EP2456462A2 - Impfstoff zur prävention von akuter lymphoblastischer leukämie - Google Patents

Impfstoff zur prävention von akuter lymphoblastischer leukämie

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EP2456462A2
EP2456462A2 EP10734996A EP10734996A EP2456462A2 EP 2456462 A2 EP2456462 A2 EP 2456462A2 EP 10734996 A EP10734996 A EP 10734996A EP 10734996 A EP10734996 A EP 10734996A EP 2456462 A2 EP2456462 A2 EP 2456462A2
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EP
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coxsackie
viruses
vaccine
virus
lymphoblastic leukemia
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Detlef Oerter
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    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to a coxsackie B virus-based vaccine for the prevention of acute lymphoblastic leukemia (ALL).
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • Coxsackie viruses belong to the genus Enteroviruses, which include polioviruses and echoviruses. Coxsackie viruses can be subdivided into two subgroups: Coxsackie virus of type A with 23 serotypes and coxsackie virus of type B with 6 serotypes.
  • Coxsackie virus was isolated for the first time in the late 1940s from the chair of children in the US city of Coxsackie, showing paralysis. Based on different effects on newborn mice, the isolated viruses were divided into the two groups A and B mentioned above. While group A coxsackie viruses generally cause inflammatory reactions, type B coxsackie viruses infect a variety of tissues and organs in humans and animals, and can lead to rapid destruction of the tissue. They lead in a infection of newborn mice in animal experiments after a few days to a paralysis and death.
  • viruses of the genus Enterovirus is predominantly fäko-oral or eg in the form of droplet infections. It is known that coxsackie viruses in humans usually cause harmless infectious diseases, such as common cold, but also other diseases such as hand-foot-mouth disease. However, Coxsackie B viruses can also cause meningitis, pancreatitis or myocarditis, and more rarely paralysis. Type B coxsackie viruses are found worldwide and are known to cause a range of human diseases. Coxsackie B viruses are also discussed in the literature in connection with viral-induced heart muscle inflammation (myocarditis) and viral-induced type 1 diabetes mellitus (IDDM). For example, Coxsackie B4 viruses are suspected to be the cause of a viral myocarditis, which can sometimes be fatal.
  • myocarditis myocarditis
  • IDDM type 1 diabetes mellitus
  • Acute lymphoblastic leukemia is a rare disease, but it is a life-threatening childhood cancer.
  • ALL occur in industrialized countries and in 80 to 90% of children in the age group 2-5 (Rossig et al., Radiation Protection Dosimetry, 2008, 132, 114-118). This distribution is also referred to as the "childhood peak.” In the developing world, the ALL occurs much less frequently, the described "childhood peak” is not formed here.
  • ALL acute lymphoblastic leukemia of childhood
  • cytostatic and radiotherapeutic treatment an average of 80% of children with ALL disease can be cured primarily.
  • these tedious and lengthy conventional cancer therapies have significant side effects, for example in the form of disorders of the thyroid function and weakening of neurocognitive abilities.
  • part of the originally healed patients later suffers infestation by a second tumor.
  • An object of the present invention is to provide a safe and well-tolerated vaccine for the prevention of ALL in children. It has now been found that Coxsackie B viruses are a causative agent for acute lymphoblastic leukemia (ALL) in children, and that a targeted immunization (vaccination) against Coxsackie B viruses causes a disease of acute lymphoblastic leukemia (ALL). can be prevented.
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • the invention also relates to the use of a vaccine based on Coxsackie B viruses for the prevention of acute lymphoblastic leukemia (ALL).
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • Coxsackie B viruses About 5-10% of pregnant women in industrialized countries experience a clinically normal infection with Coxsackie B viruses. Since the Coxsackie B virus can pass through the placental barrier, infection of the embryo can also occur. This leads due to the lymphocytotropy of Coxsackie B virus to an increased incidence of chromosomal abnormalities in the precursors of mature lymphocytes in the embryo. The proportion of children who come into contact with Coxsackie B virus in their first year of life is not contracted because the mother's passively transferred antibodies provide protection against Coxsackie B virus diseases. Those infected in their first year of life Children form additional new antibodies that provide long-lasting protection.
  • ALL disease malignant lymphocyte degeneration
  • ALL is a rare disease, as evidenced by the specific two-step nature of ALL caused by coxsackie B viruses described above.
  • the Smith study shows the temporal changes in the hepatitis A virus (HAV) infection rates, using the HAV infection pattern as an indicator of the fecal oral transmission serves, in proportion to the changes in mortality and incidence of childhood leukemia in different countries.
  • HAV hepatitis A virus
  • Coxsackie B viruses which as described can overcome the placental barrier and infect the embryo, can cause malformations in humans in rare cases. • Influence of other viral diseases in the first year of life:
  • roseola infections which are also known as three-day fever (Roseola infantum), and often occur in infancy or early infancy, as well as ear infections, such as otitis media, in the first year of life, the risk lower ALL.
  • infant leukemia The small increase in cases of leukemia in the first year of life (“infant leukemia”) is probably only an expression of improved access to diagnosis, while the sharp rise between the second and fifth childhood (“childhood peak”) is undoubtedly due to a real increase .
  • childhood peak The de facto increase in cases of "infant leukemia” as opposed to "childhood peak” very well supports the above-stated hypothesis that the two-step infection is an infection with the identical serotype: the infection during Therefore, the first year of life with the identical Coxsackie B virus can not lead to a disease because the infant is protected by the passively transferred antibodies of the mother during the first year of life against infection with coxsackie B viruses.
  • the present invention is a vaccine based on Coxsackie B viruses as a medicament for the prevention of acute lymphoblastic leukemia (ALL), especially of acute lymphoblastic leukemia (ALL) in children.
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • the vaccine is used in the prevention of childhood acute lymphoblastic leukemia, which occurs in the age group from the second to the fifth year of life.
  • vaccines based on Coxsackie B viruses are to be understood as meaning those compositions which contain a biologically or genetically engineered Coxsackie B virus-specific antigen. These include killed coxsackie B viruses, protein and / or nucleic acid fragments (such as cDNA or RNA) of coxsackie B viruses and coxsackie B virus-specific viral genomes, which contain a nucleotide sequence encoding cytokines, such as interferon Gamma, in question. For the purposes of the present invention, so-called dead or live vaccines can be used.
  • the vaccine is a composition based on coxsackie B viruses and becomes more acute for the prevention of coxsackie B viruses lymphoblastic leukemia (ALL) in children as a dead vaccine (eg inactivated coxsackie B viruses).
  • ALL lymphoblastic leukemia
  • dead vaccines based on coxsackie B viruses are suitable for eliciting a specific immune response without causing disease by coxsackie B viruses.
  • Attenuation or virulence reduction is meant the targeted reduction of virulence, that is, the disease-causing properties of the pathogen, whereby its ability to reproduce (live-attenuated) and its antigenic properties are largely retained.
  • a distinction is generally cold-adapted strains that can only multiply at temperatures around 25 0 C, and temperature-sensitive strains that can only multiply in a temperature range of about 38-39 0 C.
  • Dead vaccines usually contain inactivated or killed pathogens that are not capable of reproduction. For example, the following dead vaccine types can be used:
  • the inactivation (killing) of the viruses is carried out by means of chemical substances or substance combinations, eg. As formaldehyde, beta-propiolactone, psoralen, wherein the virus envelope is retained.
  • cDNA vaccine Trigger pathogens.
  • active immunization active vaccination, active vaccine
  • passive immunization passive vaccination, passive vaccine
  • active vaccination an attenuated form of the disease or an immune response is achieved artificially by the administration of viable or non-viable pathogens.
  • passive vaccination immunoglobulin preparations or serum are administered (parenterally, intravenously) to actively immunized humans or animals, with specific antibodies being used to treat or prevent infectious diseases.
  • the present invention is a vaccine based on Coxsackie B viruses as a vaccine for the prevention of acute lymphoblastic leukemia (ALL), in particular of acute lymphoblastic leukemia (ALL) in children, using an active and / or passive vaccine can.
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • the present invention relates to a vaccine based on coxsackie B viruses and a medicament for the prevention of acute lymphoblastic leukemia (ALL), especially of acute lymphoblastic leukemia (ALL) in children, using an active vaccine.
  • the vaccine contains one or more antigens selected from killed coxsackie B viruses, protein and / or nucleic acid fragments (in particular cDNA fragments) of coxsackie B viruses and coxsackie B virus-specific viral genomes a nucleotide sequence coding for cytokines, such as interferon-gamma, has been inserted.
  • the connection between the occurrence of ALL and the above-described two-stage infection process with Coxsackie B viruses can be proven in particular by using "Guthrie cards.”
  • the Guthrie test is one of the worldwide Newborn screening tests are usually performed around the third day of life of the child and are then imbibed with a filter paper card in predefined fields, which is then tested for various metabolic disturbances (such as blood pressure) Often, these filter paper cards are stored in the clinics over many years and can also be years after the birth can still be used for blood tests. It is also possible to detect viruses or virus-specific antibodies in these dried neonatal blood samples, such as cytomegalovirus. In Guthrie charts of ALL patients, there is much evidence of coxsackie B virus infection during pregnancy.
  • the vaccine based on coxsackie B viruses is a vaccine containing at least one coxsackie B virus-specific antigen selected from the group consisting of killed ones (inactivated) coxsackie B viruses, coxsackie B virus protein fragments and nucleic acid fragments (especially cDNA fragments) from coxsackie B viruses.
  • the vaccine based on coxsackie B viruses may contain coxsackie B virus specific antigens, in particular killed coxsackie B viruses, of at least one serotype selected from the group Coxsackie Bl viruses, coxsackie B2 viruses, coxsackie B3 viruses, coxsackie B4 viruses, coxsackie B5 viruses, and coxsackie B6 viruses.
