EP1200614A1 - Herbizidresistente transgene pflanzen mit mutiertem alpha-tubulin - Google Patents

Herbizidresistente transgene pflanzen mit mutiertem alpha-tubulin

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EP1200614A1
EP1200614A1 EP00954581A EP00954581A EP1200614A1 EP 1200614 A1 EP1200614 A1 EP 1200614A1 EP 00954581 A EP00954581 A EP 00954581A EP 00954581 A EP00954581 A EP 00954581A EP 1200614 A1 EP1200614 A1 EP 1200614A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
tubulin
alpha
plant
dna construct
dna
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00954581A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter Nick
Diego Breviario
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Original Assignee
Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Albert Ludwigs Universitaet Freiburg filed Critical Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Publication of EP1200614A1 publication Critical patent/EP1200614A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers

Definitions

  • the present invention relates to DNA constructs which code for mutated tubulins, and to plants and plant cells which contain these constructs.
  • the invention further relates to processes for the production of plants with increased herbicide resistance and altered sensitivity to cold.
  • red rice has mainly been tried to prevent the initial infection of rice fields. This is complicated by the fact that the red rice has a perfect mimicry, so that it is practically impossible to keep the seeds clean.
  • pseudo sowing is carried out, that is plowing over without sowing, so that the seeds of the red rice that persist in the soil are germinated.
  • herbicides When using herbicides to control harmful herbs, it would be desirable for the herbicide to selectively prevent only the harmful herbs and not the useful plants from growing. It is therefore an object of the present invention to provide a plant which is insensitive to certain herbicides, as well as starting materials and methods for producing such plants.
  • Microtubules are polymers made up of heterodimers of alpha and beta tubulin. Plant microtubules play an important role in the control of plant development, for example in the control of growth, tuber formation, branching, leaf and root formation, in the formation of wood, in gravitropism and in the reaction to light, wind, pathogens and cold. Nevertheless, they have so far not used biotechnologically, although numerous tubulin genes with diverse regulatory patterns are known. The reason is essentially that there has been no possibility to manipulate the behavior of the tubulin proteins and thus the function.
  • the invention relates to transgenic plants which express alpha-tubulins whose C-terminus is modified in such a way that certain herbicides can no longer bind.
  • the exogenous alpha-tubulin gives the microtubules of the transgenic plants increased resistance to certain herbicides.
  • C-terminus of an alpha tubulin encompasses that C-terminal amino acid region of an alpha tubulin that can be deleted without losing the ability of the alpha tubulin to be incorporated into microtubules.
  • One aspect of the invention is DNA constructs which are suitable for expressing a C-terminally modified alpha tubulin in plant cells.
  • the alpha tubulin for which the DNA sequence encoded has an N-terminal part, which is unchanged to the extent that the alpha-tubulin can still be incorporated into microtubules.
  • the C-terminal part of the encoded alpha-tubulin has a mutation compared to the wild-type tubulin from which the DNA sequence is derived.
  • the DNA construct according to the invention also has at least one DNA sequence which controls the expression of the alpha tubulin DNA sequence in plant cells.
  • the DNA construct according to the invention also contains at least one DNA sequence which codes for a resistance factor which allows the selection of transfected plant cells.
  • Resistance factors are often proteins with enzymatic activity that can convert or break down certain compounds. Consequently, genes which code for these proteins are used as DNA sequences.
  • DNA sequences which code for the resistance factor neomycin phosphotransferase II are preferably used. This conveys resistance to kanamycin.
  • This DNA sequence coding for a resistance factor is also under the control of a DNA sequence which regulates the expression of the sequence in plant cells. It is preferably a promoter which is suitable for the expression of DNA sequences in plant cells.
  • the resistance factor can be the C-terminally modified alpha tubulin itself. Expression of the modified alpha tubulin can confer resistance to certain herbicides. It is therefore possible to select transfected cells by culturing in the presence of the herbicides.
  • One embodiment of the invention is therefore a DNA construct which has a DNA sequence which is for a C-terminal modified alpha-tubulin, but no additional DNA sequence that codes for a resistance factor.
  • the DNA sequence coding for a resistance factor is the alpha-tubulin sequence itself.
  • the DNA constructs according to the invention are preferably circular plasmids which encode a C-terminally mutated alpha-tubulin under the control of a promoter active in plant cells and have a resistance gene under the control of a promoter active in plant cells.
  • Ti plasmids which are derived from the Ti plasmid from Agrobacterium tumefaciens and are suitable for the production of transgenic plants are also conceivable. However, they can also be “naked” DNA constructs or constructs with viral components.
  • the DNA construct according to the invention is at least partially produced in vitro. This means that at least one step in the production of the DNA construct took place outside of a plant cell.
  • the DNA constructs according to the invention differ from naturally occurring sequences.
  • the DNA sequence coding for the alpha tubulin can either have been isolated from a gene library, but it can also be produced by polymerase chain reaction (PCR) or by chemical synthesis. A combination of these methods is also conceivable.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the alpha-tubulin sequence is cloned into the "multiple cloning site" of an expression vector which is suitable for the expression of DNA sequences in plant cells.
  • the C-terminal mutation of the alp a-tubulin gene can be obtained in different ways. For example, part of an alpha tubulin that already has the corresponding one Mutation carries, be cloned into the desired alpha tubule gene.
  • the mutated starting sequence can originate, for example, from a herbicide-resistant plant line in which the alpha-tubulin gene has been isolated and sequenced and a corresponding mutation has been found.
  • the mutation is preferably introduced by in vitro mutagenesis. Point mutations are specifically introduced into the DNA of the alpha tubulin gene. Suitable methods for this can be based on the PCR technique.
  • the alpha-tubulin DNA sequence into which the mutation is to be introduced is used as the template.
  • the PCR primers carry a corresponding base exchange with respect to the template sequence.
  • the mutation is also amplified via the primers.
  • the C-terminal mutation of the alpha-tubulin is at an amino acid position that is within the amino acid range that corresponds to the amino acid positions 414 to 451 of the alpha-tubulin TUBA1 from rice. Most preferably, however, the C-terminal mutation of the alpha-tubulin is located at an amino acid position which lies within the 15 C-terminal amino acids of the corresponding wild-type alpha-tubulin from which the DNA sequence is derived.
  • the mutations can be of different types. At the DNA level, deletions, insertions, or one or more point mutations can be involved. At the amino acid level, there can be point mutations, so that the mutated alpha-tubulin has at least one amino acid position a different amino acid than the corresponding wild-type alpha-tubulin from which the tubulin sequence is derived. However, mutations are preferred which lead to a shortened C-terminus in the expressed alpha-tubulin. This is achieved in that a codon which codes for an amino acid in the corresponding wild-type alpha-tubulin is converted into a stop codon. Conceivable are, however, also mutations which lead to a shift in the reading frame so that "foreign amino acids" are encoded which are not part of a tubulin sequence.
  • the most preferred is a DNA construct in which, in the mutated DNA sequence, the codon which corresponds to codon 414 of the TUBA1 alpha-tubulin gene from rice is a stop codon.
  • the DNA sequence coding for the alpha tubulin is usually derived from a plant alpha tubulin gene. However, this is not mandatory, since due to the very high degree of conservation of the tubulins, alpha-tubulin genes from non-plant organisms in plants could also be functional. Chimeric tubulin sequences that are composed of sections of different tubulin genes are even conceivable.
  • the alpha-tubulin-DNA sequence of the DNA construct is a DNA sequence which codes for an alpha-tubulin of a useful plant. It is preferably a DNA sequence which codes for an alpha tubulin of rice, most preferably at least a part of the gene TUBA1 of rice. Also preferred are DNA constructs that contain a DNA sequence that codes for an alpha tubulin of the potato.
