EP1771577A2 - Verfahren zum bestimmen der h[ufigkeit von sequenzen in einer probe - Google Patents

Verfahren zum bestimmen der h[ufigkeit von sequenzen in einer probe

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EP1771577A2
EP1771577A2 EP05776036A EP05776036A EP1771577A2 EP 1771577 A2 EP1771577 A2 EP 1771577A2 EP 05776036 A EP05776036 A EP 05776036A EP 05776036 A EP05776036 A EP 05776036A EP 1771577 A2 EP1771577 A2 EP 1771577A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sample
sequence
frequency
predetermined sequence
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05776036A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfgang Mann
Christoph Gauer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beckman Coulter Inc
Original Assignee
Advalytix AG
Alopex GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Advalytix AG, Alopex GmbH filed Critical Advalytix AG
Publication of EP1771577A2 publication Critical patent/EP1771577A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the frequency of a predetermined sequence or of several identical or nearly identical (homologous) sequences of the sample to the predetermined sequence.
  • Huntington Disease A particular subject (CAG) occurs in cascade in more than 37 copies. The predisposition to disease education increases with the number of repetitions of this 5 motive.
  • Other examples of unstable human trinuclide sequences are Kennedy syndrome or spinocerebral ataxia 1.
  • molecular diagnostics involves the quantification of sequence segments, ie, the number of times that a predetermined sequence is contained in a sample.
  • Chromosome-specific probe molecules for in / ⁇ t / hybridizations by FISH (fluorescence in situ hybridization) method are known from US 5,817,462. Through various combinations of different fluorophores all human chromosomes can be detected simultaneously.
  • the chromosomes to be analyzed are brought into contact with dye-labeled hybridization probes, so that sequence-complementary sections can be found. After the sequence-specific hybridization, a washing step follows and then the fluorescence signals of the cell are evaluated under a fluorescence microscope. If a fluorescence signal is present, the sequence is also present. It can e.g. be concluded on the presence of a complete chromosome. If no fluorescence signal is present, either the chromosome is missing or there is a microdeletion for the area of the probes.
  • FISH FISH, the number of copies of several different sequences within a genome can be determined in parallel today, which differ in the evaluation by the fluorescent dye used. The number is limited by the number of simultaneously usable fluorescent dyes. Typically, cell populations are examined that all have the same genetic status.
  • CGH comparative genomic hybridization
  • WO 00/24925 Karyotyping Means and Methods
  • a patient DNA is labeled with a fluorescent dye (eg red)
  • a reference DNA with a second dye (eg green).
  • Equal amounts of the various DNA populations are mixed and hybridized against a chromosome spread on a glass surface. Complementary strands will compete for the attachment sites on the chromosome sections. If the sequence segments in patient DNA and reference DNA are the same, a ratio of 1: 1 between green and red will be established at the corresponding hybridization site of the chromosome.
  • a particular embodiment of the method is the matrix CGH (chip or array format), in which instead of a chromosome spread, the gene sections are present in the form of discrete measurement points of a DNA array. Again, an intensity comparison of two hybridization signals is made.
  • the sample For the CGH, the sample must either be amplified (e.g., by PCR) or a multiplicity of nominally identical cells must be present.
  • the quantitative real-time PCR method is in principle suitable for detecting the smallest amounts of nucleic acids (in principle a copy of a
  • Endocrinol. 103: 150-155 The method is used for routine diagnostics. However, the amount of starting material can not be reduced arbitrarily, since with a few starting molecules (10-100) than
  • US Pat. No. 6,440,706 B1 discloses a method for determining the relative frequency of the sequences in a sample, which is referred to as digital amplification or digital PCR.
  • the sample is diluted to such an extent and distributed over a large number of reaction vessels that no more than a single molecule of one of the sequences to be investigated is present in a reaction vessel.
  • the sample distributed over several reaction vessels is then filled with several primers amplified, wherein the primers are each specific for one of the sequences and are provided with a specific marker. After amplification, the marker incorporated in the amplificate detects in which reaction vessel which of the sequences was present.
  • WO 2004/027089 Another method which makes it possible to determine the relative frequency of sequences is known from WO 2004/027089. For example, in this method, it should be determined whether one of several delineate subsets (i.e., separate nucleic acids or sequences) of a genetic material occurs more frequently or less frequently than the remaining delineatable subsets in a sample.
  • a specific embodiment of this prior art method involves determining the relative abundance of individual chromosomes in a cell, e.g. to determine if aneuploidy is present.
  • a single cell amplification e.g.
  • the invention has for its object to provide a method for determining the frequency of a predetermined sequence or identical or nearly identical (homologous) sequences to the predetermined sequence of a sample that is reliably, simply and inexpensively executable even with a small number of sequences of the sample ,
  • the method according to the invention for determining the frequency of a predetermined sequence or identical or nearly identical (homologous) sequences in a sample comprises the following steps: - carrying out one or more amplification reactions, with which several target sections of the sequence or sequences of the sample can be amplified to an amplificate Detecting whether certain target sections of the sequence of the sample have been amplified, and Determining the frequency of the sequence (s) in the sample on the basis of
  • This method of determining the frequency n of a predetermined sequence or sequences identical or nearly identical to the predetermined sequence in a sample comprises the steps of:
  • Amplification reactions is dependent on the frequency n of the predetermined sequence in the sample
  • step (d) detecting the amplified target portions from step (c) and determining the number of successful amplification reactions; (e) determining the frequency n of the predetermined sequence contained in the sample.
  • the frequency n of the predetermined sequence contained in the sample is performed by comparison with one or more controls in which the predetermined sequence exists at a known frequency.
  • the controls may be either controls in parallel with the method of the present invention using the same reaction conditions for the parallel control samples as for carrying out the amplification reaction (s) with the sample. It is also possible to subject the control samples, independently of the sample, to a method according to the invention and to create validated data or reference data which serve as controls for the comparison with the sample.
  • multiple targeting portions of the original sequences can be amplified by using multiple primer pairs or combinations of primers, each specific for a particular target portion or a few particular target portions of the sequence, or using primers specific for a variety of particular target portions.
  • primer includes not only single primers but also primer pairs (ie, each a forward and a second primer) a reverse primer) and primer combinations (more than one each forward and reverse primer for a particular target segment).
  • PCR methods employing a plurality of particular target amplifying primers are referred to as IRS-PCR (Inter-Repetitive Sequence-PCR) and WGA-PCR (Whole-Genome-Amplification-PCR), i. the primers are nonspecific in that they amplify a variety of different sequences.
  • the inventors of the present invention have found that in amplifying a plurality of different distinct target portions of a sequence, the number of amplified different target portions depends on the number of sequences originally present in the sample. The smaller the number of sequences present in the sample, the lower the number of different target sections amplified therefrom.
  • each amplification has a certain likelihood, that is, that each amplification is not performed with absolute certainty.
  • a competition between the amplification reactions of the individual different sections such that, if only one or a few of the predetermined sequences are present in the sample material, less of the individual different sections will be amplified than if a large number of sequences were to be amplified ,
  • the efficiency depends on a variety of factors, for example the choice of primers, the length of the sequence to be amplified and the other reaction conditions, e.g. in a PCR the
  • the efficiency of the amplification should be set to an intermediate value , eg in the range of 0.1 to 0.9, preferably 0.2 to 0.8, preferably 0.3 to 0.7, preferably 0.4 to 0.6 and most preferably about 0.5.
  • the efficiency of the amplification should be within a range that provides a statistically significant indication of the absolute quantity of sequences originally present, i. Nucleic acid molecules, can be made.
  • the invention's suitable amplification is typically in the range of 0.5 to 1.
  • the actual probability of amplification of a particular segment with a small number of start copies of the sequence depends on the amount of starting material, i. the number of predetermined sequences in the sample, and can basically cover the entire possible range of 0 to 1.
  • the original templates i. the original sequence from which the target segments are to be amplified is present only in low copy numbers, e.g. in the range of 0, 1, 2, 3,
  • each amplification reaction has a certain probability of error, it is very difficult to distinguish between different samples containing different numbers of templates for the amplification reactions using prior art methods.
  • a sample may contain two sequences from which particular target portions are to be amplified, and a second sample may contain three of these sequences from which certain target portions are to be amplified. It has not hitherto been possible with amplification methods of the prior art, based on the results of the amplification reactions, to deduce the number of original templates, ie the frequency of the sequences originally present in a sample, if the numbers are in this small range.
  • n is in the range of 0-100, preferably 0-30, preferably 0-10, preferably 0-5.
  • the method of the present invention thus provides a quantitative indication of the copy number of the sequence present in a sample.
  • amplification reactions are carried out to several different target segments on the sequence to amplify an amplificate. If the predetermined sequence from which the plural target portions are to be amplified is present in only a very small copy number, and the amplification efficiency is less than 1, there is a high probability that not all of the selected target portions will actually be amplified in the amplification reaction, even if this is done over several cycles.
  • n 0 98 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
  • n 1 2 13 24 57 3 1 0 0 0 0
  • n 2 0 0 0 0 3 40 35 20 2
  • n 0 95 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
  • n 1 0 0 3 20 44 30 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0
  • n 0 98 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
  • n 1 0 1 14 22 40 20 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
  • n 2 0 0 0 0 0 0 3 10 30 32 15 7 3
  • the goal of the optimization of the counting method according to the invention is a safe To distinguish the copy numbers n in the desired area.
  • the PCR conditions and, if appropriate, the primers must be optimized accordingly.
  • the parameters obtained can then be added to the kit according to the invention and serve the user to interpret his results.
  • Table 4 shows how the statistical certainty of the statement increases as the number of independently examined results is increased. A normal distribution is used:
  • the method according to the invention is therefore also particularly suitable for determining the frequency of a small number of sequences, the number of which is preferably in the range from 0 to 10.
  • the number of independent PCR reactions m and the PCR conditions can be set such that the reliability of the result is optimized to the expected number of sequences.
  • the sample material Preferably, only the genome of a single cell is used as the sample material, it being possible with the method according to the invention to determine with certainty whether the predetermined sequence is absent or present once or twice or three times or four times or five times etc.
  • the method according to the invention is also particularly suitable for polar body analysis.
  • the predetermined sequence may e.g. It may also be a fragment of a chromosome or part of a chromosome. However, the predetermined sequence may also be a gene or a larger sequence segment.
  • the method according to the invention can be used for any kind of nucleic acids and nucleic acid sequences, e.g. also for plasmids and other artificial sequences. The embodiments described below by way of example are therefore not to be construed restrictively, but they are suitable for any of quantitative detection of nucleic acid sequences in small numbers in the original sample.
  • the nucleic acid sequence may be a DNA, RNA, mRNA, cDNA or genomic DNA.
  • the method according to the invention is suitable for determining the number of chromosomes in a single cell, ie the method is useful for detecting the presence of aneuploidy.
  • the method according to the invention can be carried out in several embodiments.
  • a single cell amplification is carried out with specific primers. It is not necessary in this case to first connect the cell to a WGA, i. to undergo a non-specific amplification.
  • a WGA is first performed to nonspecifically amplify the nucleic acid material of a single cell or a few cells. Subsequently, the specific amplification according to claim 1 is carried out. Also in these series-connected two amplification reactions, e.g. PCRs, the number of amplicons depends on the number of copies of the sequences to be counted originally in the sample. Tables are then determined experimentally for the overall process analogous to Tables 1 to 3, and based on this, the user can deduce the copy number from his samples. Here, too, a certain probability distribution arises for the presence or absence of the amplificates.
  • the cell is subjected to an amplification reaction with specific primers or corresponding primer pairs / primer combinations, the primers or pairs of primers being selected so that a number of specific and specific target segments can be amplified for each chromosome.
  • the number m of the target portions to be amplified is preferably at least 4, more preferably at least 6, more preferably at least 8. More target portions may also be selected per chromosome, eg 10, 12, 14, 16, 20, 30 or even more , Here, however, it is up to the skilled person to select an appropriate number of target sequences per chromosome.
  • the number m of target sequences specific to each chromosome should be large enough to be statistically distributed the successful and unsuccessful amplification reactions at the end of a statement can be made about the originally present numbers of template molecules.
  • the numbers of specific target sections per chromosome m should not be too high, so that the number of primers or primer pairs used does not exceed a reasonable level.
  • the person skilled in the art can itself select the number m of target sections to be amplified per chromosome, depending on the analysis and amplification method, and also determine the corresponding amplification conditions.
  • control experiments are performed wherein the control samples are selected from each cell having a known number n of nucleic acid molecules, e.g. a cell in which the nucleic acid is not present at all, as control 0, a cell in which the nucleic acid is once present, as control 1, etc.
  • This first embodiment of the present invention is particularly suitable for detecting chromosomal numbers in individual cells.
  • the method is suitable for Polismechen analyses, wherein a Polianuchen can have a haploid or diploid chromosome set.
  • a Polianuchen can have a haploid or diploid chromosome set.
  • Each of the target segments preferably occurs only once on a particular chromosome and is thus specific.
  • the amplification reactions do not always yield an amplificate, ie that some of the m target segments per chromosome are not amplified and are subsequently undetectable.