  • the vaccine based on coxsackie B viruses contains specific antigens, in particular killed coxsackie B viruses, of at least one serotype selected from the group of coxsackie B2 viruses, coxsackie B3 viruses, coxsackie B4 viruses and Coxsackie B5 viruses.
  • a vaccine containing a combination of two, three, four or even several antigens, each of which is specific for one of the coxsackie B virus serotypes Bl, B2, B3, B4, B5 and B6, is also preferred.
  • a preferred embodiment of the invention is directed to a Coxsackie B virus-based vaccine comprising Coxsackie B virus-specific antigens, in particular killed Coxsackie B viruses, of the Serotypes Coxsackie Bl viruses, Coxsackie B2 viruses, Coxsackie B3 viruses, Coxsackie B4 viruses, Coxsackie B5 viruses and Coxsackie B6 viruses.
  • the vaccine described above preferably contains, based on coxsackie B viruses, protein and / or nucleotide fragments of coxsackie B viruses of at least one serotype selected from the group of coxsackie B2 viruses, coxsackie B3 viruses, coxsackie B4 viruses and Coxsackie B5 viruses.
  • the vaccine described in the present application for the prevention of childhood acute lymphoblastic leukemia is preferably administered to children before the age of one, in particular before the sixth month of life. Therefore, the vaccine described for the prevention of acute lymphoblastic leukemia is suitable for administration to children before the age of one, especially before the age of six months.
  • the vaccination is preferably intramuscularly or subcutaneously in the 3rd, 4th and 5th month of life of the child, as well as in a booster vaccination in the 11th and 18th year of the child.
  • the coxsackie B virus based vaccine disclosed in the present specification can be administered in a form of administration known for vaccines, especially for active vaccines.
  • the vaccine according to the invention can be administered parenterally, in particular by intramuscular and subcutaneous administration. Intramuscular administration of the vaccine is preferred.
  • the described Coxsackie B virus based vaccine for the prevention of acute lymphoblastic leukemia is suitable for intramuscular administration in children before the age of six months.
  • the present invention further relates to the use of a vaccine based on coxsackie B viruses for the preparation of a composition for the prevention of childhood acute lymphoblastic leukemia.
  • Coxsackie B virus based vaccine The methods for producing a Coxsackie B virus based vaccine are known in the art in principle.
  • inactivated coxsackie B viruses for example, mammalian cell cultures (for example monkey kidney cells (eg, Cells), human diploid lung cell lines (WI-238, MRC5) and inoculated with coxsackieviruses of a single (or multiple) serotype.
  • mammalian cell cultures for example monkey kidney cells (eg, Cells), human diploid lung cell lines (WI-238, MRC5) and inoculated with coxsackieviruses of a single (or multiple) serotype.
  • the virus harvest takes place by removing the supernatant fluid under sterile conditions. These can then be filtered eg by a small filter pore size (eg of 0.22 microns) to remove larger cell residues.
  • a small filter pore size eg of 0.22 microns
  • the sosstechniksvo- lumen of the necessary concentration of virus adapted to the virus suspension frozen until use and / or stored at low temperatures (eg, from about 4 0 C).
  • the viruses thus obtained can be killed, for example, by heat or chemicals, or attenuated using common virus attenuation techniques.
  • the inactivation of Coxsackie B viruses can be carried out, for example, by treatment with chemicals such as formaldehyde, by high-energy radiation or heat treatment.
  • Another method of preparation of the vaccine is based on the insertion of the coding sequences of cytokines (such as interferon-gamma) into the virus genome of coxsackie B virus.
  • Vaccination with a coxsackie B3 strain modified in this way has proven to be very effective in the animal-experimental prevention of coxsackie B3-induced myocarditis.
  • aliquots of the virus suspension may be mixed with a suitable stabilizer, particularly sorbitol, to achieve the recommended dosage, with viral components present in a concentration that elicit a sufficient immune response in the human body.
  • a suitable stabilizer particularly sorbitol
  • the dosage of the vaccine depends on the application form and is familiar to the skilled worker in principle.
  • the vaccines described in the present application may contain pharmaceutically acceptable carriers and excipients and additives. Phenoxyethanol, magnesium chloride, aluminum, etc. can be used. salts, carbohydrates such as sucrose, preservatives such as antibiotics, thiomersal, phenol, formaldehyde.
  • the ready-to-use formulated vaccine can be dispensed into ampoules and stored until use.
  • the present application further relates to a method of producing a vaccine based on coxsackie B viruses for the prevention of childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL), wherein coxsackie B viruses selected from at least one serotype are mixed with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • ALL childhood acute lymphoblastic leukemia
  • chromosome preparation refers to the representation of chromosomes or their aberrations.
  • Chrmosomes can be prepared from all dividable tissues, the so-called sample material, eg peripheral blood, tissue (fibroblasts), amniotic fluid
  • sample material eg peripheral blood, tissue (fibroblasts), amniotic fluid
  • peripheral blood lymphocytes for chromosomal imaging, as the removal of venous blood is easy and the mitotic yield during cultivation is very good, but as the lymphocytes in the blood normally do not divide, they must pass through the culture
  • the techniques of chromosome preparation are variable and generally known, but are fundamentally based on the following steps: if appropriate, application of a culture with the special culture medium and in a suitable culture container; Wait culture time, if necessary change of Ku lturmediums and control of the number of mites; Stopping growth by colchicine (spindle poison); Treatment of vital cells with hypotonic solution; Fixation with an acetic acid-methanol mixture; optionally applying
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • CISS chromosomal in situ suppression
  • GISH genomic in situ hybridization
  • DNA is chemically synthesized as a linear polyester from deoxyribose and phosphoric acid with heterocyclic nitrogen bases in the side chain
  • Two single strands of DNA can form a double helix through hydrogen bonds, and hydrogen bonds in the double helix can be separated into two single strands by heating to temperatures of about 80 ° C.
  • melting temperature After separation, two DNA single strands can recombine specifically to the duplex once the base sequence of the single strands is complementary to each other. This specific recombination of DNA single strands of different origin to double strand is called hybridization.
  • a hybridization site can be detected by attaching a fluorescent dye to a DNA molecule and exciting it to fluorescence after hybridization by a suitable light source. If a biological preparation is used as target DNA, this specific recombination can be used to produce a specific DNA sequence, e.g. in a chromosome or in a nucleus. This particular hybridization variant is called fluorescence in situ hybridization (FISH).
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • Example 1 Preparation of Inactivated Coxsackie B Virus Based Vaccine
  • the manufacturing process of an inactivated coxsackie B vaccine comprises the following steps:
  • Virus harvest Clarification; concentration; Purification by gel permeation chromatography; and ion exchange chromatography; - filtration;
  • the Coxsackie B virus is obtained from the stool of a fresh ALL-ill child and, for example, in Vero cells (normal kidney cells from the Green Monkey) multiplied. After microcarrier cultures, the medium is removed, the cells are washed and infected with the seeds (multiplicity of infection, MOI).
  • Vero cells normal kidney cells from the Green Monkey
  • the host cells are incubated at 37 ° C for 72 to 96 hours.
  • the virus fluid is removed from the microcarriers (e.g., by sedimentation or by a special filter). This is followed by a coarse cleaning step to remove the majority of the contaminating cells. Subsequently, the fine purification is carried out by chromatography. In the first rough cleaning step, the virus fluid is first clarified to remove the coarse cell debris. A series of different filters is used, with the last filter representing a 0.2 ⁇ m filter. The pre-clarified virus suspension is then concentrated by ultrafiltration (cut off of 100 kD) to reduce the volume of the liquid.
  • chromatographic purification different principles can be used and combined; for example, a separation based on the molecular weight of the material by gel filtration as well as a separation based on the ion loading by ion exchange chromatography.
  • the antigen content of the liquid is monitored.
  • the concentration of contaminating proteins is monitored after each step to monitor the consistency of the purified product. Since cell lines are used for the production of this vaccine, the elimination of nucleic acids is of particular importance.
  • the DNA clearance factor after the final purification step must be 10 8 , which means that the final product contains less than 10 pg of DNA per dose.
  • the inactivation process for example in a chemical inactivation process, the Antigenicity of the virus particles are maintained. Inactivation takes place at the end of the purification process to avoid crosslinking of contaminants with the virus particle.
  • the chemical inactivation can be carried out, for example, with formaldehyde, which is about to be inactivated by other enteroviruses such as the poliomyelitis virus.
  • the purified virus suspension is sterilized by filtration. This filtration sterilization is not added for more than 27 hours to the amount of formaldehyde required for inactivation under aseptic conditions to the purified and sterilized virus suspension. Thereafter, this mixture is incubated at 37 ° C for 6 days. The suspension is then filtered a second time and incubated again (6 to 9 days). Inactivation temperature: 37 ° C, formaldehyde concentration in final dilution 1: 4000, pH of the medium 7.0. Before the final formulation of the vaccine, the inactivated virus suspension is stored at 4 ° C. During this time samples are taken to determine complete virus inactivation. The above-described preparation steps are carried out similarly for all six serotypes of coxsackie B virus. Following review of the inactivation step, the monovalent coxsackie B vaccines of the serotypes are pooled.
  • Example 2 Animal Experiments Pregnant mice are inoculated inteaperitoneally with a specific coxsackie B virus strain and half of their offspring are inoculated with the identical strain (first group), the remaining 50% are inoculated with a coxsackie B virus strain, the belongs to another serotype (second group). It can be shown that lymphocytic leukemia occurs in the first group, but not in the second group.
