el transcurso de esta fase, los elementos celulares disminuyen y aumenta el tejido conector, de manera que se produce un tejido de granulación compacto y duradero. (Bennet N.T., Schultz G.S., Am. J. Surg. 1993, 165: 728-737; Bennet N.T., Schultz G.S., Am. J. Surg. 1993, 166: 74-81).

La formación de tejido de granulación en el estadio II del proceso de curación de la herida se lleva a cabo mediante factores de crecimiento, los cuales promueven la migración y la división de las células de tejido conector, así como la formación de vasos, y de esta manera promueven la curación de la herida. De los factores de crecimiento conocidos, los que toman parte en estos procesos son en particular el factor de crecimiento derivado de plaquetas ("Platelet derived growth factor" PDGF), el factor de crecimiento transformante \beta ("Transforming Growth Factor \beta" TGF-\beta), el factor de crecimiento epidérmico ("Epidermal Growth Factor" EGF) y el factor de crecimiento similar a la insulina I ("Insulin-like Growth Factor I" IGF-I). (Bennett N.T., Schultz G.S., Am. J. Surg. 1993, 165: 728-737; Bennett N.T., Schultz G.S., Am. J. Surg., 1993, 166: 74-81; Bhora F.Y. et al., J. Surg. Res. 1995, 59: 236- 244; Lynch S.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84: 640-646; Lynch S.E. et al., J. Clin. Invest. 1989, 84: 7696-7700).

La formación de la epidermis también se lleva a cabo mediante factores de crecimiento. Estos activan las células epidérmicas (queratocitos), las cuales se han liberado de la matriz intercelular de la capa de células basales, de manera que conforman receptores de membrana específicos, los cuales permiten la adhesión sobre la base del tejido de granulación, particularmente fibrina-fibronectina, lo cual representa una estructura provisional para la migración de los queratocitos. (Brown G.L. et al., J. Exp. Med. 1986, 163: 1319-1324; Brown G.L. et al., N. Engl. J. Med. 1989, 321: 76-79).

En el cuerpo humano, los factores de crecimiento son sintetizados por diferentes tejidos o tipos celulares y se secretan en los líquidos corporales circundantes. En el marco de la curación de heridas toman un importante papel los trombocitos, que sintetizan en cantidades significativas los factores de crecimiento substanciales para la curación de heridas PDGF, TGF-\beta, EGF e IGF-I y pueden almacenarlos en gránulos citoplasmáticos. (Lynch S.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987; 84: 640-646; Ginsberg M.H. et al., Thromb. Haemostas. 1988, 59: 1-6; Hyner O.R., Thromb. Haemostas. 1991, 66:40-43).

Para liberar o ceder los factores de crecimiento almacenados por los trombocitos, éstos deben ser activados mediante estímulos fisiológicos, como por ejemplo colágeno, trombina, tripsina, ADP, serotonina o adrenalina, los cuales se unen a receptores específicos existentes sobre la superficie exterior de la membrana plasmática de los trombocitos. La activación conduce a un cambio de conformación con la subsiguiente agregación de los trombocitos, de manera que estos secretan al líquido corporal circundante los factores de crecimiento almacenados. En la mayoría de estos estímulos fisiológicos, la agregación de los trombocitos subsiguiente a la activación es un prerrequisito para la liberación de los factores de crecimiento. En la estimulación con trombina, los factores de crecimiento también pueden liberarse sin que tenga lugar una agregación de los trombocitos. (Kaplan K.L. et al., Blood 1979, 53: 604-618; Holmsen H. et al., J. Biol. Chem. 1981, 256: 9393-9396; Philipps D.R., Baughan A.K., J. Biol. Chem. 1983, 258: 10240-10245).