  • the DNA construct according to the invention can also have a DNA sequence which codes for a beta-tubulin. This is advantageous if high expression levels are reached, since the ratio of alpha to beta tubulin could then be disturbed by expression of the alpha tubulin alone. This is avoided by the simultaneous expression of a beta tubulin.
  • Alpha and beta tubulin sequences are preferably located in succession as a "tandem construct".
  • the DNA construct can complete sequence of the OSTBB16 gene (coding for beta-tubulin) from rice.
  • the most important control sequences for regulating the expression of the alpha-tubulin sequence are promoters.
  • the following promoters are preferably used:
  • the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (CaMV) allows constitutive expression in plant cells.
  • the maize ubiquitin promoter achieves very strong expression in cereal cells.
  • the rice TUBA1 promoter is suitable for expressing DNA sequences in growing cells, while the rice OSTBB16 promoter is suitable for constitutive expression.
  • specific promoters can be used to achieve expression that is limited in time and space. An example of this is the use of the potato patatin promoter. He ensures that sequences under his control are only expressed in the tubers. This limits the effects of expression on certain parts of plants or cell types.
  • control sequences mentioned can also control the expression of the resistance factor.
  • plant cells which contain at least part of a DNA construct according to the invention. As a rule, this part is firmly integrated into the genome of the plant cell. It is preferably the cell of a useful plant, for example wheat, barley, rye, oats, corn, tobacco, cotton, rice, brassicaceae, cherries, plums, potatoes.
  • the invention further relates to a method for producing plants, in which a DNA construct according to the invention is introduced into a plant cell, so that at least a part of this construct is stable in the genome of the plant cell is integrated.
  • a suspension of plant cells can be transfected, after which a selection of the successfully transfected cells takes place.
  • the transfected cells are multiplied and cultivated, which leads to the growth of a complete plant.
  • the exogenous tubulin sequence is expressed in the plant cells.
  • the cells are grown and cultured.
  • a callus culture is preferably generated from mature embryos and this is then transfected on agar plates which contain the selection factor (for example kanamycin or carbamate herbicides) with the "particle-inflow gun" using DNA-coated gold particles.
  • the transfected cells are grown on the agar plates under selection pressure and then treated with cytokinins so that shoots form from the callus. These are then cut off after a few weeks and rooted on auxin-containing agar medium.
  • the resulting plantlets can then be transferred to soil and flowered after one to two months.
  • the resulting seeds are then sown and checked for the presence of the modified tubulin gene and the resulting resistance to carbamate.
  • the positive lines can then be propagated in a conventional manner.
  • Another aspect of the invention is plants which are produced by the method according to the invention. These plants express a C-terminally modified tubulin.
  • This alpha-tubulin is built into the cellular microtubules and hybrid microtubules are formed which have both native and modified alpha-tubulin. It is also possible that the microtubules contain predominantly modified alpha-tubulin, since the expression of the native alpha-tubulin is down-regulated.
  • the hybrid microtubules have changed properties. Since certain herbicides bind to the C-terminus of alpha-tubulin, the microtubules of the plants according to the invention can no longer be bound by these herbicides and consequently can no longer be depolymerized.
  • the modified alpha-tubulin thus gives the plant according to the invention increased resistance to certain herbicides.
  • herbicides are preferably carbamate herbicides, most preferably ethyl N-phenyl carbamate, isopropyl N-phenyl carbamate (Propham) and 3-chloroisopropyl N-phenyl carbamate (chlorpropham).
  • the hybrid microtubules can also give the plants other advantageous properties.
  • a specialty of microtubules is their sensitivity to cold, which leads to depolymerization below certain temperatures. This behavior of the microtubules is considered to be responsible for the inhibition of plant growth in the cold. Cold is understood to mean temperatures of 0-10 ° C. In this context, cold resistance is to be separated from frost resistance. The loss of harvest in cold summers has far-reaching economic consequences.
  • the C-terminus of alpha-tubulin is responsible for the sensitivity to microtubules to cold.
  • the plant according to the invention can thus have cellular microtubules with altered sensitivity to cold. Crop plants containing an alpha tubulin are conceivable express, the C-terminus is changed so that the microtubules are more stable against cold and thus the growth of the plant is less inhibited by low temperatures.
  • one aspect of the invention is a potato plant that expresses a C-terminally modified alpha-tubulin under the control of the tuber-specific patatin promoter.
  • the alpha-tubulin is modified in such a way that the resulting hybrid microtubulins have an increased sensitivity to low temperatures, i.e. depolymerize even at higher temperatures.
  • the modified alpha-tubulin is advantageously not expressed in plant parts except in the tubers, thereby minimizing any side effects.
  • the invention also relates to propagation agents of the plants according to the invention, especially their seeds.
  • Other propagation agents are, for example, the seed tubers of potatoes.
  • Another aspect of the invention is the use of C-terminally mutated alpha-tubulins or of nucleic acids containing them code for the production of the plants according to the invention mentioned above or their propagation agents.
  • Nucleic acids include in particular single or double stranded DNA and RNA.
  • FIG. 1 shows a comparison of the nucleotide sequences of the TUBA1 gene from Arborio (Arb .; SEQ ID NO: 3), Nihonmasari wild type (Nihmas WT; SEQ ID NO: 5) and Nihonmasari ER31 (Nihmas ER31; SEQ ID NO: 7).
  • Nucleotide 1353 of ER31 has a mutation that leads to a stop codon.
  • the corresponding amino acid sequences for Arborio (SEQ ID NO: 4), Nihonmasari wild type (SEQ ID NO: 6) and Nihonmasari ER31 (SEQ ID NO: 8) are given below the nucleotide sequences. The corresponding experiments are explained in Example 2.
  • FIG. 2 shows the increased resistance of the line ER31, which expresses the C-terminally modified TUBAl gene, to the herbicide ethyl N-phenylcarbamate (EPC) in comparison with the wild type.
  • EPC herbicide ethyl N-phenylcarbamate
  • carboxy derivatives of the carbamate herbicides ethyl N-phenyl carbamate and isopropyl N-phenyl carbamate were prepared and coupled to Sepharose 4B. This matrix was now incubated with various alpha-tubulins and C-terminal peptides from various alpha-tubulins.
  • the gene products of the rice alpha tubulin genes TUBAl, TUBA2 and TUBA3 an alpha tubulin consisting of amino acids 1 to 413 of the gene product of the rice alpha tubulin gene TUBAl, three peptides, each having amino acids 437 to 451 of the gene products of the rice alpha tubulin genes correspond to TUBAl to TUBA3.
  • the native alpha-tubulins were obtained in the following way: Rice coleoptiles (grown for 6 days at 25 ° C in complete darkness) were harvested in safety green light, snap frozen in liquid nitrogen and ground to a fine powder in liquid nitrogen.
  • microtubule stabilizing buffer (1 part by weight powder: 1 part by weight buffer) and slowly thawed on ice.
  • the microtubule-stabilizing buffer contains 25 mM MES, 5 mM EGTA, 1mM MgS0 4 , 1% w / v glycerol, 1mM GTP, 1mM PMSF and 10 ⁇ g / ml pepstatin A, aprotinin and leupeptin, pH 6.9.
  • the mixture was then filtered through two layers of 80 ⁇ m nylon fabric, ultracentrifuged for 10 min at 4 ° C.
  • the carbamate-resistant rice line ER31 was used as the starting material to obtain the mutated TUBA1 protein (amino acids 1 to 413).