  • the frequency of Coxsackie B infections is determined, in particular by the detection of IgM antibodies, in ALL patients and in a control group. It can be shown that IgM antibodies are found more frequently in ALL patients. This supports the role of Coxsackie B viruses on the "second beat", i.e., the second stage of the two-stage infectious course described d) virus serology in stool of ALL patients
  • the frequency of coxsackie B viruses in the stool of ALL patients and in a control group is determined. It can be shown that coxsackie B viruses are more prevalent in ALL patients. This supports the role of Coxsackie B viruses in the "second beat", i.e. in the second stage of the two-stage infectious course described e) Virus detection in the lymphocyte of ALL patients
  • Detection of coxsackie B viruses or parts of them in the lymphocytes of ALL patients and control children In the lymphocytes of ALL patients, evidence of coxsackie B viruses can be obtained at a higher frequency. This supports the role of Coxsackie B viruses in the "second beat", ie in the second stage of the described two-stage infection process.
  • Example 4 Biological evidence Biological evidence has been used to test whether human umbilical cord blood lymphoblasts respond to exposure to Coxsackie B virus in vitro to chromosome aberrations found in routine diagnostics in patients with ALL of the child, and whether exposure to Coxsackie A virus does not leads to those for the predisposition to ALL necessary chromosome aberrations.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the chromosome preparation is based on the accumulation of metaphase cells by arresting the cells in mitosis by adding the spindle toxin colchicine.
  • hypotonic solution Treatment of the still vital cells with hypotonic solution is carried out by osmosis-induced swelling of the cells, which are then fixed with a mixture of methanol and vinegar and applied to the slide. Then the analysis of the chromosomes or their aberrations takes place.
  • FISH fluorescence in situ hybridization

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Coxsackie-Impfstoff bzw. einenauf Coxsackie-B- Viren beruhenden Impfstoff zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL), welche insbesondere bei Kindern im Alter vom zweiten Geburtstag bis zum fünften Geburtstag auftritt.

Description

Impfstoff zur Prävention von akuter lymphoblastischer Leukämie
Die vorliegende Erfindung betrifft einen auf Coxsackie-B-Viren beruhenden Impfstoff zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL). Diese Erkrankung tritt insbe- sondere bei Kindern in der Altersgruppe vom zweiten bis zum fünften Lebensjahr auf.
Die Coxsackie- Viren gehören zu der Gattung der Enteroviren, zu denen auch die Polioviren und die Echoviren gehören. Coxsackie- Viren können unterteilt werden in zwei Untergruppen: Coxsackie- Viren von Typ A mit 23 Serotypen sowie Coxsackie- Viren vom Typ B mit 6 Serotypen.
Coxsackie- Viren wurde Ende der 1940er Jahre erstmals aus dem Stuhl von Kindern aus der US-amerikanischen Stadt Coxsackie isoliert, welche Lähmungserscheinungen zeigen. Anhand unterschiedlicher Wirkungen auf neugeborene Mäuse wurden die isolierten Viren in die zwei oben genannten Gruppen A und B eingeteilt. Während Coxsackie- Viren der Gruppe A generell entzündliche Reaktionen hervorrufen, infizieren Coxsackie- Viren vom Typ B eine Vielzahl von Geweben und Organen bei Mensch und Tier und können dabei zu einer raschen Destruktion des Gewebes führen. Sie führen bei einer Infektion von neugeborenen Mäusen in Tierversuche nach einigen Tagen zu einer Lähmung und dem Tod.
Die Übertragung von Viren der Gattung Enterovirus erfolgt überwiegend fäko-oral oder z.B. in Form von Tröpfcheninfektionen. Es ist bekannt, dass Coxsackie- Viren beim Menschen meist harmlos verlaufende Infektionskrankheiten, wie gewöhnliche Erkältung, aber auch andere Erkrankungen wie die Hand-Fuß-Mund-Krankheit verursachen. Coxsackie-B- Viren können allerdings auch eine Meningitis, Pankreatitis oder Myokarditis, seltener auch Lähmungen, auslösen. Coxsackie- Viren vom Typ B sind weltweit verbreitet und bekannte Verursacher einer Reihe von Krankheiten beim Menschen. Coxsackie-B-Viren werden in der Literatur auch in Zusammenhang mit viral-induzierten Herzmuskelentzündungen (Myokarditis) und viral- induziertem Diabetes mellitus Typ I (IDDM) diskutiert. So stehen etwa Coxsackie-B4-Viren im Verdacht, Ursache einer viralen Myokarditis zu sein, welche mitunter auch tödlich verlaufen kann.
Das RNA Genom sowie die Struktur des Kapselproteins von verschiedenen Coxsackie- Viren-Serotypen wurden bereits identifiziert und beschrieben. Es existieren auch bereits experimentelle Impfstoffe zu Coxsackie-B-Viren, z.B. auch auf Basis von cDNA- Immunisierungen, jedoch ist derzeit noch kein zugelassener Impfstoff auf dem Markt erhältlich. Die akute lymphoblastische Leukämie (ALL) ist eine seltene Erkrankung, sie stellt jedoch eine lebensbedrohliche Krebserkrankung im Kindesalter dar. Anhand von spezifischen Markern lassen sich vier Typen der ALL unterscheiden. Die ALL tritt insbesondere in den Industrieländern und zu 80 bis 90 % der Fälle bei Kindern in der Altersgruppe vom zweiten bis zum fünften Lebensjahr auf (Rossig et al. Radiation Protection Dosimetry, 2008, 132, 114-118). Diese Verteilung wird auch als„childhood peak" bezeichnet. In den Entwicklungsländern tritt die ALL insgesamt wesentlich seltener auf, der beschriebene „childhood peak" ist hier nicht ausgebildet.
An der akuten lymphoblastischen Leukämie des Kindesalters (ALL) erkranken in Deutsch- land jährlich ca. 800 Kindern bei mehr als 500.000 Geburten (Kaatsch et al., Radiation Protection Dosimetry, 2008, 132, 107-113) sowie in den USA ca. 3000 Kinder, wobei die meisten zwischen dem zweiten und fünften Lebensjahr erkranken. Durch eine zytostatische- und strahlentherapeutische Behandlung können durchschnittlich 80 % der an ALL- erkrankten Kindern primär geheilt werden. Diese strapaziösen und langwierigen herkömm- liehen Krebstherapien haben neben den relativ hohen Versagensquoten erhebliche Nebenwirkungen, zum Beispiel in Form von Störungen der Schilddrüsenfunktion und Schwächung neurokognitiver Fähigkeiten. Zudem erleidet ein Teil der ursprünglich geheilten Patienten später den Befall durch einen Zweittumor. Aus den oben dargelegten Gründen ergibt sich ein dringender Bedarf an neuen Methoden und Medikamenten zur Verhütung dieser Krankheit, die zudem einen großen medizinischen Fortschritt bedeuten würden. Da die Ursachen, die zu einer ALL-Krankheit führen (Ätiologie der ALL) trotz intensiver Forschung bislang noch unbekannt sind, existieren bislang keine Impfstoffe oder Arzneimittel, welche die Erkrankung ursächlich bekämpfen. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen sicheren und gut verträglichen Impfstoff zur Vorbeugung von ALL bei Kindern bereitzustellen. Es wurde nun gefunden, dass Coxsackie-B-Viren ein verursachendes Agens für akute lymphoblastische Leukämie (ALL) bei Kindern darstellen und dass durch eine gezielte Immunisierung (Impfung) ge- gen Coxsackie-B-Viren eine Erkrankung an akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) verhindert werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist zudem die Anwendung eines Impfstoffes beruhend auf Coxsackie-B-Viren zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL).
Es wurde gefunden, dass die Charakteristika der akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL) mit den Merkmalen übereinstimmen, welche für Infektionen und Erkrankungen durch Coxsackie-B-Viren beschrieben sind. Zudem wurde ein zweistufiger Infektionsverlauf durch Coxsackie-B-Viren in Zusammenhang mit ALL-Erkrankungen deutlich. Eine zweimalige Infektion, erstens im Mutterleib, bevorzugt in der embryonalen Phase von der 3. bis 8. Schwangerschaftswoche und eine zweite Infektion nach dem ersten Lebensjahr mit dem identischen Serotyp, ist wie im Folgenden dargelegt wird, häufig für die Entstehung von ALL verantwortlich. Kommen Kinder, die bereits in der embryonalen Phase in Kontakt mit Coxsackie-B-Viren gekommen sind, beispielsweise im ersten Lebensjahr erneut mit Coxsackie- Viren in Kontakt, erfolgt keine Coxsackie-induzierte Erkrankung, wie ALL. Es besteht ein ausreichender, passiver Immunisierungsschutz durch die von der Mutter übertragenen Antikörper. Kommt jedoch ein Kind, welches im Embryonalstadium Kontakt mit einem Coxsackie-B- Virus hatte, nach dem ersten Lebensjahr mit dem identischen Coxsackie-B- Virus in Kontakt, mit dem seine Mutter Kontakt hatte, hat es eine deutlich erhöhte Chance an ALL zu erkranken.
Etwa 5 bis 10 % der Schwangeren in den Industrieländern erfahren eine klinisch unauffäl- lige Infektion mit Coxsackie-B-Viren. Da der Coxsackie-B-Virus die Plazentaschranke passieren kann, kann es auch zu einer Infektion des Embryos kommen. Diese führt auf Grund der Lymphocytotropie des Coxsackie-B-Virus zu einem vermehrten Auftreten von Chromosomenanomalien in den Vorstufen der reifen Lymphocyten beim Embryo. Der Teil derjenigen Kinder, die im ersten Lebensjahr mit Coxsackie-B- Virus in Kontakt kommen, erkranken beobachtungsgemäß nicht, denndie bei der Geburt passiv übertragenen Antikörper der Mutter stellen einen Schutz gegen Erkrankungen durch Coxsackie-B-Virus dar. Die im ersten Lebensjahr infizierten Kinder bilden zusätzliche neue Antikörper, die einen lang andauernden Schutz darstellen.