Las interacciones entre los trombocitos activados y sus unidades de adhesión situadas sobre las superficies, cuyas interacciones conducen a la agregación, se posibilitan mediante proteínas de matriz de adhesión extracelulares, como por ejemplo el fibrinógeno, la fibronectina y el factor de Von-Willebrand, los cuales se unen a un receptor de glicoproteínas situado sobre la cara exterior de la membrana plasmática de los trombocitos activados. Una fuerte unión de estas proteínas de matriz a los receptores sólo tiene lugar cuando los trombocitos se han activado mediante un estímulo apropiado, tal como se ha descrito más arriba. Esta compleja secuencia de sucesos de activación y agregación de los trombocitos con la subsiguiente liberación de factores de crecimiento constituye uno de los elementos de control substanciales en el proceso de la curación de heridas. (Ginsberg M.H. et al., Thromb. Haemostas. 1988, 59: 1-6; Hyner O.R., Thromb Haemostas. 1991, 66: 40-43; Landolfi R. et al., Blood 1991, 78: 377-381; Perschke E.I. et al., Blood 1980, 55: 841-847; Hynes O.R., Cell 1992, 69: 11-25; Perschke E.I., J. Lab. Clin. Med. 1994, 124: 439-446; Savage B., Ruggeri Z.M., J. Biol. Chem. 1991, 266: 11227-11233; Bennett J.S. et al., J. Biol. Chem. 1982, 257: 8049-8054; Cierniewski C.S. et al., Biochim. Biophys. Acta 1982, 714: 543-548; Philipps D. R., Baughan A.K., J. Biol. Chem. 1983, 258: 10240-10245).

Los impedimentos en la curación de heridas, como por ejemplo en la diabetes, en las enfermedades de oclusión venosas o arteriales, pero también los impedimentos en la curación de heridas de otros orígenes, como por ejemplo la irradiación con substancias radioactivas o tras quemaduras, conciernen en particular al estadio II del proceso de curación de la herida. En este sentido podría enfatizarse que en estos casos los factores de crecimiento están presentes en menor proporción, de manera que no se forma tejido de granulación o se forma sólo en una cantidad inferior. (Dvonch V.M. et al., Surgery 1992, 112: 18-23; Matsuoka J., Grotendorst G.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86: 4416-4420).

Para mejorar la curación de la herida en el caso de impedimentos en la curación de heridas se ha descrito la aplicación de factores de crecimiento aislados o en combinación, como substancia pura o con excipientes, sobre el área de la herida (Knighton D.R. et al., Surg. Gynecol. Obstet. 1990, 170: 56-60; Brown G.L. et al., J. Exp. Med. 1986, 163: 1319-1324; Holmsen H. et al., J. Biol. Chem. 1981, 256: 9393-9396). Sin embargo, los factores de crecimiento administrados de esta manera se inactivan o se descomponen rápidamente y despliegan su efecto sólo durante un corto intervalo de tiempo (minutos) tras la aplicación, de manera que con estas preparaciones no se alcanza un mejora satisfactoria de la curación de la herida.

Otras terapias conocidas consisten en cubrir el área de la herida con esponjas de colágeno u otras preparaciones, que deben garantizar una humedad del área de la herida, o utilizar preparaciones que descompongan fermentativamente la capa de tejido conector superficial del área de la herida, de manera que pueda crecer nuevo tejido conector a partir de la base de la herida (Nielsen P.G. et al., Acta Dermato-Venerologica 1990, Suppl. 152: 1-12; Lippert P., Wolff H., Zent.bl. Chir. 1990, 115: 1175-1180). Sin embargo, todos estos apósitos de heridas o preparaciones o medicamentos utilizados hasta ahora no conducen a un éxito satisfactorio en la mejora de la curación de la herida.

Es objeto de la presente invención proporcionar un medicamento que acelere efectivamente los procesos de curación de heridas naturales y que mejore notablemente la curación de heridas en presencia de impedimentos en la curación de heridas, en particular también en sus formas agudas, en comparación con los medios y medidas conocidos hasta ahora.

Este objeto se resuelve según la invención proporcionando un medicamento de aplicación local que promueve la curación de la herida, el cual presenta componentes insolubles de trombocitos, los cuales contienen factores de crecimiento y pueden cederlos y los cuales se encuentran en estado liofilizado o ultracongelado y los cuales se han sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus.