  • the conditions may be adjusted such that, if only one chromosome is present, only four of the eight target segments of the particular chromosome will be amplified (by statistical means). As a result, this means that subsequent detection with appropriate probes gives a result of 4/8. Having previously set the amplification efficiency to a value of 0.5 using control samples, one can conclude from the conclusion 4/8 that the chromosome was simply present in the sample.
  • Example 1 can be used to examine whether a polar body contains chromosome 2 once or twice. The question of whether chromosomes are present once or twice in a polar body is for the
  • the method according to the invention is particularly suitable for determining the frequency or counting of a small number of a predetermined sequence, e.g. less than 20, less than 10, preferably less than 5 or 3, since the statistical spread of the number of successfully amplified sequence sections is particularly pronounced with a small number of predetermined sequences in the sample.
  • a predetermined sequence e.g. less than 20, less than 10, preferably less than 5 or 3, since the statistical spread of the number of successfully amplified sequence sections is particularly pronounced with a small number of predetermined sequences in the sample.
  • Example 1 the ⁇ 2 test is used as the statistical method Service.
  • other statistical methods are also suitable for evaluating the amplification results, such as mean comparison (t-test, F-test), variance analysis methods (ANOVA, MANOVA), multi-field ⁇ 2 tests or hierarchical loglinear methods.
  • amplification conditions based on statistical distribution of control samples of known numbers n of starting nucleic acids (templates) such that, due to the statistical distribution of positive i. successful, and negative, i. unsuccessful in inferring amplification reactions from the number of amplified target segments compared to the number (m) of preselected target segments on the number (n) of nucleic acids originally present.
  • the frequency tables (Tables 1, 2, 3) then refer to the combination of the two amplifications.
  • Example 1 An example of this second embodiment is given in Example 1.
  • any amplification method is suitable for amplifying the sample with which several different predetermined sections of a sequence to be detected are amplified.
  • a single primer as in Example 1 can be used.
  • the amplicons may e.g. be analyzed by electrophoresis, a hybridization analysis on a DNA array, a bead system or other optical measurement, electrical measurement or electrochemical measurement.
  • the methods 1-3 can also be carried out with a few nominally identical cells, the number of which is preferably known, e.g. ⁇ 10.
  • a WGA amplification is performed, which corresponds to the WGA amplification of the embodiment described above.
  • Such single cell amplification is also referred to as statistical amplification.
  • the sections are detected without further amplification by complex hybridization.
  • a complex hybridization is understood to mean a process in which several probes are present at the same time, as is the case with DNA arrays or bead systems.
  • a multiplex PCR is performed. This is a PCR with several specific primer pairs that are run simultaneously in a reaction vessel. With each primer pair, preferably exactly one segment of the sequence is amplified. With such a multiplex PCR, it is expedient to amplify two to ten portions simultaneously. With a larger number of sections problems arise because then the amplifications are too unspecific.
  • Variant 4 summarizes the information about the genetic material of some nominally identical cells in a sample.
  • the genetic material of some nominally identical cells is first investigated independently of each other in different reaction vessels with a specific PCR that amplifies exactly one section. Thereafter, the sections are detected without further amplification (variant 5) or with further amplification (variant 6).
  • the method of the present invention is particularly suitable for analyzing the genome of a single cell (e.g., a polar body, fetal maternal fetal cells, etc.).
  • the frequency of a predetermined sequence in a sample can be determined.
  • the predetermined sequence may be multiple in separate molecules in the sample. However, it can also be formed several times on a strand.
  • the method according to the invention can thus count a predetermined sequence which occurs several times on a strand as well as a predetermined sequence which is present in the form of separate molecules.
  • the sequence to be determined only has to be sufficiently long so that several sections can be amplified independently of one another.
  • the length of the predetermined sequence is at least 100 bases, preferably a few 100 bases.
  • the frequencies of several different predetermined sequences can be determined at the same time, whereby here too the different sequences can be formed on different strands or on the same strand. On the same strand, the different sequences may overlap.
  • relative frequencies of a predetermined sequence of different samples can be determined.
  • the method according to the invention can also be validated by a series of experiments such that the frequency of the presence or absence of the particular sections in the amplificate permits a statement about the absolute number of predetermined sequences of a sample.
  • the method of the invention can be used to determine the frequency of sequences that are on a common strand, as well as to determine the frequency of sequences that are on different strands.
  • the sequences should only have a sufficient length that different sections can be addressed by primers.
  • Another object of the invention is a kit for carrying out the method according to the invention, comprising
  • the kit may further comprise one or more nonspecific primers with which the predetermined sequence can be nonspecifically amplified according to a predetermined protocol.
  • the results of the control amplification experiments may be in the form of stored data, or printed materials may be added to the kit from which the user can read the results and compare them with his own results from real samples.
  • the method according to the invention can also be carried out in a small space, e.g. on a solid support, chip or slide or the like. Also in multiwell plates, e.g. Microtiter plates, the procedure can be performed.
  • the solid support is preferably a slide, a CD or other solid support used for DNA array formats.
  • the device preferably contains a device for detecting nucleic acids which have been "captured" with labeled probes, ie, for example, a device for detecting fluorescence or colorimetric measuring methods
  • the device also comprises either stored data, which serve as comparison data, to obtain the results from the Amplification can be assigned to the control data in such a way that the comparison makes it possible to determine the absolute number of predetermined sequences originally contained in a sample
  • the device additionally or alternatively
  • Figure 1 is a table showing the results of a first example
  • FIGS. 2a, 2b show illustrations of an electrophoresis examination for detecting the predetermined sections.
  • Figure 3 shows a comparison of the presence or absence of chromosomes for 7 cell lines from Coriell on the one hand and according to the method of the invention on the other hand.
  • Transparent boxes Chromosomes present (results of the methods are the same).
  • Hatched boxes Chromosomes not present (results of methods match).
  • Dotted boxes Method according to the invention shows the presence of a chromosome, not the other methods.
  • Black boxes Method according to the invention shows the absence of the chromosome, the other methods the presence.
  • FIG. 4 shows the result of a FISH analysis of a human ovum with a hybridization kit from Vysis.
  • FIG. 5 shows the image analysis of a scan with the program "TIFF Analyzer”.
  • a single cell WGA PCR is designed to amplify the genetic material of a single cell or a few cells.
  • Single-cell WGA-PCR is performed on a slide, with 1 ⁇ l of PCR mix and 5 ⁇ l of mineral oil added to the samples.
  • 25 ⁇ l of PCR mix are composed as follows: 19.125 ⁇ l ampoule water 2.5 ⁇ l MgCl 2 (25 mM)
  • the AIeI primer has the following sequence:
  • PCR mixtures each consisting of one sample, the PCR mix and the oil film, were cycled with the following PCR conditions:
  • the PCR product was transferred to 20 ⁇ l of TE buffer. 2 ⁇ l of it were on analyzed polyacrylamide gel, 15 .mu.l were amplified with a marker PCR. The rest was frozen at -20 0 C.
  • Marker PCR was used to detect whether certain portions of the samples had been amplified with single cell WGA PCR.
  • primer pairs were placed in microtiter plate reaction vessels and the remaining PCR mixture was pipetted. To demonstrate the sections that were amplified from chromosome 2 in single-cell PCR, the following eight primer pairs were used:
  • SHGC-62010 ⁇ '-AAGGTTTATAATGGAAACACTG-S ' ⁇ '-TGAGTTCTGGAATTCATTACATA-S'
  • FIGS. 2a and 2b show the corresponding images of the electrophoresis study on polyacrylamide gel.
  • FIGS. 2a and 2b The corresponding images of the electrophoresis study on polyacrylamide gel are shown in FIGS. 2a and 2b, FIG. 2a showing the bands of sample 1 and FIG. 2b the bands of sample 2.
  • sample 1 has two positive amplificates.
  • the remaining six other amplificates are negative, that is, only two of the portions of chromosome 2 predetermined by the selection of the primers of the marker PCR have been amplified by single cell PCR.
  • Eight positive amplificates were detected, i.e., all eight predetermined portions were amplified with single cell PCR.
  • the results are summarized in FIG.
  • Example 1 shows very impressively the effect that with a smaller number of predetermined sequences (in this case: chromosome 2 of sample 1) in a sample, fewer portions of the sequence are amplified than at a higher number of predetermined sequences (here: chromosome 2 of sample 2) in a sample.
  • ⁇ 2 test also: Chi-Square Test
  • the absolute number of chromosome 2 in a sample can be determined on the basis of the statistical data thus determined on the basis of the frequency of the presence or absence of the particular sections in the amplificate .
  • the influence of the thresholds described above must be considered. If the threshold is set high, there will be less positive amplifications of the sections, whereas at a low threshold there will be several positive amplifications.
  • the cell lines were tested for the presence or absence of certain chromosomes.
  • the cell lines were obtained from Coriell.
  • the cells obtained from Coriell have already been tested by Coriell himself for the presence or absence of certain chromosomes.
  • the cells were also tested by the method according to the invention.
  • the result is shown in FIG.
  • the DNA of the cells is delivered and, according to the packing slip, contains a specific panel of human chromosomes.
  • Coriell can still be a test result from the Web page of Coriell be fetched, which is based on a blotting test. Why the company makes two statements is not known. Obviously, the blotting test is sensitive enough to detect chromosomes that are present in only a fraction of the cells.
  • the third line of FIG. 3 shows the result of the chip in each case.
  • the 25 ⁇ l PCR batch was purified (PCR Purification Kit Macherey & Nagel) and taken up in 250 ⁇ l elution buffer. Of these, 1 ⁇ l was added to each anchor of a chip supplied with Master Mix.
  • the first polar body contains 2 copies of a sequence
  • the mature ovum and the second polar body each contain a copy of a sequence.
  • the following distributions are possible (partly mis-distributions): mature ovum contains 4 copies ⁇ r >> polar bodies do not contain a copy mature egg cell contains 3 copies ⁇ r >> polar bodies contain a copy mature ovum contains 2 copies ⁇ • ⁇ * polar bodies contain 2 copies mature ovum contains 1 copy ⁇ r ⁇ * Polar body contains 3 copies Mature ovum does not contain a copy ⁇ r " ⁇ Polar bodies contain 4 copies
  • the example examines corresponding polar bodies and oocytes. If fluorescence in situ hybridization (FISH) shows 4 correct signals, no sequence may be detectable in the polar bodies. If the FISH shows 3 or fewer signals, the method according to the invention must be positive (the polar bodies contain at least one copy).
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • the following experiment shows the correspondence of the chip results to an established FISH method.
  • the processing of the single cell and the FISH hybridization is carried out according to the protocol of the company Vysis, which is enclosed with each kit.
  • the polar body amplificate is analyzed for the presence / absence of all chromosomes after Whole Genome Amplification.
  • the experimental procedure is described above in Examples 1 and 2.
  • the PCR conditions and components are as in Example 2, but the template (DNA) is replaced by polar bodies, which are located on the chip as templates.
  • the corresponding first polar body accordingly contains no chromosome 16. This can be shown by the chip.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit einer vorbestimmten Sequenz oder mehrerer zur vorbestimmten Sequenz identische oder nahezu identische Sequenzen einer Probe. Das Verfahren umfasst folgende Schritte: Ausführen einer oder mehrerer Amplifikationsreaktionen mit welchen mehrere unterschiedliche Abschnitte der Sequenz bzw. Sequenzen der Probe zu einem Amplifikat amplifiziert werden können, Nachweisen, ob bestimmte unterschiedliche Abschnitte der Sequenz der Probe amplifiziert worden sind, und Bestimmen der Anzahl der Sequenz(en) in der Probe anhand der Häufigkeit des Vorhandenseins bzw. Nicht-Vorhandenseins der bestimmten unterschiedlichen Abschnitte im Amplifikat.

Description

Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit von Sequenzen in einer
Probe
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit einer vorbestimmten Sequenz oder mehrerer zur vorbestimmten Sequenz identische oder nahezu identische (homologe) Sequenzen einer Probe.
Hintergrund der Erfindung
Neben der Sequenzanalyse ist die quantitative Analyse von Nukleinsäuren eine der wesentlichen Herausforderungen in der molekularen Medizin. Für das grundlegende Verständnis der Biologie von Zellen, Geweben und Organismen ist es notwendig, die Zusammensetzung und Häufigkeit genetischer Sequenzen, z.B. auf DNA-Ebene, bzw. deren Transkripte (RNA- Ebene) zu kennen. Individuelle Unterschiede zwischen Organismen sowie Ursachen für genetisch bedingte Krankheiten und Prädispositionen liegen in den Sequenzunterschieden (Mutationen, z.B. Deletionen, Insertionen) und der Häufigkeit, mit der die Sequenzen vorkommen, begründet. Damit sind die quantitativen Analysen des Genoms (DNA) und des Transkriptoms- (RNA) zu den zentralen Fragestellungen der molekularen Medizin geworden.