Der Teil der Kinder, die nach dem ersten Lebensjahr mit dem Coxsackie-B-Virus vom gleichen Serotyp in Kontakt kommt, mit dem ihre Mutter Kontakt hatte, erkrankt verstärkt an ALL. Wie molekulargenetische Untersuchungen verdeutlichen, zeigen etwa 1% der Kinder, die eine in utero erlittene Chromosomenanomalie der Lymphozyten aufweisen, einen Übergang zu einer malignen Entartung der Lymphozyten (ALL-Erkrankung), dass heißt 1% von etwa 5%, was etwa 0,05% gleichkommt (Mori et al, Proc Natl Acad Sei USA, 2002, 99, 8242-8247). Es kann gezeigt werden, dass die Charakteristika der ALL in ursächlichem Zusammenhang mit den Charakteristika einer oben beschriebenen zweistufigen Infektion mit Coxsackie-B- Viren gebracht werden können. Insbesondere die folgenden Charakteristika der ALL können mit einer Coxsackie-B-Viren-Infektion korreliert werden, wobei ein ursächlicher Beitrag von Coxsackie-B-Viren belegt werden kann:
• Allgemeine Seltenheit der ALL:
Wie oben beschrieben ist die ALL eine seltene Erkrankung, was sich durch den oben beschriebenen speziellen zweistufigen Verlauf der ALL verursacht durch Coxsackie-B-Viren ergibt. Ein geringer Prozentsatz von 5-10% der Schwangeren in den Industrieländern erfährt eine meist klinisch unauffällige Infektion mit Coxsackie-B-Viren. Die Kinder, die im Embryonal-Stadium eine Infektion mit Coxsackie-B-Viren und damit eine Chromosomenanomalie der Lymphozyten erlitten haben, und erst nach dem ersten Lebensjahr mit Coxsackie-B-Virus vom identischen Serotyp in Kontakt kommen, können an ALL erkranken.
• Besondere Seltenheit der ALL in Entwicklungsländern mit fehlendem „childhoodpeak": Die ALL tritt in Entwicklungsländern wesentlich seltener auf als in den Industrieländern, wobei in den Entwicklungsländern der so genannte„childhood-peak" fehlt.
In den Entwicklungsländern kommt es durch mangelnde Hygiene, insbesondere dem Fehlen von Wassertoilette und von Einmal- Windeln, bei dem überwiegenden
Anteil der Kinder zu einer Infektion mit Coxsackie-B- Viren im ersten Lebensjahr. Aufgrund des oben beschriebenen Passiv-Schutz durch mütterliche Antikörper und der erneuten Immunisierung kommt es nicht zu ALL Erkrankungen. tehung des„childhood peak nach dem ersten Weltkrieg in den Industrieländern:
Der oben beschriebene„childhood-peak" trat in England und bei der weißen Bevölkerung in den USA nach dem ersten Weltkrieg in Erscheinung. Bei der afroamerikanischen Bevölkerungsgruppe in den USA und in Japan konnte der „childhood-peak" erst nach dem zweiten Weltkrieg beobachtet werden.
Dieses zeitliche Auftreten steht im Einklang mit der Verbreitung der Wassertoilette und der zunehmenden Hygiene in den genannten Ländern/Bevölkerungsgruppen. Diese zunehmende Hygiene verhindert einen Kontakt mit Coxsackie-B- Viren im ersten Lebensjahr.
Die Untersuchung von Smith (Smith et al., Cancer causes and Control, 1998, 9, 285-298) zeigen die zeitliche Veränderungen in den Hepatitis- A- Virus (HAV) Infektionsraten, wobei das HAV-Infektionsmuster als Indikator für den fäkal-oralen Übertragungsweg dient, im Verhältnis zu den Veränderungen in der Mortalität und Inzidenz der kindlichen Leukämie in verschiedenen Ländern. Die Untersuchung kommt zu dem Schluss, dass verbesserte Bedingungen der öffentlichen Hygiene mit höheren Raten kindlicher Leukämie zusammengehen. Da Coxsackie- B-Viren vornehmlich durch fäkal-orale Wege übertragen werden, unterstützt diese Arbeit den in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen zweistufigen Infektionsverlauf mit Coxsackie-B-Viren und den ursächlichen Zusammenhang von ALL und Coxsackie-B-Viren Infektionen.
In einer japanischen Studie (Watanabe et al., Kansenshogaku Zasshi, 1982, 56, 977-981) wird beispielsweise vorgestellt, dass im Zeitraum 1960-1962 noch 50% der Kinder unter einem Jahr Kontakt mit Coxsackie-B-Viren hatten. Dagegen hat- te im Zeitraum 1977-1980 keines der Kinder unter einem Jahr Kontakt zu Coxsackie-B-Viren.
• ALL als monoklonale Erkrankung der Lymphocyten:
Die ALL betrifft fast ausschließlich die Vorstufen der Lymphocyten, weshalb ein verursachendes Agens eine hohe Affinität zu Lymphocyten aufweisen muss. Der Coxsackie-B-Virus weist eine deutliche Lymphocytotropie auf. • Verringerung des ALL Risikos durch frühen Kindergartenbesuch:
Übersichtsarbeiten kommen zu dem Schluss, dass ein Zusammenhang zwischen dem Kindergartenbesuch und der Erkrankung an ALL besteht, und dass insbesondere ein früh beginnender Kindergartenbesuch, d.h. vor dem 3. Lebensmonat und zwischen dem 3. und 6. Lebensmonat, das Risiko der ALL-Erkrankung stärker vermindert als der späte Kindergartenbesuch (Ma et al., British Journal of Cancer, 2002, 86, 1419-1424 ; Urayama et al., Int J Epidemiol, 2010, 39, 718-32). Der Besuch in einer Gemeinschaftseinrichtung im ersten Jahr erhöht die Wahrscheinlichkeit eines Kontaktes und einer klinisch unbemerkten Infektion mit Coxsackie-B- Viren. Dies stellt nach dem oben beschriebenen zweistufigen Infektionsweg einen
Schutz vor ALL-Erkrankung dar.
• Saisonaler Einfluss auf ALL: Die Autoren der Übersichtsarbeit (McNaIIy et al., Brit J Haematol, 2004, 127,
243-263) stellen ein Zusammenhang zwischen dem Geburtsmonat und dem Auftreten von ALL-Erkrankungen dar. Von vier Studien über die Saisonalität des Geburtsmonats zeigen drei einen Gipfel im Februar bis April an. Lediglich eine gibt einen Gipfel im späten Sommer an.
In einer anderen Studie werden sämtliche Fälle von ALL in Nordengland zwischen 1968 und 2005 bezüglich Saisonalität der Geburt analysiert. Hier wird eine statistisch signifikante Häufung für den Geburtsmonat März für 1 bis 6 Jahre alte Kinder mit ALL aufgezeigt (Basta et al., Paediatr Perinat Epidemiol, 2010, 24, 309-18). Da in England und Dänemark die Coxsackie-B-Viren einen deutlichen Erkrankungsgipfel im dritten Quartal des Kalenderjahrs zeigen, entsprächen die ersten vier bis acht Embryonalwochen einer bezüglich des erhöhten ALL-Risikos sensiblen Phase. Dies steht in Übereinstimmung mit dem Zeitpunkt der besonderen Häu- figkeit des Auftretens von Vorstufen der Lymphopoese beim Embryo.
Des Weiteren stehen die Ergebnisse von Studien, welche die Saisonalität der ALL-Diagnosestellung beschreiben, in guter Übereinstimmung mit dem zeitlichen Gipfel von Coxsackie-B-Virus-Infektionen im dritten Quartal des Jahres.
• Space-Time-Clustering von ALL Erkrankungen:
Einige Untersuchungen betreffen die Frage nach einer signifikanten Häufung von ALL-Erkrankungen im Hinblick auf Raum und Zeit. In vielen Fällen weisen die Untersuchungen auf ein signifikantes so genanntes Space-Time-Clustering von
ALL-Erkrankungen hin. Eine Übersichtsarbeit von McNaIIy (McNaIIy et al, Int . Cancer, 2009, 124, 449-455) kommt zu dem Schluss, dass die Ergebnisse des Space-Time-Clustering und des Spatial-Clusterings der ALL-Erkrankungen konsistent für eine Reihe von ALL-Infektionen insbesondere für den„childhood-peak" sind. Space-time-clustering ist auch für Krankheitsfälle durch Coxsackie-B-Viren beschrieben.
• Einfluss von vorausgegangenen Spontanaborten auf Erkrankung an ALL: Verschiedene Arbeiten (van Steensel-Moll et al., Int J Epidemiol, 1985, 14, 555-
559; Kaye et al., Cancer, 1991, 68, 1351-1355; Yeazel et al., Cancer, 1995, 75, 1718-1727) untersuchen die Frage, ob ein Spontanabort einen Einfluss darauf hat, ob das danach geborene Kind an ALL erkrankt. Die Arbeiten kommen zu dem Schluss, dass ein Spontanabort das Risiko erhöht, dass das nächstgeborenen Kind an ALL erkrankt. Der Zusammenhang von Spontanaborten und kürzlich durchgemachten Infektionen mit Coxsackie-B-Viren wird in einer schwedischen Studie gezeigt, Hinweise auf eine Infektion mit anderen Viren finden sich nicht (Frisk, G., Diderholm, H., J Infect, 1992, 24, 141-145; Axelsson et al., J Med Virology, 1993, 39, 282-285).
• Einfluss von sozio-ökonomischen Lebensstandard und Erkrankung mit ALL: In der Übersichtsarbeit von McNaIIy (McNaIIy et al. (Brit J Haematology, 2004, 127, 243-263) wird eine positive Assoziation zwischen akuter Leukämie und höherem sozio-oekonomischen Lebensstandard festgestellt.