Bajo el término "componentes insolubles de trombocitos" se entiende cualquier componente insoluble de los trombocitos que puede separarse de los componentes solubles de los trombocitos mediante filtración, incluida la nanofiltración, o mediante centrifugación, incluida la ultracentrifugación.

A partir de ahora se designará también con el término "trombocitos" las "componentes insolubles de los trombocitos" - a no ser que se indique lo contrario -.

La invención se basa en el reconocimiento de que la aplicación local de los componentes insolubles de los trombocitos, los cuales contienen factores de crecimiento y pueden cederlos, pueden acelerar efectivamente los procesos de curación de heridas. Los componentes de trombocitos aplicados sobre el área de la herida constituyen una reserva natural para la promoción de los factores de crecimiento necesarios para los procesos de curación de heridas. Se ha comprobado que la activación de los componentes de trombocitos aplicados localmente mediante estímulos fisiológicos presentes en el área de la herida, con la subsiguiente agregación y unión de las proteínas de matriz presentes en el área de la herida, conduce a que los factores de crecimiento almacenados en los componentes de trombocitos se cedan continuamente a lo largo de un intervalo de tiempo más largo (varios días) en el área de la herida. De esta manera se hacen accesibles concentraciones claramente más elevadas de factores de crecimiento a lo largo de un intervalo de tiempo notablemente más largo respecto a la administración directa de los factores de crecimiento en el área de la herida, de manera que se promueve la migración de células inflamatorias, de células de tejido conector y de células endoteliales y aumenta la multiplicación de dichas células en el estadio II del proceso de curación de la herida. De esta manera se alcanza una formación rápida y suficiente de tejido de granulación, el cual a su vez posibilita la formación de tejido epitelial y el cierre definitivo de la herida. El proceso de epitelización se acelera además mediante los factores de crecimiento liberados, los cuales promueven también la migración y multiplicación de las células epiteliales.

Para garantizar la preservación del medicamento a lo largo de un intervalo de tiempo más largo, los componentes de trombocitos se presentan en el medicamento según la invención preferentemente en estado liofilizado o ultracongelado. Para minimizar el riesgo de infección por virus, los trombocitos se someten preferentemente a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus, pudiéndose utilizar un procedimiento físico o químico o un procedimiento combinado.

Para preparar una mayor concentración de factores de crecimiento, en particular en el tratamiento de impedimentos en la curación de heridas, se prefiere que el contenido de componentes insolubles de trombocitos del medicamento según la invención sea de tal que después de la reconstitución del liofilizado o después de la descongelación, respectivamente, corresponda como mínimo a 10^{4}, preferentemente como mínimo a 10^{5} trombocitos por \mul.

Para alcanzar un efecto inicial pronunciado del medicamento según la invención inmediatamente después de su aplicación, puede tener sentido, en particular en el caso de impedimentos severos en la curación de heridas, que el medicamento presente factores de crecimiento adicionales, que no procedan de los trombocitos contenidos en el medicamento. Los factores de crecimiento adicionales pueden pertenecer al mismo tipo que los factores de crecimiento almacenados y cedidos en los trombocitos del medicamento según la invención o pueden pertenecer a otro tipo. Los factores de crecimiento pueden estar presentes en el mismo recipiente que los trombocitos o estar contenidos en un recipiente separado en forma de disolución o liofilizado.

Se ha comprobado, en particular en los casos pronunciados de impedimentos en la curación de heridas, que es ventajoso que el medicamento presente biomateriales. Bajo el término biomateriales se entiende, según la invención, cualquier material que sea compatible con el tejido y reabsorbible y refuerce la promoción de la curación de heridas conjuntamente con los trombocitos o factores de crecimiento contenidos en el medicamento o independientemente de los mismos. De esta manera pueden estar contenidos en el medicamento según la invención como biomateriales las substancias que activan los trombocitos como estímulos y/o los materiales que median la agregación de los trombocitos. De esta manera se refuerza el efecto de las substancias activadoras y mediadoras de la agregación presentes en el área de la herida, de manera que aumenta en mayor grado la liberación de factores de crecimiento y se promueve en mayor grado la curación de la herida.