  • the peptides were made by chemical synthesis. The peptides and proteins mentioned were incubated with the matrix so that they could bind. They were then eluted with a potassium chloride gradient.
  • the individual fractions were precipitated with trichloroacetic acid and then examined for the presence of the respective tubulin isotype after gel electrophoresis by Western blot with isotype-specific antibodies against rice alpha-tubulin.
  • the intensity of the bands was determined using a gel scanning quantification program. The following table shows the relative intensities of the bands as a function of the potassium chloride concentration:
  • Native rice TUBAl protein binds to the matrix material much more firmly than native rice TUBA3 protein.
  • C-terminal shortened rice TUBAl protein binds much weaker. This shows that the C-termmus of TUBAl is necessary for binding to carbamate herbicides.
  • the C-terminal 15 amino acids of the TUBAl protein bind to the matrix material with the same strength as the total protein. This shows that the C-termmus of the TUBAl protein is also sufficient for binding to carbamate herbicides.
  • Isotype-specific PCR primers were produced (see FIG. 1).
  • the 5 'primer had the sequence "GAGACTGCAGCGTCGCAGCATCAACCCAAT” (SEQ ID NO: 1)
  • the 3' primer had the sequence "GAGAATTCCCAGACGACGACGACTCCTC” (SEQ ID NO: 2).
  • wild type Kelzane
  • carbamate-resistant line ER31 different, independent sister lines were cultivated for six days in complete darkness (at 25 ° C), of which the coleoptiles were harvested in a safety green light and then according to the method described by Ehmann et al. (Planta 183, 416-422, 1991) published method isolated the mRNA.
  • the mRNA was transcribed with reverse transcriptase (available from Röche Diagnostics) according to the manufacturer's protocol into cDNA and then the cDNA for TUBAl was amplified by means of PCR using the isotype-specific primers.
  • a recognition sequence for the restriction enzymes EcoRI and PstI was synthesized on the primers, the PCR was carried out with 35 cycles at an "annealing temperature" of 55 ° C. with the particularly error-free "ExTaq" polymerase from TaKaRa.
  • the PCR product was separated on an agarose gel according to standard methods, the amplified band was cut out and eluted with the aid of the "Qiagen Gel Extraction Kit” (available from Qiagen) and according to the manufacturer cleaned up. After digestion with EcoRI and PstI according to the manufacturer (Gibco), the TUBAl cDNA fragment was ligated into the vector pUC19 and transformed into E. coli by the usual method. Five independent clonings were performed for the wild type and six independent clonings for the carbamate resistant line ER31. Finally, the amplified DNA sequences were determined.
  • the sequences obtained were compared with the sequence for TUBAl published for the rice cultivar Arborio.
  • the comparison shows that the two cultivars differ in several places. Two differences were found both in the wild type and in the carbamate-resistant line, so they are cultivar-specific. It is the exchange of a serine (arborio) in position 52 for a phenylalanine (Nihonmasari) and the exchange of a serine (arborio) in position 437 for an alanine.
  • ER31 and wild-type rice caryopses were grown in complete darkness for six days at 25 ° C. on aqueous solutions of ethyl N-phenylcarbamate.
  • 20 caryopses were placed equidistantly on a fine plastic net, which floated on the solution with the help of polystyrene blocks.
  • the length of the coleoptile and mesocotyl was measured after cultivation and the corresponding mean values against the logarithm of the concentration of ethyl-N- phenyl carbamate applied.
  • the degree of resistance can be determined as a factor from the shift in the dose-response curve for the mutant to higher concentrations. The result is shown in Figure 2.
  • the callus tissue is now a week after subculture on MS-A agar (Hartke, S. and Lörz, H. - 1989 Somatic embryogenesis and plant regeneration from various incfica rice (“Oryza sativa L.") genotypes. J.Genet. Breeding 43 , 205-214) using the "particle inflow gun".
  • the callus tissue is distributed on MS-A agar, which is complemented with 0.3 M mannitol and sorbitol, and incubated for 3 hours at 25 ° C.
  • the cells are then transformed under sterile conditions with 10 ⁇ l of DNA-coated gold particles per shot and left on the agar plates containing mannitol / sorbitol for a further 12 hours at 25 ° C.
  • selection medium MS-A agar with 1 mM ethyl-N-phenylcarbamate
  • Newly formed callus tissue is transferred to fresh selection medium after two weeks in the dark at 25 ° C until compact and opaque callus nodules form. These are removed sterile and placed on pre-regeneration medium (selection medium, in which the 2.4 D is replaced by 2 ppm 6-benzylaminopurine, 1 ppm alpha-naphthylacetic acid and 5 ppm abscisic acid). After a further week of cultivation in the dark, the compact and opaque callus is again removed and transferred to regeneration medium (selection medium in which the 2,4 D is replaced by 3 ppm of 6-benzylaminopurine and 0.5 ppm of alpha-naphthylacetic acid) and cultivated further in daylight, regenerate until rung.
  • selection medium in which the 2,4 D is replaced by 3 ppm of 6-benzylaminopurine and 0.5 ppm of alpha-naphthylacetic acid
  • the shoots are transferred to selection medium without hormones and cultivated further at 10000 Lx / m 2 until roots have formed.
  • the rice plants are then grown on soil and seeds are produced from them as described in Nick et al. (1994) (see above).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Konstrukte, die eine C-terminal mutierte alpha-Tubulinsequenz umfassen. Weiterhin betrifft die Erfindung Pflanzenzellen und Pflanzen, die diese Konstrukte enthalten sowie Verfahren zur Herstellung derartiger Pflanzen.

Description

HERBIZIDRESISTENTE TRANSGENE PFLANZEN MIT MUTIERTEM ALPHA-TUBULIN
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Konstrukte, die für mutierte Tubuline kodieren, sowie Pflanzen und Pflanzenzellen, die diese Konstrukte enthalten. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Herbizidresistenz und veränderter Kältesensitivität .
Das Auftreten von Schadkräutern, beispielsweise Roter Reis, Leersia , Echinocl oa, Heteranthera in Kulturen von Nutzpflanzen wie Reis, Gerste oder Roggen stellt in der Landwirtschaft ein großes Problem mit weitreichenden wirtschaftlichen Konsequenzen dar. Für einige dieser Schadkräuter (besonders für den Befall von Reisfeldern mit Rotem Reis) gibt es bislang keinen Ansatz zur Kontrolle. Bislang wird zum Beispiel für den Roten Reis vor allem versucht, die Erstinfektion von Reisfeldern zu verhindern. Dies ist dadurch erschwert, daß der Rote Reis eine perfekte Mimikry betreibt, so daß es praktisch unmöglich ist, das Saatgut reinzuhalten. Ein anderer Ansatz beruht darauf, daß eine Pseudoaussaat durchgeführt wird, also ein Umpflügen ohne Aussaat, so daß die im Boden überdauernden Samen des Roten Reises zum Keimen gebracht werden. Danach werden die Keime durch Behandlung mit Trichloressigsäure zum Absterben gebracht. Da aber die Samen dieser Schadpflanze bis zu fünf Jahre im Boden überdauern können, ist dieser Ansatz nicht sehr wirksam, abgesehen von der ökologischen Belastung. Im Durchschnitt vergehen drei Jahre von der Erstinfektion eines Reisfelds bis zum völligen Zusammenbruch des Reisanbaus auf diesem Feld. Die Verluste liegen inzwischen bei 30 % der Ernte.