Der oben beschriebene zweistufige Infektionsprozess und die Tatsache, dass die Wahrscheinlichkeit des Kontaktes mit Coxsackie-B- Viren im ersten Lebensjahr bei Kindern mit hohem sozio-oekonomischen Lebensstandard gering ist, erklären eine gering höhere Rate an ALL-Erkrankungen bei Kindern mit hohem sozio- oekonomischen Lebensstandard. nische Unauffälligkeit des verursachenden Agens bei ALL-Erkrankungen:
Da bisher kein Zusammenhang der ALL mit einer viralen Erkrankung erkannt wur- de, muss das die ALL verursachende Virus sowohl bei der Mutter als auch beim
Kind nach dem ersten Lebensjahr (welches dann später an ALL erkrankt) klinisch entweder überhaupt keine Symptome verursachen oder sich unter einem unspezifischen Krankheitsbild, wie etwa einer gewöhnlichen Erkältung („common cold") oder einen akuten Gastroenteritis, abspielen. Die Mehrzahl der Coxsackie-B- Infektionen verlaufen entweder klinisch stumm oder unter dem Krankheitsbild einer gewöhnlichen Erkältung („common cold") oder einen akuten Gastroenteritis.
In einer wissenschaftlichen Studie von Greaves und Büffler (Greaves, M., Büffler, P., A., Brit J Cancer, 2009, 100, 863), wird betont, dass im Gegensatz zu den Er- gebnissen von Cardwell (Cardwell et al., Brit J Cancer, 2008, 99, 1529-1533); welche keinen Hinweis auf die„delayed-infection"-Hypothese von Greaves ergaben, der Schutz durch Infektionen im ersten Lebensjahr durchaus durch klinisch stumme, d.h. asymptomatische Infektionen verursacht werden kann. Der in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Schutz vor ALL durch eine Infektion mit Coxsackie-B- Viren im ersten Lebensjahr trifft mit der Vermutung von Greaves in sehr guter Weise zusammen, da eine Infektion mit Coxsackie-B-Viren in dem größten Teil der Fälle asymptomatisch verläuft (Danes et al., J Hy g Epidemiol Microbiol Immun, 1983, 27, 163-172). Einer, durch zytogenetische Untersuchungen belegten und allgemein akzeptierten Hypothese („double hit"-Theorie, Greaves loc. cit.) zufolge, führen mindestens zwei Ereignisse zur ALL: eine Infektion während der Schwangerschaft („first hit"), und eine folgende zweite postnatale Infekti- on („second hit"). Die oben dargelegte zweischrittige Infektion mit einem Coxsackie-B-Virus steht mit dieser„double hit"-Theorie in sehr guter Übereinstimmung. • Häufung von Missbildungen bei Kindern mit ALL:
In den Arbeiten von Miller (Miller R., W., New Engl J Med, 1963, 268, 393-401) wird auf eine geringe, aber signifikante Häufung von Missbildungen bei Kindern mit ALL hingewiesen.
Es ist bekannt, dass Coxsackie-B-Viren, welche wie beschrieben die Plazentaschranke überwinden und den Embryo infizieren können, beim Menschen in seltenen Fällen Missbildungen verursachen können. • Einfluss von anderen Viruserkrankungen im ersten Lebensjahr:
Es wurde gezeigt, dass Roseola-Infektionen, welche auch als Drei-Tage-Fieber {Roseola infantum) bekannt sind, und häufig im Säuglings- oder frühen Kleinkindalter auftreten, sowie Ohr-Infektionen, wie etwa Otitis media, im ersten Lebensjahr, das Risiko senken, an ALL zu erkranken.
Es ist bekannt, dass unter anderem auch Coxsackie-B-Viren eine Mittelohr- Entzündung {otitis media) auslösen können. Weiterhin wird beschrieben, dass Roseoloa-Infektionen {Roseoloa infantum, (normalerweise ausgelöst durch den Humanen Herpes Virus) Folge einer Coxsackie-Infektion sind. Gemäß dem oben beschriebenen zweistufigen Infektionsverlauf mit Coxsackie-B-Viren, stellt der Kontakt mit Coxsackie-B-Viren im ersten Lebensjahr einen Schutz gegen die ALL Erkrankung dar. • ALL-Epidemie Anfang der siebziger Jahre:
Ende der sechziger Jahre bis Anfang der siebziger Jahre kommt es in den Industrieländern zu einem Anstieg der Fälle von ALL, der etwa Mitte der siebziger Jahre wieder verschwindet. Zwischen 1963 und 1969 kommt es zu einer ausgeprägten Coxsackie-B- Epidemie. Der Anstieg der Leukämiehäufigkeit im ersten Lebensjahr ist zwischen 1920 und 2000 gering, der Anstieg der Leukämiefälle zwischen dem zweiten und fünften Ge- burtstag ist jedoch stark. Der geringe Anstieg der Fälle von Leukämie im ersten Lebensjahr („infant leukemia") ist wahrscheinlich lediglich Ausdruck des verbesserten Zugangs zur Diagnose, während der starke Anstieg zwischen dem zweiten und fünften Geburtstag („childhood peak") ohne jeden Zweifel auf einem echten Anstieg beruht. Der de facto aus- gebliebene Anstieg der Fälle von„infant leukemia" im Gegensatz zum„childhood peak" unterstützt in sehr guter Weise die oben dargelegte Hypothese, dass es sich bei der zweischrittigen Infektion um eine Infektion mit dem identischen Serotyp handelt: Die Infektion während des ersten Lebensjahres mit dem identischen Coxsackie-B- Virus kann deshalb nicht zu einer Erkrankung führen, da der Säugling durch die passiv übertragenen Antikörper der Mutter während des ersten Lebensjahres gegen eine Infektion mit Coxsackie-B-Viren geschützt ist. Die bei der Geburt passiv übertragenen Antikörper sind gegen Ende des ersten Lebensjahres aus dem Kind verschwunden, das Kind ist nun empfänglich gegenüber einer erneuten Infektion mit dem Coxsackie-B-Virus, mit dem es zum ersten Mal während der Embryogenese Kontakt hatte. Dies erklärt, weshalb der„childhood peak" in allen Publikationen erst nach dem ersten Geburtstag beginnt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Impfstoff beruhend auf Coxsackie-B-Viren als Arzneimittel zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL), insbesondere von akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) bei Kindern.
Insbesondere findet der Impfstoff Anwendung bei der Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie von Kindern, welche in der Altersgruppe vom zweiten bis zum fünften Lebensjahr auftritt. Unter Impfstoffen beruhend auf Coxsackie-B-Viren sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Zusammensetzungen zu verstehen, welche ein biologisch oder gentechnisch hergestelltes Coxsackie-B-Viren-spezifisches Antigen enthalten. Hierbei kommen abgetötete Coxsackie-B-Viren, Protein- und/oder Nukleinsäure-Fragmente (wie cDNA oder RNA) von Coxsackie-B-Viren und Coxsackie-B-Viren-spezifische Virengenome, denen eine Nukleotid- Sequenz codierend für Zytokine, wie Interferon-Gamma, eingefügt wurden, in Frage. Im Sinne der vorliegenden Erfindung können so genannte Tot- oder Le- bend-Impfstoffe zum Einsatz kommen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Impfstoff eine Zusammenset- zung beruhend auf Coxsackie-B-Viren und wird zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) bei Kindern als Tot-Impfstoff (z.B. inaktivierte Coxsackie-B-Viren) angewendet.
Insbesondere sind Tot-Impfstoffe beruhend auf Coxsackie-B-Viren zur Auslösung einer spezifischen Immunantwort geeignet, ohne dabei eine Erkrankung durch Coxsackie-B- Viren hervorzurufen.
Unter der Attenuierung oder Virulenzverminderung versteht man die gezielte Verminderung der Virulenz, dass heißt der Krankheitsauslösenden Eigenschaften des Erregers, wo- bei seine Vermehrungsfähigkeit (lebend-attenuiert) und seine antigenen Eigenschaften weitgehend erhalten bleiben. Man unterscheidet im Allgemeinen kälte-adaptierte Stämme, die sich nur bei Temperaturen um 25 0C vermehren können, und temperatur-sensitive Stämme, die sich nur in einem Temperaturbereich von etwa 38-39 0C vermehren können. Tot-Impfstoffe enthalten in der Regel inaktivierte oder abgetötete Erreger, die nicht vermehrungsfähig sind. Es können z.B. die folgenden Tot-Impfstoff-Typen zum Einsatz kommen:
• Inaktivierte Ganzpartikelimpfstoffe (Vollvirusimpfstoff):
Die Inaktivierung (Abtötung) der Viren erfolgt mittels chemischen Stoffen oder Stoffkombinationen, z. B. Formaldehyd, beta-Propiolacton, Psoralen, wobei die Virushülle erhalten bleibt.
• (Inaktivierte) Teilpartikelimpfstoffe:
Es erfolgt eine Spaltung der Virushülle mit Detergentien oder organischen Lösungsmitteln und ggf. eine Inaktivierung mit chemischen Stoffen.
• Untereinheit-Impfstoffe:
Die Oberfläche der Viren wird vollständig aufgelöst und spezifische Protein- Komponenten isoliert. Untereinheit-Impfstoffe sind nur wenig immunogen, besitzen dafür aber geringe Nebenwirkungen.