Para minimizar el riesgo de infección por virus, se somete preferentemente a los biomateriales a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus, pudiéndose utilizar un procedimiento físico o químico o un procedimiento combinado. Los biomateriales pueden someterse a un procedimiento de este tipo aisladamente o mezclados con otros componentes del medicamento (por ejemplo trombocitos).

Para garantizar la preservación del medicamento a lo largo de un intervalo de tiempo más largo, los biomateriales se presentan en el medicamento según la invención preferentemente en estado liofilizado o ultracongelado. Además, los biomateriales pueden estar presentes en los mismos recipientes que los trombocitos y/o factores de crecimiento o estar contenidos en recipientes separados y la congelación o liofilización, respectivamente, de los biomateriales en los mismos se lleva a cabo de forma aislada o en forma de mezcla con otros componentes del medicamento.

Se ha comprobado que la activación y agregación de los trombocitos y como consecuencia la liberación de los factores de crecimiento almacenados en los trombocitos se posibilita mediante la reticulación de proteínas de la matriz. Además, dichas proteínas pueden formar estructuras reticuladas en las cuales se adhieren los trombocitos y se unen fuertemente al área de la herida, de manera que dichas estructuras promueven la difusión de los factores de crecimiento hacia el área de la herida y la migración de las células a partir del área de la herida. En conexión con lo anterior, una realización preferida del medicamento según la invención se caracteriza por el hecho de que se proporciona como biomateriales un material de adhesión y/o colágeno. Bajo el término material de adhesión, en el sentido de la invención, se entiende los biomateriales que constan total o parcialmente de proteínas reticulables, las cuales son apropiadas para la adhesión de tejidos.

El fibrinógeno es una substancia particularmente efectiva para desencadenar la agregación de los trombocitos activados, mientras que la trombina representa una de las substancias más efectivas para la activación de los trombocitos. Por tanto es ventajoso de cara al aumento de la liberación de los factores de crecimiento y a la mejora de la curación de la herida, que el material de adhesión se introduzca conjuntamente con proteínas que contienen fibrinógeno y con trombina.

Se ha comprobado que las células humanas, como los queratocitos, las células epiteliales, las células embrionales y fetales, así como los componentes celulares, como los liposomas, pueden acelerar adicionalmente la curación de la herida y la multiplicación celular promovida por los trombocitos. Por ello se prefiere que el medicamento presente adicionalmente células epiteliales y/o queratocitos y/o células embrionales y/o fetales y/o liposomas. Las células o liposomas pueden estar presentes, en forma de una suspensión líquida o ultracongelada o en forma de un liofilizado, en recipientes separados, o pueden estar presentes en recipientes conjuntos uno o varios de los tipos celulares o liposomas mencionados sin los demás componentes del medicamento o con alguno de los otros componentes del medi-
camento.

Para minimizar el riesgo de infecciones por virus, las células o liposomas pueden someterse a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus, pudiéndose utilizar un procedimiento físico o químico. Las células o liposomas pueden someterse a un procedimiento de este tipo de forma aislada o mezclados con otros componentes del medicamento.

La invención se refiere también a la utilización de componentes insolubles de trombocitos, los cuales contienen factores de crecimiento, para la preparación de un medicamento de aplicación local para la promoción de la curación de heridas.

Algunas formas de realización preferidas de la invención se explican en detalle a continuación con la ayuda de ejemplos.

Ejemplo 1 Preparación de un medicamento según la invención

Se anticoagula un concentrado de trombocitos humano o un concentrado de componentes de trombocitos mediante citrato sódico al 3% y se centrifuga (1000 g/20 min) para separar el plasma y otros componentes celulares. El sobrenadante rico en trombocitos o el sobrenadante con componentes de trombocitos se suspende en medio RPMI y se lava tres veces con medio RPMI (1000 g /20 min). Los trombocitos lavados o componentes de trombocitos lavados se suspenden en un medio RPMI y se ajustan a una concentración de 6x10^{5} trombocitos o componentes de trombocito
por \mul cómo mínimo. La suspensión de trombocitos se somete entonces a un procedimiento de inactivación de virus según el ejemplo 3 y finalmente se ultracongela o se liofiliza según los procedimientos descritos más abajo, obteniéndose un medicamento según la invención.