Beim Einsatz von Herbiziden zur Bekämpfung von Schadkräutern wäre es wünschenswert, daß das Herbizid selektiv nur die Schadkräuter, nicht jedoch die Nutzpflanzen am Wachstum hindert. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Pflanze bereitzustellen, die unempfindlich gegen bestimmte Herbizide ist, sowie Ausgangsmaterialien und Verfahren zur Herstellung solcher Pflanzen.
Verschiedene Herbizide greifen an Mikrotubuli an. Mikrotubuli sind Polymere, die aus Heterodimeren von alpha- und beta- Tubulin aufgebaut sind. Pflanzliche Mikrotubuli spielen für die Steuerung der pflanzlichen Entwicklung eine bedeutende Rolle, beispielsweise bei der Steuerung des Wachstums, Knollenbildung, Verzweigung, Blatt- und Wurzelbildung, bei der Bildung von Holz, beim Gravitropismus und bei der Reaktion auf Licht, Wind, Pathogene und Kälte. Dennoch wurden sie bislang biotechnologisch nicht genutzt, obwohl zahlreiche Tubulingene mit mannigfaltigen Regulationsmustern bekannt sind. Der Grund liegt im wesentlichen darin, daß bislang keine Möglichkeit bestand, das Verhalten der Tubulinproteine und damit die Funktion zu manipulieren.
Für eine bestimmte Klasse von Substanzen, die sogenannten Dinitro-Aniline, wird vermutet, daß sie an den N-Terminus des Tubulins binden. Es ist gelungen, eine Resistenz gegen diese Herbizide von der Spezies Eleusine indica , wo diese Resistenz spontan aufgetreten war, auf Mais zu übertragen (Nature 393, 1998, 260-262).
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß eine andere Klasse von Herbiziden, die Carbamatherbizide, an den C-Terminus pflanzlicher alpha-Tubuline bindet. Dadurch wird eine Depolymerisierung der Mikrotubuli bewirkt, was zu Wachstumshemmung führt.
Die Erfindung betrifft transgene Pflanzen, die alpha-Tubuline exprimieren, deren C-Terminus so modifiziert ist, daß bestimmte Herbizide nicht mehr binden können. Das exogene alpha-Tubulin verleiht den Mikrotubuli der transgenen Pflanzen erhöhte Resistenz gegen bestimmte Herbizide.
Im Rahmen dieser Erfindung umfaßt der "C-Terminus eines alpha- Tubulins" denjenigen C-terminalen Aminosäurebereich eines alpha-Tubulins, der deletiert werden kann, ohne daß die Fähigkeit des alpha-Tubulins, in Mikrotubuli eingebaut zu werden, verloren geht.
Ein Aspekt der Erfindung sind DNA-Konstrukte, die zur Expression eines C-terminal modifizierten alpha-Tubulins in Pflanzenzellen geeignet sind. Das alpha-Tubulin, für das die DNA-Sequenz kodiert, besitzt einen N-terminalen Teil, der insoweit unverändert ist, daß das alpha-Tubulin noch in Mikrotubuli eingebaut werden kann. Der C-terminale Teil des kodierten alpha-Tubulins weist eine Mutation gegenüber dem Wildtyp-Tubulin auf, von dem die DNA-Sequenz abgeleitet ist. Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt weist weiterhin wenigstens eine DNA-Sequenz auf, die die Expression der alpha-Tubulin-DNA- Sequenz in Pflanzenzellen kontrolliert.
Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt enthält auch wenigstens eine DNA-Sequenz, die für einen Resistenzfaktor kodiert, der die Selektion transfizierter Pflanzenzellen erlaubt. Oft sind Resistenzfaktoren Proteine mit enzymatischer Aktivität, die bestimmte Verbindungen umwandeln oder abbauen können. Folglich werden als DNA-Sequenzen Gene eingesetzt, die für diese Proteine kodieren. Bevorzugt werden DNA-Sequenzen eingesetzt, die für den Resistenzfaktor Neomycin-Phosphotransferase II kodieren. Dadurch wird Resistenz gegen Kanamycin vermittelt.
Diese für einen Resistenzfaktor kodierende DNA-Sequenz steht ebenfalls unter der Kontrolle einer DNA-Sequenz, die die Expression der Sequenz in Pflanzenzellen reguliert. Vorzugsweise handelt es sich dabei um einen Promotor, der zur Expression von DNA-Sequenzen in Pflanzenzellen geeignet ist.
Eine Besonderheit der vorliegenden Erfindung ist, daß der Resistenzfaktor das C-terminal modifizierte alpha-Tubulin selbst sein kann. Expression des modifizierten alpha-Tubulins kann Resistenz gegen bestimmte Herbizide vermitteln. Es ist also möglich, transfizierte Zellen durch Kultivieren in Gegenwart der Herbizide zu selektionieren.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist also ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz aufweist, die für ein C-terminal modifiziertes alpha-Tubulin kodiert, aber keine zusätzliche DNA-Sequenz, die für einen Resistenzfaktor kodiert. Die für einen Resistenzfaktor kodierende DNA-Sequenz ist in diesem speziellen Fall die alpha-Tubulin-Sequenz selbst.
Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen DNA- Konstrukten um circuläre Plasmide, die ein C-terminal mutiertes alpha-Tubulin unter der Kontrolle eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors kodieren und ein Resistenzgen unter der Kontrolle eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors aufweisen.
Denkbar sind ebenfalls Ti-Plasmide, die von dem Ti-Plasmid von Agrobakterium tumefaciens abgeleitet sind und zur Herstellung transgener Pflanzen geeignet sind. Es kann sich aber auch um "nackte" DNA-Konstrukte oder um Konstrukte mit viralen Komponenten handeln.
Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt- ist zumindest teilweise in vitro hergestellt. Das bedeutet, daß zumindest ein Schritt bei der Herstellung des DNA-Konstrukts außerhalb einer Pflanzenzelle stattgefunden hat. Dadurch unterscheiden sich die erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte von natürlich vorkommenden Sequenzen. Die DNA-Sequenz, die für das alpha-Tubulin kodiert, kann entweder aus einer Gen-Bibliothek isoliert worden sein, es kann aber auch durch Polymerase Kettenreaktion (PCR) oder durch chemische Synthese hergestellt werden. Denkbar ist auch eine Kombination dieser Methoden. In der Regel wird die alpha- Tubulin-Sequenz in die "multiple cloning site" eines Expressionsvektors kloniert, der zur Expression von DNA- Sequenzen in Pflanzenzellen geeignet ist.
Die C-terminale Mutation des alp a-Tubulingens kann auf verschiedene Weisen gewonnen werden. Beispielsweise kann ein Teil eines alpha-Tubulins, das bereits die entsprechende Mutation trägt, in das gewünschte alpha-Tubulingen umkloniert werden. Die mutierte Ausgangssequenz kann beispielsweise aus einer herbizidresistenten Pflanzenlinie stammen, bei der das alpha-Tubulingen isoliert und sequenziert worden ist und eine entsprechende Mutation festgestellt wurde. Bevorzugt wird die Mutation jedoch durch In vitro Mutagenese eingeführt. Dabei werden in die DNA des alpha-Tubulingens gezielt Punktmutationen eingeführt. Hierzu geeignete Verfahren können auf der PCR- Technik basieren. Dabei wird als Matrize die alpha-Tubulin-DNA- Sequenz verwendet, in die die Mutation eingeführt werden soll. Die PCR-Primer tragen einen entsprechenden Basenaustausch gegenüber der Matrizensequenz. Über die Primer wird auch die Mutation amplifiziert .