Neben der Möglichkeit, vollständige abgetötete (inaktivierte) oder abgeschwächte
(attenuierte) Erreger als Antigene in einem Impfstoff einzusetzen, besteht auch die Mög- lichkeit, die gewünschte Immunantwort mit Nukleinsäure- oder Protein- Fragmenten der
Erreger auszulösen. So sind in den letzten Jahren Verfahren zur Herstellung von cDNA- Impfstoffen auf der Basis von viraler oder bakterieller cDNA in der Literatur beschreiben worden. Vorteil der so genannten cDNA-Impfung ist die weitgehende Vermeidung von Nebenwirkungen der üblichen Impfmethoden. In der Literatur unterscheidet man im Allgemeinen eine aktive Immunisierung (aktive Impfung, aktiver Impfstoff) und eine passive Immunisierung (passive Impfung, passiver Impfstoff). Bei der aktiven Impfung wird künstlich eine abgeschwächte Form der Erkrankung oder eine Immunantwort durch Gabe von vermehrungsfähigen oder nicht vermehrungsfähigen Erregern erzielt. Bei der Passiv-Impfung werden Immunoglobulin-Präparate oder das Serum von aktiv immunisierten Menschen oder Tieren verabreicht (parenteral, intravenös), wobei spezifische Antikörper zur Behandlung oder Vorbeugung von Infektionskrankheiten übertragen werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Impfstoff beruhend auf Coxsackie-B-Viren als Impfstoff bzw. Arzneimittel zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL), insbesondere von akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) bei Kindern, wobei ein aktiver und/oder passiver Impfstoff eingesetzt werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere einen Impfstoff beruhend auf Coxsackie- B-Viren und ein Arzneimittel zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL), insbesondere von akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) bei Kindern, wobei ein aktiver Impfstoff Anwendung findet. Insbesondere enthält der Impfstoff ein oder mehrere Antigene ausgewählt aus abgetöteten Coxsackie-B-Viren, Protein- und/oder Nuklein- säure-Fragmenten (insbesondere cDNA-Fragmenten) von Coxsackie-B-Viren und Coxsackie-B-Viren-spezifischen Virengenomen, denen eine Nukleotid- Sequenz codierend für Zytokine, wie Interferon-Gamma, eingefügt wurde.
Der Zusammenhang zwischen dem Auftreten von ALL und dem oben beschriebenen zweistufigen Infektionsprozess mit Coxsackie-B-Viren (erst pränatal, dann nach dem ersten Lebensjahr) kann insbesondere unter Heranziehen von„Guthrie-Karten" belegt werden. Der Guthrie-Test gehört zu den weltweit angewandten Screening-Untersuchungen bei Neugeborenen, bei dem in der Regel um den 3. Lebenstag des Kindes eine Fersenblutent- nahme erfolgt. Mit diesem Blut wird dann eine Filterpapierkarte in vorgegebenen Feldern durchtränkt. Diese Trockenblutprobe wird dann hinsichtlich verschiedener Stoffwechsel- Störungen untersucht (wie etwa der Phenylketonurie). Häufig werden diese Filterpapierkarten in den Kliniken über viele Jahre hinweg aufbewahrt und können auch Jahre nach der Geburt noch für Blutuntersuchungen herangezogen werden. Es können auch Viren bzw. Viren-spezifische Antikörper in diesen getrockneten Blutproben von Neugeborenen nachgewiesen werden, wie beispielsweise der Cytomegalovirus. In Guthrie-Karten von ALL- Patienten finden sich dann gehäuft Hinweise auf eine während der Schwangerschaft durchgemachte Coxsackie-B-Viren Infektion der Mutter.
Das Auftreten von ALL bei Kindern steht in eindeutigem Zusammenhang mit dem Vorhandensein von Coxsacki-B-Viren bzw- Coxsackie-B-Viren spezifischen Antikörpern. Zudem kann hinsichtlich der verschiedenen Serotypen von Coxsackie-B-Viren unterschie- den werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Impfstoff beruhend auf Coxsackie-B-Viren (zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie) um einen Impfstoff enthaltend mindestens ein Coxsackie-B-Viren-spezifisches Anti- gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus abgetöteten (inaktivierten) Coxsackie-B- Viren, Protein-Fragmenten von Coxsackie-B-Viren und Nukleinsäure-Fragmenten (insbesondere cDNA-Fragmenten) von Coxsackie-B-Viren.
Insbesondere kann der auf Coxsackie-B-Viren beruhende Impfstoff Coxsackie-B-Virus- spezifische Antigene, insbesondere abgetötete Coxsackie-B-Viren, von mindestens einem Serotyp ausgewählt aus der Gruppe Coxsackie-Bl -Viren, Coxsackie-B2-Viren, Coxsackie- B3 -Viren, Coxsackie-B4- Viren, Coxsackie-B5 -Viren und Coxsackie-B6- Viren enthalten.
Weiterhin bevorzugt ist eine Ausführungsform, bei welcher der auf Coxsackie-B-Viren beruhende Impfstoff spezifische Antigene, insbesondere abgetötete Coxsackie-B-Viren, von mindestens einem Serotyp ausgewählt aus der Gruppe Coxsackie-B2-Viren, Coxsackie-B3 -Viren, Coxsackie-B4-Viren und Coxsackie-B5 -Viren enthält.
Vorteilhaft kann es sein, wenn der Impfstoff eine Imunisierung gegen alle sechs bekannten Serotypen des Coxsackie-B-Virus bewirkt. Bevorzugt im Sinne der Erfindung ist daher auch ein Impfstoff enthaltend eine Kombination von zwei, drei, vier oder auch mehreren Antigenen, die jeweils für einen der Coxsackie-B-Virus- Serotypen Bl, B2, B3, B4, B5 und B6 spezifisch ist. In diesem Sinne ist eine bevorzugte Ausführung der Erfindung gerichtet auf einen, auf Coxsackie-B-Viren beruhenden Impfstoff, welcher Coxsackie-B- Viren- spezifische Antigene, insbesondere abgetötete Coxsackie-B-Viren, von den Serotypen Coxsackie-Bl -Viren, Coxsackie-B2-Viren, Coxsackie-B3 -Viren, Coxsackie- B4-Viren, Coxsackie-B5- Viren und Coxsackie-B6-Viren enthält.
Bevorzugt enthält der oben beschriebene Impfstoff beruhend auf Coxsackie-B- Viren Prote- in- und/oder Nukleotid-Fragmente von Coxsackie-B-Viren mindestens eines Serotyps ausgewählt aus der Gruppe Coxsackie-B2- Viren, Coxsackie-B3 -Viren, Coxsackie-B4- Viren und Coxsackie-B5 -Viren.
Der in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Impfstoff zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie bei Kindern wird bei den Kindern bevorzugt vor Vollendung des ersten Lebensjahres, insbesondere vor Vollendung des sechsten Lebensmonats, verabreicht. Daher ist der beschriebene Impfstoff zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie zur Verabreichung bei Kindern vor Vollendung des ersten Lebensjahres, insbesondere vor Vollendung des sechsten Lebensmonats, geeignet.
Die Impfung erfolgt bevorzugt intramuskulär oder subkutan im 3., 4. und 5. Lebensmonat des Kindes, sowie in einer Auffrischungsimpfung im 11. und 18. Lebensjahr des Kindes.
Der in der vorliegenden Beschreibung offenbarte auf Coxsackie-B-Viren beruhende Impf- stoff kann in einer für Impfstoffe, insbesondere für aktive Impfstoffe bekannten Applikationsform verabreicht werden. Im Prinzip kann der erfindungsgemäße Impfstoff parenteral, wobei insbesondere intramuskuläre und subkutane Gaben in Frage kommen, verabreicht werden. Eine intramuskuläre Applikation des Impfstoffes ist bevorzugt. In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform ist der beschriebe auf Coxsackie-B-Viren beruhende Impfstoff zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie zur intramuskulären Verabreichung bei Kindern vor Vollendung des sechsten Lebensmonats geeignet. Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Verwendung eines Impfstoffes beruhend auf Coxsackie-B-Viren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie bei Kindern.
Die Methoden zur Herstellung eines auf Coxsackie-B-Viren beruhenden Impfstoffes sind dem Fachmann im Prinzip bekannt. Zur Herstellung von inaktivierten Coxsackie-B-Viren können beispielsweise Säugetier-Zellkulturen (beispielweise Affennierenzellen (z.B. Vero- Zellen), humane diploide Lungenzelllinien (WI-238, MRC5) gezüchtet und mit Coxsackieviren eines einzelnen (oder mehreren) Serotypen beimpft werden. Hierbei ist es erforderlich, auf eine strenge Standardisierung der Produktionsbedingungen (Zusammensetzung der Kulturmedien, Zelldichte, Alter der Kulturen bei Inokulation, Menge des pro Zelle überimpften Virus, Inkubationstemperatur und -dauer, Zahl der Vermehrungszyklen je Produktionsdurchgang etc.) zu achten. Insbesondere nach 48 bis 72 Stunden erfolgt die Virusernte durch Abnahme der Überstandsflüssigkeit unter sterilen Bedingungen. Diese können dann z.B. durch eine geringe Filterporengröße (z.B. von 0,22 Mikrometer) filtriert werden, um größere Zellrückstände zu entfernen. Gegebenenfalls kann das Flüssigkeitsvo- lumen der notwendigen Viruskonzentration angepasst, die Virussuspension bis zum Gebrauch eingefroren und/oder bei niedrigen Temperaturen (z.B. von etwa 4 0C) gelagert werden.
Gegebenenfalls können die so erhaltenen Viren etwa durch Hitze oder Chemikalien abge- tötet werden, oder mit Hilfe gängiger Verfahren zur Virus- Attenuierung abgeschwächt werden. Die Inaktivierung der Coxsackie-B-Viren kann beispielsweise durch Behandlung mit Chemikalien wie Formaldehyd, durch energiereiche Strahlung oder Hitzebehandlung erfolgen. Eine andere Herstellungsmethode des Impfstoffes beruht auf der Einfügung der Kodierungssequenzen von Zytokinen (wie Interferon-Gamma) in das Virus-Genom des Coxsackie-B-Virus. Eine Impfung mit einem solcherart veränderten Coxsackie-B3-Stamm hat sich bei der tierexperimentellen Verhütung von Coxsackie-B3 -induzierten Myokarditi- den sehr wirkungsvoll erwiesen.