Die Gesamtheit der genetischen Information ist im Genom eines Organismus verankert. Änderungen des Informationsträgers (genetische Sequenzen von Nukleinsäuren mit den Basenabfolgen von G, A, T und C; = DNA) können sich als Krankheit manifestieren. Vielfach ist eine quantitative Aussage bezüglich definierter Sequenzabschnitte für die Diagnostik notwendig. Beispiele für Krankheitsbilder, die auf unterschiedliche Häufigkeiten genetischer Sequenzen zurückzuführen sind, sind vielfältig:
Trisomien/Monosomien ganzer Chromosomen
Trisomie 21, Down Syndrom: ein ganzes Chromosom (21) ist betroffen und kommt mit 3 Kopien je Zelle vor (statt 2 Kopien). Repeat Motive
Huntington Disease: ein bestimmtes Motiv (CAG) kommt unmittelbar hintereinandergeschaltet in mehr als 37 Kopien vor. Die Prädisposition zur Krankheitsausbildung steigt mit der Anzahl der Wiederholungen dieses 5 Motivs. Andere Beispiele für instabile Trinukleidsequenzen beim Menschen sind Kennedy Syndrom oder spinocerebrale Ataxie 1.
Chromosomale Mikrodeletionen kleiner Sequenzabschnitte
Für eine wachsende Zahl klinischer Syndrome stellt es sich heraus, dass o chromosomale Mikrodeletionen eine Rolle spielen. Es gibt zahlreiche
Beispiele wie das Wolf Hirschhorn Syndrom (Deletion 4p16.3), Williams
Beuren Syndrom (7q 11.23, betrifft die Deletion eines gesamten Gens) oder auch Prader-Labhart-Willi Syndrom (15q11-q13), bei dem nur die väterlichen
Gene betroffen sind. Seltener sind Mikroduplikationen, das Auffinden 5 solcher Abschnitte ist aus methodischen Gründen aber heute sehr schwierig.
Punktmutationen
Viele Krankheitsbilder ergeben sich, weil genau eine Basenposition o geändert vorkommt, was im resultierenden Protein zu einer
Funktionsstörung führt. Auch für diese Fälle (Single Nucleotide
Polymorphisms, SNPs) ist eine quantitative Aussage von entscheidender
Bedeutung, weil die Mutationen oder Allele nicht in allen Zellen vorkommen bzw. unterschiedlich häufig exprimiert werden können. Mutationen dieser 5 Art, die nicht in Gensequenzen liegen, kommen im Genom sehr häufig vor und führen in der Regel zu keinem Krankheitsbild. Dennoch sind sie als
Marker geeignet, weil viele Tumorzellen die Neigung haben, eines der beiden elterlichen Allele zu verlieren (loss of heterozygosity, LOH). Die
Feststellung, dass von ursprünglich zwei Sequenzvarianten nur noch eine o vorhanden ist, hat ein sehr bedeutendes Potential für die Tumordiagnostik.
Zu den methodischen Entwicklungen, diesen Zustand sicher und quantitativ zu erfassen, gehört die digitale PCR (US 6,440,706 B1).
In allen genannten Beispielen verläuft die molekulare Diagnostik über die 5 Quantifizierung von Sequenzabschnitten, d.h., dass nachgewiesen werden muss, wie oft eine vorbestimmte Sequenz in einer Probe enthalten ist. Stand der Technik
Heute werden in Diagnostik und Forschung im wesentlichen folgende Verfahren verwendet, um die oben beschriebenen Aufgaben für DNA zu lösen:
Chromosomen-spezifische Sonden-Moleküle für in s/ϊt/-Hybridisierungen im Wege FISH-Verfahrens (fluorescence in situ hybridization) sind aus US 5,817,462 bekannt. Durch verschiedene Kombinationen verschiedener Fluorophore können dabei alle menschlichen Chromosomen simultan nachgewiesen werden.
Die zu analysierenden Chromosomen werden mit farbstoffmarkierten Hybridisierungssonden in Kontakt gebracht, so dass sich sequenzkomplementäre Abschnitte finden können. Nach der sequenzspezifischen Hybridisierung folgt ein Waschschritt und anschließend werden die Fluoreszenzsignale der Zelle unter einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Ist ein Fluoreszenzsignal vorhanden, so ist auch die Sequenz vorhanden. Es kann so z.B. auf die Anwesenheit eines kompletten Chromosoms geschlossen werden. Ist kein Fluoreszenzsignal vorhanden, so fehlt entweder das Chromosom oder für den Bereich der Sonden liegt eine Mikrodeletion vor. Per FISH kann heute die Kopienzahl mehrerer verschiedener Sequenzen innerhalb eines Genoms parallel bestimmt werden, die sich in der Auswertung durch den verwendeten Fluoreszenzfarbstoff unterscheiden. Die Zahl ist limitiert durch die Zahl der gleichzeitig verwendbaren Fluoreszenzfarbstoffe. Typischerweise werden Zellpopulationen untersucht, die alle den gleichen genetischen Status haben.
Eine FISH-Analyse ist sehr schwer zu validieren. In DE Rooney ed., 2001 : Human Cytogenetics Constitutional Analysis, Oxford University Press, heißt es zur Interpretation der Ergebnisse einer FISH-Analyse: "Probes used for interphase analysis should be chosen to hybridize with high efficiency (>90 %)". Das heißt einerseits, dass mindestens 100 Zellen gezählt werden müssen, andererseits schließt diese Aussage die Einzelzelldiagnostik per FISH generell aus. Für Einzelzelldiagnostik ist diese Methode nicht adäquat. - A -
Ein anderer Ansatz, bei dem die Kopienzahl mehrerer Sequenzen parallel bestimmt werden kann, ist die CGH (comparative genomic hybridization, WO 00/24925, Karyotyping Means and Methods). Hier wird eine Patienten- DNA mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert (z.B. rot), eine Referenz-DNA mit einem zweiten Farbstoff (z.B. grün). Gleiche Mengen der verschiedenen DNA Populationen werden gemischt und gegen einen Chromosomenspread auf einer Glasoberfläche hybridisiert. Komplementäre Stränge werden um die Anbindungsstellen auf den Chromosomenabschnitten konkurrieren. Sind die Sequenzabschnitte in Patienten-DNA und Referenz-DNA gleich häufig, so wird sich an der entsprechenden Hybridisierungsstelle des Chromosoms eine Ratio von 1 :1 zwischen grün und rot einstellen. Überwiegt eine Farbe, so deutet dies bei der Patienten-DNA entweder auf eine Vervielfältigung oder auf eine Deletion des entsprechenden Abschnitte hin. Im Fluoreszenz- Mikroskop wird der Chromosomenspread analysiert, was die Auflösung der Methode limitiert, sie liegt bei etwa 10-30 Mb (1 Mb = 1 Megabasen = 106 Sequenzbausteine). Bei der CGH eines Chromosomenspreads kann an einem einzelnen Chromosom an einer definierten Sequenz nur genau eine (rot oder grün markierte) Sonde binden. Nur die schlechte räumliche Auflösung der Methode führt dazu, dass man nebeneinander viele Signale erhält, die statistisch dann eine Ratioanalyse zulassen.
Eine besondere Ausführung der Methode ist die Matrix CGH (Chip oder Array Format), bei dem statt eines Chromosomenspreads die Genabschnitte in Form diskreter Messpunkte eines DNA-Arrays vorliegen. Auch hier wird ein Intensitätsvergleich von zwei Hybridisierungssignalen vorgenommen. Für die CGH muss die Probe entweder amplifiziert werden (z.B. per PCR) oder aber es muss eine Vielzahl nominell identischer Zellen vorliegen.
Die Quantitative Real-Time-PCR Methode ist prinzipiell geeignet, kleinste Mengen an Nukleinsäuren nachzuweisen (im Prinzip eine Kopie einer
Sequenz). Die quantitative Analyse wird mittels interner Standards gewährleistet (Hagen-Mann, K. & Mann, W. (1995): RT-PCR and alternative methods to PCR for in vitro amplification of nucleic acids. Exp. Clin.
Endocrinol. 103: 150-155). Die Methode wird für die Routinediagnostik eingesetzt. Die Menge an Ausgangsmaterial kann aber nicht beliebig verkleinert werden, da mit wenigen Startmolekülen (10-100) als
Ausgangsmaterial der stochastische Fehler aufgrund der exponentiellen Amplifikation sehr groß wird und keine quantitative Aussage mehr zulässt.
Neben der PCR gibt es andere enzymatisch basierte Amplifikationsmethoden, die eine quantitative Aussage in dem genannten Bereich nicht zulassen (z.B. NASBA1 LCR, SDA RT-PCR oder Qß- Replikase; Übersicht in Hagen-Mann & Mann 1995).
Alle genannten Methoden haben bei der quantitativen Analyse von Sequenzen verschiedene Nachteile, so dass sie für eine absolute Aussage bezüglich Kopienzahlen nicht geeignet sind.
Es existiert heute keine einfache und sichere Methode zum Zählen von
Sequenzabschnitten (im Bereich 0, 1 , 2, 3 bis etwa 10), weil zwei
Entwicklungen völlig gegensätzlich verlaufen: a) man arbeitet ohne Amplifikation, dann ist eine Vielzahl von Zellen notwendig (typisch für CGH wäre eine Zahl von 106 ); anders ist die Fluoreszenz nicht messbar. Aufgrund der Komplexität der Hybridisierungsreaktion (unspezifische Bindungen, Kreuzreaktionen, langsame und meist unbekannte Kinetik) und der aufwändigen Probenvorbereitung (Aufreinigung der Probe, unbekannte Effizienz beim
Einbau von Fluoreszenzfarbstoffen) ist die Quantifizierung von Gensequenzen experimentell sehr komplex und die Interpretation der Ergebnisse keineswegs trivial. b) man führt eine quantitative Amplifikationsreaktion von wenig Ausgangsmaterial durch, um die Kopienzahl einer definierten Sequenz
(im Sinne von 0, 1, 2, 3..) z.B. aus dem Anstieg des Signals bei einer real time PCR zu bestimmen. In diesem Fall wird der Fehler aufgrund der exponentiellen Amplifikationsrate hoch.
Aus der US 6,440,706 B1 ist ein Verfahren zum Bestimmen der relativen Häufigkeit der Sequenzen in einer Probe bekannt, das als digitale Amplifikation bzw. digitale PCR bezeichnet wird. Die Probe wird hierbei soweit verdünnt und auf eine Vielzahl Reaktionsgefäße verteilt, dass in einem Reaktionsgefäß möglichst nicht mehr als ein einzelnes Molekül einer der zu untersuchenden Sequenzen vorhanden ist. Die auf mehrere Reaktionsgefäße verteilte Probe wird dann mit mehreren Primern amplifiziert, wobei die Primer jeweils für eine der Sequenzen spezifisch sind und mit einem bestimmten Marker versehen sind. Nach der Amplifikation wird anhand der in das Amplifikat eingebundenen Marker erkannt, in welchem Reaktionsgefäß welche der Sequenzen vorhanden war. Durch Abzählen der Reaktionsgefäße, die jeweils eine bestimmte der Sequenzen enthalten, kann das Mengenverhältnis der Sequenzen in der ursprünglichen Probe festgestellt werden. Dieses Verfahren enthält erhebliche Unsicherheiten, die im wesentlichen durch die Verdünnungsreihe verursacht wird, da nie mit absoluter Sicherheit ermittelt werden kann, ob in einem Reaktionsgefäß nicht doch mehrere Sequenzmoleküle enthalten sind, wodurch das Ergebnis verfälscht werden kann. Zudem können mit diesem Verfahren nur relative und keine absoluten Mengenverhältnisse bestimmt werden.
Ein weiteres Verfahren, welches die Bestimmung der relativen Häufigkeit von Sequenzen ermöglicht, ist aus der WO 2004/027089 bekannt. In diesem Verfahren soll zum Beispiel bestimmt werden, ob eine von mehreren abgrenzbaren Teilmengen (d.h. separate Nukleinsäuren oder Sequenzen) eines genetischen Materials häufiger oder weniger häufig als die übrigen abgrenzbaren Teilmengen in einer Probe vorkommt. Eine konkrete Ausführungsform dieses Verfahrens aus dem Stand der Technik betrifft die Bestimmung der relativen Häufigkeit von einzelnen Chromosomen in einer Zelle, z.B. zur Bestimmung, ob eine Aneuploidie vorliegt. In dieser Ausführungsform des in der WO 2004/027089 offenbarten Verfahrens wird zunächst eine Einzelzellamplifikation, z.B. eine Whole-Genome- Amplification (WGA) mit einem unspezifischen Primer oder mehreren solcher Primer durchgeführt, wobei dabei jeweils mehrere für ein Chromosom spezifische Zielsequenzen theoretisch amplifiziert werden müssten. Da eine solche Whole-Genome-Amplification jedoch nicht zu 100 % effizient abläuft, werden im statistischen Mittel nicht alle der theoretisch durch die Primer amplifizierbaren Zielsequenzen amplifiziert. Nach der Amplifikationsreaktion werden für jedes Chromosom spezifische Zielsequenzen nachgewiesen.