Ultracongelación: Cada 1 ml de suspensión de trombocitos se ultracongela por schock a -80ºC en el transcurso de 30-40 minutos y se almacena a baja temperatura. Antes de su utilización, el concentrado de trombocitos se descongela a temperatura ambiente.

Liofilización: cada 1 ml de suspensión de trombocitos se congela a -80ºC durante 24 horas como mínimo y finalmente se liofiliza al vacío durante 20 a 24 horas de -20ºC hasta -40ºC. Los trombocitos se almacenan entre -20ºC y -80ºC y antes de su utilización se rehidratan con 1 ml de medio RPMI.

Ejemplo 2 Preparación de un medicamento según la invención, que presenta biomateriales

Se añade a la suspensión de trombocitos con inactivación de virus, preparada según el ejemplo 1, una disolución de proteínas humanas reticulables (fibrinógeno, fibronectina, factor de coagulación de la sangre XIII o colágeno), que puede haberse sometido a uno o varios procedimientos para la inactivación de virus según el ejemplo 4, sometiéndose cada proteína aislada o combinadas entre sí, debiendo ser la concentración de las proteínas reticulables en la disolución añadida de 70-90 mg/ml. La relación de mezcla de la suspensión de trombocitos respecto a la disolución de proteínas humanas reticulables debe ser preferentemente de 1:3. La mezcla contenida de esta manera se ultracongela o liofiliza según el procedimiento descrito en el ejemplo 1 para conseguir el tiempo de permanencia deseado.

En lugar de llevar a cabo la inactivación de virus en los componentes aislados (trombocitos o biomateriales) también es posible efectuar la inactivación de virus en la mezcla de suspensión de trombocitos y disolución de proteínas según el procedimiento del ejemplo 3.

Ejemplo 3 Inactivación de virus en la suspensión de trombocitos (inactivación de virus fotodinámica)

Se añade 8-metoxipsoral (disuelto en dimetilsulfóxido [DMSO] a 50 ml de la suspensión de trombocitos, preparada según el ejemplo 1, hasta una concentración final de 300 \mug/ml (concentración final de DMSO 3%) y se irradia a
22-27ºC bajo una atmósfera de 5% de CO_{2} y 95% de N_{2} y una presión de 2 psi durante 6 horas con luz ultravioleta, desde abajo y desde arriba, de manera que la intensidad de luz global sea de 3,5 mW/cm^{2} a 4,8 mW/cm^{2} (Lin L. et al., Blood 1989,l 74: 517-525).

Después de la fotoinactivación realizada, se analiza la capacidad funcional de las suspensiones de trombocitos obtenidas de esta manera. La capacidad funcional se determina mediante la medición de la formación de [^{3}H]-timidina en un cultivo celular de fibroblastos.

Ejemplo 4 Inactivación de virus en los biomateriales (inactivación de virus química)

Los biomateriales que se añaden a la suspensión de trombocitos preparada según el ejemplo 1, se someten a inactivación de virus mediante el procedimiento solvente-detergente. Para ello, se añade a una suspensión de biomateriales a 30ºC un 1% (peso/peso) de tri(n-butil)fosfato y un 1% (peso/peso) de tritón X-100 y se deja la mezcla 4 horas bajo agitación. A continuación, mediante la adición de un 5% (vol./vol.) de aceite de soja se separa la mezcla solvente-detergente de la suspensión de biomateriales sobre una columna C18 (Waters Millipore) mediante cromatografía (Horowitz B. et al., Blood 1992, 79: 826-831; Piet M.P.J. et al., Transfusión 1990, 30: 591-598; Piquet Y. et al., Vox sang. 1992, 63: 251-256).

Los biomateriales tratados con el procedimiento de inactivación de virus químico descrito más arriba pueden someterse a continuación adicionalmente a otra inactivación de virus fotodinámica.