Vorzugsweise liegt die C-terminale Mutation des alpha-Tubulins an einer Aminosäureposition, die innerhalb des Aminosäurebereichs liegt, der den Aminosäurepositionen 414 bis 451 des alpha-Tubulins TUBA1 aus Reis entspricht. Am bevorzugtesten aber liegt die C-terminale Mutation des alpha- Tubulins an einer Aminosäureposition, die innerhalb der 15 C- terminalen Aminosäuren des entsprechende Wildtyp-alpha-Tubulins liegt, von dem die DNA-Sequenz abgeleitet ist.
Die Mutationen können verschiedener Art sein. Auf DNA-Ebene kann es sich um Deletionen, insertionen oder eine oder mehrere Punktmutationen handeln. Auf Aminosäureebene kann es sich um Punktmutationen handeln, so daß das mutierte alpha-Tubulin an wenigstens einer Aminosäureposition eine andere Aminosäure aufweist als das entsprechende Wildtyp-alpha-Tubulin, von dem die Tubulin-Sequenz abgeleitet ist. Bevorzugt sind jedoch Mutationen, die in dem exprimierten alpha-Tubulin zu einem verkürzten C-Terminus führen. Das wird dadurch erreicht, daß ein Kodon, das im entsprechenden Wildtyp-alpha-Tubulin für eine Aminosäure kodiert, in ein Stopkodon umgewandelt ist. Denkbar sind jedoch auch Mutationen, die zu einer Verschiebung des Leserahmens führen, so daß "fremde Aminosäuren" kodiert werden, die nicht Teil einer Tubulin-Sequenz sind.
Am bevorzugtesten ist ein DNA-Konstrukt, in dem in der mutierten DNA-Sequenz das Kodon, das dem Kodon 414 des alpha- Tubulingens TUBA1 von Reis entspricht, ein Stopkodon ist.
Die DNA-Sequenz, die für das alpha-Tubulin kodiert, ist in der Regel von einem pflanzlichen alpha-Tubulingen abgeleitet. Dies ist jedoch nicht zwingend, da aufgrund des sehr hohen Konservierungsgrades der Tubuline auch alpha-Tubulingene aus nichtpflanzlichen Organismen in Pflanzen funktionell sein könnten. Es sind sogar Chimäre Tubulinsequenzen denkbar, die aus Abschnitten verschiedener Tubulingene zusammengesetzt sind. In der Regel handelt es sich bei der alpha-Tubulin-DNA-Sequenz des DNA-Konstrukts um eine DNA-Sequenz, die für ein alpha- Tubulin einer Nutzpflanze kodiert. Vorzugsweise handelt es sich um eine DNA-Sequenz, die für ein alpha-Tubulin von Reis kodiert, am bevorzugtesten um wenigstens einen Teil des Gens TUBA1 von Reis. Ebenfalls bevorzugt sind DNA-Konstrukte, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für ein alpha-Tubulin der Kartoffel kodiert.
Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt kann neben einer DNA- Sequenz, die für ein C-terminal modifiziertes alpha-Tubulin kodiert, auch eine DNA-Sequenz aufweisen, die für ein beta- Tubulin kodiert. Dies ist vorteilhaft, wenn hohe Expressionsniveaus erreicht werden, da dann durch alleinige Expression des alpha-Tubulins das Verhältnis von alpha- zu beta-Tubulin gestört sein könnte. Das wird durch gleichzeitige Expression eines beta-Tubulins vermieden. Vorzugsweise befinden sich alpha- und beta-Tubulin-Sequenz als "Tandemkonstrukt" hintereinander. Beispielsweise kann das DNA-Konstrukt die vollständige Sequenz des OSTBB16-Gens (für beta-Tubulin kodierend) aus Reis aufweisen.
Die wichtigsten Kontrollsequenzen zur Regulation der Expression der alpha-Tubulinsequenz sind Promotoren. Bevorzugt werden folgende Promotoren eingesetzt: Der 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) erlaubt konstitutive Expression in Pflanzenzellen. Durch den Maisubiquitin-Promotor wird sehr starke Expression in Getreidezellen erreicht. Der TUBA1- Promotor aus Reis ist zur Expression von DNA-Sequenzen in wachsenden Zellen geeignet, während der OSTBB16-Promotor aus Reis zur konstitutiven Expression geeignet ist. Schließlich kann durch spezifische Promotoren eine zeitlich und räumlich begrenzte Expression erreicht werden. Ein Beispiel dafür ist der Einsatz des Patatin-Promotors aus Kartoffel. Er sorgt dafür, daß Sequenzen unter seiner Kontrolle nur in den Knollen exprimiert werden. Dadurch werden die Wirkungen der Expression auf bestimmte Pflanzenteile oder Zelltypen begrenzt.
Die genannten Kontrollsequenzen können auch die Expression des Resistenzfaktors kontrollieren.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind Pflanzenzellen, die wenigstens einen Teil eines erfindungsgemäßen DNA-Konstruktes enthalten. In der Regel ist dieser Teil fest in das Genom der Pflanzenzelle integriert. Vorzugsweise handelt es sich um die Zelle einer Nutzpflanze, beispielsweise Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Mais, Tabak, Baumwolle, Reis, Brassicaceen, Kirschen, Pflaumen, Kartoffeln.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, bei dem ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt in eine Pflanzenzelle eingebracht wird, so daß zumindest ein Teil dieses Konstrukts stabil in das Genom der Pflanzenzelle integriert wird. Dazu kann man eine Suspension von Pflanzenzellen transfizieren, wonach eine Selektion der erfolgreich transfizierten Zellen stattfindet. Erfindungsgemäß werden die transfizierten Zellen vermehrt und kultiviert, was zum Auswachsen einer vollständigen Pflanze führt. Dabei wird die exogene Tubulin-Sequenz in den Pflanzenzellen exprimiert.
Es sind verschiedene Transfektionsmethoden anwendbar, um das DNA-Konstrukt in Pflanzenzellen einzubringen. Möglich sind der "Silicon carbide"-vermittelte Gentransfer, Infektion durch Agrobakterium tumefaciens und Elektroporation, bevorzugt ist jedoch der Beschüß von Zellen mit DNA-beschichteten Goldkügelchen ( "particle-inflow gun" ) .
Nach Transfektion werden die Zellen vermehrt und kultiviert.
Vorzugsweise wird aus reifen Embryonen eine Kalluskultur erzeugt und diese dann auf Agarplatten, die den Selektionsfaktor (z.B. Kanamycin bzw. Carbamatherbizide) enthalten, mit der "particle-inflow gun" mithilfe DNA- beschichteter Goldpartikel transfiziert. Erfindungsgemäß werden die transfizierten Zellen auf den Agarplatten unter Selektionsdruck vermehrt und dann mit Cytokininen behandelt, so daß sich aus dem Kallus Sprosse bilden. Diese werden dann nach einigen Wochen abgeschnitten und auf auxinhaltigem Agarmedium bewurzelt. Die so entstandenen Pflänzchen können dann nach ein bis zwei Monaten auf Erde umgesetzt und zur Blüte gebracht werden. Die entstehenden Samen werden dann ausgesät und auf die Anwesenheit des eingebrachten modifizierten Tubulingens und die dadurch ausgelöste Carbamatresistenz geprüft. Die positiven Linien können dann auf konventionelle Weise weitervermehrt werden. Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind Pflanzen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden. Diese Pflanzen exprimieren ein C-terminal modifiziertes Tubulin. Dieses alpha- Tubulin wird in die zellulären Mikrotubuli eingebaut und es entstehen Hybridmikrotubuli , die sowohl natives als auch modifiziertes alpha-Tubulin aufweisen. Es ist auch möglich, daß die Mikrotubuli überwiegend modifiziertes alpha-Tubulin enthalten, da die Expression des nativen alpha-Tubulins herunterreguliert wird. Die Hybridmikrotubuli besitzen veränderte Eigenschaften. Da bestimmte Herbizide an den C- Terminus des alpha-Tubulins binden, können die Mikrotubuli der erfindungsgemäßen Pflanzen nicht mehr von diesen Herbiziden gebunden werden und folglich auch nicht mehr depolymerisiert werden. Somit verleiht das modifizierte alpha-Tubulin der erfindungsgemäßen Pflanze eine erhöhte Resistenz gegenüber bestimmten Herbiziden. Vorzugsweise handelt es sich dabei um Carbamatherbizide, am bevorzugtesten um Ethyl-N-phenylcarbamat, Isopropyl-N-phenylcarbamat (Propham) und 3-Chlorisopropyl-N- phenylcarbamat (Chlorpropham) .