Mit keinem der oben beschriebenen Verfahren ist es möglich, eine Anzahl von z.B. zehn oder weniger im wesentlichen identischer Sequenzen einer Probe zu zählen. Die meisten Verfahren sind für den quantitativen Nachweis einer derart geringen Anzahl von Sequenzen prinzipiell nicht geeignet. Lediglich mit der digitalen PCR können die relativen Häufigkeiten von unterschiedlichen Sequenzen, die in relativ geringer Menge vorliegen, ermittelt werden. Aufgrund der Verwendung einer Verdünnungsreihe ist die Ermittlung der relativen Häufigkeit von Sequenzen, die lediglich in einer sehr geringen Anzahl von z.B. 10 oder weniger vorliegen, problematisch.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit einer vorbestimmten Sequenz oder identischer oder nahezu identischer (homologer) Sequenzen zur vorbestimmten Sequenz einer Probe zu schaffen, das selbst bei einer geringen Anzahl der Sequenzen der Probe zuverlässig, einfach und kostengünstig ausführbar ist.
Die Erfindung wird mit dem Verfahren nach Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit einer vorbestimmten Sequenz oder identisch oder nahezu identischer (homologer) Sequenzen in einer Probe umfasst folgende Schritte: - Ausführen einer oder mehrerer Amplifikationsreaktionen, mit welchen mehrere Zielabschnitte der Sequenz bzw. Sequenzen der Probe zu einem Amplifikat amplifiziert werden können, - Nachweisen, ob bestimmte Zielabschnitte der Sequenz der Probe amplifiziert worden sind, und - Bestimmen der Häufigkeit der Sequenz(en) in der Probe anhand der
Häufigkeit des Vorhandenseins bzw. Nicht-Vorhandenseins der bestimmten Zielabschnitte im Amplifikat.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in Anspruch 2 angegeben. Dieses Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit n einer vorbestimmten Sequenz oder mehrerer zur vorbestimmten Sequenz identischer oder nahezu identischer Sequenzen in einer Probe, umfasst die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Probe, enthaltend die Sequenz in einer zu bestimmenden Häufigkeit n,
(b) Bereitstellen von Primern, mit welchen eine Anzahl m von Zielabschnitten der vorbestimmten Sequenz in der Probe zu jeweils unterschiedlichen Amplifikaten amplifiziert werden können,
(c) Ausführen einer oder mehrerer Amplifikationsreaktionen mit der Probe aus (a) und den Primern aus (b), wobei die Reaktionsbedingungen so gewählt werden, dass die Anzahl der erfolgreichen
Amplifikationsreaktionen abhängig ist von der Häufigkeit n der vorbestimmten Sequenz in der Probe,
(d) Nachweisen der amplifizierten Zielabschnitte aus Schritt (c) und Bestimmen der Anzahl der erfolgreichen Amplifikationsreaktionen, (e) Bestimmen der Häufigkeit n der in der Probe enthaltenen vorbestimmten Sequenz.
Vorzugsweise wird die Häufigkeit n der in der Probe enthaltenen vorbestimmten Sequenze durch Vergleich mit einer oder mehreren Kontrollen durchgeführt, in denen die vorbestimmte Sequenz mit einer bekannten Häufigkeit vorliegt. Die Kontrollen können entweder parallel dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogene Kontrollproben sein, wobei für die parallelen Kontrollproben die gleichen Reaktionsbedingungen angewandt werden wie für das Ausführen der Amplifikationsreaktion(en) mit der Probe. Es ist auch möglich, die Kontrollproben unabhängig von der Probe einem erfindungsgemäßen Verfahren zu unterziehen und validierte Daten bzw. Referenzdaten zu erstellen, welche als Kontrollen für den Vergleich mit der Probe dienen.
Mehrere Zielabschnitte der ursprünglichen Sequenzen können beispielsweise durch Verwendung mehrerer Primerpaare oder Primerkombinationen amplifiziert werden, die jeweils für einen bestimmten Zielabschnitt oder einige wenige bestimmte Zielabschnitte der Sequenz spezifisch sind oder durch Verwendung von Primern, die jeweils für eine Vielzahl bestimmter Zielabschnitte spezifisch sind.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff Primer nicht nur einzelne Primer, sondern auch Primerpaare (d.h. je ein Vorwärts- und ein Rückwärtsprimer) und Primerkombinationen (mehr als je ein Vorwärts- und Rückwärtsprimer für einen bestimmten Zielabschnitt).
PCR-Verfahren, die eine Vielzahl bestimmter Zielabschnitte amplifizierende Primer verwenden, werden als IRS-PCR (Inter-Repetetive-Sequence-PCR) bzw. WGA-PCR (Whole-Genome-Amplification-PCR) bezeichnet, d.h. die Primer sind insofern unspezifisch, als sie eine Vielzahl von unterschiedlichen Sequenzen amplifizieren.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, dass bei der Amplifikation mehrerer unterschiedlicher bestimmter Zielabschnitte einer Sequenz die Anzahl der amplifizierten unterschiedlichen Zielabschnitte von der Anzahl der ursprünglich in der Probe vorhandenen Sequenz abhängt. Je geringer die Anzahl der in der Probe vorhandenen Sequenz ist, desto geringer ist auch die Anzahl der davon amplifizierten unterschiedlichen Zielabschnitte.
Es wird angenommen, dass die Ursache hierfür ist, dass der Erfolg einer jeden Amplifikation mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit bzw. Effizienz behaftet ist, d.h., dass eine jede Amplifikation nicht mit absoluter Sicherheit ausgeführt wird. So besteht z.B. beim gleichzeitigen Amplifizieren mehrerer unterschiedlicher Abschnitte ein Wettbewerb zwischen den Amplifikationsreaktionen der einzelnen unterschiedlichen Abschnitte, so dass, wenn nur eine oder wenige der vorbestimmten Sequenzen im Probenmaterial vorhanden sind, weniger der einzelnen unterschiedlichen Abschnitte amplifiziert werden, als wenn eine große Anzahl an Sequenzen amplifiziert werden würde.
Die Effizienz hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, beispielsweise von der Wahl der Primer, der Länge der zu amplifizierenden Sequenz und den weiteren Reaktionsbedingungen, wie z.B. bei einer PCR dem
Temperaturprotokoll, der Dauer der Zyklen, der Zyklenanzahl, der
Konzentration der Reaktanden, dem Reaktionsvolumen, den Polymerasen, etc. Der Fachmann ist in der Lage, diese Parameter so einzustellen, dass eine gewünschte Effizienz erreicht wird.
Indem diese Faktoren festgelegt werden, ist es auch möglich, die Effizienz einer Amplifikation in einem gewissen Bereich festzulegen. Falls zum Beispiel eine Sequenz mit möglichst großer Sicherheit amplifiziert werden soll, jedoch nur in geringen Anzahlen vorliegt, ist es vorteilhaft, wenn die Effizienz so nahe wie möglich an 1 herankommt. Dies ist z.B. für diagnostische PCR (Nachweis von Pathogenen) und dgl. andere Anwendungen vorteilhaft.
Wenn andererseits, wie im Verfahren der vorliegenden Erfindung, außerdem unterschieden werden soll, ob eine Probe eine vorbestimmte Sequenz nur ein einzige Mal, zweimal, dreimal oder in einer ähnlich geringen Anzahl enthält, ist es vorteilhafter, die Effizienz der Amplifikation auf einen mittleren Wert einzustellen, z.B. im Bereich von 0,1 bis 0,9, vorzugsweise 0,2 bis 0,8, vorzugsweise 0,3 bis 0,7, vorzugsweise 0,4 bis 0,6 und am meisten bevorzugt bei etwa 0,5. Die Effizienz der Amplifikation sollte in einem Bereich liegen, dass eine statistisch signifikante Aussage über die absolute Quantität von ursprünglich vorhandenen Sequenzen, d.h. Nukleinsäuremolekülen, gemacht werden kann.
Der Begriff Effizienz wird deshalb im Folgenden derart ausgelegt, dass er die Wahrscheinlichkeit der Amplifikation unter der Annahme angibt, dass beliebig viel Ausgangsmaterial vorhanden ist. Die Effizienz einer für die
Erfindung geeigneten Amplifikation liegt typischerweise im Bereich von 0,5 bis 1. Die tatsächliche Wahrscheinlichkeit der Amplifikation eines bestimmten Abschnittes bei geringer Zahl der Startkopien der Sequenz hängt hingegen von der Menge des Ausgangsmaterials ab, d.h. der Anzahl der vorbestimmten Sequenzen in der Probe, und kann grundsätzlich den gesamten möglichen Bereich von 0 bis 1 abdecken.
Beispielsweise ist es so, dass unter bestimmten Bedingungen die Amplifikation von mehreren Zielabschnitten einer Sequenz auch bei
Auswahl der geeigneten Primer für jeweils diese mehreren Zielabschnitte nicht in jeder Amplifikationsreaktion alle Zielabschnitte amplifiziert werden.
Dies trifft insbesondere dann zu, wenn die ursprünglichen Templates, d.h. die ursprüngliche Sequenz, von der die Zielabschnitte amplifiziert werden sollen, nur in geringen Kopienzahlen vorliegt, z.B. im Bereich von 0, 1 , 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Da jede Amplifikationsreaktion mit einer gewissen Fehlerwahrscheinlichkeit behaftet ist, ist es sehr schwer, mit Verfahren gemäß dem Stand der Technik zwischen verschiedenen Proben zu unterscheiden, welche unterschiedliche Anzahlen der Templates für die Amplifikationsreaktionen enthalten. Beispielsweise kann eine Probe zwei Sequenzen enthalten, von der jeweils bestimmte Zielabschnitte amplifiziert werden sollen, und eine zweite Probe kann drei dieser Sequenzen enthalten, von der bestimmte Zielabschnitte amplifiziert werden sollen. Es ist mit Amplifikationsverfahren aus dem Stand der Technik bisher nicht möglich gewesen, aufgrund der Ergebnisse der Amplifikationsreaktionen auf die Anzahl der Ursprungstemplates, d.h. die Häufigkeit der ursprünglich vorhandenen Sequenzen in einer Probe rückzuschließen, wenn die Anzahlen in diesem kleinen Bereich liegen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht jedoch eine Bestimmung der absoluten Anzahl von ursprünglich vorhandenen Sequenzen in einer Probe, insbesondere wenn diese Anzahl, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung mit n bezeichnet wird, im Bereich n = 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 liegt. Vorzugsweise liegt n im Bereich von 0-100, vorzugsweise 0-30, vorzugsweise 0-10, vorzugsweise 0-5. Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren so eingestellt, dass Proben mit Sequenz- Anzahlen von n = 0, 1, 2, 3 und 4 quantitativ bestimmt werden können.
Hierzu werden vorzugsweise die Amplifikationsbedingungen so gewählt, dass die Effizienz der Amplifikationsreaktion für n =1 im Bereich von 0,2-0,8, vorzugsweise 0,4-0,6 liegt. Besonders bevorzugt sollte die Amplifikationseffizienz im Bereich um die 0,5 liegen. Dies bedeutet, dass, wenn eine Sequenz, deren Anzahl n in der Probe = 1 beträgt (d.h. dass diese Sequenz ein einziges Mal in der Probe vorkommt, also nur ein einziges Template zur Verfügung steht) und für diese Sequenz eine Anzahl m Zielabschnitte amplifiziert werden sollen, bei einer Effizienz von 0,5 im statistischen Mittel nur die Hälfte der Zielabschnitte nach der Amplifikationsreaktion nachweisbar sind.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht somit eine quantitative Aussage über die Kopienzahl der Sequenz, die in einer Probe vorhanden ist. Zu diesem Zweck werden Amplifikationsreaktionen ausgeführt, um mehrere unterschiedliche Zielabschnitte auf der Sequenz zu einem Amplifikat zu amplifizieren. Wenn die vorbestimmte Sequenz, von der die mehreren Zielabschnitte amplifiziert werden sollen, nur in einer sehr geringen Kopienzahl vorliegt, und die Amplifikationseffizienz weniger als 1 beträgt, so besteht eine große Wahrscheinlichkeit, dass nicht alle der ausgewählten Zielabschnitte tatsächlich in der Amplifikationsreaktion amplifiziert werden, selbst wenn diese über mehrere Zyklen durchgeführt wird. Vergleicht man das Ergebnis einer Amplifikationsreaktion einer Probe mit einer vorbestimmten Sequenz durch Nachweis der mehrere unterschiedlichen Zielabschnitte und vergleicht man dieses Ergebnis mit einer unter gleichen Bedingungen ausgeführten Amplifikationsreaktion einer Probe, welche 2 Kopien der vorbestimmten Sequenz enthält, so erhält man für die Probe mit den 2 Kopien mit einer statistisch signifikanten Wahrscheinlichkeit eine höhere Anzahl an positiv nachweisbaren amplifizierten Zielabschnitten.
Dieser statistische Ansatz wird im folgenden näher erläutert.