Zur endgültigen Formulierung können Aliquots der Virussuspension mit einem geeigneten Stabilisator, insbesondere mit Sorbitol, vermischt werden, um die empfohlene Dosierung zu erzielen, wobei virale Bestandteile in einer Konzentration vorhanden sein sollten, die eine ausreichende Immunantwort im menschlichen Körper hervorrufen. Die Dosierung des Impfstoffes richtet sich nach der Applikationsform und ist dem Fachmann im Prinzip geläufig.
Zusätzlich zu dem Coxsackie-B-Viren spezifischen Antigen, welches die gewünschte Immunantwort im menschlichen Körper auslöst, können die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Impfstoffe pharmazeutisch verträgliche Träger und Hilfs- und Zusatzstoffe enthalten. Eingesetzt werden können etwa Phenoxyethanol, Magnesiumchlorid, Alumini- umsalze, Kohlenhydrate wie Saccharose, Konservierungsmittel wie Antibiotika, Thiomersal, Phenol, Formaldehyd.
Der anwendungsfertig formulierte Impfstoff kann beispielsweise in Ampullen abgefüllt und bis zum Gebrauch gelagert werden.
Die vorliegende Anmeldung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes beruhend auf Coxsackie-B-Viren zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) bei Kindern, wobei Coxsackie-B-Viren ausgewählt aus mindestens einem Serotyp mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vermischt werden.
Der Begriff „Chromosomenpräparation" wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich auf die Darstellung von Chromosomen bzw. deren Aberrationen. Chromosomen können aus allen teilungsfähigen Geweben, dem so genannten Probenmaterial präpa- riert werden, z.B. peripheres Blut, Gewebe (Fibroblasten), Fruchtwasser, Chorionzotten, Knochenmark. Bevorzugt eignen sich zur Chromosomendarstellung Lymphozyten aus peripherem Blut, da die Entnahme von venösem Blut einfach und die Mitoseausbeute bei der Kultivierung sehr gut ist. Da sich die im Blut befindlichen Lymphozyten normalerweise aber nicht teilen, müssen sie in der Kultur durch ein Mitogen (bsp. Colchizin) zur Tei- lung stimuliert werden. Die Techniken der Chromosomenpräparation sind variabel und allgemein bekannt, basieren aber grundsätzlich auf den folgenden Schritten: ggf. Anlegen einer Kultur mit dem speziellen Kulturmedium und in einem dafür geeigneten Kulturbehältnis; ggf. Kulturdauer abwarten, ggf. Wechsel des Kulturmediums und Kontrolle der Mitosenanzahl; Stoppen des Wachstums mittels Colchizin (Spindelgift); Behandlung der vitalen Zellen mit hypotoner Lösung; Fixierung mit einem Essigsäure-Methanol-Gemisch; ggf. Aufbringen der Zellen auf einen Objektträger; Sichtbarmachung durch Färben der Präparate, oder Anregung von Fluoreszenz bei FISH. Um auch kryptogene Chromosomenaberrationen, wie beispielsweise Translokationen von Chromosom auf Chromosom zu erfassen (bei ALL Translokation von Chromosom 12 auf 21 verwendet man die Fluoreszenz- in-situ-Hybridisierung.
Der Begriff„Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung" (FISH), wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich auf eine molekularbiologische Methode, um Nukleinsäuren, also RNA oder DNA, in Geweben, einzelnen Zellen oder auf Metaphase-Chromosomen mittels Fluoreszenz nachzuweisen. Dabei wird eine künstlich hergestellte Sonde aus einer Nukleinsäure eingesetzt, die über Basenpaarungen an die nachzuweisende Nukleinsäure hybridisiert, also bindet. Die Bezeichnung„in situ" wird verwendet, da der Nachweis direkt in der jeweiligen Struktur durchgeführt wird. Grundsätzlich kann die Anzahl, Lage und Aktivität von Genen bestimmt werden oder auch gesamte Chromosomen mittels chromosomaler- in-situ-Suppressions (CISS-) Hybridisierung markiert werden, sowie gesamtgenomische DNA als Sonde eingesetzt werden, genomische-in-situ-Hybridisierung (GISH). Der zugrunde liegenden Mechanismus von FISH lässt sich wie folgt beschreiben: DNA ist chemisch aufgebaut als linearer Polyester aus Desoxyribose und Phosphorsäure mit heterozyklischen Stickstoffbasen in der Seitenkette, so genannter Einzelstrang. Zwei solcher DNA-Einzelstränge können durch Wasserstoffbrückenbindungen eine Doppelhelix ausbilden. Wasserstoffbrücken der Doppelhelix können durch Erwärmung auf Temperaturen um ca. 800C oder durch Zugabe organischer Lösungsmittel wie Formamid in zwei Einzelstränge getrennt werden. Die Temperatur, bei der diese Separation des Doppelstranges stattfindet, wird als Schmelztemperatur bezeichnet. Nach einer Separation können zwei DNA Einzelstränge wieder spezifisch zum Doppelstrang rekombinieren, wenn die Basensequenz der Einzelstränge zueinander komplementär ist. Diese spezifische Rekombination von DNA-Einzelsträngen verschiedener Herkunft zum Doppelstrang nennt man Hybridisierung.
Eine Hybridisierungsstelle kann dadurch nachgewiesen werden, dass man an ein DNA- Molekül einen Fluoreszenzfarbstoff anbindet und diesen nach erfolgter Hybridisierung durch eine geeignete Lichtquelle zur Fluoreszenz anregt. Setzt man als Ziel-DNA ein biologisches Präparat ein, so kann man durch diese spezifische Rekombination eine ganz bestimmte DNA-Sequenz z.B. in einem Chromosom oder in einem Zellkern nachweisen. Diese spezielle Hybridisierungsvariante wird Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) genannt.
Durch die nachfolgenden Beispiele wird die vorliegende Erfindung näher beschrieben.
Beispiel 1 Herstellung eines auf inaktivierten Coxsackie-B-Viren beruhenden Impfstoffes Der Herstellungsprozess eines inaktivierten Coxsackie-B-Impfstoffes umfasst die folgenden Schritte:
Herstellung von Säugetier-Zell-Kulturen;
Virus- Saat/ Virus-Inokulation;
- Virus- Wachstum (inkubiert bei 37°C);
Virus-Ernte; Klärung; Konzentrierung; Aufreinigung durch Gelpermeationschromatographie; und Ionenaustauschchromatographie;- Filtration;
Hinzufügen von Impfstoffe andere Serotypen;
- endgültige Formulierung.
Das Coxsackie-B-Virus wird aus dem Stuhl eines frisch an ALL-erkrankten Kindes gewonnen und zum Beispiel in Vero-Zellen (normale Nierenzellen von der Grünen Meerkatze) vermehrt. Nach Mikrocarrier-Kulturen wird das Medium entfernt, die Zellen werden gewaschen und mit der Aussaat infiziert (multiplicity of infection, MOI).
Nach Beimpfung werden die Wirtszellen bei 37°C für 72 bis 96 Stunden inkubiert. Zur Ernte wird die Virus-Flüssigkeit von den Microcarrier entfernt (z.B. durch Sedimentierung oder durch ein Spezialfilter). Es folgt ein grober Reinigungsschritt, um die Mehrzahl der kontaminierenden Zellen zu entfernen. Anschließend erfolgt die Feinreinigung durch Chromatographie. Im ersten groben Reinigungsschritt wird als erstes die Virus-Flüssigkeit geklärt, um den groben Zell-Debris zu entfernen. Dabei wird eine Serie unterschiedlicher Filter benutzt, wobei der letzte Filter einen 0,2 μm Filter darstellt. Die so vorgeklärte Virussuspension wird dann durch Ultrafiltration (cut off von 100 kD) konzentriert, um das Volumen der Flüssigkeit zu reduzieren.
Bei der chromatographischen Aufreinigung können unterschiedliche Prinzipien angewendet und kombiniert werden; zum Beispiel eine Trennung beruhend auf dem Molekulargewicht des Materials durch Gelfiltration sowie eine Trennung beruhend auf der Ionenbela- düng durch Ionenaustausch-Chromatographie. Der Antigengehalt der Flüssigkeit wird überwacht. Dazu wird die Konzentration von kontaminierenden Proteinen nach jedem Schritt überwacht, um die Übereinstimmung des gereinigten Produktes zu überwachen. Da Zelllinien für die Produktion dieses Impfstoffes verwendet werden, ist die Eliminierung von Nukleinsäuren von besonderer Bedeutung. Der DNA-Clearance-Faktor nach dem letz- ten Reinigungsschritt muss 108 betragen, was bedeutet, dass das Endprodukt weniger als 10 pg DNA pro Dosis enthält.
Im nächsten Schritt erfolgt die Inaktivierung der gereinigten Virussuspension, wobei im
Sinne von Qualität und Sicherheit des Impfstoffes sichergestellt sein muss, dass keine Ie- benden Viren im Endprodukt vorhanden sind. Gleichzeitig muss allerdings bei dem Inakti- vierungsprozess, zum Beispiel bei einem chemischen Inaktivierungsprozess, die Antigenität der Virus-Partikel aufrechterhalten werden. Die Inaktivierung findet am Ende des Reinigungsprozesses statt, um ein Crosslinking von Verunreinigungen mit dem Viruspartikeln zu vermeiden. Die chemische Inaktivierung kann beispielsweise mit Formaldehyd erfolgen, was etwa zur Inaktivierung von anderen Enteroviren wie etwa den Poliomye- litis- Viren gesetzt wird.