Die Hybridmikrotubuli können den Pflanzen auch weitere vorteilhafte Eigenschaften verleihen. Eine Besonderheit von Mikrotubuli ist ihre Kältesensitivität, die zur Depolymerisierung unterhalb bestimmter Temperaturen führt. Dieses Verhalten der Mikrotubuli wird als verantwortlich für die Hemmung des pflanzlichen Wachstums bei Kälte angesehen. Unter Kälte sind Temperaturen von 0-10°C zu verstehen. Kälteresistenz ist in diesem Zusammenhang von Frostresistenz zu trennen. Der Ernteausfall bei kalten Sommern hat weitreichende wirtschaftliche Konsequenzen. Es gibt Hinweise, daß der C- Terminus des alpha-Tubulins für die Kälteempfindlichkeit der Mikrotubuli verantwortlich ist. Somit kann die erfindungsgemäße Pflanze zelluläre Mikrotubuli mit veränderter Kältesensitivität aufweisen. Denkbar sind Nutzpflanzen, die ein alpha-Tubulin exprimieren, dessen C-Terminus derart verändert ist, daß die Mikrotubuli stabiler gegen Kälte sind und somit das Wachstum der Pflanze weniger durch niedrige Temperaturen gehemmt wird.
Es sind auch Pflanzen vorstellbar, die eine erhöhte Kältesensitivität aufweisen. Bei der Lagerung von Kartoffeln ist ein frühzeitiges Auskeimen unerwünscht. Dem wird derzeit durch Einsatz chemischer Keimhemmer wie beispielsweise Propham oder Chlorpropham begegnet. Daneben wird versucht, das Auskeimen durch sehr niedrige Temperaturen unter 4°C zu verhindern. Das führt jedoch zur Umwandlung von Stärke in Zucker und somit zur Geschmacksveränderung. Außerdem treten Verfärbungen auf. Ein Aspekt der Erfindung ist beispielsweise eine Kartoffelpflanze, die ein C-terminal modifiziertes alpha- Tubulin unter der Kontrolle des knollenspezifischen Patatin- Promotors exprimiert. Das alpha-Tubulin ist derart modifiziert, daß die entstehenden Hybridmikrotubuline eine erhöhte Empfindlichkeit gegen niedrige Temperaturen aufweisen, d.h. bereits bei höheren Temperaturen depolymerisieren. Dadurch könnte die Keimung bei Kartoffeln durch Lagerung und Transport bei entsprechender Temperatur verhindert werden, ohne daß die unerwünschten Wirkungen extrem niedriger Temperaturen auftreten. Deshalb könnte auf chemische Keimhemmer verzichtet werden. Vorteilhafterweise wird das modifizierte alpha-Tubulin nicht in Pflanzenteilen außer in den Knollen exprimiert, dadurch werden etwaige Nebeneffekte minimiert.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmittel der erfindungsgemäßen Pflanzen, vor allem ihre Samen. Weitere Vermehrungsmittel sind beispielsweise die Saatknollen von Kartoffeln.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung C-terminal mutierter alpha-Tubuline oder von Nucleinsäuren, die diese kodieren zur Herstellung der oben genannten erfindungsgemäßen Pflanzen oder ihrer Vermehrungsmittel. Nucleinsäuren umfassen hier insbesondere einzel- oder doppelsträngige DNA und RNA.
Alle Aspekte der vorliegenden Erfindung, insbesondere die, welche Pflanzen und Verfahren zu ihrer Herstellung betreffen, sind auf viele verschiedene Pflanzen und Pflanzensorten anwendbar. Die vorliegende Erfindung ist damit nicht auf eine bestimmte Pflanzensorte beschränkt. Gegenstand der Erfindung sind daher erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Pflanzen, nicht aber einzelne Pflanzensorten.
Figur 1 zeigt einen Vergleich der Nukleotidsequenzen des TUBA1- Gens aus Arborio (Arb.; SEQ ID NO:3), Nihonmasari Wildtyp (Nihmas WT; SEQ ID NO: 5) und Nihonmasari ER31 (Nihmas ER31; SEQ ID NO:7). Nukleotid 1353 von ER31 weist eine Mutation auf, die zu einem Stopcodon führt. Die entsprechenden Aminosäuresequenzen für Arborio (SEQ ID NO:4), Nihonmasari Wildtyp (SEQ ID NO: 6) und Nihonmasari ER31 (SEQ ID NO: 8) sind unterhalb der Nukleotidsequenzen angegeben. Die entsprechenden Experimente sind in Beispiel 2 erläutert.
Figur 2 zeigt die erhöhte Resistenz der Linie ER31, die das C- terminal modifizierte TUBAl-Gen exprimiert, gegen das Herbizid Ethyl-N-phenylcarbamat (EPC) im Vergleich mit dem Wildtyp. Es wurden Koleoptil- und Mesokotylwachstum in Abhängigkeit von der EPC-Konzentration ermittelt. Die entsprechenden Experimente sind in Beispiel 3 erläutert.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:
Beispiel 1: Bindung von Carbamatherbiziden an den C-Terminus von alpha- Tubulin
Zunächst wurden Carboxy-Derivate der Carbamatherbizide Ethyl-N- phenylcarbamat und Isopropyl-N-phenylcarbamat hergestellt und an Sepharose 4B gekoppelt. Diese Matrix wurde nun mit verschiedenen alpha-Tubulinen und C-terminalen Peptiden verschiedener alpha-Tubuline inkubiert. Im einzelnen wurden eingesetzt: die Genprodukte der Reis-alpha-Tubulingene TUBAl, TUBA2 und TUBA3 , ein alpha-Tubulin bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 413 des Genprodukts des Reis-alpha- Tubulingens TUBAl, drei Peptide, die jeweils den Aminosäuren 437 bis 451 der Genprodukte der Reis-alpha-Tubulingene TUBAl bis TUBA3 entsprechen. Die nativen alpha-Tubuline wurden auf folgende Weise gewonnen: Reiskoleoptilen (6 Tage bei 25°C in absoluter Dunkelheit gewachsen) wurden im Sicherheitsgrünlicht geerntet, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver gemörsert. Das Pulver wurde mit eiskaltem Mikrotubuli-stabilisierendem Puffer gemischt (1 Gewichtsteil Pulver : 1 Gewichtsteil Puffer) und langsam auf Eis aufgetaut. Der Mikrotubuli-stabilisierende Puffer enthält 25 mM MES, 5 mM EGTA, lmM MgS04, 1% w/v Glycerin, lmM GTP, lmM PMSF und jeweils 10 μg/ml pepstatin A, aprotinin und leupeptin, pH 6,9. Das Gemisch wurde dann durch zwei Lagen 80 μm Nylongewebe filtriert, für 10 min bei 4°C mit 300000 g ultrazentrifugiert, der Niederschlag verworfen und der Überstand durch ein 0,22 μm-Membran ilter filtriert. Dieser Überstand ist stark angereichert an Tubulin und Mikrotubuli- assoziierten Proteinen. Zur Gewinnung des mutierten TUBA1- Proteins (Aminosäuren 1 bis 413) wurde als Ausgangsmaterial die Carbamat-resistente Reislinie ER31 verwendet. Die Peptide wurden durch chemische Synthese hergestellt. Die genannten Peptide und Proteine wurden mit der Matrix inkubiert, so daß sie binden konnten. Anschließend wurden sie mit einem Kaliumchloridgradienten eluiert. Die einzelnen Fraktionen wurden mit Trichloressigsäure gefällt und dann nach Gelelektrophorese durch Western-Blot mit Isotyp-spezifischen Antikörpern gegen Reis-alpha-Tubulin auf die Anwesenheit des jeweiligen Tubulin-Isotyps untersucht. Die Intensität der Banden wurde mit Hilfe eines Gel-Scanning- Quantifizierungsprogramms ermittelt. In folgender Tabelle sind die relativen Intensitäten der Banden in Abhängigkeit von der Kaliumchloridkonzentration angegeben :