Das Vorhandensein oder NichtVorhandensein eines Amplifikats auf Basis eines definierten PCR-Protokolls (u.a. Temperaturprotokoll, Zyklenzahl, Konzentration der Reaktanden, Volumen, Schwellenwert bei der Detektion des Amplifikats) durchgeführt mit einem spezifischen Primer oder Primerpaar hängt ab von der Kopienzahl der Sequenz im Ausgangsmaterial. Das erfindungsgemäße Zählverfahren wird im folgenden beispielhaft in einem Gedankenexperiment erläutert:
Es sollen die Kopienzahlen 0, 1 und >=2 in einer Probe mit einer Sicherheit von >=90% unterschieden werden. Bezieht man diese Kopienzahlen auf ein Chromosom in einem Polkörperchen, so werden damit die Fälle Monosomie (Kopienzahl 2 im Polkörperchen), gesunde Zelle (Kopienzahl 1 im Polkörperchen) und Trisomie (Kopienzahl 0 im Polkörperchen) unterschieden. Zunächst werden PCRs an Kontrollproben mit bekannter Kopienzahl n = 0, 1 , 2 mit m = 8 verschiedenen fluoreszenzmarkierten Primern und einem definierten PCR-Protokoll durchgeführt. Die Detektion des Amplifikats erfolgt per Hybridisierung auf einem Array mit einem Schwellenwert für das Vorhandensein eines Amplifikats vom 5-fachen Hintergrundsignal. Bei je k = 100 Experimenten für die drei Fälle der Kopienzahlen n erhält man folgende Häufigkeitsverteilung:
Tabelle 1 Anzahl der positiven Amplifikationen
0/8 1/8 2/8 3/8 4/8 5/8 6/8 7/8 8/8
n=0 98 2 0 0 0 0 0 0 0
n=1 2 13 24 57 3 1 0 0 0
n=2 0 0 0 0 3 40 35 20 2
Unter der Annahme, dass sich die Verteilung auch für größere Zahlen k nicht ändert, kann man aus der Tabelle folgende Schlüsse ziehen: Führt man dasselbe Experiment an einer Probe mit unbekannter Kopienzahl durch und erhält die Ergebnisse 5/8, 6/8, 7/8, oder 8/8 positive, so kann mit der geforderten Sicherheit auf die Kopienzahl n = 2 geschlossen werden. Lautet das Ergebnis 0/8 positive, so lag die ursprüngliche Kopienzahl mit >90 % Konfidenz bei n = 0. Ist das Ergebnis 2/8, 3/8, so lag die Kopienzahl n = 1 mit der geforderten Sicherheit vor. Die Ergebnisse 1/8 und 4/8 können nicht mit der geforderten Konfidenz entschieden werden. Möchte man auch diese Fälle mit der geforderten Sicherheit entscheiden können, so kann man z.B. die Zahl der unterschiedlichen Amplifikationen m erhöhen oder das PCR- Protokoll verändern. In einem weiteren Gedankenexperiment sei nun m = 12 und man erhält folgende Tabelle 2 Häufigkeitsverteilung mit den entsprechenden Kontrollproben: Tabelle 2
Anzahl der positiven Amplifikationen
0/12 1/12 2/12 3/12 4/12 5/12 6/12 7/12 8/12 9/12 10/12 11/12 12/12
n=0 95 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
n=1 0 0 3 20 44 30 3 0 0 0 0 0 0
n=2 0 0 0 0 0 0 0 3 27 45 15 7 3
Hier ist nun die Zahl der positiven Amplifikationsreaktionen überschneidungsfrei, d.h. alle relevanten Werte n können im geforderten Konfidenzintervall unterschieden werden. Ein weiteres Gedankenexperiment an den Kontrollproben wird nun unter anderen PCR-Bedingungen mit folgendem Ergebnis durchgeführt (Reduzierung der Zyklenzahl von I = 30 auf I = 27):
Tabelle 3
Anzahl der positiven Amplifikationen
0/12 1/12 2/12 3/12 4/12 5/12 6/12 7/12 8/12 9/12 10/12 11/12 12/12
n=0 98 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
n=1 0 1 14 22 40 20 3 0 0 0 0 0 0
n=2 0 0 0 0 0 0 3 10 30 32 15 7 3
Hier ist keine klare Aussage für die Werte 1/12 und 6/12 möglich. In einem weiteren Iterationsschritt kann nun versucht werden, z.B. durch Anpassung des Schwellenwertes der Detektion wieder überschneidungsfreie Ergebnisse auf Basis derselben Experimente zu erhalten.
Allgemein ist es das Ziel der Optimierung des erfindungsgemäßen Zählverfahrens, mit möglichst wenig PCR-Reaktionen m eine sichere Unterscheidung der Kopienzahlen n im gewünschten Bereich zu erhalten. Hierzu müssen die PCR-Bedingungen und gegebenenfalls die Primer entsprechend optimiert werden. Die erhaltenen Parameter können dann dem erfindungsgemäßen Kit beigefügt werden und dienen dem Anwender zur Interpretation seiner Ergebnisse.
Die Tabelle 4 zeigt, wie sich die statistische Sicherheit der Aussage erhöht, wenn die Anzahl der unabhängig voneinander untersuchten Ergebnisse erhöht wird. Zugrunde gelegt wird eine Normalverteilung:
Tabelle 4
Es ist unerheblich, ob die Ergebnisse bezüglich der Zielsequenzen in mehreren Einzelexperimenten mit nominell identischem Ausgangsmaterial gewonnen werden (für den letzten Fall in 32 voneinander unabhängigen Einzelreaktionen) oder aber in einer einzigen Multiplexreaktion (z.B. ein 32- Plex basierend auf einer einzigen Zelle).
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, dass in Multiplex-Experimenten Abhängigkeiten der Amplifikationsreaktionen untereinander gegeben sind.
Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es bevorzugt, die Reaktionsbedingungen so einzustellen, dass die oben beispielhaft beschriebenen Verteilungen von erfolgreichen Amplifikationsreaktionen möglichst scharf sind. Das heißt insbesondere für den Nachweis von vorbestimmten Sequenzen mit niedrigen Häufigkeiten, dass Proben mit n=1 von solchen mit n=2 und solche von n=3 unterschieden werden können.
Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass bei Amplifikationsreaktionen, insbesondere bei PCR-Amplifikationen, die Verteilungen, wie sie oben beschrieben sind, bei entsprechend eingestellten Bedingungen viel schärfer sind als man annehmen würde.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist deshalb auch insbesondere zum Bestimmen der Häufigkeit einer kleinen Anzahl von Sequenzen geeignet, deren Anzahl vorzugsweise im Bereich von 0 bis 10 liegt. Vorzugsweise können je nach dem zu erwartenden Zahlenbereich der Anzahl der Sequenzen die Zahl der unabhängigen PCR-Reaktionen m und die PCR- Bedingungen derart eingestellt werden, dass die Zuverlässigkeit des Ergebnisses auf die zu erwartendende Anzahl von Sequenzen optimiert wird.
Vorzugsweise wird als Probenmaterial lediglich das Genom einer einzigen Zelle verwendet, wobei mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sicher festgestellt werden kann, ob die vorbestimmte Sequenz nicht vorhanden ist oder einmal oder zweimal oder dreimal oder viermal oder fünfmal etc. vorhanden ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch insbesondere für die Polkörperchenanalyse.
Die vorbestimmte Sequenz kann z.B. ein Chromosom sein, sie kann aber auch ein Fragment eines Chromosoms sein oder ein Teil eines Chromosoms. Es kann sich bei der vorbestimmten Sequenz aber auch um ein Gen oder einen größeren Sequenzabschnitt handeln. Grundsätzlich kann das erfindungsgemäße Verfahren für jede Art von Nukleinsäuren und Nukleinsäuresequenzen angewandt werden, z.B. auch für Plasmide und andere künstliche Sequenzen. Die unten beispielhaft beschriebenen Ausführungsformen sind daher nicht beschränkend auszulegen, sondern sie eignen sich für jede von quantitativen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen in geringer Anzahl in der Ausgangsprobe. Die Nukleinsäuresequenz kann eine DNA, RNA, mRNA, cDNA oder genomische DNA sein.
Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Anzahl von Chromosomen in einer einzigen Zelle, d.h. das Verfahren eignet sich zur Ermittlung des Vorhandenseins von Aneuploidien.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in mehreren Ausführungsformen durchgeführt werden.
In einer ersten Ausführungsform, die beispielhaft für eine Chromosomenanalyse beschrieben wird, wird eine Einzelzell-Amplifikation mit spezifischen Primern durchgeführt. Es ist hierbei nicht notwendig, die Zelle zunächst einer WGA, d.h. einer unspezifischen Amplifikation zu unterziehen.
In einer bevorzugten zweiten Ausführungsform wird jedoch zunächst eine WGA durchgeführt, um das Nukleinsäurematerial einer Einzelzelle oder einiger weniger Zellen unspezifisch zu amplifizieren. Anschließend wird die spezifische Amplifikation gemäß Anspruch 1 durchgeführt. Auch bei diesen hintereinander geschalteten zwei Amplifikationsreaktionen, z.B. PCRs, hängt die Zahl der Amplifikate von der ursprünglich in der Probe vorhandenen Kopienzahl der zu zählenden Sequenzen ab. Es werden dann Tabellen analog zu Tabelle 1 bis 3 experimentell für den Gesamtprozess bestimmt und auf dieser Basis kann der Anwender bei seinen Proben auf die Kopienzahl schließen. Auch hierbei entsteht eine gewisse Wahrscheinlichkeitsverteilung für das Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein der Amplifikate.
Bei der spezifischen Amplifikation wird die Zelle wird mit spezifischen Primern bzw. entsprechenden Primerpaaren/Primerkombinationen einer Amplifikationsreaktion unterzogen, wobei die Primer bzw. Primerpaare so ausgewählt sind, dass für jedes Chromosom eine Anzahl m bestimmter und spezifischer Zielabschnitte amplifiziert werden kann. Für eine Chromosomenanalyse beträgt die Anzahl m der zu amplifizierenden Zielabschnitte vorzugsweise mindestens 4, stärker bevorzugt mindestens 6, stärker bevorzugt mindestens 8. Es können auch pro Chromosom mehr Zielabschnitte ausgewählt werden, z.B. 10, 12, 14, 16, 20, 30 oder noch mehr. Hier ist es jedoch dem Fachmann überlassen, eine geeignete Anzahl von Zielsequenzen pro Chromosom auszuwählen. Die Anzahl m der für jedes Chromosom spezifschen Zielsequenzen (wobei m pro Chromosom zu verstehen ist) sollte groß genug sein, dass bei einer statistischen Verteilung der erfolgreichen und nicht erfolgreichen Amplifikationsreaktionen am Ende eine Aussage gemacht werden kann über die ursprünglich vorhandenen Anzahlen an Templat-Molekülen. Andererseits sollten die Anzahlen von spezifischen Zielabschnitten pro Chromosom m nicht zu hoch sein, damit die Anzahl der verwendeten Primer bzw. Primerpaare ein vernünftiges Maß nicht übersteigt. Wie bereits erwähnt, kann der Fachmann die Anzahl m der zu amplifizierenden Zielabschnitte pro Chromosom je nach Analyse und Amplifikationsverfahren selbst auswählen und auch die entsprechenden Amplifikationsbedingungen festlegen.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Kontrollexperimente durchgeführt, wobei die Kontrollproben aus jeweils einer Zelle mit einer bekannten Anzahl n von Nukleinsäuremolekülen ausgewählt werden, z.B. eine Zelle, in der die Nukleinsäure überhaupt nicht vorhanden ist, als Kontrolle 0, eine Zelle, in der die Nukleinsäure einmal vorhanden ist, als Kontrolle 1 usw. Anschließend werden alle diese Kontrollproben mit entsprechend ausgewählten Primern oder Primerpaaren einer Amplifikationsreaktion unterzogen, und es werden die Amplifikationsbedingungen so optimiert, dass für die Kontrollprobe, in der die Nukleinsäure einmal (n = 1) vorkommt, die Anzahl der für die Nukleinsäure spezifschen Zielabschnitte im Bereich von m = 4 bis 30 liegt und die Amplifikationseffizienz in einem Bereich um die 0,5 liegt. Dies bedeutet, dass, wenn die Kontrollprobe 2, welche die Nukleinsäure in zwei Exemplaren enthält, unter gleichen Amplifikationsbedingungen amplifiziert wird, die Amplifikationseffizienz signifikant höher ist. Dies ist auch aus Tabelle 1 zu ersehen.
Diese erste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eignet sich besonders gut zum Nachweis von Chromosomenanzahlen in einzelnen Zellen. Insbesondere eignet sich das Verfahren für die Polkörperchenanalyse, wobei ein Polkörperchen einen haploiden oder diploiden Chromosomensatz besitzen kann. Vorzugsweise werden hier pro Chromosom etwa 4-30, vorzugsweise 6, vorzugsweise 8 Zielabschnitte ausgewählt, welche für das jeweilige Chromosom spezifisch sind. Jeder der Zielabschnitte kommt vorzugsweise nur ein einziges Mal auf einem jeweiligen Chromosom vor und ist somit spezifisch. Wenn eine solche Zelle nun mit einem Satz Primer für ein Chromosom oder auch mit mehreren Sätzθn solcher Primer für alle Chromosomen amplifiziert wird, so ergeben die Amplifikationsreaktionen, wie oben erwähnt, nicht in allen Fällen ein Amplifikat, d.h. dass einige der m Zielabschnitte pro Chromosom nicht amplifiziert werden und später auch nicht nachweisbar sind. Beispielsweise können die Bedingungen so eingestellt werden, dass, wenn ein Chromosom nur einmal vorhanden ist, von den beispielsweise acht Zielabschnitten des jeweiligen Chromosoms nur vier (im statistischen Mittel) amplifiziert werden. Im Ergebnis bedeutet das, dass ein anschließender Nachweis mit entsprechenden Sonden ein Ergebnis von 4/8 ergibt. Hat man zuvor die Amplifikationseffizienz auf einen Wert von 0,5 festgelegt anhand von Kontrollproben, so kann man aus dem Ergebnis 4/8 schließen, dass das Chromosom einfach in der Probe vorhanden war.