Ejemplo 5 Comprobación de la promoción del aumento de tejido conector mediante el medicamento según la invención

Se llevó a cabo el test en un cultivo de fibroblastos. Sobre una placa de cultivo celular se aplicó el medicamento según la invención preparado según el ejemplo 2 en una cantidad de 200 \mul por cm^{2} y se activó mediante 50 \mul de una disolución de trombina (3,2 IU trombina por ml de disolución de sal común fisiológica). Sobre la suspensión aplicada se añadieron fibroblastos humanos, que procedían del pasaje 4 a 10 de un cultivo primario, en un grosor de 4x10^{4} células por cm^{2} y se cultivaron en un medio de cultivo celular (RPMI) (cultivo 1). En el tercer, quinto y séptimo día del cultivo, se midió el índice de mitosis celular mediante la medición de la síntesis de ADN a través de la formación de [^{3}H]-timidina. El índice de mitosis celular del cultivo 1 se comparó con el índice de mitosis celular de otro cultivo de fibroblastos (cultivo 2), el cual se realizó en un medio nutritivo RPMI, en el cual se había añadido un 10% en volumen de suero de ternero, sin añadirse el medicamento según la invención.

Resultado: el cultivo 1 mostró el día 3 de cultivo una formación de [^{3}H]-timidina (196645 \pm 56864 cpm/ml) 7 veces mayor que el cultivo 2. En el día 5 (152749 \pm 93951 cpm/ml) y en el día 7 (77045 \pm 27974 cpm/ml), la formación de [^{3}H]-timidina en el cultivo 1 continuaba siendo de 5 a 10 veces mayor que en el cultivo 2. Estas diferencias entre el cultivo 1 y el cultivo 2 son estadísticamente altamente significativas (p < 0,01) y demuestran la capacidad del medicamento según la invención de promover la propagación del tejido conector y mantener dicha actividad a lo largo de un intervalo de tiempo más largo (como mínimo 7 días).

Ejemplo 6 Comprobación de que la unión de proteínas de la matriz sobre las superficies de los trombocitos conduce a que se cedan continuamente los factores de crecimiento almacenados en los trombocitos

El test se llevo a cabo en un cultivo de fibroblastos (según el ejemplo 5). En el cultivo 1 se añadió en medicamento según la invención - como en el ejemplo 5 -. En el cultivo 2, los trombocitos se trataron con anticuerpos específicos contra los sitios de unión superficiales para proteínas de la matriz, de manera que las proteínas de la matriz no pudieran unirse a las superficies de los trombocitos. En el tercer día de cultivo, se midió el índice de mitosis celular a través de la medición de la síntesis de ADN mediante la formación de [^{3}H]-timidina.

Resultado: mientras que el cultivo 1 presenta una formación de timidina similar a la del ejemplo 5, en el cultivo 2 no pudo medirse ninguna formación de timidina. Esta diferencia prueba que para la liberación de los factores de crecimiento almacenados en los trombocitos es necesaria la unión de proteínas de la matriz sobre la superficie de los trombocitos.

Ejemplo 7 Determinación de la promoción de la curación de heridas mediante el medicamento según la invención

La eficacia clínica del medicamento según la invención se comprobó en 6 pacientes con úlcera cutánea incurable crónica de las extremidades inferiores, que se habían tratado sin éxito durante más de medio año con terapias locales quirúrgicas o conservativas. Las úlceras se clasificaron según la valoración de heridas descrita por Knighton D.R. et al., Ann. Surg. 1986, 204: 322-330. La valoración de heridas englobaba parámetros generales, condiciones anatómicas y el tamaño del ulcus. Cuanto mayor sea la valoración, peores son los pronósticos de la curación; pueden alcanzarse como máximo 97 puntos (= peor situación de partida).

Plan de tratamiento

Se limpiaron las úlceras, se separó el tejido necrótico y se reticuló con disolución de trombina (3,2 IU trombina bovina/ml de medio RPMI). Finalmente, se rellenó el defecto con el medicamento según la invención preparado según el ejemplo 2 descongelado y se aplicó por encima la disolución de trombina para la activación de los trombocitos mencionada más arriba en una relación de suspensión de medicamento respecto la disolución de trombina de 3:1 en volumen. Las úlceras tratadas de esta manera se cubrieron con un vendaje de herida (lámina de aluminio) no adhesivo. Hasta la curación, las úlceras se trataron de la manera que se ha descrito más arriba dos veces por semana. El progreso de la curación se documentó fotográficamente e histológicamente (biopsia de microaguja en la semana de tratamiento 2 y 5).