Tabelle 1:
M KC1 0 0.05 0.1 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.5 0.6 0.7 natives Reis-TUBAl 0 0 0 0 4 9 22 25 19 15 6
natives Reis-TUBA2 0 0 0 4 4 32 28 20 12 0 0
natives Reis-TUBA3 0 0 10 17 32 31 10 0 0 0 0
mutiertes Reis-TUBAl 15 16 0 21 29 2 8 2 7 0 0
TUBAl Peptid 0 0 0 0 0 11 18 28 12 19 12
TUBA 2 Peptid 0 0 0 7 12 33 27 14 7 0 0
TUBA 3 Peptid 0 0 4 19 41 29 7 0 0 0 0
Natives Reis-TUBAl-Protein bindet deutlich fester an das Matrix-Material als natives Reis-TUBA3-Protein. C-terminal verkürztes Reis-TUBAl-Protem bindet jedoch viel schwacher. Das zeigt, daß der C-Termmus von TUBAl für die Bindung an Carbamatherbizide notwendig ist. Die C-terminalen 15 Aminosäuren des TUBAl-Protems binden mit gleicher Starke an das Matrix-Material wie das Gesamtprotein. Das zeigt, daß der C-Termmus des TUBAl-Proteins auch hinreichend für die Bindung an Carbamatherbizide ist.
Beispiel 2:
Klonierung des mutierten Reis-TUBAl-Gens
Es wurden Isotyp-spezifische PCR-Primer hergestellt (siehe Figur 1). Der 5 ' -Primer hatte die Sequenz "GAGACTGCAGCGTCGCAGCATCAACCCAAT" (SEQ ID NO : 1 ) , der 3 ' -Primer hatte die Sequenz "GAGAATTCCCAGACGACGACGACTCCTC" (SEQ ID NO:2). Es wurden für Wildtyp (Kultivar Nihonmasari) und die carbamatresistente Linie ER31 verschiedene, voneinander unabhängige Schwesterlinien bei völliger Dunkelheit für sechs Tage kultiviert (bei 25°C), davon im Sicherheitsgrünlicht die Koleoptilen geerntet und darauf gemäß der von Ehmann et al. (Planta 183, 416-422, 1991) publizierten Methode die mRNA isoliert. Die mRNA wurde mit reverser Transkriptase (erhältlich von Firma Röche Diagnostics) gemäß Herstellerprotokoll in cDNA umgeschrieben und daraus dann mittels PCR mit den Isotypspezifischen Primern die cDNA für TUBAl amplifiziert . An die Primer war eine Erkennungssequenz für die Restriktionsenzyme EcoRI und PstI ansynthetisiert, die PCR wurde mit 35 Zyklen bei einer "Annealingtemperatur" von 55 °C mit der besonders fehlerfreien "ExTaq"-Polymerase der Firma TaKaRa durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde nach Standardverfahren auf einem Agarosegel aufgetrennt, die amplifizierte Bande ausgeschnitten und mit Hilfe des "Qiagen Gel Extraction Kit" (erhältlich von der Firma Qiagen) nach Angaben des Herstellers eluiert und aufgereinigt . Nach Verdau mit EcoRI und PstI nach Angaben des Herstellers (Firma Gibco) wurde das TUBAl-cDNA-Fragment in den Vektor pUC19 ligiert und nach dem üblichen Verfahren in E.coli transformiert. Es wurden fünf unabhängige Klonierungen für den Wildtyp und sechs unabhängige Klonierungen für die carbamatresistente Linie ER31 durchgeführt. Schließlich wurden die amplifizierten DNA-Sequenzen ermittelt.
Die erhaltenen Sequenzen wurden mit der für den Reiskultivar Arborio publizierten Sequenz für TUBAl verglichen. Der Vergleich (siehe Figur 1) zeigt, daß sich die zwei Kultivare an mehreren Stellen unterscheiden. Zwei Unterschiede wurden sowohl im Wildtyp als auch bei der carbamatresistenten Linie gefunden, sind also Kultivar-spezifisch. Es handelt sich um den Austausch eines Serins (Arborio) in Position 52 gegen ein Phenylalanin (Nihonmasari) und den Austausch eines Serins (Arborio) in Position 437 gegen ein Alanin. Zusätzlich liegt bei den carbamatresistenten Linien an Position 1353 ein Basenaustausch G zu T vor, dadurch wird das Triplett GAG (Gutamat) in das Triplett TAG (Stop) überführt, wodurch das entstehende Protein C-terminal von 451 auf 413 Aminosäuren verkürzt wird.
Beispiel 3:
Resistenz der Linie ER31 gegen Ethyl-N-phenylcarbamat
Reiskaryopsen von ER31 und Wildtyp wurden bei völliger Dunkelheit für sechs Tage bei 25°C auf wäßrigen Lösungen von Ethyl-N-phenylcarbamat angezogen. Dazu wurden jeweils 20 Karyopsen äquidistant auf einem feinen Plastiknetz ausgelegt, das mithilfe von Polystyrolblöckchen auf der Lösung flottierte. Die Länge von Koleoptile und Mesokotyl wurde nach Ablauf der Anzucht gemessen und die entsprechenden Mittelwerte gegen den Logarithmus der eingesetzten Konzentration von Ethyl-N- phenylcarbamat aufgetragen. Aus der Verschiebung der Dosis- wirkungs-Kurve für die Mutante zu höheren Konzentrationen läßt sich der Grad der Resistenz als Faktor bestimmen. Das Ergebnis ist in Figur 2 gezeigt.
Beispiel 4 :
Herstellung einer transgenen Reispflanze.
Als Ausgangsmaterial dienen reife Reissamen, aus denen Kallus hergestellt wird. Dieser Schritt ist beschrieben in P. Nick, 0. Yatou, M. Furuya, A.M. Lambert (1994) Auxin-dependent microtubule responses and seedling development are affected in a rice mutant resistant to EPC. Plant J. 6, 651-663.
Das Kallusgewebe wird nun eine Woche nach Subkultur auf MS-A Agar (Hartke, S. and Lörz, H. - 1989 Somatic embryogenesis and plant regeneration from various incfica rice ("Oryza sativa L.") genotypes. J.Genet. Breeding 43, 205-214) mit Hilfe der "particle inflow gun" transformiert.