Mit dem Beispiel 1 kann untersucht werden, ob ein Polkörperchen das Chromosom 2 einmal oder zweimal enthält. Die Frage, ob Chromosomen einmal oder zweimal in einem Polkörperchen vorhanden sind, ist für die
Untersuchung von Polkörperchen von Bedeutung. In anderen
Fragestellungen kann es jedoch sinnvoll sein zu ermitteln, ob eine vorbestimmte Sequenz mit einer anderen Häufigkeit vorkommt und ob der mögliche Zahlenbereich nicht nur zwei Zahlen wie in diesem Beispiel mit 1 und 2 umfasst, sondern einen Zahlenbereich von z.B. drei, vier oder fünf
Zahlen abdeckt. Um größere Zahlenbereiche erfassen zu können, z.B. ob eine vorbestimmte Sequenz drei, vier, fünf oder sechs mal in einer Probe enthalten ist, kann grundsätzlich auch das erfindungsgemäße Verfahren angewandt werden. Größere Zahlenbereiche können nur mit einer größeren statistischen Grundlage erfasst werden. Hier sind mehr unterschiedliche
Abschnitte der vorbestimmten Sequenz zu amplifizieren und nachzuweisen.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zum Bestimmen der Häufigkeit bzw. zum Zählen einer kleinen Anzahl einer vorbestimmten Sequenz, die z.B. kleiner als 20, kleiner als 10, vorzugsweise kleiner als 5 bzw. 3 ist, da die statistische Spreizung der Anzahl der erfolgreich amplifizierten Sequenzabschnitte bei einer geringen Anzahl bei vorbestimmten Sequenzen in der Probe besonders ausgeprägt ist.
Bei dem Beispiel 1 ist als statistisches Verfahren der χ2-Test angewandt worden. Es sind jedoch auch andere statistische Verfahren zur Bewertung der Amplifikationsergebnisse geeignet, wie z.B. Mittelwertsvergleich (t-Test, F-Test), varianzanalytische Methoden (ANOVA, MANOVA), Mehrfelder χ2- Testungen oder hierarchische loglineare Methoden möglich.
In einer bevorzugten zweiten Ausführungsform ist es jedoch auch möglich, anstatt die Probe gleich mit spezifischen Primern für die spezifischen Zielabschnitte einer Amplifikationsreaktion zu unterziehen, zunächst eine Whole-Genome-Amplification durchzuführen. Auch für eine WGA- Amplifikation gefolgt von einer spezifischen Amplifikation gemäß Anspruch 1 ist es möglich, anhand einer statistischen Bestimmung von Kontrollproben mit bekannten Anzahlen n von Ausgangsnukleinsäuren (Templates) die Amplifikationsbedingungen so festzulegen, dass aufgrund der statistischen Verteilung von positiven, d.h. erfolgreichen, und negativen, d.h. nicht erfolgreichen, Amplifikationsreaktionen von der Anzahl an amplifizierten Zielabschnitten im Vergleich mit der Anzahl (m) der zuvor ausgewählten Zielabschnitte auf die Anzahl (n) der ursprünglich vorhandenen Nukleinsäuren zu schließen. Die Häufigkeitstabellen (Tabellen 1, 2, 3) beziehen sich dann auf die Kombination der beiden Amplifikationen.
Ein Beispiel für diese zweite Ausführungsform ist in Beispiel 1 angegeben.
Im Rahmen der Erfindung ist jedes Amplifikationsverfahren zum Amplifizieren der Probe geeignet, mit welchem mehrere unterschiedliche vorbestimmte Abschnitte einer zu detektierenden Sequenz amplifiziert werden. Hierzu kann ein einzelner Primer, wie in Beispiel 1 eingesetzt werden. Es ist jedoch auch möglich, mehrere Primerpaare zu verwenden, die jeweils für einen bestimmten Abschnitt oder einige wenige Abschnitte spezifisch sind.
Die Amplifikate können z.B. mittels Elektrophorese, einer Hybridisierungsanalyse auf einem DNA-Array, einem Bead-System oder einer anderen optischen Messung, elektrischen Messung oder elektrochemischen Messung analysiert werden.
Zum Bestimmen der Häufigkeit einer vorbestimmten Sequenz im Genom einer einzelnen Zelle oder einiger weniger nominell identischer Zellen sind folgende Varianten des Verfahrens sinnvoll:
1. 1 Zelle, WGA-Amplifikation (unspezifische Einzelzell-Amplifikation), räumliche Trennung der nachfolgenden PCR Reaktionen (Marker-PCR), Nachweis der Abschnitte (entspricht obigem Ausführungsbeispiel);
2. 1 Zelle, WGA-Amplifikation (unspezifische Einzelzell-Amplifikation), Nachweis der Abschnitte durch komplexe Hybridisierung;
3. 1 Zelle, Multiplex PCR, direkter Nachweis der Abschnitte ohne weitere Amplifikation;
4. wenige nominell identische Zellen, Multiplex PCR mit je einer Zelle pro Reaktionsgefäß, Nachweis der Abschnitte ohne weitere Amplifikation;
5. wenige nominell identische Zellen, spezifische PCR (genau eine) Reaktion mit je einer Zelle pro Reaktionsgefäß, Nachweis der Abschnitte ohne weitere Amplifikation;
6. wenige nominell identische Zellen, spezifische PCR (genau eine) Reaktion mit je einer Zelle pro Reaktionsgefäß, Amplifikation mit je einem unterschiedlichen Primerpaar je Reaktion und Zelle, Nachweis der Abschnitte.
Die Verfahren 1-3 können auch mit wenigen nominell identischen Zellen durchgeführt werden, deren Anzahl vorzugsweise bekannt ist, z.B. ≤10.
Bei den oben angegebenen Varianten 1 und 2 wird eine WGA-Amplifikation ausgeführt, die der WGA-Amplifikation des oben beschriebenen Ausführungsbeispiels entspricht. Eine derartige Einzelzell-Amplifikation wird auch als statistische Amplifikation bezeichnet.
In der Variante Nr. 2 erfolgt der Nachweis der Abschnitte ohne weitere Amplifikation durch eine komplexe Hybridisierung. Unter einer komplexen Hybridisierung versteht man ein Verfahren, bei dem gleichzeitig mehrere Sonden anwesend sind, wie es bei DNA-Arrays oder Bead-Systemen der Fall ist. Bei den Varianten Nr. 3 und 4 wird eine Multiplex PCR ausgeführt. Dies ist eine PCR mit mehreren spezifischen Primerpaaren, die gleichzeitig in einem Reaktionsgefäß ausgeführt werden. Mit jedem Primerpaar wird vorzugsweise exakt ein Abschnitt der Sequenz amplifiziert. Mit einer solchen Multiplex PCR können zweckmäßigerweise zwei bis zehn Abschnitte gleichzeitig amplifiziert werden. Bei einer größeren Anzahl von Abschnitten ergeben sich Probleme, da dann die Amplifikationen zu unspezifisch werden.
Bei der Variante 4 wird die Information über das genetische Material einiger nominell identischer Zellen in einer Probe zusammengefasst. Bei den Varianten 5 und 6 wird das genetische Material einiger nominell identischer Zellen zunächst unabhängig voneinander in jeweils unterschiedlichen Reaktionsgefäßen mit einer spezifischen PCR, die genau einen Abschnitt amplifiziert, untersucht. Danach erfolgt der Nachweis der Abschnitte ohne weitere Amplifikation (Variante 5) oder mit weiterer Amplifikation (Variante 6).
Wenn man mehrere Zellen in die Analyse einsetzt, so wird die Unsicherheit zur Bestimmung der Häufigkeit größer. Die optimale Bestimmung der Häufigkeit ist bei Analyse einzelner Zellen gegeben. Liegen mehrere nominell identische Zellen vor, so können die Ergebnisse verglichen werden. Das erfmdungsgemäße Verfahren ist zur Analyse des Genoms einer einzelnen Zelle (z.B. eines Polkörperchens, einzelner fötaler Zellen aus mütterlichem Blut etc.) besonders geeignet.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Häufigkeit einer vorbestimmten Sequenz in einer Probe bestimmt werden. Die vorbestimmten Sequenz kann mehrfach in separaten Molekülen in der Probe vorliegen. Sie kann jedoch auch mehrfach an einem Strang ausgebildet sein. Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit eine vorbestimmte Sequenz, die mehrfach an einem Strang vorkommt gleichermaßen zählen wie eine vorbestimmte Sequenz die in Form von separaten Molekülen vorliegt. Die zu bestimmende Sequenz muss lediglich ausreichend lang sein, damit mehrere Abschnitte unabhängig voneinander amplifiziert werden können. Die Länge der vorbestimmten Sequenz beträgt mindestens 100 Basen, vorzugsweise einige 100 Basen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können gleichzeitig die Häufigkeiten mehrerer unterschiedlicher vorbestimmter Sequenzen bestimmt werden, wobei auch hier die unterschiedlichen Sequenzen an unterschiedlichen Strängen oder auf dem gleich Strang ausgebildet sein können. Auf dem gleichen Strang können sich die unterschiedlichen Sequenzen auch überlappen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können relative Häufigkeiten einer vorbestimmten Sequenz unterschiedlicher Proben ermittelt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann jedoch auch durch eine Versuchsreihe derart validiert werden, dass die Häufigkeit des Vorhandenseins bzw. Nicht¬ Vorhandenseins der bestimmten Abschnitte im Amplifikat eine Aussage über die absolute Anzahl der vorbestimmten Sequenzen einer Probe zulässt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Bestimmen der Häufigkeit von Sequenzen, die sich auf einem gemeinsamen Strang befinden, sowie zum Bestimmen der Häufigkeit von Sequenzen, die sich auf unterschiedlichen Strängen befinden, angewandt werden. Die Sequenzen sollen lediglich eine ausreichende Länge besitzen, dass unterschiedliche Abschnitte mittels Primer adressierbar sind.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend
(i) einen oder mehrere spezifische Primer, mit welchen eine Anzahl m von Zielabschnitten der vorbestimmten Sequenz, deren Häufigkeit in einer Probe bestimmt werden soll, zu jeweils unterschiedlichen Amplifikaten amplifiziert werden können, (ii) gegebenenfalls Kontrollproben für jeden möglichen Wert n der Häufigkeit der vorbestimmten Sequenz in der Kontrollprobe und/oder
(iii) gegebenenfalls Ergebnisse von Amplifikationsreaktionen mit den Primern aus (i) und/oder von Kontrollproben mit bekannter Häufigkeit der zu zählenden Sequenz, z.B. den Kontrollproben aus (ii),
(iv) die Angaben der Reaktionsbedingungen für die Amplifikationsreaktionen.
Der Kit kann weiterhin einen oder mehrere unspezifische Primer, mit welchen die vorbestimmte Sequenz nach einem vorgegebenen Protokoll unspezifisch amplifiziert werden kann, umfassen.
Die Angabe der Ergebnisse der Kontroll-Amplifkationsreationen kann in Form von gespeicherten Daten erfolgen, oder es können gedruckte Materialien dem Kit beigefügt werden, aus denen der Anwender die Ergebnisse ablesen und mit seinen eigenen Ergebnissen aus echten Proben vergleichen kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch auf kleinem Raum, z.B. auf einem festen Träger, Chip oder einem Objektträger oder dgl. durchgeführt werden. Auch in Multiwell-Platten, z.B. Mikrotiterplatten, kann das Verfahren durchgeführt werden. Der feste Träger ist vorzugsweise ein Objektträger, eine CD oder ein sonstiger fester Träger, der für DNA-Array-Formate verwendet wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung, die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Die Vorrichtung enthält vorzugsweise eine Einrichtung zur Detektion von Nukleinsäuren, die z.B. mit markierten Sonden „gefangen" wurden, d.h. z.B. eine Einrichtung zum Nachweis von Fluoreszenz oder kolorimetrischen Messmethoden. Die Vorrichtung umfasst weiterhin entweder gespeicherte Daten, welche als Vergleichsdaten dienen, um die Ergebnisse aus den Amplifikationen den Kontrolldaten so zuordnen zu können, dass durch den Vergleich die Bestimmung der absoluten Anzahl von ursprünglich in einer Probe enthaltenen vorbestimmten Sequenzen ermöglicht wird. Anstelle von Kontrolldaten, die in der Vorrichtung gespeichert sind, ist es auch möglich, dass die Vorrichtung zusätzlich oder alternativ dazu Kontrollstellplätze enthält, auf denen Kontrollproben unter den gleichen Bedingungen wie die Proben analysiert werden können. Die Kontrollproben enthalten z.B. die im echten Versuch nachzuweisende Nukleinsäure bzw. vorbestimmte Sequenz in den folgenden Anzahlen: n = 0, n = 1, n = 2, n = 3 usw. Das erfindungsgemäße Verfahren wird dann mit den Kontrollen genauso durchgeführt wie mit den echten Proben. Die weitere Erläuterung der Erfindung erfolgt unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, die zeigen in:
Figur 1 in einer Tabelle die Ergebnisse eines ersten Beispiels, und
Figur 2a, 2b Abbildungen einer Elektophoreseuntersuchung zum Nachweis der vorbestimmten Abschnitte.