Resultado

En la tabla 1 se resumen los datos de los pacientes, así como las enfermedades de vasos y enfermedades enzimáticas causantes así como la determinación de la valoración de la herida al inicio del tratamiento.

TABLA 1

1

\hskip0,3cm

^{\text{a, b}}) dos úlceras en una pierna: ^{a}) ulcus proximal, ^{b}) ulcus distal

El transcurso temporal de la curación de la herida (indicada en semanas después del inicio del tratamiento) se representa en la tabla 2.

TABLA 2

2

\hskip0,3cm

A excepción del paciente 3, a partir del cuerpo del ulcus ya se formó en todos los pacientes en la primera semana de tratamiento un buen tejido de granulación irrigado, que después de posteriores tratamientos con el medicamento según la invención de hasta aproximadamente dos semanas tras el inicio de la terapia, disminuyó y rellenó el ulcus. Es destacable el hecho de que en todos los pacientes, incluso después de los primeros tratamientos, se calmó el entorno del ulcus, desapareció el eritema y el edema de la piel a su alrededor y el margen del ulcus ya no era edematoso ni de color indefinido. Histológicamente, en la segunda semana de tratamiento se mostró en todas las biopsias tejido de granulación compuesto por fibroblastos y fibrocitos con una rica génesis de vasos y formación de fibras de colágeno y con una baja infiltración sólo superficial de células inflamatorias y de necrosis de tejido. Una epitelización del defecto de la piel se inició después de la tercera semana de tratamiento a partir de los márgenes de la herida y pudo comprobarse entonces también histológicamente en las segundas biopsias realizadas en la quinta semana de tratamiento. En el posterior transcurso del tratamiento, disminuyó el área de la úlcera por un lado a través de la epitelización, pero también a través de una contracción cicatrizante. Dichas úlceras cicatrizaron a mucho tardar la 12ª semana de tratamiento, a excepción del paciente 5.

Los resultados citados más arriba muestran que, en pacientes que se habían tratado sin éxito como mínimo durante medio año con una terapia conservativa y que por tanto presentaban pronósticos extremamente malos en cuanto a una curación de la herida, la aplicación local del medicamento según la invención puede promover la curación de herida y de esta manera curar la úlcera cutánea incurable crónica.

Claims

1. Medicamento de aplicación local para promover la curación de heridas, que presenta componentes insolubles de trombocitos, los cuales

-: contienen factores de crecimiento y pueden cederlos,

-: están presentes en estado liofilizado o ultracongelado, y

-: se han sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus.

2. Medicamento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el contenido de componentes insolubles de trombocitos es tal que después de la reconstitución del liofilizado o después de la descongelación, corresponde como mínimo a 10^{4}, preferentemente como mínimo a 10^{5} trombocitos por ml.

3. Medicamento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por el hecho de que presenta factores de crecimiento adicionales.

4. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que presenta biomateriales.

5. Medicamento según la reivindicación 4, caracterizado por el hecho de que los biomateriales se han sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o la inactivación de virus.

6. Medicamento según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado por el hecho de que los biomateriales están presentes en estado liofilizado o ultracongelado.

7. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado por el hecho de que se proporciona un material adhesivo de tejidos y/o colágeno como biomateriales.

8. Medicamento según la reivindicación 7, caracterizado por el hecho de que el material adhesivo de tejidos se combina con proteínas que contienen fibrina y con trombina.

9. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizado por el hecho de que presenta adicionalmente células epiteliales y/o queratocitos y/o células embrionales y/o fetales y/o liposomas.

10. Utilización de componentes insolubles de trombocitos, los cuales contienen factores de crecimiento y pueden cederlos, para la preparación de un medicamento de aplicación local para promover la curación de heridas.