Dazu wird das Kallusgewebe auf MS-A Agar, der mit jeweils 0,3 M Mannit und Sorbit komplementiert ist, verteilt und für 3 Stunden bei 25°C inkubiert. Danach werden die Zellen unter sterilen Bedingungen mit jeweils 10 μl DNA-beschichteten Goldpartikeln pro Schuß transformiert und für weitere 12 Stunden bei 25°C auf den Mannit/Sorbit-haltigen Agarplatten belassen. Danach werden sie auf Selektionsmedium umgesetzt (MS- A Agar mit 1 mM Ethyl-N-phenylcarbamat), wobei die beschossene Fläche des Kallus nach oben zeigt. Neugebildetes Kallusgewebe wird nach zwei Wochen im Dunkeln bei 25°C auf frisches Selektionsmedium übertragen, bis sich kompakte und undurchsichtige Kallusknöllchen bilden. Diese werden steril entnommen und auf Vor-Regenerationsmedium (Selektionsmedium, in dem das 2,4 D durch 2 ppm 6-Benzylaminopurin, 1 ppm alpha- Naphthylessigsäure und 5 ppm Abscisinsäure ersetzt ist) umgesetzt. Nach einer weiteren Woche Kultivierung im Dunkeln wird wiederum kompakter und undurchsichtiger Kallus entnommen und auf Regenerationsmedium überführt (Selektionsmedium, in dem das 2,4 D durch 3 ppm 6-Benzylaminopurin und 0,5 ppm alpha- Naphthylessigsäure ersetzt ist) und bei Tageslicht weiterkultiviert, bis Sprosse regenerieren. Die Sprosse werden nach mehreren Wochen auf Selektionsmedium ohne Hormone umgesetzt und bei 10000 Lx/m2 weiterkultiviert, bis sich Wurzeln gebildet haben. Die Reispflänzchen werden dann auf Erde weitergezogen und davon Samen erzeugt wie in Nick et al. (1994) (siehe oben) beschrieben.

Claims

Ansprüche
1) DNA-Konstrukt, das geeignet ist, um eine DNA-Sequenz in Pflanzenzellen zu exprimieren und zumindest teilweise in vitro hergestellt wird, umfassend folgende Bestandteile:
a) eine DNA-Sequenz, die für ein mutiertes alpha-Tubulin kodiert, wobei
aa) der N-terminale Teil des alpha-Tubulins so erhalten ist, daß das alpha-Tubulin in Mikrotubuli eingebaut werden kann;
bb) der C-terminale Teil des 'alpha-Tubulins eine Mutation gegenüber dem Wildtyp-Tubulin aufweist, von dem die DNA-Sequenz abgeleitet ist;
b) wenigstens eine DNA-Sequenz, die die Expression der alpha- Tubulin-DNA-Sequenz in Pflanzenzellen kontrolliert;
c) wenigstens eine DNA-Sequenz, die für einen Resistenzfaktor kodiert, der die Selektion erfolgreich transfizierter Pflanzenzellen erlaubt, wobei diese DNA-Sequenz unter der Kontrolle einer DNA-Sequenz nach b) steht.
2) DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutation des alpha-Tubulins im C-terminalen Drittel des alpha-Tubulins ist.
3) DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutation des alpha-Tubulins an einer Aminosäurepostion ist, die innerhalb des Aminosäurebereichs liegt, der den Aminosäurepositionen 414-451 des alpha-Tubulins TUBAl aus Reis entspricht .
4) DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutation des alpha-Tubulins an einer Aminosäureposition ist, die innerhalb der 15 C-terminalen Aminosäuren des entsprechenden Wildtyp-alpha-Tubulins liegt.
5) DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das mutierte alpha-Tubulin an wenigstens einer Aminosäureposition eine andere Aminosäure als das entsprechende Wildtyp-alpha-Tubulin aufweist.
6) DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das mutierte alpha-Tubulin im Vergleich zum entsprechenden Wildtyp-alpha-Tubulin C-terminal verkürzt ist.
7) DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 -3, dadurch gekennzeichnet, daß in der mutierten DNA-Sequenz das Kodon, das dem Kodon 414 im alpha-Tubulin-Gen TUBAl von Reis entspricht, ein Stopkodon ist.
8) DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das alpha-Tubulin ein alpha-Tubulin einer Nutzpflanze ist.
9) DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das alpha-Tubulin ein alpha-Tubulin von Reis ist.
10) DNA-Konstrukt nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz wenigstens einen Teil des Gens TUBAl von Reis umfaßt.
11) DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für ein alpha-Tubulin der Kartoffel kodiert. 12) DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es als eine Kontrollsequenz den Promotor des TUBAl-Gens aus Reis aufweist.
13) DNA-Konstrukt nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es als eine Kontrollsequenz den knollenspezifischen Patatin-Promotor der Kartoffel aufweist.
14) Pflanzenzelle, enthaltend wenigstens einen Teil eines DNA- Konstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
15) Pflanzenzelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es die Zelle einer Nutzpflanze ist.
16) Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, das folgende Schritte umfaßt:
a) Bereitstellung eines DNA-Konstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 13,
b) Einbringen dieses DNA-Konstrukts in eine Pflanzenzelle, so daß zumindest ein Teil des Konstrukts stabil in das Genom der Pflanzenzelle integriert wird,
c) Vermehrung und Kultivierung der transformierten Pflanzenzellen, wobei die exogene Tubulinsequenz exprimiert wird.
17) Pflanze, herstellbar durch ein Verfahren nach Anspruch 16, sowie Vermehrungsmittel dieser Pflanze.
18) Pflanze nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze Resistenz gegenüber wenigstens einem Herbizid aufweist, sowie Vermehrungsmittel dieser Pflanze. 19) Pflanze nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze Resistenz gegenüber wenigstens einem Carbamatherbizid aufweist, sowie Vermehrungsmittel dieser Pflanze.
20) Pflanze nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze Resistenz gegenüber wenigstens einem der Herbizide Ethyl-N-Phenylcarbamat , Isopropyl-N-Phenylcarbamat (Propham) und 3-Chlorisopropyl-N-phenylcarbamat (Chlorpropham) aufweist, sowie Vermehrungsmittel dieser Pflanze.
21) Pflanze nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze erhöhte Kälteresistenz gegenüber der entsprechenden Wildtyppflanze aufweist, sowie Vermehrungsmittel dieser Pflanze.
22) Pflanze nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze erhöhte Kälteempfindlichkeit gegenüber der entsprechenden Wildtyppflanze aufweist, sowie Vermehrungsmittel dieser Pflanze.
23) Verwendung von C-terminal mutierten alpha-Tubulinen oder von Nucleinsäuren, die diese kodieren, zur Herstellung von herbizidresistenten Pflanzen oder deren Vermehrungsmittel.
24) Verwendung von C-terminal mutierten alpha-Tubulinen oder von Nucleinsäuren, die diese kodieren, zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Kälteresistenz oder deren Vermehrungsmittel .
25) Verwendung von C-terminal mutierten alpha-Tubulinen oder von Nucleinsäuren, die diese kodieren, zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Kälteempfindlichkeit oder deren Vermehrungsmittel .
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102011013449B4 (de) 2011-03-09 2013-12-05 Continental Automotive Gmbh Baugruppe mit einem Träger, einem SMD-Bauteil und einem Stanzgitterteil
CN115160425A (zh) * 2022-05-16 2022-10-11 安徽省农业科学院水稻研究所 一种高抗二硝基苯胺类除草剂水稻突变型蛋白及相应基因
CN114989282B (zh) * 2022-07-19 2023-06-20 安徽省农业科学院水稻研究所 一种抗二硝基苯胺类除草剂的水稻突变型蛋白及应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9211130D0 (en) * 1992-05-26 1992-07-08 Ici Plc Herbicide resistant plants

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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