Figur 3 zeigt einen Vergleich bezüglich des Vorhandenseins bzw. NichtVorhandenseins von Chromosomen für 7 Zelllinien von der Firma Coriell auf der einen Seite und gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren auf der anderen Seite. Transparente Kästchen: Chromosomen vorhanden (Ergebnisse der Methoden stimmen überein). Schraffierte Kästchen: Chromosomen nicht vorhanden (Ergebnisse der Methoden stimmen überein). Gepunktete Kästchen: Erfindungsgemäßes Verfahren zeigt das Vorhandensein eines Chromosoms, die anderen Verfahren nicht. Schwarze Kästchen: Erfindungsgemäßes Verfahren zeigt NichtVorhandensein des Chromosoms, die anderen Methoden das Vorhandensein.
Figur 4 zeigt das Ergebnis einer FISH-Analyse einer humanen Eizelle mit einem Hybridierungskit der Firma Vysis.
Figur 5 zeigt die Image-Analyse eines Scans mit dem Programm „TIFF- Analyser".
Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der nachfolgenden Beispiele erläutert:
Beispiel 1
Es soll untersucht werden, ob in einem Polkörperchen das Chromosom 2 einmal oder zweimal vorhanden ist.
Ein Polkörperchen wurde hierzu nach der Entnahme mit destilliertem Wasser gewaschen und auf einen beschichteten Objektträger gelegt. Dieses Polkörperchen bildete eine Probe 1. Zum Vergleich wurde eine Probe 2 mit zwei Polkörperchen in gleicher Weise zubereitet.
Einzelzell-WGA-PCR
Mit einer Einzelzell-WGA-PCR wurden die beiden Proben amplifiziert. Eine Einzelzell-WGA-PCR ist dazu ausgelegt, das genetische Material einer einzelnen Zelle oder einiger weniger Zellen zu amplifizieren. Die Einzelzell- WGA-PCR wird auf einem Objektträger durchgeführt, wobei auf die Proben jeweils 1 μl PCR-Mix und 5 μl Mineralöl gegeben wurden.
25 μl PCR-Mix sind folgendermaßen zusammengesetzt: 19,125 μl Ampullen-Wasser 2,5 μl MgCI2 (25 mM)
2,5 μl dNTP-Mix Qe 2 mM)
0,375 μl HotStar Taq-DNA Polymerase von Qiagen (5 U/μl)
0,5 μl AIeI Primer (100 pmol/μl)
Der AIeI Primer weist folgende Sequenz auf:
AIeI δ'-TCCCAAAGTGCTGGGATTACAG-S' (SEQ ID No. 1)
Die PCR-Ansätze, bestehend aus jeweils einer Probe, dem PCR-Mix und dem Ölfilm, wurden mit folgenden PCR-Bedingungen gecycelt:
Denaturierung: 15 min bei 95 0C
40 Zyklen 30 sec bei 94° C
30 sec bei 62 0C 30 sec bei 72° C
Elongation 10 min bei 72° C
Mit dieser PCR werden mehrere unterschiedliche Abschnitte der Proben gleichzeitig amplifiziert. Sie kann deshalb auch als WGA-PCR bezeichnet werden.
Das PCR-Produkt wurde in 20 μl TE-Puffer überführt. 2 μl davon wurden auf einem Polyacrylamid-Gel analysiert, 15 μl wurden mit einer Marker-PCR amplifiziert. Der Rest wurde bei -20 0C eingefroren.
Marker-PCR
Die Marker-PCR wurde zum Nachweis, ob bestimmte Abschnitte der Proben mit der Einzelzell-WGA-PCR amplifiziert worden sind, ausgeführt.
Mit der Marker-PCR wurden jeweils Teile des PCR-Produkts der Einzelzell- PCR mit jeweils einem anderen Primerpaar amplifiziert, die jeweils für einen dieser Abschnitte spezifisch sind. Für eine jede einzelne Marker-PCR wurde folgender PCR-Ansatz zubereitet:
1,5925 μl Ampullenwasser 0,6 μl Puffer
0,6 μl MgCI2 (25 mM)
0,0325 μl Taq-Polymerase (5 U/μl) von Promega
0,075 μl PCR-Produkt der Einzelzell-PCR
2,5 μl Primer (2 pmol/μl) vorgelegt
Die Primerpaare wurden in Reaktionsgefäßen von Mikrotiterplatten vorgelegt und der übrige PCR-Ansatz wurde hinzu pipettiert. Zum Nachweis der Abschnitte, die vom Chromosom 2 in der Einzelzell-PCR amplifiziert wurden, wurden folgende acht Primerpaare verwendet:
RH102790 δ'-TGAAGTCATCGTCTATAAGGCA-S' 5'-TCTATTTGTCCTGGGACCCA-3'
SHGC-31419 δ'-TCCTATTTTGAGGGCGAGG-S' δ'-ATAAATACAAACATGTCAGACTGGG -S'
SHGC-62010 δ'-AAGGTTTTATAATGGAAACACTG-S' δ'-TGAGTTCTGGAATTCATTACATA-S'
RH102813 δ'-CCAACCACTTCAAGAAATAGGC-S' 5'-AATACAGTGTGGCCAAAGCC-3' SHGC-30955 5'-G l I I I I I CTTTGAGTGACACAAGC-3' 5'-ACTTGTGTGATTTGTAAGCTGAAC-S'
G62066 δ'-GCCTCACAAGCCTCATCAGT-S' δ'-CGGACTTGTCTAGAAATGAGCA-S'
G31877 δ'-TTGGCCTCCACTTTACAGAC-S' 5'-CACCCGGCCTATGGACAGA-3'
SHGC-144725 δ'-ATGGACAGGATGGTGATAAGGAA-S' δ'-AGATGCAAGGAAAGATGCTTACG-S'
Die Sequenzen der obigen Primer sind in SEQ ID No. 2-17 dargestellt.
Mit folgenden PCR-Bedingungen wurden die beiden Proben in jeweils acht PCR-Ansätzen mit jeweils einem der oben angegebenen Primerpaaren amplifiziert: Denaturierung: 3 min bei 95 0C
35 Zyklen 30 sec bei 95 0C
30 sec bei 55 0C
30 sec bei 72 0C Elongation 10 min bei 72 0C
Nach den Amplifikationen wurden die 16 Amplifikate jeweils mit einem Loading-Puffer auf einem Polyacrylamid-Gel dahingehend analysiert , ob der jeweils vorbestimmte Sequenzabschnitt vorhanden war, d.h. ob die Amplifikation positiv oder negativ verlaufen ist. Die entsprechenden Abbildungen der Elektrophorese-Untersuchung auf Polyacrylamid-Gel sind in Fig. 2a und 2b gezeigt, wobei Fig. 2a die Banden der Probe 1 und Fig. 2b die Banden der Probe 2 zeigt. Anhand dieser Abbildungen kann man erkennen, dass bei der Probe 1 zwei positive Amplifikate ermittelt worden sind. Die übrigen sechs weiteren Amplifikate sind negativ, d.h., dass lediglich zwei der durch die Auswahl der Primer der Marker-PCR vorbestimmten Abschnitte des Chromosons 2 mit der Einzelzell-PCR amplifiziert worden sind. Bei der Probe 2 wurden acht positive Amplifikate ermittelt, d.h., dass alle acht vorbestimmten Abschnitte mit der Einzelzell- PCR amplifiziert worden sind. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 zusammengefasst.
Bei dem in Fig. 2a und 2b gezeigten Beispiel sieht man eindeutig, dass bei der Probe 2 alle acht Abschnitte amplifiziert worden sind, wohingegen bei der Probe 1 lediglich die mit den Nummern 2 und 7 versehenen Abschnitte amplifiziert worden sind, wobei das Signal für den mit der Nummer 2 versehenen Abschnitt schwächer ist. Grundsätzlich ist es zweckmäßig, einen Schwellenwert festzulegen, mit dem man eine positive Amplifikation eines Abschnittes von einer negativen Amplifikation diskriminiert, um ein rein digitales Ergebnis zu erhalten, das beispielsweise auch durch eine „0" für eine negative Amplifikation und eine "1" für eine positive Amplifikation darstellbar ist. Diese Schwellenwerte müssen in Abhängigkeit der gewählten Methode zum Nachweis der Abschnitte empirisch festgelegt werden.
Das Beispiel 1 zeigt sehr eindrucksvoll den Effekt, dass bei einer geringeren Anzahl vorbestimmter Sequenzen (hier: das Chromosom 2 der Probe 1) in einer Probe weniger Abschnitte der Sequenz amplifiziert werden als bei einer höheren Anzahl vorbestimmter Sequenzen (hier: das Chromosom 2 der Probe 2) in einer Probe.
Ob dieses Ergebnis auf einer rein zufälligen Stichprobe beruht oder eine Signifikanz besitzt, kann mit statistischen Verfahren ermittelt werden. Ein geeignetes statistisches Verfahren ist der χ2-Test (auch: Chi-Square Test), wie er z.B. in L. Cavalli - Sforza, Biometrie, Gustav Fischer Verlag Stuttgart,
1974 im Kapitel 22 beschrieben ist. Bei Anwendung dieses Tests auf die ermittelten Ergebnisse ergibt sich ein Wert für χ2 von 9,6 und eine Irrtumswahrscheinlichkeit P von 0,003. Das bedeutet, dass die Hypothese
„die Unterschiede in den beobachteten Häufigkeiten sind zufällig" mit einer
Irrtumswahrscheinlichkeit von P = 0,003 verworfen wird.
Mit diesem Verfahren wurde somit festgestellt, dass in der Probe 2 mehr Chromosomen 2 als in der Probe 1 enthalten sind.
Führt man das oben beschriebene Verfahren mehrmals durch und wertet man die Ergebnisse statistisch aus, so kann man anhand der hierdurch ermittelten statistischen Daten die absolute Anzahl des Chromosons 2 in einer Probe anhand der Häufigkeit des Vorhandenseins bzw. Nicht¬ Vorhandenseins der bestimmten Abschnitte im Amplifikat bestimmen. Dies stellt eine Validierung des Verfahrens zum Zählen der absoluten Anzahl der vorbestimmten Sequenzen einer Probe dar. Bei dieser Validierung ist der Einfluss der oben beschriebenen Schwellenwerte zu berücksichtigen. Wird der Schwellenwert hoch angesetzt, so gibt es weniger positive Amplifikationen der Abschnitte, wohingegen bei einem geringen Schwellenwert es mehrere positive Amplifikationen gibt.
Beispiel 2
Es wurden 7 Zelllinien (P1-2 bis P1-8) auf die An- bzw. Abwesenheit von bestimmten Chromosomen getestet. Die Zelllinien wurden von Coriell erhalten. Die von Coriell erhaltenen Zellen wurden bereits von Coriell selbst auf die An- bzw. Abwesenheit bestimmter Chromosomen getestet. Die Zellen wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls getestet. Das Ergebnis ist in Figur 3 dargestellt. Die DNA der Zellen wird ausgeliefert und enthält laut Packzettel ein bestimmtes Panel an humanen Chromosomen. Zusätzlich zu dieser Aussage von Coriell kann noch ein Testergebnis von der Web-Seite von Coriell geholt werden, dem ein Blotting Test zugrunde liegt. Warum die Firma zwei Angaben macht, ist nicht bekannt. Offensichtlich ist der Blotting- Test sensitiv genug, um auch Chromosomen zu detektieren, die nur in einem Bruchteil der Zellen enthalten sind. Die dritte Zeile der Figur 3 zeigt jeweils das Ergebnis des Chips.
Ergebnis:
In über 90 % der Fälle stimmen die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens mit denen der anderen Methoden überein.
Experimentelle Durchführung der PCR auf den Coriell-Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung:
Jeweils 10 ng chromosomale DNA wurden in eine 25 μl Ale PCR (Whole- Genom-Amplification mit dem Primer AIeI; siehe Beispiel 1) eingesetzt und nach Standardbedingungen gecycelt:
Der 25 μl PCR-Ansatz wurde gereinigt (PCR-Purification Kit Macherey & Nagel) und in 250 μl Elutionspuffer aufgenommen. Davon wurde jeweils 1 μl auf jeden mit Master-Mix vorgelegten Anker eines Chips gegeben.
und dieser wurde mit den folgenden Bedingungen gecycelt und hybridisiert.