Vor der chemischen Inaktivierung wird die gereinigte Virus-Suspension durch Filtration sterilisiert. Diese Filtrationssterilisierung wird nicht länger als 27 Stunden die zur Inaktivierung erforderliche Formaldehyd-Menge unter aseptischen Bedingungen zur gereinigten und sterilisierten Virus-Suspension hinzugefügt. Danach wird diese Mischung bei 37°C für 6 Tage inkubiert. Die Suspension wird dann ein zweites Mal gefiltert und erneut inkubiert (6 bis 9 Tage). Inaktivierungstemperatur: 37°C, Formaldehydkonzentration in Endverdünnung 1 : 4000, pH des Mediums 7.0. Vor der endgültigen Formulierung des Impfstoffes wird die inaktivierte Virus-Suspension bei 4°C gelagert. Während dieser Zeit werden Proben entnommen, um die komplette Vi- rusinaktivierung zu bestimmen. Die oben beschriebenen Herstellungsschritte werden für alle sechs Serotypen des Coxsackie-B-Virus in ähnlicher Weise durchgeführt. Nach der Überprüfung des Inaktivierungsschrittes werden die monovalenten Coxsackie-B- Impfstoffe der Serotypen gepoolt.
Beispiel 2: Tierexperimentelle Versuche Schwangere Mäuse werden inteaperitoneal mit einem bestimmten Coxsackie-B-Virus Stamm inokuliert und die Hälfte von deren Nachkommen mit dem identischen Stamm (erste Gruppe), die übrigen 50% werden mit einem Coxsackie-B-Virus Stamm inokuliert, der einem anderen Serotyp zugehörig ist (zweite Gruppe). Es kann gezeigt werden, dass in der ersten Gruppe eine lymphatische Leukämie auftritt, in der zweiten nicht.
Beispiel 3 : Viroserologische Untersuchungen a) Virusserologie bei Müttern
Mütter von ALL-Patienten und Kontroll-Müttern werden Blutproben entnommen und die Häufigkeiten von Coxsackie-B-Infektionen vergleichend bestimmt. Es kann gezeigt wer- den, dass der Anteil der Mütter mit Coxsackie-B-Viren Infektionen bei den Müttern von ALL-Patienten höher ist als in der Kontrollgruppe. b) Virusnachweis in Guthrie-Karten
Es werden die Häufigkeiten von Coxsackie-B-Infektionen bei ALL-Patienten und in einer Kontrollgruppe anhand von Guthrie Karten bestimmt. Es kann nachgewiesen werden, dass IgM-Antikörper, die auf eine kürzlich durchgemachte Coxsackie-B-Infektion hinweisen, mit höherer Häufigkeit in Guthrie-Karten von ALL-Patienten zu finden sind. Dies unterstützt die Rolle der Coxsackie-B-Viren beim„ersten Schlag", d.h. in der ersten Stufe des beschriebenen zweistufigen Infektionsverlaufes. c) Virusserologie bei ALL-Patienten
Es wird die Häufigkeit von Coxsackie-B-Infektionen, insbesondere durch den Nachweis von IgM-Antikörper, bei ALL-Patienten und in einer Kontrollgruppe bestimmt. Es kann nachgewiesen werden, dass IgM-Antikörper mit höherer Häufigkeit in ALL-Patienten zu finden sind. Dies unterstützt die Rolle der Coxsackie-B-Viren beim„zweiten Schlag", d.h. in der zweiten Stufe des beschriebenen zweistufigen Infektionsverlaufes. d) Virusserologie im Stuhl von ALL-Patienten
Es wird die Häufigkeit von Coxsackie-B-Viren im Stuhl von ALL-Patienten und in einer Kontrollgruppe bestimmt. Es kann nachgewiesen werden, dass Coxsackie-B-Viren mit größerer Häufigkeit in ALL-Patienten zu finden sind. Dies unterstützt die Rolle der Coxsackie-B-Viren beim„zweiten Schlag", d.h. in der zweiten Stufe des beschriebenen zweistufigen Infektionsverlaufes e) Virusnachweis im Lymphocyten von ALL-Patienten
Nachweis von Coxsackie-B-Viren oder Teilen von diesen in den Lymphocyten von ALL- Patienten und von Kontrollkindern: In den Lymphocyten von ALL-Patienten kann mit einer größeren Häufigkeit der Nachweis für Coxsackie-B-Viren erbracht werden. Dies unterstützt die Rolle der Coxsackie-B-Viren beim„zweiten Schlag", d.h. in der zweiten Stufe des beschriebenen zweistufigen Infektionsverlaufes Beispiel 4: Biologische Evidenz Biologische Evidenz ergab die Testung, ob menschliche Lymphoblasten aus Nabelschnurblut gegenüber einer Exposition mit Coxsackie B-Viren in vitro mit solchen Chromosomenaberrationen reagieren, wie sie in der Routinediagnostik bei Patienten mit ALL des Kindes gefunden werden, und ob eine Exposition mit Coxsackie A- Viren nicht zu solchen für die Prädisposition zur ALL notwendigen Chromosomenaberrationen führt.
Es wurden Proben von menschlichem Nabelschnurblut der Firma PromoCell, Heidelberg, verwendet. Die Proben wurden im Brutschrank bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 kultiviert, dann mit einer bestimmten Menge Coxsackie B-Viren, respektive Coxsackie A- Viren be- impft und weiter kultiviert. Dann wurde mit PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung) aufgefüllt und für 10 Minuten bei 778xg zentrifugiert. Der Buffy-Coat wurde abgenommen, die Zellen gewaschen und in den Kulturansatz mit Phythaemagglutinin gebracht.
A) Die Chromosomenpräparation basiert auf der Anreicherung von Metaphasezellen durch Arretierung der Zellen in der Mitose durch Zugabe des Spindelgiftes Colchizin. Durch
Behandlung der noch vitalen Zellen mit hypotoner Lösung erfolgt eine durch Osmose bedingte Schwellung der Zellen, die im Anschluss mit einem Gemisch aus Methanol und Essig fixiert und auf den Objektträger aufgebracht werden. Dann erfolgt die Analyse der Chromosomen, bzw. deren Aberrationen.
Ergebnis zu A: etwa 70 % mit vorliegenden ALL spezifischen Chromosomenaberrationen wurden gefunden.
B) Zur Erfassung kryptogener Chromosomenaberrationen wurde die Fluoreszenz-in-situ- Hypbridisierung (FISH) erforderlich. Dies betrifft insbesondere die häufigste Chromosomenaberration der ALL, nämlich Translokation von Chromosom 12 auf 21.
Ergebnis: Häufigkeit: in 15 % wurde Translokation von Chromosom 12 auf 21 gefunden.

Claims

Patentansprüche
1. Impfstoff beruhend auf Coxsackie-B-Viren zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) .
2. Impfstoff beruhend auf Coxsackie-B-Viren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie von Kindern handelt, welche bei Kindern in der Altersgruppe vom zweiten bis zum fünften Lebensjahr auftritt.
3. Impfstoff beruhend auf Coxsackie-B-Viren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Impfstoff enthaltend mindestens ein Antigen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus abgetötete Coxsackie-B-Viren, Protein-Fragmenten von Coxsackie-B-Viren und cDNA-Fragmenten von Coxsackie- B-Viren handelt.
4. Impfstoff beruhend auf Coxsackie-B-Viren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Impfstoff enthaltend abgetötete Coxsackie-B-Viren von mindestens einem Serotyp ausgewählt aus der Gruppe Coxsackie-Bl -Viren, Coxsackie-B2- Viren, Coxsackie-B3 -Viren, Coxsackie-B4-
Viren, Coxsackie-B5- Viren und Coxsackie-B6-Viren handelt.
5. Impfstoff beruhend auf Coxsackie-B-Viren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Impfstoff enthaltend abgetötete Coxsackie-B-Viren von mindestens einem Serotyp ausgewählt aus der Gruppe
Coxsackie-B2- Viren, Coxsackie-B3 -Viren, Coxsackie-B4- Viren und Coxsackie-B5- Viren handelt.
6. Impfstoff beruhend auf Coxsackie-B-Viren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, da- durch gekennzeichnet, dass es sich um einen Impfstoff enthaltend abgeschwächte und/oder abgetötete Coxsackie-B-Viren von den Serotypen Coxsackie-Bl -Viren, Coxsackie-B2- Viren, Coxsackie-B3 -Viren, Coxsackie-B4- Viren, Coxsackie-B5- Viren und Coxsackie-B6-Viren handelt.
7. Impfstoff beruhend auf Coxsackie-B-Viren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Impfstoff enthaltend Protein- und/oder Nukleotid-Fragmente von mindestens einem Coxsackie-B-Viren-Serotyp ausgewählt aus der Gruppe Coxsackie-Bl -Viren, Coxsackie-B2- Viren, Coxsackie-B3 -Viren, Coxsackie-B4-Viren, Coxsackie-B5 -Viren und Coxsackie-B6-Viren handelt.
8. Impfstoff beruhend auf Coxsackie-B-Viren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie zur Verabreichung bei Kindern vor Vollendung des ers- ten Lebensjahres geeignet ist.
9. Impfstoff beruhend auf Coxsackie-B-Viren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie zur Verabreichung bei Kindern vor Vollendung des sechsten Lebensmonats geeignet ist.
10. Impfstoff beruhend auf Coxsackie-B-Viren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Impfstoff zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie zur intramuskulären oder subkutanen Verabreichung bei Kindern vor Vollendung des sechsten Lebensmonats geeignet ist.
11. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs beruhend auf Coxsackie-B-Viren zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie bei Kindern, wobei inaktivierte Coxsackie-B-Viren ausgewählt aus mindestens einem Serotyp mit einem pharmazeu- tisch verträglichen Träger gemischt werden.
12. Verwendung eines Impfstoffes beruhend auf Coxsackie-B-Viren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Vorbeugung von akuter lymphoblastischer Leukämie bei Kindern.
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