Die Südes wurden anschließend gewaschen und eingescannt (Standard Scanner von der Firma Axxon oder der Firma Tecan).
Beispiel 3
Während der Reifeteilung einer humanen Eizelle wird der diploide Chromosomensatz mit 4 Kopien einer Sequenz auf die reife Eizelle mit nur einer Kopie reduziert. Die Teilung verläuft in 2 Schritten: a. Trennung der homologen Chromosomen in Eizelle 4"* 1. Polkörper b. Trennung der Chromatiden in reife Eizelle 4r ■> 2. Polkörper
Der erste Polkörper enthält 2 Kopien einer Sequenz, die reife Eizelle sowie der zweite Polkörper enthalten jeweils eine Kopie einer Sequenz. Folgende Verteilungen (z.T. Fehlverteilungen) sind denkbar: Reife Eizelle enthält 4 Kopien <r ■> Polkörper enthalten keine Kopie Reife Eizelle enthält 3 Kopien <r ■> Polkörper enthalten eine Kopie Reife Eizelle enthält 2 Kopien <• ■* Polkörper enthalten 2 Kopien Reife Eizelle enthält 1 Kopie <r ■* Polkörper enthalten 3 Kopien Reife Eizelle enthält keine Kopie <r "^ Polkörper enthalten 4 Kopien
Fehlverteilungen kommen vor und können dazu dienen, die Richtigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zu zeigen.
Im Beispiel werden korrespondierende Polkörper und Eizellen untersucht. Zeigt die Fluoreszenz-In Situ-Hybridisierung (FISH) 4 richtige Signale, so darf in den Polkörpern keine Sequenz nachweisbar sein. Zeigt die FISH 3 oder weniger Signale, so muss das erfindungsgemäße Verfahren positiv sein (die Polkörper enthalten mindestens eine Kopie).
Folgendes Experiment zeigt die Korrespondenz der Chip Ergebnisse zu einer etablierten FISH Methode. Die Bearbeitung der Einzelzelle und die FISH Hybridisierung erfolgt nach dem Protokoll der Firma Vysis, die jedem Kit beiliegt.
Das Ergebnis der FISH-Analyse einer humanen Eizelle mit einem Hybridisierungs-Kit der Firma Vysis ist in Figur 4 dargestellt. Die größten Punkte (im Original blau) sind fluoreszenzmarkierte Sondenmoleküle, die spezifsch Chromosom 16 nachweisen. 4 positive Signale (keine Aartefakte) zeigen an, dass sich 4 Chromatiden in der Eizelle befinden, während der Meiose sind die Chromatiden fälschlicherweise in der Eizelle verblieben. Korrespondierende Analyse per Chip:
Das Polkörperamplifikat wird nach Whole Genome Amplification auf An/Abwesenheit aller Chromosomen untersucht. Die experimentelle Vorgehensweise ist oben in den Beispielen 1 und 2 beschrieben. Die PCR Bedingungen und Komponenten sind wie in Beispiel 2, allerdings wird das Template (DNA) ersetzt durch Polkörper, der sich als Template auf dem Chip befindet.
Ergebnis des Scans:
Die Image Analyse der Bilddatei erfolgt mittels des Programms „TIFFAnalyzer" der Firma Alopex. Chromosom 16 ist nicht nachzuweisen. Das Ergebnis dieser Analyse ist in Fig. 5, Spalte 5 dargestellt.
Das korrespondierende erste Polkörperchen enthält dementsprechend kein Chromosom 16. Dies kann durch den Chip gezeigt werden.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit einer vorbestimmten Sequenz oder mehrerer zur vorbestimmten Sequenz identischen oder nahezu identischen Sequenzen einer Probe, umfassend folgende Schritte:
- Ausführen einer oder mehrerer Amplifikationsreaktionen mit welchen mehrere unterschiedliche Zielabschnitte der Sequenz bzw. Sequenzen der Probe zu einem Amplifikat amplifiziert werden können,
- Nachweisen, ob bestimmte unterschiedliche Zielabschnitte der Sequenz der Probe amplifiziert worden sind, und
- Bestimmen der Häufigkeit der Sequenz(en) in der Probe anhand der Häufigkeit des Vorhandenseins bzw. Nicht-Vorhandenseins der bestimmten unterschiedlichen Zielabschnitte im Amplifikat.
2. Verfahren nach Anspruch 1 zum Bestimmen der Häufigkeit n einer vorbestimmten Sequenz oder mehrerer zur vorbestimmten Sequenz identischen oder nahezu identischen Sequenzen in einer Probe, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Probe, enthaltend die Sequenz in einer zu bestimmenden Häufigkeit n,
(b) Bereitstellen von Primern, mit welchen eine Anzahl m von Zielabschnitten der vorbestimmten Sequenz in der Probe zu jeweils unterschiedlichen Amplifikaten amplifiziert werden können,
(c) Ausführen einer oder mehrerer Amplifikationsreaktionen mit der Probe aus (a) und den Primern aus (b), wobei die Reaktionsbedingungen so gewählt werden, dass die Anzahl der erfolgreichen Amplifikationsreaktionen abhängig ist von der Häufigkeit n der vorbestimmten Sequenz in der Probe,
(d) Nachweisen der amplifizierten Zielabschnitte aus Schritt (c) und Bestimmen der Anzahl der erfolgreichen Amplifikationsreaktionen,
(e) Bestimmen der Häufigkeit n der in der Probe enthaltenen vorbestimmten Sequenz.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin umfassend den Schritt: (f) Bestimmen der Häufigkeit n der in der Probe enthaltenen vorbestimmten Sequenz durch Vergleich mit einer oder mehreren Kontrollen, in denen die vorbestimmte Sequenz mit einer bekannten Häufigkeit vorliegt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Kontrollen aus Schritt (f) Kontrollproben sind, welche die Sequenz mit einer bekannten Häufigkeit enthalten, und wobei die Kontrollproben den gleichen Amplifikationsbedingungen wie die Probe unterzogen werden.
5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Kontrollen aus Schritt (f) validierte Daten aus Kontrollproben sind, welche die Sequenz mit einer bekannten Häufigkeit enthalten, und welche den gleichen Amplifikationsbedingungen wie die Probe unterzogen wurden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Ausführen der Amplifikationsreaktion aus Schritt (b) die folgenden Schritte umfasst: (i) Ausführen einer ersten Amplifikationsreaktion mit einem oder mehreren unspezifischen Primern, welche die vorbestimmte
Sequenz unspezifisch amplifizieren, (ii) Ausführen einer zweiten Amplifikationsreaktion mit für die jeweiligen
Zielabschnitte spezifischen Primern.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe eine Einzel-Zelle ist und/oder die Sequenzen einer einzigen Zelle umfasst.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe ein Polkörperchen ist und/oder die Sequenzen eines einzigen Polkörperchens umfasst.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die vorbestimmte Sequenz ein Chromosom oder ein Fragment oder ein Teil davon ist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zu bestimmende Häufigkeit n der vorbestimmten Sequenz in der Probe zwischen 0 und 100, vorzugsweise im Bereich zwischen 0 bis 30, vorzugsweise im Bereich zwischen 0 bis 10 liegt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die zu bestimmende Häufigkeit n der vorbestimmten Sequenz in der Probe zwischen 0 und 5 liegt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die zu bestimmende Häufigkeit n der vorbestimmten Sequenz in der Probe 0, 1 , 2 oder 3 ist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Schwellenwert für eine erfolgreiche Amplifikationsreaktion festgelegt wird.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reaktionsbedingungen so gewählt werden, dass die Effizienz der Amplifikationsreaktion für n = 1 für einen gegebenen Zielabschnitt zwischen 0,2 und < 1 beträgt.
15. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Reaktionsbedingungen so gewählt werden, dass die Effizienz der Amplifikationsreaktion für n = 1 für einen gegebenen Zielabschnitt zwischen 0,4 und 0,6, vorzugsweise etwa um 0,5 beträgt.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Anzahl m der für die vorbestimmte Sequenz spezifischen Zielabschnitte mindestens 4 beträgt.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Anzahl m der für die vorbestimmte Sequenz spezifischen Zielabschnitte mindestens 6 beträgt.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei die Anzahl m der für die vorbestimmte Sequenz spezifischen Zielabschnitte mindestens 8 beträgt.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei beim Bestimmen der Häufigkeit n der vorbestimmten Sequenz(en) in der Probe anhand des Vorhandenseins bzw. Nicht-Vorhandenseins von Amplifikaten der bestimmten unterschiedlichen Zielabschnitte validierte Daten verwendet werden, wobei die validierten Daten aus Kontrollproben erhalten wurden, in denen die vorbestimmte Sequenz mit einer bekannten Häufigkeit vorliegt, so dass die absolute Häufigkeit n der vorbestimmten Sequenzen bestimmt wird.
20. Verfahren einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zum Ausführen der Amplifikationsreaktion ein Typ von Primern
(statistische Primer) verwendet wird, der zum Amplifizieren unterschiedlicher Zielabschnitte der Sequenz(en) geeignet ist.
21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei zum Untersuchen, ob bestimmte Zielabschnitte der vorbestimmten Sequenz amplifiziert worden sind, das Amplifikat mittels mehrerer Typen von Primern, die für jeweils einen oder mehrere der bestimmten unterschiedlichen Zielabschnitte spezifisch sind, amplifiziert wird.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zum Ausführen der Amplifikationsreaktionen der Probe mehrere Typen von Primern verwendet werden, die für jeweils einen oder mehrere der bestimmten unterschiedlichen Zielabschnitte spezifisch sind.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Amplifikat mittels Elektrophorese, einer
Hybridisierungsanalyse auf einem DNA-Array, einer Markierungsmethode, eines Bead-Systems oder anderer optischer, elektrischer oder elektrochemischer Messungen auf das Vorhandensein der unterschiedlichen Abschnitte untersucht wird, wobei bestimmt wird, ob die Menge Amplifikat eines jeweiligen Zielbschnittes einen bestimmten Schwellenwert überschreitet.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mit Markierungen versehene spezifische Primer verwendet werden, und bei der Untersuchung der bestimmten unterschiedlichen Zielabschnitte detektiert wird, ob die einem bestimmten unterschiedlichen Zielabschnitt vermittels des jeweiligen Primers zugeordnete Markierung einen vorbestimmten Schwellenwert überschreitet.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Häufigkeit der vorbestimmten Sequenz(en) mittels statistischer Analyse aus der Häufigkeit der bestimmten Zielabschnitte im Amplifikat bestimmt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Aussage der statistischen Analyse einer Irrtumswahrscheinlichkeit von weniger als 10 % und vorzugsweise weniger als 1 % unterliegt.
27. Kit zur Durchfürung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 26, umfassend (i) einen oder mehrere spezifische Primer, mit welchen eine Anzahl m von Zielabschnitten der vorbestimmten Sequenz, deren Häufigkeit in einer Probe bestimmt werden soll, zu jeweils unterschiedlichen Amplifikaten amplifiziert werden können,
(ii) gegebenenfalls Kontrollproben für jeden möglichen Wert n der Häufigkeit der vorbestimmten Sequenz in der Kontrollprobe und/oder
(iii) gegebenenfalls Ergebnisse von Amplifikationsreaktionen mit den Primern aus (i) und/oder von Kontrollproben mit bekannter Häufigkeit der zu zählenden Sequenz, (iv) Angaben der Reaktionsbedingungen für die
Amplifikationsreaktionen.
28. Kit nach Anspruch 27, weiterhin umfassend:
(v) einen oder mehrere unspezifische Primer, mit welchen die vorbestimmte Sequenz unspezifisch amplifiziert werden kann.
(vi) gegebenenfalls Ergebnisse von Amplifikationsreaktionen mit den Primern aus (i) und (v) und/oder von Kontrollproben mit bekannter Häufigkeit der zu zählenden Sequenz,
(vii) Angaben der Reaktionsbedingungen für die Amplifikationsreaktionen.
29. Kit nach Anspruch 27 oder 28, weiterhin umfassend Reagenzien zur Durchführung einer Amplifikationsreaktion.
30. Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 29, weiterhin umfassend einen festen Träger zur Durchführung der Amplifikationsreaktion und/oder des Nachweises der amplifizierten Zielabschnitte.
31. Kit nach Anspruch 30, wobei der feste Träger ein Chip oder ein Objekträger ist.
32. Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 31 , weiterhin umfassend geeignete Sonden zum Nachweis der spezifischen Zielabschnitte.
33. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die Vorrichtung umfasst:
(a) einen festen Träger, auf welchem das Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis 26 durchgeführt wird, (b) eine Einrichtung zur Detektion der auf dem festen Träger aus (a) erhaltenen Amplifikate sowie (c) entweder gespeicherte Kontrolldaten, welche aus Kontrollproben erhalten wurden, in denen die vorbestimmte Sequenz mit einer bekannten Häufigkeit vorliegt, oder (d) Kontrollstellplätze, auf denen Kontrollproben unter den gleichen
Bedingungen wie das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26 analysiert werden können.
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